Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная структура токсина OSK1 и дизайн универсального блокатора К-каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пространственная структура токсина OSK1 и дизайн универсального блокатора К-каналов"

V ^МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

- " ОБРАЗОВАНИЯ РФ

^ МОСКОВСК1Н'! ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

^ Жярашш Виктор Александрович

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ТОКСИНА ОЯК1 II ДИЗАЙН УНИВЕРСАЛЬНОГО БЛОКАТОРА КМСАИАЛОН

Специальность 03.fl0.02 Биофизика

Автореферат диссертации на соискание учено» степени кандидата фтнко-мптсматнчесхих паук

Москва 1997

Работа выполнена в Группе ядерного магнитного резонанса Института биоорганическон химии М,М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор ' A.C. Арсеньев Официальные оппоненты:

доктор биологических Ьаук, вед.ц.с. В.Н. Бушуев fc.f-*- •

доктор химических наук, профессор ¡O.K. Гришин

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А.Энгельгардта РАЙ

Защита состоится "7' 1997 г. в . часов на заседании

Специализированного сонета Московском физико-

техническом институте по адресу: 141700 г. Долгопрудный Московской , области, Институтский переулок, 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского физико-технического института.

7/ /0<у

Автореферат разослан" и ' 1997 г.

Ученый секретарь I пгциилизировшшого совета (¿_„<J>. М . IX t

Ь.Е. КU. f!

Актуальность проблемы.

Одно из центральных мест з современной биофизике занимает исследование К+-каналов, присутствующих в клеточных мембранах большинства организмов. Поскольку токсины скорпиона являются специфическими ингибиторами К+-каналов, то они используются в качестве инструмента для их изучения. Причем исследования проводятся как на хорошо изученных белках, так и на недавно обнаруженных. Токсины скорпиона используются для изучения двух типов К+-каналов: потенциал-зависимых н -Са2+-зависимых. Особый интерес представляет выяснение механизма специфичности действия токсинов скорпиона на различные К*-каналы. Необходимой основой для этих исследований является установление" пространственной структуры токсинов и анализ их структурно-функциональных взаимосвязей.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось 1) установление пространственной структуры токсина ОБКЛ из яда скорпиона ОпЬосЫшя БСГоЫЫозиз методом 'Н-ЯМР, 2) изучение структурно-функциональных особенностей ОБК1 и коротких токсинов семейства скорпиона и 3) проектирование пространственной структуры "универсального" блокатора К+-каналов.

■ Научная новтиа и практическая ценность работы.

В данной работе впервые получена пространственная структура токсина ОБКЛ в водном растворе, используя данные 'Н-ЯМР экспериментов и метод дистанционного геометрического алгоритма. Анализ вторичной структуры токсина показал, что он имеет аУр-тип укладки полипептидной цепи в пространстве. Кроме того выявлен ряд существенных деталей пространственной структуры ОБК1, таких как солевой мостик в га-спирали, М- и С-концевые "шапочки", конформационная дисперсия в дисульфидных связях, подвижность (5-поворота и некоторых боковых цепей. Показана корреляция участия аминокислотного остатка в связывании с рецептором и его подвижностью. Полученные результаты позволяют лучше понять связь структуры и функции токсинов скорпиона. .

Впервые для идентификации структурных и функциональных остатков токсинов семейства скорпиона применен метод МГП. Кроме того получена наиболее устойчивая к мутациям аминокислотная последовательность иТХ, обеспечивающая привнесение в его пространственную структуру наиболее сильных взаимодействий (как стабилизирующих так и функциональных) из присутствующих в семействе токсинов скорпиона. Разработанные подходы позволяют синтезировать

токсин UTX, более стабильный и с более широким спектром действия на К+-каналы по сравнению с природными гомологами.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на 4-м бсесоюзном семинаре но .ЯМР-спектроскошш, посвященном памяти В.Ф. Быстрова, Москва, декабрь 1995 г.; 13-й Европейской Конференции "Экспериментальный ЯМР", Париж, Франция, май 1996 г.; 3-х Чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, ноябрь 1996 г.; 9-й Зимней студенческой научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, февраль 1997 г.

Структура диссертации.

•Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 35 рисунков и состоит из введения, грех глав, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 146 наименовании. В конце диссертации приведены табличные данные и сокращения.

Псиользоианпые сокращении.

PDB (Protein Data Dank) - Брукхэйвенский банк белковых структур; OSK1 - токсин скорпиона Orthochirus scrubkulvsus ; UTX - "универсальный" токсин скорпиона; SXM - ноксиустоксин; ChTX - харибдотоксин; М»ТХ -марготоксин; AgTX - апютоксин; КТХ - калнотоксин; K.V - потенциал-зависимые К+-каналы; ВК (или maxi).- Са2+-зависимые К+-каналы высокой проводимости; DQF-COSY - корреляционная, спектроскопия с двухквантовым фильтром; TOCSY - тотальная корреляционная спектроскопия; ЯЭО (МОЕ) '- ядерный эффект Овехаузера; NOESY -двумерная спектроскопия ЯЭО; r.m.s.d. - средне-квадратичное отклонение; МГП - молекулярный гидрофобный потенциал; F SC - коэффициент соответствия гндрофобности остатка его окружению.

СОДЕРЖАНИЕ РЛСО ГЬ!

-В первой главе, являющейся литературным обзором, рассмотрены работы, посвященные коротким токсинам скорпиона, КЛканалам н термодинамическим аспектам образования комплекса лиганд-рецептор. Во второй главе- диссертации' изложено отнесение химических сдвигов сигналов протонов в спектрах ЯМР токсина OSK1 и результаты расчета его пространственной структуры. Третья глава посвящена новому методу рационального проектирования "универсального" токсина скорпиона с более широким спектром действия на К+-каналы-и более стабильной a/ß-укладкой по сравнению с природными гомологами. В экспериментальной части приведены сведения об используемых в диссертационной работе

оборудовании, методах получения и обработки спектров 'Н-ЯМР, а также основные определения и формулы, применявшиеся при рациональном проектировании "универсального" токсина скорпиона.

1. Пространственная структура токсина OSK1

OSK1, новый токсин из яда скорпиона Orthochirus scrobiculosus, состоит из одной высоко положительно заряженной (7 Lys+, 1 Arg+, против 1 Glu- остатка) полйпептидной цели. Известно, что этот токсин блокирует апамин нечувствительные Са2+-активируемые К+-каналы малой проводимости в NG 108-15 гибридных клетках. Токсин гомологичен ряду известных коротких токсинов скорпиона, обладающих различной специфичностью действия на К+-каналы. Отличие в биологической функции токсина OSK.1 от других токсинов скорпиона связаны с отличием в его пространственной структуре. Поэтому точно определенная пространственная структура OSK1 .представляет значительный интерес для выяснения природы специфичности токсинов семейства скорпиона. Содержание токсина OSSC1 в яде очень низкое (<0.5%), поэтому удачось выделить лишь небольшое количество белка - 3.1 мг. Тем не менее, данного количества оказалось достаточно для получения двумерных спектров ЯМ Р. ЯМР-спектроскопия позволяет исследовать пространственную структуру белка в растворе, т.е. в условиях, близких к физиологическим, что является важным для изучения связи функции и структуры.

1.1. Экспериментальные ограниченна для расчета,пространственной структуры OSK1

Отнесение сигналов' в спестрах Я1ЧР началось с идентификации спиновых систем аминокислотных остатков и спектрах DQF-COSY (РисЛ) и TOCSY, снятых при 30°С. Спиновые системы, соответствующие остаткам OSK1, были однозначно идентифицированы. Используя наблюдаемые в спектрах NOESY ¿/-связи, проводилось последовательнее соотнесение спиновых систем с аминокислотной последовательностью токсина. Дополнительные спектры, полученнце при • 10" и 45"С, обеспечили разрешение возникших в результате перекрывания сигналов неоднозначностей в интерпретации. Обзор данных ЯМР показан на Рис.2.

Особенности получения »экспериментальных ограничений »\ JOiР-спектров. Четыре типа экспериментальных ограничений нсполь юка.'пкь программой DIANA для расчета пространсгненной структуры OSKI; I.) межпротониые (верхние и нижние) ограничения ни расстояния. 2) Ol раиичеиия дисульфидных связей, 3) ограничения водородных en icir 4» oi раничения на двугранные углы.

М.Д."

4 -

5

........• '9 * ' * ' В

М.Д.

Рис Л. "Fingerprint"-область спектра ОС^-СОБУ токсина СЙК1 при 30°С, рН 3.0. Показаны отнесения кросс-пиков КМ/С"!!, окрухаюсгями помечены кросс-пики "примесей".

Для отнесения химически ) сдвигов сигналов использовался спектр МОЕЗУ 200 мс, в котором эффект спиновой диффузии мал, но для в измерения объемов кросс-пиков в программе ХЕАБУ использовались данные спектра ЫСШБУ Ю0 мс. Ограничения сверху (с1и) на расстояния между протонами были вычислены из обьемов кросс-пиков посредством программы САЫВА. Ограничения сверху на расстояния между протонами были модифицированы следующим способом: с1а=0.95(1и+0.05(1112 для компенсации увеличивающейся погрешности определения расстояния для небольших интенснвностей кросс-пиков, что обеспечило более корректную калибровку без ненужного ослабления ограничений на короткие расстояния. - . . . .

Общее число однозначно отнесенных кросс-пиков ЯЭО равнялось 578. Число верхних ограничений на расстояния в диапазоне от 2.3 до 5.5 А, использовавшихся при расчетах по дистанционному геомегрическому

ГШ-сШ

5111

кзе

«С2Ь

$мэа 8е1ь

€22

—:

К20 ■■$■-■■ Ц£,'.........

ш' 4* Г22

.«Г

1 Ж . !•-»

1124

2 ч!з

I С1В | 0

:н278 8К*9

: *

С28 3 : "

8тЗЬ 4

'V в1«3

в ; 5 со

к?

) С35

ё ив 1сзз

А21

..С14 'Х2Ь

К32

алгоритму, равнялось 312. Для некоторых кросс-пиков ЯЭО, включая прохиральные центры без стереоспецифических отнесении, использовались • ограничения с участием псевдоцентров.

1 1В 28 . за 30

СЧ!1НиКСК13НЧС1.ЕРСХНАСПНГСНСПМСКСНСТРН

л^гы-ч! _ ииавн а выв _ а.

_шаш я. на -___а1-в-...а,,Еш..виша а

арН[|,¡+1] ВЕНЕ. вв_я ■■■, да _ _ г«—;я ^[Ы+З! _ ■ , .и .

Я »Я Я_И

Н-0 Обмен х ж х х ххх хххххх х х х ххххх х

ООО о оо6«в«ю®* ее® вооооооо ооооо

(3-тялс

а-спираль

р -тяж

р-тяж

Рис.2. Краткий обзор данных Я MP, характеризующих вторичную структуру OSK1. Ограничения на" расстояния, полученные из интенсивной кросс-пиков ЯЭО, обозначены как: dAB(i,j) - расстояние между протонами типа А и В аминокислотных остатков i и у, где N, а и р обозначают N11, СаН и СРН протоны, соответственно. Целый квадрат Щ обозначает -высокую интенсивность, половина квадрата (д) - среднюю, и линия (_) -низкую интенсивность соответствующего кросс-пика в спектре NOESY 100 мс. 3Jtsu - константы спин-спинового взаимодействия протонов H-NCU-H -(в) меньше 6 Гц, (О) больше 8 Гш В строке H-D обмен символ (X) ознлчаег 'времена полуобмена соответствующего амидного протона основной цепи > ■ 2 часов при 30°С и рН 3.0. Аминокислотная последовательность OSK1 показана наверху однобуквенными символами, кроме того внизу, показаны элементы вторичной структуры.

Модификация метода геометрического алгоритма для использования "отрицательной" информация, -содержащейся в спектрах Я MP. Данная модификация включала рассмотрение дополнительных ограничении на расстояния снизу. Сначала список "отсутствующих" кросс-пиков включал все пересечения химических сдвигов протонов OSKI. Затем из этого списка были удалены кросс-пики, для которых уже имелись ограничения сверху. Кроме того были удалены все кросс-пики, попадающие на зашумленные и близкие к диагонали области' спектра.- Визуальны» анализ остаяшейет части "отсутствующих" кросс-инков подтвердил отсутствие вблизи ни.< (5<0.05 м.д.) сигналов ЯЭО. Было также принято во внимание, что внутримолекулярная подвижность могла повлечь за собой "исчезновение" кросс-пиков из спектров ■ NOESY. Поэтому отсутствие кросс-пикт

использовалось как "отрицательная" информация (ограничения снизу на расстояния) только, если протон имел верхние ограничения на расстояния. После исключения кросс-никоа для иротоноа подвижных боковых цепей мы получили список из 175 "отсутствующих" кросс-пиков. На соответствующие этим кросс-пикам расстояния были наложены ограничения снизу, в 3.0 А. Добавление этой информации уменьшило r.m.s.d. координат тяжелых атомов основной цепи примерно на. 0.1 А, не вызнав нарушений других ограничений.

Ограничения диеульфидных мостиков. 18 ограничений на расстояния-были включены в вычисление в программе DIANA, чтобы зафиксировать три дисульфидных мостика. 6 ограничений на расстояния (3 верхних, 3 нижних) для каждого дисульфидного мостика определили верхнюю и нижнюю границу в 2.0 и 2.1 А для расстояния d(SY, SY), соответственно, и с 3.0 и 3.1 А для расстояний d(C'\ SY), соответственно.

Связность цистеннов и акцепторы водородных связей для медленно обменивающихся амидшлх протонных доноров были определены после вычисления, предварительной пространственной структуры.

Oi'iaiiii'unHii водородных связей. 24 протона NU через два часа после растворения OSK1 в ЧЬО дали сигналы в 1D спектрах и спектре TOCSY. Эти протоны образуют 24 водородные связи. Для каждой водородной связи в последующих вычислениях использовалось 8 ограничений на расстояния: 4 верхних: (3.4 А, 2.3 А, 4.6 А, 3.6 А) и 4 нижних: (3.0 А, 1.9 А, 4.2 А, 3.2 А) для d(0, N), d(0, HN), d(C, N), d(C, HN), соответственно. Эти ограничения были получены согласно критериям образования водородной связи:-для углов 140" < NIIO < 180° и 130" < СОН < 170", и для расстояний. Это дало 192 ограничения на расстояния (96 верхних, 96 нижних).

Шмерсние конегднт сшш-еишюшио таимадсиствия. Вициналшые константы спин-спинового взаимодействия протонов H-NCMl, 3Jnu были определены из тонкой структуры неиерекрышх кросс-пиков по двум осям спектров ЫОEiSY между соответствующим амидным прогоном (по 2-он частоте) и любым протоном соседнего остатка (но 1-ой част о je) с использованием-программы 1NF1T. Эгот же метод использовался для ■ измерения константы сшш-сгшноиого взаимодействия протонов H-Cr'Cu-H, 3JU|!, остатков lie, Thr и Val. В этом случае была проанализирована тонкая, структура межостаточных кросс-пиков в спектре NOESY в 2Н;0. Для остяков, имеющих разные химические сдвиги протонов С1'Н, константы 3Jaß были получены в результате анализа тонкой структуры самых сильных кросс-пиков между протонами С'Н и СРМ а спектре DQF-COSY в 2НлО. Активная константа была определена, измеряя ¡штифазное расщепление, а

пассивная была вычислена посредством анализа инфазного дублета в программе INFÍT.

Расчет ограничений на двугранные углы. На начальной стадии ограничения на двугранные углы были определены из анализа локальной структуры, используя программу HABAS. Эта программа, используя верхние ограничения' на расстояния, константы спин-спинового взаимодействия 3Jtjtt и имеющиеся стереоспеинфические отнесения, рассчитала 37 ограничений на углы ср. Границы, интервалов для 27 двугранных углов были выбраны как 60с'±30°, -60°±30° и 180°±30° в зависимости от соответствующей константы " спин-спинового взаимодействия 3Jnp. Данные ограничения использовались для расчета в программе DIANA на первой итерации REDAC., На последующих итерациях ограничения на двугранные углы были уточнены. На последней итерации "алгоритма REDAC число ограничений торсионных углов стало максимально возможным: 143 (35 для ф, 37 для \у, 29 доя 21 для х2, 12 для X3 и 9 для х4).

1.2. Результаты расчета пространственной структуры OSK1 ко методу дистанционного геометрического алгоритма

Продолжений отнесения неоднозначных и перекрытых кросс-пиков ЯЭО : в спектрах NOESY после' получения предварительных пространственных структур выполнялось при помощи программы ASNO. В этой программе вариант отнесения химических сдвигов считается возможным, если минимальное расстояние между соответствующими двумя протонами внутри набора предварительно полученных пространственных структур меньше 6.5 А. Оставшиеся после использования программы ASNO неоднозначности в отнесении кросс-пиков протонов OSK1 были разрешены с использованием формы линии и точных значений химических сдвигоп сигналов и распределения расстояний между парами протонов в наборе полученных структур. На заключительной стадии (после 3 циклов вычислений в программе DIANA и последующих переотнесений кросс-пиков) мы получили 578 кросс-пиков ЯЭО (198 влутриостаточных, 194 последовательных, 28 средних и 158 дальних). л

Водородные связи показаны на Рис.3 и Рис.4а. Все медленно. обменивающиеся NH группы участвуютв образовании водородных святей. Среднее расстояние Водородной связи d(Hw-Or) после, минимизации конформациопной энергии равно 2.23±0.16 А, а угол ¿.'NOII ранен 19.5°±11.2°. Девять медленно обменивающихся ампднмх проюнов н энергетически минимизированных структурах сформировали «»дородны.; связна-спирального типа (Н^-О1-': остатки 14-10, 15-11, 16-12, 18-14. 19-15, ■20-10. 21-17. 22-18, 23-18). Другие 10 амидных групп формир\кч р.о.т/ро i-.

ные связи, типичные для р-слоя (Рис.3). Из них б водородных связей (Нм-Ос: остатки 25-36, 27-34, 29-32, 32-29, 34-27, 36-25) соединяют тяжи р2 и рЗ, и 4 водородных связи соединяют тяжи р> и р1 (Ны-Ос: остатки 2-35, 4-33, 33-4, 35-2). В структуре также присутствуют две концевые а-спиральные "шапочки": К-"шапочка" - карбонильная группа боковой цепи 01п 13 формирует водородные связи с амидными протонами остатков Ьуь9 и ИеЮ, и С-"шапочка" - карбонильная группа Сув18 формирует водородные связи с амидными протонами остатков С1у22 и Мй23. Имеется специфическая водородная связь между заряженными боковыми цепями остатков С1и16 и А^12 (Рис,4а), формирующих солевой мостик.

лшниями показаны наблюдаемые кросс-пики ЯЭО и водородные связи, соответственно.

Набор пространственных структур (Рис.4, Рис.5) рассчитан по методу дистанционного .геометрического алгоритма в программе DIANA с последующей минимизацией конформационной энергии в программе SYBYL. Качество пространственной структуры охарактеризовано в Таблице I. Анализ распределения углов ср, ц/, х' и локального r.m.s.d. аминокислоты* остатков OSKI показал, что его основная цепь хорошо " определена, .а положение N- и С-концевых остатков менее определено. Согласно карге Рамачандрана в 30 полученных структурах большинство углов ср и Ц1 находится в благоприятных областях, за исключением остатков Gly22, С;1уЗ! и Asn30. ' _

\

/ A

_// v lK,

0 luin

fW's

wk Sv t5 "к

■••г- .... И: ■ . ii ;

■■•-■hij . гг

ьАч» ,, ■Л Л i

6)

Рис.4.а) Конформации основной цепи а наборе пространственных структур OSKI. 30 конформации показаны тонкими пунктирными линиями. Средняя структура ("mean") показана жирной сплошной линией. Водородные связи показаны жирными пунктирными линиями. Видно, что п данном наборе имеется две основные конформации для Р-поворога (обозначен "[З-turn") н дпсульфидных (SS) мостиков, б) Расположение боковых цепей набора пространственных структур .OSKI. Основная цепь показана в виде "трубчатой" модели. Некоторые боковые цепи (только тяжелые атомы) изображены пунктирными линиями. Цифрами отмечены номера некоторых остатков.

№ среднего значения нелепой функции (Таблица I) следует, что конечные пространственные структуры хорошо согласуются с данными ЯЭО. Структуры не имеют нарушений ограничений на расстояния больших 0.2 А. Имеется 11 нарушений торсионных углов превышающих 5". Величина r.m.s.d. между пространственной структурой до и после, минимизации конформационной энергии равна 0.44±0.03 А для тяжелых агоиов основной цепи и 0.79А0.05 А для всех тяжелых атомов. 'Значения попарного r.m.s.d. для тяжелых атомов основной цепи белка раины 0.42±0.14 А до и 0.48+0.13 А после минимизации конфорч;!нионной энергии. ' .

Ниже подробно рассмотрены основные элементы пропрансгиеннои структуры OS К. I.

Рис.5. Стереоизображение суперпозиции 30 пространственных структур 05К1. Основные цепи показаны черным цветом, боковые цепи -. серым. ' .

Основная цепь. В ОйКЛ можно выделить четыре области с регулярной вюричпой струк1урой (Рис.2,. Рис.7). 'Наличие короткого а-спиральнот учаока подтверждается системой последовательных (.¡им-связей, наличием связей с]„м (¡,¡+3) и сГр' (¡,¡+3) и малыми (меньше 6Гц) консчалтамп спин-спинового • взаимодействия ^¡ц. Данные (Рпс.З) указывают, ¿гто ашипараллелышй р-сшй характеризуется последовательными связями, большой константой спин-спинового взаимодействия 3_|м„ (больше 8 Гц) и пшпчнымп для (¡^-слоев <1цм н дальними связями. Взаимное пространственное расположение а-спирали и р-слоя в 05К.1 отражено в дальних ЯЭО между спиральным участком н р2-тяжем (24-29), а также, между "вытянутым" фрагментом [И (1-8) и [53-тяжем (30-37) р-слоя. Следовательно, структура ()SK 1 имеег тип укладки схф.

а-Спиршъ (Пе10-А1а21) является амфифильной. Она содержит одни остгок пролина (Рго17), вызывающий в ее средней части изгиб в 30°. Изгиб отражен в значении константы спин-спинового взаимодействия З.)ни (9;0Гц) для остатка Суз 14. Подобный изгиб типичен для всех токсинов скорпиона н может играть важную роль в проявлении биологической

функции этого семейства. За исключением этого, спираль является канонической правой а-спиралью, так как углы <|> имеют значения от -50° до -80°, а углы \|/ — от -10" до -70

Таблица I: Анализ 30 "лучших" пространственных структур OSKI"

Параметр Величина Единица DIANA SYHYL

! (елевая функция А3 . 1.3210.04

Число ограничений на ЯЗО - 312,4 75 312/175

расстояния (сверху/снизу) водородная связь 5-5 мостик «fi/96 9/9 96/96 9/9

Число ограничении на Двугранный угол 8S 14

двугранные углы

нарушения ограничении Число > 0.2 Л 0L0 (И0

сверху Максимальное 0.l9i0.0l .0.17J0.01

Сум ма А. 1.14:0.10 0.70:0.06

нарушения ограничении Число > 0.2 А 010 (>H>

снизу Максимальное 0.160).02 0Л910.01

Сумма 1 А 1.00:0.10 oMoio.os

нарушения Число > 0.1 Л 8i2 (i.'O

VDW Максимальное 0.26:0.03 0 O'.n.n

Сумма А 2.70 O).20 O.Oiil.O

нарушение Числи >5" . 011

-о| раниченнй на углы ф Максимальное 4.l::0.4 15 0.: 2.0

Сумма град 25.2.13.0 46.7.'K.O

Число >5" 0Л 0' 1

\jl .Максимальное 0.6! 2,0 0.6 t 2.0

Сумма град 0.6 <2.0 ■ 0 6 .2,0

Число >5" 0M 1 >2

Максимальное . 6.П1Ч.З 15 « ' 4.1) .

Сумм;* I )'>',>Д 6.013.3 15.0" 4.0

r.m.s.d. остатков: 1-38 осипиная пень Л 0.-12:0.14 0.4>:, 0. i 3

псе атомы А 1.30-0,20 1.3401.19

3-29.32-37 основная оеш. Л 0.34; 0.14 ' 0.40:0.12

все агомы Л 1.22 Ol. 1,4 1.2701.1,4

р-слои:2-6,24-20,32-37 основная цепь Л O.VT'O.h: 0.4 l'O. 15

все лгомн Л - i. Ift'0.22 1.19-0.23

a-ampam-'. 10-21 основная пень все.атмы Л Л • 0.05-0.02 1.02-0.16 0. 10-0.0-1 1.0 7-0.25

<3нергия> оошая 6ü, 1 1 6

,1Р>| ран. ккал' 93 0 Ii-'

свякн , МОТЬ 10 i'0.4

\ [.'МП ; ,' ''

\ ! )•'.'• -г-'. '• \7

" Ко тонки "DIAVA" и 'SYlTi I.' с«жр.га i чсо-лия \< . .i:>V' \ петпчин ,то п нес ie мшшчи мимн м.ок|,, рчлип онон "i ii.ni

(ы1| неге I пенно.

Р-Слой ОБ КI состоит из трех тяжей (Рис.З): [51 (Уа!2-\'а16), |52 (Ме(23-Ме129) и (53 (ЬуБ32-Ьу538). 13 целом р-слой хорошо определен - значение г.пЧ.б.с!. основной цепи равно 0.39±0.18 А (Таблица П. Характеристики [5-слоя: правый, умеренно закрученный (угол 30"), антипарл.тлепьнъш.

Р-Поворош. Тяжи Р1 и (52 (5-слоя соединен.'.! |5-иоворотом, сформированным остатками Мй29, АбпЗО, С1у31, 1.уь32. По-видимому, этот поворот является очень гибкой частью молекулы, чю проявляется в большом значении г-.т.з.с!., которое равно 0.67±0.49 А для атомов его основной цепи. р-Поворот имеет водородную связь между остатками \ и 1+3 (Ме129 и Ьуз32). Между двумя амидными протонами остатков ¡+1 и ¡+2 (АбпЗО и С1уЗ 1) наблюдается характерный ЯЭО. Анализ углов <р, показал, что две зеркальные конформации (^ц, ц#зо - -60", 100°, фл.ц.'л = 125°,-60") и (фзо.Ч'зп = 60й,-100" фэьУл = -125°,60°) присутствуют в 30 структурах 08К1 и соответствуют каноническим типам И и 1Г р-новорота. >

Боковые цег.и. Значительная часть поверхности является

положительно заряженной благодаря большому количеству- (7) боковых цепей лизина. Конформации боковых цепей остатков 1^7, 5ег11, Ьу&19, 1_уз20, Ьуз27 и ТЬгЗб однозначно не определены. Эта неопределенность могла возникнуть благодаря подвижности соответствующих боковых цепей или в процессе расчета структуры из-за равенства химических сдвигов сигналов геминальных Р-нротонов этих остатков.

Анализ распределения расстояний между атомами Б-Б в предварительных пространственных структурах выявил единственную возможность для формирования трех дисульфидных мостиков: СуьЙ-Су$28, СувМ-СувЗЗ и Су518-Суз35. Эги мостики очень важны для стабилизации структуры Cj.SK I, Два мостика соединяют а-еппраль и Р-слой, а третий мостик (8-28) соединяет вытянутый фрагмент и (З-слой. В наборе пространственных структур ОБЮ каждая дисульфндная связь может принимать две конформации. В таблице 2 приведены соответствующие эгим коиформациям пары углов у}, X2. Эта дисперсия может происходить из-за неполноты экспериментальных данных иди из-за внутренней гибкости дисульфидных мостиков. " »

Таблица 2: Конформации дисульфидных мостиков

<Х> <х')>

мисщк структур град град 'руд град гуад

Су$»-Су528 93 76.515.5 -147.813.8 -95.314.4 -165.7*4.8 -16715.4

7 90.9Ю.4 88.4Ю.2 65.5И. 1

Су514-СузЗЗ 90 -64.3.12.7 169.6И.8 79.1±2.8 175.4il.9~1 -82.916.6

10 -81.712.4 -74.911.8 -68.412.6

Су$18-Су$35 50 -64.514.6 -162.612.0 77.511.8 174.2±зТГ1 -68.717.7

50 - -47.413.4 -75.513.4 -49.017.0

1.3. Пространственна» стпугпугыОЯК!

Пространственная структура ОБ УС 1 очень походит на структуры гомологичных токсинов АцТХ, СЬТХ, БХМ и МцТХ (Рпс.6). Все они имеют похожую укладку основной цепи, однако детальное^ исследование пространственных структур токсинов выявляет некоторые структурные различия, приводящие к различиям в их специфичности.

Í-(—~1-1. , I 1

СШ Z F Г Fl US С Т Г § К S C'J S V [i L11 [| Г SIIG ¡ ¡íCHOKCfl^S Ш

IhTK Zf TDUDbSWSKnCUSMCKDLFGUD Л с; К CMG JÍKCJÍ C.VfJ, 36y,

HgtK Til lUUKCTSPKQCLPPCKftQFGQSftGAKCHHGKCKC.VEil Ш

(.NÍX , T I IHUKCrSPKQCSKPCKELVGSSAGAKCi'HGKCKCyilii 55■/

íÍSIÜ.1 I lííUKCK ISHQCLEPCKKAGHRF G| KCHHGKCHCTPK ICO/

Ш т. Ш У К С S G S P Q С L К P С К D n G n Я F G' KCHHItKCIIC ГРК Gífc

ftgTX SaUPIlllMC;!G SP í) С LH P COílGH31|; tí KíLllIGlíCHCIPH: В/.

1 5 Ш 15 23 25 33 35 30

Рнс.6. Выровненные последовательности OSK.1 и других токсинов скорпиона. Нумерация остатков соответствует последовательности OSKI. Днсульфпдиые мостики показаны тремя линиями сверху,- Остатки, гомологичные последовательности OSK.I, затенены, процент гомологии приведен, справа.

Л'-, С-"шапочки". Из интересных находок в структуре OSKI можно зазвать присутствие терминальных N- и С-"шапочек" на концах а-спнрали Рис.7).

Солевой мостик.- Другой интересной особенностью структуры шляется наличие солевого мостика Argl2-G!ul6, дополнительно табилнзирующего а-сппрцл'ь в средней части. Эгот нывод подтверждается ледующими фактами: углы ' остатков Arg-12 и Gluló фиксированы,-1М11дный протон NCH боковой цепи Argl2, имеет пониженную скорость 1ейтерообмена, наблюдается соответствующая комбинация кросс-пиков 1ЭО. Информация о данной солевой связи в других токсинах отсутствует, ¡о, по-видимому, похожая связь может располагаться в разных местах доль а-спнрали. Например, в SXM'может существовать солевой мостик (ежду остатками Lysló к G!u20, в КТХ и AgTX -.между Lysl6 и Asp20, а в 4gTX имеется гидрофобное взаимодействие между боковыми цепями го 16 и А1а20. Такие мостики могут определять специфичность токсина, .к. изгиб a-спирали может управлять углом закручивания поверхности ¡i-

слоя токсинов, взаимодействующей с поверхностью рецептора. Интересно чго'всякий ра), когда имеются пролины в а-спиральной области (Рис.6; формирование такого мостика является возможным: для ОЗК! - эт< совместное присутствие Рго17 и солевого мостика Агц 12-01и 16; для КТХ 1 AgTX г присутствие Рго12, Рго17 и мостики 1л816-Л$р20; для SXM - Рго11 Рго17 и с.лй 16-С;1и2(1; для МдТХ - присутствие трех пролинов. Рго11, Рго1й Рю17 и гидрофобного взаимодействия между Рго16 и Л1а20; и в особои случае токсина СЬТХ -.отсутствие пролинов в а-спирали и отсутстви стабилизирующего мостика.- .-'

О !1116 ,Лдг12

' А / 21

г

Ч сс ■íl \

( ■ ! I -I 7 Gin 13

'VA./I fé,Y '

ran j |0 а N cap

cap ^ j ,ол \ \

va,

V •-. .. J •

u

.BS

\

1 lir3G

v i

His34 . Asri30

1Уб27. • ' . Me129

Pne.7.. Схема шческое представление структуры OS К. I в вида ленточкой ■• молетн. Показаны 'основные структурн.о-функциональныь neuem и OSK.I- а-спираль, ß -слой (широкие лепты), соединяющие neun: Корме ipyöKii) и 3 .тисульфндных. моешка (шиши). Водородные связи N- и l'-"[ií.[[¡i'iU;" а-сиирати показаны штриховыми линиями. Покмкш также сотенки- м.'чпнч \n'12-(iliiIo н боковые цепи "критических" для i :.,:¡M.. ..чкмин'ч с Miake» канатом осгагк.>Mlhr36. Iл\27, Ar^3-1, Met29. W-;H> 1 ¡ .•..¡•jww v'fMCMCHii и. »мера N- и С -концевых ос пикон и on ai коп i; ¡i< \'.i .. . - ■ ■

*

Гибкий p-поворот, сформированный консервативными осинками sn30 и Gly3l, является очень важные доя проявления функции токсина, 1к как этот поворот вовлечен во взаимодействие с рецептором. OS КI чеет {^-поворот типа П, 11', a SXM - 1, Г. Различие в типе ^-поворота КМ и OSK1 можно объяснить вставками двух аланинов с обеих сторон шсервативного остатка С1у26. Эги вставки ведут к пространственному lemeiiiHO дисульфидного мостика, соединяющего р-слой и N-конец «-¡ирали. Различие в типе p-поворота вполне может быть основной шчиной изменения сиецифичпосш внутри семейства токсинов скорпиона, СМ и Mg'IX ннгибируют потенциал-зависимые КЛкапллы с небольшим |фектом на Са2,-актнвируемые КЛкацалы, вто время как OSKI действуй! С;г+-актив1фуемые КЛканалы малой проводимости*

Лна.чн» вншмосвнзн между пространственной структурой юксшшв » функцией.

Анализ влияния большою количества мутаций ChTX 'на его шмодейсгвие . с Shaker каналом позволил определить поверхность шмодействия токсина и канала. Боковые цени "критических" остатков ксина важны для блокирования рецептора. Основная роль я свиилвлпин инадлежш ноложтиелыю заряженной боковой ifeiiit ocraiка Lys27. юрая встраивастся » "си верст не" в середине поры КЛканада, имеющем îimase.'H,но заряженные остатки.

Остатки 'Пи36, Asn3l> и Ilis34 образуют водородные свяш с дном ten тора, a Met29 стабили шруст кошакч ыщрофобным взаимодействием гласно Рис.6, и« пяти оекпков, "критических" для стнмпшшя ChTX t iker каналом, три консервативны н данном семействе. Они нключавн :нь важный остаток l,ys27 и два остатка р-понороТа.-.'ЪпЗО и Mel29. Диа тих '."кришческнх" остапса Arg34 и ТугЗб неконсерваишны. По-:имому, неконсерва!ивность тни ост aiко» также может определяй, ипчие в специфичности.токсинов. Рис.6 представляет две труппы сипов, отличающихся осинками в пошцияч 34 и ЗЬ. Первая i руппн ючает ChTX, SXM и MgTX с парой остатков I.ys34,ТугЗб. В юрая ana включает OSK.1, КГХ и AgTX с парой Ihs34, ГЬгЗб. Мы ^полагаем, что одна группа более специфична к Са2г-ак'1ивпруемым К'-тлам, вто время как другая показывает лучшее связывание с шненцнал-(симыми К^-каналами.

Согласно данным ЯМР остатки Lys7, Serll, Lys 1.9, Lys20, Lys27, His34 Iir36 имеют подвижные боковые цени, а остатки Glyl, Met29, АьиЗО, И -и Lys38 - подвижные основные цепи. Т.е. имеется существенная геляция участия" остатка в связывании и его подвижностью, в пост и, все "критические" остатки подвижны. Токсин скорпиона, как

правило, связывается с различными рецепторами. По-видимому, некоторые конформации подвижных частей токсина выбираются в процессе связывания с рецептором. Даже если после такого связывания конфигурационная энтропия лиганда уменьшается, то эта потеря может быть скомпенсирована возникновением новых низкочастотных коллективных движений' в комплексе и удалением связанной воды из поверхностей контакта лиганда н рецептора. Кроме того, оптимально согласованные взаимодействующие поверхности токсина и рецептора в тесном комплексе обеспечат более прочное связывание и выигрыш в свободной энергии благодаря энтальпийному члену. По-видимому, лиганд с более подвижными боковыми цепями более пригоден.для взаимодействия с различными поверхностями рецепторов, в то время как лиганд с фиксированной конформацией поверхности взаимодействия может тесно связываться лишь с какой-то одной поверхностью рецептора. '

Таким образом, пространственная структура ОБК1, полученная с высокой степенью точности, позволила обнаружить ряд существенных деталей, таких как солевой мостик в а-спирали,- Ы- и С-концевые "шапочки", конформашюнная дисперсия в дисульфидных связях, подвижность р-поворота и некоторых боковых цепей. Часть этих деталей является общей для семейства коротких токсинов скорпиона и была, по-видимому, пропущена другими исследователями. Другая часть, например, положение' солевого мостика в а-спирали, является характерной особенностью пространственной структуры ОЗК.1 и связана с его специфической функцией. В процессе сравнения полученной пространственной структуры со структурами других известных -токсинов скорпиона мы обнаружили ряд характеристик, определяющих специфичность различных подгрупп токсинов, например, это. вставка в полипептидной цепн, определяющая тип Р-поворота, или парная замена остатков, "критических" для связывания с рецептором.

"2. Рациональное проектирование токсинов скорпиона

В лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Института бноорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН был впервые выделен и охарактеризован основной токсический компонент из яда скорпиона Оп!юс1пгих хсгоЫсиЬьиь, названный 0БК1. Первоначально ц?лыс настоящей работы являлось определение пространственной структуры 05К1 в водном растворе методом ЯМ Р. Однако, по мере опубликования информации но гомологичным токсинам другими лабораториями. появилась возможность, провести анализ структурно-функшюнлтьных различий и сходств дтя семейства коротких токсинов

корпиона, основываясь на тонких отличиях в их пространственных труктурах и специфичностях. Далее, стало естественным продолжить ряд омологичных токсинов скорпиона, но уже новым, искусственным оксином, используя новые методы теоретического анализа и ационального проектирования пространственной структуры белков.

Прнниипы дизайна "универсального" токсина скорпиона, В ходе волюции создано большое количество специализированных К+-каналов -ецепторов токсинов. Параллельно создавались как токсины тецифические для конкретного' К+-канала, так и действующие на есколько видов КЛканалов. По-видимому, короткие токсины скорпиона, бладающие наиболее широким спектром действия, представляют ольшую биологическую ценность для скорпионов. Это. следует из того, го разнообразие К+-каналов в организмах млекопитающих, насекомых и акообразных постоянно возрастает, а общее количество различных жсинов в яде одной особи скорпиона обычно не превышает пятидесяти. В шной работе мы попытались создать модеч^ "универсального" токсина, рименяя рациональные методы проектирования белков.

Считается, что изменение белков происходит в результате :нетических мутаций. При этом, во многих случаях новый бедок содержит [ементы пространственной структуры своих предшественников. Согласно ории Кимуры о нейтральном характере мутации при молекулярной олюцпн белков генетические кодоны в ходе эволюции увеличивают епень своей устойчивости против случайной мутации. Существенную шь при отборе более эффективного белка, помимо усиления его осоГшости к выполнению определенной функции, играет его структурная аби'льность. В свою, очередь стабильность той или-иной структурной 1гаиизации белка определяется наличием вполне определенных рукгурных элементов, таких как гидрофобные кластеры, солевые >стики, заряженные боковые цепи, гидрофобные й полярные контакты с рактерной периодичностью вдоль аминокислотной последовательности, и С-концевыеэлементы а-спиралей и др.

В настоящей работе мы попытались продолжить эволюцию коротких ксиноо скорпиона, проведя одновременно замену большого числа гатков рациональным способом в соответствии с теорией увеличения гойчивости генетических кодонов, обеспечив при эзом сохранение и ггалнительную стабилизацию структуры токсина и усиление его функции [зывания' с КЛканалами. Для проведения такой эволюции необходимо лить две задачи: I) выявить аминокислотные остатки, ответственные за ткрегный тип пространственной структуры белка (при замене таких -атков требуется повысить общую стабильность пространственной

структуры белка); 2) выявить аминокислотные остатки, ответственные за взаимодействия с рецепторами (при замене таких остатков требуется повысить способность токсинов связываться с различными рецепторами). Следует отметить, что большинство инвариантных остатков нельзя заменять, так как они ответственны либо за сохранение структуры, либо за осуществление функции, поэтому замены должны касаться в основном вариабельной части белка. Так как этот токсин создается на основе стабилизирующих и функциональных элементов, присутствующих в нескольких представителях данного семейства токсинов, то можно ожидать, что он окажется более универсальным, т. е. будет обладать более широкий, чем у его предшественников, спектром действия на К+-каналы.

Для анализа внутримолекулярных взаимодействий в пространственных структурах трксинов семейства скорпиона используется метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП). Этот метод основан на вычислении взаимного МГП между пространственно сближенными остатками полнпептпдной цегш и позволяет выявить структурно и функционально важные остатки для белков с известной пространственной структурой. ,

1 5 10 15 - 20 25 30 35 40

А(]ТХ 6\/Р11Ф/КСТ68РОС1КРСКО АШ^Й КСШСКСНСТРК 62%

ШХ 2РТМУЗСТТ8КЕСУБУСОРШЯ5Я6~КСШККСВСУ8 .60%

МдТХ ~Т 11МУКСТЗРКСХ:1РРСКА0РС06А0АКСШСКСКСУРН 60% ОЗК1 ' ЕУI I М\'КСК IЭПОСЬЕРСКК /\GMRFG КСШОКСНСТРК 60%

8ХМ _Т I ШУКСТБРКСЮЗКРСКЕСУСЗЗАШСШОКСКСУШ 62%

1ЛХ вУИ IМУЭСТТБРОС^'КУСКК У6С6А6 КСШККСКСУРН

Б/А 8 БАЭ ЭААА ББ БЭ _ А~АБАА АБАЭА

С/ N . NN N С СС

□О I « I ГР | Ш

Рис.8. Выровненные аминокислотное последовательности ,5 токсинов скорпиона: А^ТХ, СИТХ, Мё'ГХ, ОБЮ, БХМ и иТХ. Остатки токсинов, инвариантные с последовательностью иТХ, пежазаны на сером фоне, степень гомологии последовательностей токсинов и иТХ показана справа в процентах. Вверху рисунка показала нумерация по семейству токсинов. Линии сверху обозначают 3 дисульфидных. мостика. 'Ниже показаны инвариантные характеристики аминокислотных остатков данного семейства токсинов: Б/А - структурные (Б) остатки и активные (А) остатки; СХ-шлпочки помечены буквами С и N. соответственно; Элементы вторичной структуры показаны в рамках (а, (31, Р2, рЗ).

Для. МГП-аналнза использован набор пространственный структур семейства коротких токсинов скорпиона, полученных методом спектроскопии' 'Н-ЯМР: АцТХ, СЫХ,' MgTX, ОБК! н БХМ. Их аминокислотные последовательности показаны на Рис.8.

Значения РЯС (Рис.9а) отражают соответствие гидрофобносги отдельных аминокислотных остатков и их окружения. Например, отрицательная величина соответствует гидрофобному остатку в полярном окру;кени^. Все профили весьма схожи для токсинов данного семейства, и мы использовали их для выравнивания аминокислотных последовательностей (Рис.8). Последующая нумерация останов соответствует данному выравниванию.

Выявление виутримолекулярных'кошактои, присутствующих во всех структурах токсинов, позволяет определить характерные для 'лого :емеГ-ства внутримолекулярные, взаимодействия, определить, основные лабилизирующие гидрофобные взаимодействия и • указать на •(опсрхиостные области структур, ссхмвектнующие возможным ' местам :вчзывани!1 с другими молекулами. •

а КС в, С"03 -о ■ й с^ т

' в

--1

. ь

. л !ч А

<ХГ. 1 м

4« . л ?? г.

'я см к ,11____сЗ 11-я____ 11

~7Г .и .Л

1««. р - Г я Г1 1 0 1) ОС731СЖ г, . й. <1

Рис,9. Одномерные МГП-профили вкладов аминокнслошых остаIков пя семейства токсинов (рассчитанные для помещенных в гндратные Золочки наборов структур): Р5С (а),.полярные ВВ (б) п гидрофобные .SS ) внутримолекулярные взаимодейетния.

В)

ЭВ

...'....л...,': л.. '1...Л....1

"Г1- ; 5 I. т л-С. ................I

Л)

I. .Ж? " и

< »

•V

к* " '

Рис.10. Симметричные двумерные МГП-карты контактов: (а) токсинг ОБК.1Л6) инвариантных в семействе токсинов, (в) итХ-токсина. Показань: гидрофобные (Н), полярные (О) и неблагоприятные (+/-) контакты между остатками.

Двумерные МГП-карты для всех токсинов очень похожи. На Рис.Ша представлены типичные карты БЗ-, БВ- и ВВ-контактов ОБКЛ с величинами МГП, превышающими пороговое значение 0.0001. (ЗБ - контакты между эоковыми цепями, БВ - контакты между боковой и основной цепями, ВВ -контакты между основными цепями.) На Рис.106 изображены карты «вариантных - контактов, т. е. присутствующих во всех токсинах. Характерный узор, присутствующий'на МГП-картах, как и на обычных сартах пространственной сближенности остатков, определяется гомологией 1ервичной структуры, наличием похожих элементов вторичной структуры I типом их укладки в пространстве.

Различия в узорах на картах разных токсиноз связаны в основном с >азличиями в гидрофобностях боковых цепей остатков, с пропусками и ставками аминокислотной последовательности. Прежде всего можно аметить, что боковые цепи (карта БЭ) участвуют в гидрофобных заимодействиях приблизительно в 10 раз чаще, чем в полярных. Для сновной цепи (карта ВВ) ситуация обратная. Между боковыми и сповными цепями (карта БВ) много "неблагоприятных" (т.е. гидрофобных полярными) контактов (знаки "+" и "-."). Чтобы проанализировать груктурно-функциональное значение каждого аминокислотного остатка, еобходимо определить характерный тип взаимодействий этого остатка. 1нвариантные контакты между остатками показаны на Рис.11 толстыми нниями. Здесь хорошо видна группа контактов (Рис.11а), ютветствующая гидрофобному кластеру," многочисленные полярные энтакты а-спиралн и Р-слоя (Рис.116) и "неблагоприятные" контакты 'ис.11 в) активной области токсина. "

Из анализа карты инвариантных контактов боковых цепей следует, го во всех токсинах боковые цепи остатков цистеинов В, 14, 18, 30, 35, 37 и татков 2, 4, 6, 13, 17 имеют гидрофобные контакты - это структурные татки (Б) (Рис.8). Боковые цепи этих остатков формируют гидрофобный [астер. Активные остатки (А) (5, 9, 10, И, 27, 29, 31. 32, 34, 36, 38) имеют благоприятные БЗ-контакты. То, что инвариантный остаток имеет благоприятные контакты, может означать, что он важен для ецифической функции, т.е. связывания. Чтобы определить области ксина, потенциально активные для связывания, необходимо выбрать гивные остатки, имеющие наибольшее количество неблагоприятных нтактов и компактно расположенные на поверхности токсина. В )ультате получаем две группы активных остатков: 9, 10, 11 и 5, 27, 29, 31, 34, 36, 38.

:{ Л3*

'Л 221 --^Х ' "

38 Ф -:

Рис. 11. Структура токсина СЖК1 и гидрофобные (а), полярные (б) и неблагоприятные (в) контакты (темные линии) инвариантные для все)! токсииов скорпиона. Основная цепь показана серой -трубой (боковые остатки - тонкими серыми линиями). Цифрами отмечены номера некоторых остатков. <

Дизайн_пространственной структуры IJTX. С помощью метода

последовательных мутаций ампноксилотной последовательности OSK1 была получена - последовательность "универсального" токсина (UTX) (Рнс'8). В соответствии с ней смоделирована пространственная структура UTX (Pite.¡.2). Конформацмонная энергия полученной структуры UTX равна -2S ккнд/моль, что меньше конформационной энергии природных токсинов после минимизации (в диапазоне от 24 до 90 ккал/моль).

- Ро!\ль'гагы МГП-расчетов ятя UTX приведеныi на Рис.9 и Рис.Юе вместе.с аналогичными результатами для природных токсинов. Из Рис.96-е с.т,-лит\ что в Г ГХ гидрофобные SS-котакты несколько _больше пс

23 « •

бсолютной величине, чем в исходном 'токсине ОЯК1, а полярные В13-онтакты для разных токсинов практически не различаются. Первое ¡олжно соответствовать увеличенной стабильности иТХ, а -второе оответствует. похожей а/р-укладке аминокислотной последовательности сех коротких токсинов скорпиона.

, -¿У \ -1 {

4 ¥ \ \ /У ■' Ч* /

АЩ 1ч '

"Ж ■ -

Ж ЧГ ш р- ..

• < \ .. '/ . •

/ .

У

' Рис.!?.. "Трубчатая" модель "универсального" токсина скорпиона, -годслированая в соответствии с последовательностью 1'ТХ. Показаны жовые цепи набора из 10 совмещенных по тяжелым атомам сгрутаур, пи гидрофобного кластера - черным, остальные - серым цветом.

Мшады

1.Получены двумерные 'Н-ЯМР спектры токсина ОБКЛ, блокатора ("^-активируемых КЛканадов малой проводимости, и проведено полное несение химических сдвигов сигналов протонов в этих спектрах. На ковании полученных данных определена вторичная структура ОБК! (а-траль (остатки 10-21), состоящий из трех тяжей антинараллельный р-. )й (2-6, 24-29, 32-38), и р-поворот 11 типа), а также положение 3 :ульфидных мостиков и 24 акцепторов водородных связей.

2. По данным спектроскопии 'Н-ЯМР проведен расчет эстранственной структуры ОЯК1 в водном распюре. В результате

расчета получен набор из 30 конформаций токсина, обладающих наименьшей конформационной энергией.

3.Учет "отрицательной информации", содержащейся в 'Н-ЯМР спектрах, и предложенная нелинейная калибровка интенсивносгей кросс-пиков' ЯЭО позволили получить средне-квадратичное отклонение координат атомов основной цепи равное'0.42 А, что является хорошим результатом по сравнению с аналогичными результатами для гомологичных токсинов.

4.На основании данных о пространственной организации .OSK1, анализа двумерных внутримолекулярных контактных МГП-карт токсинов семейства скорпиона и данных мутагенеза гомологичного токсина ChTX проведено сравнение функций^ этих токсинов и получено, что остатки токсина OSK1: 2, 4, 6, 8, 13, 14, 17, 18, 26, 30, 35,-37 - являются "структурными" и ответственны за укладку белка, 5; 9, 10, 11, 27,'29, 31, 32, 34, 36, 38 - являются "активными" и ответственны за проявление его блокирующей функции, 12, 16, 17, 25, 34, 36 - определяют функциональную специфичность токсина OSK1.

5.Разработан теоретический метод рационального проектирования "универсального" токсина скорпиона с более широким спектром дсйств::;: на К+-каналы по сравнению с природными гомологами и предложена модель его пространственной структуры.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующие работах: -

1 .В.Л.Жаравнн, Д.Е.Нольде, А.С.Арсеньев - Тезисы 4-го Всесоюзной: семинара по ЯМР-спектроскрпии, посвященного памяти В.Ф. Быстрова Москва, декабрь 1995 г.

2..Jaravirie V.A., Nolde D.E.,V., Arseniev A.S. - Proceedings of 13tt European Experimental NMR Conference, 19-24 May, 1996.

3. Golovanov A.P., Efremov R.G., Ja'ravine V.A., Vergoten G., Arsenie\ A,S.-FEBS Lett., 1995, v. 375, p. 162- 166. .

4. Jaravine V.A., Nolde D.E., Reibarkh M.J., KoroJkova Y.V., Koz!o\ S.A., Pluzhnikov K.A., Grishin E.V., Arseniev A.S. - Biochemistry, 1997, v.36 p.1223-1232.

5. Жаравин В.А., Голованов А.П„ Арсеньев А. С. - Бноорганическа! химия, 1997, №7.