Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности распределения и молекулярная детекция бактерий рода Caulobacter озера Байкал

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Особенности распределения и молекулярная детекция бактерий рода Caulobacter озера Байкал"

На правах рукописи

Ковадло Анна Сергеевна

ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА САНЬ ОБА СТЕК ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.00,16 — экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИРКУТСК - 2006

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск)

Научны» руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор,

Дрюккер Валентин Валерьянович

доктор биологических наук, профессор,

Мучки на Елена Яковлевна

кандидат биологических наук, доцент,

Вятчина Ольга Федоровна

Институт биологии внутренних вод РАН (Борок)

Защита диссертации состоится 18 декабря 2006 г. в 14 час. на заседании Диссертационного совета Д. 212.074.07 при ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет, Байкальский музей им. профессора М. М, Кожова (ауд, 219).

Почтовый адрес: 644003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ, е-таШ <kkanatfgibio.isu.ru . тел/Факс: (3952)241-855.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского Государственного университета.

Автореферат разослан _£?ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. ^^•¿¿ц. е. С. Купчинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В связи с большим интересом современного общества к вопросам охраны окружающей среды, в настоящее время активно развивается такое научное направление исследований, как микробная экология. Многочисленные работы показывают огромную роль микроорганизмов биосферы в трансформации широкого спектра веществ. Поэтому, исследование микробного разнообразия и процессов, в которых участвуют те или иные микроорганизмы, является актуальной проблемой.

Исследованию таксономического состава культивируемого гетеротрофного микробиоценоза озера Байкал посвящено множество работ (Максимова, 1989; Дрюккер и соавт., 2000; Парфенова и соавт., 2006). На основе морфологических и молекулярно-генетических признаков гетеротрофные бактерии рода Caulobacter ранее были обнаружены в озере Байкал (Лаптева, 1990; Белькова и соавт,, 1996), Согласно данным Н, А, Лаптевой, этот род бактерий является одним из доминирующих в составе группы олигокарбофильных бактерий микробного сообщества озера.

H. А. Лаптева предположила, что бактерии Caulobacter занимают второе место после Pseudomonas по степени распространения и численности, и именно эти две бактериальные группы ответственны за минерализацию растворенного органического материала в водных местообитаниях, причем, бактерии Caulobacter особенно важны, когда концентрация питательных веществ и температура в среде обитания низки (Лаптева, 1987),

Caulobacter crescent us является модельным организмом в изучении регуляции клеточного цикла прокариот, секвенирован его полный геном (Ely et al., 1990; Jacobs et al-, 1999; Nierman et al., 2001; Crosson et al. 2004; Viollier et al., 2004). В то же время экологическим особенностям рода Caulobacter уделяется мало внимания (MacRae et al., 1991; Fenton et al., 1999).

Цель исследований состояла в изучении особенностей распространения бактерий рода Caulobacter в различных биотопах экосистемы озера Байкал и в разработке олигонуклеотидного зонда для детекции этого рода бактерий.

Основные задачи исследования:

I, Сравнить методы выделения и учета численности клеток бактерий рода Caulobacter в озере Байкал.

2. Исследовать вертикальное и сезонное распределение численности популяции бактерий Caulobacter в различных биотопах озера Байкал.

3. Выделить и идентифицировать штаммы представителей рода Caulobacter из проб воды и осадков озера Байкал с использованием эпифлуоресцентной, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

4. Разработать структуру олигонуклеотидного зонда и применить метод гибридизации для детекции бактерий, принадлежащих к роду Caulobacter.

Научная новизна п практическая значимость работы. Впервые было проведено исследование численности бактерий Caulobacter в воде и грунте литоральной части озера Байкал, в зонах влияния притоков озера и выявлена сезонная динамика их численности в пелагиали Байкала. Критически проанализирован метод десятикратных разведений учета численности бактерий рода Caulobacter. Впервые разработан олигонуклеотидный зонд для детекции данных прокариот методом FISH (флуоресцентной гибридизацией in situ). Методика детекции Caulobacter методом FISH может быть использована при проведении микробиологического мониторинга различных пресноводных экосистем и включена в лекционный и практический курс по экологическим специальностям высших учебных заведений.

Oci I о в н ы е за щ ища ем ые по ложен! 1я:

1. Выделение бактерий рода Caulobacter из различных биотопов озера Байкал, имеющих свои специфические особенности, наиболее эффективно на среде PYE (пептон — 0.2 %, дрожжевой экстракт -0.1 %, MgSO« х 7НгО - 0.02 %, агар -1.5 %, водопроводная вода) и воде озера Байкал с добавлением пептона в концентрации 0.01 %.

2. Для молекулярно-биологической детекции бактерий рода Caulobacter впервые разработан олигонуклеотидный зонд, имеющий структуру Су-3-5 '-CGGA AGAGGTATGTGGA АС-3

3. Наибольшее количество бактерий Caulobacter во все сезоны исследований установлено в придонном слое воды, в верхнем слое осадка мелководной литорали озера Байкал и в зоне смешения вод реки Селенги и озера Байкал, а также реки Баргузин - с водами Баргузинского залива.

Личный вклад соискателя. В основу диссертации положены исследования, выполненные лично автором в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН. Разработка структуры олигонуклеотидного зонда проведена совместно с м.н.с. Т. И. Трибой, измерение концентрации неорганического фосфата выполнила м.н.с. М. В. Сакирко.

Апробация результатов диссертации и публикации. Результаты исследований были представлены на Международном Байкальском микробиологическом симпозиуме IBSM-2003 «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» {Иркутск, 2003), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), 69—ом Лимнологическом симпозиуме в Японии (Ниигата, 2004), Четвертой Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции ((Научное творчество молодежи» (Анжеро-Судженск, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), Международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных

экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006). По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, литературного обзора, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения, списка литературы, включающего 146 источников, в том числе 35 отечественных и 111 на иностранных языках. В работе приводится 12 таблиц, 23 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подробное описание объекта исследования -бактерий рода Caulobacier, а именно: морфологические, культуральные характеристики и современную таксономию представителей данного рода. В данной главе рассматривается вопрос стратегий выживания бактерий Cauiobacter в олиготрофных средах обитания. В обзор литературы входит также описание особенностей озера Байкал как среды обитания для микроорганизмов и дается информация о таксономическом составе гетеротрофного микробного сообщества озера.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

В работе использовано 199 проб воды и донных осадков озера Байкал, отобранных из различных биотопов озера в различные сезоны 2003-2006 гг. Пробоотбор производили стандартными методами (Кузнецов и соавт., 1989). Природные образцы воды с разных глубин отбирали, используя батометры, а у дна - стерильными шприцами (аквалангисты). Осадки отбирали дночерпателем Петерсена и стерильными шприцами (с поверхности). Пробы помещали в стерильные стеклянные флаконы (объем 200 мл) и немедленно подвергали соответствующей обработке или хранили при температуре +4* С не более суток до начала исследований.

Выделение штаммов бактерий рода Cauiobacter осуществляли на различных, разработанных ранее агаризованных питательных средах: PYE, PYE с рибофлавином, РСа, ПДС, R2A (Poindexter, 1981).

Исследования морфологии клеток бактерий рода Cauiobacter, выделенных из озера Байкал, осуществляли с помощью светового микроскопа CARL ZEISS JENA (Германия), эпифлуоресцентного микроскопа Olympus Т041(Япония), сканирующего электронного микроскопа PHYLIPS SEM 525M и трансмиссионного электронного микроскопа LEO 906Е (Германия). Препараты бактериальных клеток для микроскопии готовили по общепринятым методикам (http://bama.ua.edu). Для световой микроскопии препараты бактериальных клеток контрастировали карболовым фуксином основным; в качестве красителя при флуоресцентной микроскопии применяли ДАФИ (4,6-диамино-2-фенил индол); 2% водный раствор уранилацетагта был использован для контрастирования препаратов при трансмиссионной электронной микроскопии;

для сканирующего электронного микроскопирования образцы напыляли золотом.

Флуоресцентную гибридизацию Ы Ши проводили при условиях реакций гибридизации основанных на протоколах, разработанных ранее (Аталп И а1., 1995). В работе были использованы следующие олигонуклеотидные зонды: САи СОвА АйА СОТАТСТСОА АС, АЬР 968 СОТАЛООТТСШСОСОТТ, ЕиВ 338 ССЮССТССССТАССАСТ. Зонды были мечены флуоресцентной меткой СУ-З. Синтез зондов произведен фирмой «Синтол» (г. Москва).

Для подсчета числа клеток Саи1оЬас1ег в образцах воды и осадков озера Байкал был использован метод десятикратных разведений (метод титра) (Беляев, 1968). Для расчета наиболее вероятного числа культивируемых клеток Саи!оЬас1ег в природных образцах, полученного методом титра, использовали таблицу Мак-Креди, разработанную на основании методов вариационной статистики. Для определения доверительного интервала использовали коэффициент ш, величина которого зависит от коэффициента разведений (К), условия значимости (Р) и числа засеянных пробирок. Значение коэффициента гп для К=10 и Рои использовали по таблице и вычисляли доверительный интервал, используя следующую формулу: №ш < М > N х т (Егоров, 1976).

Эксперимент по выявлению ассимиляции неорганического фосфата бактериями рода Саи\оЪаШг проводили в модифицированной среде НЮд (Ре1гепЬег§ е1 а1., 1996), Измерение оптической плотности бактериальной суспензии производили на ФЭК при длине волны 590 им.

Глава 3. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ II ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БАКТЕРИЙ

РОДА С А \JLOBA СТЕК В РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПАХ ОЗЕРА БАЙКАЛ

Распределение бактерий рода Саи\оЬас1ет в мелководной литоральной зоне Южной котловины озера Байкал (мыс «Березовый»). По нашим наблюдениям в литоральной части Южного Байкала бактерии рода Саи1оЬас(ег концентрируются в придонной зоне водной толщи. В весенний период наиболее благоприятные условия для развития стебельковых бактерий СагйоЪасыг, судя по их численности, находились в самой мелководной зоне (глубина - 1.5-1.7 м). По мере удаления от береговой линии численность Саи1оЬас(ег в придонной воде снижалась: 60 ООО кл/мл, 200 кл/мл, 50 кл/мл в 50, 290 и 740 м от берега, соответственно. В октябре мы наблюдали перераспределение популяции бактерий СаиЬЬааег из придонного слоя воды в верхний слой грунта. И вновь наблюдалась та же картина распределения, когда популяция была многочисленна у берега: 700 000 кл/мл в 50 м от берега, 130 000 кл/мл в 290 м от берега и 6 000 кл/мл в 740 м от берега. Так же, как и в октябре 2004 г., в октябре 2005 г. бактерии Саи1оЬас(ег предпочитали заселять верхний слой осадка, нежели придонный слой воды.

Пробы, отобранные аквалангистами из поверхностного слоя осадков стерильными шприцами, содержали частицы детрита и различные виды водорослей. Прямое микрос копирование показало, что клетки СаиЫхгаег избирательно прикрепляются к микроводорослям рода $сепеЛезтш зр. Был

поставлен - эксперимент - в течение 24 часов культивировали зеленые микроводоросли рода Scenedesmus sp. и выделенный из верхнего слоя фунта штамм Caulobacter sp. (№ 13). В результате проведенных наблюдений было установлено, что все клетки культуры Caulobacter sp. № 13 активно прикрепились как к живым, так и к отмирающим клеткам водорослей.

Распределение бактерий рода Caulobacter в зоне влняння крупных притоков озеря Байкал. Изучение распространения популяции бактерий Caulobacter в зоне влияния третьей по величине водного стока реки Баргузин проводили на основе проб воды, отобранных в устье реки Баргузин и в Баргузин с ком заливе в июне 2004 г. Наиболее вероятное число клеток Caulobacter в поверхностной пробе воды в устье составило 700 ООО кл/мл. Мы наблюдали уменьшение количества клеток данных микроорганизмов по мере удаления от устья реки Баргузин, В Баргузинском заливе на станции с глубиной 20 м количество клеток Caulobacter было на порядок меньше, чем в устье реки. В пробах воды на выходе из Баргузинского залива, где глубина составила 1000 м, мы наблюдали бактерии Caulobacter в количестве 25 кл/мл на поверхности воды, 6 кл/мл - на глубине 25 м и на глубине 1000 м бактерии Caulobacter не обнаружены.

Сопоставляя данные по пространственному распределению численности бактерий Caulobacter с физико-химическими параметрами вод Баргузинского залива, можно сделать вывод, что бактерии Caulobacter приурочены к высоким концентрациям взвешенных частиц. Гетеротрофные культивируемые микроорганизмы могут служить косвенным показателем наличия органического вещества, доступного для утилизации и метаболизма гетеротрофных микроорганизмов. Сравнение данных по численности гетеротрофных микроорганизмов, культивируемых на среде PYE, и числу клеток Caulobacter показало положительную корреляцию. На основании полученных результатов высокого уровня корреляции содержания бактерий Caulobacter и количества гетеротрофов можно заключить, что они сосредоточены в реке Баргузин и Баргузинском заливе в местах с повышенным содержанием биологически доступных органических субстратов и принимают активное участие в деструкции различных соединений.

Проведенные нами исследования в дельте и зоне влияния реки Селенги в июле 2004 показали также высокую численность бактерий Caulobacter с максимумом значений в воде устья протоки Харауз — 130 000 кл/мл (рис. 1). Распределение их в приустьевой части подчинялось определенной закономерности - наибольшие значения численности наблюдались на расстоянии до 9.5 км вглубь Байкала. Что касается вертикального распространения бактерий рода Caulobacter в этом уникальном биотопе озера Байкал, то они обнаруживались до глубины 15 м в прибрежной части дельты, а по направлению вглубь озера они регистрировались только в слое воды 0-10 м. Морфология бактерий рода Caulobacter, изолированных из зоны влияния реки Селенги, представлена на рис. 2.

эдосташмв ОТ VCTW* ПРОТОКИ XMhn

Рис, 1. Распределение популяции бактерий Саи!оЬас/ег в дельте и в 10-ти километровой зоне влияния реки Селенги.

Рис. 2. Морфологическое разнообразие бактерий Caulobacter в накопительной культуре, полученной на основе пробы, отобранной в 5 км от устья протоки Харауз. Трансмиссионная электронная микроскопия (Leo 906 Е).

Распределение бактерий рода Саи1оЬаШг в пела гнал и озера Байкал и сезонная динамика численности. Изучение сезонной динамики численности бактерий Саи1оЬааег было проведено в пелагнали Южного Байкала с февраля 2005 г. по июнь 2006 г. на центральной станции разреза Л иств я ика-Тан хо й. Пробы воды отбирались в зимний, весенний, летний и осенний периоды с поверхности и глубин 5, 10, 15,25, 50, 100, 150,250,500,750, 1000, 1200 и 1400 метров. В феврале Саи1оЬас!ег наблюдали в поверхностном слое воды и на глубинах 5 м, 15 м, 50 м, 250 м в количестве 6-130 кл/мл (рис. 3). В марте на глубинах 750 и 1200 м были найдены единичные'микроорганизмы, а от поверхности по всей толще воды до 50 м обнаружено значительные количества Саи1оЬас1ег с максимумом на 50-ти метровой глубине в количестве 1200 кл/мл. В мае мы не обнаружили бактерий Саи1оЬасыг во всей толще воды до. максимальных глубин. В июле их популяция , по результатам наших исследований обитала на глубинах 50 м, 250 м, 750 м и .1400 м с численностью ст 60 до 600 кл/мл. В сентябре количество Саи1оЬас1ег было самым высоким -мы находили стебельковые клетки Саи1оЬас1ег по: всей толще воды Байкала, кроме 10-25 м и 150-500 м, В этот сезон пик численности клеток приходился на 50 и 1000 м.

Таким образом, было обнаружено, что бактерии рода Саи1оЬас1ег предпочитают заселять относительно высокопродуктивные биотопы озера Байкал. В связи с этим, был поставлен эксперимент по выяснению жизнеспособности этих бактерий при различных концентрациях органических веществ. В результате его выявлено разделение байкальских штаммов Саи1оЬас1ег на группы по скорости роста на различных концентрациях пептона. Показано, что все штаммы (70 выделенных штаммов) Саи1оЬас1ег после 7 суток культивирования синтезирует биомассу при концентрации пептона 0.2 %; половине из них требуется-в 2 раза больше времени для роста в среде с пептоном в концентрации 0.05%. Поэтому, возможно," в высокопродуктивных зонах озера Байкал бактерии Саи1оЬас(ег за счет относительно высокой скорости роста клеток способны конкурировать с другими микроорганизмами и образуют высокую плотность популяции.

Анализ метода десятикратных разведений для-учета бактерий рода Саи1оЬас1ег в природных образцах. Прямая микроскопия проб воды, профильтрованных через поликарбонатные фильтры с диаметром лор 0.22 мкм, выявила различные морфологические формы существования Саи1оЬас(ег т $Ии. Было обнаружено, что данные организмы образуют «розеточные» скопления ■ при высокой плотности популяции в придонном слое воды литоральной зоны . озера Байкал (рис. 4.), а при невысокой численности в пелагнали клетки Саи1оЬас1ег не образуют таких скоплений. Это наблюдение позволило предположить, что существование бактерий рода Саи1оЬас1ег в виде скоплений должно оказывать влияние на результат, получаемый методом десятикратных разведений, одним из допущений которого является то, что клетки микроорганизмов распределяются в сериях разведений как

Рис. 3. Сезонная динамика численности культивируемых бактерий рода Caulobacter в пелагиали Южной котловины озера Байкал (центральная станция разреза Листвянка-Танхой).

отдельные единицы. Поэтому, был проведен эксперимент по влиянию образования скоплений бактерий Саи1оЬас1ег на результат учета методом десятикратных разведений. В эксперимент был взят штамм Саи!оЬас(ег № 83, образующий розеточный скопления, как и большинство штаммов исследуемого рода, и неидентифицированный штамм № 82, клетки которого, судя по микроскопическим наблюдениям, не склонны к образованию скоплений. Суспензии клеток титровали в жидкой питательной среде, подходящей для развития соответствующей культуры, а исходные суспензии высевали на агаризованные питательные среды для учета КОЕ (колонии образующие единицы). Согласно результатам эксперимента было выяснено, что клетки СаиЬЬасЫг неравномерно распределяются при десятикратных разведениях в отличие от штамма Ха 82. У бактерий рода Саи\оЬааег штамма № 83 количество КОЕ было 0, а количество клеток в исходной суспензии по таблице Мак Креди оказалось 200 кл/мл. У штамма № 82, который в отличие от штамма Саи1оЬас!ег, не имеет прикрепительного материала и свойства адгезии, количество КОЕ составило 1200 кл/мл, а количество клеток в исходной суспензии, учитываемое по результатам десятикратных разведений по таблице Мак Креди, оказалось 1400 кл/мл при доверительном интервале 368 <1400< 5320. Таким образом, в результате исследования численности бактерий рода СаиЬЬааег методом титра получается не учитываемая ошибка расчета при условии, если клетки Саи1оЬас!ег образуют скопления.

Рис. 4. Caulobacter sp. in sittt. Организмы, осажденные на поликарбонатный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Источник — вода, отобранная из придонного слоя литоральной зоны озера Байкал. Слева-эпифлуоресцентная микроскопия, справа — сканирующая электронная микроскопия (шкала 10 мкм).

Ассимиляция и накопление неорганического фосфата бактериями рода Caulobacter. При исследовании морфологии бактерий рода Caulobacter озера Байкал с помощью ТЭМ (трансмиссионной электронной микроскопии) было обнаружено наличие гранул полифосфата внутри клеток. Для эксперимента по изучению особенностей метаболизма накопления фосфата был выбран штамм Caulobacter sp. № 82, выделенный с глубины 250 м центральной станции разреза Листвянка-Танхой, При культивировании на среде PYE, где источником фосфата является дрожжевой экстракт, этот штамм накапливал гранулы полифосфата. Штамм Caulobacter sp. N.з 82 был культивирован в модифицированной среде HiGg (Felzenberg, 1996), В качестве источника углерода была использована глюкоза в количестве 0,015 % (вес/объем), в качестве источника неорганического фосфора - 10 jiM NaH2P04 Клетки бактерий Caulobacter культивировали в аэробных условиях при температуре 20 °С в течении 96 часов. В процессе эксперимента проводили измерение оптической плотности клеточной суспензии, а также измеряли концентрацию Р04'" и исследовали морфологию клеток с помощью ТЭМ и эпифлуоресцентной микроскопии. Полученные результаты эксперимента (рис. 5) позволяют сделать ряд выводов и предположений. Caulobacter sp. штамм № 82 выявил наличие индуцибельной системы высокого сродства ассимиляции фосфата. Это было показано уменьшением концентрации экстрацеллюлярного фосфата. Накоплением гранул полифосфата указывало на наличие фермента полифосфаткиназы, активность которой ингибируется высокими концентрациями минерального фосфора.

0,7

0.« 0,5

5 0.4 *

§ 0,3

ол 0.1 о

0,613 К1Ц175

0.0'

/0.05

, 0 211 I

йМ1— I

г i

сутга

0,01

0,07

О,«

0.05

0,04 ;

0,03

0.01

0,01

о

.Га

fr •

ir

^s*

ч

Рис. 5, Изменение оптической плотности суспензии клеток бактерий Саи1оЬас(ег и концентрации РСЬ3". 0059о-оптическая плотность культуры, при длине волны 590 нм (а). Морфология клеток бактерий рода Саи1оЬас1ег штамма № 82 после инкубации в модифицированной среде HiGg. Черные электронно-плотные гранулы внутри клеток — полимеры фосфата (б).

Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГИБРИДИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ЗОНДА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ С A ULOBA CTER

Для расчета структуры зонда мы использовали последовательности бактериального гена 16S рРНК, принадлежащие к пяти родам семейства Caulobacteraceae: Asuccacciatis, Brevundimonas, Phenylobacterium, Nitrobacteria, Caulobacter. Названия видов, а также регистрационные номера соответствующих им последовательностей гена 16S рРНК приведены в таблице 12. Все последовательности выравнивали программой ChtstalW (Thompson, 1994).

Среди выровненных последовательностей выявили консервативные участки для видов рода Caulobacter, по которым представители данной группы отличаются от других родов семейства Caulobacteraceae. Эти участки мы выбрали в качестве претендентов на роль родоспецифичного зонда. Каждый из предполагаемых зондов проверили на комплементарность к последовательностям разных микроорганизмов по базам данных молекул ДНК с помощью программы BLAST (Altschul, 1990; Gish et al„ 1993). В результате этого получили список бактериальных последовательностей, которые демонстрировали большую степень сходства (до 100% совпадений в нуклеотидном составе) с анализируемыми нами фрагментами. Подавляющее большинство найденных последовательностей приходилось на не культивируемые не идентифицированные бактерии из природных образцов. Поэтому, перед нами встала задача - определить принадлежность данных последовательностей к роду Caulobacter. Для её решения мы воспользовались филогенетическим анализом. Молекулярное филогенетическое древо реконструировали методом объединения ближайших соседей (NJ-метод), реализованном в пакете филогенетических программ Phyl'ip (Felsenstein, 1989). Древо включало в себя последовательности гена 16S рРНК бактерий семейства Caulobacteraceae, Pseudomonadaceae и последовательности, взятые из результатов поиска программы BLAST (Altschul, 1990). Таким образом, все найденные бактериальные последовательности, которые гипотетически могли бы гибрид изо ваться с зондом, разделились на две группы: одна группа образовывала общий кластер с последовательностями видов рода Caulobacter, другая группа последовательностей лежала вне этого кластера, то есть не относилась к данному роду. Последовательности неидентифицированных организмов, группирующиеся в один кластер с родом Caulobacter, было принято считать представителями этого рода. Оставшиеся «некаулобактерные» последовательности снова выравнивали с предполагаемыми зондами и отбирали из всех анализируемых ол и гону клеоти до в те, которые показывали наибольшую родоспецифичность. Таким образом, нами был выбран фрагмент, располагающийся в районе 602-620 п.н. полной последовательности гена 16S рРНК Caulobacter crescentus (идентификационный номер последовательности -MS22S2)- имеющий структуру CGGAAGAGGTATGTGGAAC и названный

в

нами CAU, Разработанный зонд занимает позицию 328-347 нуклеотид в молекуле 16S рРНК по £ coli, т.е. комплементарен высокодоступному участку молекулы 16S рРНК (Behrens et al, 2003). Подбор оптимальных условий гибридизации разработанного зонда был проведен посредством флуоресцентной гибридизации с байкальскими штаммами рода Caulobacter, идентифицированными нами электронной микроскопией. В экспериментах варьировали концентрацию форм амида в гибридизационном буфере и концентрацию NaCl в отмывочном буфере. Также задавали различную экспозицию в реакции отмывания несвязавшегося зонда.

Для работы с зондом использовали Caulobacter sp. штамм Ks 9 и штамм № 83. Данные штаммы выявили положительный результат гибридизации с зондами EUB 338, ALF 963. Разные сочетания реактивов были использованы для проверки специфической гибридизации зонда CAU. При разных условиях гибридизации (20 % формамцд в гибридизационном буфере, 0.225 M NaCl в отмывочном буфере, 15 минут инкубации в отмывочном буфере - относительно строгие условия гибридизации, и при 0 % формамида в гибридизационном буфере, 0.225 M NaCl в отмывочном буфере, 15 минутах инкубации в отмывочном буфере - относительно нестрогие условия гибридизации), интенсивность флуоресценции визуально одинаковая. А при 35 % формам ида в гибридизационном буфере и при 0.225 M NaCl в отмывочном буфере был получен слабый сигнал гибридизации для штамма № 9. Гибридизацию штамма № 83 проводили при следующих строгих условиях реакции гибридизации: 35% формамида в гибридизационном буфере, 0,0 M NaCl в отмывочном буфере, отмывка 20 минут, и при 35% формамида в гибридизационном буфере, 0.225 M NaCl в отмывочном буфере, отмывка 30 минут (рис, б).

Для подбора условий гибридизации с отрицательным контролем был использован штамм факультативного метилотрофа бактерий рода Methylorhabdus multivorans, который имеет одно несовпадение с последовательностью зонда в целевом участке. Нестрогие условия гибридизации: 0 % формамида и 0.225 M NaCl в отмывочном буфере при 15 минутной инкубации в отмывочном буфере давали одинаковый результат гибридизации как у Methylorhabâus multi vorans, так и у Caulobacter. После подбора условий гибридизации удалось добиться отсутствия сигнала флуоресценции у Methylorhabdus multivorans при строгих условиях 35 % или 20 % формамида и S0 мМ NaCl при 15 минутах в отмывочном буфере и наличия сигнала у бактерий Caulobacter. Олигонуклеотидный зонд также бьш использован в накопительных культурах, где бактерии Caulobacter из-за истощения развивают гипертрофированные простеки. Таким образом, гибридизация, проведенная при 35 % формамида, S0 мМ NaCl и 15 минутной отмывке выявила клетки бактерий рода Caulobacter, выделенные из озера Байкал.

Рис. 6. Микрофотография байкальского штамма Саи!оЬас/ег Л® 83. Голубое окрашивание (слева) получено обработкой клеток флуоресцентным красителем ДА ФИ, красное окрашивание (справа) получено олигонуклеотидным зондом С А и, Условия гибридизации: 35% формамид в гибридизационном буфере, 0,0 М №С1 в отмывочном буфере, отмывка 20 минут (шкала -10 мкм).

Были проведены эксперименты по гибридизации зонда САи с бактериями, населяющими поверхностную пленку одной из проб воды озера Байкал. Как было уже описано ранее (Рот(1ехгег, 1964), в природных пробах воды в течение месяца культивирования в микробном сообществе развиваются бактерии, способные переживать недостаток питательных веществ. Среди таких микробов наблюдается и Саи1оЬас(ег, который к тому же развивает гипертрофированные простеки и становится видимым в световой микроскоп. Теоретически предполагается, что зонд должен детектировать только Саи1оЬас1ег. Данное предположение было подтверждено практически. Был выявлен сигнал флуоресцентной гибридизации зонда САи.

ВЫВОДЫ

1. За период исследований 2003-2006 гг. из воды и донных осадков различных биотопов озера Байкал на различных по составу питательных средах выделено 70 штаммов бактерий рода Саи!оЬас1ег.

2. Исследования сезонной динамики и вертикального распределения показали,

что наибольшая численность бактерий Саи1оЬас1ег наблюдается в верхнем слое осадка и придонном слое воды мелководной литорали Южного Байкала (до 700 ООО кл/мл), в устье реки Баргузин (700 000 кл/мл) и в зоне смешения байкальских вод и реки Селенги (130 000 кл/мл). В пелагнали озера количество клеток Саи1оЬас(ег не превышало значений порядка 103 кл/мл.

3. Установлена положительная корреляция между количеством культивируемых гетеротрофных микроорганизмов и наиболее вероятным числом культивируемых бактерий рода Саи1оЬаШг в мелководной литоральной части озера Байкал и в Баргузине ком заливе

4. Обнаружено образование «розеточных» скоплений in situ бактериями рода Caulobacter в воде придонной зоны при высокой плотности популяции. Экспериментально показана допускаемая ошибка подсчета их численности методом десятикратных разведений при исследовании образцов, где клетки Caulobacter имеют вид «розеточных» скоплений.

5. Сконструирован олигонуклеотидный зонд с последовательностью CGGAAGAGGTATGTGGAAC. Специфичность зонда проверена флуоресцентной гибридизацией на штаммах бактерий рода Caulobacter, выделенных из озера Байкал. Подобраны условия специфичной гибридизации зонда CAU с применением в качестве отрицательного контроля штамма метилотрофной бактерии Methylorhabdus multivorans с одним несовпадением в целевом участке: 35% или 20 % фор мам ид а в гибридизационном буфере при 46 °С*; 80 мМ NaCl и 15 минутах инкубации в отмывочном буфере при температуре 48 °С - условия специфичной гибридизации для CY-3 меченого зонда CAU при флуоресцентной гибридизации со штаммами бактерий рода Caulobacter.

6. Экспериментально показана способность бактерий рода Caulobacter ассимилировать минеральный фосфор микромолярной концентрации и запасать его в виде гранул неорганического полифосфата.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д.б.н., профессору, чл.-корр. РЭА В, В. Дркжкеру за постоянную помощь при выполнении работ, зав. лабораторией водной микробиологии к.б.н. В. В. Парфеновой, д.б.н., профессору Ю. А. Троценко, д.б.н. Н. В. Дорониной, к.б.н. Т. И. Земской, д.б.н. О. А. Тимошкину, к.б.н. Н. Л. Бельковой, к.б.н. О. И. Белых, к.б.н. И. В. Кпименкову, Т. И. Трибой, С. Ю. Максименко, И. В. Тихоновой, М, В, Сакирко, Т. Е. Перетолчиной, Е. Д. Бедошвили, А. П. Лопатину и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии Лимнологического института за поддержку и сотрудничество.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дрюккер В.В., Ковадло A.C., Парфенова В.В. К вопросу о выделении бактерий рода Caulobacter из воды озера Байкал // Международный Байкальский симпозиум по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», Иркутск, 2003, с. 37.

2. Ковадло A.C. Особенности распределения бактерий рода Caulobacter в воде и осадках озера Байкал // Материалы межрегиональной научно-практической конференции, «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 2004, с. 142-143.

3. Drucker V.V., Dutova N.V.,Terkina I.A., Pavlova O.N., Kovadlo A.S. The structure of microbial community and water quality of Lake Baikal // A bs tract Limnol Society of Japan, 69 Annual Meeting Niigata, 2004, p. 168,

4. Дрюккер В.В., Ковадло А.С., Сакирко M.В. Экологические факторы распределения и морфологическое разнообразие бактерий Caulobacter в озере Байкал // Четвертая Верещагинская байкальская конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений, Иркутск, 2005, 96-97.

5. Тимошкин О.А., Сутурин А.Н,, Кравцова Л.С., Ситникова Т.Я., Оболкина Л.А., Ковадло А.С. Исследование биогеохимических процессов в литорали озера Байкал: распределение гидробионтов, взаимосвязь с пелагиалью, мониторинг (ланшафтно-экологический подход) // Четвертая Верещагинская байкальская конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений, Иркутск, 2005,189-190.

6. Ковадло А.С., Дрюккер В.В. Распространение бактерий рода Caulobacter (Henrici and Johnson, 1935) в озере Байкал П Сибирский экологический журнал, 2006, № 5, с. 581-585.

7. Дрюккер В.В., Ковадло А.С. Природные условия обитания бактерий рода Caulobacter в экосистеме озера Байкал // География и природные ресурсы, 2006, № 2, с. 69-72.

8. Ковадло А. С. Бактерии рода Caulobacter в экосистеме озера Байкал // Материалы 10 всероссийской научно-практической конференции «Научное творчество молодежи», Анжеро-Судженск, 2006, с, 20,

9. Ковадло А.С. Пространственно-временное распределение популяций бактерий рода Caulobacter в пел аг нал и озера Байкал // Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии», Улан-Удэ, 2006, с, 51,

10. Дрюккер В.В., Дутова Н.В., Ковадло А.С., Косторнова Т.Я., Никулина И,Г. Вирусологический и бактериологический мониторинг экосистемы озера Байкал Н Материалы международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем», Ростов-на-Дону, 2006, с. 118-120.

11. Тимошкин О.А., Сутурин А.Н., Кравцова Л.С., Ситникова ТЯ., Оболкина Л. А., Ковадло А.С. Экология, биохимия и мониторинг каменистой литорали озера Байкал // 9-ый съезд Гидробиологического общества РАН, тезисы докладов, Тольятти, 2006, с.193.

Подписано к печати ] 6, ] 1.2006 г. Формат 60*84/16. Объем I пл. Тираж 100 экз. Заказ Кг 366. Издательство Института географии им. В Б. Сочавы СО РАН 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковадло, Анна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика и классификация бактерий рода

Caulobacter.

1.2. Адаптация бактерий рода Caulobacter к выживанию в олиготрофных средах обитания.

1.3. Распространение бактерий рода Caulobacter в природе.

1.4. Условия обитания микроорганизмов в озере Байкал.

1.5. Микробное сообщество озера Байкал.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Отбор проб.

2.2. Методы культивирования.

2.3. Подготовка препаратов для светового, эпифлуоресцентного, сканирующего и трансмиссионного электронного микроскопирования.

2.4. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.5. Метод титра для определения концентрации жизнеспособных бактерий рода Caulobacter.

2.6. Изучение особенностей метаболизма полифосфатнакопления у Caulobacter.

2.7. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БАКТЕРИЙ РОДА CAULOBACTER В РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПАХ ОЗЕРА

БАЙКАЛ.

3.1. Литоральная зона озера Байкал.

3.2. Зона влияния крупных притоков озера Байкал.

3.3. Эпилимнион озера.

3.4. Сезонная динамика численности Caulobacter в пелагиали Южного Байкала.

3.5. Анализ метода десятикратных разведений для учета бактерий рода Caulobacter в природном образце.

3.6. Ассимиляция и накопление неорганического фосфата бактериями рода Caulobacter.

Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГИБРИДИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ЗОНДА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ CAULOBACTER.

4.1. Разработка структуры олигонуклеотидного зонда.

4.2. Гибридизация зонда CAU со штаммами Caulobacter, выделенными из озера Байкал.

4.3. Гибридизация зонда CAU со штаммами отрицательного контроля.

4.4. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) зонда CAU с бактериями природных образцов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности распределения и молекулярная детекция бактерий рода Caulobacter озера Байкал"

В связи с большим интересом современного общества к вопросам охраны окружающей среды в настоящее время активно развивается такое направление научных исследований, как микробная экология. Многочисленные исследования показывают огромную роль микроорганизмов биосферы в трансформации широкого спектра веществ. Поэтому, исследование микробного разнообразия и процессов, в которых участвуют те или иные микроорганизмы является актуальной проблемой.

Объектом данной работы являются бактерии рода Caulobacter. Это грамотрицательные а-протеобактерии (Stackebrandt et al., 1988), хемоорганотрофы, аэробы. Несимметричное деление и уникальная морфология позволяет отнести их к сложноорганизованным организмам (Poindexter, 1981).

Бактерии рода Caulobacter распространены повсеместно (Беляев, 1967; Лаптева, 1977, 1987, 2003; Горленко, 1977; Васильева, 1980; Берестовская, 2006; Poindexter, 1981; Anast et al.; 1988). Их можно обнаружить как в Антарктике (Poglazova, 2001), так и в сооружениях для переработки сточных вод (MacRae et al., 1991) или в компосте (Pedro et al., 2001).

Высокое соотношение поверхности к объему, диморфный клеточный цикл, способность накапливать биополимеры и низкая скорость роста позволяют отнести бактерий рода Caulobacter к олиготрофным микроорганизмам, т.е. микроорганизмам, способным развиваться при потоке органических веществ в концентрации не более 1гС/л (Никитин, 2001).

По анализу компонентов, определяющих трофический статус водоема, было определено, что крупнейшее озеро мира Байкал - водоем олиготрофного типа (Вотинцев 1975; Мещерякова, 1975; Тарасова, 1984; Nakano, 2003). Его географическое положение, геологические, гидрологические и гидрохимические особенности определяют уникальность его флоры и фауны, и также высокую степень эндемизма. Caulobacter уже был обнаружен ранее в озере Байкал как один из доминирующих родов в составе группы олиготрофных бактерий озера (Лаптева, 1990), а также обнаружен по последовательности гена 16S рРНК (Белькова, 1996). Хотя публикаций, где сообщается об обнаружении Caulobacter в озере Байкал всего две из множества работ, посвященных исследованию таксономического состава микробиоценоза озера Байкал (Максимова, 1989; Парфенова, 2006), но как показывает мировая научная практика, малоизученный объект не означает редкий. Тем более, что исследование бактерий рода Caulobacter имеет как практическое, так и фундаментальное значение. В настоящее время Caulobacter - организм-модель для исследования регуляции клеточного цикла прокариот (Ely et al., 1990; Jacobs et al., 1999; Crosson et al., 2004; Viollier et al., 2004). Однако, исследованию Caulobacter в экологическом аспекте в настоящее время уделено немного внимания (MacRae et al., 1991; Fenton et al., 1999), в то время как экология данных микроорганизмов представляет большой интерес в связи с их олиготрофным образом жизни. Так как большая часть биосферы является олиготрофной, то и, соответственно, большая часть микроорганизмов биосферы - олиготрофы (Sheng et al., 2005).

Цель исследований состояла в изучении особенностей распространения бактерий рода Caulobacter в различных биотопах экосистемы озера Байкал и в разработке олигонуклеотидного зонда для детекции этого рода бактерий.

Основные задачи исследования:

1. Сравнить методы выделения и учета численности клеток бактерий рода Caulobacter в озере Байкал.

2. Исследовать вертикальное и сезонное распределение численности популяции бактерий Caulobacter в различных биотопах озера Байкал.

3. Выделить и идентифицировать штаммы представителей рода Caulobacter из проб воды и осадков озера Байкал с использованием эпифлуоресцентной, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.

4. Разработать структуру олигонуклеотидного зонда и применить метод гибридизации для детекции бактерий, принадлежащих к роду Caulobacter.

Научная новизна работы. Впервые было проведено исследование численности бактерий Caulobacter в воде и грунте литоральной части озера Байкал, в зонах влияния притоков озера и выявлена сезонная динамика их численности в пелагиали Байкала. Критически проанализирован метод десятикратных разведений учета численности бактерий рода Caulobacter. Впервые разработан олигонуклеотидный зонд для детекции данных прокариот методом FISH (флуоресцентной гибридизацией in situ).

Практическое значение. Методика детекции Caulobacter методом FISH может быть использована при проведении микробиологического мониторинга различных пресноводных экосистем и включена в лекционный и практический курс по экологическим специальностям высших учебных заведений.

Основные защищаемые положения:

1. Выделение бактерий рода Caulobacter из различных биотопов озера Байкал, имеющих свои специфические особенности, наиболее эффективно на среде PYE (пептон - 0.2 %, дрожжевой экстракт - 0.1 %, MgSC>4 х 7Н20 - 0.02 %, агар - 1.5 %, водопроводная вода) и воде озера Байкал с добавлением пептона в концентрации 0.01 %.

2. Для молекулярно-биологической детекции бактерий рода Caulobacter впервые разработан олигонуклеотидный зонд, имеющий структуру Су-3-5 '-CGGAAGAGGTATGTGGAAC-3

3. Наибольшее количество бактерий Caulobacter во все сезоны исследований установлено в придонном слое воды, в верхнем слое осадка мелководной литорали озера Байкал и в зоне смешения вод реки Селенги и озера Байкал, а также реки Баргузин - с водами Баргузинского залива.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на: Международном Байкальском микробиологическом симпозиуме IBSM-2003 «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск, 2003), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), 69 -ом Лимнологическом симпозиуме Японии (Ниигата, 2004), Четвертой Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Научное творчество молодежи» (Анжеро-Судженск, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), Международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах и 9 тезисов.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Ковадло, Анна Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. За период исследований 2003-2006 гг. из воды и донных осадков различных биотопов озера Байкал на различных по составу питательных средах выделено 70 штаммов бактерий рода Caulobacter.

2. Исследования сезонной динамики и вертикального распределения показали, что наибольшая численность бактерий Caulobacter наблюдается в верхнем слое осадка и придонном слое воды мелководной литорали Южного Байкала (до 700 000 кл/мл), в устье реки Баргузин (700 000 кл/мл) и в зоне смешения байкальских вод и реки Селенги (130 000 кл/мл). В пелагиали озера количество клеток Caulobacter не превышало значений порядка 10 кл/мл.

3. Установлена положительная корреляция между количеством культивируемых гетеротрофных микроорганизмов и наиболее вероятным числом культивируемых бактерий рода Caulobacter в мелководной литоральной части озера Байкал и в Баргузинском заливе .

4. Обнаружено образование «розеточных» скоплений in situ бактериями рода Caulobacter в воде придонной зоны при высокой плотности популяции. Экспериментально показана допускаемая ошибка подсчета их численности методом десятикратных разведений при исследовании образцов, где клетки Caulobacter имеют вид «розеточных» скоплений.

5. Сконструирован олигонуклеотидный зонд с последовательностью CGGAAGAGGTATGTGGAAC. Специфичность зонда проверена флуоресцентной гибридизацией на штаммах бактерий рода Caulobacter, выделенных из озера Байкал. Подобраны условия специфичной гибридизации зонда CAU с применением в качестве отрицательного контроля штамма метилотрофной бактерии Methylorhabdus multivorans с одним несовпадением в целевом участке: 35% или 20 % формамида в гибридизационном буфере при 46 °С'; 80 мМ NaCl и 15 минутах инкубации в отмывочном буфере при температуре 48 °С - условия специфичной гибридизации для CY-3 меченого зонда CAU при флуоресцентной гибридизации со штаммами бактерий рода Caulobacter. 6. Экспериментально показана способность бактерий рода Caulobacter ассимилировать минеральный фосфор микромолярной концентрации и запасать его в виде гранул неорганического полифосфата.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д.б.н., профессору, чл.-корр. РЭА В. В. Дрюккеру за постоянную помощь при выполнении работы, зав. лабораторией водной микробиологии к.б.н. В. В. Парфеновой, д.б.н., профессору Ю. А. Троценко, д.б.н. Н. В. Дорониной, к.б.н. Т. И. Земской, д.б.н. О. А. Тимошкину, к.б.н. Н. J1. Бельковой, к.б.н. О. И. Белых, к.б.н. И. В. Клименкову, Т. И. Трибой, С. Ю. Максименко, И. В. Тихоновой, М. В. Сакирко, Т. Е. Перетолчиной, Е. Д. Бедошвили, А. П. Лопатину и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии Лимнологического института за поддержку и сотрудничество.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований особенностей распределения, экологии, биологии и молекулярной детекции бактерий рода Caulobacter в экосистеме озера Байкал, нами были получены новые результаты. Так, в летний период установлена приуроченность бактерий рода Caulobacter к высокопродуктивным зонам акватории озера - верхней границе донных осадков и придонному слою воды в литоральной части озера (станция «Мыс Березовый»), а также в зоне смешения вод главных притоков озера Байкал (реки Селенга и Баргузин). Экспериментально выявлено разделение байкальских штаммов Caulobacter на группы по скорости роста на различных концентрациях пептона. Было установлено, что все семьдесят выделенных из озера Байкал штаммов бактерий рода Caulobacter, после семи суток культивирования синтезирует биомассу при концентрации пептона 0.2 %. Половине из этих штаммов требуется в 2 раза больше времени для роста в среде с пептоном в концентрации 0.05%. Исходя из этих результатов можно предположить, что в высокопродуктивных зонах озера Байкал бактерии Caulobacter за счет относительно высокой скорости роста клеток способны конкурировать с другими микроорганизмами и образовывать высокую плотность популяции.

В наших исследованиях также изучен вопрос о возможном участии этих микроорганизмов в регуляции уровня одного из биогенных элементов -фосфора. Целью проведенного эксперимента было исследование особенностей метаболизма фосфатнакопления у байкальских штаммов Caulobacter. На электронно-микроскопических снимках, полученных при изучении накопительных и чистых культур Caulobacter, в их клетках были обнаружены гранулы полифосфатов. На сегодняшний день известно, что полифосфаты способны синтезировать бактерии с геном полифосфаткиназы. На примере бактерий Acinetobacter baumannii показано, что фосфат ингибирует транскрипцию гена полифосфаткиназы. Таким образом, нами была смоделирована среда с дефицитом фосфора и азота для изучения экологических особенностей жизнедеятельности Caulobacter, выделенных из воды и грунтов оз. Байкал. В качестве источника углерода использовалась глюкоза в концентрации 0.015 % (вес/объем) и NaH2P04 с концентрацией порядка 10 |iM. Проведенные экспериментальные исследования выявили способность байкальского штамма Caulobacter № 82 ассимилировать и накапливать минеральный фосфор. Также при помощи трансмиссионной электронной микроскопии нам удалось выявить гранулы полифосфатов внутри клеток байкальского штамма Caulobacter.

Полученные результаты по распределению и местообитанию бактерий Caulobacter в различных биотопах озера Байкал позволили провести исследования по непосредственному фильтрованию проб воды, взятых из этих биотопов, заселенных данными микроорганизмами, для изучения их морфологии in situ. Оказалось, что в придонной зоне литорали бактерии Caulobacter объединяются в «розеточные» скопления. Метод десятикратных разведений, использованный нами и другими исследователями для определения численности Caulobacter, основан на допущении, что бактериальные клетки распределяются как независимые отдельные единицы. Логично было предположить, что если бактерии Caulobacter в природе слипаются в «розетки», то не соблюдается данное допущение и в конечном итоге получаются результаты подсчета численности, не соответствующие истине. Для выяснения влияния «розеткообразования» на конечный результат подсчета Caulobacter, нами был выполнен эксперимент, в котором использовался штамм Caulobacter, выделенный из озера Байкал, и штамм, у которого клетки, судя по микроскопическим наблюдениям, не склонны к слипанию. Сопоставляя количество КОЕ из исходной суспензии и результатов, полученных при пересчете из таблицы Мак-Креди, было показано равномерное распределение «нелипкого» штамма бактерий и соответствие значений КОЕ и доверительного интервала. У бактерий Caulobacter, образующих «розетки» было установлено неравномерное распределение клеток и несоответствие значений КОЕ и доверительного интервала при использовании метода десятикратных разведений. Следовательно, учет бактерий Caulobacter в местах, где они имеют высокую плотность и собираются в «розетки», методом десятикратных разведений дает неучитываемую ошибку. Таким образом, возникла необходимость разработки модификации подсчета численности бактерий Caulobacter, что в настоящей работе было сделано на молекулярно-биологическом уровне.

На сегодняшний день самым современным методом подсчета бактерий различных филогенетических, физиологических и других групп бактерий является FlSH-метод. Для поиска консервативных участков гена 16S рРНК у Caulobacter были использованы последовательности, принадлежащие представителям Caulobacter по результатам филогенетического анализа. Согласно консенсусной модели доступа CY-3 меченых зондов для прокариот, целевой участок зонда Caulobacter приходится на один из самых высокодоступных районов вторичной структуры молекулы 16S рРНК, т.е. участок молекулы, который не экранирован рибосомными протеинами и структурой молекулы 16S рРНК. Подбор условий гибридизации зонда был осуществлен на байкальских штаммах бактерий Caulobacter, выделенных нами в данной работе. При проведении гибридизации мы варьировали концентрацию формамида, NaCl и время экспозиции в отмывочном буфере. Уровень гибридизации оценивали визуально по интенсивности свечения флуоресцентной метки олигонуклеотидного зонда. При гибридизации в условиях относительно нестрогой специфичности зонд, специфичный для Caulobacter, давал визуально одинаковый сигнал флуоресцентной гибридизации. Даже при более строгих условиях, таких как 35 % формамида, 80 мМ NaCl и 30 минутная инкубация в отмывочном буфере, а также 35 % формамида, бессолевой отмывочный буфер и 20 минутная инкубация в отмывочном буфере был получен сигнал гибридизации зонда CAU при реакции с участием байкальского штаммам Caulobacter № 83. Для подбора условий гибридизации с отрицательным контролем был использован штамм факультативного метилотрофной бактерии рода Methylorhabdus multivorans

VKM B-20307 (АТСС 51890, ACCESSION AF004845), у которого нуклеотидная последовательность целевого участка зонда CAU имеет одно несовпадение с нуклеотидной последовательностью зонда CAU. Нестрогие условия гибридизации: 0 % формамида и 0.225 М NaCl в отмывочном буфере при 15 минутной инкубации в отмывочном буфере давали одинаковый результат гибридизации как у Methylorhabdus multivorans, так и у Caulobacter. Из набора условий гибридизации удалось добиться отсутствия сигнала у Methylorhabdus multivorans при строгих условиях гибридизации: 35 % или 20 % формамида в гибридизационном буфере и 80 мМ NaCl в отмывочном буфере при 15 минутах в отмывочном буфере и наличия сигнала у бактерий Caulobacter sp. (штамм № 9). Олигонуклеотидный зонд также был использован в накопительных культурах, где бактерии Caulobacter из-за истощения развивают гипертрофированные простеки. Гибридизация, проведенная при 35 % формамида, 80 мМ NaCl и 15 минутной инкубации в отмывочном буфере выявила клетки простековые бактерий рода Caulobacter, выделенные из озера Байкал.

Таким образом, проведенные исследования установили ряд экологических факторов, оказывающих влияние на количественное развитие и распределение бактерий рода Caulobacter в различных биотопах экосистемы озера Байкал: высокая концентрация кислорода, приуроченность к водам, содержащим значительное количество взвешенных частиц и органического вещества, низкое содержание биогенных элементов. В виду высокой физиологической пластичности и различных форм существования - одиночные клетки, «розеточные» скопления, способность в неблагоприятных условиях образовывать простеки и накапливать минеральный фосфор, симбиоз с водорослями можно предполагать, что бактерии рода Caulobacter играют существенную роль в функционировании микробиального сообщества озера Байкал.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковадло, Анна Сергеевна, Иркутск

1. Арискина, Е. В. Гетерогенность вида Caulobacter bacterioides по результатам ДНК-ДНК гибридизации Текст. / Е. В. Арискина // Микробиология. 1995. - Т. 64. N. 4. - С. 503-506.

2. Белькова, Н. Л. Изучение состава водного бактериального сообщества озера Байкал методом гибридизации in situ Текст. / Н. Л. Белькова, В. В. Дрюккер, С. X. Хонг, Т. С. Ан // Микробиология. 2003. -Т. 72. - С. 282-283.

3. Беляев, С. С. Распространение группы Caulobacter в водохранилищах Волго-Дона Текст. / С. С. Беляев // Микробиология.- 1967. Т. 36. - С. 157162.

4. Беляев, С. С. О методах учета и выделения Caulobacter Текст. / С. С. Беляев // Микробиология. 1968. - Т. 37. - С. 925-929.

5. Беляев, С. С. Биология бактерий рода Caulobacter Текст. / С. С. Беляев // Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 1870. - 14 с.

6. Берестовская, Ю. Ю. Психротолерантный Caulobacter из почвы заполярной тундры России Текст. / Ю. Ю. Берестовская, А. М. Лысенко, Т. П. Турова, Л. В. Васильева // Микробиология. 2006. - Т. 75. N. 3. - С. 377382.

7. Васильева, Л. В. Морфологическое группирование простекобактерий Текст. / Л. В. Васильева, // Изв. Акад. Наук. Серия биологическая. 1980. -N. 5.- С.719-737.

8. Вотинцев, К. К. Биоэнергетическая трансформация и баланс органического вещества в пелагиали Байкала Текст. / К. К. Вотинцев // «Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах»: сб. науч. тр. -Новосибирск, 1975. С. 48-54.

9. Вотинцев, К. К. Круговорот органического вещества в оз. Байкал Текст. / К. К. Вотинцев, А. И. Мещерекова, Г. И. Поповская Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1975. -С. 187.

10. Горленко, В. М Экология водных микроорганизмов Текст. / В. М. Горленко, Г. А. Дубинина, С. И. Кузнецов Москва: Наука, 1977. - 289 с.

11. Громов, Б. В. Бактерии рода Caulobacter, сопутствующие водорослям Текст. / Б. В. Громов // Микробиология. -1964.- Т. 33, № 2. С. 298-305.

12. Дымшиц, Г. М. Нерадиоактивно меченые олиго -и полинуклеотидные зонды инструмент изучения структуры генома и диагностики Текст. / Г. М. Дымшиц // Соровский образовательный журнал. - 2001.- Т. 7. N. 9. - С. 30-37.

13. Дрюккер, В. В. Микробиологические исследования Текст. / В. В. Дрюккер, А. И. Штевнева // «Путь познания Байкала»: сб. науч. тр. -Новосибирск, 1987.-С. 156-163.

14. Егоров, Н. С. Практикум по микробиологии Текст. / Н. С. Егоров.- М., Изд-во Моск. Ун-та, 1976. 307 е.- 13600 экз.

15. Ковадло, А. С. Экологические факторы распределения и морфологическое разнообразие бактерий Caulobacter в озере Байкал Текст.

16. А. С. Ковадло, В. В. Дрюккер, М. В. Сакирко // Четвертая Верещагинская байкальская конференция: сб. науч. тр. Иркутск, 2005, - С. 96-97.

17. Красильников, Н. А. О распространении Caulobacter в некоторых почвах Текст. / Н. А. Красильников, С. С. Беляев // Микробиология. 1967. -Т.36.-С. 1083-1086.

18. Кузнецов, С. И. Методы изучения водных микроорганизмов Текст. / С. И. Кузнецов, Г. А. Дубинина Москва: Наука, 1989. - 288 с.

19. Кулаев, И. С. Неорганические полифосфаты и их роль на разных этапах клеточной эволюции Текст. / И. С. Кулаев // Соровский образовательный журнал. -1996.- №2. С. 28-35.

20. Лаптева, Н. А. Видовой состав гетеротрофных бактерий Рыбинского водохранилища Текст. / Н. А. Лаптева // Микробиология. 1977. - Т.46. - С. 570-576.

21. Лаптева, Н. А. Экологические особенности распределения бактерий рода Caulobacter в пресных водоемах Текст. / Н. А. Лаптева // Микробиология. 1987. - Т.56. - С. 677-683.

22. Лаптева, Н. А. Видовая характеристика гетеротрофных бактерий в озере Байкал Текст. / Н. А. Лаптева // Микробиология. 1990.- Т.59. - С. 499-505.

23. Ленгелер, Й. Современная микробиология: Прокариоты. Текст.: [пер. с англ.] / И. Ленгелер, Г. Древе, Г. Шлегель; под редакцией А. И. Нетрусова, Т. С. Ильиной -М.: Мир, 2005.- 656 е.: ил., 16 с. цв. ил.-ISBN 5-03-003707-1

24. Максимова, Э. А. Микробиология вод Байкала Текст. / Э. А. Максимова, В. Н. Максимов Иркутск: Изд-во Иркутского университета, 1989. 168с.

25. Мещерякова, А. И. Первичная продукция Байкала Текст. / А. И. Мещерякова // «Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах»: сб. науч. тр. Новосибирск, 1975. - С. 10-16

26. Никитин, Д. И. Особенности физиологии стебельковых бактерий рода Caulobacter Текст./ Д. И. Никитин, И. А. Питрюк // Микробиология. -1983. -Т. 6.-С. 293-299.

27. Никитин, Д. И. Современные представления о бактериальной олиготрофии Текст. / Д. И. Никитин // Перспективы развития почвенной микробиологии: сб. научн. тр.-Москва. 2001 - С. 39.

28. Определитель бактерий Берджи Текст.: в 2 т. / [Р. Беркли и др.] : [пер. с англ.] / под ред. акад. РАН Г. А. Заварзина. 9-е изд. - М.: Мир, 1997.- 26 см.-10000 экз. - ISBN 5-03-003110-3

29. Павлова, О. Н. Особенности распространения бактерий рода Pseudomonas в озере Байкал Текст. / О. Н. Павлова, В. В. Дрюккер, Т. Я. Косторнова, И. Г. Никулина // Сибирский экологический журнал. 2003. -Т. З.-С. 267-272.

30. Парфенова, В. В. Присклоновые процессы и распределение микроорганизмов в озере Байкал Текст. / М. Н. Шимараев, Т. Я. Косторнова, А. А. Левин, В. В. Дрюккер // Сибирский экологический журнал. 1999. -N. 6 - С. 613-618.

31. Тарасова, Е. Н. Взвешенное вещество и доля взвешенного органического углерода в водах Байкала Текст. / Е. Н. Тарасова, К. К. Вотинцев // «Взаимодействие между водой и седиментами в озерах и водохранилищах» сб. науч. тр. Новосибирск, 1984. - С. 61-72.

32. Altschul S. F. Basic local alignment search tool Text. / S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, D. J. Lipman // J. Mol. Biol.- 1990.-V. 215.-P. 403410.

33. Amann, R. I. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation Text. / R. I. Amann, W. Ludwig, K. Schleifer // Microbiol. Rev. .-1995.- V. 59. P. 143-169.

34. Ausmees, N. Intermediate filament-like cytoskeleyon of Caulobacter crescentus Text. / N. Ausmees // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V. 11. P. 152-158.

35. Bel'kova, N. L. Microbial Biodiversity in the Water of Lake Baikal Text. / N. L. Bel'kova, V. V. Parfenova, T. Ya. Kostornova, L. Ya. Denisova, E. F. Zaichikov // Microbiology. 2003. - V. 72. - P. 203-212.

36. Behrens, S. In Situ Accessibility of Small Subunit rRNA of Members of the Domains Bacteria, Archaea, and Eucarya to Cy3-Labeled Oligonucleotide Probes Text. / Applied and Environmental Microbiology.- 2003,- V. 69. P. 1748-1758.

37. Benyehuda, G. Metal resistance among aerobic chemoheterotrophic bacteria from the deep terrestrial subsurface Text. / G. Benyehuda, J. Coombs, P. L.Ward, D. Balkwill, T. Barkey // Can. J. Microbiol. 2004.-V. 49. - P. 151-156.

38. Botero, L. M. Characterization of Two Inducible Phosphate Transport Systems in Rhizobium tropici Text. / L. M. Botero, S. T. Alniemi, T. R.

39. Mcdermott // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - V. 66, № 1. - P. 15-22.

40. Bodenmiller, D. Development of Surface Adhesion in Caulobacter crescentus Text. / D. Bodenmiller, T. Evelyn, Y. V. Brun // Journal of bacteriology. 2004,-V. 186. - P. 1438-1447.

41. Cole, J. L. The HfaB and HfaD adhesion proteins of Caulobacter crescentus are localized in the stalk Text. / J. L. Cole, G. G. Hardy, D. Bodenmiller, E. Toh, A. Hinz,Y. V. Brun // Mol. Microbiol. 2003. - V. 49. - P. 1671-1683.

42. Conan, P. Relationship between phytoplankton efficiency and the proportion of bacterial production in the Mediterranean sea Text. / P. Conan, C. Turley, E. Stutt, M. Pujo-Pay, F. Van Wambeke // Aquat. Microb. Ecol. 1999. - V. 17. - P. 131-144.

43. Crimes, W. B. Electronic resourse. / W. B. Crymes, B. Ely // The Caulobacter Streak Protocol-2001. http://www.cosm.sc.edu/caulobacter/tech/html

44. Crosson, S A genetic oscillator and the regulation of cell cycle progression in Caulobacter crescentus Text. / S. Crosson, H. McAdams, L. Shapiro // Cell Cycle. 2004. - V. 3,№10. - P. 55-57.

45. Doucette, G. J. Interaction between bacteria and harmful algae: a review Text. / G. J. Doucette // Nat. Toxins. 1995. - V. 3, №. 2. - P. 65-74

46. Ely, B. Circularity of the Caulobacter crescentus Chromosome Determined by Pulsed-Field Gel Electrophoresis Text. / B. Ely, T.W. Ely, C.J. Gerardot, A. Dingward // Journal of Bacteriology. 1990. - V. 172. - P. 1262-1266.

47. Ely, B. DNA sequence of the 3' end of the Caulobacter crescentus 16S rRNA gene Text. / B. Ely, //Nucleic Acids Res. 1992. - V. 25. - P. 1423.

48. England, J. C. Cell cycle control of cell morphogenesis in Caulobacter Text. / J. C. England, J. W. Gober // Current opinion in Microbiology. 2001. -V. 4.-P. 674-680.

49. Felsenstein, J. PHYLIP Phylogeny Inference Package (Version 3.2) Text. / J. Felsenstein // Cladistics. - 1989. -V. 5. - P. 164-166.

50. Fenton, C. D. Caulobacter in New Zealand. The isolation and characterisation of Caulobacter species from Manawatu Systems Electronic resourse. / C. D. Fenton // Nexus research group. 1994. - http://www. nexusresearchgroup.com/microbiology/caul 1994.htm.

51. Fenton, M. The isolation and characterization of New Zealand Caulobacter species / M. Fenton, C. D. Fenton, K. Stewart // Nexus research group. 1999. -http://www. nexusresearchgroup-research publication.htm

52. Jacobs, C. Cell cycle-dependent polar localization of an essential bacterial histidine kinase that controls DNA replication and cell division Text. / C. Jacobs, I. J. Domian, J. R. Maddock, L. Shapiro // Cell. 1999. - V. 97, № 1. - P. 111120.

53. Jones, H. C. Ultrastructural Study of Crossbands Occurring in the Stalks of Caulobacter crescentus Text. / H. C. Jones, N. D. Schmidt, M. Jean // Journal of Bacteriology. 1973. - V. 116,№. 1 - P. 466-470.

54. Jenal, U. The Caulobacter cell cycle: timing, spatial organization and checkpoints Text. / U. Jenal, C. Stephens // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - V. 5. -P. 558-563.

55. Garrity, G. M. Taxonomic outline of the procariotes Bergey's manual of systematic bacteriology Electronic resource./ G. M. Garrity, Bell J. A., Lilburn T. G.I12004. http://141.150.157.80/bergeysoutline/main.htm

56. Gavigan, J. Regulation of polyphosphate kinase gene expression in Acinetobacter baumannii 252 Text. / J. Gavigan, M. M. Leonard, D. W. Dobson // Microbiology. 1999. - V. 145. - P. 2931-2937.

57. Gish, W. Identification of protein coding regions by database similarity search Text. / W. Gish, D. J. States // Nature Genet. 1993. - V. 3. - P. 266-272.

58. Glockner, F. 0. Bacterioplancton composition of lakes and oceans: a first comparision based on fluorescence in situ Hybridization Text. / F. O. Glockner, В. M. Fuchs, R. Amann // Applied and Environmental Microbiology. 1999. -V.65,№ 8.-P. 3721-3726.

59. Gonin, M. Regulation of stalk elongation by phosphate in Caulobacter crescentus Text. / M. Gonin, E. Quardocus, D. O'Donnol, J. Maddok, Y. V. Brun // Journal of Bacteriology. 2000. - V. 182,№ 2. - P. 337-347.

60. Grula, E. A. Intracellular structures in Caulobacter vibrioides Text. / E. A. Grula, R. H. Weaver, O. F. Edwards // Journal of Bacteriology, bacteriology. -1954.-V. 68.-P. 498-505.

61. Grula, E. A. Studies on strain of Caulobacter from water 11. Nutrition, with implications for cytology Text. / E. A.Grula, R. H. Weaver, O. F. Edwards // Journal of Bacteriology. 1954. -V. 68. - P. 201-206.

62. Guerrini, F. Bacterial-algal interactions in polysaccharide productions Text. / F.Guerrini, A. Mazzotti, L. Boni, R. Pistocchi // Aquat. Microb. Ecol. -1998.-V. 15.-P. 247-253.

63. Haars, E. G. Stalk Formation and Its Inhibition in Caulobacter crescentus Text. / E. G. Haars, J. M. Schmidt // Journal of bacteriology. 1974. - V. 120. № 3.-P. 1409-1416.

64. Henrici, A. T. Studies on Fresh Water Bacteria. II. Stalked Bacteria, a New Order of Schizorayceter Text. / A. T. Henrici, Johnson D. E. // Journal of Bacteriology. 1935. - V. 30. - P. 61-93.

65. Houwink, A. L. Electron microscopial observations on bacterial cytology.II A study on flagellation. Text. / A. L. Houwink, W. van Iterson // Biochim. Biophys. Acta. 1950. -V. 5. - P. 10-44.

66. Hu, P.Whole-Genome Transcriptional Analysis of Heavy Metal Stresses in Caulobacter crescentus Text. / P. Hu, L. Eoin, Y. Suzuki, H. H. McAdams, G.L. Andersen // Journal of Bacteriology. 2005. - V. 187,№ 24. - P. 8437-8449.

67. Chromosome replication in Caulobacter crescentus growing in a nutrient broth Text. / H. Iba, A. Fukuda, Y. Okada// J Bacteriol. -1977. V. 129. - P. 1192-7.

68. Katano, T. Abundance, growth and grazing loss rates of picophytoplankton in Barguzin Bay, Lake Baikal Text. / T. Katano, S. Nakano, H. Ueno, O. Mitamura, K. Anbutsu, M. Kihira, Y. Satoh, V. Drucker, M. Sugiyama // Aquatic Ecology. -2005.

69. Koch, A. L. Microbial Physiology and Ecology of Slow Growth Text. / A. L. Koch // Microbiology and molecular biology reviews. 1997. - V. 61,№ 3.- P. 305-318.

70. MacRae, J. D. Characterization of Caulobacter isolated from wastewater treatment systems Text. / J. D. MacRae, J. Smit // Applied and environmental microbiology. 1991. - V. 57,№3. - P. 751-758.

71. Macur, R. E. Microbial populations associated with the reduction and enhanced mobilization of arsenic in mine tailings Text. / R. E. Macur, J. T. Wheeler , T. R. McDermott, W. P. Inskeep // Environ. Sci. Technol. 2001. - V. 35. N. 18.-P. 3676-3682.

72. Margolin, W. Bacterial shape: concave coiled coils curve Caulobacter dispatch Text. / W. Margolin // Current biology. 2004. - V. 14. - P. 242-244.

73. Mannisto, M. K. Diversity of chlorophenol-degrading bacteria isolated from contaminated boreal groundwater Text. / M. K. Mannisto, M. A. Tiirola, M. S. Salkinoja-Salonen, M. S. Kulomaa, J. A. Puhakka // Arch. Microbiol. 1999. - V. 171.-P. 189-197.

74. Moore, R. L. Deoxyribonucleic acid homology among the caulobacters Text. / R. L. Moore, J. Schmidt, J. S. Poindexter, J.T. Staley // Int. J. Syst. Bacteriol. 1978. - V. 28. - P. 349-353.

75. Neugebauer, J.F. ExbBD-Dependent Transport of Maltodextrins through the Novel MalA Protein across the Outer Membrane of Caulobacter crescentus Text. / J. F. Neugebauer // Journal of Bacteriology. 2005. - V. 187,№ 24. - P. 83008311.

76. Nierman, W. C. Complete genome sequence of Caulobacter crescentus Text. / W. C. Nierman, Т. V. Feldblyum, M. T. Laub, 1. T. Paulsen, К. E. Nelson, J. A.

77. O'Connell, M. A. Purification and characterization of fatty acid beta-oxidation enzymes from Caulobacter crescentus Text. / M. A. O'Connell, G. Orr, L. Shapiro // J Bacteriol. 1990. - V.172. - P. 997-1004

78. Omeliansky, V. L. A new bacillus: Bacillus flagelatus Omel. Text. / V. L. Omeliansky// Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. -1914.-V. 1. P. 24.

79. Ong, C. J. Attachment of the adhesive holdfast organelle to the cellular stalk of Caulobacter crescentus Text. / C. J. Ong, M. L. Wong, J. Smit // J Bacteriol. -1990.-V. 172,№ 3. P. 1448-1456.

80. Pang, С. M. Biological filtration limits carbon availability and affects downstream biofilm formation and community structure Text. / С. M. Pang, W.T. Liu // Appl Environ Microbiol. 2006. - V. 72. - P. 5702-12.

81. Poindexter, J. S. Biological properties and classification of the Caulobacter group Text. / J. S. Poindexter // Bacteriological Reviews. 1964. - V. 28. N. 3. -P. 231-295.

82. Poindexter, J. S. Selection for Nonbuoyant Morphological Mutants of Caulobacter crescentus Text. / J. S. Poindexter// Journal of Bacteriology. 1978. - V. 135,№3-1141-1145.

83. Poindexter, J. S. The Caulobacters: ubiquitous unusual bacteria Text. / J. S. Poindexter // Microbiological reviews. 1981. - V. 45. N 1. - P. 123-189.

84. Poindexter, J. S. Novel Peptidoglycans in Caulobacter and Asticcacaulis spp. Text. / J. S. Poindexter, J. G. Hagenzieker // Journal of Bacteriology. 1982. -V. 150,№ 1-P. 332-347.

85. Poindexter, J S. The role of calcium in stalk development and in phosphate acquisition in Caulobacter crescentus Text. / J. S. Poindexter // Arch. Microbiol. 1984.-V. 138.-P. 140-152.

86. Poindexter, J. S. Caulobacter and Asticcacaulis stalk bands as indicator of stalk age Text. / J. S. Poindexter, J. S. Staley // Journal of Bacteriology. 1996. -V. 178,№ 13.-P. 3939-3948.

87. Poindexter, J. S. In situ reproductive rate of freshwater Caulobacter spp. Text. / J. S. Poindexter, K. P. Pujara, J. T. Staley // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - V. 66,№ 9. - P. 4105-4111.

88. Ross, С. M. An evolutionary comparison of Acinetobacter calcoaceticus trpF with trpF genes of several organisms Text. / С. M. Ross , J. B. Kaplan, M. E. Winkler, B. P. Nichols//Mol Biol Evol. 1990. -V. 7. - P. 74-81.

89. Qingsheng, Q. Polyhydroxybutyrate biosynthesis in Caulobacter crescentus: molecular characterization of the polyhydroxybutyrate synthase Text. / Q. Qingsheng, H. A. Bernd//Microbiology. 2001. - V. 147 - P. 3353-3358.

90. Satyanarayana, T Extremophilic microbes: Diversity and perspectives Text. 1С. Raghukumar, S. Shivaji // Current science. 2005 - V.89,№1.

91. Schmidt, J. M. Caulobacter crescentus mutants with short stalks Text. / J. M. Schmidt // Journal of bacteriology. 1969. - V. 98. N. 2. - P. 816-817.

92. Schuppler, M. In situ identification of nocardioform actinomycetes in activated sludge using fuorescent rRNA-targeted oligonucleotide probes Text. / M. Schuppler, M. Wagner, G. Schofen, U. B. Gosbel // Microbiology. 1998. -V. 144.-P. 249-259.

93. Sheng, Y. Y. Oligotrophic bacteria and their applications in environmental science Text. / Y. Y. Sheng, Т. X. Bao // Chinese. 2005. - V. 16. - P. 773-777.

94. Sly, L. I. The phylogenetic relationships of Caulobacter, Asticcacaulis and Brevundimonas species and taxonomic implications Text. / L. I. Sly, T. L. Cox, Т. B. Beckenham // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. - V. 45. - P. 483-488.

95. Staley, J. T. Microbial Ecology Budding and prosthecate bacteria from freshwater habitats of various trophic states Text. / J. T. Staley, К. C. Marshall, V. B. Skerman//Microbial Ecology. 1980. - V. 5,№4. - P. 245 - 251.

96. Steinman, H. M. Copper-Zinc superoxide dismutase of Caulobacter crescentus: cloning, sequencing, and mapping of the gene and periplasmic location of the enzyme Text. / H. M. Steinman, B. Ely // Journal of bacteriology.- 1990. V. 78.-P. 2901-2910.

97. Swoboda, U. The Study of homogeneus populations of Caulobacter stslked (mother) cells Text. / U. Swoboda, C. S. Dow // Journal of general microbiology.- 1979. -V. 112.-P. 235-239.

98. Tsang, P. H. Adhesion of single bacterial cells in the mi crone wton range Text. / P. H. Tsang, G. Li, Y. V. Brun, L. B. Freund, J. X. Tang // Proceedings of National Academy of Science the USA. 2006. - V. 103. - P. 5764-5768.

99. Ueno, H. Abundance and community structure of picoplankton and protists in the microbial food web of Barguzin Bay, Lake Baikal Text. / H. Ueno, T.

100. Katano, S. Nakano, 0. Mitamura, K. Anbutsu, Y. Satoh, V. Drucker, M. Sugiyama // Aquatic Ecology. 2005. - V. 39. - P. 263-270.

101. Van Gemerden, H. Strategies for growth and evolution of microorganisms in oligotrophic habitats / H. Van Gemerden, J. G. Kuenen // Heterotrophic Activity in the Sea. NATO Conference Series IV. Marine Sciences: trends. 1984.- V. 15. -P. 25-54.

102. Van Veen, H. W. Characterization of two phosphate transport systems Acinetobacter johnsonii 21 OA Text. / H. W. Van Veen, T. Abee, G. J. Kortstee,

103. W. N. Konings, A. B. Zehnder // Journal of Bacteriology. 1993. - V. 175, № 1,- P. 200-206.

104. Yilmaz, L. S. Mechanistic approach to the problem of hybridization efficiency in fluorescent in situ hybridization Text. / L. S.Yilmaz, D. R. Noguera // Applied and Environmental microbiology. 2004. - V. 70,№12. - P. 7126— 7139.

105. Yun, C. Identification of genes affecting production of the adhesive holdfast of a marine caulobacter Text. / C. Yun, B. Ely, J. Smit// J Bacteriol. 1994. - V. -176.- P.796-803.

106. Walker, S. G. Isolation and comparison of the paracrystalline surface layer proteins of freshwater Caulobacter Text. / S. G. Walker, S. H. Smith, J. Smit // Journal of Bacteriology. 1992. - V.174. - P. 783-1792.

107. Willskyt, G. R. Characterization of two genetically separable inorganic phosphate transport systems in Escherichia coli Text. / G. R. Willskyt, M. H. Mailamy // Journal of Bacteriology . 1980. - V. 144,№ 1 - P. 356-365.