Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации

Стародубова, Елизавета Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации"

Российская академия наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта

На правах рукописи

-гь^-^у}

СТАРОДУБОВА Елизавета Сергеевна

ПРОТЕАСОМНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ДИКОГО И ЛЕКАРСТВЕННО-УСТОЙЧИВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИЧ-1 И ЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ДНК-ВАКЦИНАЦИИ

Специальность 03.00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории структуры и функции хроматина Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и группе химии вирусных белков и нуклеиновых кислот отдела общей вирусологии ГУ Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор B.JI. Карпов

кандидат химических наук М.Г. Исагулянц

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор B.C. Прасолов

(Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) доктор биологических наук Н.П. Шарова

(Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН)

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

РАН

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Деградация белков - один из важнейших механизмов регуляции клеточных процессов. Известно, что большинство внутриклеточных белков разрушается на 26Б протеасоме. Протеасомная деградация вовлечена в контроль таких клеточных процессов как дифференцировка, онкогенез, апоптоз, клеточный цикл, деление, репарация ДНК, реакция на стрессовые воздействия и иммунный ответ.

Важная роль протеасомы состоит в образовании эпитопов, представляемых на поверхности клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I. Такие комплексы распознаются СП8+ Т-клетками, которые участвуют в образовании клеточного иммунного ответа. Именно эта функция протеасомы привлекает большое внимание исследователей, создающих вакцины нового поколения.

В настоящее время активно разрабатывается стратегия вакцинации против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) на основе белков вируса и их генов. Одним из них является обратная транскриптаза ВИЧ, синтезирующая ДНК-копию одноцепочечного РНК-генома вируса. Синтез ДНК-копии генома ВИЧ - один из ключевых этапов жизненного цикла вируса, что делает обратную транскриптазу одной из основных мишеней действия антиретровирусных препаратов и вакцин. Применение антиретровирусных препаратов приводит к появлению штаммов вирусов, устойчивых к лекарствам, прежде всего за счет мутаций в гене обратной транскриптазы. В совокупности это указывает на необходимость создания вакцин, индуцирующих иммунный ответ, направленный на обратную транскриптазу как диких, так и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ. Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против ВИЧ весьма перспективными считаются ДНК-вакцины. В самом простом варианте ДНК-вакцина представляет собой плазмидный вектор, содержащий ген белка патогена и элементы, необходимые для транскрипции этого гена. При введении ДНК-вакцины реципиенту в клетках происходит синтез закодированного белка, который активирует иммунную систему.

Несмотря на то, что обратная транскриптаза является столь привлекательной мишенью для индукции ВИЧ-специфического иммунного ответа, ее экспрессия и деградация в клетке до сих пор мало изучены. Данные о протеолизе обратной транскриптазы ВИЧ, имеющиеся в литературе, косвенные и противоречивые. Поэтому для разработки ДНК-вакцин на основе генов обратной транскриптазы диких и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ особенно необходима информация о синтезе и деградации этого белка в клетке.

Используемые на сегодняшний день ДНК-вакцины имеют сравнительно низкую иммуногенность, в связи с чем ведется разработка различных подходов по повышению их эффективности. Одним из таких молекулярно-биологических подходов является модификация генов ДНК-вакцины, направляющая кодируемый этим геном белок в протеасому. Благодаря ускорению деградации на протеасоме, возможно увеличение презентации эпитопов и повышение уровня Т-клеточного ответа. Таким путем были успешно модифицированы ДНК-вакцины, несущие антигены некоторых патогенов. До сих пор подобные исследования для обратной транскриптазы ВИЧ не проводились. Поэтому повышение иммуногенности ДНК-вакцины на основе гена обратной транскриптазы как дикого, так и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ представляет большой теоретический и практический интерес. Цель н задачи исследования.

Целью данного исследования было изучение деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 и направление обратной транскриптазы по протеасомному пути деградации для повышения иммуногенности ДНК-вакцинной конструкции, созданной на основе ее гена. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- определить время полужизни обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 в клетке;

- установить участие различных протеаз клетки в деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1;

- увеличить скорость деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 на протеасоме;

- в опытах по ДНК-иммунизации мышей изучить иммуногенность ДНК-вакцинной конструкции, созданной на основе гена модифицированной обратной транскриптазы ВИЧ-1 с усиленной протеасомной деградацией.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Изучена деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1, кодируемых ДНК-вакцинными конструкциями, в культуре клеток почки эмбриона человека НЕК293. Обнаружено, что содержание в клетках обратной транскриптазы с мутациями лекарственной устойчивости ниже, чем фермента дикого типа. Установлено, что накопление мутаций лекарственной устойчивости приводит к повышению скорости деградации лекарственно-устойчивых вариантов обратной транскриптазы, что обусловливает их низкий уровень содержания в клетке.

С помощью различных ингибиторов выявлено, что в клетках НЕК293 в деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее лекарственно-устойчивых вариантов участвует

преимущественно протеасома, а вклад других клеточных протеаз в этот процесс незначителен. Обнаружено, что лекарственно-устойчивые варианты обратной транскриптазы ВИЧ-1 имеют более высокую скорость деградации и сродство к протеасоме, чем фермент дикого типа.

С целью увеличения Т-клеточного ответа на ДНК-иммуноген на основе обратной транскриптазы ВИЧ-1 использован специальный подход, включающий повышение ее скорости деградации и сродства к протеасоме. Для этого создан химерный белок обратной транскриптазы с орнитиндекарбоксилазой мыши. Показано, что такой химерный белок деградирует в 6 раз быстрее и стабилизируется протеасомными ингибиторами в 10 раз сильнее, чем исходная немодифицированная обратная транскриптаза.

В экспериментах по иммунизации мышей ДНК-вакцинными конструкциями показана высокая эффективность полученного химерного ДНК-иммуногена на основе гена обратной транскриптазы ВИЧ-1 с усиленной протеасомной деградацией.

Полученные данные о деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 и возможности ее регулирования вносят важный вклад в понимание биологии ВИЧ, природы лекарственной устойчивости вируса, а также расширяют спектр подходов к конструированию ДНК-вакцин. Подход, успешно примененный в данной работе, может быть использован для повышения иммуногенности ДНК-вакцин против других патогенов. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на 13th International Symposium on HIV & Emerging Infectious Diseases, Toulon, France, 2004; «DNA Vaccines 2004», Monaco, 2004; на VII международной конференции по молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Суздаль, 2004; на XVII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2005; 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2005; на Международной школе-конференции «Системная биология и биоинженерия», Звенигород, 2005; на Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2006.

По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи. Структура и объем работы.

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит

иллюстраций (фотографии, рисунки, таблицы и диаграммы). Библиография включаетэЛС£ наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Генетические конструкции

В настоящей работе в культуре клеток почки эмбриона человека IIEK293 исследовали синтез и деградацию нескольких вариантов обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ-1, кодируемых ДНК-вакцинными конструкциями. Используемые плазмидные векторы содержали гены обратной транскриптазы дикого типа (ОТдт), соответствующий последовательности изолята НХВ2, и двух вариантов ОТ, несущих мутации лекарственной устойчивости. Один из мутантных вариантов ОТ содержал 4 аминокислотных замены D67N/K70R/T215F/K219Q (ОТ4м), которые характерны для устойчивости к нуклеозидному ингибитору - азидотимидину. Ген, кодирующий ОТ4м, был получен сайт-направленным мутагенезом гена, кодирующего ОТдт. Второй вариант мутантной обратной транскриптазы имел 26 замен в аминокислотной последовательности A62V/D67N/S68N/K70G/V75I/F77L/Y115F/F11 б Y/O 151М/М184 Vfl202V/O2Q7E/L214F/T21 5Y/K2JJQ/Q334L/K390Q/E399D/N460D/T468S/Y483I1/L491S/A508T/Q512IÍ/N519S/A554S (ОТ 1.14), двенадцать из которых являются охарактеризованными мутациями лекарственной устойчивости (отмечены подчеркиванием). Ген, кодирующий ОТ1.14, был клонирован с использованием кДНК лекарственно-устойчивого изолята ВИЧ-1. Этот изолят выделен из образца крови пациента, получавшего несколько антиретровирусных препаратов (ламивудин, ставу дин, сакунавир и ритонавир). Мутации в ОТ 1.14 соответствуют характерным мутациям множественной лекарственной устойчивости к нуклеозидным ингибиторам.

Гены, кодирующие различные варианты обратной транскриптазы ВИЧ-1, были клонированы в экспрессионные базовые векторы pCMV (pCMVAb) или pKCMV. Эти векторы различались только по последовательности антибиотика для селекции: ампицилина (pCMV) или канамицина (pKCMV). Экспрессируемые гены находились под контролем промотора CMVie и имели сигнал полиаденилирования HPV16. В работе использовали следующие конструкции: pCMVRT, кодирующая ОТдт, pCMVRT4mut -ОТ4м и pK.CMVRTl.14 - ОТ1.14.

Синтез различных вариантов обратной транскриптазы ВИЧ-1 в культуре клеток

На первом этапе исследования был проведен сравнительный анализ экспрессии гена обратной транскриптазы дикого типа и форм с мутациями лекарственной устойчивости в клетках почки эмбриона человека НЕК293. Клетки трансфицировали плазмидами, содержащими гены ОТ, и оценили синтез белка в клетках с помощью полуколичественного иммуноблотинга. Обнаружено, что содержание в клетках трех

вариантов ОТ различается. По содержанию белка на клетку варианты ОТ располагались в следующем порядке по убыванию: ОТдт>ОТ4м>ОТ1.14. Содержание ОТдт достигало 25фг на клетку, ОТ4м — 15фг, и ОТ1.14 - 8фг (Рис. 1). Из этих результатов следует, что лекарственно-устойчивые формы ОТ накапливаются в клетках в меньшем количестве и увеличение числа мутаций сопровождается уменьшением содержания белка.

(А)

Е С

4 ь-02

2 2 о и

£ >

о м

о.

ОТ, нг 1 5 10 25

- ОТ

-тубулин

Рис. 1. Содержание разных вариантов ОТ в клетках НЕК293.

(А) Иммуноблотинг лизатов клеток, трансфицированных плазмидами рСМУАЬ, рСМУКТ, pCMVRT4mi.it и pK.CMVRTl.14. ОТ выявляли специфическими поликлональными антителами. Для нормирования образцов мембраны окрашивали антителами против тубулина. (Б). Содержание ОТ в клетке, определенное по результатам иммуноблотинга.

С помощью флуоресцентной микроскопии изучили локализацию в клетке двух вариантов обратной транскриптазы — ОТдт и ОТ 1.14. Для этого провели иммуноокрашивание клеток НЕК293, трансфицированных плазмидами рСМУКТ и рКСМУЮТ.14, с использованием поликлональных антител против ОТ и соответствующих антивидовых НТС-конъюгированных вторичных антител. Обнаружено, что обе формы обратной транскриптазы локализованы в цитоплазме клеток. Однако, ОТдт распределяется в цитоплазме равномерно, в то время как распределение ОТ1.14 имеет зернистый характер.

Таким образом, в наших экспериментах установлено, что появление мутаций сопровождается уменьшением содержания обратной транскриптазы, синтезируемой в эукариотических клетках. Различный уровень накопления белков, кодируемых идентичными конструкциями (идентичные регуляторные элементы), связан с особенностями поведения этого белка в клетке. Основным параметром, влияющим на содержание белка, в этом случае является его стабильность в клетке. При появлении мутации лекарственной устойчивости конформация ОТ нарушается, что может приводить к агрегации белка и направлению белковых агрегатов на деградацию. Предположение об

агрегации лекарственно-устойчивой формы ОТ подкрепляется зернистый характером ее внутриклеточного распределения. Кроме того, мутации могут приводить к появлению дополнительных сайтов узнавания клеточными протеазами, что также может увеличивать скорость разрушения белка. Поэтому для установления причины различия в уровне содержания в клетках разных вариантов ОТ, было необходимо исследовать механизм деградации разных форм обратной транскриптазы ВИЧ-1 в клетке. Для этого следовало определить скорость деградации ОТ в клетке и установить, какие клеточные протеазы участвуют в протеолизе обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых вариантов.

Определение скорости деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 в клетках

Одна из основных характеристик деградации белка в клетке — это время его полужизни. На первом этапе исследования мы сравнили скорость протеолиза разных вариантов обратной транскриптазы. Для определения времени полужизни белка в клетке используются два подхода. Первый - «pulse-chase», в котором применяется импульсное включение радиоактивномеченного предшественника (353-метионин) и последующий анализ сохранившего белка иммунопреципитацией и авторадиографией. Второй метод -«cycloheximide-chase». При использовании этого метода трансляцию ингибируют циклогексимидом и через определенные промежутки времени после остановки трансляции иммуноблотингом определяют содержание неразрушенного белка. В нашей работе были использованы оба метода.

Сначала мы использовали метод «pulse-chase» и протестировали динамику деградации в клетке белков ОТдт и ОТ4м в течение длительного промежутка времени (до 30 ч) (Рис. 2). В результате эксперимента установили, что время полужизни обратной транскриптазы дикого типа составляет 18 ч, а ОТ4м -6 ч. Затем методом «cycloheximide-chase», используя промежутки времени после остановки трансляции от 0 до 8 ч, определили время полужизни ОТдт и ОТ1.14. Значение времени полужизни ОТдт было равно значению, определенному методом «pulse-chase». Это подтверждает возможность использования обоих методов для адекватной оценки времени полужизни обратной транскриптазы. По нашим данным время полу жизни ОТ1.14 составило 2 ч.

(А)

10 30

„ jjjjjjgg

(Б)

-ОТдг -ОТ4м -ОТ1.14

Рис. 2. Деградация ОТдт, ОТ4м и ОТХ.14 в клетках НЕК293.

(A) «Pulse-chase». Радиоавтограмма ПААГ с радиоакгивномеченной иммунопреципитированной обратной транскриптазой, сохранившейся в трансформированных плазмидами клетках через указанные промежутки времени после окончания мечения. (Б). «Chicloheximide-chase». Иммуноблотинг трансформированных плазмидами клеток, лизированных в указанные промежутки времени после остановки трансляции циклогексимидом. (В). Диаграмма, демонстрирующая скорость распада белков ОТдт, ОТ4м и ОТ 1.14.

Таким образом, обнаружено, что появление мутаций в гене обратной транскриптазы приводит к ускорению ее деградации, что в свою очередь понижает уровень накопления обратной транскриптазы в клетке. Следует отметить, что деградация белков, определяет презентацию эпитопов на поверхности клеток. Поэтому для иммуногена, синтезирующегося в клетке при введении ДНК-вакцины, исследование характера протеолиза особенно важно. Следовательно, дальнейшей задачей было определить, какие именно клеточные протеазы осуществляют деградацию различных вариантов ОТ и тем самым определить путь представления ее эпитопов.

Изучение деградации на протеасоме обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых изолятов Ш1Ч-1

Деградация большинства внутриклеточных белков осуществляется по протеасомному пути (СНсктап ал<1 С1ес1гапоуег, 2002). Поскольку мы показали, что обратная транскриптаза локализована в цитоплазме клетки, то наиболее вероятно, что в ее протеолизе участвует именно протеасома. Для определения роли протеасомы в деградации разных вариантов ОТ в клетке использовали ингибиторы. Наиболее широко применяемый протеасомный ингибитор - Мв132. Альдегид пептида Мв 132 (СЬг-Ьеи-Ьеи-Ьеисша1, СЬг-1ХЬ-Н) - обратимый ингибитор, который эффективно подавляет активность всех протеолитических центров протеасомы. Нами было изучено накопление ОТдт, ОТ4м и ОТ1.14 в присутствии \<Ю132. Клетки НЕК293, трансфицированные

плазмидами, инкубировали с М0132 в конечной концентрации 30 |хМ в течение 6 ч. В лизатах клеток, нормированных по общему количеству белка, проанализировали содержание обратной транскриптазы иммуноблотингом с поликлональными антителами против ОТ (Рис. 3). В результате обнаружено, что при ингибировании протеасомы содержание всех изучаемых вариантов ОТ увеличивается. Зти данные свидетельствуют о том, что в деградации обратной транскриптазы как дикого, так и лекарственно-устойчивых вариантов принимает участие протеасома.

ОТдт ОТ4м ОТ1.14 МХЛ32 -+- + - +

юд^ГиГмай?:-*«^

Рис. 3. Действие ингибитора протеасомы MG132 на содержание в клетках обратной транскриптазы.

Иммуноблотинг лизатов клеток, трансфицированных плазмидами pCMVRT, pCMVRT4mut и pKCMVRT1.14 и инкубированных с 30 цМ MG132 (+) или без ингибитора (-) в течение 6 ч. На дорожки нанесено равное количество суммарного белка. ОТ выявляли специфическими поликлональными антителами.

Следует отметить, что MG132 не обладает строгой специфичностью к протеасоме и частично действует и на другие клеточные протеазы: кальпаины и катепсины (Adams et al., 1998). Поэтому следовало провести контрольный эксперимент с ингибитором, действующим только на протеасому, и протестировать ингибиторы других клеточных протеаз. Для этого мы использовали другой ингибитор протеасомной активности — эпоксомицин. Он представляет собой эпоксикетон пептида (Ac(Me)-Ile-Ile-Thr-Leu-EX) и является необратимым ингибитором, который подавляет активность только протеасомы.

Мы провели эксперимент по сравнению действия обоих ингибиторов на ОТдт и ОТ 1.14. Поскольку нами установлено, что ОТ — долгоживущий белок, то мы использовали длительное время экспозиции с ингибитором. Была выбрана продолжительность инкубации 18 ч, сопоставимая со временем полужизни наиболее медленно деградирующей ОТдт. В предварительных экспериментах подобрали оптимальные концентрации ингибиторов. В выборе концентрации MG132 и эпоксомицина, достаточных для эффективного ингибирования деградации, мы ориентировались на значения, сравнительно нетоксичные для клеток (процент гибели клеток за 18 ч инкубации составлял около 20%). По результатам этого опыта для дальнейших экспериментов были выбраны следующие концентрации ингибиторов: MG132 - 5 цМ и эпоксомицина —0.1 Ц.М.

В подобранных условиях ингибирования протеасомы МО 132 и эпоксомицином бьшо продемонстрировано увеличение содержания ОТдт и ОТ 1.14 (Рис. 4). В присутствии Мй132 содержание ОТдт увеличилось в 2,5 раза. Эпоксомицин в концентрации 0.1 рМ действовал слабее, чем МС132, увеличение содержания ОТдт было незначительным. В случае лекарственно-устойчивого варианта - ОТ1.14 эффект ингибиторов оказался более значительным. Содержание в клетках ОТ1.14 при действии МС132 увеличивалось в 4, а в случае эпоксомицина - в 2 раза.

(А)

& -Г /

(Б)

.О* у

ОТ

тубулин

ОТ1.14

тубулин

■ MGI32 □ Эпоксомицин

Рис. 4. Накопление ОТдт и ОТ1.14 в присутствии МС132 и эпоксомицина.

(А) Иммуноблотинг лизатов клеток, трансфицированных плазмидами рСМУЯТ (1) и pKCMVTi.Tl.14 (2) и инкубированных в течение 18 ч с 5 цМ М0132 или 0.1 |хМ эпоксомицином, или без ингибиторов. ОТ выявляли специфическими поликлональными антителами. Для нормирования образцов мембраны окрашивали антителами против тубулина. (Б) Содержание белков в образцах, обработанных ингибиторами, относительно содержания белка в образце без ингибитора. Стандартное отклонение указано по результатам трех независимых экспериментов.

Таким образом, было установлено, что при добавлении ингибиторов протеасомы MG132 и эпоксомицина содержание в клетке обратной транскриптазы дикого типа и лекарственно-устойчивого вариантов увеличивается. На основании этого можно заключить, что деградация ОТ в клетках осуществляется преимущественно протеасомой. Степень стабилизации обратных транскриптаз двумя ингибиторами: MG132 и эпоксомицином различалась: MG132 действовал сильнее, чем эпоксомицин. Подобный эффект может быть вызван тем, что MG132 действует не только на протеасому, но и на другие протеазы, в то время как эпоксомицин строго специфичен. Это позволяет предположить, что в деградации обратной транскриптазы наряду с протеасомой могут принимать участие и другие клеточные протеазы, например, сериновые, что согласуется с ранее опубликованными данными (Chateau et al., 2001). Следовательно, на следующем этапе работы, было необходимо установить, какие еще клеточные протеазы участвуют в

деградации обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых форм и насколько значителен их вклад.

Оценка участия различных протеаз клетки в деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1

Установление участия клеточных протеаз в деградации обратной транскриптазы было проведено с помощью различных ингибиторов. В ходе работы использовали ингибиторы: протеасомы (М0132 и эпоксомицин), закисления лизосом (хлорохин), сериновых протеаз (РМБР, апротинин и леупептин), цистеиновых протеаз (леупептин и Е64); кислых протеаз (пепстатин А) и аминопептидаз (бестатин). Трансфицированные НЕК293 клетки инкубировали с ингибиторами в течение 18 ч. Концентрации ингибиторов выбраны в соответствии с литературными данными. Содержание обратной транскриптазы в клетках проанализировали с помощью иммуноблотинга (Рис. 5). Из полученных данных следует, что наибольший эффект на накопление обратной транскриптазы дикого типа и лекарственно-устойчивого варианта оказывают только протеасомные ингибиторы. Небольшое увеличение содержания обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивого варианта наблюдалось также при использовании ингибитора сериновых протеаз — РМ8Р и цистеиновых протеаз — Е64. Добавление остальных ингибиторов на содержания обратной транскриптазы не влияло.

(А)

123456789 10

(Б)

ОТ1.14

тубулин

Рис. 5. Содержание в клетках ОТдт н ОТ1.14 при инкубации с различными ингибиторами.

Иммуноблотинг лизатов клеток, трансфицированных плазмидами рСМУЯТ (А) и pKCMVR.Tl.14 (Б) и инкубированных в течение 18 ч без ингибиторов (1) с 5 цМ МО 132 (2), 0.1 цМ эпоксомнцином (3), 100 цМ хлорохином (4), 1 мМ РМЭГ (5), 10 мкг/мл апротинина (6), 10 цМ Е64 (7), 50 мкг/мл бестатином (8), 5 цМ пепстатином А (9) или 10 мкг/мл леупептина (10). ОТ выявляли специфическими поликлональными антителами. Для нормирования образцов мембраны окрашивали антителами против тубулина.

Таким образом, бьио установлено, что в клетках почки эмбриона человека НЕК293 в деградации обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых вариантов ВИЧ-1 основную роль играет протеасома. Вклад других клеточных протеаз незначителен.

Искусственное усиление протеасомной деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1

Ген обратной транскриптазы ВИЧ-1, используемый в нашей работе, применяется для ДНК-иммунизации. ДНК-вакцинная конструкция вводится в организм и попадает в клетки, где происходит синтез закодированного в ней белка-иммуногена. На синтезированный белок развивается иммунный ответ. Для стимулирования иммунного ответа иммуноген должен быть представлен на поверхности клетки в составе главных комплексов гистосовместимости (МНС). Эпитопы, представляемые на поверхности клетки в составе комплексов с МНС класса I, образуются при деградации белка на протеасоме.

Исследования обратной транскриптазы ВИЧ-1 в культуре клеток показали, что этот белок локализован в цитоплазме клетки и деградирует преимущественно по протеасомному пути, однако утилизируется медленно, с участием не только протеасомы, но и сериновых и цистеиновых протеаз. Так как скорость и путь деградации антигена влияет на эффективность презентации пептидов, мы решили повысить сродство ОТ к протеасоме с расчетом увеличить ее презентацию в составе комплексов МНС класса I. Для деградации на протеасоме белок должен нести определенный сигнал, который узнается убиквитин-конъюгирующей системой белков, после чего белок-мишень подвергается полиубиквитинированию. Именно в таком виде большинство белков связывается протеасомой и подвергается деградации. В связи с этим необходимо присоединить к ОТ сильный сигнал деградации, создав химеру ОТ с белком, быстро деградирующим на протеасоме. В большинстве работ используются модификации белка-мишени, усиливающие направление в протеасому через узнавание убиквитин-конъюгирующей системой. Следует отметить, что это сложная регулируемая система, многие аспекты ее узнавания еще не выяснены, поэтому в нашей работе мы решили обойти этот этап. В качестве белка с сильным сигналом деградации выбрали орнитиндекарбоксилазу (ОДК) мыши. Время полужизни ОДК составляет 30 мин. Направление ОДК в протеасому не требует убиквитинирования, что может облегчить направление в протеасому химерных белков, содержащих ОДК.

Быстрая протеасомная деградация орнитиндекарбоксилазы в клетках НЕК293

Орнитиндекарбоксилазу, предложенную в качестве усилителя направления обратной транскриптазы в протеасому, протестировали в условиях нашего эксперимента. Ген орнитиндекарбоксилазы мыши (ОДК) клонировали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих рС1пео. На С-конец ОДК добавили последовательность из шести остатков гистидина для его детектирования с помощью антител против этой метки. Продукцию орнитиндекарбоксилазы (51 кДа) клетках НЕК293, трансфицированных плазмидой рОпеоООС, обнаруживали с помощью антител против 6Шэ (Рис. 6А).

(А) , 2 3 (Б) (В)

170—»............/ /

100—^ 0 20 40 60 мин / ^ /

72__ ----- ОДК ^ #

5540-

ОДК тубулин

Рис. б. Синтез н деградация орнитиндекарбоксилазы в клетках НЕК293.

(А). Иммуноблотинг лизатов клеток, трансфицированных плазмидой рОпеоООС (2) и базовым вектором рС1пео (1). В качестве контроля нанесен рекомбинантный белок ОДК (3). Блоты окрашивали антителами против ОДК. Слева указано положение белковых маркеров молекулярных масс (кДа). (Б). Иммуноблотинг клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой рОпеоООС, после добавления циклогексимида. Для нормирования образцов мембраны окрашивали антителами к тубулину. (В). Иммуноблотинг клеток НЕК293, трансфицированных плазмидами рС1пеоООС, после 18 ч инкубации с МО 132 (5 цМ), эпоксомицином (0.1 |ХМ) или без ингибиторов (-). Для нормирования образцов мембраны окрашивали антителами против тубулина.

Методом с остановкой трансляции циклогексимидом определили скорость деградации ОДК в культуре клеток. Время полужизни ОДК с шестью остатками гистидина на С-конце составило 30 мин, что совпало с определенными ранее данными из литературы (Рис. 6Б). Добавленная на С-конец метка из шести остатков гистидина на скорость деградации ОДК не повлияла.

Подавление деградации ОДК протеасомными ингибиторами определяли в тех же условиях, как описано для ОТ. Мы обнаружили, что после инкубации клеток в течение 18 ч в присутствии МО 132 содержание ОДК в них возрастало в 13 раз, а в присутствии эпоксомицина в 9 раз по сравнению с образцом, не обработанным ингибиторами (Рис. 6В). Следовательно, ОДК гораздо быстрее утилизируется на протеасоме, чем ОТ, и поэтому может усилить сродство ОТ к протеасоме при создании химерного белка.

Деградация химерного белка обратная транскриптаза-орнитиндекарбоксилаза

В первую очередь было решено усилить деградацию на протеасоме обратной транскриптазы дикого типа как более устойчивого белка, с меньшим исходным вкладом протеасомы в деградацию. Был сконструирован вектор pCMVRT-ODC, кодирующий ОТдт, на С-конец которой добавили ОДК (ОТ-ОДК). В клетках НЕК293, трансфицированных полученной плазмидой, с использованием поликлоналышх антител против ОТ обнаружили химерный белок с молекулярной массой ~ 120 кДа, соответствующей ожидаемой (Рис. 7).

(А) (Б)

1 2 3 4 5 6 7

170 —

130— ___.

100—-

72 —' ____ __ ;

40 —

Рис. 7. Сннтез белков ОТ, ОДК и ОТ-ОДК в культуре клеток IIEK293,

Иммуноблотинг лизатов клеток НЕК293 после трансфекции плазмидами: базовый вектор pCMVAb (1 и 5), pCVMRT (2), pCIneoODC (6) и pCMVRT-ODC (3); рскомбинантных белков ОТ (4) и ОДК (7). Использовали поликлональные антитела против ОТ (А) и против His6 для ОДК (Б). Слева указано положение белковых маркеров молекулярных масс (кДа).

Анализ экспрессии белка подтвержден также иммуноокрашиванием клеток. Для этого использовали поликлональные антитела против ОТ с вторичными TR1C-конъюгированными антителами и моноклональные антитела против ОДК с вторичными FITC-коъюгированными антителами. В результате показали ко-локализация сигнала окрашивания двумя антителами. Химерный белок так же как и исходные формы ОТдт и ОДК, локализован в цитоплазме клеток.

Далее в ходе работы нами была исследована скорость деградации полученного химерного белка в клетках НЕК293. Для этого использовали метод с остановкой трансляции циклогексимидом. Время полужизни ОТ-ОДК составило 3 ч, что существенно ниже, чем у ОТдт (Рис. 8).

(А)

(Б)

О 1

! от-одк

Рис. 8. Динамика деградации ОТ-ОДК в клетках НЕК293 после остановки трансляции циклогексимндом.

(А) Иммуноблотинг клеток НЕК293, трансфицированных плазмидой рСМУКТ-ООС, после добавления циклогексимида. ОТ-ОДК выявляли антителами против ОТ. Для нормирования образцов мембраны окрашивали антителами против тубулина. (Б) Диаграмма, демонстрирующая скорость распада белка ОТ-ОДК.

Проведенный эксперимент подтвердил наше предположение о том, что химерный белок ОТ-ОДК деградирует гораздо быстрее, чем ОТдт. Таким образом, в нашем случае добавление ОДК на С-конец обратной транскриптазы дикого типа привело к увеличению скорости деградации. Следует отметить, что слияние с ОДК не всегда позволяет повысить скорость деградации химерного белка. Так, из двенадцати исследованных химерных белков ускорение деградации наблюдалось только для пяти (Ма1зша1уа й а1., 2004).

В ходе анализа эффекта протеасомного ингибирования на накопление химерного белка нами обнаружено, что МС132 (5 цМ) увеличивает содержание белка ОТ-ОДК в 19 раз по сравнению с неингибированным образцом. Эпоксомицин (0.1 цМ) повышает накопление ОТ-ОДК в 11 раз (Рис. 9).

ОТ-ОДК тубулин

Рис. 9. Накопление ОТ-ОДК в присутствии ингибиторов протеасомы.

(А) Иммуноблотинг клеток НЕК293, трансфицированной плазмидой рСМУЯТ-ОИС, после 18 ч инкубации с МО 132 (5 цМ), эпоксомицином (0.1 цМ) или без ингибиторов. ОТ-ОДК выявляли антителами против ОТ. Для нормирования образов по количеству белка мембраны окрашивали антителами к тубулину. (Б) Содержание белков в образцах, обработанных ингибиторами, относительно содержания белка в образце без ингибитора.

Таким образом, при инкубации клеток в присутствии ингибиторов протеасомы стабилизация химерного белка ОТ-ОДК по сравнению с исходной ОТ увеличилась в 8-10 раз. Следовательно, при слиянии с ОДК, ОТ более эффективно направляется по протеасомному пути деградации белков.

Интересно отметить, что соотношение содержания в клетке белков ОТдт, ОДК и ОТ-ОДК при инкубации с MG132 и эпоксомицином различалось. Степень стабилизации эпоксомицином по сравнению со степенью стабилизации MG132 увеличивалась в следующем порядке: ОДК > ОТ-ОДК > ОТдт. В качестве объяснения нами были выдвинуты две гипотезы. Первая заключается в том, что, в отличие от MG132, эпоксомицин действует только на протеасому, следовательно, можно предположить, что специфическая деградация белков на протеасоме в этом ряду увеличивается. Так, доля специфичной деградации на протеасоме химерного белка ОТ-ОДК возрастает на 10% по сравнению с деградацией ОТдт. Таким образом, слияние ОТ с ОДК позволяет уменьшить долю деградации ОТ другими клеточными протеазами, не приводящую к образованию пептидов, составляющих комплексы с молекулами МНС класса I. Вторая основана на том, что действие эпоксомицина на протеасому зависит от концентрации. Эпоксомицин в концентрации 0.1 цМ подавляет активность преимущественно химотрипсин-подобного центра протеасомы, а остальные активности ингибируются менее чем на 5 %, в то время как MG132 в концентрации 5 цМ блокирует все три активности протеасомы. На этом основании можно предположить, что протеолиз ОТ осуществляется на 15% химотрипсин-подобным центром и на 85 % трипсин- и каспаза-подобными центрами. Обе гипотезы требуют дополнительных исследований.

Иммунизация мышей ДНК-вакцинными конструкциями, несущими ген обратной транскриптазы ВИЧ-1

Для оценки иммунологической эффективности полученного ДНК-иммуногена мы провели ДНК-иммунизацию мышей. Для этой цели использовали мышей линии BALB/C. Животных разделили на три группы по 12 мышей в каждой. Группы иммунизировали плазмидами: pCMVAb (базовый вектор), pCMVRT (обратная транскриптаза дикого типа) и pCMVRT-ODC (химерный белок обратная транскриптаза-орнитиндекарбоксилаза). После трехкратной иммунизации животных проводили анализ иммунного ответа. В сыворотке крови определяли содержание антител против ОТ с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Из селезенки выделяли сплепоциты и стимулировали рекомбинантным полноразмерным белком обратной транскриптазой и двумя его пептидными фрагментами. С помощью проточной цитофлуориметрии

проводили оценку величины популяции клеток, несущих маркер CD8 и синтезирующих у-интерферон. Таким образом, по титру антител оценивали В-клеточиый (гуморальный) иммунный ответ на ДНК-вакцину и по проценту CD8+/IFN-Y+ клеток— Т-клеточный иммунный ответ.

При использовании иммуноферментного анализа показано, что титры антител против ОТ у мышей, иммунизированных pCMVRT и pCMVRT-ODC, составили 1:800 и 1:1600 соответственно (Рис. 10). Таким образом, усиление направления обратной транскриптазы в протеасому с расчетом повышения клеточного иммунного ответа не привело к уменьшению гуморального ответа на обратную транскриптазу при ДНК-иммунизации.

pCMVAb —•—pCMVRT —pCMVRT-ODC

Рис. 10. Распознавание ОТ в пулах сывороток крови мышей, иммунизированных рСМУЯТ, рСМУИТ-ОВС и базовым вектором рСМУАЬ.

Конечный титр при иммунизации рСШ^Т 1:800, а рСМ\Т1Т-ООС- 1:1000.

Т-клеточный ответ характеризовали по проценту СЭ8+ Т-клеток селезенки, способных синтезировать у-интерферон в ответ на стимуляцию антигеном. Для активации спленоцитов использовали полноразмерную обратную транскриптазу и два ее пептидных фрагмента: 1ТТЕ51У1\УСКТРКР (а.о. 375-389) и КЕКУУЬА\УУРАНКСЮ (а.о. 528-543), которые являются охарактеризованными Т-клеточными эпитопами. С помощью проточной цитофлуориметрии оценивали процент С08+/1Г;Ы-у+ клеток в популяции спленоцитов иммунизированных мышей, специфически активированных ОТ или ее пептидами (Рис. 11). Индукция синтеза у-интерферона С08+ клетками в ответ на ОТ-специфичную стимуляцию наблюдалась во всех группах иммунизированных мышей, включая контрольную группу, иммунизированную базовым вектором рСМУАЬ. Однако популяция С08+ЛРЫ-у+ клеток в группах мышей, иммунизированных векторами рСМУКТ и рСМ\Т1Т-ООС, была больше чем в контрольной. Необходимо отметить, что процент С08+/1РМ-у+ клеток у мышей внутри группы сильно различался. Кроме того, в

популяции спленоцитов мышей, иммунизированных рСМУЯТ, был обнаружен высокий процент С08+/1РЫ-у+ клеток в контрольных образцах, стимулированных средой без антигена (белый столбик, Рис. 11). Вследствие этого, в группе мышей, иммунизированных рСМУЯТ, процент С08+/1РЫ-у+ клеток, наблюдаемый в ответ на стимуляцию специфическими антигенами, достоверно не отличался как от процента С08+/1РК-у+-клеток, активировавшихся в ответ на стимуляцию средой без антигена в этой группе, так и от процента С08+/1Р>1-у+ клеток, активировавшихся в ответ на стимуляцию антигенами в контрольной группе мышей, иммунизированных рСМУАЬ. Повышенный фон в группе мышей, иммунизированных рСМУЙТ, может отражать поликлональную активацию лимфоцитов в ответ на экспрессию обратной транскриптазы, поскольку у мышей может предсуществовать ответ на обратную транскриптазу ретровирусов мышей, высоко гомологичную ОТ ВИЧ-1. Достоверно более высокий процент С08+/1РМ-у+ клеток, наблюдаемый в ответ на стимуляцию ОТ-специфическими антигенами, был отмечен в группе, иммунизированной рСМУЯТ-ООС, по сравнению с процентом С08+/1П\(-у+ клеток, активировавшихся в ответ стимуляцию средой без антигена в этой группе, и также по сравнению с процентом С08+/1РМ-у+ клеток, активировавшихся в ответ на ОТ и на контрольную стимуляцию средой без антигена в группе мышей, иммунизированных базовым вектором.

pCMVAb pCMVRT pCMVRT-ODC

Рис. 11. Т-клеточный ответ у мышей, иммунизированных pCMVRT, pCMVRT-ODC и базовым вектором pCMVAb.

У мышей, иммунизированных плазмидами pCMVAb, pCMVRT и pCMVRT-ODC, определяли процент спленоцитов, экспрессирующих CD8 и INF-y маркеры после стимуляции ОТ, ее пептидами и средой без антигена (контроль).

После определения процента С08+ Т-клеток, секретиругощих НТ^-у в ответ на специфическую стимуляцию, мы проанализировали, у какого числа мышей в группе было достоверное увеличение процента СОв+ЛБЫ-у клеток при стимуляции специфическим антигеном по сравнению с контрольным антигеном, т.е. регистрировался специфический Т-клеточный ответ на иммунизацию. Для этого у каждой мыши сравнили процент С08+/1РЫ-у+ клеток, активированных ОТ и ее пептидами, с процентом С08+/1РЫ-у+ клеток в контрольном образце. Критерием наличия специфического ответа на ДНК-иммунизацию, было превышение уровня, равного среднему значению процента С08+/1Р№у+ клеток в контрольном образце группы плюс три стандартных отклонения (Рис. 12). При предложенной обработке данных мы получили, что в группе, иммунизированной рСМУЯТ, у 40% мышей имеется узнавание полноразмерной ОТ, у 30% - пептида 528-543. В группе, иммунизированной рСМУЯТ-ООС, 75% мышей специфически реагировали на ОТ, 60% - на пептид 528-543 и 40% - на пептид 375-389. В целом, ОТ или ее пептиды узнавались у 88 % мышей, иммунизированных рСМУЯТ-ООС, и у 56 % мышей, иммунизированных рСМУЯТ.

О X

X я 80

6 о

¡2 а =5 60

% X 7 X а

О 3 X к 40

й «

о 3 S 20

5 я 0

ST s

IpCMVRT

□ pCMVRT-ODC

контроль ОТ 375-389 ОТ 528-543 ОТ

Антиген, используемый для стимуляции спленоцитов

Рис. 12. Частота образованна Т-клеточного ответа на обратную транскриптазу ВИЧ-1 и ее пептиды у мышей, после иммунизации плазмидами pCMVRT и pCMVRT-ODC.

Процент мышей в группе, у которых наблюдается увеличение INFy+/CD8+ спленоцитов при in vitro стимуляции средой без добавления антигена (контроль), пептидами ОТ375-389 и ОТ528-543 и полноразмерным белком ОТ.

Установлено, что ДНК-иммунизация базовым вектором не вызывает ОТ-специфического Т-клеточного ответа. При введении полноразмерного гена обратной транскриптазы вырабатывается специфический Т-клеточный ответ на ОТ. При

иммунизации геном химерного белка этот ответ усиливается, что проявляется, в частности, большем числе респондентов в группе и в более широком спектре распознаваемых эпитопов. Таким образом, введение ДНК-иммуногена на основе гена обратной транскриптазы с увеличенной протеасомной деградацией приводит к увеличению Т-клеточного ответа на ОТ, по сравнению с немодифицированным геном.

Следует отметить, что результат создания химерных конструкций для увеличения направления в протеасому с конечной целью усиления Т-клеточного ответа, неоднозначен. Введение дестабилизирующего N-концевого остатка было использовано при создании конструкции Ub-Arg-Nef (Tobery and Siliciano, 1999), в которой на N-конце белка был встроен убиквитин. В таком положении убиквитин после синтеза гибридного белка отщепляется клеточными гидролазами, и на N-конце белка Nef остается аргинин, который, являясь дестабилизирующим остатком, усиливает деградацию. В экспериментах по иммунизации мышей была обнаружена повышенная иммуногенность этой вакцины по сравнению с вакциной, несущей немодифицированный ген белка Nef. Известен и другой способ модификации белков, кодируемых ДНК-вакциными векторами, при которой убиквитин связан с С-концом белка. В этом случае убиквитин не отщепляется и является сигналом для инициации наращивания цепи полиубиквитина. Такое изменение ускоряет протеасомную деградацию и улучшает иммуногенность вакцин, как показано для нуклеопротеина вируса лимфоцитарного хориоменингита (Rodrigues et al., 1997). Однако создание химерного белок может не ускорить деградации, а если и ускорить, то не привести к усилению иммунного ответа при ДНК-иммунизации. Так, иммуноген на основе гена белка Gag, модифицированного введением убиквитина и N-концевого дестабилизирующего остатка (Ub-Arg-Gag), не вызвал усиления иммунного ответа на Gag (Wong et al., 2004). Присоединение убиквитина на N-конец корового белка вируса гепатита С и введение дестабилизирующего N-концевого остатка ускорило деградацию белка, но не дало усиления иммунного ответа (Vidalin et al., 1999). Модификация нуклеопротеина вируса гриппа с помощью присоединения убиквитина не повлияла ни на время его полужизни, ни на индукцию Т-клеточного ответа при его введении (Fu et al., 1998). На этом фоне, созданный нами химерный белок обратной транскриптазы с орнитиндекарбоксилазой является успешным примером конструирования прототипной ДНК-вакцины, в котором ускорение деградации иммуногена на протеасоме приводит к повышению Т-клеточного ответа при ДНК-иммунизации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе получены и исследованы ДНК-иммуногены на основе гена обратной транскриптазы ВИЧ-1. В эукариотических клетках (НЕК293) нами был проанализирован синтез обратной транскриптазы ВИЧ-1 дикого типа и лекарственно-устойчивых вариантов, кодируемых ДНК-вакцинными конструкциями. В результате обнаружено, что накопление мутаций лекарственной устойчивости сопровождается снижением содержания белка в клетке. Наиболее вероятным объяснением этого является большая нестабильность мутантных белков в клетке. Для выяснения этого было необходимо исследовать деградацию различных вариантов обратной транскриптазы ВИЧ-1. Следует отметить, белковые компоненты ВИЧ-1 в этом отношении изучены мало. Так, описана деградация интегразы (Mulder and Muesing, 2000) и белка Vif (Fujita et al., 2004) на протеасоме. Данные о деградации ОТ противоречивы и недостаточны. Известно, что в экстрактах клеток периферической крови человека ОТ специфически расщепляется гигантской сериновой протеазой, а протеасома в деградации не участвует (Chateau et al., 2001). В то же время получены данные, подтверждающие, что процессинг ОТ, приводящий к представлению ее эпитопа ILKEPVHGV, зависит от активности протеасомы и не происходит в присутствии ингибиторов протеасомы (Sewell et al., 1999).

В настоящей работе была изучена деградация обратной транскриптазы ВИЧ-1 в клетке. Охарактеризованы такие параметры протеолиза ОТ в культуре клеток, как время полужизни и путь деградации. Показано, что ОТ - долгожнвущий белок, время полужизни которого в клетке составляет 18-20 ч. При наличии четырех мутаций лекарственной устойчивости время полужизни ОТ в клетке уменьшается до 6 ч, а двенадцати мутаций -до 2 ч. Таким образом, впервые было обнаружено, что накопление мутаций лекарственной устойчивости приводит к повышению скорости деградации лекарственно-устойчивых вариантов обратной транскриптазы, что объясняет их низкий уровень содержания в клетке.

С использованием различных ингибиторов проведен анализ механизма деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее лекарственно-устойчивых вариантов. Наибольшее повышение содержания белка обратной транскриптазы в клетке наблюдалось при ингибировании протеасомы. ОТ с мутациями множественной лекарственной устойчивости стабилизировалась протеасомными ингибиторами в 2 раза сильнее, чем ОТ дикого типа. По сравнению с ингибиторами протеасомы, ингибиторы других клеточных протеаз незначительно стабилизировали как дикий, так и лекарственно-устойчивые варианты ОТ. Следовательно, обратная транскриптаза ВИЧ и, еще в большей степени, ОТ с мутациями множественной лекарственной устойчивости, деградируют

преимущественно по протеасомному пути. Это может быть связано с тем, что мутации приводят к неправильной укладке молекулы белка, и такие белки являются более доступной мишенью для деградации на протеасоме.

В поиске способов борьбы с инфекционными заболеваниями в настоящий момент активно разрабатывается такой подход, как ДНК-вакцинация. Однако эффективность ДНК-вакцин, имеющихся на сегодняшний день, является сравнительно низкой, поэтому различными способами пытаются повысить их иммуногенность. Один из таких способов -генно-инженерное изменение генов, входящих в ДНК-вакцинный вектор. В результате может быть увеличено сродство к протеасоме белков, кодируемых этими генами, и, таким образом, усилена презентация вакцинного антигена по пути МНС класса I. Так удалось увеличить иммуногенность некоторых ДНК-вакцин. Однако, также известны работы, в которых подобная модификация не привела к увеличению иммунного ответа.

Конечная цель настоящей работы состояла в создании нового ДНК-иммуногена на основе гена обратной транскриптазы ВИЧ-1, искусственно направленной в протеасому для усиления ее представления по пути МНС класса I. Увеличение направления ОТ в протеасому осуществили путем слияния с орнитиндекарбоксилазой (ОДК), которая быстро деградирует на протеасоме по убиквитин-независимому механизму. В ходе работы создан химерный белок, в котором на С-конец обратной транскриптазы присоединена орнитиндекарбоксилаза мыши. В наших экспериментах было показано, что время полужизни химеры обратной транскриптазы дикого типа с орнитиндекарбоксилазой (ОТ-ОДК) уменьшается в 6 раз по сравнению с исходной формой ОТ. Используя протеасомпые ингибиторы, мы подтвердили увеличение именно протеасомнои деградации. Так, химерная форма ОТ-ОДК стабилизировалась протеасомными ингибиторами в 10 раз более эффективно, чем ОТ дикого типа. Таким образом, с помощью слияния с орнитиндекарбоксилазой был изменен путь деградации ОТ и повышено ее сродство к протеасоме. Мы предполагали, что это приведет к увеличению презентации ее эпитопов на поверхности клетки и усилению иммунного ответа на данный иммуноген, за счет увеличения Т-клеточной компоненты.

деградации, получив при этом эффективный Т-клеточный иммуноген. В дальнейшем возможны доклинические испытания сконструированных аналогичным образом химер лекарственно-устойчивой ОТ ВИЧ-1 с целью создания средств иммунотерапии и профилактики распространения лекарственно-устойчивых форм ВИЧ-1.

В заключение необходимо отметить важность изучения деградации белков для решения различных научных и прикладных задач (при работе с различными белками и создании генно-инженерных конструкций). Так, изучение скорости и пути деградации обратной транскриптазы в культуре клеток показало ее медленную протеасомную деградацию. На основании этого было сделано предположение, что обратная транскриптаза представляется на поверхности клетки в составе комплексов МНС класса I и стимулирует клеточный иммунный ответ. Иммунизация мышей геном обратной транскриптазы ВИЧ-1 показала, что этот антиген в действительности вызывает значимый Т-клеточный ответ. Следовательно, информация о пути деградации антигена может быть использована в моделировании его иммуногенных свойств. Конструкция ОТ-ОДК, созданная для повышения скорости деградации и сродства к протеасоме ОТ, была успешно использована для ДНК-иммунизации: создание химерного белка с уменьшенным временем полужизни и повышенной протеасомной деградацией усилило Т-клеточный ответ на ДНК-иммуноген. Это показывает, что успешные работы по моделированию, разработке и совершенствованию ДНК-вакцинных конструкций невозможны без широких исследований путей и скорости деградации белков в клетке.

выводы

1. Изучена деградация обратной транскриптазы дикого и двух лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1, кодируемых ДНК-вакцинными конструкциями. Обнаружено, что накопление мутаций лекарственной устойчивости в гене обратной транскриптазы ВИЧ-1 приводит к снижению ее содержания в клетке за счет уменьшения времени полужизни белка.

2. Деградацию обратной транскриптазы ВИЧ-1 дикого типа и ее лекарственно-устойчивых вариантов в клетке осуществляет преимущественно протеасома. Обратная транскриптаза ВИЧ-1 с мутациями лекарственной устойчивости имеет повышенную скорость деградации и сродство к протеасоме по сравнению с обратной транскриптазой дикого типа.

3. Присоединение орнитиндекарбоксилазы мыши на С-конец обратной транскриптазы ВИЧ-1 приводит к ускорению протеасомной деградации химерного белка по сравнению с немодифицированной обратной транскриптазой. Показано, что химерный белок деградирует в 6 раз быстрее и стабилизируется протеасомными ингибиторами в 10 раз эффективнее, чем немодифицированная обратная транскриптаза.

4. В экспериментах на мышах показан высокий уровень Т-клеточного ответа у 88% мышей, иммунизированных химерным ДНК-иммуногеном на основе обратной транскриптазы ВИЧ-1 с усиленной протеасомной деградацией, что доказывает высокую эффективность нового ДНК-иммуногена.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. M.G. Isaguliants, S.V. Belikov, E.S. Starodubova, R.Z. Gizatullin, E. Rollman, B. Zuber, A.K. Zuber, O.I. Andreeva (Grishchenko), A.S. Rytting, C.F.R., Kallander, S.N. Kochetkov, V.L. Karpov, В. Wahren. Mutations Conferring Drug Resistance Affect Eukaryotic Expression of HIV Type 1 Reverse Transcriptase. Aids Research and Human Retroviruses. 2004. V. 20, no. 2, pp.191-201.

2. E. Starodubova, A. Boberg, E.V. Kashuba, B. Wahren, V.L. Karpov, M.G. Isaguliants. HIV-1 Reverse Transcriptase Targeted for Proteasomal Degradation as a Prototype Vaccine against Drug-Resistant HIV-1. Vaccine. 2006. V. 24, no. 21, pp. 4541-4547.

3. E.C. Стародубова, А. Боберг, Б. Варен, B.JI. Карпов, М.Г. Исагулянц. Направление лекарственно-устойчивой обратной транскриптазы ВИЧ-1 на протеасомную деградацию. Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье». 2006. Т. 10, № 2, с. 34-35.

4. Е.С. Стародубова, М.Г. Исагулянц, В.Л. Карпов. Искусственное увеличение скорости утилизации обратной транскриптазы ВИЧ-1 по протеасомному пути. Молекулярная биология. 2006. Т. 40, №6, с. 983-989.

Тезисы конференций

1. E.S. Starodubova, A.S. Pazlin, V.L. Karpov, M.G. Isaguliants. Enhanced degradation of drug-resistant HIV-1 reverse transcriptase is mediated through proteasomal pathway. 13th International Symposium on HIV and Emerging Infectious Diseases, Toulon, France, 3-5 June 2004, Abstract book, p. 185.

2. E.C. Стародубова, М.Г. Исагулянц, B.JI. Карпов. Искусственное усиление протеасомной деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1. XVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Россия, 7-10 февраля 2005 г, сборник тезисов, с. 79.

3. Е.С. Стародубова, М.Г. Исагулянц, В.Л. Карпов. Роль клеточных протеаз в деградации различных форм обратной транскриптазы ВИЧ-1. 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, Россия, 18-22 апреля 2005 г. сборник тезисов, с. 54.

4. Е.С. Стародубова, Л. Чжан, М.Г. Исагулянц, В.Л. Карпов. Новый подход к конструированию ДНК-вакцин на основе изменения деградации вносимого антигена. Международная школа-конференции «Системная биология и биоинженерия». Звенигород, Россия, 28 ноября- 2 декабря 2005 г, сборник тезисов, с. 210.

5. E.S. Starodubova, R.N. Stepanenko, В. Wahren, M.G. Isaguliants, V.L. Karpov. Proteasome targeted reverse transcriptase HIV-1 generates strong T-cell response in DNA-vaccination. Eastern and European and Central Asian AIDS Conference, Moscow, Russia, 15-17 May 2006, abstract book, p. 35.

Заказ№ 219/10/06 Подписано в печать 24.10.2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 WMrw.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Стародубова, Елизавета Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Процесс деградации белков в клетке.

2. Убиквитин-протеасомная система деградации белков.

2.1. Система убиквитинирования.

2.2. Убиквитин-независимое направление белков в протеасому.

2.3. 26S протеасома.

2.3.1. 20S протеасома.

2.3.2. 19S регуляторный комплекс или РА700.

2.4. Иммунопротеасома.

2.5. Локализация протеасом в клетке.

2.6. Процессы, регулируемые убиквитин-протеасомной системой.

2.6.1. Транскрипция.

2.6.2. Регуляция клеточного цикла.

3. Роль процесса деградации белков в представлении антигена в комплексе с молекулами МНС для узнавания Т-клетками.

3.1. Представление антигенов в комплексе с МНС класса 1.

3.2. Представление антигенов в комплексе с МНС класса II.

4. ДНК-вакцины.

4.1. Развитие технологии ДНК-вакцин.

4.2. Механизм действия.

4.3. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа.

4.4. Стратегии усиления иммунного ответа на ДНК-вакцинацию.

4.5. Терапевтическое применение ДНК-вакцин.

4.6. Преимущества использования ДНК-вакцин.

5. Обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека.

5.1. Роль обратной транскриптазы в жизненном цикле ВИЧ.

5.2. Свойства обратной транскриптазы ВИЧ.

5.3. Лекарственная устойчивость обратной транскриптазы ВИЧ-1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Культивирование и хранение бактериального штамма.

2.2. Культивирование, криоконсервация и хранение клеточной линии НЕК293.

2.3. Трансфекция клеток линии НЕК 293.

2.4. Определение времени полужизни белка методом с импульсным включением метки (pulse-chase).

2.5. Определение времени полужизни белка методом с остановкой трансляции циклогексимидом и последующим иммуноблотингом (cycloheximide-chase).

2.6. Определение концентрации белка по методу Брэдфорд.

2.7. Клонирование фрагментов ДНК.

2.7.1. Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции.

2.7.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.7.3. Выделение фрагментов ДНК из геля.

2.7.4. Рестрикционный анализ ДНК.

2.7.5. Лигирование фрагментов ДНК.

2.7.6. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.7.7. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.

2.7.8. Выделение плазмидной ДНК.

2.8. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ.

2.9. Перенос белков из ПААГ на целлюлозную мембрану.

2.10. Иммуноокрашивание мембраны.

2.11. Создание генетических конструкций, использованных в работе.

2.11.9. Векторные молекулы, содержащие ген обратной транскриптазы

2.11.10. Клонирование вектора pCIneoODC.

2.11.11. Получение векторных молекул, кодирующих белок слияния ОТ-ОДК.

2.12. Флуоресцентная микроскопия эукариотических клеток.

2.13. Иммунизация мышей.

2.14. Иммуноферментный анализ антител в сыворотке крови мышей.

2.15. Выделение спленоцитов из селезенки мыши.

2.16. Анализ спленоцитов иммунизированных мышей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Экспрессия в культуре клеток обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1.

1.1. Генетические конструкции.

1.2. Содержание разных вариантов обратной транскриптазы в клетках НЕК293.

1.3. Внутриклеточная локализация обратной транскриптазы.

2. Деградация в клетках обратной транскриптазы ВИЧ-1 и ее лекарственно устойчивой формы.

2.1. Определение скорости деградации обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1 в клетках.

2.2. Изучение деградации на протеасоме обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ-1.

2.3. Оценка участия различных клеточных протеаз в деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1.

3. Искусственное усиление протеасомной деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1.

3.1. Быстрая протеасомная деградация орнитиндекарбоксилазы в клетках НЕК293.

3.2. Деградация химерного белка обратная транскриптазаорнитиндекарбоксилаза.

3.2.12. Дизайн конструкции.

3.2.13. Время полужизни.

3.2.14. Стабилизация ингибиторами протеасомы.

3.3. Иммунизация мышей ДНК-вакцинными конструкциями, несущими ген обратной транскриптазы ВИЧ-1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации"

Деградация белков - один из важнейших механизмов регуляции клеточных процессов. Известно, что большинство внутриклеточных белков разрушается на 26S протеасоме. Протеасомная деградация вовлечена в контроль таких клеточных процессов как дифференцировка, онкогенез, апоптоз, клеточный цикл, деление, репарация ДНК, реакция на стрессовые воздействия и иммунный ответ.

Важная роль протеасомы состоит в образовании эпитопов, представляемых на поверхности клеток в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I. Такие комплексы распознаются CD8+ Т-клетками, которые участвуют в образовании клеточного иммунного ответа. Именно эта функция протеасомы привлекает большое внимание исследователей, создающих вакцины нового поколения.

Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против ВИЧ весьма перспективными считаются ДНК-вакцины. В самом простом варианте ДНК-вакцина представляет собой плазмидный вектор, содержащий ген белка патогена и элементы, необходимые для транскрипции этого гена. При введении ДНК-вакцины реципиенту в клетках происходит синтез закодированного белка, который активирует иммунную систему.

Используемые на сегодняшний день ДНК-вакцины имеют сравнительно низкую иммуногенность, в связи с чем ведется разработка различных подходов по повышению их эффективности. Одним из таких молекулярно-биологических подходов является модификация генов ДНК-вакцины, направляющая кодируемый этим геном белок в протеасому. Благодаря ускорению деградации на протеасоме, возможно увеличение презентации эпитопов и повышение уровня Т-клеточного ответа. Таким путем были успешно модифицированы ДНК-вакцины, несущие антигены некоторых патогенов. До сих пор подобные исследования для обратной транскриптазы ВИЧ не проводились. Следует отметить, что наличие специфического Т-клеточного ответа на обратную транскриптазу обнаружено у пациентов с длительным периодом непрогрессирующей ВИЧ-инфекции. Поэтому повышение иммуногенности ДНК-вакцины на основе гена обратной транскриптазы как дикого, так и лекарственно-устойчивых изолятов ВИЧ представляет большой теоретический и практический интерес.

Цель и задачи исследования.

- увеличить скорость деградации обратной транскриптазы ВИЧ-1 на протеасоме;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Стародубова, Елизавета Сергеевна

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе была изучена деградация обратной транскриптазы ВИЧ-1 в клетке. Охарактеризованы такие параметры протеолиза ОТ в культуре клеток, как время полужизни и путь деградации. Показано, что ОТ -долгоживущий белок, время полужизни которого в клетке составляет 18-20 ч. При наличии четырех мутаций лекарственной устойчивости время полужизни ОТ в клетке уменьшается до 6 ч, а двенадцати мутаций - до 2 ч. Таким образом, впервые было обнаружено, что накопление мутаций лекарственной устойчивости приводит к повышению скорости деградации лекарственноустойчивых вариантов обратной транскриптазы, что объясняет их низкий уровень содержания в клетке.

В поиске способов борьбы с инфекционными заболеваниями в настоящий момент активно разрабатывается такой подход, как ДНК-вакцинация. Однако эффективность ДНК-вакцин, имеющихся на сегодняшний день, является сравнительно низкой, поэтому различными способами пытаются повысить их иммуногенность. Один из таких способов - генно-инженерное изменение генов, входящих в ДНК-вакцинный вектор. В результате может быть увеличено сродство к протеасоме белков, кодируемых этими генами, и, таким образом, усилена презентация вакцинного антигена по пути МНС класса I. Так удалось увеличить иммуногенность некоторых ДНК-вакцин. Однако, также известны работы, в которых подобная модификация не привела к увеличению иммунного ответа.

Конечная цель настоящей работы состояла в создании нового ДНК-иммуногена на основе гена обратной транскриптазы ВИЧ-1, искусственно направленной в протеасому для усиления ее представления по пути МНС класса I. Увеличение направления ОТ в протеасому осуществили путем слияния с орнитиндекарбоксилазой (ОДК), которая быстро деградирует на протеасоме по убиквитин-независимому механизму. В ходе работы создан химерный белок, в котором на С-конец обратной транскриптазы присоединена орнитиндекарбоксилаза мыши. В наших экспериментах было показано, что время полужизни химеры обратной транскриптазы дикого типа с орнитиндекарбоксилазой (ОТ-ОДК) уменьшается в 6 раз по сравнению с исходной формой ОТ. Используя протеасомные ингибиторы, мы подтвердили увеличение именно протеасомной деградации. Так, химерная форма ОТ-ОДК стабилизировалась протеасомными ингибиторами в 10 раз более эффективно, чем ОТ дикого типа. Таким образом, с помощью слияния с орнитиндекарбоксилазой был изменен путь деградации ОТ и повышено ее сродство к протеасоме. Мы предполагали, что это приведет к увеличению презентации ее эпитопов на поверхности клетки и усилению иммунного ответа на данный иммуноген, за счет увеличения Т-клеточной компоненты.

Результаты, полученные при ДНК-иммунизации мышей геном химерного белка ОТ-ОДК, подтвердили, что он действительно является эффективным Т-клеточным иммуногеном. Частота узнавания, как полноразмерной обратной транскриптазы, так и двух ее эпитопов, у мышей, иммунизированных геном химерного белка, возрастала практически в 2 раза, по сравнению с иммунизацией немодифицированным геном обратной транскриптазы. Следовательно, соединив орнитиндекарбоксилазу с обратной транскриптазой, мы направили последнюю преимущественно по протеасомному пути деградации, получив при этом эффективный Т-клеточный иммуноген. В дальнейшем возможны доклинические испытания сконструированных аналогичным образом химер лекарственно-устойчивой ОТ ВИЧ-1 с целью создания средств иммунотерапии и профилактики распространения лекарственно-устойчивых форм ВИЧ-1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стародубова, Елизавета Сергеевна, Москва

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П, Карпов B.JI. Протеасома: разрушать, чтобы жить. Молекуляр. Биология. 2002. 36, 761-776.

2. Бойченко М.Н., Воробьев А.А., Донин М.В., Козлов А.П. Некоторые подходы к разработке вакцины против ВИЧ-инфекции. Вестн. РАМН. 2004. 7,51-53.

3. Галактионов В.Г. Иммунология: Учебник. М.: Нива России, 2000. -488 е.: ил.

4. Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., Воробьев А.А. Генетические вакцины. Вестн. Рос. АМН. 2005.1,14-19.

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ Под.ред. А.А. Воробьева. М.: Медицинское информационное агенство, 2004.

6. Покхолок Д.К., Гудима С.О., Есипов Д.С., Добрынин В.Н., Мемелова JI.B., Речинский В.О., Кочетков С.Н. Изучение устойчивости вируса иммунодефицита человека к азидотимидину. Биохимия. 1994. 59, 739-747.

7. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб.-справ. Пособие.- 2-е изд., испр. И доп.- Новосибирск: Сиб.унив.изд-во, 2004.

8. Abbas А.К., Murphy К.М., Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature. 1996. 383, 787-793.

9. Adams J., Behnke M., Chen S., Cruickshank A.A., Dick L.R., Grenier L., Klunder J.M., Ma Y.T., Plamondon L., Stein R.L. Potent and selective inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. 8, 333-338

10. Aki M, Shimbara N, Takashina M, Akiyama K, Kagawa S., Timura Т., Tanahashi N., Yoshimura Т., Tanaka K., Ichihara A. Interferon-gamma induces different subunit organizations and functional diversity of proteasomes. J. Biochem. 1994. 11,5257-5269.

11. Arent C.S., Hochstasse M. Identification of the yeast 20S proteasome catalytic centers and subunit interactions required for active-site formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. 94, 7156-7161.

12. Arrogo A.P., Tanaka K., Goldberg A.L., Welch W.J. Identity of the 19S 'prosome' particle with the large multifunctional protease complex of mammalian cells (the proteasome). Nature. 1988. 331, 192-194.

13. Arts E.J., Wainberg M.A. Mechanisms of nucleoside analog antiviral activity and resistance during human immunodeficiency virus reverse transcription. Antimicrob. Agents Chemother. 1996. 40, 527-540.

14. Asher G., Lotem J., Sachs L., Kahana C., Shaul Y. Mdm-2 and ubiquitin-independent p53 proteasomal degradation regulated by NQOl. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 2002. 99,13125-13130.

15. Benaroudj N., Tarcsa E., Cascio P., Goldberg A.L. The unfolding of substrates and ubiquitin-independent protein degradation by proteasomes. Biochimie. 2001. 83,311-318.

16. Bochtler M., Ditzel L., Groll M., Hartmann C., Humber H. The proteasome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999. 28, 295-317.

17. Borg J.P., Ihlenfeldt H.G., Jung G., Haas G., Pierres M. Human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase immunodominant CD4+ T-cell epitopes: a peptide-based multyparametric assessment in the mouse. Eur. J. Immunol. 1994. 24,1496-1502.

18. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H. Selective excision of AZTMP by drug-resistant human immunodeficiency virus reverse transcriptase. J. Virol. 2001.75,4832-4842.

19. Boyle J.S., Brady J.L., Lew A.M. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction. Nature. 1998. 392,408-411

20. Braciale T.J., Morrison L.A., Sweetser M.T., Sambrook J., Gething M.J., Braciale V.L. Antigen presentation pathways to class I and class II MHC-restricted T lymphocytes. Immunol. Rev. 1987. 98, 95-114.

21. Buus S., Sette A., Colon S.M., Jenis D.M., Grey H.M. Isolation and characterization of antigen-la complexes involved in T cell recognition. Cell. 1986. 47,1071-77.

22. Calarota S., Bratt G., Nordlund S., Hinkula J., Leandersson A.C., Sandstrom E., Wahren B. Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients. Lancet. 1998.351,1320-1325.

23. Calarota S.A. and Weiner D.B. Enhancement of human immunodeficiency virus type 1-DNA vaccine potency through incorporation of T-helper 1 molecular adjuvants. Immunol. Rev. 2004.199, 84-99.

24. Chateau M.T., Robert-Hebmann V., Devaux C., Lazaro J.B., Canard В., Coux O. Human monocytes possess a serine protease activity capable of degrading HIV-1 reverse transcriptase in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. 285, 863-872.

25. Chau V, Tobias J.W., Bachmair A., Marriott D., Ecker D.J., Ganda D.K., Varshavsky A. A multiubiquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein. Science. 1989. 243,1576-1583.

26. Cid-Arregui A., Juarez V., Hausen H. A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies. J. Virol. 2003. 77,4928-4937.

27. Ciechanover A., Heller H., Katz-Etzion R., Hershko A. Activation of the heatstable polypeptide of the ATP-dependent proteolytic system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. 78, 761-765.

28. Ciechanover A., Hod Y., Hershko A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978.81,1100-1105.

29. Condon C., Watkins S.C., Celluzzi C.M., Thompson K., Falo L.D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nat. Med. 1996. 2, 11221128.

30. Conry R.M., Widera G., LoBuglio A.F., Fuller J.T., Moore S.E., Barlow D.L., Turner J., Yang N.S., Curiel D.T. Selected strategies to augment polynucleotide immunization. Gene Ther. 1996. 3, 67-74.

31. Corish P., Tyler-Smith C. Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Engineering. 1999.12,1035-1040.

32. Coux О., Tanaka K., Goldberg A.L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasome. Annu. Rev. Biochem. 1996. 65, 801-847.

33. Cresswell P. Antigen presentation. Getting peptides into MHC class II molecules. Annu. Rev. Immunol. 1994.12,259-93.

34. D'Andrea A. and Pellman D. Deubiquitinating enzymes: a new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998. 33,337-332.

35. Dahlmann B, Kopp F, Kuehn L, Niedel B, Pfeifer G, Hegerl R., Baumeister W. The multicatalytic proteinase (prosome) is ubiquitous from eukaryotes to archaebacteria. FEBS Lett. 1989. 25,125-31

36. Dalpke A., Zimmermann S., Heeg K. Immunopharmacology of CpG DNA. Biol. Chem. 2002.383,1491-1500.

37. De Clercq E. HIV resistance to reverse transcriptase inhibitors. Biochem. Pharmacol. 1994.47,155-169.

38. De Clercq E. Antiviral therapy for human immunodeficiency virus infections. Clin. Microbiol. Rev. 1995. 8, 200-239.

39. De Duve C. Lysosomes revisited. Eur. J. Biochem. 1983. 137, 391-397.

40. De Duve C., Gianetto R., Appelmans F., Wattiaux R. Enzymic content of the mitochondria fraction. Nature. 1953. 172,1143-1144.

41. Dell'Angelica E.C., Mullins С., Caplan S., Bonifacino J.S. Lysosome related organelles. FASEB J. 2000. 14,1265-1278.

42. DeMartino G.N. and Slaughter C.A. The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms. J. Biol. Chem. 1999. 274, 22123-22126.

43. DeMartino G.N. and Goldberg A.L. Identification and partial purification of an ATP-stimulated alkaline protease in rat liver. J. Biol. Chem. 1979. 25, 4371243755.

44. Ding J., Das K., Moereels H., Koymans L., Andries K., Janssen P.A., Hughes S.H., Arnold E. Structure of HIV-1 RT/TIBO R 86183 reveals similarity in the binding of diverse nonnucleoside inhibitors. Nat. Struct. Biol. 1995. 2,407-415.

45. Donnelly J. J., Ulmer J.B., Liu M.A. DNA vaccines. Life Sci. 1997. 60, 163172.

46. Donnelly J.J., Wahren В., Liu M.A. DNA vaccines: progress and challenges. J. Immunol. 2005. 175, 633-639.

47. Doublie S., Sawaya M.R., Ellenberger T. An open and closed case for all polymerases. Structure. 1999. 7, 2-7.

48. Drabick J.J., Glasspool-Malone J., King A., Malone R.W. Cutaneous transfection and immune responses to intradermal nucleic acid vaccination are significantly enhanced by in vivo electropermeabilization. Mol. Ther. 2001. 3, 249-255.

49. Dubiel W., Pratt G., Ferrell K., Rechsteiner M. Purification of a 1 IS regulator of the multicatalytic proteinase. J. Biol. Chem. 1994. 267, 22369-22377.

50. Dunn W.A. Autophagy and related mechanisms of lysosome mediated protein degradation. Trends Cell. Biol. 1992. 4,139-143.

51. Esnouf R., Ren J., Ross C., Jones Y., Stammers D., Stuart D. Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by non-nucleoside inhibitors. Nat. Struct. Biol. 1995.2,303-308.

52. Ferrell K., Wilkinson C.R., Dubiel W., Gordon C. Regulatory subunit interactions of the 26S proteasome, a complex problem. Trends Biochem. Sci. 2000. 25, 83-88.

53. Frankel A.D., and Young J.A. HIV-1: Fifteen Proteins and an RNA. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67,1-25.

54. Fujita M., Akari H., Sakurai A., Yoshida A., Chiba Т., Tanaka K., Strebel K., Adachi A. Expression of HIV-1 accessory protein Vif is controlled uniquely to be low and optimal by proteasome degradation. Microbes Infect. 2004. 6, 791798.

55. Gianetto R., de Duve C. Tissue fractionation studies 4. Comparative study of the binding of acid phosphatase, (3-glucoronidase and cathepsin by rat liver particles. Biochem. J. 1955. 59,433^38.

56. Glickman M.H. and Adir N. The proteasome and the delicate balance between destruction and rescue. Plos. Boilogy. 2004.2,25-27

57. Glickman M.N. and Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction. Physiol.Rev. 2002. 82, 373428.

58. Goff S. P. Retroviral reverse transcriptase: synthesis, structure, and function. J. Acq. Imm. Def. Syndromes. 1990. 3, 817-831.

59. Gregoriadis G., Bacon A., Caparros-Wanderley W., McCormack B. A role for liposomes in genetic vaccination. Vaccine. 2002.20,1-9.

60. Groettrup M., Ruppert Т., Kuehn L., Seeger M., Standera S., Koszinovski U., Kloetzel P.M. The interferon-y-inducible 11S regulator (PA28) and126

61. P2/LMP7 subunits govern the peptide production by the 20S proteasome in vitro. J.Biol.Chem. 1995. 270, 23808-23815.

62. Groll M., Ditzel L., Lfwe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 1997. 386, 463-471.

63. Guermonprez P. and Amigorena S. Pathways for antigen cross presentation. Springer Semin. Immun. 2005. 26, 257-271.

64. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application and optimization. Annu. Rev. Immunol. 2000. 18, 927-974.

65. Harouse J.M., Gettie A., Tan R.C., Blanchard J., Cheng-Mayer C. 1999. Distinct pathogenic sequela in rhesus macaques infected with CCR5 or CXCR4 utilizing SHIVs. Science 284, 816-819.

66. Harrigan P.R., Bloor S., and Larder B.A. Relative replicative fitness of zidovudine-resistant HIV-1 isolates in vitro. J. Virol. 1998. 72, 3773-3778.

67. Hayashi S., Muracami Y., Matsufuji S. Ornithine decarboxylase antizyme: a novel type of regulatory protein. TIBS. 1996. 21,27-30.

68. Heemels M.T. and Ploegh H. Gereration, translocation and presentation of MHC class I-restricted peptides. Annu. Rev. Biochem. 1995. 64,463-491

69. Hendil K.B., Khan S., Tanaka K. Simultaneous binding of PA28 and PA700 activators to 20S proteasomes. Biochem. J. 1998. 332, 749-754.

70. Henell F., Berkenstam A., Ahlberg J., Glaumann H. Degradation of short- and long-lived proteins in perfused liver and in isolated autophagic vacuoles-lysosomes. Exp. Mol. Pathol. 1987. 46, 1-14.

71. Hershko A. and Ciechanover A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 1998. 67, 425-479.

72. Hershko A., Heller H., Elias S., Ciechanover A. Components of ubiquitin-protein ligase system: resolution, affinity purification and role in protein breakdown. J. Biol. Chem. 1983. 258, 8206-8214.

73. Hershko A., Leshinsky E., Ganoth D. Heller H. ATPdependent degradation of ubiquitin-protein conjugates. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984. 81,1619-1623.

74. Hilt W., Wolf D.H. Proteasomes of the yeast S.cerevisiae: genes, structure and functions. Mol. Biol. Rep. 1995. 21, 3-10.

75. Hirch C. and Ploegh H.L. Intracellular targeting of the proteasome. Trends. Cell. Biol. 1997. 10,268-271.

76. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. Ubiquitin-lysozyme conjugates. Identification and characterization of an ATP-dependent protease from rabbit reticulocyte lysates. J. Biol. Chem. 1986. 261,2400-2408.

77. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 1987. 262, 8303-8313.

78. Huang H., Chopra R., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. Science. 1998. 282, 1669-1675.

79. Huibregtse J., King R.W., Deshaies R.J., Peters, J.M., Kirschner M.W. How proteolysis drives the cell cycle. Science. 1996. 274, 1652-1659.

80. Hung C.F. and Wu T.C. Improving DNA vaccine potency via modification of professional antigen presenting cells. Curr. Opin. Mol. Ther. 2003. 5,20-24.

81. Hung C.F., Hsu K.F., Cheng W.F., Chai C.Y., He L., Ling M., Wu T.C. Enhancement of DNA vaccine potency by linkage of antigen gene to a gene encoding the extracellular domain of Fms-like tyrosine kinase 3-ligand. Cancer Res. 2001.61,1080-1088

82. Irvine K.R., Rao J.B., Rosenberg S.A., Restifo N.P. Cytokine enhancement of DNA immunization leads to effective treatment of established pulmonary metastases. J. Immunol. 1996. 156,238-245.

83. Isaguliants M.G., Pokrovskaya K., Kashuba V.I., Pokholok D., Hinkula J., Wahren В., Kochetkov S.N. Eukaryotic expression of enzymatically active human immunodeciency virus type 1 reverse transcriptase. FEBS Lett. 1999. 447, 232-236.

84. Jariel-Encontre I., Pariat M., Martin F., Carillo S., Salvat C., Piechaczyk M. Ubiquitinylation is not an absolute requirement for degradation of c-Jun protein by the 26 S proteasomeJ. Biol. Chem. 1995. 270,11623-11627.

85. Jonckheere H., Anne J., De Clercq E. The HIV-1 reverse transcription (RT) process as target for RT inhibitors. Med. Res. Rev. 2000. 20, 129-54.

86. Kim J.J., Yang J.S., Dang K., Manson K.H., Weiner D.B. Engineering enhancement of immune responses to DNA-based vaccines in a prostate cancer model in rhesus macaques through the use of cytokine adjuvants. Clin. Cancer Res. 2001.7, 882-889.

87. Kim J.J., Yang J.S., Dentchev Т., Dang K., Weiner D.B. Chemokine gene adjuvants can modulate immune responses induced by DNA vaccines. J. Interferon Cytokine Res. 2000. 20,487-498.

88. Kisselev A.F. and Goldberg A.L. Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates. Chem. Biol. 2001. 8, 739-758.

89. Kloetzel P.M. Antigen processing by the proteasome. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001.2, 179-188.

90. Knowlton J.R., Johnston S.C., Whitby F.G., Realini C., Zhang Z., Rechsteiner M., Hill C.P. Structure of the proteasome activator REG(PA28). Nature. 1997. 390, 639-643.

91. Kohlstaedt L.A., Wang J., Friedman J.M., Rice P.A., Steitz T.A. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. Science. 1992. 256,1783-1790.

92. Lee A.H., Suh Y.S., Sung Y.C. DNA inoculations with HIV-1 recombinant genomes that express cytokine genes enhance HIV-1 specific immune responses. Vaccine. 1999. 17,473^179.

93. Lee S.Y., Rasheed S., A simple procedure for maximum yield of hight-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990. 9, 676-679.

94. Leifert J.A., Rodriguez-Carreno M.P., Rodriguez F., Whitton J.L. Targeting plasmid-encoded proteins to the antigen presentation pathways. Immunol. Rev. 2004. 199,40-53.

95. Lin L., DeMartino G.N., Greene W.C. Cotranslational biogenesis of NF-kappaB p50 by 26S proteasome. Cell. 1998. 92, 819-828.

96. Ma C.P., Slaugther C.A., DeMartino G.N. Identification, purification and characterisation of a protein activator (PA28) of the 20S proteasome (macropain). J. Biol. Chem. 1992. 267,10515-10523.

97. MacGregor R.R., Ginsberg R., Ugen K.E., Baine Y., Kang C.U., Tu X.M., Higgins Т., Weiner D.B., Boyer J.D. T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev. AIDS. 2002. 16, 2137-2143.

98. Mayer R.J. The meteoric rise of regulated intracellular proteolysis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000. 1,145-149.

99. Meng L., Mohan R., Kwok B.H., Elofsson m., Sin N., Crews G.M. Epoxomicin, a potent and selective proteasome inhibitor, exhibits in vivo antiinflamatory activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96, 10403-10408.

100. Meriin A.B., Gabai V.L., Yaglom J., Shifrin V.I., Sherman M.Y. Proteasome inhibitors activate stress kinases and induce Hsp72. J. Biol. Chem. 1998. 273, 6373-6379.

101. Miller V, Larder В A. Mutational patterns in the HIV genome and cross-resistance following nucleoside and nucleotide analogue drug exposure. Antivir Ther. 2001.6, 2544.

102. Mo, X.Y., Cascio P., Lemerise K., Goldberg A.L., Rock K. Distinct proteolytic processes generate the С and N-termini of the MHC class I-binding peptides. J. Immunol. 1999. 163, 5851-5859.

103. Momburg F., Hammerling G.J. Generation and TAP-mediated transport of peptides for major histocompatibility complex class I molecules. Adv. Immunol. 1998. 68,191-256.

104. Mulder L.C. and Muesing M.A. Degradation of HIV-1 integrase by the N-end rule pathway. J. Biol. Chem. 2000. 275,29749-29753.

105. Murakami Y., Matsufiiji S., Hayashi S., Tanahashi N., Tanaka K. Degradation of ornithine decarboxylase by the 26S proteasome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. 267, 1-6.

106. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji Т., Hayashi S., Igarashi K., Tamura Т., Tanaka K., Ichihara A. Ornithine decarboxylase is degraded by the 26 S proteasome without ubiquitination. Nature. 1992. 360, 597-599.

107. Muratani M. and Tansey W.P. How the ubiquitin-proteasome system controls transcription. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. 4, 1-10.

108. Musial A., Eissa N.T. Inducible nitric-oxide syntase is regulated by the protesome degradation pathway. J. Biol. Chem. 2001. 276, 24268-24273.

109. Neefles J.J., Schumacher N., Ploegh H.L. Assembly and intracellular transport of major histocompatibility complex molecules. Curr. Opin. Cell. Biol. 1991. 3, 601-609.

110. Negroni M., and Buc H. Mechanisms of retroviral recombination. Annu. Rev. Genet. 2001.35,275-302.

111. Nijhuis M, Deeks S, Boucher C. Implications of antiretroviral resistance on viral fitness. Curr. Opin. Infect. Dis. 2001. 14, 23-28.

112. O'Hagan D. Т., Singh M., Ulmer J.B. Microparticles for the delivery of DNA vaccines. Immunol. Rev. 2004. 199, 191-200.

113. Orlowski M. The multicatalitic proteinase complex. A major extralysosomal proteolytic system. Biochemistry. 1990.29, 10289-10297.

114. Orlowski M. and Wilk S. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome. Arh. Biochem. Bioph. 2003. 415, 1-5.

115. Ortega J., Heymann J.B., Kajava A.V., Ustrell V., Rechsteiner M. and Steven A.C. The axial channel of the 20S proteasome opens upon binding of the PA200 activator. J. Mol. Biol. 2005. 346, 1221-1227.

116. Ortiz-Navarrete V., Seelig A., Gernold M., Frentzel S., Kloetzel P.M., Hammerling G.J. Subunit of the '20S' proteasome (multicatalytic proteinase) encoded by the major histocompatibility complex. Nature. 1991. 353, 662-664

117. Parniak, M. A. and Sluis-Cremer N. Inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Adv. Pharmacol. 2000. 49, 67-109.

118. Paster W., Zehetner M., Kalat M., Schuller S., Schweighoffer T. In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+ T-cell responses. Gene Ther. 2003. 10,717-724

119. Piccinini M., Mostert M., Rinaudo M.T. Proteasomes as drug targets. Curr. Drug Target, 2003. 4, 657-671.

120. Pickart C.M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu. Rev. Biochem. 2001.70, 503-533.

121. Pickart C.M. and Cohen R.E. Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2004. 5,177-187.

122. Porgador A., Irvine K.R., Iwasaki A., Barber B.H., Restifo N.P., Germain R.N. Predominant role for directly transfected dendritic cells in antigen presentation to CD8+ T cells after gene gun immunization. J. Exp. Med. 1998. 188, 10751082.

123. Princiotta M.F., Finzi D., Qian S.B., Gibbs J., Bennink J.R., Yewdell W. Quantitating protein synthesis, degradation, and endogenous antigen processing. Immunity. 2003. 18,343-354.

124. Rajapurohitam V., Morales C.R., El-Alfy M., Lefrancois S. Bedard N., Wing S.S. Activation of a UBC4-dependent pathway of ubiquitin conjugation during postnatal development of the rat testis. Dev. Biol. 1999. 212, 217-28.

125. Rammensee H.G., Friede Т., Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics. 1995. 41,178-228.

126. Reits E.A., Benham A.M., Plougastel В., Neefjes J., Trowsdale T. Dynamics of proteasome distribution in living cells. EMBO J. 1997. 169, 6087-6094.

127. Reyes-Sandoval A. and Ertl H.C. DNA vaccines. Curr. Mol. Med. 2001. 1, 217243.

128. Rice J., Buchan S., Stevenson F.K. Critical components of a DNA fusion vaccine able to induce protective cytotoxic T cells against a single epitope of a tumor antigen. J. Immunol. 2002. 169, 3908-3918.

129. Rivett A.J. Proteasomes: multicatalytic proteinase complexes. Biochem. J. 1993. 291,1-10.

130. Rock K.L. and Goldberg A.L. Degradation off cell proteins and the generation of MHC class I presented peptides. Annu. Rev. Immunol. 1999. 17, 739-779.

131. Rock K.L., Gramm C., Rothstein L., Clark K., Stein R., Dick L., Hwang D., Goldberg A.L. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 1994. 78,761-771

132. Rodrigues F., Zhang J., Whitton J.L. DNA immunization: ubiquitination of a viral protein enhances CTL induction, and antiviral protection, but abrogates antibody induction. J. Virol. 1997. 71, 8497-8503.

133. Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science. 1986. 234, 364-368.

134. Rosenberg-Hasson Y., Bercovich Z., Ciechanover A., Kahana C. Degradation of ornithine decarboxylase in mammalian cells is ATP dependent but ubiquitin independent. Eur. J. Biochem. 1989. 185, 469-474.

135. Sallusto, F., Lanzavecchia, A., and Mackay, C.R. Chemokines and chemokine receptors in T cell priming and Thl/Th2-mediated responses. Immunol. Today. 1998. 19, 568-574.

136. Sarafianos S.G., Das K., Hughes S.H., Arnold E. Taking aim at a moving target: designing drugs to inhibit drug-resistant HIV-1 reverse transcriptases. Curr. Opin. Struct. Biol. 2004.14, 716-730.

137. Schlessinger D.H., Goldstein G., Niall H.D. The complete amino acid sequence of ubiquitin, an adenylate cyclase stimulating polypeptide probably universal in living cells. Biochemistry. 1975. 14, 2214-2218.

138. Schmidtke G., Schmidt M., Kloetzel P.M. Maturation of mammalian 20S proteasome: purification and characterization of 13S and 16S proteasome precursor complexes. J. Mol. Biol. 1997. 286, 95-106.

139. Schwartz A.L. and Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway and pathogenesis of human diseases. Annu. Rev. Med. 1999. 50, 57-74.

140. Sewell A.K., Price D.A., Teisserenc H., Booth B.L. Jr, Gileadi U., Flavin F.M., Trowsdale J., Phillips R.E., Cerundolo V. IFN-gamma exposes a cryptic135cytotoxic T lymphocyte epitope in HIV-1 reverse transcriptase. J. Immunol. 1999. 162, 7075-7079.

141. Shaw D.R. and Strong T.V. DNA vaccines for cancer. Frontiers in Bioscience. 2006. 11,1189-1198.

142. Sheaff R.J., Singer J.D., Swanger J., Smitherman M., Roberts J.M., Clurman B.E. Proteasomal turnover of p21Cipl does not require p21Cipl ubiquitination. Mol. Cell. 2000. 5,403-410.

143. Shulman N, Winters M. A review of HIV-1 resistance to the nucleoside and nucleotide inhibitors. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2003. 3,273-281.

144. Singh M., Briones M., Ott G., O'Hagan D. Cationic microparticles: a potent delivery system for DNA vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97, 811816

145. Spence R.A., Kati W.M., Anderson K.S., Johnson K.A. Mechanism of inhibition of HIV-1 reverse transcriptase by nonnucleoside inhibitors. Science. 1995. 267, 988-993.

146. Spetz A.L., Sorensen A.S., Walther-Jallow L., Wahren В., Andersson J., Holmgren L., Hinkula J. Induction of HIV-1-specific immunity after vaccination with apoptotic HIV-l/murine leukemia virus-infected cells. J. Immunol. 2002. 169, 5771-5779.

147. Stohwasser R., Salzmann U., Giesebrecht J., Kloetzel P.M., Holzhutter H.G. Kinetic evidences for facilitation of peptide channelling by the proteasome activator PA28. Eur. J. Biochem. 2000. 276, 6221-6239.

148. Stuart L.M. and Ezekowitz R.A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 2005. 22, 539-550.

149. Svarovskaia E.S., Cheslock S.R., Zhang W.H., Hu W.S., Pathak V.K. Retroviral mutation rates and reverse transcriptase fidelity. Front. Biosci. 2003. 8,117-134.

150. Tanahashi, N., muracami Y., Minami Y., Shimbara N., Hendil K.B. Tanaka K. Hybrid proteasomes: Induction by interferon-y and contribution to ATP-dependent proteolysis. J. Biol. Chem. 2000. 275,14336-14345.

151. Tanaka K, Yoshimura T, Tamura T, Fujiwara T, Kumatori A, Ichihara A. Possible mechanism of nuclear translocation of proteasomes. FEBS Lett. 1990. 271,41-46.

152. Tanaka K. Molecular biology of the proteasome. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998.247, 537-541.

153. Tarcsa E., Szymanska G., Lecker S., O'Connor C.M., Goldberg A.L. Ca2+-free calmodulin and calmodulin damaged by in vitro aging are selectively degraded by 26S proteasomes without ubiquitination. J. Biol. Chem. 2000. 275, 2029520301.

154. Telesnitsky A. and Goff S. P. Reverse transcriptase and the generation of retroviral DNA. In Retroviruses (Coffin, J. M., Hughes, S. H., and Varmus, H. E., Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1997. 121-160.

155. Tobery Т., Siliciano R.F. Cutting edge: induction of enhanced CTL-dependent protective immunity in vivo by N-end rule targeting of a model tumor antigen. J. Immunol. 1999. 162, 639-642.

156. Townsend A., Ohlen C., Bastin J., Ljunggren H-G., Foster L., Karre K. Association of class I major histocompatibility heavy and light chainsinduced by viral peptides. Nature. 1989. 340,443-448.

157. Turner B.G. and Summers M.F. Structural biology of HIV. J. Mol. Biol. 1999. 285, 1-32.

158. Ulmer J.B., Donnelly J.J., Parker S.E., Rhodes G.H., Feigner P.L., Dwarki V.J., Gromkowski S.H., Deck R.R., DeWitt C.M., Friedman A. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science. 1993. 259,1745-1749.

159. Unanue E.R. Cellular studies on antigen presentation by class II MHC molecules. Curr. Opin. Immunol. 1992. 4, 63-69.

160. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G., Rechsteiner M. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair. EMBO J. 2002. 21, 3516-3525

161. Wahren B. and Liu M. Therapeutic vaccination against HIV. Expert. Rev. Vaccines. 2004.3,179-188.

162. Walz J., Redmann A., Kania M., Турке D., Koster A.J., Baumeister W. 26S proteasome structure revealed by the three-dementional electron microscopy. J. Struc. Biol., 1998. 121, 19-29.

163. Veazey R.S., Marx P.A., Lackner A.A. The mucosal immune system: primary target for HIV infection and AIDS. Trends Immunol. 2001. 22, 626-633.

164. Weissman A.M. Themes and variations on ubiquitylation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001.2, 169-179.

165. Whitcomb J.M., and Hughes S.H. retroviral reverse transcription and integration: progress and problems. Annu. Rev. Cell Biol. 1992. 8,275-306.

166. Wilkinson K.D. Regulation of ubiquitin-dependent processes by deubiquitinating enzymes. FASEB J. 1997. 11, 1245-1256.

167. Wilkinson K.D. Ubiquitin: a Nobel protein. Cell. 2004. 119,741-745.

168. Wilkinson K.D., Urban M.K., Haas A.L. Ubiquitin is the ATP-dependent proteolysis factor I of rabbit reticulocytes. J. Biol. Chem. 1980. 255, 7529-7532.138

169. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu. Rev. Biochem. 1999. 68,1015-1068.

170. Wojcik C. Regulation of apoptosis by the ubiquitin and proteasome pathway. J. Cell. Mol. Med. 2002. 6,25-48.

171. Wojcik C. and DeMartino G.N. Intracellular localization of proteasomes; Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2003. 35, 579-589

172. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A., Feigner P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 1990. 247, 1465-1468.

173. Wong S.B., Buck C.B., Shen X., Siliciano R.F. An evaluation of enforced rapid proteasomal degradation as a means of enhancing vaccine-induced CTL responses. J. Immunol. 2004. 173, 3073-3083.

174. Wu H., Chi K., Lin W. Proteasome inhibitors stimulate activator protein-1 pathway via reactive oxygen species production. FEBS Lett. 2002. 526, 101105.

175. Wu Y., Kipps T.J. Desoxyribonucleic acid vaccines encoding antigens with rapid proteasome-dependent degradation are highly efficient inducers of cytolytic T lymphocytes. J. Immunol. 1997. 159, 6037-6043.

176. Xiang R., Lode H.N., Chao Т.Н., Ruehlmann J.M., Dolman C.S., Rodriguez F., Whitton J.L., Overwijk W.W., Restifo N.P., Reisfeld R.A. An autologous oral DNA vaccine protects against murine melanoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97, 5492-5497.

177. Yang Y., Waters J.B., Fruh K., Peterson P.A. Proteasomes are regulated by interferon gamma: implications for antigen processing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. 89,4928-4932.

178. Yewdell J., Anton L.C., Bacik I., Schubert U., Snyder H.L., Bennink J.R. Generating MHC class I ligands from viral gene products. Immunol. Rev. 1999. 172, 97-108.

179. Yewdell J.W. and Belmink J.R. Cell biology of antigen processing and presentation to major histocompatibility complex class I molecule-restricted T lymphocytes. Adv. Itmmmol. 1992. 52,1-123.

180. Yoshimura T, Kameyama K, Takagi T, Ikai A, Tokunaga F, Koide Т., Tanahashi N., Cejka Z., Baumeister W. Molecular characterization of the "26S" proteasome complex from rat liver. J. Struct. Biol. 1993. 111, 200-211.

181. Zacksenhaus E. and Sheinin R. Molecular cloning, primary structure and expression of the human X linked A1S9 gene cDNA which complements the ts A1S9 mouse L cell defect in DNA replication. EMBO J. 1990. 9,2923-2929.

182. Zhang M., MacDonald A.I., Hoyt M.A., Coffino P. Proteasome begins ornithine decarboxylase digestion at the С terminus. J. Biol. Chem. 2004. 279, 2095920965.

183. Zhang M., Pickart C.M., Coffino P. Determinants of proteasome recognition of ornithine decarboxylase, a ubiquitin-independent substrate. EMBO J. 2003. 22, 1489-1496.

184. Zhou P. Determining protein half-lives. Methods Mol. Biol. 2004. 284, 67-77.

185. Zhou P. Targeted protein degradation. Curr. Opin. Chem. Biol. 2005. 9, 51-55.1. БЛАГОДАРНОСТИ

186. Выражаю благодарность заведующему лабораторией доктору биологических наук, профессору B.C. Прасолову и сотрудникам Д.С. Иванову и М.С. Ростовской за ценные советы и помощь в экспериментальной работе.

187. А также благодарю коллектив группы химии вирусных белков и нуклеиновых кислот отдела общей вирусологии ГУ Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

188. Благодарю за сотрудничество проф. Б.Варен и всех сотрудников группы Шведского Института Контроля инфекционных заболеваний (Стокгольм, Швеция).

Информация о работе

Стародубова, Елизавета Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы