Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование метода ДНК-ДНК гибридизации в классификации метанокисляющих и некоторых родов олиготрофных бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование метода ДНК-ДНК гибридизации в классификации метанокисляющих и некоторых родов олиготрофных бактерий"



он

российская акддрш iшт институт микробиологии

Иа правах рукописи

ЧЕР1Ш НаколаП Алексе в нич

Ш 57Э.22«-57Э.8414:577£1

птользо&мшв ьетода дшс-да гйБкодаацза

В КЛАССПЕПШЩЗ НВТАНОЯКСУШПЦИ П НЕКОТОРЫХ

родов олиготрогшх рактенщ

ОЗ.00.ОТ - ЦШфСбНОЯОПШ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

москва - 1993

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН Научный руководитель: кандидат биологических наук А.N.Лысенко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.М.Горлешо

кандидат биологических наук Б.А.Фомин

Ведущее учреждение: кафедра микробиологии МГУ им.М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится щ/6 к и*1993 г. в час. мин. на заседании Специализированного Совета Д.002.64.01 при Институте микробиологии РАН , г. Москва по адресу¡117811, Москва В-811, проспект 60-летия Октября, д.7, к.2

Автореферат разослан 7/" ^А^7 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета , ¡у

канд. биол. наук ^^ ' Е.Ш'лштни

Актуальность проблемы. Современная классификация бпктерий Есе больше основывается на данных по. анализу генома ( нуклеотидныЯ состав ДНК, размер генома, ДНК-ДНК гибридизация, анализ последовательностей отдельных генов и т.д.). Однако при описании бидов и родов бактерий также большое значение имеют морфологические и физиолого-биохимические особенности организмов. Часто классификационные схемы, построенные с использованием одностороннего подхода к классификации, не совпадают. Том не менее, пути преодоления этих противоречий уже намечены. Однз из таких возможностей может быть осуществлена при создании частных классификационных схем на уровне штамм, вид, род с учетом результатов фенотипического и генотгатаческого методов. Исходя из этого, Международный Комитет по согласованию поводов к систематике бактерий предложил относить к одному виду множество штаммов с уровнем гомологии ДНК не менее 70 %. При этом не рекомендуется давать названия отдельным геноЕИдам, .которые не отличаются от других геновидов по фенотипическим свойствам, до тех пор пока не будут найдены какие-либо дифференцирующие признаки (Wayne,Brener,Colv; ell et al., 1987). Таким образом, положены основы для определения вида у прокариот, где определяющее значение имеет генетическое родство, которое достаточно надехяо выявляется при проведении реакщш гибридизации ДНК исследуемых орг;,низмов.

Подобного рода проблемы имеются и при изучении бактерий, относимых к классу Proteobacteria , в частности в

группе метанокисляющих и некоторых родов олиготрофных сактер;;й. У этих организмов достаточно хорошо изучены фенотипические свойства. Однако определение генетического родства не проводилось. Такхе в свете генотипической классификации не изучался вопрос о езлидности имеющихся фенотипических признаков в этих хорошо известных группах. Статус новых изолятов, относимых к этим группам, не был определен.

Целью настоящей работы явилось построение на основании методов геносистематики классификационных схем для ряда протеобактерий, относящихся К родам Methylomonas, Methylobacter, Methylooooous, Methylooystis, Methylosinus, Hyphonicrobium, Stella, Labris, Prosthecobaoterium и Ancalomicrobium; анализ

полученных генотжшчвских признаков в сравнения с имеющимися фенотюглческкми дескрипторами; описание новых видов. В задачу работы входило: определение нуклеотидного состава, размера генома, у гомологий ЛИК; проведение корреляционного анализа фенотипических я генотипических признаков для определения таксономического веса признаков; описание новых видов на основании полученных данных и коррелирующих с ними фенотипических признаков.

Научная новизна и практическая ценность работы . Впервые ^рсвед'.-но систематическое исследование геномных свойств большинства известных видов и родов метанотрофных и отдельных родов олиготрсфных бактерий, изучены физико-химические характеристики их ДНК. Уточнено или определено таксономическое положение некоторых видов и штаммов. Проведен корреляционый анализ известных и вновь предложенных фенотипических дескрипторов исследованных бактерий в рамках генотипической классификации.

Б ходе работы был создан и в настоящее время используется банк репершх ДНК, позволяющий ускорять процесс идентификации новых форм бактерий . Метод молекулярной гибридизации оказывается полезным при исследовании производственных штаммов микроорганизмов, поскольку при их длительном культивировании' постоянно возникает необходимость быстрой идентификации.

Апробация работы. Материалы диссертации были должены на VII Всесоюзном съезде Всесоюзного микробиологического общества 'Алма-Ата, 1985 );на II Международной конференции по таксономии и автоматической идентификации бактерий в Чехословакии ( Прага, 1937) ; на III Всесоюзной коферешши "Проблемы экологии Прибайкалья"( Иркутск, 1988 ).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах.

Место проведения работы . Работа проводилась в Институте микробиологии АН СССР в лаборатории общей и сравнительной вирусологии и лаборатории олиготрофных микроорганизмов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ В работе были использованы следующие штаммы метанотрофных бактерий: Methylobacter bovis ШТ. 89 , M.vinelandii ШТ. 87,

-ö-

M.oapeulatus ШТ. 69 и шт. "Y", M.chroococcm ШТ. 72 ir шт. 90, Methylomonas albus ИТ. Bg3, M.nethanica шт. JN/1, шт. 95, шт. 12 к шт. 75. М. rubra ШТ. Ш15, Methylocoocus capsulatum ШТ. Tosas и шт. 119, Methylocystis piriformis шт. 14, М.minimus шт. 26, М.parvus ШТ. ОБ BP, Methylosinus sporium ШТ. 1V5, ?í. trichosporiiw: ИТ. 44. Культуры получены от В.Ф. Гальченко (ШИ АН СССР, лаборатория микробной биогеохимяи).

Шташы олиготрофных бактерий, относимые к рода- Stella (S.humosa, ВКМ 1137, S.vacuolata шт. 229,шт. 141 и ШТ.143, Stella sp. ШТ.142, ШТ.12 В , шт. 12 П, ШТ. 227, шт. 15, шт. 10 П, шт. 10 В ) И Labris (Ъ. monachos 1479 ). Prostheccbacteriun (?. enchydrm, ВКМ В-1376, P. pneuaiaticua ВКМ В-1С89, ?. polyspheroidum ВКМ В-1313, Prosthecomiorobium sp. шт. 11, ст.16, ШТ.26, ШТ.25в, ШТ.25БМ, ШТ.25с, ШТ.17Ж, ШТ. 17с, !ПТ. 186, ШТ.18м, шт. 18к, шт.20, U1T.B-1138, тт.21, шт.22) получены из отдела почвенных микроорганизмов ИШИ АН СССР от Л.В.Васильевой л A.M.Семенова .

Штаммы рода Hyphomicrobium sp .шт. ZV, ИТ. Z-3, ШТ. "-115, шт. Z-116, шт.Х, шт. НЗ, шт. G3, шт. G5, шт. 4ТЗ получены из коллекции ИНМИ от И.Я.Ведениной и А.В.Лебединского . Штамм Hyph< microbitm NA-160 получен от Д.И.Никитина.

Выделение ДНК проводили модифицированным методом Мару,ура Шаггшг, 1961). Нуклеотидный состав определяли по температуре плавления ДНК и рассчитывали по формуле 111=2,03x^-106(Owen et al.,1976), где Тпд-температура плавления молекулы ДНК. Гомологию ДНК изучали двумя способами: спектрофотометрически (Ге Ley et al.,1970) к с применением радиоактивной метки. Для о'/ределения молекулярной массы ДНК (размер генома) использовали формулу, предложенную Джилисом (Giliis et at.,1970):

98,37-0,91ГЦ М = -п- .

А. 10'

где М - размер генома, выраженный в дальтонах, ь - коэффициент реассоциации ДНК.

Гибридизацию на яитроцеллюлозных фильтрах проводили, используя реперную ДНК, меченую методом nicic-трансляиш (Маниатио и др..

-61984). Реакцию осуществляли при 48°С в течение 36 ч в растворе, содержащем 50% фэрмамида и 6-кратный стандартный солевой раствор.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Метанотрофные организмы.

В основу классификации облигатных метанотрофных бактерий прежде всего были положены различия в путях ассимиляции углерода метана и типах внутрицитоплазматических мембран. Согласно системе, предложенной Витенбари с соавт.(v/hithenbary et al.,1970), все облигатные метанотрофы разделяются на две группы. Представители I группы включают роды Methylomonas, Methylobacter И Methyiooocous, характеризуются рибулезомонофосфатным циклом С,-ассимиляции и мембранными везикулами, собранными в стопки. Для метанотрофных бактерий II групш (Methylоsinus и Methylocystis) характерно наличие ферментов серинового цикла С1-ассимляции и разобщенные мембранные везикулы, расположенные по периферии цитоплазмы.

В последние годы з ряде работ (Woliruт et al., 1987, Tsuji et ai., 1990) на основании анализа последовательностей рибосомной РНК установлено филогенетическое положение нескольких представителей' метанотрофов. Эти организмы предложено относить к классу Proteobacteria (Stackebrandt et al., 1988). Причем представители I.и II групп значительно дивергировали друг от друга и относятся к разным филогенетическим линиям. Рода Methylosinus и Methylocystis Еключены в а- подтрушу, а роды Methylomonas и Methyiooocous в 7-подгруппу. Methylobacter как род в этих работах не упоминается. Однако в работе Баумана с соавторами (Bowman et al.,1991) показано, что все в настоящее время известные метанотрофы по генотипическим свойствам можно разделить на пять кластеров. Каждому кластеру, по-видимому, соответствует родовой уровень. Причем следует отметить, что группа штаммов ранее относимых к роду Methylobacter, представлена кластером с названием low G+c Methyiooocous. Таким образом, классификация Витенбари находит свое подтверждение и на генетическом уровне.

Тем не менее в 9 м издании определителя Берги метанотрсф представлены двумя родами: Methylomonas И tiethylococcus. Кроме

того, ряд исследователей (Малашенко и др.,1978; Романовская, 1984; Романовская и др., 1986), не подвергая сомнению основную концепцию классификационной схемы деления метанотрофов на пять таксонов родового ранга, предлагают выделить новый род Methylovarii:s вместо известного рода Methylobacter.

Однако до сих пор не было проведено работ по выявлению гомологии ДНК среди основных представителей метанотрофов. Нами были впервые выполнены такие работы на 25 штаммах, относ:мых к 13 видам пяти родов согласно классификации Еитенбари.

В серии предварительных экспериментов нами были выявлены уровни гомологии ДНК различных родов метанотрофных бактерий обеих групп (табл.1). В качестве реперных образцов использованы ДНК Methylobacter oapsulatus, Methylococcus capsulatum И Methylocystis parvus. Уровень неспецифического связывания определяли в реакшш с гетерологичной ДНК, имеющей близкий нуклеотидккй состав ( ДНК Е.coli,К 12).

Между представителями обеих групп, а также различных родов метанотрофных бактерий, вне зависимости от нуклеотидного состава их ДНК, степень сходства в полинуклеотидянх последовательностях не превышает 5-10®. Полученные результаты свидетельствуют о высокой степени генетической обособленности этих бактерий на уровне рода. В то же время в пределах отдельных родов ( табл.1) наблюдаются кластеры включающие близкие формы.

Таблиш 1

Гомология в ДНК метанотрофных бактерий,определенная с поновею

радиоактивной метки

Организм

Штамм

ГЦ,мол%

Гомология,% к реперной ДНК

М. capg^-latus M.sggEUlatus M.gasjus

Methylobacter oapsulatus 69

M.chrooooooum M. chroococcum Methylomonas rubra Methylococcus oapsulatus

Methylocystis minimus Methylocystis parvus Escherichia coli

72 90 Ш15

Texas

26 OBBP К 12

51 . 4 51 .7

50, 5 53. 1

61 .5

61 .5 61 ,7 51 ,9

100

96

97 5

12 9 б

100

5 2 1

10 1 i 7 б

11

41 1C0 1

Для выяснения степени родства на уровне видов и штаммов проанализировано 25 метанотрофных организмов. Эта часть работы была выполнена методом оптической реассоциации, позволяющим получить результаты по гомологии ДНК и одновременно определить молекулярную массу ДНК, а также возможные фракции повторов в геноме.

В основном подтверждаются закономерности, обнаруженные наш раное (табл.2). Не удалось выявить гомологий в ДНК между метанотрофными бактериями I и II группы. Сходство в ДНК на уровне рода составляет 5-20%, причем более высокие значения гомологии, характерны для двух родов I группы - Methylobaoter и Methylomonas.

Внутри рода Methylobaoter (табл.2) обнаруживается группа близкородственных форм. Различия между штаммами M.chroococcum 72 и 90 незначителыш и находятся в пределах ошибки используемого метода гибридизации. Меаду отдельными видами этого рода также наблюдается высокая степень генотипического родства (60-80% гомологии). Однако следует указать, что изученные нами представители рода Methylobaoter представлены одним геновидом, а наличие единичных фенотипических различий скорее указывает на внутривидовую изменчивость ( подвижность, окраска, слабый рост в • мезсфилъных условиях).

Анализ уровня гомологии внутри рода Methylomonas выявляет хорошую очерченность этого таксона в пределах разных видов. Сходство в нуклеотидных последовательностях ДНК Methylomonas albus и Methylomonas rcethanica составляет 30%. Несколько меньшие величины гомологии характерны для Methylomonas rubra (табл.2). Широким диапазоном уровня гомологии (50-80%) представлены штаммы вида Methylomonas methanica. Причем ШТ. M.methanica JN/1 заслуживает статуса геновида. Отмечены также незначительные вариации в других геномных характеристиках, в частности в нуклеотидном составе ДНК разных видов и штаммов Methylomonas . По величине генома этот род, так же как и Methylobaoter образует достаточно компактный кластер.

Метанотрофные бактерии II группы включают два рода: Methylosinus и Methyiocystis. Для них характерно высокое содержание ГЦ-пар в ДНК и близкие их значения. Гомологии ДНК между родами составила

-920 % ( табл.3), что позволяет сделать вывод о генетической збоссбленности этих таксонов. Относительно низкое сходство (24:- ) Х5наруаивзвТСЯ мвКДУ Ме+,1ПУ10£31ГА13 врогЛиа И Ьг1сЬозрог1Ш1. Генетические взаимоотношения между вид о:.:;: 1еШ,у1осузиз составляют от 20 до 405 гомологии.

Таблица 2

Токология в ДНК иетанотрсфннх бактерий I группа, опрсделе-дная методом оптической реасссциают

Организм

¡Штамм

Heihylomonas albus

'.5. rubra

И.methanica

Methrrlobac ter eapsUIa-ous

M.capsulatus

И.chrcococcum

К. chrooooccuai

vincland.il

M.bovis

Methy1 о с о сeus c-apsUIatus

E.ooli AB

B« 8 Ш15

12 75 95 JI.V1

69 Y 72

90 87 S 9

~1'Ü ¡ГОМОЛОГИЯ В ПО ÖTHOXeiV:;:

мол£!пешой J2iK (указаны ктсммн)

-P

Вр8|Ы16'| 1 2 | 69

52 53, |52. ¡50,

5|1CO | 1 ! 13| юо!

51

51 51 51 50,

52. 5

Texas 61,7 К12 j 51,9

I

С. U

27 3£

1 4 18 б 7 9 12

10

1й! юо

Vi

та

21! 53|

3[ 51

5 10

10

19 18

21 1 0 а 21

7 2

100 91 71

75

ад

100 Ог' 83 I 80' 65

13 7

1| 1 I

100 5>б|-

оо

65! 57

ТсЛЧз

¡не

ю юо| 1 1 !

"5TD Х'Д

! 1

1 50

50 70

.30

ten со:-'-:

При проведении реакции молекулярной гжзркдкзацпк кгтодс:.: оптической реассоциации следует учитывать велгозу гскоусз изучаемых организмов и проводить реакцию з зкеигеномных соотношениях. Следует отметить, что существенные рсз-тжя з молекулярной массе ДНК могут служить допсжлголнщм таксономическим признаком, способным внести попр;:!:-;;: б классификацию родов и видов, как это было установлено ггкж для группы термофильных клостридиальшх оргш!змоз ( Черных, 1985; Кривенкс, Черных и др.,1 $3 У) <

Анализ данных табл. 1-3, позволяет заключить, что размер генома метанотрофнкх бактерий колеблется в небольших пределах. Нами отмечена слабая зависимость между велич;п;сй гзнсма и содержанием ГЦ-пар в ДНК. Для метанотрофнкх бактерий, ж?еших нуклеотидшй состав в ДНК 50-54 кол.%, размер генома находится в

Тсйлииз 3

Гомология в ДНК ыетанотрсфных бактерий II группы, определенная методом оптической ре ассоциации

ТТЛ |Гомология в ДНК, % по ОТНОЕбНИ» Штаммы .¡гол с|к реперной ДНК (указаны штаммы)

! " """'Г1£о!оввр'ы |гб га'дд гено~

ОрГЗННЗМ

М. сарЕиХаЛиз ".ругегогтпХз

". rr.inir.LU3 Ii.niniir.us I'. с

?■'. ~г1сЬо,~рог^

.иЛ

Техаз 1 19

ОВВР 14 26 42 2

22 (У5 АЛ

61 .5 61 ,7

61 ,8 62.5 51 ■ 5! 61 ,7| 63,7!

60,7 61 .3 64,7 |

1001 801

е| юо

1 .75x10" 1

7

11!

161

12! I

4 |

7

9

33 35 50 20

20 17 Ю

100 37 35 25

19

14

15

100 90 28

1 1 14 17

100 91 34

нет

.60

.30 .80 .75 .80 .00

д

100

нет

данных

,65

данных

пределах 2,2-2,7 х 10" Д, для организмов с высоким содержанием ГЦ-пар размер генома относительно меньше 1,6-2,2 х 109 Д. Сходные результы получены я другими исследователями (Вотаап et а1.,1991).

обособленность двух групп

указывают

на

Эта результаты метанотрофов.

Ка основании результатов по гомологии ДНК, с помощью метода-кластерного анализа по матрацам сходства ДНК, построена дзндрограммэ родственных отноиений между исследованными представителями метанотрофов (рис.1). На дендрограмме хорошо выявляются отдельные кластеры, которые, по-видимому, в таксономическом отношении отражают родовой уровень для метанокислякких организмов.

Таким образом, изучая геномные свойства метанокисляющих бактерий нам впервые удалось получить полную матрицу сходства исследованных геномов. На основании этих результатов построена классификационная схема для исследованных организмов (дендрограммз), отражающая родственные взаимоотношения видов метанотрофов .Из этой схемы видно, что феноткпическая классификация изученных представителей метанотрофов достаточно хороыо совпадает с генотипическим разделением. Однако для организмов рода ме1;Ьу1оЬас1:ег отмечены внутривидовые, а не межвидовые отличия. Один штамм рода Ме^1отопаз по

генотипическому статусу мокэт Сыть представлен как отдельный вид.

-на.87 П. 63 У. .свр ?!. "Т"И .сар^и^а^иц М.сЬгзосоасих.

-га.90 М. сЬгоососс-ит Ш. В.5'3 Ме $ отс л л г. • <711/' ?! с? 5гг,с !г:-'.з

ч

I _

о

25

50

75

^.75 Ме^^^плз -¡¿П.Ы.Г5 М. гиЪга

-«Я.Телаз К Ч'Л. 119 М.с

Ч'ГЛ .25 М. т '.и 1:глгз

-ИТЯ. ОВДР М. -)га-лаз -1^72.44 М. 1-о'по5т;ог!та

1 00

% гомо„-оги

з ДКК

Рис.1. Дендрограмма родствнных отношений между исследованными представителя?,и меганскисляжщих бактерий.

2.ОлиготроФнке микроорганизмы.

Группа бактерий, известная как "олиготрофкые" достаточно обширна. В нее включены представители более десятка родов, способных расти при низких концентрациях доступного органического вещества. Однако некоторые классические представители этсС группы (напр.НурЬописгоМит) могут хорошо развиваться и на богатых органически веществом средах. Таким образом, понятие "олиготрофше" организмы до определенней стенени условно. Интерес к этой группе бактерий усилился, когда стала ясна их роль в трофической цепи как замыкающих распад органического гещестза ("микрофлора рассеяния" Завзрзин, 1970). Учитывая экологические

особенности при росте на средах, в последнее время удалось выделить ряд новых организмов в чистке культура и описать их как представителей новых родов. Филогенетический анализ рибосомальной РКК показал, что солькенство известных олиготрофных бактерий относятся к классу Р^еоЬас4ег1а ( Stackebгanйt еЬ а1., 1988). Однако до настоящего времени в этой группе организмов недостаточно хорошо разработана классификация штаммов и видов; слабо изучены фенотипические характеристики, и не были проведены эксперементы по определению гомологии ДКК.

Основным критерием при выделении видов этих родов послужили морфологические признаки бактерий ( 31;а1еу,19б8, 5Ъа1еу, 1974). Род р го в ъье ссгг,1сгоЪ объединяет пять видов, различающихся по длине и количеству просгек, подвижностью клеток, наличию газовых везикул ( staley, 1988). Мы исследовали 16 штаммов прсстекобактерпй, имеющих многочисленные, варьирующие по длине прсстеки. Целью нашей работы было установление таксономического статуса этих новых изолятоз. Необходимо было выяснить, являются ли они члена?,51 известных видов рода РгозШеоот1огоЪ1ит или занимают иное таксономическое положение. Креме того, необходимо было выяснить, в какой мере уже известные фенотинические признаки коррелируют с результатами по ДНК-ДНК гибридизации и предложить эти признаки для описания новых форм.

Сравнение нуклеотлдного состава ДНК у исследованных 16 штаммов показало, что по этому признаку все штаммы находятся в пределах рода Ргоз&еооггасгоЫит ( 62,2 - 70,4 мол.%, табл.4).При определении гомологии ДНК у исследуемых культур, обнаружилось группирование штаммов в отдельные кластеры.

Первую группу составили штаммы 11, 16, 26, у которых длина простек не превышает 0,25 мкм, клетки неподвижны, колонии не пигментированы. Эта группа бактерий преимущественно потребляет углеводы, различаясь между собой по их спектру. Штаммы 16 и 26 утилизируют метанол, а итамм 26 метанол и метиламин. Несмотря на фенотипическую однородность, штаммы 11 и 16 дают 43% гомологии в ДНК, а штамм 26, по отношению к ним,'только ЗОЙ. Таким обрззом, эта группа штаммов довольно гетерогенна и ее представители

-1r}-— I w-

заслуживают статуса отдельных геновидов.

Вторая груша объединяет штаммы с зкелтым пигментом 25в, 2Бвм, 17к и непигментированшэ штаммы 25с и 17с. Варианты непигментированных штаммов получены в результате диссоциации исходных культур 25 и 17. Между диссоциированными вариантам:! каждого штамма степень гибридизации равна 100%, между исходными штаммами от 80 до 95 % ( табл.5). Длина простек не превышает 0,20 мкм, клетки неподвижны, используют широкий спектр углеводов и органических кислот. Не используют Cj-соединения. Можно заключить, что эта группа штаммов по своим геномным свойствам представлена одним геновидом.

Третья груша штаммов (18м, 186, 18к) имеет высо:сий уровень сходства в ДНК (1СШ), а по отношению ко второй группе штаммов- от 30 до 50% гомологии. Эти организмы имеют простеки длиной 0,4-0,6 мкм, их колонии окрашены в желтый цвет. По результатам ДНК-ДНК гибридизации они зашагают положение геновида. Однако, учитывая слабые фенотипические различия эти группы были описаны как два новых вида. Первая группа как Р. michustinii, вторая и третья как Р. consooiatum.

Штаммы четвертой группы, обладающие красным пигментом, (В-1138 и 20), характеризуются длиной простек в пределах 0,5-0,6 мкм, млеют между собой высокий процент сходства в полинуклеотидных последовательностях ( 55% ). Только эта группа бактерий обнаруживает 30% гомологии ДНК по отношению к типовому" штамму вида P.enhydrum В-1376, с которым они близки и морфологически (Васильева и др.,1974). Таким образом, штаммы В-1138 и 20 могут быть отнесены к номенклатурному виду P.enhydrum.

Ряд изученных штаммов не обладает родством к перечисленным группам, хотя по морфо-физиологическим характеристикам они несомненно относятся к типу бактерий, объединенных в род Prosthecomiorobium (штаммы 21, 22« В-1313).

Штамм 21 обладает морфологическими признаками, характерными для штаммов четвертой группы ( размер простек 0,5-0,6 мкм), но может при некоторых условиях образовывать единичные простеки длиной до 3,5 мкм (подобно P.pneumtioum). Иногда простеки могут ветвиться, что характерно для бактерий рода Ancalcmiorobium . Однако

Таблихуз, 4

Гомология в ДНК у простекобактерий, определенная с помощью радиоактивной метки.

Гомологии в ДНК, % по отношению к реперному штамму

Организм

Штамм

ГЦ мол%

В-1313

В-1389

В-1375

В-1376

Ргоа Шесот1сгоМ.ип1

Р. polysph.eroid.iam Р. pn.eumati.cum Р.еп11у£гит Апса1от±сгоЪ1ипг айв ■бит

Е.со11

1 1 16 26 25В 25ВМ 25 С . 17К 170 18М 185 18К 20 21 В1 133 В1313 В1389 В1376

В1375

66,5 63,5 66,0 63,7 64,5

63.7 64,3

64.8 65.2 64.2 65,2 62.5 66,0 62.5 63,1

65.7

64.8

71 .0

7

7

г г л

5 5 5 2 2

3 2

4 2

100

8 3

г

К-12 52.0

4

2

0 и

3

г.

5 16 16

2 г г з з

3

4 100

4

5

1

2

3 2 2 2

4

3

4 4 4 3

г з 1 б з

3

100 1

2

4 7 6

5 7 4

3

4 14

4 20 2 22 1 2 100

3

г

з

чрезвычайно низкий уровень ДНК-ДНК гибридизации по отношению к двум типовым штаммам рода РгозШеоот1сгоЫ.ит, а также некоторые физиологические особенности, заставляют рассматривать эту культуру как изолированный кластер, в статусе геновида (Рис.2).

Штамм 22, морфологически идентичный штаммам вида Р.МгзсЪИ ^а1еу, 1984), также не обнаруживает родства ни с типовыми штаммами рода РговШесописгоМит (Р.ейгуйгит В1Ш-1376, Р.рпеитаисит ВКМ-1389) И Апса1от1огоЫш ВКМ- 1375 ( ТабЛ.5), НИ С исследованными штаммами. Он остается в статусе геновида до тех пор, пока не будет выяснена его генетическое родство с типовым видом Р.йугБсМЗ..

Гомологии ДНК не обнаружено между перечисленными выше группами штаммов и простекобактерией ВКМ-1313, описанной ранее в отдельный вид Р.роХугрЬегохйиш (Васильева и др., 1976).

Табльщ 5

Гомология в ДНК у простекоОактерий, определенная методом оптической реассоциадаи.

Организм Штамм Гомология в ДНК , % по отношению Размер

к реперной ДНК(: /казаны репе! даые- штаммы) генсмз

11 16 26 17Ж 18К 20 21 22 25В 25С 1138 XIо Д

Тгоз-Шесот:!.-

сгоЫига 11 100 г.б

Р.зр. 16 43 100 2.2

Р.БР. 26 30 30 100 - - - - - - - - 1 .9

Р.зр. 25В 21 16 21 95 34 4 1 0 100 100 - 2.4

Р.зр. 25ВМ 21 16 20 94 38 10 2 1 100 100 - 2.3

Р.зр. 25С 21 16 24 93 41 а 1 1 100 98 - 2.3

р. ер. 17Ж 23 22 27 100 51 6 1 1 95 94 - г. 1

Р. ер. 17С 23 22 29 100 46 11 1 0 96 91 - 2.3

Р .ер. 18К 7 7 10 50 100 14 1 0 40 43 - 2 .2

Р . Бр. 186 7 8 11 50 100 13 1 1 4.3 47 - г .4

Р. эр. 18М 7 8 11 43 100 12 1 1 36 29 - г.з

Р.эр.ВКМ В1138 3 3 7 10 10 55 1 0 10 11 100 2.3

Р.БР. 20 11 9 8 10 11 100 0 1 10 11 57 2.4

Р.гр. 21 1 ' 3 2 1 1 1 100 1 1 0 1 2-4

Р.гр. 22 1 1 1 2 1 1 1 100 0 1 0 2.1

Р.роХуэркего-

11ит В1313 1 7 9 1 2 1 1 1 1 1 1 2.1

Р .епЬусЬггшп В1376 3 4 11 10 7 ЗУ 1 2 8 1 38 2.3

Р.рпеита^аит В1389 1 1 2 0 1 0 1 1 1 1 1 2.4

Апса1от1сго-

Ъ1ит вс1е1;ш1 В1375 0 0 1 0 1 0 0 0 0 2.4

В.со11 К-12 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 2.3

Полученные результаты позволяют заключить, что среди представителей рода ' РгозйгесопйсгоМии, изученных нами, наблюдается довольно значительная дивергенция геномов, при относительной схожести морфо-физиологических характеристик.

Сходные результаты были получены Шлеснером (ВсМеепег е! а!., 1990), который также показал, что гомология в ДНК у Р.рпеияаисип, Р.епоЬуйгит, Р.МгзеЬИ не превышает 5%. Однако простексбактерии были отнесены им к одной филогенетической линии по данным каталогов олигонуклеотидов 16Э рРНК. Род Ргоз^есоппсгоМиз включен в третью а-подгруппу класса Рго^еоЪасЪез^а; род Апса1от1огоЬ1ит помещен в эту же подгруппу, но в отдельный кластер.

/

На основании сходства ДНК построена дендрограша биогенетических отношений простекобактерий (Рис.2). По степени гибридизации ДНК выделяются несколько геновидов ( уровень гомологии ДНК ниже 60 %). Однако учитывая морфо-физиологические особенности статус номенклатурных видов был присвоен двум кластерам. Первый представлен штаммами: 11, 16, 26, а второй 25(В,ВМ,С), 17(С,Ж), 18(К,Б,Ы). Штамм 21 также, по-видимому, является представителем самостоятельного вида. Однако различие в степени ДНК-ДНК гибридизации, не подкрепленное достаточными фенотипическими признаками, еще не дает' основания для выделения самостоятельных таксонов.

Морфологические дескрипторы,такие как размеры и форма клеток и простек, а также расположение и численность простек на клетках, разделяют эти бактерии на несколько групп. Принадлежность к этим морфологическим группам в общем коррелирует с генетической

sp. sp. sp. sp. sp.

sp.11 sp. 1 б sp.26 sp.25B sp.25BM . sp.25C • ' sp.17C • 17Ж . 18K .186 . 18M

.1138 BKM В sp.20

sp.1376 BKM В sp.22

sp.1313 BKM В sp.1389 BKM В sp .21

Ancaloomicro'bii adetum sp.1375

50 75 100 % ГОМОЛОГИИ

В ДНК

Рис.2. Дендрограмма филогенетических отношений между исследованными представителями родов Prosthecorobim и Ancalomicrobium.

_л_

25

J

классификанией, осноезнной на результатах ДНК-ДНК газридизации.

Отттютлл rkunrv ffvafjr\mTrrrrTT7Qpv'TTY ттгут*гэтгот/'Лтэ атгил гза-тгчгм-лппгиттт гясг

УЛУ С ХЛГАА (ууЛи Ai.ui.ju "АО L/iljx^i. ¿XUÍI^ÍIi-IÍVWÍJ rfji-uj.^7 дидиу WUXIJ I< -

разграничения таких организмов, как штаммы 21, 20.

Таким образом, проведенная работа позволяет выявить среди группы вновь выделенных далипростекобактеркЗ определение штаммы, которые следует отнести к новым видам. Две группа ртю&эз б настоящее время уже описаны как новые виз рода Prostheoomicrobim (P.michustinii И P.consociatum). Шта:с.Щ 21 и 22 занимают положение геновидов.

Б.Простекобактерш_родов__Stella_H_Labris_c радиальной сг-мметпией

клетки.

Простексбактерии с радиальной ст«тркей клетки представляв? собой морфологически уникальную группу организмов. Известные в настоящее время бактерии этой группы объединены в два ро;,а: Stella и Labris (Васильева, 1980; Васильева и др., 1974; Васильева, Семенов, 1984; Vasilieva,1985).

К роду Stella относятся делящиеся' бактерии с морфологией правильной иестилучевой звезды. Описано четыре вида этого рода: S.humosa, S.vacuolata, S.aquatica, S.pusila (Vasilieva,1935; Schlecner, 1983). Определение нуклеотидного состава ДНК 12 стэм:,:оз рода Stella по температуре плавления показало, что они образуют однородную группу с высоким ГЦ-содерканпем ( 69,3-73,9 мол.;"). Выделенные Шлеснером s.aquatica и S.pusila тлеют близкий нуклеотидный состав (68,0 и 67,7 мол.% ГЦ соответственно) (Schlesner,l983). Физиологические признаки бактерий ро;з Stella з основном сходны. Все штаммы используют кислоты цикла Кребсо и аминокислоты, не использут углеводы, высокомолекулярные и циклические соединения, оксидазо- и каталазополсгительны, образуют аммиак и восстанавливают нитраты до нитоитов без образования газа.

Род babris с типовым видом Ь.monahos, ВКМ 1479 от представителей рода Stella отличаются способом размножения и некоторыми биохимическими признаками: использует углеводы, органические кислоты, но не использует аминокислоты ( Васильева, Семенов, 1984).

Е нашу задачу входило определение методом ДНК-ДНК гибридизации степени генетической близости этих организмов. Полученные результаты показали, что высокая степень гомологии проявляется среди штадаэв, имекшх газовые везикулы: 229, 141 и 143 (Табл.6). К этой группе оказались близки штаты 142,1211 и 12В, однако они не содержат гэзоеых везикул. В формальной систематике наличие газовых везикул в клетках - довольно важный признак. С другой стороны,известно, что этот признак часто детерминирован плазмидой (й'а1гьу,1976) и, по-видимому, не может считаться стабильным. Есэмозшо, что штаммы 142, 12В и 12П утеряли плазмиду и соответственно газовые везикулы. Поэтому мы предлагаем штаммы 229, 141, 143, 142, 12В и 12П относить К одному виду Б.уасио^а С уровнем гомология между штаммами от 60 до 100% (что соответствует статусу геновида). Наличие везикул считать второстепенным видовым признаком. Отсутствие гомологий в ДНК у ЬаЪг1з топаЬоэ со всеми

Таблица 6

Гоыологкя в ДНК простекобактерий с радиальной симметрией клетки, определенная с помощью радиоактивной метки

Организм Шта?»м ГЦ мол.й Гомология в ДНК, % по отношению к реперному штамму

1 137 229 227 ЬаЬг1Е

З.еЦа ¡гилпога 1 137 72,7 100 32 31 1

3. vaqaola'ta 229 73,5 а 100 21 1

БЬсНа вр. 227 70,0 5 13 100 0

ЗъеНа зр. 1 43 71 .8 б 74 11 1

Зке11а зр. 142 70,8 8 67 14 1

З-ЬоНа зр. 141 70,0 9 108 16 1

3-Ье11а зр. 15 70.4 6 10 13 1

зр. 12П 72,9 8 72 14 1

Зге11а зр. 12Е 71.4 11 60 13 1

S-teH.fi вр. 10П 71.4 3 1 14 1

3+,е11а ер. 103 72,2 3 1 16 1

1,аЪг±з топаИов 1479 67,9 1 ' 1 1 100

Е.со11 АВ 51 ,9 1 1 0 0

штзммзми рода Stella указывает на возможность выделения его в самостоятельный род.

Отношения родства исследованных штзммоз рода Stella представлены в виде дендрограммы (Рис.З), при построена которой использованы результаты по гибридизации ДНК , полученные методом оптической реассоцизции.

Типовой вид s.humosa штамм 1137 на дендрограмме занимает полокение, которое характеризует его как монозтаммсвый Та:-:ая ко ситуация наблюдается и для ряда других штаммов ( <<7, 15>;з отдельный кластер попадают штаммы 10П и 103. По всей вероятности, эти организмы отличаются пека есе не Еыязденымн физиолого-биохимичесними особенностями. По данным молекулярной гибрид, 1зэции ДНК они заслуживаю статус геновидов.

Сходные величины по уровню гкбриднзашк внутри реда steile получены Геймером и Шлзснером (Reirr.er et al.,1?99). В их работе также были использованны два изученных нами вида s.vacuolata и S.humosa, уровень гомологии которых составил 1155 íb на::ем случае-15%).

- Stîlla

hulosa ВКМ1137 - S.зр.12П

--- S . то. 12В

--- S. 'acuolata 229

- S._-p. 141

— - S . зр . <43

- S. 5p. ; 42

- S. -p. 227

- S.3P. 15

— - 3. ;p. 10П

- S..3P. 10B

l_1_1_I_l_i

0 20 40. 60 80 ICOS ГОМОЛОГИЯ

в ДН

Рис.З. Дендрограмма филогенетических отнесений кезяу исследованными представителя?,я рода Stella.

Так!й! образом, в группе изученных на?,к? представителей

Labris гомолога: в ДНК не обнаружено. С этими результатам коррелирует различие з способе разложения ( Stella- деление, bsbriü- почкование). Штажы внутри рода Stella дай&енпирувтся на пять кластеров, соответствующих положению геновидоз, два из совпадают с номенклатурными видами S.huir.osa 1137 и 229 ( 141,1436 142, 12П и 12В), а три кластера остался в статусе геновидоз ( шт. 227, 15, 10П и 10В).

К род:/ Kyphcmycгobiai относятся хемотрофные бактерии, образующие гагс- или биполярны© гифы, на концах которых формируются почки. Согласно соврем?нным представлениям, важной чертой представителей рсдь, отжча?.с»2 их от морфологически сходного рода нурЬсгаопаз, является использование (^-соединений. В 9-м издании Определителя бактер;й Берги описано 7 видов гифомикробов: Hyphomicrobium vulgare, K.as-stuarii, K.hollanäicm, H. faoilis (с двумя подвидами: (clerans и ursaphilun), К. zavarsinii, Н. coagulans, Н. nt+hylovoruci (Eergey'3,1989). Разбиение на виды представителей" этого рода в основном было стимулировано работам Кирша, особенно, молекуллрно-биологкческпмк исследованиям (Roggentin & Hirsch, 133?). Однако в представленной классификации гифомикробов не полностью исчерпано ' значение фенотипов, таких как тип денг.тр;:£;1кации на метаноле { Веденина, Лебединский, 1983). Не было предпринято попыток сравнить гкфомжробов-денитрифжаторов и гпфемикробов, не являющихся таковыми, методами молекулярной биологи:.

Исследования физиологии денитрифянации у гифомикробов показали, что 1'ПЮ;я1кробы-денитрификаторы резко различаются по скорости и эффективности анаэробного роста на средах с нитратом и метанолом, составу накапливаемых промежуточных продуктов, по зависимости процесса декитриф:кавди от ионов меди. Это позволило предположить, что, во-первых, группа денигрификаторов не является

симметрией клетки р.р. Stella и

филогенетически однородной, т.е. сама по себе способность к денитрификации не является ценным таксономическим признаком для гифомикробов, и, во-вторых,что в систематике гифомикробов тип денитрификации может иметь ванное таксономическое значение. Проверка этих предположений явилась одной из задач настоящей работы.

Результаты по ДНК-ДНК гибридизации показывают (табл.7), что исследованные наш штаммы гифомикробов распадаются на три кластера причем такое разделение коррелирует и с фенотипическими признаками: физиологическим типом денитрификации и образованием розеток. Первый кластер представлен штаммами НурЬса1сгоЫип 2-3. 2-115 и X, выделенными в анаэробных условиях, не образующими розеток и осуществляющими денитрификацию по I типу (накопление нитрата в отсутствии Си2+). Между этими штаммам! обнаружены такие уровни гомологии в молекулах ДНК (53-55 %), которые принято расценивать как отдаленные штаммы одного вида («Ытвоп, 1594).

Во второй кластер входят штагам Нур1ют1сгоЬ1ит 14 и КА-160, выделенные в аэробных условиях, образующие розетки и осуществляющие денитрификацию по II типу ( не накапливает нитрит в присутствии ионов меди). Уровень гомологии ДНК между этими штаммам еысок-93%.

В третий кластер входят штаммы НурЬогсисгоМит 3,03 и с-5, не образующие розеток и не растущие анаэробно. Уровни гомологии в ДНК этих штаммов, так же как и в первом кластере, соответствуют отношениям отдаленных штаммов одного вида.

Таблица 7

Содержание ГЦ и гомология в ДНК штаммов гифомикробов

]таммы ГЦ Процент гомологии в дни со штаммами Размер

мол.% г-з X г-115 14 N4-160 3 аз в5 4ТЗ генома

7.-3 61 .2 100 55 53 25 20 40 - 16 41 1 . 9x101

X 59,0 100 - 31 18 33 - - 37 1 .9

2-115 57.3 100 4 10 16 - - - 2.2

гу 61 .5 100 93 16 28 20 29 1 .9

КА-160 61 ,5 ЮО 30 - - 29 1 .9

3 56.3 100 60 - 35 2.1

аз 56,0 100 60 - 2.3

05 56.2 100 5 -

4ТЗ 58,0 100 2.1

Между штаммами, относящимися к разным кластерам, наблюдается такой уровень гомологии в ДНК, который принято расценивать как отражающий отношения отдаленных видов одного рода (геновида).

Штамм Нур1ютусгоЬз.т 4ТЗ (как и штаммы третьего кластера, не образует розеток и не способен к денитрификзции) занимает по результатам ДНК-ДНК гибридизации обособленное положение, соответствующее отдельному геновиду.

- Hyphomicrobium Z-3

— - " - X

— - " - Z-115 (— H. zavaryzinii ZV

1- _ » _ NA-160

G3 G5

4T3

— го

-i— 40

н 60

П-

so

100% ГОМОЛОГИИ в ДНК

Рис.4. Деядрограша филогенетических отношений мевду исследованными шташами гифомикробов.

Величина генома у изученных цредставителей гифомикробов колебалась в незначительных пределах (1,9 - 2,3 х109 Д) , по видимому, характерных для этого рода . Схожие величины были получены Хиршем с соавторами для других штаммов этого рода ( Hirsch et al., 1987).

Из приведенной на рисунке 4 дендрограммы видно, что изученные нами представители гифомикробов распадаются на четыре кластера со статусом геновида каждый. Причем, эта классификация коррелирует с такими фенотигшческими характеристиками как тип денитрификации, образование розеток и с кирнокислотными спектрами.

Геновид, состоящий из двух штаммов (ZV и NA-160) совпадает с номенклатурным видом H.zavarzinii. Другой кластер, представленный тремя штаммами денитрифицирующих по I ^типу гифомикробов (Z-3, X, Z-115) пока не описан как номенклатурный вид, но морфо-физиологические и хемотаксономические 'основания для этого

имеются. Два других кластера также соответствуют статусу разнкх геновидов. Однако оба эти кластера нз обладают достаточным наборов февотипических признаков, чтобы быть рассмотренными в кочестве номенклатурных видов.

Заключение

Полученные результаты позволили построить частные классификационные схема для представителей отдельнах родов класса РхЫеоЬаоЪегЗ-ит. Эти схемы основаны на генотипическом родстве и имеют независимое значение, т.к. при этом исследованные организмы были разделены на группы, соответствующие статусу геновида исходя из принятых значений гомологии ДНК( не меннее 60-70 % ).

Анализируя имеющиеся для изученных бактерий фенотипические дескрипторы, мы позволили себе отметить ряд несоответствий между генотипической классификацией и классификацией, основанной в большей степени на морфо-физиологичесских признаках. Однако учитывая рекомендации Международного комитета по согласованию подходов к систематике бактерий и собственный опыт, мы рекомендовали для описания в качестве номенклатурных видоз, только те организмы, у которых достаточно хорошо изучены фенотипические свойства.

ВЫВОДЫ

1. Впервые применены методы ДНК-ДНК гибридизации для исследования широкого спектра штаммов, видов ' и родов метанокисляющих бактерий. На основании этих результатов подтверждена таксономическая концепция Виттенбари, основанная на изучении морфо-физиологических свойств метанотрофов. Показано, что внутри родов большинство штаммов группируются в кластеры со статусом геновидов ( не менее 60-70 % гомологии ДНК). Это группирование в большинстве случаев коррелирует с фенотипическими дескрипторами и таким образом, совпадает с номенклатурными видами. Для рода Мегиу1оЪас1ег внутриродовые различия незначительны и должны расцениваться как внутривидовые. Штамм Ме4}гу1отопзз те^апхоа <Ш/1 занимает статус отдельного геновида.

2. Для простекобактерий впервые показано отсутствие гомологии ДНК между родами РгозШесот1сгоЬ:ш1п И Апса1отз.сгоЬ:ши. На основании

ДНК-ДНК гибридизации и морфо-физио логических особенностей ошсаны два новых вида Prosthecornicrobiuri mischustinii и P. consooiatum.

3. Среди представителей родов Stella и labrls не обнаружено гомологии ДНК. Три штамма рода Stella 142, 12П и 12В с неясным таксономическим положением отнесены к виду s.vacuoiata. Наличие газовых везикул у этих организмов продложено считать штаммоспецифичным признаком.

4. Для представителей рода Hyphomicrobium показано наличие четырех кластеров со статусом отдельных геновидов. Один из кластеров, состоящий из двух штаммов, совпадает с номенклатурным видом H.zavarsinii.'Кластер из трех штаммов Z-Э, X и Z-115 может быть представлен как номенклатурный вид. Два других кластера остаются в статусе отделных геновидов. К видовым фенотипическим дескрипторам следует относить тип денитрификации на метаноле и способность к образованию розеток.

По теме работы опубликованы следующие статьи:

1. Черных H.A., КриЕенко В.В. Генотипическая характеристика анаэробных неспорообразущих бактерий.// '• Молодые ученые и основные направления развития современной биологии. М. 1985: Ч.З.-С.225-229 ( Деп. в ВИНИТИ М°5272-85 ).

2 Кривенко В.В., Черных H.A., Захарова Е.В., Дуда В.И. Характеристика генотипических свойств некоторых анаэробных термофильных хемоорганотрофных бактерий. // Микробиология. Í987.-Т.56-С.855-859

3. Лысенко A.M., Гальченко В.Ф., Черных H.A. Таксономическое изучение облигатных метанотрофных бактерий методом ДНК-ДНК гибридизации.// Микробиология. - 1988.-Т.57.- 0. 816-822

4. Черных H.A., Васильева Л.В., Семенов A.M., Лысенко A.M. Степень ДНК-ДНК гомологии у простекобактерий рода Stella. // Извеестия АН СССР, сер. биол., т1988.- С. 776-780

5._ Chernykh H.A., Vedenina I .Ya. То the problem oí the genus Hyphomycrobim systematic at the species.// 2 Conf. on taxonomy and automatic identification of bacteria. Prague, CaehoSlovakia. 1987-P.56

6. Ciiernykh N.A., Vasilieva L.Y. Taxonomic investigation of the

pro3thecobaoteria with radial symmetry of by the DNA-DNA hybridisation. // 2 Conr. on taxonoray and automatic identification of bacteria. Prague, Czehoslovakia.-1987.-P.59

7. Черных H.A., Васильева Л.В., Гениятулина А.И., 'ЧемеэновА.М. Исследование ДНК-ДНК гибридизации новых итаммов рода Prosthecomicrobium.// Микробиология. -1990.- Т.59. - С.127-132

8. Веденина И.Я., Черных H.A., Лебединский A.B., Андреев Л.В. О корреляции признаков в роде Hyphomycrobium. // Микробиология. -1990.- Т.59.- С.895-902

Москва, 1993, ВНИИВСГЭ, Звенигородское ш., 5.