Таксономическое разнообразие микробного сообщества водной толщи озера Байкал

Белькова, Наталья Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Таксономическое разнообразие микробного сообщества водной толщи озера Байкал
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Таксономическое разнообразие микробного сообщества водной толщи озера Байкал"

На правах рукописи

БЕЛЫСОВА НАТАЛЬЯ ЛЕОНИДОВНА

ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ВОДНОЙ ТОЛЩИ ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН

Научные руководители: кандидат химических наук

Зайчиков Евгений Федорович кандидат биологических наук

Парфенова Валентина Владимировна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, с н.с.

Бузолева Любовь Степановна доктор биологических наук

Намсараев Баир Бадмабазарович

Ведущая организация: Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

Защита диссертации состоится 6 октября 2004 г. в _10_ часов на заседании диссертационного совета Д 212.056 02 при Дальневосточном государственном университете МО РФ по адресу: 690000, г. Владивосток, ул. Мордовцева 12, каб. 139.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Дальневосточного государственного университета.

Автореферат разослан сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к б н.

А В. Поддубный

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Байкал - древнейшее из пресноводных озер мира, характеризующееся уникальными экологическими условиями существования водной экосистемы. Своеобразие гидрологических и гидрохимических факторов озера Байкал -большие глубины, длительный ледовый период, низкая температура воды в летний период даже в поверхностных слоях и постоянство в глубинной зоне озера, высокое содержание кислорода по всей толще воды, низкая концентрация органических веществ -обуславливает специфические условия жизнедеятельности организмов. Бактериальные сообщества составляют важную часть экосистемы водоема и микроорганизмы, населяющие воды Байкала, определенным образом адаптированы к существованию в такой среде. Идентификация бактерий и изучение особенностей их распространения в зависимости от локальных экологических условий являются одними из ключевых задач в исследованиях состава микробных сообществ озера. Однако в то время как из других природных экосистем культивируется не более 10-15% от общей численности бактерий, из байкальской воды удается культивировать от 17 до 575 КОЕ/мл при общей численности 0.2 - 4.6х106 кл/мл, что составляет в среднем 0.5 - 0.8х10-4 %. Таким образом, существенная часть микробного сообщества озера остается неизученной. В данном случае большое значение приобретает использование методов молекулярной биологии, которые позволяют идентифицировать и выявлять отдельные бактериальные группы непосредственно в природных образцах без культивирования.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования - изучить филогенетическое разнообразие и распределение представителей основных таксономических групп в водной толще озера Байкал методами молекулярной биологии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать эффективные методы выделения суммарной ДНК из природных образцов и из чистых культур микроорганизмов, подобрать оптимальные условия амплификации на консервативных бактериальных праймерах фрагмента гена 168 рРНК, обеспечивающие максимальное представительство последовательностей, имеющихся в природном образце, и определить их нуклеотидные последовательности;

2. провести количественный анализ распределения представителей основных филогенетических групп в микробном сообществе водной толще озера Байкал;

3. провести филогенетическую идентификацию полученных последовательностей на основе их сравнения с международным банком данных;

4. сопоставить результаты идентификации методами

классической и молекулярной микробиологии.

Научная новизна. Впервые с использованием молекулярных методов доказано, что адаптационной особенностью водного микробного сообщества озера Байкал является наличие большого количества некультивируемых форм бактерий. На основании филогенетической идентификации этих последовательностей показано, что кекультивируемые формы бактерий представляют не только покоящиеся стадии известных культивируемых бактерий, но и большое разнообразие не идентифицированных бактерий, которые являются характерными для экосистемы озера. Получен банк данных рибосомальных последовательностей культивируемых и некультивируемых микроорганизмов, выделенных из водной толщи озера.

Практическая значимость. Широко распространенный метод молекулярно-биологических исследований адаптирован для изучения микробного сообщества водной толщи озера Байкал с учетом его экологических особенностей. Отработанный метод может быть применен для мониторинга экосистемы озера, для быстрой диагностики экологического состояния микробных сообществ. Кроме того, полнота информации о составе микробных популяций имеет огромное практическое значение для выявления и выделения микроорганизмов, обладающих различными ферментативными активностями. Применение молекулярно-биологических методов для изучения филогенетического разнообразия байкальских микроорганизмов, соотнесение этих результатов с данными микробиологических исследований позволяет сформировать более полную картину разнообразия природного сообщества и функционирования экосистемы в целом, потому что позволяют учитывать не только культивируемые микроорганизмы. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 168 рРНК культивируемых и некультивируемых бактерий, 78 из них зарегистрированы в международном БМБЬ-банке данных и им присвоены следующие номера Х99983-Х99989, Л222832-Л222835, Л1222839-Л1222858, АШ9926-АШ9961, ЛШ9966-ЛШ9981. Эта информация может быть использована для конструирования групп- и видоспецифичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа состава микробного сообщества озера Байкал.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В озере Байкал с глубиной изменяется качественный и количественный состав микробного сообщества, на определенных глубинах доминируют определенные группы микроорганизмов.

2. Преобладающей формой существования микроорганизмов ввиду естественных олиготрофных условий является некультивируемое состояние.

3. К обнаруженным некультивируемым формам бактерий относятся микроорганизмы,

адаптированные к олиготрофным условиям существования и неидентифицированные микроор1анизмы, встречающиеся в других пресноводных и почвенных экосистемах. 4. Некультивируемые бактерии с неясным филогенетическим положением широко распространены в глубинных слоях озера Байкал и могут рассматриваться как эндемичные виды, характерные для его экосистемы.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Второй и Третьей Верещагинских Байкальских конференциях, проходивших в Иркутске в октябре 1995 г. и августе 2000 г., 'на научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», проходившей в Иркутске (март, 2002), на международных конференциях «Biodiversity in Ancient Lakes», проходивших в Японии (сентябрь, 1997) и Иркутске (сентябрь, 2002), на международных симпозиумах в Японии (сентябрь, 1998) и Корее (март, 2000), на VIII международном экологическом конгрессе INTECOL, проходившем в Сеуле, Корея (август, 2002), на I микробиологическом конгрессе европейского микробиологического общества FEMS, проходившем в Любляне, Словения (июнь-июль, 2003) и на международном Байкальском симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», проходившем в Иркутске (сентябрь, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа (7 из них в рецензируемых журналах).

Структура и объем работы. Предлагаемая диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (118 отечественных и зарубежных источников) и приложения. Объем работы составляет 109 страницы машинописного текста, включающего 6 таблиц, 15 рисунков и 1 приложение.

Автор выражает сердечную благодарность научным руководителям к.б.н. В.В. Парфеновой и к.х.н. Е.Ф.Зайчикову за всестороннюю помощь и поддержку в работе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Стратегия пробоотбора. Для анализа некультивируемого микробного сообщества водной толщи пробы воды были отобраны в летний период с глубин 25 м, 400, 1200 и 1400 м на центральной станции южной котловины (Листвянка - Танхой) и с глубин 25, 1400 и 1600 м - центральной станции средней котловины озера (м. Ухан - м. Тонкий) (рис. 1). Подбор глубин был проведен таким образом, чтобы получить достоверную информацию о наиболее полном разнообразии водных байкальских микроорганизмов. В

данной работе не проводится сравнение с поверхно-стным горизонтом, 0 м, ввиду того, что в летний период в поверхностном

горизонте доминирующими являются фотосинтезирующие микроорганизмы.

Методы» использованные в работе. Первым этапом работы стала отработка современных молекулярно-биологических методов:

106*

40 км ¡

1. была предложена оригинальная

Рис. 1. Схема проведения пробоотбора на озере Байкал в летний период 1995,1996 гг.

процедура выделения суммарной бактериальной ДНК из природных образцов и оптимальные условия

амплификации (ПЦР) фрагмента гена 16S рРНК;

2. трансформацию и клонирование проводили по стандартным методикам;

3. селекцию клонов, содержащих вставки фрагментов гена рРНК, вели методом бело-голубого скрининга, а идентичные клоны определяли методом однобуквенного секвенирования;

4. нуклеотидные последовательности определяли секвенированием по стандартной методике. Последовательности полноразмерных и частичных фрагментов гена 16S рРНК отправлены в EBML-банк данных;

5. для сравнительного анализа полученных последовательностей с известными в EMBL-банке данных использовали пакет программ FASTA, филогенетический анализ проводили с помощью программы TreeConW.

В таблице 1 приведены структуры бактериальных праймеров, использованных для амплификации бактериальной ДНК. Для ПЦР с суммарной бактериальной ДНК использовали пару наиболее консервативных праймеров 500L и 1350R. Для амплификации ДНК чистых культур микроорганизмов использовали пару праймеров 27L и 1350R, позволяющие получить практически полный ген 16S рибосомальной РНК (длина амплифицированного фрагмента составляет более 1300 п.н.). На паре плазмидных праймеров проводили амплификацию фрагментов гена 16S рРНК после трансформации и клонирования.

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе.

Название Последовательность 5'- 3' Позиция на рибосомальной РНК E.coli

27L AGAGTTTGATCATGGCTCAG 8-27

500L CG7GCCAGCAGCCGCGGTAA 514-533

800L AGGATTAGATACCC7GGTAGTC 790-812

1000L GATGCAACGCGAAGAACCTTACC 972-994

1000R CCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGC 975-997

I230R CATTGXAGCTCGTGTGTAGCCC 1219-1240

I350R GACGGGCGGTGTGTACAAG 1389-1407

Универсальные плаэмидвые праймеры

M13-UP GGAAACAlGCTATGACCAT

M13-DOWN GTAAAACGACGGCCAGTG

Флуоресцентная гибридизация in situ с групп специфичными зондами. Для

количественного анализа состава и структуры водного сообщества был использован метод флуоресцентной гибридизации in situ с групп-специфичными зондами на основные группы бактерий. Зонды - это короткие одноцепочечные нуклеотидные фрагменты, имеющие гомологию либо с высококонсервативными, либо с вариабельными последовательностями рибосомальных генов, несущие флуоресцентную или нефлуоресцентную метку и позволяющие селективно выявлять наличие ДНК определенного состава. Нами был использован стандартный набор зондов на основные бактериальные таксоны: эубактерии, цитофаги и протеобактерии подгрупп альфа, бета и гамма. Все зонды были мечены флуоресцентным красителем тетраметилродамином, их нуклеотидные последовательности представлены в таблице 2. Условия гибридизации, такие как концентрация формамида в гибридизационном буфере и концентрация соли в отмывочном буфере, варьировали в зависимости от используемого в данной реакции зонда (табл.2).

Ввиду того, что олигонуклеотидные зонды GAM42a и ВЕТ42а отличаются только на одну букву, дополнительно к ним в реакцию брали немеченые зонды-конкуренты: для GAM42a - немеченый ВЕТ42а, а для ВЕТ42а - немеченый GAM42a. Для подсчета общей численности бактерий фильтры красили флуоресцентным красителем ДАФИ. Для корректной детекции сигнала гибридизации была оценена фоновая гибридизация с зондом NON338, который не имеет сайта комплементарности на рибосомальных генах, и все подсчеты были скорректированы с учетом гибридизации отрицательного контроля. Кроме того, было показано, что при гибридизации смывается не более 10% клеток, Таблица 2. Олигонуклеотидные зонды, использованные в работе.

Название зонда Структура зонда 5*-3' Позиция на рибосомальной РНК Выявляемая группа бактерий Формамид* NaCl"

EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT I6S,338-355 Все эубактерии 0% 0.9 М

ALF968 GGTAAGGTTCTGCGCGTT 16S, 968-986 Альфа-подгруппа протеобактерий 20% 0.225 М

ВЕТ42а ассхтсссясххсаттх 23S,1027-1043 Бета-подгруппа протеобактерий 35% 0.08 М

GAM42a GCCTTCCCACATCGTTT 23S,1027-1043 Гамма-подгруппа протеобактерий 35% 0.08 М

CF319a GGTCCGTGTCTCAGTAC 16S, 319-336 Группа цитофаги-флавобактерии 15% 0.08 М

NON338 HCTCCTACGGGAGGCAGC - Отрицательный контроль 0% 0.225 М

*- концентрация формамида, используемая в гибридизационном буфере; ** - концентрация Nad в отмывочном буфере.

зафиксированных на фильтрах. Для каждого сегмента было просчитано 10-20 полей зрения с общей численностью не менее 400-500 бактериальных клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Количественный анализ таксономического состава водного микробного сообщества

озера Байкал

Состав глубоководного микробного сообщества изучался флуоресцентыми методами: проводили подсчет общей численности бактерий при окрашивании ДАФИ и определяли долю представителей основных филогенетических групп микроорганизмов методом гибридизации in situ с флуоресцентными групп-специфичными зондами. В рамках данной работы был проведен количественный анализ проб воды, отобранных в летний период на центральной станции Южного Байкала (вертикальный профиль до глубины 760 м) и поверхностный горизонт, отобранный в районе бухты Песчаная. Подсчет общей численности бактерий показал максимальную численность в поверхностных слоях озера от 1.6 до 1.4x106(0 - 10 м). С глубиной ОЧБ уменьшается до 0.1 - 0.2x106 и с горизонта 50 - 100 м становиться стабильно низкой, что хорошо согласуется с данными ежегодных наблюдений. Результаты количественного анализа таксономического состава бактериального водного сообщества озера Байкал методом флуоресцентной гибридизации in situ показали, что представители основных филогенетических групп присутствуют на всех глубинах (рис. 2). Однако следует отметить, что эубактериальным зондом выявляется далеко не полное разнообразие бактерий, суммарно не более 77.9% от ОЧБ детектируется на разных глубинах.

% от ОЧБ

70 J

50-

20-!

10-

I •

Рис. 2 Распределение обшей численности бактерий (А) и представителей основных филогенетических групп (Б) по глубинам на центральной станции южной котловины озера Байкал.

Следует отметить, что в других пресноводных водоемах этим зондом выявляется от 43 до 61% клеток. Кроме того, обращает на себя внимание высокий процент клеток, не гибридизующихся с известными зондами и составляющих группу "другие", особенно по сравнению с клетками, выявляемыми этими зондами (рис. 2). Например, на глубине 10 м из 70.4% эубактсриальных клеток только 15.6% гнбридизуются с зондами на основные группы бактерий, а 54.8% составляет фракцию неопределенных бактерий. Из литературных данных известно, что для пресноводных экосистем это характерный факт (Gloeckner et al., 1999). Однако, чаше всего доля клеток, не выявляемых зондами, не настолько велика. Эги данные несомненно юворят о том, что в микробном сообществе озера Байкал большую долю составляют микроорганизмы, нуклеотидные последовательности которых не зарегистрированы еще в международном банке данных, и следовательно они не были учтены при расчете известных олигонуклеотидных зондов. Таким образом, использование метода гибридизации in situ показало, чю бактериальное сообщество озера Байкал представлено не только широко известными и повсеместно распространенными видами бактерий, но и новыми, присущими именно для этой экосистемы микроорганизмами.

По результатам молскулярно-биологического анализа библиотеки клонов, полученных из проб воды, отобранных с глубин 25,400, 1200 и 1400 м южной котловины показано, что состав бактериального сообщества на различных глубинах существенно различается (табл. 3). Микроорганизмы, обитающие в водной толще озера, представлены

Таблица 3. Распределение основных филогенетических групп бактерий на разных глубинах южной котловины озера Байкал по результатам молекулярно-генетического анализа библиотеки клонов некультивируемых байкальских микроорганизмов.

Филогенетическая группа Глубина, м Всего

25 400 1200 1400*

Цианобактерии 17 - - 16 33

Альфа-протеобактерии - 4 12 4 20

Бета-протеобактерии 1 - - - I

Гамма-протеобактерии - 3 3 - 6

Дельта-протеобактерии - - 4 - 4

Актинобактерии 2 17 8 1 28

Планктомицеты - - 3 1 4

Голофаги - - 2 - 2

Нитроспира - - 1 1 2

Всего 20 24 33 23 100

в основном цианобактериями, протеобактериями и актинобактериями. Цианобактерии доминируют на глубинах 25 и 1400 м. Наличие их в поверхностном слое согласуется с ежегодным цианобактериальным пиком в летний период. Наличие же цианобактериальных последовательностей в придонном слое можно объяснить циркуляцией вод в Байкале. Протеобактерии составляют доминирующее и очень разнообразное сообщество в глубинных байкальских водах, а актинобактерии доминируют на глубине 400 м, куда поступает в основном труднорастворимые органические соединения.

Таким образом, разные методы оценки состава водного микробного сообщества озера Байкал показали, что бактериопланктон в основном представлен видами, которые характерны для экосистемы озера.

Изучение таксономического разнообразия некультивируемых глубоководных микроорганизмов озера Байкал

Не смотря на долгую историю микробиологических исследований озера Байкал, видовой состав водных микроорганизмов изучен далеко не полностью. Для молекулярно-генетического анализа водного микробного сообщества озера Байкал использовали подход, предложенный ранее Р. Аманном и соавторами (Лшапп е! а1., 1995). В рамках данной работы детально проанализирована проба воды, отобранная с глубины 1200 м

южной котловины озера. Получена библиотека клонов, и для 29 из них определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена I6S рРНК. Был проведен их сравнительный анализ с последовательностями, имеющимися в международном банке данных. Филогенетический анализ проводили для последовательностей, полученных не только с глубины 1200 м южной котловины, но и 25,400 и 1400 м южной котловины и 25, 1400 и 1600 м средней котловины озера.

Результаты сравнительного анализа показали, что небольшое количество последовательностей имеют гомологию с последовательностями культивируемых штаммов, или штаммов, полученных в накопительной культуре, из других природных водоемов. Это такие последовательности, как 1200-9, 1200-12, 1200-25, 1204-37, 1204-42, 1200-63 и 1200-64. Следует отметить, что эти нуклеотидные последовательности показали высокий процент гомологии (выше 97%) с последовательностями культивируемых штаммов, относящихся к альфа-подгруппе протеобактерий и грам-положительным бактериям с низким содержанием Г+Ц пар. Для корректного определения филогенетической позиции последовательностей некультивируемых байкальских микроорганизмов, показавших высокое сходство с представителями культивируемых штаммов альфа-подгруппы протеобактерий, был проведен их филогенетический анализ как с ближайшими родственниками из банка данных, так и с типовыми штаммами гамма-подгруппы протеобактерий (рис. 3). В качестве типовых штаммов, относящихся к гамма-подгруппе, были выбраны Pseudomonas aeruginosa (AY16213 8), Pseudomonas stutzeri (AB098613) и Pseudomonas putida (AY308050). Филогенетический анализ показал, что некультивируемые бактерии 1200-9, 1200-63, 1204-37 и 1204-42 являются представителями семейства Sphingomonadaceae. Было показано, что штамм Pseudomonas sp. (AF331664) с высокой статистической достоверностью (98%) входит в кластер, образованный последовательностями, близкими к определенной нами (1200-63) и относящимися к семейству Sphingomonadaceae. С другой стороны, нуклеотидные последовательности типовых штаммов гамма-подгруппы псевдомонад образуют отдельный кластер на филогенетическом дереве. Две другие последовательности, 1200-25 и 1200-64, входят в кластеры, образованные представителями семейств Caulobacteraceae и Methylobacteriaceae, соответственно (рис. 3). Еще одна последовательность, 1200-12, имеет высокую гомологию с последовательностями спорообразующих грам-положительных бактерий, имеющими низкое содержание Г+Ц пар в ДНК.

Ранее было показано, что гомология гибридизации ДНК-ДНК выше 70% характеризует границы межвидовых различий двух бактериальных штаммов (Wayne et al, 1987). Б.М Гобелом и Е. Стакебрандтом (1994) на примере анализа смешанных

Distance 0.1 I-1

I Sphtngomonas sp. (X89903) Sphtngomonas sp. (Z231S7)

100

Некультивируемая бактерия (AB074638) ■-1204-37 —1204-42

Pseudomonas sp. (AF331664) 4

Spkingomonas sp. (AF385529) Звездчатая мнкроколония (AJ001344) L1200-63 ГХ99983) g

Astlccacaulls excenlrkus (AJ007800fl £ § Caulobaeter leiiyi (AJ227812) g|

я -2

-е- -2

В S

v >

i a

Caulobaeter subvibroidies (M83797) L 1200-25 (X99988) ■Sphtngomonas alaska (AF14S7S4) (Бактерия из накопительной культуры (AF532188) \Sphingomonas sp. (АВ033949) 4 200-9 0(99989) g §

1200-64 ГХ99984) ^ |f

S «

? I

100

15)

Methylobaclerium sp. (AF395035)! | | Methylobacterlum sp. (D32231) I«. 'S, Methylobaclerium sp. (Z23I60) J J ^

Pseudomonasputida (AY308050) Pseudomonas stutzeri (ABO 98 613) Pseudomonas aeruginosa (AY162138)

-Escherichia coll (

AY3193931

I— i

Рис. 3. Филогенетическое дерево протеобактерий, относящихся к подгруппам альфа и гамма, и некультивируемых байкальских микроорганизмов, основанное на результатах секвенирования гена 16S рРНК.

микробных популяций из природных и коммерческих выщелачивающих реакторов было показано, что уровень ДНК-ДНК гибридизации выше 70% соответствует идентичности в нуклеотидных последовательностях выше 98.5%, и может адекватно отражать видовые различия штаммов. Однако, если идентичность двух гомологичных последовательностей ниже 97%, представляется затруднительным определение видоспецифичности данного штамма и его филогенетическое положение определяется как нестабильное. Таким образом, можно считать, что внутривидовой уровень сходства для микроорганизмов большинства групп составляет выше 98.5%, а внутриродовой может быть оценен 97% (Лшапп е! а1., 1992; ОоеЪе1, 81аскеЪ1апС1;, 1994). На основании этих предположений, можно заключить, что нуклеотидные последовательности, полученные при анализе суммарной

бактериальной ДНК, выделенной из глубоководной пробы воды с горизонта 1200 м центральной станции Южного Байкала, принадлежат бактериям родов Sphingomonas, Methylobacterium, Caulobacter и PaenibacШus, которые населяют придонные глубины, озераБайкал.

Остальные 22 нуклеотидные последовательности показали максимальную гомологию с последовательностями некультивируемых микроорганизмов, которые были получены из других, чаще всего, природных источников аналогичными молекулярно-биологйческими методами. Среди них можно выделить несколько групп. Особо следует отметить, что некоторые из последовательностей" имеют высокую гомологию с последовательностями байкальских некультивируемых микроорганизмов, полученных из других горизонтов южной и средней котловин озера Байкал. При этом гомология с ближайшими родственниками из банка данных оказывается существенно ниже (табл. 4). Это такие последовательности, как 1204-15 и 1204-10, имеющие гомологию 99.0 и 98.5% с последовательностью 1404-59, выделенной с глубины 1400 м Южного Байкала и относящейся к альфа-подгруппе протеобактерий. Ближайшими родственниками из банка данных для этого организма оказываются - симбиотическая (№104474) и некультивируемая (АР280850) бактерии. Последовательность 1204-43 на 98.2% идентична другой последовательности, 1404-16, выделенной также с глубины 1400 м, но относящейся к группе нитроспира. Ее ближайшими родственниками из банка данных язляются штаммы Nitrospira 8р. (А224042) и Nitrospira с£ moscoviensis (АБ155153), показавшие 96.2% и 96.0% сходства с анализируемой байкальской бактерией. Такие последовательности, как 1204-33 и 1204-39, имеют высокую гомологию с последовательностями, которые выделены как из южной, так и из средней котловин озера. Так, последовательность 1204-33 гомологична на 98.1% с последовательностью 1605-59, которая выделена с глубины 1600 м Среднего Байкала и на 94.7% - с 1404-25, выделенной с глубины 1400 м Южного Байкала. Такую же высокую гомологию имеет последовательность 1204-39 с последовательностью 404-23 (98.8%) и 25-4-10 (96.2%), которые выделены с глубин 400 и 25 м южной котловины, соответственно. Ближайшие родственники из банка данных для байкальской бактерии 1204-33 - это Methylobacter ер. (АГ414655), относящийся к гамма-подгруппе протеобактерий, а для 1204-39 -некультивируемый клон (АБ328189), входящий в группу актинобактерии (табл. 4). Еще одна последовательность, 1204-24, имеет невысокий процент гомологии как с последовательностями представителей группы актинобактерии (93.7%, АУ192288 и 93.5%, АБ328189), так и с байкальскими некультивируемыми микроорганизмами (94.0%). На основании этих данных можно заключить, что некультивируемые микроорганизмы,

Таблица 4. Результаты сравнительного анализа последовательностей некультивируемых глубоководных микроорганизмов озера Байкал, показавших максимальную гомологию с последовательностями байкальских некультивируемых бактерий.

Номер клона (п.н.) Номере банке данных Ближайший родственник (номер в банке данных) Гомология (% сходства) Филогенетическая группа, определенная авторами

1204-15 (412) AJ289926 Некультивируемая бактерия 1404-59 (AJ0076S7) 99.0 Протеобактерии

Симбиотическая бактерия (AF104474 93.2 Альфа- протеобактерии

Некультивируемая бактерия (AF280850) 90.8 Альфа-протеобакгерии

1204-33 (422) AJ289928 Некультивируемая бактерия 1605-59 (AJ007658) 98.1 Протеобактерии

Некультивируемая бактерия 1404-25 (А1289933) 94.7 Гамма- протеобактерии

Methylobacter sp. SV96 (AJ414655) 94.0 Гамма- протеобактерии

1204-39 (417) AJ289929 Некультивируемая бактерия 404-23 (AJ289957) 98.8 Актииобактерии

Некультивируемая бактерия 25-4-10(AJ007641) 96.2 Не определена авторами

Некультивируемый клон KS (AF328189) 95.7 Не определена авторами

1204-29 (402) Некультивируемая бактерия 1405-72 (AJ007655) 99.0 Протеобактерии

Некультивируемый клон 160510 (AJ289944) 98.3 Актииобактерии

Некультивируемая бактерия из кратерного озера (AF316665) 98.0 Не определена авторами

1204-43 (399) Некультивируемая бактерия 1404-16 (AJ007648) 98.2 Не определена авторами

Nitrospira sp. (AJ224042) 96.2 Группа нитроспира

Nitrospira cf. moscoviensis (AF155153) 96.0 Группа нитроспира

1204-24 (431) Некультивируемая бактерия 25-4-10(AJ007641) 94.0 Не определена авторами

Некультивируемая актинобактерия (AY192288) 93.7 Актииобактерии

Некультивируемый клон (AF328189) 93.5 Не определена авторами

1204-6 (412) Некультивируемая бактерия из кратерного озера (AF316678) 97.3 Не определена авторами

Bacterial sp. 1404-31 (AJ222835) • 96.1 Не определена авторами

Некультивируемый клон 160535 (AJ289948) 93.7 Актииобактерии

действительно населяют водную толшу озера, и некоторые виды повсеместно распространены в глубоководных слоях. Однако следует отметить, что гомология этих последовательностей с известными культивируемыми и некультивируемыми последовательностями из банка данных невысока и составляет чаше всего меньше 95%,

что говорит об уникальности этих штаммов.

Отдельной группой можно выделить еще несколько последовательностей, которые имеют практически одинаковую гомологию с последовательностями некультивируемых байкальских бактерий и некультивируемых бактерий, выделенных из ультра-олиготрофного кратерного озера (иЛасИ й а1., 2001). Это четыре последовательности, одна из которых (1204-29) имеет высокую гомологию с последовательностями байкальских некультивируемых бактерий 1405-72 (99.0%) и 1605-10 (98.3%), выделенных с глубин 1400 и 1600 м Среднего Байкала. Кроме того, сходство этой байкальской бактерии и некультивируемой бактерии (ЛБ316665), выделенной из кратерного озера, составляет 98.0%. Остальные три последовательности, 1204-6, 1204-28 и 1204-50, гомологичны последовательности другой некультивируемой бактерии, выделенной из этого же источника, (ЛБ316678). Процент их идентичности составил 97.3, 97.1 и 91.7, соответственно. Однако все эти четыре байкальские последовательности попадают в группу актинобактерии.

Еще одна группа последовательностей микроорганизмов включает в себя те из них, которые не имеют высокой гомологии с последовательностями других байкальских некультивируемых бактерий. Они показали максимальную гомологию с последовательностями микроорганизмов, которые были получены молекулярными методами из других природных и искусственных пресноводных или почвенных экосистем. Последовательность 1204-7 имеет процент гомологии 99.3% с последовательностью некультивируемой почвенной бактерии (Л252701), относящейся к альфа-подгруппе протеобактерий. Другие две последовательности 1204-51 и 1204-61 гомологичны другой последовательности, выделенной из этого же источника (Л252685). Процент их гомологии с этой последовательностью составляет 97.9 и 92.3%, в то время как следующий ближайший родственник идентичен с этими байкальскими бактериями только на 88.9 (некультивируемая бактерия, ЛР293009) и 88.7% (Desulfuromonas acetexigens, Ш3140). Остальные последовательности имеют гомологию с представителями альфа-подгруппы протеобактерий (1204-53, 95.7%), актинобактерии (1204-20, 93.9%; 1204-19, 96.2%), планктомицетов (1200-34, 94.1%; 1204-46, 87.0%; 120447, 92.0%) и недавно выделенной группы ацидобактерии-голофаги (1204-25, 88.4%; 120056, 96.5; 1204-45, 88.2%). Ввиду низкой гомологии с известными последовательностями их филогенетическое положение остается неясным.

Был проведен филогенетический анализ исследуемых байкальских микроорганизмов с ближайшими родственниками, которые являются представителями протеобактерий для некультивируемых бактерий 1204-15, 1204-10, 1204-33 (рис. 4),

актииобактерий (1204-24, 1204-39) и группы нитроспира (1204-43). Следует обратить внимание, что последовательности байкальских микроорганизмов 1204-15, 120410 и 1204-33 образуют кластеры с другими ближайшими родственниками, которые также являются некультивируемыми бактериями в разных филогенетических группах. Однако интересным феноменом является кластер, образованный последовательностью 1204-33 (рис. 4). Вместе с этой последовательностью группируются только последовательности байкальских бактерий, выделенные с больших глубин южной (1404-25, AJ289933, глубина 1400м) и средней (1405-1 (AJ007649), 1405-2 (AJ289936), - глубина 1400 м и 1605-59 (AJ007658), глубина 1600 м) котловин озера. Ближайший культивируемый родственник из банка данных, не смотря на 94.0% сходства, Methylobacter sp. (AJ414655) входит в кластер, образованный другими представителями этого рода, однако, ветвящийся отдельно от кластера 1204-33. Кроме того, в большом кластере, образованном последовательностями рода Methylobacter также отдельно ветвятся две другие последовательности, выделенные с 1400 и 1600 м средней котловины, 1405-48 (AJ289939) и 1605-43 (AJ289949), соответственно.

Филогенетический анализ, проведенный для последовательностей 1204-24 и 120439 и представителей актинобактерий (рис. 5), выявил, что байкальские последовательности образуют отдельный кластер с последовательностью 404-23 (AJ289957), выделенной с горизонта 400 м южной котловины, который ветвится вместе с другими последовательностями некультивируемых актинобактерий, выделенных из пресноводных (AF316678, Urbach et al., 2001; AF418962, Stein et al., 2002) и почвенных (AJ2 77699, Luedetnann, Conrad, 2000) экосистем. Следует отметить, что этот кластер отличен от монофилетичного кластера hgcl, который был охарактеризован Ф.О. Глокиером для актинобактериальных последовательностей, выделенных из трех пресных озер Госсенколлезее (Австрия), Фучшухле, (Германия) и Байкал, однако также включает только последовательности, выделенные непосредственно из природных экосистем. Существование подобных кластеров показано в других группах: ацидобактсрии-голофаги, нитроспира, планктомицеты. Весьма вероятно, что они относятся к неописанным пока группам бактерий, уникальных для экосистемы озера Байкал. Это служит еще одним доказательством предложенного ранее вывода об уникальности экосистемы озера, бактериопланктон которой в значительной степени представлен видами, характерными только для этой системы.

Из представленных данных видно, что последовательности байкальских микроорганизмов образуют кластеры, которые ветвятся отдельно от представителей

r Hex

¿Bei],

Г He.

i—i I— Ali,

Некультнвврумая бактерии (AJ289986) Beijerlnckla indica (M59060) Некультнвнруемая бактерия (AJ290032)

-1204-53 (АЛ89931)

7la

Methylocapsa acidiphiia (AJ278726) -г Methyiosinus sporium (Y18946) U Sfethyiocystis sp. LWS (AF150790) 7 Methyiosinuspucelana (AF107461) 1 Methylocystis parvus (AF15080S) rRhodopseudomonas cryptolact (AB087718) J1- Rhodoplanes elegans (AF487437) Rhodoplanes roseas (D25313) 1605-23 1404-8

Почвенная бактерия (AJ252701) 1204-7

Некультнвнруемая бактерия (AF337888) Некультнвнруемая бактерня (AJ534617) •1404-59 "»J 1204-15 (AJ289926) L1204-10

Симбнотвческая бактерня (AF104474) -Некультвввруемая бактерня (AF280850) г-Acldipbilium faciiis (D30774) '-AcidiphUium aminolytica (D30771)

i-404-5

^Г1404-44 -~ 400-149 —Peiobacter acetylenicus (X70955) -Desulfuromonas acetexigens (U23140)

-Desuifobutbus eiongatus (X95180) ■

-1405-10 (AJ007651)

Некультнвнруемая бактерня (AF293009)'

-61(AJ289932)

Почвенная бактерия (AJ252685) 1204-51 (AJ289930) 1405-1 (AJ007649)

1204-33 (AJ289928) 1605-59 (AJ007658) 1405-2 (AJ289936)

-1404-25 (AJ289933) Metkylosphaera hansonii (U67929)

j-1605-43 (AJ289949) 1405-48 (AJ289939) г Methylobacter psychrophilus (AF152597) ' Methylobacter sp. (A J414655) r-Methytomonas rubra (AF150807) LI Methylomonas sp. (AF150796) |й}г Methylobacter marinas (AF304197) л Methylobacter sp. (AF016981) ■ Escherichia coli (AY319393)

« H

■e

Ряс. 4. Филогенетическое дерево для некультивируемых байкальских протеобактерий и их ближайших родственников из банка данных.

культивируемых и идентифицированных штаммов, имеющихся в банке данных, что свидетельствует о том, что глубинные слои озера населены видами, уникальными и характерными именно для экосистемы озера Байкал

Сопоставление результатов идентификации культивируемых гетеротрофных бактерий по морфо-биохимическим тестам и секвенированию гепа 16S рРНК

В ходе экспедиционных работ, проведенных летом 1995-1996 гг, было выделено 106 штаммов гетеротрофных микроорганизмов из проб воды, отобранных с разных горизонтов центральных станций Южного и Среднего Байкала. Изучение видового состава, культивируемых бактерий озера показало, что среди гетеротрофных микроорганизмов чаще всего культивируются представители широко распространенных родов В рамках данной работы проведен сравнительный идентификационный анализ представителей рода Pseudomonas. Секвенирование гена 16S рибосомальной РНК показало, что большинство штаммов имеют высокий процент гомологии с последовательностями, которые были зарегистрированы относительно недавно (1999 -

2000 гг.) в банке данных. Нами для выяснения филогенетических отношений был использован фрагмент гена 16S рРНК размером от 450 до 800 п.н., по которому ранее проводился филогенетический анализ некультивируемого сообщества. Результаты показали, что эти последовательности ветвятся вместе с типовыми штаммами псевдомонад, такими как Pseudomonas fluorescens bv. (AF228367), Pseudomonas veronii (AF064460) и Pseudomonas brassicacearum (AF100322), относятся к гамма-подгруппе протеобактерий, и, следовательно, являются разными видами рода Pseudomonas.

Несомненно, большой интерес представляет сравнительный филогенетический анализ последовательностей культивируемых гетеротрофных бактерий и некультивируемых байкальских микроорганизмов. Следует отметить, что последовательности некультивируемых альфа-протеобактерий хоть и группируются вместе с такими представителями этой группы, как бактерии рода Sphingomonas, однако образуют отдельные ветви на филогенетическом дереве, аналогичные полученными ранее в разных таксономических группах (рис. 4,5).

Таким образом, можно заключить, что среди культивируемых гетеротрофных микроорганизмов мы также обнаружили представителей, определение которых только по морфологическим признакам и биохимическим тестам затруднено. Идентификация этих штаммов должна проводиться с учетом данных молекулярного анализа. Несомненно, что они представляют ту часть микробного сообщества, которая, являясь уникальной для экосистемы, вносит существенный вклад в ее функционирование.

ВЫВОДЫ

1. Впервые проведена филогенетическая идентификация микроорганизмов водной толщи озера Байкал. Всего определено 138 новых некультивируемых бактерий.

2. Таксономическое разнообразие представлено практически всеми филогенетическими группами микроорганизмов. Отмечено, что на разных глубинах доминируют различные группы бактерий. На глубине 25 м доминирующими являются цианобактерии, на 400 м преобладают актинобактерии, в глубинных слоях озера (1200 м) широко распространены протеобактерий, а в придонном слое на центральной станции южной котловины преобладают цианобактерии, которые на филогенетическом дереве образуют группу, отличную от поверхностных форм.

3. Ввиду специфических гидрологических и гидрохимических условий в микробном сообществе озера преобладают некультивируемые формы бактерий, которые могут быть разделены на 3 основные группы.

4. К первой группе отнесены бактерии, которые переходят в некультивируемое состояние в результате адаптации к экстремальным условиям существования. Это

бактерии родов Methylobactsrium, Sphingomonas и Paenibacillus, которые впервые выявлены в составе микробного сообщества водной толщи озера, а также представители рода Caulobacter, описанные ранее только по морфологическим признакам.

5. Ко второй группе некультивируемых бактерий относятся широко распространенные виды, обнаруженные молекулярными методами в других пресноводных и почвенных экосистемах.

7. Установлено, что особенности существования микробных сообществ в олиготрофных условиях байкальских вод предполагают наличие адаптационных приспособлений у бактерий. Байкальские микроорганизмы обладают способностью переходить в некультивируемое (покоящееся) состояние.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белькова Н.Л.. Денисова Л.Я., Манакова Е.Н., Зайчиков Е.Ф., Грачев МА. Видовое разнообразие глубоководных микроорганизмов озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК. //Докл. РАН. 1996. Т. 348. №5. С. 692-695.

2. Белькова Н.Л.. Денисова Л.Я., Манакова Е.Н., Зайчиков Е.Ф., Грачев МАВидовое разнообразие глубоководных микроорганизмов озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК. // Вторая Верещагинская Байкальская конференция: Тез. докл. и стенд, сообщ. - Иркутск, 1995. С. 24.

3. Denissova L.Ya., BeDcova N.L.. Ladyguna R, Parfenova V.V., Zaychikov E.F. Phylogenetic analysis of aquatic bacteria of the Lake Baikal. // International Conference on Ancient Lakes: their Biological and Cultural Diversities: Abstr. of conference. - Shiga, Japan, 1997. P. 233.

4. Drucker V., Parfenova V., Belkova N.. Poddubnyak N.. Kostomova Т., Nikulina I. Biodiversity of autochtonous microbial community of Lake Baikal. // BICER, BDP and DIWPA Joint International Symposium on Lake Baikal: Abstr. of conference. -Yokohama, Japan, 1998. P. 12.

5. Khanaeva Т., Zemskaya Т., Belkova N. Biodiversity of bacteria in bottom sediments of Akademichesky Ridge (by BDP-96 materials). // BICER, BDP and DIWPA Joint

International Symposium on Lake Baikal: Abstr. of conference. - Yokohama, Japan, 1998. P. 39.

6. Денисова ЛЛ., Белькова Н.Л.. Тулохонов И.И., Зайчиков Е.Ф. Биоразнообразие бактерий на различных глубинах южной котловины озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК. //Микробиология. 1999. Т. 68. №4. С. 475-483.

7. Денисова Л.Я., Белькова Н.Л.. Тулохонов И.И., Зайчиков Е.Ф. Филогенетическое разнообразие бактерий на различных глубинах Южного Байкала, выявленное по последовательностям 16S рРНК. // Сибирский экологический журнал. 1999. Т.б. С. 619-624.

8. Glockner О., Zaichikov E., Belkova N.. Denissova L., Pernthaler J., Pernthaler A., Amann R. Comparative 16S rRNA Analysis of Lake Bacterioplankton Reveals Globally Distributed Phylogenetic Clusters Including an Abundant Group ofActinobacteria. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66. No. 11. P. 5053-5065.

9. Белькова Н.Л.. Парфенова В.В., Косторнова TJL, Денисова ЛЛ., Зайчиков Е.Ф. Особенность биоразнообразия микробного сообщества озера Байкал. // Третья Верещагинская Байкальская Конференция: Тез. докл. и стенд, сообщ. - Иркутск, 2000. С. 31-32.

10. Хонг С.-Х., Ох Д.-Х., Ким Д.-Дж., Белькова Н.Л.. Дрюккер В.В., Ан Т.-С. Структура бактериального сообщества Южного Байкала , выявленная методом гибридизации in situ. // Третья Верещагинская Байкальская Конференция: Тез. докл. и стенд, сообщ. -Иркутск, 2000. С. 262-263.

11. Parfenova V., Belkova N.. Kostornova Т., Drucker V. Lake Baikal as a world source of pure drinking water. // International conference on drinking water management for 21st century: Proceeding of conference. - Kumi, Korea, 2000. P. 21-35.

12. Белькова Н.Л.. Чунг Х.М., Ан Т.С. Применение метода гибридизации IN SITU для выявления цианобактериальных клеток. // Микробиология. 2002. Т. 71. №3. С. 381386.

13. Drucker V., Parfenova V., Kostornova Т., Pavlova О., Terkina I., Belkova N. Biodiversity of microbial community in Lake Baikal. // VIII INTECOL International Congress of Ecology: Proceeding of conference. - Seoul, Korea, 2002. P. 57.

14. Parfenova V., Belkova N.. Kostornova T. Investigation of microorganisms of Lake Baikal: methods, approaches and results. // The 3rd International Symposium on Ancient Lakes: speciation, development in time and space, natural history: abstr. of conference. - Irkutsk, 2002. P. 131.

15. Белькова Н.Л.. Парфенова В.В., Максименко С.Ю., Захарова Ю.Р. Молекулярно-

биологические исследования микробного сообщества оз. Байкал. // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе: Материалы российской научно-практической конференции. - Иркутск, 2002. С. 87-88.

16. Парфенова В.В., Белькова Н.Л.. Максименко С.Ю., Захарова Ю.Р., Никулина И.Г., Поддубняк Н.Ю. Изучение видового состава культивируемых гетеротрофных микроорганизмов оз. Байкал. // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе: Материалы российской научно-практической конференции. - Иркутск, 2002. С. 117-118.

17. Белькова Н.Л.. Парфенова В.В., Косторнова Т.Я., Денисова Л Л., Зайчиков Е.Ф. Характеристика биоразнообразия микробного сообщества водной толщи озера Байкал. // Микробиология. 2003. Т. 72. №2. С. 239-249.

18. Белькова Н.Л.. Дрюккер В.В., Хонг С.Х., Ан Т.С. Изучение состава водного бактериального сообщества озера Байкал методом гибридизации IN SITU. // Микробиология. 2003. Т. 72. №2. С. 282-283.

19. Paifenova V., Belkova N.. Zakharova Ju., Maksiraenko S. Description ofbiodiversity and enzyme activity of microbial community of Lake Baikal water mass. // The 1-st FEMS Congress of European microbiologists: Abstr. of conference. - Ljubljana, Slovenia, 2003. P. 229.

20. Белькова Н.Л.. Парфенова В.В., Косторнова Т.Я., Денисова Л.Я., Зайчиков Е.Ф. Филогенетическая идентификация и биоразнообразие микроорганизмов в глубинных слоях озера Байкал. // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ: Международный Байкальский симпозиум по микробиологии. - Иркутск, 2003. С. 12.

21. Парфенова В.В., Ан Т., Белькова Н Л Микробиальное сообщество озера Байкал как компонент экосистемы. // Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ: Международный Байкальский симпозиум по микробиологии. - Иркутск, 2003. С. 109.

»15896

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белькова, Наталья Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Лимнологические характеристики озера Байкал, обусловливающие особенности функционирования водной экосистемы

1.2. Развитие микробиологических исследований озера Байкал

1.3. Молекулярно-биологические методы в изучении состава и структуры микробных сообществ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Методы

2.2. Состав буферов и сред, использованных в работе

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Количественный анализ таксономического состава водного микробного сообщества озера Байкал

3.2. Изучение филогенетического разнообразия некультивируемых глубоководных микроорганизмов озера Байкал

3.3. Сопоставление результатов идентификации культивируемых гетеротрофных бактерий по морфо-биохимическим тестам и секвенированию гена 16S рРНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Таксономическое разнообразие микробного сообщества водной толщи озера Байкал"

Актуальность проблемы. Байкал - древнейшее из пресноводных озер мира, характеризующееся уникальными экологическими условиями существования водной экосистемы. Главнейшей особенностью химизма вод озера Байкал является их крайне низкая минерализация; суммарная концентрация растворенных солей составляет около 100 мг/л. Своеобразие гидрологических и гидрохимических факторов озера Байкал - большие глубины, длительный ледовый период, низкая температура воды в летний период даже в поверхностных слоях и постоянство в глубинной зоне озера, высокое содержание кислорода по всей толще воды, низкая концентрация органических веществ, - обуславливает специфические условия жизнедеятельности организмов. Бактериальные сообщества составляют важную часть экосистемы водоема. Несомненно, что микроорганизмы, населяющие воды Байкала, определенным образом адаптированы к существованию в такой среде. Идентификация бактерий и изучение особенностей их распространения в зависимости от экологических условий являются одними из ключевых задач в исследованиях состава и структуры микробных сообществ озера. Однако в то время как из других природных экосистем культивируется не более 10-15% от общей численности бактерий, из байкальской воды удается культивировать от 17 до 575 КОЕ/мл при общей численности 0.2 - 4.6x106 кл/мл, что составляет в среднем 0.5 — 0.8х 10"4 %. При этом существенная часть микробного сообщества озера остается неизученной. В данном случае большое значение приобретает использование методов молекулярной биологии, которые позволяют идентифицировать и выявлять отдельные бактериальные клетки непосредственно в природных образцах без культивирования.

Развитие молекулярной биологии как самостоятельной дисциплины, привело к возникновению новых направлений исследования не только отдельных бактериальных штаммов, но и микробного сообщества в целом. Путь от простого к более сложному прошла молекулярная микробиология в последние 15 - 20 лет. Накоплены обширные данные о различиях между гомологичными генами, лежащие в основе существующего разнообразия. Молекулярная идентификация микроорганизмов привела к возникновению нового понятия - филогенетическая таксономия. В настоящее время создан большой банк данных последовательностей рибосомальных генов, сравнительный анализ которых лежит в основе современной филогенетической классификации микроорганизмов. Этот банк данных включает в себя нуклеотидные последовательности не только культивируемых штаммов, но и последовательности, полученные молекулярными методами из различных природных сообществ. Построение филогенетических деревьев позволяет выявлять близкие и отдаленные группы микроорганизмов, составляющих природные микробные сообщества, восстанавливать возможные филогенетические связи между этими группами и, таким образом, делать заключение о родстве и вносить изменения в существующую классификацию микроорганизмов, проводить ее реконструкцию. Кроме того, в настоящее время проводится поиск наиболее достоверных маркерных белок-кодирующих генов для построения эволюционных взаимоотношений разных групп микроорганизмов. Сравнительно недавно широкое развитие получил такой метод, как гибридизация in situ, позволяющий выявлять отдельные бактериальные клетки непосредственно в природных образцах, и, следовательно, изучать состав природного микробного сообщества без культивирования. В основе этого метода лежат особые свойства рибосомальных генов, такие как, присутствие во всех микроорганизмах, высокая копийность, наличие как высококонсервативных, так и вариабельных фрагментов. Именно благодаря этим характеристикам и наличию большого банка данных их нуклеотидных последовательностей стал возможным расчет и использование групп-специфичных маркеров на отдельные таксономические группы, рода и виды бактерий. В настоящее время отработаны эффективные методы быстрой детекции многих патогенных и условно патогенных штаммов в медицинской микробиологии, патогенной микрофлоры в пищевых продуктах и питьевой воде. Кроме того, это направление нашло широкое развитие в экологической микробиологии при анализе состава природных микробных сообществ.

1. разработать эффективные методы выделения суммарной ДНК из природных образцов и из чистых культур микроорганизмов, подобрать оптимальные условия амплификации на консервативных бактериальных праймерах фрагмента гена 16S рРНК, обеспечивающие максимальное представительство последовательностей, имеющихся в природном образце, и определить их нуклеотидные последовательности;

2. провести количественный анализ распределения представителей основных филогенетических групп микробного сообщества в водной толще озера Байкал;

4. сопоставить результаты идентификации культивируемых микроорганизмов методами классической и молекулярной микробиологии.

Научная новизна. Впервые с использованием молекулярных методов доказано, что адаптационной особенностью водного микробного сообщества озера Байкал является наличие большого количества некультивируемых форм бактерий. На основании филогенетической идентификации этих последовательностей показано, что некультивируемые формы бактерий представляют не только покоящиеся стадии известных культивируемых бактерий, но и большое разнообразие не идентифицированных бактерий, которые являются характерными для экосистемы озера.

Практическая значимость. Широко распространенный метод молекулярно-биологических исследований адаптирован для изучения микробного сообщества водной толщи озера Байкал с учетом его экологических особенностей. Отработанный метод может быть применен для экологического мониторинга экосистемы озера, для быстрой диагностики состояния микробных сообществ. Полнота информации о составе микробных популяций имеет огромное практическое значение для выявления и выделения микроорганизмов, обладающих различными ферментативными активностями. Применение молекулярно-биологических методов для изучения филогенетического разнообразия байкальских микроорганизмов, соотнесение этих результатов с данными микробиологических исследований позволяет сформировать более полную картину разнообразия природного сообщества и функционирования экосистемы в целом, потому что позволяют учитывать не только культивируемые микроорганизмы. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК культивируемых и некультивируемых бактерий, 78 из них зарегистрированы в международном EMBL-банке данных и им присвоены следующие номера Х99983-Х99989, AJ222832-AJ222835, AJ222839-AJ222858, AJ289926-AJ289961, AJ289966-AJ289981. Эта информация может быть использована для конструирования групп- и видоспецифичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа состава водного микробного сообщества.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на международных конференциях: Второй и Третьей Верещагинских Байкальских конференциях, проходивших в Иркутске в октябре 1995 г. и августе 2000 г., на научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе», проходившей в Иркутске (март, 2002), на международных конференциях «Biodiversity in Ancient Lakes», проходивших в Японии (сентябрь, 1997) и Иркутске (сентябрь, 2002), на международных симпозиумах в Японии (сентябрь, 1998) и Корее (март, 2000), на VIII международном экологическом конгрессе INTECOL, проходившем в Сеуле, Корея (август, 2002), на I микробиологическом конгрессе европейского микробиологического общества FEMS, проходившем в Любляне, Словения (июнь-июль, 2003) и на международном Байкальском симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», проходившем в Иркутске (сентябрь, 2003). По материалам диссертации опубликована 21 работа (7 из них в рецензируемых журналах).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Предлагаемая диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (118 источников, из них 87 - зарубежных) и приложения. Объем работы составляет 109 страниц машинописного текста, включающего 6 таблиц, 15 рисунков и 1 приложение.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Белькова, Наталья Леонидовна

ВЫВОДЫ

4. К первой группе отнесены бактерии, которые переходят в некультивируемое состояние в результате адаптации к экстремальным условиям существования. Это бактерии родов Methylobacterium, Sphingomonas и Paenibacillus, которые впервые выявлены в составе микробного сообщества водной толщи озера, а также представители рода Caulobacter, описанные ранее только по морфологическим признакам.

6. Третья группа включает некультивируемые бактерии, которые широко распространены в водной толще озера Байкал, но показали низкую гомологию их нуклеотидных последовательностей с ближайшими родственниками из международного банка данных. Они представляют виды, характерные для экосистемы озера Байкал и могут быть эндемичными видами. 7. Установлено, что особенности существования микробных сообществ в олиготрофных условиях байкальских вод предполагают наличие адаптационных приспособлений у бактерий. Байкальские микроорганизмы обладают способностью переходить в некультивируемое (покоящееся) состояние.

Я хотела бы выразить сердечную благодарность научным руководителям к.б.н. В.В. Парфеновой и к.х.н. Е.Ф.Зайчикову за всестороннюю помощь в работе. Я очень благодарна ученому секретарю института к.б.н. Земской Т.И. за постоянную поддержку, понимание и мудрые советы. Я очень ценю помощь и поддержку в работе коллег по лаборатории: д.б.н. Дрюккера В.В., к.б.н. Денисовой Л.Я., Манаковой Е.Н., Захаровой Ю.Р., Максименко С.Ю., Косторновой Т.Я. и многих-многих других. Я очень благодарна своей семье за каждодневную помощь, теплую поддержку и доброе понимание.

Работа выполнялась при финансовой поддержке грантов РФФИ (1996-1997, 1997-1999, 1998-2000), частичной поддержке немецкого общества академических обменов и гранта корейского правительства на поддержание научных контактов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На первом этапе данной работы была проведена отработка методов выделения суммарной бактериальной ДНК из водных проб и подбор оптимальных условий проведения полимеразной цепной реакции, которые обеспечили максимальное представительство последовательностей, имеющихся в природном образце. Филогенетическую идентификацию полученных последовательностей проводили путем их сравнения с международным банком данных.

Изучение биоразнообразия микробного сообщества водной толщи озера Байкал молекулярно-биологическими методами с привлечением литературных данных, оценивающих внутривидовую и внутриродовую гомологию бактериальных последовательностей, показало, что нуклеотидные последовательности, полученные при анализе суммарной бактериальной ДНК, выделенной из глубоководной пробы воды с горизонта 1200 м центральной станции Южного Байкала, принадлежат бактериям родов Sphingomonas, Methylobacterium, Caulobacter и Paenibacillus. Следует отметить, что впервые в составе микробного сообщества водной толщи озера показано наличие бактерий родов Methylobacterium, Sphingomonas и Paenibacillus, которые ранее не были выделены и описаны методами культивирования, а представители рода Caulobacter были охарактеризованы только по морфологическим признакам.

Результаты сравнительного филогенетического анализа выявили в составе водного микробного сообщества большую группу последовательностей, имеющих гомологию с последовательностями некультивируемых бактерий, которые были получены аналогичными методами из других пресноводных и почвенных экосистем. Даже высокий процент гомологии с известными последовательностями из банка данных в этом случае не позволяет однозначно определить филогенетическое положение этих микроорганизмов. Необходимо отметить наличие таких бактерий с неясным филогенетическим положением в разных филогенетических группах. Они образуют кластеры в альфа-, гамма и дельта-подгруппах протеобактерий и широко представлены среди актинобактерий, планктомицетов, ацидобактерий и голофагов. Особо следует отметить, что эти бактерии повсеместно распространены в глубоководных слоях озера.

Для филогенетической идентификации культивируемых гетеротрофных бактерий был использован фрагмент гена 16S рРНК размером от 450 до 800 п.н., по которому ранее проводился анализ некультивируемого сообщества. Несмотря на наличие нескольких вариабельных районов, этот участок оказался не достаточно протяженным для корректной видовой идентификации бактерий рода Pseudomonas. Кроме того, при филогенетической идентификации байкальских микроорганизмов оказалась недостаточно нуклеотидных последовательностей отдельных бактериальных групп, которые в настоящее время представлены в банке данных, что затрудняет провести идентификацию по полученным нами последовательностям. Таким образом, среди культивируемых гетеротрофных микроорганизмов обнаружены представители, определение которых как по морфо-биохимическим тестам, так и по результатам филогенетического анализа затруднено. Несомненно, что они представляют ту часть микробного сообщества, которая является неизученной и, возможно, обитающей только в озере Байкал.

Для количественной оценки структуры бактериального водного сообщества был использован и метод флуоресцентной гибридизации in situ с групп-специфичными зондами. Не смотря на то, что в пробах байкальской воды обнаружены представители всех основных групп, эу бактериальным зондом выявляется не полное разнообразие бактериальных форм. Следует отметить, что нами получен высокий процент клеток, не гибридизующихся с известными зондами и составляющих группу «другие».

Все это говорит о том, что в микробном сообществе озера Байкал большую долю составляют микроорганизмы с неясным филогенетическим положением, определение которых проблематично по морфо-биохимическим тестам. Несомненно, что они являются редкими и характерными для экосистемы озера Байкал.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белькова, Наталья Леонидовна, Иркутск

1. Афанасьев А.Н. Водный баланс озера Байкал // Тр. Байкальской Лимнологической станции. 1960. - Т. 18. - С. 155-241.

2. Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Михайлова В.В., Недашковская О.К, Горшкова Н.М., Парфенова В. В. Распространение a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских и пресноводных микроорганизмов // Микробиология. 1994. Т. 63. №5. - С. 847-853.

3. Беликов С.И., Грачев М.А., Земская Т.И., Манакова Е.Н., Парфенова В.В. Определение таксономического положения бактерий из озера Байкал методом анализа последовательностей фрагментов // Микробиология. 1996. Т. 63. № 5. - С. 847-853.

4. Белых О.И., Заика Е.И., Березиков Е.В. Автотрофный пикопланктон озера Байкал // Сибирский Экологический журнал. 1999. № 6. - С. 631637.

5. Бондаренко Н.А., Гусельникова Н.Е. Продукция фитопланктона Южного Байкала // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. Науки. 1989. №1. - С. 7780.

6. Верхозина В.А. Микробиальные процессы круговорота азота в Байкале // Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. -Новосибирск: Наука, 1985. С. 33^2.

7. Вотинцев К.К., Мещерякова А.И., Поповская Г.И. Круговорот органического вещества в озере Байкал. Новосибирск: Наука, 1975. -189 с.

8. Грачев М.А. О современном состоянии экологической системы озера Байкал. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2002. - 156 с.

9. Дедков B.C., Репин В.Е., Речкунова Н.И., Дегтярев С.Х., Верхозина В.А., Виноградова Т.П. Выявление штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди водных микроорганизмов озера Байкал // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. Науки. 1990. Т. 1. - С. 35-37.

10. Дрюккер В.В., Штевнева А.И. Микробиологические исследования на Байкале // Путь познания Байкала. Новосибирск: Наука, 1987. - С. 156-163.

11. Дрюккер В.В., Косторнова Т.Я., Моложавая О.А., Афанасьев В.А. Оценка качества воды оз. Байкал по санитарно-бактериологическим показателям // География и природные ресурсы. 1993. Т. 1. - С. 6064.

12. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии Москва: Изд-во МГУ, 1976. С. 139-149.

13. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Горшкова Н.М., Романенко JI.A., Михайлов В.В., Елякова JI.A., Парфенова В.В. Распространение хитинразлагающих ферментов у морских и пресноводных микроорганизмов // Биология моря. 1992. Т. 3-4. - С. 69-75.

14. Кожова О.М., Казанцева Э.А. О сезонных изменениях численности бактериопланктона в водах озера Байкал. // Микробиология. 1961. Т.30. №1. - С.113-117.

15. Кузнецов С.И. Сравнительная характеристика биомассы бактерий и фитопланктона в поверхностном слое воды среднего Байкала // Труды Байкальской Лимнологической Станции АН СССР. 1951. Т. 13. - С. 217-224.

16. Лаптева Н.А. Видовая характеристика гетеротрофных бактерий в озере Байкал // Микробиология. 1990. Т. 59. № 3. - С. 499-506.

17. Максимова Э.А., Колесницкая Г.Н. К идентификации сапрофитной микрофлоры Южного Байкала // Новые материалы по фауне и флоре Байкала. Иркутск: Наука, 1976. - С. 74-79.

18. Младова Т.А. О качественном составе бактериопланктона // Труды Лимнологического института СО АН СССР. 1971. Т. 12. № 32. - С. 196-201.

19. Намсараев Б.Б., Дулов JI.E., Дубинина Г.А., Земская Т.И., Гранина JI.3., Карабанов Е.В. Участие бактерий в процессах синтеза и деструкции органического вещества в микробных матах озера Байкал // Микробиология. 1994. Т. 63. № 2. - С. 345-351.

20. Намсараев Б.Б., Дулов JI.E., Земская Т.Н., Карабанов Е.Б. Геохимическая деятельность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках озера Байкал // Микробиология. 1995(a) Т. 64. № 3. - С. 405-410.

21. Намсараев Б.Б., Дулов JI.E., Соколова Е.Н., Земская Т.Н. Бактериальное образование метана в донных осадках озера Байкал // Микробиология. 1995(6). Т. 64. № 3. - С. 411-417.

22. Намсараев Б.Б., Дулов JI.E., Земская Т.Н. Разложение целлюлозы в донных осадках озера Байкал. // Микробиология. 1995(b). Т. 64. №4. - С. 553-558.

23. Намсараев Б.Б., Земская Т.Н. Микробиологические процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал. Новосибирск: Издательство СО РАН Филиал «ГЕО», 2000. - 154 с.

24. Парфенова В.В. Количественная характеристика и сезонная динамика микроорганизмов, мобилизующих фосфаты в воде Байкала // Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. -Новосибирск: Наука, 1985. С. 42-55.

25. Парфенова В.В., Илялетдинов А.Н. Видовой состав фосформобилизу-ющих микроорганизмов, выделенных из воды и грунтов Байкала // Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. -Новосибирск: Наука, 1985. С. 55-64.

26. Поповская Г.И. Новый вид рода Synechocystis Sauv. в планктоне озера Байкал // Новости систематики низших растений. 1968. - С.3-5.

27. Романова А.П. Интенсивность развития бактериальной флоры на литорали озера Байкал (по пластинкам обрастания) // Микробиология. 1958. Т. 27. № 5. - С. 634-640.

28. Семенова Е.А., Кузнеделов К Д. Изучение видового разнообразия пикопланктона озера Байкал путем сравнительного анализа 5'-концевых участков генов 16S рРНК // Молекулярная Биология. 1998. Т. 32. №5.-С. 895-901.

29. Amann R.I., Krumholz L., Stahl D.A. Fluorescent oligonucleotide probing of whole cells for deteminative, phylogenetic, and environmental studies inmicrobiology // Journal of Bacteriology. 1990(b). - Vol. 172. - P. 762770.

30. Amann R.I., Lin C., Key R., Montgomery L., Stahl D.A. Diversity among Fibrobacter isolates: towards a phylogenetic classification // Systematic and Applied Microbiology. 1992. - Vol. 15. - P. 32-31.

31. Amann R. I. In situ identification of micro-organisms by whole cell hybridization with rRNA-targeted nucleic acid probes // Molecular Microbial Ecology Manual. Netherlands: Kluwer, 1995. - Vol. 3.3.6. - P. 1-15.

32. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiological Reviews. 1995. - Vol. 59. - P. 143-169.

33. Anzai Y., Kim H., Park J.-Y., Wakabayashi H., Oyaizu H. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. -2000.-Vol. 50.-P. 1563-1589.

34. Bahr, M., J. E. Hobbie, and M. L. Sogin. Bacterial diversity in an arctic lake a freshwater SARI 1 cluster // Aquatic Microbial Ecology. 1996. - Vol. 11. -P. 271-277.

35. Belykh O.I., Semenova E.A., Kuznedelov K.D., Zaika E.I., Guselnikova N.E. An eukaryotic alga from picoplankton of Lake Baikal: morphology, ultrastructure and rDNA sequence data // Hydrobiologia. 2000. - Vol. 435.-P. 83-90.

36. Blackstone G.M., Nordstrom J.L., Vickery M.C., Bowen M.D., Meyer R.F., DePaola A. Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichments by real time PCR // Journal of Microbiological Methods. -2003.-Vol. 53.-P. 149-155.

37. Bruce I.J. Nucleic acid amplification mediated microbial identification // Science Progress. 1993. - Vol. 77. - P. 183-206.

38. Chandler D.P., Fredrickson J.K., Brockman F.J. Effect of PCR template concentration on the composition and distribution of total community 16S rDNA clone libraries // Molecular Ecology. 1997. - Vol. 6. - P. 475^182.

39. Christensson M., Blackall L.L., Welander T. Metabolic transformations and characterization of the sludge community in an enhanced biological phosphorus removal system // Applied Microbiology and Biotechnology. -1998.-Vol. 49.-P. 226-234.

40. Christner B.C., Mosley-Thompson E., Thompson L.G., Reeve J.N. Isolation of bacteria and 16S rDNAs from Lake Vostok accretion ice // Environmental Microbiology. -2001. Vol. 3. - P. 570-577.

41. Costello A.M., Lidstrom M.E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - Vol. 65. - P. 5066-5074.

42. DeLong E.F., Wickham G.S., Pace N.R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells // Science. 1989. - Vol. 243.-P. 1360-1363.

43. Denner E.B., Kampfer P., Busse H.J., Moore E.R. Reclassification of Pseudomonas echinoides Heumann 1962, 343AL, in the genus

44. Sphingomonas as Sphingomonas echinoides comb. nov. // International Journal of Systematic Bacteriology. 1999. - Vol. 49. - P. 1103-1109.

45. Ehrich S., Behrens D., Lebedeva H., Ludwig W., Bock E.J. A new obligately chemolithoautotrophic, nitrite-oxidizing bacterium, Nitrospira moscoviensis sp. nov. and its phylogenetic relationship // Archive Microbiology. 1995. - Vol. 164. - P. 16-23.

46. Ellis R.J., Morgan P., Weightman A.J., Fry J.C. Cultivation-dependent and -independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil 11 Applied and Environmental Microbiology. 2003. -Vol. 69.-P. 3223-3230.

47. Evers S., Weizenegger M., Ludwig W., Schink В., Schleifer K.H. The phylogenetic positions of Pelobacter acetylenicus and Pelobacter propionicus 11 Systematic and Applied Microbiology. 1993. - Vol. 16. -P. 216-218.

48. Garcia-Martinez J., Acinas S.G., Anton A.I., Rodriges-Valera F. Use of the 16S-23 S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity // Journal of Microbiological Methods. 1999. - Vol. 36. - P. 55-64.

49. Giovannoni S.J., Turner S., Olsen G.J., Bams S., Lane D.J., Pace N.R. Evolutionary relationships among cyanobacteria and green chloroplasts // Journal of Bacteriology. 1988(a). - Vol. 170. - P. 3584-3592.

50. Giovannoni S.J., DeLong E.F., Olsen G.J., Pace N.R. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cells // Journal of Bacteriology. 1988(b). - Vol. 170. - P. 720-726.

51. Giovannoni S.J., Britschgi T.B., Moyer C.L., Field K.G. Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton // Nature. 1990. - Vol. 345. - P. 60-63.

52. Gloeckner F.O., Fuchs B.M., Amann R. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - Vol. 65. - P. 37213726.

53. Glockner F.O., Babenzien H.D., Amann R. Phylogeny and identification in situ of Nevskia ramose // Applied and Environmental Microbiology. 1998. -Vol. 64.-P. 1895-1901.

54. Goebel B.M., Stackebrandt E. Cultural and phylogenetic analysis of mixed microbial populations found in natural and commercial bioleaching environments // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - Vol. 60.-P. 1614-1621.

55. Gray N.D., Head I.M. Linking genetic identity and function in communities of uncultured bacteria // Environmental Microbiology. 2001. - Vol. 3. - P. 481-492.

56. Heyrman J., Swings J. 16S rDNA sequence analysis of bacterial isolates from biodeteriorated mural paintings in the Servilia tomb (Necropolis of

57. Carmona, Seville, Spain // Systematic and Applied Microbiology. 2001. -Vol. 24.-P. 417-422.

58. Para T.M., Nakatsu C.H., Pantea L., Alleman J.E. Phylogenetic analysis of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors treatingpharmaceutical wastewater // Applied and Environmental Microbiology. -2000. Vol. 66. - P. 3951-3959.

59. Nakabachi A., Ishikawa H., Kudo T. Extraordinary proliferation of microorganisms in aposymbiotic pea aphids, Acyrthosiphon pisum H Journal of invertebrate pathology. 2003. - Vol. 2. - P. 152-161.

60. Olsen G.J., Pace N.R., Nuell M., Kaine B.P., Gupta R., Woese C.R. Sequence of the 16S rRNA gene from the thermoacidophilic archaebacterium

61. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Coning. A laboratory Manual // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Vol. 2.-345 p.

62. Selenska-Pobell S., Flemming K., Tzvetkova Т., Raff J., Schnorpfeil M, Geissler A. Bacterial communities in uranium mining waste piles and their interactions with heavy metals // Uranium in the aquatic environments. -Springer, 2002. p. 455-464.

63. Sly L.I., Cox T.L., Beckenham T.B. The phylogenetic relationships of Caulobacter, Asticcacaulis, and Brevundimonas species and their taxonomic implications // International Journal of Systematic Bacteriology. 1999. - Vol. 49. - P. 483-488.

64. Snaidr J., Amann R., Huber I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria in activated sludge // Applied and Environmental Microbiology. 1997. - Vol. 63. - P. 2884-2896.

65. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial community by 5S rRNA sequences // Applied and Environmental Microbiology. 1985. - Vol. 49. - P. 1379-1384.

66. Stahl D.A., Flesher В., Mansfield H.R., Montgomery L. Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology // Applied and Environmental Microbiology. 1988. - Vol. 54. - P. 10791084.

67. Stahl D.A., Key R., Flesher В., Smit J. The phylogeny of marine and freshwater caulobacters reflects their habitat // Journal of Bacteriology. 1992. Vol. 174. -P. 2193-2198.

68. Stein L.Y., La Due M.T., Grundl T.J., Nealson K.H. Bacterial and archaeal populations associated with freshwater ferromanganous micronodules and sediments // Environmental Microbiology. 2001. - Vol. 3. - P. 10-18.

69. Stein L.Y., Jones G., Alexander В., Elmund K, Wright-Jones C., Nealson K.H. Intriguing microbial diversity associated with metal-rich particles from a freshwater reservoir // FEMS Microbiology Ecology. 2002. V. 42. № 3. -C. 431-440.

70. Turner S., Burger-Wiersma Т., Giovannoni S.J., Mur L.R., Pace N.R. The relationship of a prochlorophyte Prochlorothrix hollandica to green chloroplasts // Nature. 1989. - Vol. 337. - P. 380-382.

71. Urbach E., Vergin K.L., Young L., Morse A., Larson G.L., Giovannoni S.J. Unusual bacterioplankton community structure in ultra-oligotrophic Crater Lake // Limnological Oceanography. 2001. - Vol. 46. - P. 557-572.

72. Wang G.C., Wang Y. The frequency of chimeric molecules as a consequence of PCR co-amplification of 16S rRNA genes from different bacterial species // Microbiology. 1996. - Vol. 142. - P. 1107-1114.

73. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community 11 Nature. 1990. -Vol. 345.-P. 63-65.

74. Webster N.S., Wilson K.J., Blackall L.L., Hill R.T. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile H Applied and Environmental Microbiology. 2001. - Vol. 67. - P. 434-444.

75. Wise M.G., McArthur J. V., Shimkets L.J. Bacterial diversity of a Carolina bay as determined by 16S rRNA gene analysis: confirmation of novel taxa // Applied and Environmental Microbiology. 1997. - Vol. 63. - P. 1505— 1514.

76. Woese C.R. Bacterial Evolution // Microbiological Reviews. 1987. - Vol. 51. -P. 221-271.

77. Woese C.R., Fox G.E. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5088-5090.

Информация о работе

Белькова, Наталья Леонидовна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2004
ВАК 03.00.16

Диссертация

Таксономическое разнообразие микробного сообщества водной толщи озера Байкал - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы