Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Простекобактерии почвы

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Простекобактерии почвы"



ВАСИЛЬЕВА Лина Васильевна ПРОСТЕКОБАКТЕРИИ ПОЧВЫ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Академия наук СССР

/

Институт микробиологии

На правах рукописи УДК 631.46

Москва 1990

Работа выполнена в Институте микробиология АН СССР.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.Г.Звягинцев,

доктор биологических наук, профессор Б.В.Громов,

доктор биологических наук В.М.Горшекко.

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева.

Защита диссертации состоится " "_1990 г.

в_час мин, на заседании Специализированного Совета

Д.002.54.01 при Институте микробиологии АН СССР, г. Москва по адресу: 117811, Москва В-8П, проспект 60-летия Октября, дом 7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан " "_1990 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

канд. Зиол. наук Л.Е.Никитин

Технический редактор С.К. Сведлова Т-15'269. 21.12.89. Формат 60x84/16 Уч.-изд. л. 1,7 . Тираж 150. Заказ 101

Отпечатано в ИАЭ

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Часть I. ВВЕДЕНИЕ.

Одна из основных проблем, стоящих перед микробиологией, -расширение наших знаний о группах микроорганизмов, участвующих з природных процессах, - имеет значение не только в чисто тео-ютическом плане понимания эволюции и систематики микроорганиз-юв, но позволяет уяснить ход процессов в естественной обста-ювке. Это необходимо для прогнозирования микробных процессов в гриродкых экосистемах.

Изучение физиологических групп микроорганизмов, участвующих ! круговороте углерода, имеет решающее значение дая понимания гочвенных процессов и динамики превращения веществ в почве в юзультате ее использования в хозяйственной деятельности чело-зека.

Простекобактерии представляют филогенетически единую морйо-жзиологическуго группу протеобактерий, легко идентифицируемую шкроскспически и занимающую определенное место в последователь-юсти микробных процессов в почве.

Актуальность теш. Изменение микробиологических процессов в ючве под воздействием человека требует выявления индикаторных зорм, которые можно было бы использовать для установления нап-)авленности происходящих в почве изменений. Расширение сведений > многообразии бактерий, принадаэ:хащих к специфическим группам 1 в частности сведений о простексбакгериях:

- расширяет банк генетических данных;

- выявляет роль функциональных группировок шкроорганизмов

• в биогеохкмическом цикле углерода;

- позволяет индицировать этапы в микробной сукцессии при разложении органического вещества.

Цель и задачи работы. Цаюыо настоящего исследования являлось:» >озданае коллекции чистых культур простскобактерий и иных бактерий с необычной морфологией; монографическое описание их как козой систематической и шрфо-фпзиологической группы и выяснение ос рати в природе.

Для достижения поставленной цели необходимо баю решить следующие задачи:

I. Разработать метода обнаружения и выделения чистых культур 1ростекобактэрий и бактерий с необычной морфологией.

2. Разработать методы культивирования и исследования физиологии выделенных культур.

3. Изучить зависимость морфологии, цикла развития, тонкого строения от условий внешней среды.

4. Выяснить место этой группы организмов в трофической системе микробных процессов почвы и их взаимодействие с другими микроорганизмами.

Научная новизна работы. Настоящая работа является первым в мире исследованием аэробных почвенных простекобактерий. Установлено существование нового, ранее неизвестного среди бактерий плана строения плоских клеток с радиально-лучевой симметрией.

Создана коллекция простекобактерий и бактерий с необычной морфологией, включающая 4 рода и 7 видов. Описаны и узаконены (IJSB - 1965) два НОВЫХ вида рода Stella. - S.humosa И S.vacuo-lata, имеющие характерную морфологию клеток с шестые лучами, расположенными в одной плоскости.

Описан и узаконен (IJSB - 19Q5) род Labrys, с единственным видом L.aonachua, имеющий форму плоского треугольника, на двух вершинах которого имеется от 2-3 лростек.

Описан (Bergey's,1989) новый род Anpulomlcгoblua, клетки которого имеют форму плоского треугольника без нростек.

Эффективно опубликовано три вида ранее известного рода Pros-thecomicrobiura. обладающих иростекаш различней длины.

Установлены экологическое положение и роль простекобактерий в трофической системе преобразования соединений углерода в почве.

Практическое значение. Полученные в работе сведения дают возможность применения простекобактерий как индикаторов завершения процессов аэробной деструкции органического вещества в почвах при внесении органических удобрении.

Диагнозы родов К ВИДОВ Stella, Labrys, Anp^lomlcroblum, P. polyspheroidum вошли В Берги - 9.

Результаты работы используются в курсах лекций по микробиологии в МГУ, Пищевом институте и ТСХА, а также использованы в учебнике E.H.Мишуотина и В.Т.Емцева "Микробиология", 1987.

Чистые культуры типовых штаммов вошли в коллекции ВКМ и Американскую коллекцию типовых культур (АТСС).

Штаммы из нашей коллекции были использованы для исследования разных свойств: 16s rRNA (Stackebrandt, 1985), кинетики роста почвенных микроорганизмов (Шпиков, 198Э). Результаты этих работ

использованы наш при интерпретаций особенностей физиологии, места в микробном сообществе, систематического положения.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 35 печатных работав.

Апробагхия. Результаты работы докладывались на УП съезде Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985; на заседаниях Всесоюзного микробиологического общества, Москва, 1982, 1985; "Микроорганизмы как компонент биогеоценоза", АЛма-А.та, 1982; УШ Международном симпозиуме по биологии почв, Гедели, 1981; 16-ой Мсадународной конференции ФЕБО; 17 Международном симпозиуме по микробной экологии, Любляна, 1986.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глаз, заключения и выводов. Она включает 285 страниц машинописного текста, 56 рисунка и 61 таблиц. Список литературы насчитывает 103 работы на русском и III на иностранных языках.

Работа выполнялась с 1975 по 1988 гг. в Институте микробиологии АН СССР, в отделе почвенных микроорганизмов (заведующий •отделом академик Е.Н.Мишустин)» представляя часть плановой тематики. В работе участвовали сотрудники отдела почвенных микроорганизмов: Г.А.Смирнова, Т.А.Калининская, Т.Н.Лафицкая, А.И.Гини-ятуллина, А.М.Лисенко, Н.АЛерных; сотрудники лаборатории биохимии засоленных почв Института почвоведения КазССР; ИБФМ - Л.А. Окороков; ВНИИНА АМН СССР - Л.П.Терехова, участие которых отражено совместными публикациями. Экспериментальный материал получек автором в сотрудничестве с аспирантами А.М.Семеновым и Г.Г. Благовещенской. Автор выражает искреншю благодарность сотруднику ИНМИ АН СССР Л.Л.Митюшной за помощь в изучении тонкого строения культур. Автор приносит глубокую и искреннюю благодарность академику Е.Н.Мишустину за постоянный интерес и внимание к работе, поддержку и помощь в организации исследований; член-> корреспонденту Г.А.Заварзнну за обсуждение результатов работы и ценные советы по ходу экспериментальных исследований.

Соискателю принадлежат: разработка методов выделения чистых культур простекобактернй и иных бактерий с необычной морфологией; разработка методов их культивирования; изучение особенностей морфологии, цикла развития, тонкого строения и физиологии в зависимости от условий среды у выделенных культур; распространение, учет численности и место в сообществе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Часть 2. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ 1ШОСТЕКОБАКТЕРИЙ.

Почвенные лростекобахтерии были обнаружены в 1966 г. (Никитин с соавт.). Название этой группы организмов было дано Стейли (steiey, 19бб), который дал название "щюстека" клеточным придаткам, в которые входит цитоплазма.

Организмы, относящиеся к простекобактериям характеризуются такими редкими признаками как: наличие лростек, способность размножаться почкованием, наличие радиальной симметрии клеток.

Часть 3. ПРОСТЕКОЕАКТЕРИИ КАК МОРФСДОТО-ШЗИОДОтЕШЯ

ГООША

В соответствии с тремя основными свойствами, которым следовали в таксономической практике при выделении самостоятельных ро дов, эти организмы могут быть группированы (табл.1). Простекобак терпи с радиальной симметрией клетки представляют уникальную группу организмов. Известные в настоящее время бактерии этой группы объединены в два рода: s-teila и Labrya.

3.1. Методы. Для выделения этих и других бактерий нами были разработаны и применены следующие методические приемы:

а) Среда, содержащая фульвокислоты. Фульвокислоты экстрагировали из торфяной почвы, нейтрализовали до pH 7,0, добавляли агар 2%. Мидроскопирование отдельных колоний, выросших на чашке с фульвокислотиым агаром, дало возможность обнаружить клетки прс стекобактерий.

б) Среда, содержащая экстракт конского навоза. Сухой консюй навоз в 100 кратном количестве вода автоклавироэали. Осадок отстаивали и из надосадочной жидкости готовили жидкую и ахаризоваг ную среды для роста и выделения колоний.

в) Наиболее удобным и быстрым оказался метод получения ассоциации простекобактерий с аэробными целлшозоразлагавдими бакте риями. Такая колония рассевается на синтетическую среду для лро стекобаатерий (АТСС, 1974), с последующим их выделением.

Подсчет численности простексбактерий проводили микроскопиче< ки из десятикратных разведений.

3.2. Род Stella. Клетка Stella имеет форму шостилучевой звезды и обладает радиальной симметрией. Изучение коллекции шга) мов рода Stella, выделенных из различных источников обитания (табл.2), позволило установить вариации по размерам клеток, нал что или отсутствии газовых везикул. Вез шта\мы коллекции по раз

в а о

¡Б ai о с о ъ

а с я о. »ö >3

g О* M о о S g и в £ ё

5 <-¡ § о M

о о Р «

1Й S й И Ci Ф

о я К р S

.■ф M « Hi S С

M о t" Е is

s V о в 5 § •Ö

H

Щ ¡ä 1 о g о о t-í о e с о W В S ь

« о •tí о о. M ? в

ft К? I t-* о "<!

са о б S О

у Е $ Ф <5 й р

Ь {=» Ф о ÍF W (SI ь!

Et •С гЧ üí

3 и g •cf Й Я [0

0 Í4 •Ci Çj

£0 СО -ÎÏ О К и 'в

ÍU •tí çr» ф »

и

â f

M M tû <2

g CB

I

E H

я ?■

о ч 'tí

s ?

» в

« О »CJ

О. р

со Ej

и В 4!

о eu Sa

и S s

J=t Î4 *

и й §

О Я) И

ф 1-3 1

Г. Й !

Гс

о fä

Б 1-5 <S

■rt О

За to $0 о

и й а

« о

S g

О. {5

3 •

•§ s

о

Hi >9

ÍD К

Я О ?Y

+

+ + -г + + +

+ +

+ +

*<í 1-1 1

# Ф

К> ÏO ÎO

V •

со

№ » сл сг>

сэ

В11 § ®

<Т (Я (5

ч С

M Ь> W

U о ,в>

• 3

н-

0

1 о о" t-* с s

is

м о

S в

о о h¡

® к

а о

g 4

а> Р

&

ö о

Я t

го с

О. ь"

ф

Q

•tí И

g о

CL

о в

ь*-

о ч о и

&

о »

о о Ï3-

н

0

1

+ + +

+

M

Г ¥

M 1-1

ifcv

О

сл

9

и

со »

CD

тз

О

№ <+

ГГ m о

0

1

СО «

сл

в и о •в о в td CD

о M й" п о

¡3 № ь» о с a Й

р ы о w и №

ю <+ <+ о u с

ч о tf С- ы

с » n> р g

25 » * о о

н- о о <+ s а>

<+ ri- er й>

ra р •1 Ъ)

о ►1 о •• и

сг • Ï+

ю (И > о

о s ►3 и о

<+ t? — <+ H

» о t—

1 в. о ►0 •1 о о

'd о £3 •fl

са re о СП

а J+ а о

с £Г с s

р. п> M

0 1 о 0 1 H- u 0 1

круглая

плоская

деление

почкование

отсутствие

простека

w Я f 3 к M

о •О Ï a ' Q о"

ы я Е s

w " о. ф

» ? M •ö

9

о •о

hi р

я ш s к

s

>5 о

Таблица 2

' Свойства^ Бвделенньк штаммов рода Stella.

Ш% ! штаммов ! Источник ! выделения ! Газовые ! вакуоли ! гц - мол. ' %

B-II37 чернозем (Краснодар) — '72,7я 68, ¡Зо5®

Юв Юп компост (Шереметьево, Московская обл.) ■ - 72,2 * 71,4 *

12 в 12п парниковая почва.("Барвиха", Московская обл.) - ■ 71,4 * 72,9 й

141 лошадиный навоз + 70,0 й

142 лошадиный навоз ' - 70,8 35

143 лошадиный назоз + . 71,8 *

B-I552 активный ш (свиноферма, Ленинградская обл.) + 73,5 й

228 активный ел (свиноферма, Ленинградская обл.) - 69,3 *

15 ил (аалив "Петра Вели-, кого'; дальний Восток) - 70,4 к

227 такыр (конец периода разложения соломы) • - 70,0 й

Примечание: s Лысенко A.M., Семенов A.M., Васильева Л.В., IS84.

305 Gebers R,, V/ehatyer ü., Roggentin Г., Scblesner H., et el., 1985. Юв, Юп, 12в, 12п, 15 , 227 , 228, 142 на среде МПА (1:5) образуют мелкие, круглые, гладкие, серовато-бзлые колонии. В жидкой среде все перечисленные штаммы растут в виде равномерной мути с осадком на дне. Среди штаммов Юв, Юп и 12в, 12п форма колоний варьирует: Юв и 12в - выпуклые, Юп и 12п - плоские. Штаммы I0J 12в получены путем диссоциации исходной культуры на среде МПА (1:5) и сохраняют свои свойства в культуре. Штаммы ВКМ Б-1552,

й

141, 143, клетки которых обладают газовыми везикулами, имеют молочно-белый цвет колоний. В жидкой среде рост сопровождается образовавшем белой ллзнки па поверхности и осадка на дне.

При размножении. клеток плоскость деления перпендикулярна плоскости клетки. Перегородка закладывается между лучами в наиболее узкой части клетки. В результат© поперечного деления материнской клетки образуется два дочерние, каздая из которых обладает тре.мя 'выростами от материнской метки и вновь образует три новых.

Ультратонксе строение клеток род». Stella не дает никаких указаний на причины возникновения радиальной симметрии. На уль-тратошеих срезах цитоплазма с рибосома/я и цнтоплазматкческаа мембрана входят в выросты и заполняют их полностью, что позволило назвать их простаками. Профиль клеточной стенки подобен клеточной стенке других грамотрицателькых бактерий, за исключением наружного слоя. Простеки увеличивают' перкплазматическое пространство клетки. У одного из видов Stella vacuolata внутри клеток поодиночке располагаются газовые везикуда, имещие форму цилиндра шириной до 150 нм,'заканчивающегося с двух сторон конусом.

.. Сравнительное изучение питательных потребностей штаммов Stella показало,' что из 34 испытанных углеводов ни один не использовался. Для роста требуется обязательное добавление в среду дроккевого экстракта (0,01$), содержание которого не должно превышать 0,025^,/так"как это приводит к морфологическим изменениям и подавлению роста. Из 22 проверенных аминокислот и их амидов, 14 аминокислот использовались, но не всеми штаммами. Ни одним -итаммом Stella не использовались аминокислоты:'триптофан, фе-етлаланкн, оксипролин, метиошш, лейцин, изолейцин, ватан и глицин. Всеми "штаммами использовалась ь-глутамзшовая кислота. Хорошо потреблялись следующие кислоты: пируват, малат, сукцинат, цитрат, U -квтоглутарат, лактат, а также некоторые жирные кислоты. - формиат, ацетат..

До действии возрастающих концентраций хлористого натрия на рост, все исследованные штаммы подразделились на три группы:

1. Штаммы 10в, Юп, 12в, 12л, дая которых добавление до 1% симулирует рост, а дальнейшее увеличение концентрации приводит' i снижению прироста биомассы.

2. Штаммы 141, 143, ВКМ Б-1552, содержащие везикулы в клет-<ах, лучше растут без добавления Naci.

3, Шташы 15, 227, 223, 142, ТШ B-II37, не реагируют на добавление Nací к среде до 1%, а увеличение концентрации ингиби-рует рост.

Все шташы Stella высокоустсйчивы к большем концентраций!-: антибиотиков широкого спектра действия и противоопухолевым; высо-кочувствитеяыш линь к ксомицклу СМПК 0,5-1 мкг/мп) я срэднечувс-твителъны к пенициллину (7-10 мкг/ма).

По нукдеотидному составу ДШС бактерии рода Stella образуют однородную группу с высоким содержанием ГЦ оснований в пределах 69,3-73,5 иол% (табл.2). Штаммы, клетки которых имеют газовые везикулы н другие фенотигшчаские различия, характеризуется наиболее высокими значениям; ГЦ оснований (70; 71,8; 73,5) и были выделены в новый вид рода stc-ila. - s.vacuoiata, с типовым штаммом ВКМ B-I552.

Отношения родства выделенных штаммов рода Stella на основе ДНК-ДШС гибридизации представлены на рисунке I. Типовой вид S. humosa, штамм ВКМ B-II37, в сетке отношений занимает кзодиро-вшшои положении. Тшсая же картина наблюдается и для ряда других штаммов, которые по данным ДИК-ДНК гибридизации (от 5-31$) заслуживают статус новых видов. Высока* степень гибридизации проявляется среди штаммов, тлеющих газовые везикулы: B--I552, 141, 143. К этой группе оказались близки штаммы 142, 12з, I2ri, па содерлса-üjiríd газовых везикул. В формальной систематике наличие газовых везикул в клетках вааный признак. Возможно, что штаммы 142, 12в 7 и 12л ноторяля плазшзду, детермиаируюцуц образование газовых везикул. По 51 ому uiTGivUvtK B-I552, 141, 143, 142, 12в, 12п с уровнем гибридизации между ними от 60 до 100$ мояно относить к одному виду, ичитая наличие везикул второстепенным видовым признаком.

Характеристика рода к двух видов - s.huwopa м s.vacuoiata приводоиа в йкопер-1Мйнтальной части диссертации.

Описываемые штаыш бактерий рода Stella ваделеик из различных местообитаний (табл.2), где происходит активное разрушение органического материала, являясь таким образом тидпчнал представителем аэробной о.щц'отусчпной микрофлоры рассеяния (Заварзин, 1Í-V0).

3.3. l'o.'i Labrya. Комбинацией трдх редких таксономических ' ni»i:ui!HKon - радиачышя симметрия клетка, наличие простак, раз-инлж-лш--' «очко'каиеы обладает выделенная иамк из озэра и^егьяро (üc'fof'civüm '/с!') «íoktepuíí )лъгуa kiona^'nurt.

Клетки культуры имеют форму плоского треугаяышка размером 1,1-1,3 х 1,3-1,5 мш, неподвижные. На двух вершинах треугольника образуется от 2-3 остроконечных выростов-простек длиной до 0,6 мкм и шириной до 0,4 мкм, третья остается свободной.

Организм размножается почкованием. Рост почки начинается на вершине треугольника, свободного от простек. При этом свободный конец клетки удлиняется в размерах и на нем образуется почка, которая постепенно увеличивается в размерах пока не примат форму и размеры материнской клетки, напоминая на этой стадии размножения двулезвийный топор - "лабрис". В этой же последовательности происходит появление новых сидячих почек у материнской и дочерней клеток в место ex разделения. Таким образом, полюс, на котором происходит образование почек, сохраняется.

Общий план строения клетки Labrys сходен со строением других грамотрицательннх бактерий. Клетка ограничена волнистой трехслойной наружной мембраной шириной около 7,5 км. На внешней поверхности клеточной стенки нзравномэрно выявляется яапсулярный микрослой, состоящий аз полисахаридов, обнаруживаемы.?- с помощью окраски рутением красным. Слой пептидогликана плотно прилегает к наружной мембране, Периллазматическое пространство неравномерной толщины отделяет клеточную стенку от цитоплазматической мембраны. Центральную часть клетки занимает обширная зона фибриллярного материала чуклеоида, в то время как цитоплазма, содержащая скопления рибосом различного размера и плотности, располагается по периферии клетки. Цитоплазма вместе с цитоплазматической мембраной заходит в зыросты, что свойственно дая простек.

. Из 34 проверенных углеводов культура использовала все моносахара и сахароспирты, из дисахароз - мальтозу к трегалозу. Но использовала ли-, три- и полисахарида, а таете инозит-. На использовались аминокислоты. Из органических кислот - лишь пкруват, лаг.тат л глюконат.

Таким образом, даа Labrys характерно преимущественное использование ыоносахаров, а также продуктов гидролиза полисахаридов.

Моногапнчшй род Labrya с типовым-видом L.Eonachus, ВКМ B-I479 :эдеет Щ содержание 67,9 иол.% и занимает промежуточное положение между ночкувдейея бактерией о радиальной симметрией клетки без простек - AngulomicroMum (63,3 мси$) и родом Stella.

. Определение степени ДНК-ДНК гибридизации с простекобактерия-

Рис.1. Генотипическая сетка родов Stella и Labris. (в процентах указана степень гомологии ДЕК у исследованных организмов).

ми рода Stella . показало отсутствие родства и правомерность выделения Labrys в самостоятельный род на основании морфологии и пдкла развития. В диссертации приведен диагноз нового рода Lab-

гуа С ТИПОВЫМ ВИДОМ L.monachus.

3.4. Род Anguiofflicrobium. Не являясь простекобактериями, организмы этого рода, подобно Шзгуз. сохраняют радиальную симметрии, размножаясь почкованием. Культура выделена из торфяного болота поймы реки Москвы.

Клетки штамма 1109 (ЕКМ B-I335) имеют форму плоского треугольника с размером стороны от 0,95 до 1,2 мкм. Клетки неподвижные, одиночные или в парах.

Размножение начинается с удлинения вершины треугольника в месте, где произошло разделение материнской и дочерней клеток. По достижении почкой величины и формы материнской клетки появляется перегородка, которая, сужаясь, приводит к разделению клеток. Время удвоения культуры около 14 часов.

На ультратонких срезах клеток штамма B-I336 клеточная стенка имеет строение свойственное грамотрицательным бактериям, однако ригидный слой плохо выявляется. Средний слой необычайно развит и варьирует по толщине. Ламеллярные структуры, свойственные почкующимся бактериям, отсутствуют.

Необходимым условием роста бактерии на минеральной среде с глюкозой, является наличие факторов роста, содержащихся в дрож-кевом экстракте. Ни витаминная смесь, ни свободный от витаминов гидролизат казеина не обеспечивали роста культуры. Штамм B-I336 из проверенных субстратов использовал моносахара, некоторые ди-сахара и сахароспирты; из органических кислот - только формиат, пируват и глгокуроновую кислоту; из аминокислот - глутащнорую, гистидин, пролин. Сложные углеводы не используются организмом.

Определение путей использования глюкозы показало, что штамм, B-I336 ие.пользуэт сахара по гексозомонофосфатному пути и пути Энтнэра-Дудорова. Однако, вследствие низкой активности 6-фосфо-глюконатдегидрогеназы, функционирование гексозомонофосфатного пути, по-видимому, ограничено.

Сравнение треугольной бактерии штамм B-I336 с представителем полигональных бактерий B-I335 обозначенного как "тетраедрон" (Наг,'.сараев, Заварзин, 1972), сходного с "грибоподобнсй бактерией" (Whlttenbury, Hicoll, 1971; Stanley et.al., 1976) привело к заключению, что как по морфологии, так и по физиологии эти

Ii

организмы несколько различаются, но вместе с тем относятся к одной группе многоугольных бактерий и Еынесены в отдельный род AiiKuiomicrobium. Сравнительная характеристика штаммов B-I335 и B-I336 и диагноз рода приведены в материалах диссертации. В связи с тем, что исследовано недостаточное число штаммов, мы сочли разделение на вида преждевременным.

3.5. Рои Prosthecomicrobiua. Род Prasthsconicrooiua предложен Стейли, на основании изучения штаммов выделенных из водных образцов. По первоначальному описанию род ProsthecomicroMum отличался от AncaioaicroMum способом размножения: ¿nc.eloalc.ro>. bium - почкуется, a Prosthecomicrobium - делится.

Ранее нами на примере одного штамма, сходного с типовым ведом р.enhydrum (Васильева, 1972), бьшо показано, что бактерии рода Prosthecomicrobium почкуются, хотя на поздних стадиях почкование может быть принято за деление, как это случилось при спи сании типовых штаммов рода Prosthecomioroblum (staley, 1968). Только в 1384 году СтеШш при тщательном исследовании типовых штаммов, так и вновь выделенных, подтвердил способность просхеко бактерий с многотасявякши простекамк и осевой симметрией плетки к почкованию.

Приведенные в таблице 3 штаммы выделены нею: в основном из почвенных проб. Они расположены группами по числу и дайне просте и исследование их позволило увадеть, что меаду типовыми видает существуют многочисленные варианты; разделение на основе указанных признаков оказизается условным. Очевидно такке, что приведенные в таблице штаммы составляют морфологически монотонный рщ форм. Однако нельзя забывать и то, что дайна простек и их число, - весьма зависимы от условий культивирования.

На основании морфологических, физиологических и геносыстегла-тических признаков были выделены следующие группы штаммов, при-надаехащне разным видам. -----

P.consociatuin вр. поу. Первую группу составляют штамш II, 16, 26, выделенные из различных почвенных образцов. Морфологически клетки очень сходна между собой. Короткие, толстые палоч-ш, диаметром 0,5 до 1,0 мкм и дайной от 0,8 до 1,35 мкм. Прос-теки расположены вдоль клетки плотными пятью рядами и хорошо различимы в световом микроскопе. Размеры простек 0,2-0,25 мкм. Клетки неподвижные, колонии ке пигментированы.

При исследовании процесса размножения в микрокультуре, на

Таблица 3

Свойства выделенных штаммов рода РговШесопйсгоЫит.

Номер! Источник Шростека Щодвиж-! Цвет ! щ "

штамма! выделения ! (дайна, мкм) !яость ! колоний ! мол %

II Компост (Шереметьево) <0,25 серый 66,5

16 Желтозем (Колхида) <0,25 серый 68,5

26 Парниковая почва (Барвиха) <0,25 . серый 66,0

25в ЛопадиЕый навоз <0,30 светло-оранжевый 63,7

25вм Лошадиный навоз <0,30 ярко-оранжевый 64,5

25с Лошадиный навоз <0,30 серый 63,7

17а Желтозем (Колхида) <0,30 светло-оранжевый 64,3

17с Лелтозем (Кошта) <0,30 - ' серый 64,8

1а! Парниковая почва (Московская обл.) <0,40-0,65 желто-оранжевый 65,2

186 Парниковая почва (Московская обл.) <0,40-0,65 желто-оранжевый 64,2

18з Парниковая почва (Московская обл.) <0,40-0,65 оранжевая 65,2

В-ПЗЗ Чернозем (Краснодар) <0,50 + красная 62,5

20 Парниковая почва <0,50-1,00 красная 62,2

21 Лошадиный навоз <0,45-1,00 серый 66,0

редко 3,50

22 Такыр (конечный этап, разложения

соломы) <0,35; >2,50 + серый 65,0

примере штамма II, было установлено, что клетки размножаются почкованием. Почка образуется на одном конце клетки, как растущая наружу выпуклость. Она постепенно увеличивается а дифференцируется, образуя дочернюю клетку подобную материнской. По направлению простек можно определить дочернюю и материнскую клетки: у дочерней клетки простеки направлены под углом от материнской.

Результаты изучения физиологических особенностей бактерий первой группы определили, что штаммы II, 16, 26 используют только некоторые мокосахара и сахароспирты, из дисахаров только лактозу (штамм II). Ди~, три-, полисахариды не используются этими культурами. Из органических кислот наибольший спектр субстратов у штамма II (цитрат, формиат, глюконат), последний используется и штаммом 16. Штаммы 16 и 26 используют метанол, а штамм 26 и метиламин, - признак характерный для факультативных метилотро-фов. Ни одна из аминокислот не используется этой группой организмов.

Несмотря на фенотишческую однородность бактерий первой группы, штаммы II и 16 дают 43$ гибридизации, по отношению к ним штамм 26, - только 30% (рис.2). Диагноз нового вида Р.соп-вос1агиш с типовым штаммом приведен в диссертации.

р.т^зЬизМпи ар. поу. Желтопигментные штаммы 25в, 25вм, 17ж и беспигментные штаммы 25с, 17с, которые образовались при диссоциировании исходных культур 25 к 17, а такке желтый штамм 18, при диссоциации которого образовалось три типа пигментных варианта - 186, 18в, 18м, различающихся типом колоний, объединены во вторую группу.

Клетки штамма 25в, 25вм, 25с, 17ж, 17с - морфологически похожи и.обладают вщюотат, длина которых от 0,20-0,30 шм а расположены они на клетке беспорядочно. У штаммов 186, 18м, 18з простою! имеют размер 0,4-0,65 мкм, т.е. несколько длиннее, чем у штаммов 25 и 17.

Все клетки штаммов второй группы неподвижные, размножаются почкованием. Используют больной набор субстратов; да!-, моносаг-хариды, отдельные сахароспирты. Характерным для этой группы является также использование органических кислот, в основном кислот цикла Кребса с различиями между штаммами. Используются также отдельные аминокислоты, но не всеми штаммами. Подробный список субстратов приведен в диссертации.

Степень ДНК-ДНК гибридизации между диссоциированными вариан-

м о

гибридизация, % 8

о

41

и 16 26 25в 25вм 25с

17с 17*

18в 186 18м

В-1138 20

В-1376 22

В-1313 В-1389 21

В-1375.

Рис.2. Диаграмма ДНК/ДНК гибридизации (есь ординат) впервые выделенных а ранее описанннх штаммов родвз Ргоо^есом1сгоЬ1иш и Апса1от1сгоЫцш.

тами каждого штамма равна Т00$, а между исходными культурами 25 и 17 от 80 до 95/2. Штаммы 18м, 186, 18в по отношению к штаммам 25 и 17 имеют от 30 до 50$ гибридизации. Простекобактерии второй группы имеют родство с бактериями первой, в пределах 18-30$ (рис.2). Диагноз вида р.ш1вЬиаЦп11 приведен в диссертации.

Р.епЬуагиш. Штаммы В-<1138 (Басильева, 1975) и 20, обладающие красным пигментом, получены из разных источников (табл.4). Они морфологически схожи ¡сак мевду собой, так и с р.опЬуДгиы ВИЛ В-1376 1968), имеющим желтый пигмент. У всех штам-

мов этой группы дана простек около 0,5 мкм, у штамма 20 длина может достигать до 1,0 мкм. В отличие от В-1376 и В-П38, клетки штамма 20 неподвижны.

Спектр используемых веществ бактерий этой группы отличен от штамма В-1376. Они не используют поли-, три-, да-, моносахариды. Из сахароспиртов используются штаммом 20 - арабиг, адонит, сорбит и маннит; из органических кислот - только пируват (штамм В-1138). Ни одна из аминокислот не потребляется этой группой организмов.

ДНК-ДНК гибридизация между штаммами В-1138 и 20 равна 55$ и только эта группа бактерий обнаруживает 30% гибридизации по отношению к р.епЬуагшп В-1376, с которым они близки и морфологически (Васильева с соавт., 1974). Первые две группы бактерий характеризуются низким родством от 3-10% по отношению к штаммам В-1138 и 20 (рис.2). Мы сочли преждевременным выделять их в самостоятельный вид.

Отдельно от всех рассмотренных бактерий стоит штамм 21, клетки которого кокковидной формы, размером 0,75-1,1 х. .0,9-1,2 мкм, с короткими, различной длины яростекаш, от 0,45 до 1,0 мкм. Иногда,одна из простек может достигать длины до 3,5 мк?л, редко наблюдается ветвление простек. Этот признак был отмечен для простек рода Апса1ов1сгоМиго. Организм неподвижен. Штамм 21 использует из углеводов только моносахара (рибозу, ксилозу), все испытанные дисахара (кроме мелибозы). Не использует три-, полисахарида, сахароспирты. Среди испытанных органически:': кислот и спиртов используются: «¿-кетоглутарат, мала?, бутират, ацетон, этанол, метанол, пропанол, монометиламин. Физиологические характеристики, а также отсутствие ДНК-ДНК гибридизации как по отношению к двум типоеым штаммам рода Ргоа1:Ьесоц1сгоЬ1ит, а также штаммам В-1138 и 20, заставляют рассматривать эту куль-

туру отдельно (рис.2). В связи о отсутствием других сходных штаммов выделение его в самостоятельный вид сочтено преждевременным.

Р.ЫгэсЫ!. Штамм 22 морфологически идентичный Р.ЫгасЫ! (staley, 198'0. Для культуры характерно образование двух различных типов клеток; один тип шеет многочисленные короткие (меньше 0,35 мкм), другой - длинные простеки (больше 2,0 мкм). Клетки с короткими простаками подобны клеткам видов рода РговЦ1есот1с-гоЫид, а клетки с длинными простеками похожи на Апса1опасго-Ь1иа ас1е1ит. Некоторые клетки одновременно могут иметь как короткие, так и даинныо простеки. Все штаммы этого вида подвижны с помощью одного полярно или субполярно располояенного жгутика. Большинство подвижных клеток обладают короткими простеками, хотя подвижность у клеток с одним или несколькими длинными выростами может сохраняться. Результаты изучения в микрокультурз показали, что организм размножается почкованием. Материнская клетка, независимо от типа простек, способна образовывать у дочерней клетки простеки не обязательно того же типа, которыми обладает сама.

Из 34 проверенных углеводов штамм 22 подобно Р.МгасМ! использует большинство моносахаров и не использует да-, три- и полисахариды. Из сахароспиртов используется только глицерин. Потребляются почти все кислоты цикла Кребса и летучие жирные кислоты, а также такие соединения как форшат, метанол, мо-кометила.мин, что дает основание считать культуру факультативным метилотрофом, Из провереншсс аминокислот используются: глутами-новая кислота, глутамин, аспарагиновая кислота, аспарагин, ала-нин, пролил, серии, гястидин, оксипролин.

Общность морфологических, физиологических и биохимических признаков штамма 22 и типового штамма Р.МгвсЬИ, а также отсутствие рсдстйа с типовыми штаммами рода Ргозгьссои'сгоМиго (Р.епЬуагиа В-1376, Р.Щ^еуЕа^;™ В-1389), так И ВНОВЬ выделенными, позволила идентифицировать его как р.Ы-гзсЫ, штамм 22.

Состав ГЦ оснований ДИК у исследованных штаммов простекобак-терий показало, что все они характеризуются высокая содержанием в пределах 62,2-70,4 мол$ и находятся в интервале значений для всех описанных видов рода Ргоз-ььесот1сгоЫцп и ниже значений

Апса1оп1сгоМит.

Установление различий мезду грушами штаммов по морфологии,

ДНК-ДНК гибридизации и пицевым потребностям как между группами, так и бесспорное отличие их от типовых штаммов рода, дало нам основание для выделения двух новых видов: p.conaoclatum sp. nov (штамм - II типовой, 16, 26} и P.alshugtinii sp. поу.(атаммы-17 типовой,.-25, 18). Диагнозы видов приведены в диссертация. Кроме того обнаружен ряд организмов, представленных единственными штаммами, что доказывает многообразие простекобактерий.

' Общим свойством клеток ProsthecpmicroMum является обнаруживаемый лишь фрагментарно, нечетко различимый ригидный слой, характерный для грамотрицательных бактерий, однако, доказано наличие муреига и диаминопимелиновой кислоты в составе пептидо-гликана (König et al., 1994). Во всех случаях, независимо от длины простек, цитоплазма вместе с цитоплазматической мембраной заходит в Еыросты, а периплазматическнй слой необычайно развит и варьирует по толщине. Общим свойством простекобактерий рода ProsthecomlcroMum является чрезвычайная чувствительность к пенициллину, что можно связать с особым строением клеточной стенки. Эти особенности бшш отмечены и другими авторами (Sohleг пег, 1983; König et al., 19ö4).

3.6. Морфологический критерий, особенно четкий для простекобактерий, обеспечивает возможность выделения родов. Для определения вида, фенотипических характеристик недостаточно, необходим геносистематические исследования. Все простекобактерий, в том числе наш штаммы, исследованные Э.Штакебрандтом, составили однородную группу в альфа подклассе класса proteobacterla. В данном случае морфофизиаяогическое деление получило свое подтверждение и в филогенетическом отношении. Своеобразная форма клеток простекобактерий и-олиготрофия коррелируют с их филогени ей.

Часть 4. КИНЕТИКА. И СТРАТЕШЯ РОСТА.

Проверка всех исследованных культур простекобактерий и бактерий с необычной морфологией показала, что каждый организм использует ограниченный набор простых органических соединений, причем каждый род бактерий предпочитает использовать одну или две группы соединений. Каадый вид или группа штаммов имеет различия по набору субстратов, т.е. тлеется субстратная специфичность бактерий. Полный список проверенных субстратов приведен i диссертации.

Не имея ферментых систем гидролиза полимерных соединений,

изученные простекобактерий зависят от активности других физиологических групп бактерий в сообществе, разлагающих полимерные и циклические соединения. Использование лишь простых органических веществ обуславливает возможность развития рассматриваемых бактерий в конце трофических цепей разложения углерода, т.е. на заключительных этапах минерализации органического вещества.

Одна из характерных особенностей группы простекобактерий -зто реакция организмов на различные концентрации субстрата в среде. Клетки бактерий имеют типичную морфологию на средах с низкой концентрацией субстрата (олиготрофные условия), - теряют ее на высоких (евтрофпые). Впервые это было показано наш на примере s.humosa, p.polyspheroldun, Prostheconicrobima sp. (Васильева, 1975).

Зависимость морфологии клеток простекобактерий от концентрации органических веществ в среде побудило изучить кинетику роста при различных концентрациях субстрата (0,01-0,5$), на примере трех культур простекобактерий: Stella vacuolata, Labrys monachua. Prosthecomlcroblum hirschil.

Морфология клеток сохраняется при концентрациях от 0,01$ до 0,03% глюкозы для Labrys и глуташгаовой кислоты для Stella, при этом сохраняется и пропорциональность прироста биомассы используемому субстрату, для р.hirschil - соответствующая концентрация поднимается до 0,1%. Более высокие концентрации приводят к постоянному изменению морфологии, непропорциональному приросту, а затем и ингибировашго. Морфологические изменения сводятся к потере простек, радиальной симметрии, отложению поли-^-оксибу-тирата. Таким образом, простекобактерий характеризуются субстратной специфичностью и используют эти субстраты в низких концентрациях.

В условиях хемостатного культивирования было определено, что простекобактерий обладают (табл.4):

а) низкими удельными максимальными скоростями роста,

б) исключительно низкими субстратными константами, которые на порядок - два ниже значений характерных для других бактерий при росте на аналогичном субстрате. ■ •

Таким образом, простекобактерий, обладая низкими удельными максимальными скоростями роста, имеют высокое сродство к субстрату и соответственно обеспечивают полное потребление его из среда; они конкурентоспособны в условиях лимитирования субстратом.

Таблица 4 Параметры роста простекобактерий.

Параметры j LABRYS MONACHUS ! P.H1RSCHII ! STELLA YACUOLATA

! глюкоза, мг/л ! глюкоза, Мг/л [глутамат, мг/л

! 100 ! 1 I 250 \ 2,5.103 ! 250 | j 2.5.I03 ! 100 1 | 250

^ак- час_1 0,15 0,13 0,13 0,09 0,09 0,06 0,05

4,6 5,3 5,3 7,7 7,7 11,6 13,9

Kft, мг/л 2,4.Ю-1 - - 5,4.ТО""2 — <I.I0~2 _

У, $ 76,5 62,1 52,0 - 65,0 53,0

При росте в условиях избытка субстрата (0,25$), они потребляют не весь, а лишь необходимый им минимум. Зту особенность можно рассматривать как проявление экономичного обмена олиготрофных бактерий.

Полное потребление субстрата из среды при росте на низких концентрациях субстрата, позволило предположить существование у олиготрофных простекобактерий высокоэффективных транспортных систем. На примере L.aonachus было установлено наличие двух транспортных систем, одна из которых имеет экстремально высокое сродство к субстрату (Семенов, Окороков, Васильева, 1986). Минимальное Kj^, равное 0,04 мкМ, ниже значений К^, известных для глюкозы у многих других бактерий, в том числе для изолированных простек Asticcacaulis Mprosthecum - 1,8 и 34 мкМ (Larson, Pate, 1976). В условиях избытка субстрата в среде (0,25$ глюкозы) , когда бактерия практически не имеет простек и клетки тле кг округлую форму, высокое сродство к субстрату сохраняется (Ку = 0,1 мкМ), .однако, Ушх второй транспортной системы заметно уменьшается, что доказывает роль простек в усилении поглощения питательных веществ.

Часть 5. ПРОСТЕКОБАКТЕРИЙ В АГРОФИТОЦЕНОЗЕ.

5.1. Простекобактерии как индикаторы почвенных процессов.

Морфология простекобактерий, позволяет легко отличить их от банальной микрофлоры. Отсюда потребовалось выяснение пригодности этих организмов в качестве индикаторах форм. Для этог.о нужно было установить место простекобактерий в системе микроорганизмов в процессе микробного преобразования органического вещества в почве, выявить основные йакторы, влияющие на их распространение и корреляцию между трансформацией органического вещества и численностью простекобактерий. Использование лишь простых органических веществ обуславливает развитие простекобактерий в конце трофических целей разложения углерода. Поэтому, можно бшо ожидать, что гетеротрофных простекобактерий будет больше в системах, где идет энергичный распад органических веществ.

Моделями для исследований послужили два типа почв: щелочные такыровидные, с разной степенью засоления, и лугово-черноземная, в которые вносили органические субстраты: солому, компост, сиде-раты.

5.2. Слабощелочная такыровцдная почва под рисом.

Внесение органических удобрений (солома, компост) в слабо-

засоленную и сцльнозасоленную такыровидную почву под затопляемую культуру риса, вызывает их быстрый распад. Компост, где растительные остатки подвергались предварительной анаэробной обработке, содержащий молочную, уксусную, масляную и др. соединения, оказывается гораздо более благоприятным субстратом, чем солома, поэтому стимуляция развития сапрофитной микрофлоры при удобрении компостом выше, как по ходу сукцессии,-так и по почвенному профили, особенно в слое 0-1 см в первые два месяца после затопления. К концу вегетации риса (август, сентябрь) активность сапрофитной микрофлоры на компосте падает; тем не, менее, по всему профилю почвы, независимо от солености, она выше, чем в контроле и в варианте с соломой. На соломе в составе аммонификаторов представлены богаче псевдомонады, численно уменьшаясь к нижнему горизонту, что связано с условиями разложения соломы. На компосте они определяются в первый срок анализа, а на последующих этапах сукцессии резко уменьшаются, свидетельствуя о быстроте разложения субстрата. Численность спорообразующих форм, сменяющих . не-спорообразующие, позволяет также оценить минерализацию компоста как более быструю по сравнению с соломой, особенно в верхних слоях." .

Данные, полученные по учету целлкшозоразлагающих микроорганизмов, свидетельствуют о развитии бактериального разложения целлюлозы в такыре, По качественному составу целлшозоразлага-ющие бактерии представлены в основном видами cytophaga. В каг-честве целлюлозоразлагажцего организма наш впервые было обнаружено для почв Советского Союза обильное развитие крупной многоклеточной ТрИХОМНОЙ баКТерШ Herpetosiphon.

5.3. Нтюстекобактеши в почвенном профиле.

Установленная в первые месяцы при разложении компоста высокая активность сапрофитной микрофлоры как слабозасоленной, так и сильнозасоленной почвы, особенно в верхних слоях, сопровождается наибольшими значениями образования COg. аз о тфикс ирущей активности, выделения метана. По сравнению с кошостом при разложении соломы имеется существенно меньшая активность сапрофитной микрофлоры и соответственно ниже образование COg» азотфиксация, выделение метана. На конечных этапах сукцессии, уменьшение численности микрофлоры, усваивающей органические формы азота, осо-

бенно в верхнем слое (0-1 см), сопровождается резким уменьшением продукции СОз» азотфиксации, образования метана.

Внесение компоста приводит к резкому уменьшению кислорода в ранние сроют, что указывает на более интенсивное разложение в такыровидной почве органических веществ компоста, чем соломы. Сопоставление концентрации кислорода в почвенной влаге и ОВП указывает на существование в почве как аэробных, так и анаэробных зон. Щелочные условия слабозасоленной и сильнозасоленной такыровидных почв наиболее сильно меняются' и имеют значения близкие к нейтральным, распространяясь на всю глубину профиля при разложении компоста, по сравнению с вариантом соломы.

Таким образом, была определена разница в интенсивности процессов микробиологической трансформации компоста и соломы, устанавливаемая как микробиологическим анализом, так и находящимися в соответствии с ним суммарными показателями, свидетельствующими об интенсивности почвенной биодинамики.

В процессе разложения соломы и компоста в такыровидной почве наблюдается смена микрофлоры по ходу сукцессии, обусловленная специализацией.микроорганизмов, обусловленная трофическими условиями.

Сопоставление данных по численности простекобактерий с активностью аэробной сапрофитной микрофлоры по срокам, убедительно показало, как в смешанных образцах, так и по горизонтам, слабозасоленной и сильнозасоленной-почвы, определяется временная последовательность в развитии простекобактерий в зависимости от этапов минерализации продуктов распада соломы и компоста.

Среди простекобактерий, в первый месяц после затопления слабозасоленной почвы, когда велика роль аэробной целлюлозораз-лагающей микрофлоры в разложении соломы и компоста, в смешанных образцах наиболее многочисленны каулобактеры, их численность на порядок выше контроля. Характерно, что в верхнем, активном слое (0-1 см), каулобактеров меньше, чем в следующем слое (1-5 см), где определяется.их резкое увеличение. Причина резкой вспышки численности популяций каулобактеров во втором слое, по-видимому, заключается в различиях трофических условий. Наибольшее количество каулобактеров учитывается в августе, на компосте, когда уменьшается активность сапрофитной микрофлоры. Среди каулобактеров в это время обнаруживается Ргоз-ььесоьас-ьег, которого больше всего в сдоо 0-Е см при разложении компоста, на порядок.

меньше при разложении соломы. Вниз по профшш численность его уменьшается. В сильнозасоленной почве, однако, количество ка-улобактеров первого слоя (0-1 см) постоянно выше определений в контрольном варианте и при минерализации компоста, что может быть объяснено высокой концентрацией продуктов компоста в начальной стадии разложения по сравнению с соломой верхнего слоя. Однако, в июле и августе численность этой группы олиготрофных бактерий в нижних горизонтах, особенно на последней стадии разложения компоста, значительно выше таковых, чем в варианте с соломой и тем более в контроле.

Из простекобактерий рода prosthecomicroblum преобладал вид р.рolyspherоidun. Его было больше при разложении компоста, чем соломы в обоих типах такцровидной почеы. Простекобактерий морфологически сходные с видом p.consooiatua также ьногочясле-ны, особенно на компосте, в конце вегетационного периода.

5.4. Птостекобактерия в сильнозасоленной почве.

Трофические условия сильнозасоленной почвы, в отличие от слабозасоленной, обусловлены разложением компоста, продукты которого проникают глубже по профилю, в то врема как солгала действует преимущественно в верхнем слое. Численность простекобактерий рода Prpsthecomlcroblua - Р,polyspherolduia, P.consociatum и Prosthecomicrobium sp. (простеки короткие, заостренные), на начальной стадии сукцессии по горизонтам определяются меньше з варианте с компостом, чем с соломой. Максимальное развитие простекобактерий этого рода происходит на заключительном стаде разложения компоста по всему профилю; на соломе, за исключением верхнего слоя, численность невелика. Морфологическое разнообразие простекобактерий увеличивается с появлением в ценозе клеток с простеками длиной до икм. Сначала они обнаруживаются в

варианте с компостом, а в конце сукцессии и при разложении соломы. ' '

Бактерии рода Stella появляются при разложении компоста в слабозасоленной почве лишь е верхнем слое в первый срок анализа, составляя 1С3 клеток/грамм. Этот слой характеризуется наибольшей активностью сапрофитной микрофлоры. Постепенное увеличение численности бактерий рода Stella, особенно в верхнем слое, достигает максимальных значений (10б клеток/граш) в слое 1-5 см в конце вегетационного сезона, когда происходит затухание активности зимогенной микрофлоры. При разложнеии соломы Stella.

¡наруживается позже и численность ее ниже.

5.5. Дугово-чеиноземная почва. При изучении простекобакте-$ в лугово-черноземной почве рисовых полей, в течение 50 лет зпользуемых под монокультуру риса, рассматривались варианты: ) целина, 2) контроль, 3) сидераты (измельченная люцерпо-кос-рсцовая травосмесь), 4) минеральные удобрения.

Сопоставление вариантов 1-4 позволило показать, что много-етнее применение органических удобрений повысило биогешюсть очвы. С евдзратамк наблюдалась самая большая общая численность актерий, особенно через I месяц после затопления, которая заем постепенно уменьшается. Соотношение спорообразущих и песпо-ообразующкх. форм быстро сменяется' в сторону преобладания пер-ых.

Минеральные удобрения, как и сидераты, увеличивают нелепость микроорганизмов больше, чем в контроле во все сроки изу-:ения. Одаако, в отличие от сидератов, соотношение носпоровкх ¡актерий и спорообразушдах, не столь быстро сменяется в сторону [реобладания бацилл.

Условия затопления оказывают влияние как4на общую числеп-юсть, так и на видовой состав целлюлоз оразлзхающей микрофлоры, ■ доминирующей группой являются грибы, в то время как в целине жределяются, хотя и в меньшей степени, бактерии. Целлюлоз ораз.-1агающие бактерии лугово-черноземно® почвы представлены вибрио-1ами и бактериями рода БургосугорЬвяя.

Результаты изучения простекобактерий показали, что лоличест-зо и видовой состав их зависит от трофических условий каждого из вариантов.

Многолетнее выращивание риса с затапливанием почв сказачо влияние на биоценоз. Во все сроки, дата после сброса воды, численность лаулобактеров, почти всегда выше, чс-м в целгше. Количество р. ро!уэрьего 1<Дц!а таете выче, но только на последних этапах изучения. В жкробоценозе контрольной почвы обнаружены простекобактерий .у которых ла конце каждой из простек ¡шестая пучок фнмбркй, ?,!аксимальиля кх числеяностт, огсряде.тяется через I месяц после затопления, она остается еысокой и через 3 иэс/щя, одна::о, через две недели поело сброса воды бактерии с фимбратм: исчезает.

Многолетнее зпосемио оргаяичиеких удобрений привело не только к Ж'Лпиеотвеинону раа/ппш», но, что особенно за-гпи, к морфо-лоп"'€окому проетокобакторпй на поздних этапах сук--

цессот, в отличие от почвы без удобрений. Через 2 недели поело затопления резко дозыскяась численность р. poiyspiieroidum, а также просте ксбэ-ктеркЧ с фжлбраиж к появились бактерии рода

Stella«

Через месяц, когда определяется максимальная активность зи-могенной шкрофлору, чьслсяость простекобактерий резко падает. Однако, бактерии рода ¿tolla,■'- лростехэбактерии о короткими простекачн, полностью не"подавляются. , .

После. 3-х месяцев разложения.сидератов, когда активность зи-могенной дакрофлоры уменьшается, морфологическое разнообразие, а также численность простекобактерль. достигает максимальных значений, выявляются представители пода Pi ostbecom.ici-öbJ.vim, - р.рсо у-spheroidum, Prosth^coflicröb.'.a'a'sp. (короткие Простеки), Pros-thecoMicrobiiim (длинные простеки), Stella. /Простекобактерии с короткими простекаш различаются между собой разнообразием, Kai; клотск, так и псостек..

Таким образом, ка коке^мх этапах сукцессии при спаде. актив-тости зкмогенной микрофлоры, " получают развитие различные зады ' простекобактерий, численность которых отражает особенности их , "физиологии.; '. ";

Среди лростекобактеркй, с многочисленными простеками, численность которых сильно зависала от степени разложения органического субстрата, были Р.polyspheroidum, Stella и иростекобактёрки ' с короткими простеками. Наг всех стадиях сукцессии в варианте с минеральными удобрениями,' практически нет развития p.poiysphero-idum. Только через 2 недели после'затопления обнаруживается, небольшое количество его, на три порядка ниже того,' чем в это же время при разложении органических удобрений. Минеральные удобрения оказали положительное действие на развитие' простекобакте-рий с короткими; простеками, в период максимальной численности атаонифщ$<1рушцих бактерий. Ни на одной: из стадий сукцессии но были обнару^ны-цростекобактерии с. длинными простеками. Бактерии рода Stella обнаруживались только 'в начало'в ничтожно малых "количествах, и не выявлялись через месяц функционирования ценоза в этих условиях-почвы. ' v

Таким образом, многолетнее внесение минеральных удобрений в черноземную почву создало условия, при которых яа различных этапах сукцессии обнаруживаются различные виды простекобактерий, . однако численность их. невелика. Это ..особенно хорошо прослежива-

ется на примере P.polyspheroidum, Stella И Prcsthecomlcrobium s£. (морфотип с длинными ггростекаш), ■ а также Prosthecomicro- ■ Ъ1ид (морфотип'с короткими простекамя), численность которых к концу сукцессии уменьшается, а не увеличивается так, как это происходит при разложении сидератов. "./-•"

5.6. Ассоциация целлюлозоразлагающих бактерий с пвостеко-бактериями. Возрастание численности простекобактерий в почве к концу периода разложения целлюдоэосодержащих веществ в почве, привело нас к мысли о тесной связи простекобактерий с аэробной целлюлозоразлагающей микрофлорой. ...

Сравнительные'исследования лабораторных моделей сообществ, развивающихся на целлюлозе, были проведены в географически уда-денных местах с разными типами почз (такыр, чернозем). При внесении органических, удобрений (солома, компост) в такыровидную почву, или сидератц в черноземную почву, возрастает численность не только целлюлозоразлагавдих бактерий, но и представителей других физиологических групп. .

Основная рол?> в разложении целлюлозы в исследованных почвах принадлежит цитофэгам, Бактерии родов Cytophaga и Sporocyto-phaga образуют бесцветнее, слизистые, бледно-желтые, светло-коричневые, лимонного цвета слизистые колонии. Новизну представляет широкое распространение в такыровиднкх почвах бактерий рода Herpeto3iphon - своеобразных трихомных флекскбактерий, ранее не зарегистрированных как активные целлюлозоразлагающие организмы в почвах Советского Союза. Эти бактерии образуют как желтые, так и цвета лососины колонии.

Еыявление основного трофического маршрута в сообществе позволило установить наличие простекобактерий в колониях целлюлозе-разлагающих бактерий, которые образуют ассоциации. Видовой состав и численность прссгекобактерий зависят как от источника органического вещества, так к от стадии его разложения. Характерным признаком колоний с обильным развитием простекобактерий является сильное разъедание фильтровальной бумаги. Обнаружение колоний целлшозоразлагавжях бактерий, содержала простекобакте-ршг, коррелирует с данными по динамике численности простекобактерий. Максимальное морфологическое разнообразие и численность основных видов простекобактерий обнаружено к концу разложения органического вещетсва, характеризуя конечный этап развития зи-могенной микрофлоры.

Результаты исследований подтвердили образование прочных ассоциативных связей между целлшозоразлагающими бактериями и простекобактерияш родов: Caulobacter, Hyphomlcrobluia. Stella, Prosthecoaicrcbium. Это указывает на использование простекобак-териями моносахаридов рассеиваемых из места разложения целлюлозы гидролитическими бактериями, ко не актиноыицетами или грибами, в ассоциации с которыми простекобактерии пока не обнаружены.

Б сообществе условия для размножения простекобактерий несомненно благоприятны, - лазанием на это служит морфология клеток, свидетельствующая о низкой,концентрации субстрата в колонии; формы, образующиеся при неблагоприятных условиях, отсутствуют.

ЭШШЕНИЕ.

Простекобактерии представляют весьма .четко ограниченную группу лротеобактерий. Они характеризуются своеобразной морфологией, которая функционально связана с условиями существования их в природе: простеками, резко увеличивающими периплазматичес-кое пространство и высоким отношением площади поверхности к объему клетки (s/v). Простекобактерии используют ограниченный набор простых мояомерных субстратов, не обладают гидролитической активностью. Вместе с тем, дая них характерно необычайно высокое сродство к субстрату. Они не способны развиваться при значительных колебаниях субстрата в среде, причем высокие концентрации приводят к нарушениям функционирования клетки. Простекобактерии следует рассматривать как типичных представителей олиготрофов, экофкзиология которых, разработанная в настоящей диссертации на основании изучения ряда характерных видов, указывает на их строго определенное место в микробном ценозе почв.

В отличие от многих других групп бактерий, простекобактерии представляют филогенетически единую группу в составе альфа-лсд-класса протеобактерш. Более того, они составляют ядро этого подкласса. Простекобактерии в экологическом отношении могут получать преимущество при постоянном притоке органических веществ являющихся продуктами разложения полимеров, т.е. быть типичными представителями микрофлоры рассеяния.

Поскольку, в полностью развитом микробном ценозе, концентрация промежуточных продуктов стремится 'к малым величинам вследствие потребления юс последующими компонентами трофической цепи простекобактерии, будучи олиготрофами, обильно развиваются при большом поступлении разлагаемых органических веществ в систему,

т.е. в евтрофных условиях. Таким образом, они служат индикаторами скорее зрелости и сбалансированности микробного сообщества, а не олиготрофных условий. В этом отношении наиболее показательно их взаимодействие с целлшозоразлагаюпцши бактериями, постоянными спутниками которых простекобактерии являются, как в природе, так и лаборатории культурах.

В результате проведенной работы удалось сформировать единое представление о своеобразной группе бактерий, все биологические свойства которых внутренне согласованы между собой.

ВЫВОДЫ.

1. Открыта и описана новая группа аэробных органотрофов -морфофизиологическая группа почвенных простекобактерий-и впервые выделены из почвы чистые культуры простекобактерий и бактерий с необычной морфологией клетки: 27 штаммов, принадлежащие, к четырем родам и 7 видам.

Описан новый род бактерий с двумя видами - s.humosa и S. yacuolata. Описан ноеый род почкующейся бактерии с треугольной формой клетки Lahrys rconachus. Описан новый род почкующейся бактерии с треугольной формой клетки, у которой не имеется прос-тек, - род Angulomlcroblum.

На основании выявленной эколого-физиологической ниши, занимаемой простекобактериями, предложены методы их выделения и обнаружения в сообществах с почвенными целлюлозоразлагающими бактериями.

2. Описан новый тип симметрии у прокариот: плоские клетки с радиальной симметрией. Предложена система простекобактерий, позволяющая прогнозировать новые морфологические типы простекобактерий и бактерий с необычной морфологией. Установлены особенности морфологии и цитологии, выявлены общие черты в строении клетки и ее придатков. Показала связь морфологии с концентрацией питательных веществ. Установлен цикл развития и способ размножения, приводящий к- появлению одиночных клеток, что связано с эколого-физиологической характеристикой этих олиготрофных организмов.

3. Изучена физиология простекобактерий. Установлен список используемых веществ, который дает указание на возможное мссто простекобактерий в трофической цепи. Изученные бактерии способны использовать .ограниченный круг простых органических соединений, преимущественно потребляя: Labrys - углеводы; Stella аминокислоты и органические кислоты, но не использует

углеводы; Anptilomicrobium предпочитает углеводы и аминокислоты; prosthecoaicrobium лучше ассимилируют углеводы, хуже органические кислоты. Все перечисленные бактерии не используют спожные полимерные, а также циклические соединения,•что укаоывает на нх зависимость развития от активности других групп микроорганизмов, разлагающих сложные полимерные соединения, и возгложное место простекобактерий е трофической цепи.

Установлена кинетика роста и зависимость ее от концентрации субстрата, которая соответствует занимаемой организмом эколого-йизиологической нише.

4. Изучено распространение простекобактерий в почвах и установлена приуроченность к заключительным этапам разложения органического вещества. На примере такыровидных (Казахстан) и черноземных (Краснодар) почв изучена сезонность и установлен максимум развития простекобактерий в конце вегетационного периода.

Показана зависимость численности простекобактерий от внесенного органического вещества и процессов ее микробиологической деструкции. Установлено положение простекобактерий в сообществе и связь с процессом бактериального аэробного разложения целлюлозы, что позволило выявить главный трофический маршрут в микробном сообществе, завершающийся аэробными простекобактериями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Васильева Л.В., Лафицкая Т.Н. Отнесение Agrobacteriuni poly-spheroiduzn к роду Prosthecomlcroblum polyspheroidum nov. comb. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1976, й 6,

с.919-923.

2. Лафицкая Т.Н., Васильева Л.В. Новые треугольные бактерии. -Микробиология, 1976, т.45, й 5, с.812-816.

3. Лафицкая Т.Н., Васильева Л.В., Красильникова E.H., Александ-РУШКИНЭ Н.И. ФИЗИОЛОГИЯ Prosthecomicrobium polyspheroidum.

- Известия АН CCGF, сер.биологическая, 1976, й 6, с.849-857.

4. Васильева Л.В., Лафицкая Т.Н., Намсараев Б.Б. Новый род поч-кукщихся бактерий AnRulomicrobluni tetraedrale с радиальной симметрией клетки. ~ Микробиология, 1979, т.48, J* 6, с. 1033

- 1039.

5. Васильева Л.В. Морфологическое группирование простекобактерий. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1980, № 5,

с.719-773.

6. Терехова JI.П., Лайко А.В., Лохмачева Р.А., Лафицкая Т.Н., Васильева Л.В. Чувствительность некоторых родов простеко-бактерий и почкующихся бактерий к антибиотикам. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1981, Ji I, с.143-147.

7. Козлова JLH., Семенов A.M., Васильева Л.В., Эль-Регистан

Г. И. Ауторегуляторные факторы мембранотропного типа действия простекобактерии Labrys monachus. - Известия АН СССР, сер. биологическая, 1983, № 5, с.788-790.

8. Васильева Л.В., Олиготрофы как компонент биогеоценоза. -

В кн.: Почвенные организмы как компонент биогеоценоза, М.: Наука, 1984, с.232-241.

Э. Vasilyeva L.V. Soil prosthecobacteria representative of microflora of dispersion. - Soil biology and conservation of the Biosphere. J.Szegi (ed.), 1984, p.671-676.

:0. Васильева Л.В., Семенов A.M. Новая почкующаяся простекобак-терия с радиальной симметрией клетки Labrys monachus. -Микробиология, 1984, т.53, Js I, с.85-9?.

[I. Лысенко A.M., Семенов A.M., Васильева Л.В. Нуклеотидный состав ДНК простекобактерий с радиальной симметрией клетки. -Микробиология, 1984, т.53, JJ 5, с.859-861.

[2. Васильева Л.В. Простекобактерии в почвах рисовых полей. -В кн.: Повышение продуктивности почв рисовых полей, М. : Наука, 1985, с.125-132.

3. Vasilyeva L.V. Stella, a new genus of soil prosthecobacteria, with proposals for Stella huroosa sp|t nov. and Stella vacuo-lata sp. nov. - Int. J.Syst.Bacterid., 1985, v.35, N k, p.518-521.

A. Vasilyeva L.V., Semenov A.M. - Validation of the publication of new names and new combinations previously effectively published outside the IJSB. - Int.J.Syst.Bacteriol., 1985, List 18, v.35, N 3, p.375

:5. Нелидов С.H., Васильева Л.В., Калининская Т.А., Карабалаева P.M., Ли Н.Т., Чистякова И.К., Пивоваров Л.П. Биохимическая активность щелочных почв южного Прибалхашья под культурой риса. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1985, Гл 5, с.693-699.

16. Семенов A.M., Васильева I.B. Смена лимитирующего фактора при хемостатном культивировании простекобактерии Labrys monachus. -Микробиология, IS85, т.54, И 2, с.329-330.

IV. Семенов A.M., Васильева Л.В. Морфофизислогическая характеристика роста почкующейся простекобактерии с радиальной симметрией клетки Labrys monachus при периодическом и непрерывном культивировании. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1985, ¡i 2, с.288-293.

18. Vasilyeva L.V. New unusual bacteria with radial symmetry.

- Proc. IV ISME, 1986, p.147-152.

19. Васильева JI.В., Семенов A.M. Простекобактерии рода Stella и описание нового вида Stella vacuolata. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1986, ib 4, с.534-540.

20. Нелидов С.Н., Васильева JI.В., Мишустин E.H. Использование пожнивных остатков для повышения урожайности риса на мелиорируемых щелочных почвах. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1986, й I, с.43-57.

21. Нелидов С.Н., Васильева Л.В., Попенко А.К., Першина Э.Н., Ярославцева Н.В. Микробиологическая трансформация кислото-содержащего компоста в щелочных почвах и урожайность риса.

- В кн.: Микробиологические основы повышения урожайности с/х растений, Алма-Ата: Наука, 1986, с.28-42.

22. Семенов A.M., Васильева Л.В. Морфологическая и физиологическая характеристика роста простекобактерии p.hirschii

при периодическом и непрерывном культивировании. - Микробиология, 1986, Т.55, ib 2,.с.248-252.

23. Семенов A.M., Васильева Л.В. Смена лимитирующего фактора при хемостатном культивировании простекобактерии P.hirschii.

- Известия АН СССР, сер.биологическая, 1986, й 2, с.306-309.

24. Семенов A.M., Васильева Л.В. Рост Stella vacuolata при

" периодическом и непрерывном культивировании. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1986, Js 6, с.959-963.

25. Семенов A.M., Васильева Л.В., Варфоломеев С.Д. Кинетические параметры роста некоторых простекобактерий. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1986, $ I, с.131-134.

26. Семенов A.M., Окороков Л.А., Васильева Л.В. Обнаружение экстремально высокого сродства к субстрату у олиготрофных простекобактерий. - Доклады АН СССР, 1986, т.291, № I,

С.225-227.

27. Mishustin E.N., Nelidov S.N., Vasilyeva L.V. Efficiency of . the meliorative and fertilizing action of rice crop residues on "Che alkaline soils of southern Kazakhstan. - Proc.

of the 9 th Int.Symp. on Soil Biol, and Conserv. of the ■ Biosphere (ed. J.Szegi), 1987, p.531-540.

28. Нелидов C.H., Васильева Л.В. Использование покнивных остатков риса в качестве органического удобрения. - Известия АН СССР, сер.биологическая, 1988, Js 3, с.437-449.

29. Семенов A.M., Окороков Л.А., Васильева Л.В. Поглощение глюкозы Labrys monachus - почкующейся простекобактерией с радиальной симметрией клетки. - Микробиология, 1988, .

т.57, № 6, с.912-916.

30. Черных Н.А"., Васильева Л.В., Семенов A.M., Лысенко A.M. Степень ДНК-ДНК гомологии у простекобактерий рода Stella.

- Известия АН СССР, сер.биологическая, 1988, № 5, с.776-779.

31. Maskova Н.Р., Vasilyeva L.Y., Kofronova 0., Kunc F. Microflora participating in the decomposition of carboxymethyl cellulose continuously added to the soil. - Folia microbiologia, 1988, v.33, N 6, p.482-490.

32. Vasilyeva L.V. Genus Stella (Vasilyeva,1985, 521те). - In: J.G.Holt, J.T.Staley (eds). Bergey|s Manual of Systematic Bacteriology, 9 th. Williams and Wilkins, Baltimore, 1989, v.3, p.1923-1924.

33. Vasilyeva L.V., Genus Labrys (Vasilyeva, Semenov, 1985, 375

- In: J.G.Holt, J.T.Staley (eds). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9 th. Villiams and Wilkins, Baltimore, 1909, v.3, p.1920-1922.

34. Vasilyeva L.V. Genus Angulomicroblum (Vasilyeva, Lafitskaya and Namnaraev,1979, 1037VP). - In: J.G.Holt, J.T.Staley (eds). Berey's Manual of Systematic Bacteriology, 9 th. Williams and Wilkins, Baltimore, 1989, v.3, p.1969-1971.