Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином"

004609ЫЬ На правах рукописи

ФАДЕЕВА Ольга Александровна

Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином

03.01.04- биохимия 03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 0 СЕН ?ою

Москва 2010

004609616

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович; кандидат биологических наук Смирнов Илья Валерьевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Козлов Альберт Анатольевич; кандидат химических наук, доцент Спиридонова Вера Алексеевна

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

на заседании диссертационного совета Д001.042.02 в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН (Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН.

О

Автореферат разослан " л " С£ц 2010 г.

Защита состоится

в час.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Зыбунова Елена Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Нарушения свертывания крови являются одной из ведущих причин смертности в современном мире, поскольку непременно возникают при сепсисе, травме, тяжелых кровопотерях, любых существенных операционных вмешательствах (А.И. Воробьев с соавт., 2001; R. Chakrabarti et al., 2007). Диагностика этих нарушений до сих пор остается несовершенной и позволяет выявлять далеко не все нарушения в системе гемостаза. Недостатком большинства существующих тестов является то, что свертывание протекает во всем объеме исследуемой пробы, и это принципиально отличается от условий, в которых сгусток-тромб образуется в живом организме в месте повреждения стенки сосуда (Н.С. Hemker et al., 2000; М.А. Пантелеев с соавт., 2008).

Система гемостаза представляет собой сложный каскад ферментативных реакций. Свертывание начинается при контакте крови с поверхностью клеток, находящихся в зоне повреждения стенки сосуда и имеющих на поверхности белок, который является сигналом для запуска свертывания. Этим главным активатором свертывания является интегральный мембранный белок - тромбопластин (тканевой фактор, ТФ). Тканевой фактор не обладает ферментативной активностью, но является кофактором фактора свертывания Vila - сериновой протеазы. Когда фактор Vila ^Vlla) связывается с тканевым фактором, получившийся комплекс, называемый внешней теназой, становится способен активировать факторы IX и X, что запускает весь каскад свертывания и приводит к образованию сгустка. Процесс довольно сложен не только с точки зрения биохимических превращений. Важно учитывать его пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания (М.А. Panteleev et al., 2006). Пространственная динамика свертывания может быть условно разделена на несколько стадий: 1) активация: в зоне повреждения кровь контактирует с клетками, имеющими на клеточных мембранах иммобилизованный тканевой фактор; при этом образуется комплекс VIIa/ТФ, который начинает процесс свертывания, активируя фактор X на поврежденной поверхности; 2) рост сгустка вдали от активатора, который определяется диффузией и образованием новых активных факторов, не связанным с активностью комплекса VIIa/ТФ, а обусловленным специальными реакциями поддержания роста; 3) остановка роста сгустка, которая происходит на довольно большом расстоянии от зоны активации. Она обусловлена особым каскадом биохимических реакций, инакгивирующих активные факторы свертывания.

В традиционных тестах по исследованию свертывания, активаторы добавляются в объем плазмы и все активно перемешивается. В результате

доминирующими оказываются реакции только первой стадии. Нарушения в остальных стадиях обнаруживаются такими методами довольно плохо.

Разработанный в ГНЦ РАМН метод и прибор для исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови позволяет наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде (Атауллаханов с соавт., 1995; Р.1. А1аи11акЬапоу е1 а1., 1998; М.У. Оуапевоу й а1., 2002). Сущность метода заключается в том, что в измерительной кювете имитируется локальное повреждение стенки сосуда. При повреждении стенки сосуда в кровь экспонируется тканевой фактор - белок, иммобилизованный на мембране клеток сосудистой стенки, которые до повреждения были закрыты слоем эндотелия. Контакт крови с тканевым фактором в измерительной кювете достигается за счет того, что на одной из стенок кюветы находится иммобилизованный тромбопластин. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков - информацию, которая недоступна гомогенным методам (Е.1. Бтаипске « а1., 1998; А.У. Копс1га1оу1сЬ е1 а1., 2002; К.Г. Копылов с соавт., 2003; М.У. ОуапеБОУ й а1., 2003; М.У. Оуапезоу е1 а1., 2005; М.А. Рагйекеу е1 а1., 2006). Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса. Клинические перспективы исследования пространственной динамики свертывания велики, однако его внедрение в клиническую практику тормозится тем, что в представленном в литературе варианте метода в качестве локального активатора свертывания был использован монослой фибробластов (М.У. Оуапевоу й а1., 2002). Такая технология является дорогостоящей и трудоемкой и не может быть основой для проведения рутинных исследований. Поэтому перед нами встала задача разработать ту часть экспериментальной установки, которая имитирует зону повреждения стенки сосуда. Таким элементом измерительной иоветы является пластинка, на поверхности которой должен находится иммобилизованный тромбопластин. В дальнейшем будем называть ее активатором свертывания. Нужно было разработать активатор свертывания, сравнимый по способности активировать свертывание с поверхностью покрытой фибробластами, но более удобный в применении и стабильный при хранении.

Цель работы:

Разработка метода иммобилизации тромбопластина на поверхности активатора свертывания. Сравнение способности активировать свертывание крови иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

Задачи исследования: 1. Разработать метод иммобилизации тромбопластина на пластиковой поверхности активатора свертывания;

2. Исследовать поверхностную плотность и биохимические характеристики иммобилизованного тканевого фактора (константу связывания с фУНа, условия хранения активатора свертывания);

3. Исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

Научная новизна.

Разработан и оптимизирован метод получения активатора свертывания с иммобилизованным тромбопластином. При этом плотность и активность иммобилизованного тканевого фактора близки к соответствующим параметрам монослоя природных фибробластов. Для активации поверхности пластика на первой стадии иммобилизации белка был выбран метод формирования реакционно-способной пленки, на основе полиэтиленимина. Необходимые механические свойства пленки: прочность ее закрепления, эластичность, равномерное покрытие были достигнуты за счет добавления в раствор полиэтиленимина глутарового альдегида и альбумина. Кинетические характеристики иммобилизованного тромбопластина практически соответствуют аналогичным характеристикам нативного тканевого фактора фибробластов. Он стабилен при хранении (инактивируется с характерным временем 100 дней) и активирует свертывание in vitro аналогично тканевому фактору на фибробластах.

Практическая значимость работы.

Разработан метод иммобилизации тромбопластина, с помощью которого получена пластиковая поверхность с плотностью иммобилизованного тканевого фактора примерно равной плотности этого белка на наиболее активных в отношении активации свертывания клетках - фибробластах. Полученный активатор свертывания является новым средством, которое может быть эффективно использовано при исследовании гемостаза. Применение активатора свертывания в приборе по исследованию пространственной динамики роста фибринового сгустка, в качестве составной части нового клинического метода, имеет важное практическое значение в диагностике и лечении болезней, связанных с нарушением системы свертывания.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность.

2. Максимальная плотность иммобилизованного тканевого фактора близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;

3. Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на фибробластах;

4. Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах;

5. Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не более 100 дней.

Апробация работы. Работа прошла апробацию 19 апреля 2010 г. на заседании проблемной комиссии № 1 "Биохимия, биофизика и реология крови" в Гематологическом научном центре РАМН.

Материалы диссертации были доложены на 1-ом Международном Форуме по Нанотехнологиям (Москва, декабрь 2008), на 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2009), на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, сентябрь 2009), на 2-ом Международном Форуме по Нанотехнологиям (Москва, октябрь 2009), на всероссийском совещании «Биоматериалы в медицине» (Москва, декабрь 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 тезисов в сборниках трудов 6 конференций и 1 статья в рецензируемом журнале.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах печатного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов исследования, главы 3 — описания результатов исследования и главы 4 -— обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 135 источника. Работа выполнена на базе Гематологического научного центра РАМН в лаборатории новых методов препаратной трансфузиологии (заведующий лабораторией - кандидат биологических наук Смирнов И.В.) и в лаборатории физической биохимии системы крови (заведующий лабораторией - доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Ф.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Во введении диссертации дано представление об актуальности, целях и основных задачах работы, научной новизне и научно-практической ценности.

Глава 1. Глава 1 посвящена обзору литературы по теме диссертации. Подробно описаны методы иммобилизации биополимеров, их применение. Дана полная

информация о белке тканевом факторе, описана его структура, регуляция экспрессии, биологические функции. Так же подробно рассмотрено использование тромбопластина в различных методах исследования свертывания крови.

Глава 2. Материалы и методы

Используемые реактивы: Полиэтиленимин («ICN Biomedicals», США), глутаровый альдегид («Serva», Германия), глицин («Рапгеас Química», Испания), растворимый тромбопластин («Ренам», Россия), Innovin - растворимый рекомбинантный человеческий тромбопластин («Dade Behring», Германия), фактор Vila («Ново Нордиск», Дания), фактор X («Enzyme Research Laboratories», США), хромогенный субстрат для фактора Xa S-2765 («Chromogenix», США), ингибитор трипсина из кукурузы (Corn trypsin inhibitor - CTI, Институт белка РАН, Пущино, Россия), NaCl, цитрат натрия («Реахим», Россия), 10% раствор молочной кислоты (LabChem, США), ЭДТА («Хеликон», Россия), ПЭГ-6000 («Serva», Германия), альбумин, СаС12, Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride и Tris (hydroxymethyl) aminomethane были фирмы «Sigma», США.

Доноры крови: В работе была использована кровь 100 здоровых доноров. Кровь брали в отделении заготовки крови и ее компонентов ГНЦ РАМН. В экспериментах были использованы как индивидуальные плазмы доноров, так и пулы, состоящие из плазм двух или трех здоровых доноров.

Получение плазмы крови: кровь доноров брали в пластиковую пробирку на 3,8% цитрате натрия, соотношение кровь: цитрат натрия составляло 9:1. Центрифугировали кровь в течение 15 минут при 1600g для отделения эритроцитов, далее плазму центрифугировали 5 минут при 10000g для удаления тромбоцитов. Сразу после приготовления pH в плазме стабилизировали на уровне 7,2 - 7,4 путем инкубации в течение часа при 37°С с молочной кислотой (14 мкл 10% молочной кислоты на 1 мл плазмы) в условиях контакта с атмосферным воздухом. Для предотвращения контактной активации в плазму добавляли CTI в конечной концентрации 0,2 мг/мл. Чтобы обеспечить в плазме конечную концентрацию свободных ионов кальция, равную физиологической, в начале исследования проводили рскальцификацию образца (20 мкл 1 М раствора хлорида кальция на 1 мл плазмы).

Метод иммобилизации тромбопластина на поверхности: для активации пластиковой поверхности ее покрывали тонким слоем раствора, в состав которого входил полиэтиленимин, альбумин и глутаровый альдегид. Для образования прочно прикрепленной активационной пленки полиэтиленимин (40г/л), глутаровый альдегид (1%-ный), альбумин (4 г/л) смешивали в соотношении 2:1:1 и наносили на пластиковую поверхность тонким слоем из расчета 13 мкл/см2. В этом случае после высушивания образуется слой ~ 10 мкм толщиной. Пленку высушивали в течение суток при комнатной температуре. Тромбопластин присоединяли к аминированной

поверхности ковалентно, используя глутаровый альдегид. Пластиковую поверхность с высушенной пленкой инкубировали в 0,5%-ном растворе глутарового альдегида (0,2 мл/см2 обрабатываемой поверхности) 1 час при комнатной температуре. Образцы отмывали от несвязавшегося глутарового альдегида в течение 1 часа в 10 мл дистиллированной воды с четырьмя сменами воды. Полученную поверхность инкубировали в растворе тромбопластина 12 нМ (0,2 мл/см2 обрабатываемой поверхности) 1 час при комнатной температуре. Несвязавшийся тромбопластин отмывали в течение 30 минут в 10 мл дистиллированной воды с двумя сменами воды. Оставшиеся свободными альдегидные группы блокировали глицином. Для этого поверхность инкубировали 1 час в 0,1М растворе глицина (0,2 мл/см2 обрабатываемой поверхности). После этого поверхность промывали в течение 1 часа в 10 мл дистиллированной воды с четырьмя сменами воды. Далее пластиковую поверхность с пришитым тромбопластином высушивали 30 минут при 37°С, запаковывали герметично в полиэтилен и хранили в холодильнике при 4-8°С.

Определение плотности тканевого фактора на поверхности: принцип метода состоит в том, что ТФ, иммобилизованный на поверхности заданного размера, обрабатывали избытком фактора свертывания Vila для образования активного комплекса VIIa/ТФ, после чего добавляли определенное количество фактора X. Последний под действием комплекса VIIa/ТФ превращался в активную форму фактора Ха. Скорость активации фактора X при выбранных условиях пропорциональна количеству ТФ. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА, поскольку без ионов кальция комплекс не работает. Концентрацию фактора Ха определяли фотометрически по кинетике расщепления хромогенного субстрата.

В лунки %-луночного планшета помещали пластинки с иммобилизованным ТФ (размер 1x4 мм), добавляли 0,02 мл буфера А (50 мМ ТРИС-буфер, 150 мМ NaCI, 0,1% ПЭГ- 6000, рН 8,7). Для построения калибровочной кривой в лунки планшета вносили 0,02 мл раствора тромбопластина с концентрацией от 0 до 40 пМ с шагом 4. Точную концентрацию тромбопластина для калибровки определяли с помощью ACTICHROME-TF теста («American diagnostica», США). Далее во все лунки вносили 0,02 мл раствора фактора Vila (0,06 мкМ), содержащего хлорид кальция (15 мМ) в буфере А, инкубировали 5 мин. при комнатной температуре и добавляли 0,02 мл раствора фактора X (1,5 мкМ) в буфере А. Через 15 минут инкубации при 37°С активаторы вынимали и во все лунки добавляли 0,04 мл раствора, содержащего ЭДТА (25 мМ) и субстрат S-2765 (3,76 мМ) к фактору Ха, в буфере А. Скорость расщепления хромогенного субстрата S-2765 определяли по поглощению при 405 нм с помощью микропланшетного ридера Thermomax (Molecular Devices) в кинетическом режиме. Концентрацию ТФ определяли по калибровочной кривой, используя программу анализа данных Origin (Версия 6,0, Microcal Software, Inc.).

Плотность тканевого фактора на единицу поверхности вычисляли, зная концентрацию ТФ и площадь поверхности с иммобилизованным тканевым фактором.

Определение функциональной константы диссоциации (Ks) комплекса VIIa/ТФ: принцип метода заключается в титровании тканевого фактора, иммобилизованного на поверхности, разными концентрациями фактора Vila. Количество образовавшегося комплекса VIIa/ТФ определяли по скорости активации фактора X. Ks полагали равной концентрации фактора Vila, при которой достигается полумаксимальная скорость активации фактора X. Для сравнения исследовали аналогичные Ks монослоя фибробластов и растворимых форм ТФ фирмы Ренам, Dade Behring. Поверхностная плотность тканевого фактора на пленках с фибробластами и тканевым фактором была предварительно определена по максимальной активности в активации фактора X в присутствии избытка фактора Vila.

В серию лунок вносили пластинки с иммобилизованным ТФ (размер 1x4 мм) или пленки с фибробластами (размер 2x2 мм) и добавляли 0,02 мл буфера А. В другие лунки вносили 0,02 мл раствора ТФ (40 пМ). Добавляли 0,02 мл раствора фактора Vila в диапазоне концентраций от 0 до 8 нМ в буфере А, содержащем хлорид кальция (15 мМ). Инкубировали 5 мин. при комнатной температуре и добавляли 0,02 мл раствора фактора X (1,5 мкМ) в буфере А. Через 15 мин инкубации при 37°С нерастворимые активаторы вынимали из лунок и добавляли 0,04 мл раствора, содержащего ЭДТА (25 мМ) и субстрат S-2765 (3,76 мМ) к фактору Ха, в буфере А. В случае растворимых факторов реакцию останавливали добавлением 0,04 мл раствора, содержащего ЭДТА (25 мМ) и субстрат S-2765 (3,76 мМ). Скорость расщепления хромогенного субстрата S-2765 оценивали согласно методике определения плотности иммобилизованного ТФ. Ks - функциональную константу диссоциации комплекса фVIIa/ТФ определяли, аппроксимируя данные уравнением реакции с одним центром связывания в программе Origin (Версия 6,0, Microcal Software, Inc.).

Определение параметров пространственного роста сгустка в плазме крови: исследование пространственной динамики образования сгустка в плазме крови проводили с помощью прибора «Тромбоимиджер». Этот прибор был разработан в лаборатории физической биохимии системы крови ГНЦ РАМН. Сущность метода заключается в локальной активации свертывания (M.V. Ovanesov et al., 2002) и регистрации светорассеяния от растущего фибринового сгустка в тонком слое неперемешиваемой рекальцифицированной плазмы крови с добавленным ингибитором контактной активации свертывания.

Структурная схема прибора приведена на рис. 1. Плоскую тонкую (1мм) прозрачную кювету с образцом исследуемой плазмы крови помещали в водяной термостат, быстро и равномерно прогревающий кювету до заданной температуры. Затем в кювету помещали плоскую вставку (активатор), на торце которой иммобилизован тромбопластин. При контакте активатора с исследуемой плазмой

крови запускался процесс свертывания, который распространялся от активатора вглубь плазмы. Кювета освещалась монохроматическим излучением (Х=660 нм) и рассеянный сгустком и плазмой свет, проходя через оптический фильтр и систему линз, попадал на матрицу цифровой фотокамеры, которая осуществляла фотосъемку процесса с заданным интервалом времени (30 с) между кадрами. Полученная в ходе исследования серия фотографий показывала, как меняются размеры, форма и плотность сгустка во времени. Контролем служил эксперимент, в котором активацию свертывания проводили монослоем фибробластов. Образец такого эксперимента приведен на рис. 2.

V Кювета

Рис. 1. Структурная схема прибора «Тромбоимиджер»

Для получения количественных характеристик роста сгустка с помощью программного обеспечения прибора «Тромбоимиджер» выбирали участок на изображении растущего сгустка и измеряли профили светорассеяния в направлении, перпендикулярном поверхности активатора, в разные моменты времени от контакта активатора с плазмой (рис. 2, Б). Выбирали уровень светорассеяния, соответствующий сформировавшемуся фибриновому сгустку (горизонтальная линия на рис. 2, Б), строили график зависимости размера тромба от времени (рис. 2, В). Данный уровень выбирали равным половине от максимального уровня плато процесса распространения фронта фибринового сгустка. Как видно из рис. 2, В, некоторое время рост отсутствовал, потом начинался, и затем можно было выделить два участка с разной скоростью роста. Это давало три главных параметра, характеризующих процесс: время задержки роста сгустка (лаг-тайм, Ttag ) определяли как время, за которое размер сгустка достигает 50 мкм; начальная скорость роста сгустка (V^¡,¡31) - средняя скорость роста сгустка в течение 10 мин после лаг-тайма; стационарная скорость роста сгустка (Vslalionar) - средняя скорость роста сгустка в интервале времени от 30 мин до 40 мин.

А Б

Рис. 2. Исследование пространственной динамики образования фибринового сгустка в плазме крови при активации монослоем фибробластов: А - последовательная серия фотографий растущего сгустка; Б - профили светорассеяния сгустка, построенные по результатам эксперимента, изображенного на А; В - зависимость размера сгустка от времени. Количественные характеристики роста сгустка в этом эксперименте: лаг-тайм Т|а8 = 1,5 мин: начальная скорость роста сгустка Ушш - 52 мкм/мин; стационарная скорость роста сгустка Уяапопаг - 22 мкм/мин)

Результаты и обсуждение

Разработка и оптимизация метода иммобилизации тромбопластина.

Был выбран химический метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность активатора свертывания с использованием кросс-линкера, поскольку этим методом можно получить прочное закрепление белка на поверхности и максимальную плотность белка на единицу поверхности. Метод иммобилизации тромбопластина состоял из нескольких стадий. На первой стадии проводили активацию поверхности пластика путем нанесения на нее пленки на основе полиамина. В качестве полиамина выбрали полиэтиленимин. Подобрав соотношение компонентов пленки, получили поверхность с прочно прикрепленной пленкой с большим количеством активных аминогрупп. Необходимые механические свойства пленки: прочность ее закрепления, эластичность, равномерное покрытие были достигнуты за счет добавления в раствор полиэтиленимина глутарового альдегида и альбумина. Соотношение и концентрации реагентов активационной пленки были подобраны и составили: полиэтиленимин (40 г/л), глутаровый альдегид (1%-ный), альбумин (4 г/л) в соотношении 2:1:1.

На следующей стадии проводили ковалентную пришивку белка к активированной поверхности, используя бифункциональный сшивающий агент -глутаровый альдегид. Он наиболее широко применяется для иммобилизации белков, поскольку образует устойчивые соединения, связывая аминогруппы носителя с

11

аминогруппами иммобилизуемого белка. Это отличает его от других альдегидов, образующих лабильные Шиффовы основания, требующие восстановления боргидридом натрия. Условия иммобилизации тромбопластина были оптимизированы. Подобрана концентрация глутарового альдегида - 0,5 % раствор и тромбопластина - 12 нМ на стадиях иммобилизации белка.

Затем были исследованы различные характеристики иммобилизованного тканевого фактора (плотность, константа диссоциации его комплекса с фУПа, условия хранения) и проведено сравнение способности иммобилизованного тканевого фактора и тканевого фактора фибробластов активировать рост сгустка в пространстве.

Получение разной плотности тканевого фактора на поверхности пластика.

Зависимость плотности ТФ, пришитого к поверхности пластика, от концентрации тромбопластина в растворе, в котором проводилось связывание белка представлена на рис. 3, А. Если концентрация ТФ ~ 4 нМ (и меньше) плотность связанного тканевого фактора растет линейно с ростом концентрации белка в растворе. При инкубации пластинок в растворе с концентрацией выше 5-6 нМ плотность ТФ на поверхности перестает расти, и график выходит на плато. При этом максимальная плотность ТФ на поверхности достигает 98 ± 12,5 пмоль/м2, N =3 (N -количество опытов, приведено среднее значение ± SEM). Плотность ТФ на поверхности фибробластов, покрывающих поверхность сплошным монослоем, оказалась незначительно больше - 113 ± 12,3 пмоль/м2, N=3.

Изучение вопроса, не определяется ли насыщение недостатком ТФ в растворе, в котором проводилась инкубация, показало, что из раствора связывается не более 1% белка даже при минимальных концентрациях (рис. 3, Б). Так, при концентрации ТФ в растворе выше 1 нМ доля связанного белка не превышает 0,1 %.

120-,

2 4 6 8 Ю 12 Раствор ТФ, нМ

0 2 4 6 8 10 12

Раствор ТФ, нМ

Рис. 3. Зависимость плотности ТФ на поверхности активатора от концентрации раствора ТФ, в котором происходило связывание белка с поверхностью - А. Плотность определяли по функциональной активности ТФ (см. Материалы и методы) (N=3). Зависимость доли иммобилизованного ТФ от концентрации раствора ТФ - Б

Кинетика связывания тканевого фактора с фактором Vila.

Для того, чтобы исследовать изменения кинетических характеристик тканевого фактора при иммобилизации, мы провели изучение кинетики образования в растворе комплекса фактора Vila с тканевым фактором разного происхождения. Кинетика активации фактора X растворимым комплексом ТФ/VIIa для генно-инженерного человеческого тромбопластина Innovin фирмы «Dade Behring» представлена на рис. 4. Кривая явно имеет максимум, и начиная с концентраций Vila выше 1нМ тромбопластин Innovin ингибирует активацию фактора X. В тканевом факторе, выделенном из природных источников, всегда присутствует фосфолипидная компонента, поскольку ТФ является интегральным белком мембраны клеток. Видимо, синтетические фосфолипиды, входящие в состав генно-инженерного тромбопластина фирмы «Dade Behring» влияют на конформацию образующегося комплекса. Ks определенная для генно-инженерного тромбопластина оказалась равна 0,03 ± 0,005 нМ.

Концентрация Vila, нМ

Рис. 4. Скорость активации фактора X под действием комплекса ТФ/VIIa, образованного растворимым тромбопластином фирмы «Dade Behring» (40 пМ) и различными концентрациями фУИа. Измерено с помощью гидролиза хромогенного субстрата (V), (см. Материалы и методы).

Для кроличьего тромбопластина фирмы «Ренам» данные по кинетике образования комплекса ТФ/VIIa, представленные на рис. 5, А, хорошо описываются гиперболой. В двойных обратных координатах наблюдаются некоторые регулярные отклонения от прямой, указывающие на незначительную отрицательную кооперативность (рис. 5, Б). Но эти отклонения лежат в пределах ошибок измерения. Поэтому мы полагаем, что связывание фактора Vila с ТФ подчиняется простой бимолекулярной кинетике. Функциональная константа диссоциации Ks для этого комплекса равна 0,31±0,05 нМ (табл. 1).

25

I 20-

5 15 x

10-1

10-/

5- Г

0 2 4 6 8 Концентрация Vila, нМ

0,9 0,80,70,60,5 0,40,30,20,1 0,0

20 40 60 80 100 120 140

1/[Vlla], нМ"1

Рис. 5. Скорость активации фактора X под действием комплекса ТФ/VIIa, образованного растворимым тромболластином фирмы «Ренам» (40 пМ) и различными концентрациями фУНа. А - прямые координаты, Б - двойные обратные координаты. Измерено с помощью гидролиза хромогенного субстрата (V), (см. Материалы и методы).

Таблица 1

Функциональная константа диссоциации комплекса фактора Vila с тканевым фактором, полученным из разных источников

Источник ТФ Среднее значение ^s±SEM, нМ

Растворимый тромбопластин («Ренам») (N = 3) 0,31 ±0,05

Растворимый тромбопластин («Dade Behring»)* (N = 3) 0,03 ± 0,005

Иммобилизованный тромбопластин (N = 3) 0,90 ± 0,28

Пленка с монослоем фибробластов (N= 5) 0,35 ± 0,05

* Кинетика сильно отличается от гиперболической

Иммобилизация тромбопластина фирмы «Ренам» на поверхности не меняет качественно кинетику взаимодействия ТФ с фактором Vila (рис. 6, А). В обратных координатах точки также хорошо ложатся на прямую (рис. 6, Б). Однако константа диссоциации при этом оказалась втрое больше, чем для растворимого тромбопластина, а именно, 0,90 ± 0,28 нМ (табл. 1).

Концентрация Vila, нМ 1/[Vlla], нМ"1

Рис. 6. Скорость активации фактора X комплексом ТФ/VIIa, образованным тромбопластином фирмы «Ренам», иммобилизованным на пластиковую поверхность (размер активатора 1x4 мм; поверхностная плотность ТФ 90 пмоль/м2) и различными концентрациями фУИа. А - прямые координаты, Б - двойные обратные координаты. Измерено с помощью гидролиза хромогенного субстрата (V), (см. Материалы и методы).

Кинетика комплексообразования нативного тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов с фактором Vila тоже имеет гиперболическую зависимость (рис. 7, А). Это подтверждает анализ графика, построенного в двойных обратных координатах (рис. 7, Б). Константы диссоциации комплекса ТФ/VIIa для тканевого фактора на поверхности клеток и для растворимого тромбопластина фирмы «Ренам» оказались очень близки (табл. I).

О 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 120 140 160

Концентрация Vila, нМ 1/ [Vila], нМ"1

Рис. 7. Скорость активации фактора X комплексом ТФАШа, образованным тканевым фактором на поверхности фибробластов в присутствии различных концентраций фУИа (размер пленки с монослоем фибробластов 2x2 мм; поверхностная плотность ТФ 89 пмоль/м2). А - прямые координаты, Б - двойные обратные координаты. Измерено с помощью гидролиза хромогенного субстрата (V), (см. Материалы и методы).

Таким образом, иммобилизация тканевого фактора с помощью метода ковалентного пришивания, представленного в данной работе, сохраняет его кофакторную активность, но несколько меняет его кинетические характеристики по сравнению с растворимой формой ТФ и ТФ на поверхности клеток. Это, по всей

вероятности, указывает на некоторое нарушение нормальной конформации комплекса при иммобилизации. Насколько эти различия важны для активации свертывания и нормального роста сгустка, мы исследовали в опытах по изучению пространственной динамики роста фибринового сгустка.

Сравнение пространственной динамики роста фибринового сгустка в плазме крови при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

Была изучена способность иммобилизованного тромбопластина активировать свертывание в донорской плазме. На рис. 8 приведена последовательная серия фотографий растущего сгустка, полученная при активации образования фибринового сгустка тромбопластином, иммобилизованным на поверхности пластика.

А Б

Рис. 8. Исследование пространственной динамики образования фибринового сгустка в плазме крови при активации тромбопластином, иммобилизованным на поверхности пластика. А - последовательная серия фотографий растущего сгустка. Б - профили светорассеяния сгустка, построенные по результатам эксперимента, изображенного на А. Горизонтальная прямая проходит на уровне полумаксимального светорассеяния. В -зависимость размера сгустка от времени, полученная для эксперимента, приведенного на А. Количественные характеристики роста сгустка в этом эксперименте: лаг-тайм Т[а? = 1,0 мин., начальная скорость роста сгустка У^щ! = 54,7 мкм/мин, стационарная скорость роста сгустка Уяа.гопаг = 22 МКМ/МИН.

Активатор вызывает инициацию и рост нормального сгустка в плазме. Качественно и количественно все стадии процесса протекают так же, как и при активации фибробластами (рис. 2 и рис. 8). Количественный анализ кинетики роста подтвердил сходство искусственного активатора с естественным. Профили светорассеяния сгустка при активации свертывания тромбопластином, иммобилизованным на поверхности пластика (рис. 8, Б) очень похожи на аналогичные для фибробластов. Как оказалось, искусственный активатор даже

16

несколько лучше, поскольку пластиковая поверхность с иммобилизованным ТФ, дает меньшее искажение светорассеяния в приактиваторной области, чем подложка, на которой выращиваются фибробласты. Это проявляется в том, что пик светорассеяния вблизи активатора на пластиковой подложке значительно меньше (рис. 2 и рис. 8). Основные количественные характеристики роста сгустка (время задержки свертывания, начальная и стационарная скорость роста сгустка) для иммобилизованного тромбопластина и тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов достаточно идентичны (рис. 8 В, табл. 2).

Таблица 2

Количественные характеристики роста сгустка при активации свертывания

иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором монослоя фибробластов.

Активатор свертывания Tia6, МИН. Vmi,i„l, МКМ/МИН Vs,ali„M, мкм/мин

Иммобилизованный тромбопластин (N=26) 1,82±0,33 38,1±3,3 23,3±1,6

ТФ на поверхности монослоя фибробластов (N=6) 2,6±0,74 45,5±4,6 26,5±2,6

Приведены средние значения ± SEM

Исследование зависимости параметров роста сгустка от плотности тканевого фактора.

Исследование зависимости параметров роста сгустка от плотности иммобилизованного тканевого фактора на поверхности активатора показало, что лаг-тайм начинает увеличиваться, когда плотность уменьшается ниже 20 пмоль/м2 (рис. 9), и увеличивается довольно быстро по мере снижения плотности. Как начальная (рис. 10, А), так и стационарная (рис. 10, Б) скорости роста сгустка тоже слабо меняются при увеличении плотности ТФ выше 20 пмоль/м2.

ао-

X

2 ю-

О 20 «О €0 го

Плотность ТФ, пмоль/м3

Рис. 9. Зависимость времени задержки свертывания от плотности иммобилизованного тканевого фактора на поверхности, активирующей свертывание. Данные аппроксимированы экспонентой А = Aoexp(-t/i). Представлены средние значения ± SEM (N=3)

17

03040в0е0 0 30 40 GO Ю

Плотность ТФ, пмоль/м2 Платность ТФ, пмоль/м2

Рис. 10. Зависимости основных характеристик роста сгустка от плотности иммобилизованного тканевого фактора на поверхности активатора. А - зависимость начальной скорости роста сгустка от плотности иммобилизованного тканевого фактора на поверхности, активирующей свертывание. Б - зависимость стационарной скорости роста сгустка от плотности иммобилизованного тканевого фактора на поверхности, активирующей свертывание. Представлены средние значения ± SEM (N=3)

Таким образом для использования поверхности с иммобилизованным тканевым фактором в качестве активатора в методе по изучению пространственной динамики роста фибринового сгустка плотность тканевого фактора должна быть от 20 пмоль/м2 и выше. При этом параметры роста сгустка не изменяются.

Хранение активаторов с иммобилизованным тромбопластином.

При хранении активаторов с иммобилизованным тромбопластином в герметично запакованном виде при 4-8°С наблюдается снижение активности иммобилизованного тканевого фактора на единицу площади активатора (рис. 11, А).

Характерное время уменьшения активности равно 96±13 дней. Поскольку снижение активности тканевого фактора на активирующей поверхности начинает влиять на параметры роста сгустка только при снижении активности в 4-5 раз, влияние этого снижения начинает сказываться не сразу. На рис. 11, Б показано, как меняется лаг-тайм в ходе хранения активаторов. Видно, что увеличение лаг-тайма происходит только после 100 дней хранения активаторов. Аналогичные характеристики были получены и для скоростей роста сгустка (рис. 12).

100 200 300 Хранение, дни

Рис. 11.

100 200 300 Хранение, дни

активаторов

400

иммоби лизо ванным

не-

зависимость характеристик тромбопластином от времени хранения в герметично запакованном виде при 4-8"С. А -снижение активности ТФ на единицу площади поверхности при хранении активаторов. Данные аппроксимированы экспонентой А = Aoexp(-t/T), где Ао = 97,7±4,3 пмоль/м2, т = 96±13 дней. Б - зависимость времени задержки свертывания (T|ag) от времени хранения активаторов. Представлены средние значения ± SEM (N=2)

А R

S 40 2

I 30

120 >"ю

О 50 100 150 200250300350«»

Хранение, дни

50 100 150 200 250 300 350 400

Хранение, дни

Рис. 12. Зависимость параметров роста фибринового сгустка от времени хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином в герметично запакованном виде при 4-8°С. А - зависимость начальной скорости роста сгустка (V,nl„ai) от времени хранения активаторов; Б - зависимость стационарной скорости роста сгустка (Vmtjonar) от времени хранения активаторов. Представлены средние значения ± SEM (N=2)

Выводы

1. Разработанный метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность обеспечивает максимальную плотность тканевого фактора равную 98±12,5 пмоль/м2, которая близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;

2. Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на

фибробластах. Для иммобилизованного тканевого фактора Ks равна 0,9 нМ, что в 2,6 раза больше, чем для тканевого фактора на фибробластах;

3. Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах;

4. Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не более 100 дней.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Карамзин С.С., Фадеева O.A., Синауридзе Е.И., Атауллаханов Ф.И. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Сборник тезисов стендовых докладов на 1-м Международном Форуме по Нанотехнологиям, Москва, Россия, Декабрь 3-5, 2008, стр. 366-368.

2. Сошитова Н.П., Дашкевич Н.М., Фадеева O.A., Баландина А.Н., Пантелеев М.А., Ованесов М.В., Сарбаш В.И., Атауллаханов Ф.И. Новый метод диагностики системы свертывания крови: исследование пространственной генерации тромбина. Сборник тезисов на Всероссийской молодёжной научной конференции с международным участием «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», 51-я научная конференция МФТИ, Москва, Россия, 28-30 ноября, 2008, стр. 83-85 .

3. Фадеева O.A., Карамзин С.С., Синауридзе Е.И., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Сборник тезисов на 5-ом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, Март 16-20, 2009, стр. 130-131.

4. Фадеева O.A., Карамзин С.С., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Иммобилизация тромбопластина для изучения пространственной динамики тромбообразования. Сборник тезисов на 13-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, Россия, 28 сентября-2 октября 2009, стр. 180-181.

5. Фадеева O.A., Карамзин С.С., Синауридзе Е.И., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Иммобилизация тромбопластина для изучения пространственной динамики тромбообразования. Сборник тезисов на 2-ом Международном Форуме по Нанотехнологиям, Москва, Россия, Октябрь 6-8,2009, стр. 821-823.

6. Фадеева O.A., Карамзин С.С., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Разработка нового метода диагностики нарушений свертывания крови. Сборник тезисов на

Всероссийском совещании «Биоматериалы в медицине», Москва, Россия, 04 декабря 2009, стр.85-86.

7. Фадеева O.A., Пантелеев М.А., Карамзин С.С., Баландина А.Н., Смирнов И.В., Атауллаханов Ф.И. Тромбопластин, иммобилизованный на полистироловой поверхности, обладает кинетическими характеристиками, близкими к таковым для нативного белка, и активирует свертывание крови in vitro аналогично тромбопластину на фибробластах. Биохимия, 2010, 75(6), стр. 827-838.

Подписано в печать:

23.08.2010

Заказ № 4001 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фадеева, Ольга Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Методы иммобилизации биополимеров.

1.1.2. Методы нековалентной иммобилизации.

1.1.3. Методы ковалентной иммобилизации.

1.2. Применение иммобилизованных биополимеров.

1.3. Белок - тканевой фактор.

1.3.1. Структура тканевого фактора.

1.3.2. Функционирование тканевого фактора.

1.3.3. Регуляция экспрессии тканевого фактора.

1.3.4. Биологические функции тканевого фактора.

1.4. Тромбопластин в методах исследования свертывания крови.

1.5. Постановка задачи.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Доноры крови.

2.3. Подготовка плазмы крови.

2.4. Приготовление пленок с монослоем фибробластов.

2.5. Получение геля на основе альбумина.

2.6. Получение геля на основе альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.

2.7. Получение геля на основе полиэтиленимина.

2.8. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина.

2.9. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением метилцеллюлозы.

2.10. Получение геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.

2.11. Получение геля на основе полиакриламидного геля, в состав которого включен тромбопластин.

2.11.1. Приготовление полиакриламидного геля.

2.11.2. Введение тромбопластина в состав полиакриамидного геля.

2.12. Получение пленки для активации поверхности с дальнейшей иммобилизацией тромбопластина.

2.13. Метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность

2.14. Определение плотности тканевого фактора на поверхности.

2.15. Определение функциональной константы диссоциации (К^ комплекса УИа/ТФ.

2.16. Определение параметров пространственного роста сгустка в плазме, крови.

Глава 3. Результаты.

3.1. Подбор реагентов для получения полимерного геля, в состав которого включен тромбопластин.

3.1.1. Разработка геля на основе альбумина, стабилизированного глутаровым альдегидом.

3.1.5. Разработка геля на основе альбумина с добавлением в его состав тромбопластина.

3.1.2. Разработка геля на основе полиэтиленимина.

3.1.3. Разработка геля на основе полиэтиленимина и альбумина.

3.1.4. Разработка геля на основе альбумина и полиэтиленимина с добавлением метилцеллюлозы.

3.1.5. Разработка геля на основе полиэтиленимина и альбумина с добавлением в состав геля тромбопластина.

3.1.6. Разработка геля на основе полиакриламидного геля, в состав которого включен тромбопластин.

3.2. Разработка и оптимизация метода ковалентной иммобилизации тромбопластина.

3.2.1. Подбор состава пленки для активации поверхности.

3.2.2. Оптимизация условий иммобилизации тромбопластина.

3.3. Сравнение кинетических характеристик иммобилизованного тромбопластина с тканевым фактором фибробластов.

3.3.1. Получение разной плотности тканевого фактора на поверхности пластика.

3.3.2. Кинетика связывания тканевого фактора с фактором УПа.

3.3.3. Сравнение пространственной динамики роста фибринового сгустка в плазме крови при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

3.3.4. Исследование зависимости параметров роста сгустка от плотности тканевого фактора.

3.3.5. Хранение активаторов с иммобилизованным тромбопластином.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственная динамика образования фибринового сгустка при активации иммобилизованным тромбопластином"

Нарушения свертывания крови являются одной из ведущих причин смертности в современном мире, поскольку непременно возникают при сепсисе, травме, многих видах рака, тяжелых кровопотерях, любых существенных операционных вмешательствах и т.д. [1,2]. Диагностика этих нарушений до сих пор остается очень несовершенной и позволяет выявлять далеко не все нарушения в системе гемостаза. Основным недостатком большинства существующих тестов является то, что свертывание протекает одновременно во всем, объеме исследуемой пробы, и это принципиально отличается от условий, в которых сгусток-тромб образуется в живом организме [3,4].

Система гемостаза- представляет собой сложный каскад ферментативных реакций [5]. Свертывание начинается с контакта крови с поверхностью клеток, находящихся в зоне повреждения стенки сосуда-Клетки, находящиеся под эндотелием, имеют на поверхности- белок, который является сигналом для запуска свертывания. Этим главным активатором свертывания является^ интегральный мембранныйs белок -тканевой фактор (ТФ) [6]. Он находится на поверхности всех клеток нашего* организма, не имеющих прямого контакта с кровью. Тканевой фактор не обладает ферментативной активностью, но является кофактором фактора свертывания Vila — сериновой протеазы. Когда фактор Vila связывается с тканевым фактором, получившийся комплекс, называемый внешней теназой, становится способен активировать факторы IX и X, что запускает весь каскад свертывания и приводит к образованию сгустка [5]. Процесс довольно сложен не только с точки зрения биохимических превращений. Важно учитывать его пространственную неоднородность и диффузию факторов свертывания [7]. Пространственная динамика свертывания может быть условно разделена на несколько стадий: 1) активация: в зоне повреждения к кровь контактирует с клетками, имеющими на клеточных мембранах иммобилизованный тканевой фактор; при этом образуется комплекс УПа/ТФ, который начинает процесс свертывания, активируя фактор X на поврежденной поверхности; 2) рост сгустка вдали от активатора, который определяется диффузией и образованием новых активных факторов, не связанным с активностью комплекса УПа/ТФ, а обусловленным специальными реакциями поддержания роста; 3) остановка роста сгустка, которая происходит на довольно большом расстоянии от зоны активации. Она обусловлена особым каскадом биохимпических реакций, инактивирующих активные факторы свертывания.

В традиционных тестах по исследованию свертывания, активаторы добавляются в объем плазмы, и все активно перемешивается. В результате доминирующими оказываются реакции только первой стадии. Нарушения в остальных стадиях обнаруживаются такими методами довольно плохо.

Разработанный в лаборатории физической биохимии ГНЦ РАМН метод и прибор для исследования пространственной динамики свертывания плазмы крови, позволяет наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде [8-10]. В основе метода лежит активация свертывания на, стенке измерительной камеры с помощью специального покрытия, содержащего главный белок-активатор свертывания в организме — тканевой фактор. Появление и пространственный рост сгустка от активатора регистрируется по светорассеянию методом темного поля. При этом можно измерять такие важные характеристики процесса как скорость роста, размер сгустка, образование спонтанных сгустков - информацию, которая недоступна гомогенным методам [7,8,11-14]. Это позволяет одновременно и независимо регистрировать нарушения на всех стадиях процесса. Таким образом, например, было показано, что при классических гемофилиях, когда генетически дефектен один из факторов свертывания, нарушения происходят в фазе роста сгустка, но не активации свертывания. Клинические перспективы исследования пространственной динамики свертывания велики, однако его внедрение в клиническую* практику тормозится тем, что в представленном в литературе варианте метода для активации свертывания был использован монослой фибробластов, получаемых в первичной культуре клеток [8]. Такая технология является дорогостоящей и трудоемкой и вряд ли может стать основой для проведения рутинных исследований. Поэтому перед нами встала задача разработать ту часть экспериментальной установки, которая имитирует зону повреждения стенки сосуда. Таким элементом измерительной кюветы является пластинка, на поверхности которой должен находится иммобилизованный тромбопластин. В дальнейшем будем называть ее активатором свертывания. Нужно было разработать активатор свертывания, сравнимый по способности активировать свертывание с поверхностью покрытой фибробластами, но более удобный в применении и стабильный при хранении.

Существует два основных метода иммобилизации белков: физический - сорбция, и химический - ковалентная> сшивка. Мы выбрали химический метод иммобилизации, так как при этом достигается более прочное закрепление белка на поверхности. Кроме того, иммобилизованные таким образом- белки, как правило, гораздо более стабильны. Известны многочисленные способы иммобилизации белков на поверхностях различной природы. Один из наиболее распространенных подходов - это химическая модификация поверхности. Например, обработка стеклянной поверхности 3-аминопропилтриэтоксисиланом приводит к связыванию с поверхностью стекла молекул, имеющих в своем составе первичные аминогруппы. В дальнейшем, эти группы ковалентно связываются с белками [15]. Описан способ нитрования поверхности из полистирола нитротетрафторборатом в тетраметиленсульфоне с последующим восстановлением нитрогрупп хлоридом олова (И), также приводящий к образованию на поверхности первичных аминогрупп [16].

Другой подход состоит в формировании на поверхности пленки* из полимера, содержащего в своем составе активные группы, например, аминогруппы. В этом случае уже не столь важно, поверхность из какого материала находится под пленкой, что позволяет иммобилизовать белок практически на любой поверхности. Описан способ подготовки носителя для иммобилизации белков, который включает осаждение полиамина на носителе типа неорганической окиси (пористого стекла, кремнезема) и обработку покрытого полимером носителя бифункциональным реактивом (глутаровым альдегидом), который^ образует поперечные сшивки в полиамине с целью его закрепления на носителе в виде однородной пленки [17]. Недостатком, этого метода является'то, что хорошая^ пленка образуется только- на тонкоизмельченных макропористых поверхностях с сильноразвитой поверхностью. На гладких поверхностях такая пленка не держится и> растрескивается. Это метод был взят нами за основу ^модифицирован так, чтобы получить активатор с иммобилизованным тромбопластином.

Пель работы: Разработка метода иммобилизации тромбопластина. на поверхности активатора свертывания: Сравнение способности активировать* свертывание крови иммобилизованным- тромбопластином и тканевым фактором фибробластов:

Задачи исследования:

1) Разработать метод иммобилизации тромбопластина на пластиковой поверхности активатора свертывания;

2) Исследовать поверхностную плотность и биохимические характеристики иммобилизованного тканевого фактора* (константу связывания с фУНа, условия хранения активатора свертывания);

3) Исследовать пространственную динамику роста фибринового сгустка при активации свертывания иммобилизованным тромбопластином и тканевым фактором фибробластов.

Научная новизна. Разработан и оптимизирован, метод получения активатора свертывания с иммобилизованным тромбопластином. При этом' плотность и активность, иммобилизованного тканевого фактора близки к соответствующим параметрам монослоя природных фибробластов. Для активации поверхности пластика на первой стадии иммобилизации белка был выбран метод формирования реакционно-способной пленки, на основе полиэтиленимина. Необходимые механические свойства пленки: прочность ее закрепления, эластичность, равномерное покрытие были достигнуты за счет добавления в раствор полиэтиленимина глутарового альдегида и альбумина. Кинетические характеристики иммобилизованного тромбопластина практически соответствуют аналогичным характеристикам нативного тканевого фактора фибробластов. Он стабилен при хранении (инактивируется с характерным временем 100 дней)- и активирует свертывание in vitro аналогично тканевому фактору на фибробластах.

Практическая значимость работы. Разработан метод- иммобилизации тромбопластина, с помощью которого »получена пластиковая поверхность с плотностью иммобилизованного тканевого фактора примерно равной плотности этого белка на наиболее активных в отношении активации свертывания клетках - фибробластах. Полученный активатор свертывания является новым средством, которое может быть эффективно-использовано при исследовании гемостаза: Применение активатора свертывания в приборе по исследованию пространственной' динамики роста фибринового сгустка, в качестве составной части нового клинического метода, имеет важное практическое значение в диагностике и лечении болезней, связанных с нарушением системы свертывания.

Положения, выносимые на защиту:

1) Разработан метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность;

2) Максимальная, плотность иммобилизованного тканевого фактора близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;

Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на фибробластах;

Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах; Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не более 100 дней.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фадеева, Ольга Александровна

Выводы

1) Разработанный метод иммобилизации тромбопластина на пластиковую поверхность обеспечивает максимальную плотность тканевого фактора равную 98±12,5 пмоль/м2, которая близка к плотности тканевого фактора на поверхности монослоя фибробластов;

2) Кинетика связывания иммобилизованного тканевого фактора с фактором Vila качественно совпадает с кинетикой связывания тканевого фактора на фибробластах. Для иммобилизованного тканевого фактора Ks равна 0,9 нМ, что в 2,6 раза больше, чем для тканевого фактора на фибробластах;

3) Тромбопластин, иммобилизованный на пластиковой поверхности, активирует пространственный рост фибринового сгустка аналогично тканевому фактору на фибробластах;

4) Срок хранения активаторов с иммобилизованным тромбопластином для использования в методе пространственной динамики свертывания составляет не менее 100 дней.

Благодарности

Эта работа была бы невозможна без помощи и поддержки со стороны моих коллег, которым я хотела бы выразить свою глубокую и искреннюю признательность. Я хочу поблагодарить коллектив лаборатории физической биохимии системы крови: Пантелеева Михаила, Баландину Анну, Карамзина Сергея, Шибеко Алексея, Синауридзе Елену Ивановну, Кузнецову Соню; коллектив лаборатории новых методов препаратной трансфузиологии: Гладуна Виталия, Носову Валерию, Трифонову Елену за поддержку и терпение. Для меня большое удовольствие поблагодарить моих научных руководителей, Фазоила Иноятовича Атауллаханова и Илью Валерьевича Смирнова, за их постоянное внимание, помощь и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фадеева, Ольга Александровна, Москва

1. Воробьев АИ, Городецкий ВМ, Шулутко ЕМ, Васильев С А. Острая массивная кровопотеря. М: ГЭОТАР-МЕД, 2001.

2. Chakrabarti R, Das SK. Advances in antithrombotic agents. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 2007; 5: 175-185.

3. Hemker HC, Béguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

4. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции. Клиническая онкогематология 2008; 1: 174-181.

5. Butenas S, Mann KG. Blood coagulation. Biochemistry (Mosc) 2002; 67: 312.

6. Monroe DM, Key NS. The tissue factor-factor Vila complex: procoagulant activity, regulation, and multitasking. J Thromb Haemost 2007; 5: 10971105.

7. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57.

8. Ataullakhanov FI, Volkova RI, Guriia GT, Sarbash VI. Spatial aspects of blood coagulation dynamics. III. Growth of clots in vitro. Biofizika 1995; 40: 1320-1328.

9. Ataullakhanov FI, Guria GT, Sarbash VI, Volkova RI. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim BiophysActa 1998; 1425: 453-468.

10. Sinauridze EI, Volkova RI, Krasotkina YV, Sarbash VI, Ataullakhanov FI. Dynamics of clot growth induced by thrombin diffusing into nonstirred citrate human plasma. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 607-616.

11. Kondratovich AY, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta 2002; 1569: 86-104.

12. Ovanesov MV, Lopatina EG, Saenko EL, Ananyeva NM, Ul'yanova LI, Plyushch OP, Butilin AA, Ataullakhanov FI. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

13. Ovanesov MV, Ananyeva NM, Panteleev MA, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3: 321-331.

14. Messing, R. A. Enzyme stabilization. 3556945. 1971. US Patent

15. Clark, B. Activated and conjugated polystyrene substrate. 6361936. 2002. US Patent

16. Rohrbach, R. P. Support matrices for immobilized enzymes. 4268419. 1981. US Patent

17. Growdon JH. Biomarkers of Alzheimer disease. Arch Neurol 1999; 56: 281283.

18. Sander C. Genomic medicine and the fixture of health care. Science 2000; 287: 1977-1978.

19. Keusgen M. Biosensors: new approaches in drug discovery. Naturwissenschaften 2002; 89: 433-444.

20. Chatelier RC, Gengenbach TR, Vasic ZR, Griesser HJ. Covalent attachment and non-specific binding of reactive probe molecules onto surfaces. J Biomater Sei Polym Ed 1995; 7: 601-622.

21. Cao L. Carrier-bound immobilized enzymes: principles, applications and design . WILEY-VCH Verlsg GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2005.

22. Trevan MD. Enzyme Immobilization by Adsorption. New Protein Techniques Book, 1988.

23. Kronenburg NA, de Bont JM, Fischer L. Improvement of enantioselectivity by immobilized imprinting of epoxide hydrolase from Rhodotorula glutinis. J Mol Catal B:Enzymatic 2001; 16: 121-129.

24. Camarero JA. Recent developments in the site-specific immobilization of proteins onto solid supports. Biopolymers 2008; 90: 450-458.

25. Rusmini F, Zhong Z, Feijen J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules 2007; 8: 1775-1789.

26. Cao L. Immobilised enzymes: science or art? Curr Opin Chem Biol 2005; 9: 217-226.

27. Nelson JM, Griffin EG. Adsorption of invertase. J Am Chem Soc 1916; 38: 1109-1115.

28. Ulbrich R, Golbik R, Schellenberger A. Protein adsorption and leakage in carrier-enzyme systems. Biotechnol Bioeng 1991; 37: 280-287.

29. Angenendt P, Glokler J, Sobek J, Lehrach H, Cahill DJ. Next generation of protein microarray support materials: evaluation for protein and antibody microarray applications. J ChromatogrA 2003; 1009: 97-104.

30. Arenkov P, Kukhtin A, Gemmell A, Voloshchuk S, Chupeeva V, Mirzabekov A. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions. Anal Biochem 2000; 278: 123-131.

31. Afanassiev V, Hanemann V, Wolfl S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res 2000; 28: E66.

32. Choi D, Lee W, Park J, Koh W. Preparation of poly(ethylene glycol) hydrogels with different network structures for the application of enzyme immobilization. BiomedMater Eng 2008; 18: 345-356.

33. Ghanema A, Schurig V. Entrapment of Pseudomonas cepacia lipasewith peracetylated b-cyclodextrin in sol-gel: application to the kinetic resolution of secondary alcohols. TetrahedronAsymmetry 2003; 14: 2547-2555.

34. Nguyen DT, Smit M, Dunn B, Zink JI. Stabilization of creatine kinase encapsulated in silicate sol-gel materials and unusual temperature effects on its activity. Chem Mater 2002; 14: 4300-4306.

35. Reetz MT, Tielman P, Wiesenhoefer W, Koenen W, Zonta A. Second generation sol-gel encapsulated lipases: robust heterogeneous biocatalysts. Adv Syn Catal 2003; 345: 717-728.

36. Daryl К, Eggers A, Joan S. Valentine molecular confinement influences protein structure and enhances thermal protein stability. Protein Sci 2001; 10: 250-261.

37. Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabelcov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques 2003; 34: 1008-20, 1022.

38. Demers N, Agostinelli E, Averill-Bates DA, Fortier G. Immobilization of native and poly(ethylene glycol)-treated ('PEGylated') bovine serum amine oxidase into a biocompatible hydrogel. Biotechnol Appl Biochem 2001; 33: 201-207.

39. Kersten B, Possling A, Blaesing F, Mirgorodskaya E, Gobom J, Seitz H. Protein microarray technology and ultraviolet crosslinking combined with mass spectrometry for the analysis of protein-DNA interactions. Anal Biochem 2004; 331: 303-313.

40. Cosnier S. Biomolecule immobilization on electrode surfaces by entrapment or attachment to electrochemically polymerized films. A review. Biosens Bioelectron 1999; 14: 443-456.

41. Cosnier S. Biosensors based on immobilization of biomolecules by electrogenerated polymer films. New perspectives. Appl Biochem Biotechnol 2000; 89: 127-138.

42. Cho HM, Cho DY, Jeon JY, Hwang SY, Ahn IS, Choo J, Lee EK. Fabrication of protein-anchoring surface by modification of Sio(2) with liposomal bilayer. Colloids Surf B Biointerfaces 2009.

43. Ueda T, Watanabe A, Ishihara K, Nakabayashi N. Protein adsorption on biomedical polymers with a phosphorylcholine moiety adsorbed with phospholipid. J Biomater Sci Poly m Ed 1991; 3: 185-194.

44. Jans K, Bonroy K, De PR, Reekmans G, Jans H, Laureyn W, Smet M, Borghs G, Maes G. Stability of mixed PEO-thiol SAMs for biosensing applications. Langmuir 2008; 24: 3949-3954.

45. Cass T, gler, FS. Immobilized biomolecules in analysis. A practical approach. Oxford University Press, 1998.

46. Cruise GM, Scharp DS, Hubbell JA. Characterization of permeability and network structure of interfacially photopolymerized' poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Biomaterials 1998; 19: 1287-1294.

47. Arabi H, Hashemi SA, Fooladi M. Microencapsulation of allopurinol by solvent evaporation and controlled release investigation of drugs. J Microencapsul 1996; 13: 527-535.

48. Arshady R. Preparation of nano- and microspheres by polycondensation techniques. J Microencapsul 1989; 6: 1-12.

49. Latha MS, Jayakrishnan A. A new method for the synthesis of smooth, round, hydrophilic protein microspheres using low concentrations of polymeric dispersing agents. J Microencapsul 1995; 12: 7-12.

50. Gao F, Su ZG, Wang P, Ma GH. Double emulsion templated microcapsules with single hollow cavities and thickness-controllable shells. Langmuir 2009; 25: 3832-3838.

51. Samad A, Sultana Y, Aqil M. Liposomal drug delivery systems: an update review. Curr Drug Deliv 2007; 4: 297-305.

52. Pohar A, Plazl I, Znidarsic-Plazl P. Lipase-catalyzed synthesis of isoamyl acetate in an ionic liquid/n-heptane two-phase system at the microreactor scale. Lab Chip 2009; 9: 3385-3390.

53. Wilchek M, Bayer EA. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications. Anal Biochem 1988; 171: 1-32.

54. Wacker R, Schroder H, Niemeyer CM. Performance of antibody microarrays fabricated by either DNA-directed immobilization, direct spotting, or streptavidin-biotin attachment: a comparative study. Anal Biochem 2004; 330: 281-287.

55. Ramachandran N, Hainsworth E, Bhullar B, Eisenstein S, Rosen B, Lau AY, Walter JG, LaBaer J. Self-assembling protein microarrays. Science 2004; 305: 86-90.

56. Klibanov AM. Enzyme stabilization by immobilization. Anal Biochem 1979; 93: 1-25.

57. Cuatrecasas P: Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and Polyacrylamide beads. J Biol Chem 1970; 245: 3059-3065.

58. Welle A, Gottwald E, Weibezahn KF. Patterned polymer surfaces for cell culture applications. BiomedTech (Berl) 2002; 47 Suppl 1 Pt 1: 401-403.

59. Bethell GS, Ayers JS, Hancock WS, Hearn MT. A novel method' of activation of cross-linked agaroses with l,l'-carbonyldiimidazole which gives a matrix for affinity chromatography devoid of additional charged groups. J Biol Chem 1979; 254: 2572-2574.

60. Potuzak H, Dean PD. Affinity adsorbents consisting of nucleic acids immobilized via bisoxirane activated polysaccharides. Nucleic Acids Res 1978; 5: 297-303.

61. Sobek J, Schlappbach R. Substrate architecture and functionality defining the properties and performance of DNA, peptide, protain and carbohydrate microarrays. PharmagenomicsSubstrate 2004; 32-44.

62. Avseenko NV, Morozova TY, Ataullakhanov FI, Morozov VN. Immunoassay with multicomponent protein microarrays fabricated by electrospray deposition. Anal Chem 2002; 74: 927-933.

63. Ferrua B, Maiolini R, Masseyeff R. Coupling of gamma-globulin to microcrytstalline cellulose by periodate oxidation. J Immunol Methods 1979; 25: 49-53.

64. Hoffman1 DR, Grossberg AL, Pressman D. Specificity fractionation of antibodies from individual animals against the 3-nitro-4-hydroxy-5-iodophenylacetyl (NIP) determinant. Immunochemistry 1971; 8: 769-784.

65. Matsumoto I, Mizuno Y, Seno N. Activationr of Sepharose with epichlorohydrin and subsequent immobilization of ligand, for affinity adsorbent. JBiochem 1979; 85: 1091-1098.

66. Mattson G, Conklin E, Desai S, Nielander G, Savage MD, Morgensen S. A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep 1993; 17: 167-183.

67. Wong SS, Wong LJ. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes. Enzyme Microb Technol 1992; 14: 866-874.

68. Migneault I, Dartiguenave C, Bertrand MJ, Waldron KC. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques 2004; 37: 790-802.

69. Delehanty JB, Ligler FS. Method for printing functional protein microarrays. Biotechniques 2003; 34: 380-385.

70. Brinkley M. A brief survey of methods for preparing protein conjugates with dyes, haptens, and cross-linking reagents. Bioconjug Chem 1992; 3: 2-13.

71. Ohtsuka K, Kajiki R, Waki M, Nojima T, Takenaka S. Immobilization of sunflower trypsin inhibitor (SFTI-1) peptide onto a gold surface and analysis of its interaction with trypsin. Analyst 2004; 129: 888-889.

72. Xu C, Cai H, Xu Q, He P, Fang Y. Characterization of single-stranded DNA on chitosan-modified electrode and its application to the sequence-specific DNA detection. Fresenius J Anal Chem 2001; 369: 428-432.

73. Rasooly A, Herold KE. Biosensors for the analysis of food- and waterborne pathogens and their toxins. J AO AC Int 2006; 89: 873-883.

74. Erickson D, Mandal S, Yang AH, Cordovez B. Nanobiosensors: optofluidic, electrical and mechanical approaches to biomolecular detection at the nanoscale. MicrofluidNanofluidics 2008; 4: 33-52.

75. Engvall E. The ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Clin Chem 2009.

76. Ross JS, Schenkein DP, Kashala O, Linette GP, Stec J, Symmans WF, Pusztai L, Hortobagyi GN. Pharmacogenomics. Adv Anat Pathol 2004; 11: 211-220.

77. Mendoza LG, McQuary P, Mongan A, Gangadharan R, Brignac S, Eggers M. High-throughput microarray-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Biotechniques 1999; 27: 778-6, 788.

78. Huang RP. An array of possibilities in cancer research using cytokine antibody arrays. Expert Rev Proteomics 2007; 4: 299-308.

79. Brody EN, Willis MC, Smith JD, Jayasena S, Zichi D, Gold L. The use of aptamers in large arrays for molecular diagnostics. Mol Diagn 1999; 4: 381388.

80. Sun Z, Fu X, Zhang L, Yang X, Liu F, Hu G. A protein chip system for parallel analysis of multi-tumor markers and its application in cancer detection. Anticancer Res 2004; 24: 1159-1165.

81. Nakabayashi N, Williams DF. Preparation of non-thrombogenic materials using 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine. Biomaterials 2003; 24: 2431-2435.

82. Ishihara K, Oshida H, Endo Y, Watanabe A, Ueda T, Nakabayashi N. Effects of phospholipid adsorption on nonthrombogenicity of polymer with phospholipid polar group. JBiomedMater Res 1993; 27: 1309-1314.

83. Colman RW. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2006.

84. Owen С A. A History of Blood Coagulation. Rochester: Mayo Foundation, 2001.

85. Douglas S. Coagulation history, Oxford 1951-53. Br J Haematol 1999; 107: 22-32.

86. Butenas S, Branda RF, van't Veer C, Cawthern KM, Mann KG. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation. Thromb Haemost 2001; 86: 660-667.

87. Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 2008; 1: 50-62.

88. Roy S, Hass PE, Bourell JH, Henzel WJ, Vehar GA. Lysine residues 165 and 166 are essential for the cofactor function of tissue factor. J Biol Chem 1991; 266: 22063-22066.

89. Nemerson Y. Tissue factor and hemostasis. Blood 1988; 71: 1-8.

90. Martin DM, Boys CW, Ruf W. Tissue factor: molecular recognition and cofactor function. FASEBJ1995; 9: 852-859.

91. Rapaport SI. Regulation of the tissue factor pathway. Ann N Y Acad Sei 1991; 614: 51-62.

92. Komiyama Y, Pedersen AH, Kisiel W. Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor Vila: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor. Biochemistry 1990; 29: 9418-9425.

93. Bom VJ, Bertina RM. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochem J1990; 265: 327-336.

94. Lawson JH, Butenas S, Mann KG. The evaluation of complex-dependent alterations in human factor Vila. J Biol Chem 1992; 267: 4834-4843.

95. Ruf W, Rehemtulla A, Morrissey JH, Edgington TS. Phospholipid-independent and -dependent interactions required for tissue factor receptor and cofactor function. J Biol Chem 1991; 266: 16256.

96. Roy S, Paborsky LR, Vehar GA. Self-association of tissue factor as revealed by chemical crosslinking. J Biol Chem 1991; 266: 4665-4668.

97. Bach R, Königsberg WH, Nemerson Y. Human tissue factor contains thioester-linked palmitate and stearate on the cytoplasmic half-cystine. Biochemistry 1988; 27: 4227-4231.

98. Ruf W, Miles DJ, Rehemtulla A, Edgington TS. Tissue factor residues 157167 are required for efficient proteolytic activation of factor X and factor VII. J Biol Chem 1992; 267: 22206-22210.

99. Furie B, Furie BC. The molecular basis of blood coagulation. Cell 1988; 53: 505-518.

100. Mann KG. Membrane-bound enzyme complexes in blood coagulation. Prog Hemost Thromb 1984; 7: 1-23.

101. Cutsforth GA, Whitaker RN, Hermans J, Lentz BR. A new model to describe extrinsic protein binding to phospholipid membranes of varying composition: application to human coagulation proteins. Biochemistry 1989; 28: 7453-7461.

102. Nelsestuen GL, Kisiel W, Di Scipio RG. Interaction of vitamin K dependent proteins with membranes. Biochemistry 1978; 17: 2134-2138.

103. Sakai T, Lund-Hansen T, Thim L, Kisiel W. The gamma-carboxyglutamic acid domain of human factor Vila is essential for its interaction with cell surface tissue factor. J Biol Chem 1990; 265: 1890-1894.

104. Wildgoose P, Kazim AL, Kisiel W. The importance of residues 195-206 of human blood clotting factor VII in the interaction of factor VII with tissue factor. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 7290-7294.

105. Toomey JR, Smith KJ, Stafford DW. Localization of the human tissue factor recognition determinant of human factor Vila. J Biol Chem 1991; 266: 19198-19202.

106. Wildgoose P, Jorgensen T,.Komiyama Y, Nakagaki T, Pedersen A, Kisiel W. The role of phospholipids and the factor VII G la-domain in the interaction of factor VII with tissue factor. Thromb Haemost 1992; 67: 679685.

107. Chase T, Jr., Shaw E. Comparison of the esterase activities of trypsin, plasmin, and thrombin on guanidinobenzoate esters. Titration of the enzymes. Biochemistry 1969; 8: 2212-2224.

108. Smith RL. Titration of activated bovine Factor X. J Biol Chem 1973; 248: 2418-2423.

109. Bach R, Gentry R, Nemerson Y. Factor VII binding to tissue, factor in reconstituted' phospholipid vesicles: induction of cooperativity by phosphatidylserine. Biochemistry 1986; 25: 4007-4020.

110. Neuenschwander PF, Branam DE, Morrissey JH. Importance of substrate . composition, pH and other variables on tissue factor enhancement of factor

111. Vila activity. Thromb Haemost 1993; 70: 970-977.

112. Fiore MM; Neuenschwander PF, Morrissey JH. The biochemical basis for the apparent defect of soluble mutant tissue factor in enhancing the proteolytic activities of factor Vila. J Biol Chem 1994; 269: 143-149.

113. Crompton IE, Waley SG. The determination of specificity constants in enzyme-catalysed reactions. Biochem J1986; 239: 221-224.

114. Morrison SA. Kinetics of activation of human prothrombin. Use of a fluorescein-labeled derivative to obtain kinetic constants as a function of factor V concentration and activation state. Biochemistry 1983; 22: 40534061.

115. Carmeliet P, Collen D. Tissue factor. Int J Biochem Cell Biol 1998; 30: 661667.

116. Krishnaswamy S, Field KA, Edgington TS, Morrissey JH, Mann KG. Role of the membrane surface in the activation of human coagulation factor X. J Biol Chem 1992; 267: 26110-26120.

117. Hemker HC, Al DR, De SE, Béguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb Haemost 2006; 96: 553-561.

118. Al DR, Peyvandi F, Santagostino E, Giansily M, Mannucci PM, Schved JF, Béguin S, Hemker HC. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to clinical bleeding. Thromb Haemost 2002; 88: 576582.

119. Tengvall, P. and Lundstrom, I. Determination of polymerization/coagulation in a fluid: 6379976. 2002. US Patent

120. Zweig, S. E., Sharma, S., and Meyer, В. G. Test articles for performing dry reagent prothrombin time assays. 5418141. 1995. US Patent

121. Orvim U, Roald HE, Stephens RW, Roos N, Sakariassen KS. Tissue factor-induced coagulation triggers platelet thrombus formation as efficiently as fibrillar collagen at arterial blood flow conditions. Arterioscler Thromb 1994; 14: 1976-1983. •

122. Козинец Г.И., Макаров В.А. Исследование системы крови в клинической практике. 1997. Москва, Триада-Х.

123. Hoffman M, Monroe DM, III. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001; 85: 958-965.

124. Ataullakhanov FI, Pohilko AV, Sinauridze EI, Volkova RI. Calcium threshold in human plasma clotting kinetics. Thromb Res 1994; 75: 383-394.

125. Hendriks, M., Verhoeven, M., Cahalan, L. L., Cahalan, P. T., and Fouache, B. Method of modifying the surface of a medical device. 5811151. 1998. US Patent

126. Schullek JR, Ruf W, Edgington TS. Key ligand interface residues in tissue factor contribute independently to factor Vila binding. J Biol Chem 1994; 269: 19399-19403.

127. Defilippi, L. J. Process for preparing immobilized enzymes. 4229536. 1980. US Patent

128. Broze GJ, Jr., Leykam JE, Schwartz BD, Miletich JP. Purification of human brain tissue factor. J Biol Chem 1985; 260: 10917-10920.