Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура микробных сообществ в барьерных зонах впадения основных притоков озера Байкал

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Структура микробных сообществ в барьерных зонах впадения основных притоков озера Байкал"

На правах рукописи

МАКСИМЕНКО Светлана Юрьевна

СТРУКТУРА МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ

В БАРЬЕРНЫХ ЗОНАХ ВПАДЕНИЯ ОСНОВНЫХ ПРИТОКОВ ОЗЕРА БАЙКАЛ

03.02.08-Экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 [лДР 1С.2

005012996

Иркутск-2012

005012996

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Лимнологическом институте Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Земская Тамара Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Саловарова Валентина Петровна

кандидат биологических наук

Косолапов Дмитрий Борисович

Ведущая организация: Дальневосточный Федеральный

университет

Защита состоится 13 апреля 2012 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: 666003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, ауд. 219.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИГУ по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Бульвар Гагарина, 24.

Отзывы просим направлять ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 1, биолого-почвенный факультет ИГУ. Тел./факс: (3952) 241855; e-mail: dissovet07@gmail.com. Автореферат разослан 12 марта 2012 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент

А.А. Приставка

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Устьевые области рек - место контакта и взаимодействия двух водных масс (речной и озёрной) с различными физическими, химическими и биологическими свойствами. Одновременно устья рек представляют собой природные барьеры на пути поступления стока воды, наносов, растворённых веществ речного происхождения в озёра. Между этими водными массами располагается довольно обширная зона смешения (т.н. барьерная зона), в пределах которой происходят наиболее активные процессы трансформации свойств речной воды, что наглядно показано на примерах зон впадения рек в моря и океаны (Liss, 1976; Лисицын, 1974, 1994; Емельянов, 1998; Гордеев, 2004; Лопатин и др., 2000). Подобные процессы происходят и в районах впадения рек в пресноводные водоёмы (Kenzaka et al., 1998; del Giorgio et al., 2002).

В процессах трансформации свойств воды большая роль принадлежит микробным сообществам, которые осуществляют круговорот биогенных веществ, обеспечивают функционирование пищевой цепи, благодаря чему органическое вещество вновь вовлекается в пищевые цепи водной толщи. В барьерных зонах бакгериопланктон обеспечивает деструкцию 40-60% органического вещества водной толщи (Woodwell et al., 1973; Fuhrmam et al., 1982; Kirchman et al., 1985; Виноградов, 1987; и др.). Микроорганизмы осуществляют до 30-75% круговорота азота, показана их существенная роль и в преобразованиях соединений фосфора (Sorokin, 1971; Jackson, 1985).

Воды крупных притоков оз. Байкал (Селенга, Верхняя Ангара, Баргузин и др.) отличаются от вод Байкала по содержанию взвешенных и органических веществ, растворённых солей, биогенных элементов и планктонных организмов. В зоне смешения речных и озёрных вод отмечается постепенная смена речного комплекса водорослей на озёрный, увеличивается численность фитопланктона и его первичная продукция (Вотинцев и др., 1963, 1965; Шимараев, 1971; Поповская, 1975; Богданов, 1978; Тарасова, 1992; Сороковикова и др., 2000, 2006). Общая численность микроорганизмов, численность органотрофов и бактериальная активность (гетеротрофная ассимиляция углекислоты) также претерпевают изменения в этих зонах (Максимов и др., 2002). Выполненные ранее микробиологические работы ограничивались определением количественных показателей бактериопланктона, а его филогенетический состав и таксономическое разнообразие оставались неисследованными. В связи с этим была поставлена цель работы:

Исследовать особенности количественной и филогенетической структуры микробных сообществ в барьерных зонах впадения трёх наиболее крупных притоков оз. Байкал и установить связь с некоторыми экологическими факторами. Чадачи исследования:

1. Исследовать особенности распределения общей численности микроорганизмов, культивируемых органотрофных бактерий и гетеротрофную ассимиляцию углекислоты в зонах впадения рек и взаимосвязь данных параметров с экологическими характеристиками.

2. Оценить состояние водных экосистем барьерных зон впадения по количественным показателям бактериопланктона,

3. Провести количественную оценку распределения представителей основных филогенетических классов и групп микроорганизмов в зонах впадения крупных рек в оз. Байкал и оценить их вклад в структуру микробных сообществ.

4. Исследовать таксономический состав микроорганизмов, входящих в состав микробных сообществ изучаемых районов сравнительным анализом структуры нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 168 рРНК.

Научная новизна: Впервые исследована филогенетическая структура микробных сообществ основных притоков оз. Байкал, оценен вклад различных классов и групп микроорганизмов в структуру сообществ.

Выявлены особенности распределения доминирующих представителей микробного сообщества с учётом конкретных экологических факторов, установлены наиболее значимые таксоны микроорганизмов в зонах с высокой функциональной активностью.

Получен банк данных рибосомальных последовательностей некультивируемых микроорганизмов, выделенных из водной толщи зон смешения речных вод с озёрными.

Практическая значимость. Проведённые комплексные исследования зон впадения крупных рек в оз. Байкал дают возможность оценить состояние бактериопланктона в данных зонах в современный период, выявить изменения в количественных показателях структуры микробных сообществ по сравнению с отмечаемыми ранее (База данных «Бактериопланктон р. Селенги, ее дельты и барьерной зоны Селенгинского мелководья оз. Байкал» - свидетельство № 2006620011 Роспатент РФ).

Данные по общей численности микроорганизмов, численности органотрофов и их соотношение позволяют охарактеризовать качество воды при различных гидрологических условиях, установить зоны, где происходят процессы деструкции органического вещества. Результаты работы могут быть использованы для оценки современного состояния микробных сообществ приустьевых зон и учтены при разработке рекомендаций по охране озера Байкал.

Выявленные таксоны микроорганизмов, доминирующие в зонах с наибольшей функциональной активностью, характеризуются как активные деструкторы органического вещества и различных химических соединений, поступающих с речного водосбора. Среди этих групп можно более целенаправленно вести поиск активных штаммов микроорганизмов для биотехнологических целей.

Полученная в данной работе библиотека последовательностей фрагментов гена 16Б рРНК (Ж255165-Ж255180) пополняет банк известных байкальских последовательностей и может быть использована для конструирования специфичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа структуры водного микробного сообщества.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. В барьерных зонах впадения крупных притоков оз. Байкал основные структурные показатели микробных сообществ (общая численность микроорганизмов, численность культивируемых органотрофных бактерий и вклад ЕиЬас1епа в ОЧМ) коррелируют с температурой воды. Характер распределения данных показателей зависит от гидрологических и геоморфологических особенностей района.

2. Количественная структура микробных сообществ свидетельствует о стабильности качества вод в барьерных зонах основных притоков оз. Байкал.

3. В филогенетической структуре микробных сообществ зон впадения доминируют ЕиЬас1епа, АгсИаеа характеризуются минорным вкладом. В устьях рек преобладают Су1орУш£а-Р1тоЪас1егш, среди ЕиЬас!епа с различным

вкладом детектируются основные классы протеобактерий: Alpha-, Beta-, Gammaproleobacteria. При удалении от устья реки изменяется соотношение классов Proteobacteria, в зоне смешения доминируют представители филума Actinobacleria, в 7 км от устья - Planctomyces.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на российских и международных конференциях и совещаниях: FEMS Congress of European Microbiologists (Slovenia, 2003); на трёх Международных байкальских Симпозиумах «Микроорганизмы в экосистемах озёр, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2004, 2008, 2011); The First Baikal Workshop on Evolutionary Biology (Irkutsk, 2004); на IV и V Верещагинских Байкальских конференциях (2005, 2010); «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (Улан-Удэ-Улан-Багор, 2004); «Основные факторы и закономерности формирования дельт и их роль в функционировании водно-болотных экосистем в различных ландшафтных зонах» (Улан-Удэ, 2005); на IX Съезде Гидробиологического общества РАН (Тольятти, 2006); III Международная научная конференция «Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды» (Нарочь-Минск, 2007); 1st International Symposium «Use of algae for monitoring rivers» (Luxembourg, 2009); lsl International Conference «Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook» (Mongolia, 2010).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 27 научных работ, из них 7 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК, 1 глава в совместной монографии и 18 тезисов конференций. Российским агентством по патентам зарегистрирована база данных «Бакгериопланктон р. Селенги, ее дельты и барьерной зоны Селенгинского мелководья оз. Байкал» (свидетельство № 2006620011 РОСПАТЕНТ РФ. Дата регистрации 10.01,2006г.).

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам НИР в отделе микробиологии Лимнологического института СО РАН, в рамках базовых проектов и проектов по программе Президиума РАН. Фактические данные получены автором при его непосредственном участии в экспедиционных и лабораторных работах, включая отбор проб, подготовку специальных сред, реактивов, анализ и обобщение полученных результатов. Измерение температуры и удельной электропроводности воды проведено сотрудником лаборатории гидрологии и гидрофизики н.с. В.Г. Ивановым, гетеротрофная ассимиляция углекислоты оценена сотрудником Института общей и экспериментальной биологии СО РАН к.б.н., н.с. С.П. Бурюхаевым. Секвенирование проведено в ЦКП «Секвенирование ДНК» (г. Новосибирск).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, содержит 30 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 177 наименования, из которых 91 - отечественных и 86 - зарубежных изданий.

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Т.И. Земской за научное руководство и поддержку в работе, сотрудникам отдела микробиологии за всестороннюю помощь, а также сотрудникам лаборатории гидрохимии: к.г.н. Л.М. Сороковиковой, к.г.н. И.В. Томберг, сотрудникам лаборатории гидрологии и гидрофизики: д.г.н. М.Н. Шимараеву, к.г.н. В.Н. Синюковичу, н.с. В.Г. Иванову, сотруднику лаборатории геносистематики н.с. Т.И. Трибой.

Содержание работы

Глава I. Обзор литературы

Приведены литературные данные по выполненным ранее исследованиям зон впадения рек в «приёмный водоём». Большое количество работ посвящено зонам впадения рек в солёные водоёмы - моря и океаны. Освещены факты применения молекулярно-биологических подходов для оценки структуры микробных сообществ и описания их таксономического состава.

Дана физико-географическая характеристика районов исследования, рассмотрены гидрологические особенности зон впадения основных притоков Байкала и обобщены результаты по микробиологическим исследованиям, проведённым ранее в данных зонах впадения.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Фишко-химическая характеристика объектов исследования

В качестве объектов были исследованы микробные сообщества барьерных зон впадения крупных притоков оз. Байкал - рр. Селенга, Верхняя Ангара и Баргузин.

Река Селенга является самым крупным притоком оз. Байкал. В среднем за год она приносит около 30 км3 воды, что составляет половину всего притока в озеро. При впадении в Байкал р. Селенга образует обширную дельту площадью около 1800 км2.

Река Верхняя Ангара - второй по величине приток оз. Байкал, впадает в залив Ангарский сор, образуя обширную дельту с множеством проток, рукавов и озер-стариц (Ресурсы ..., 1973). В отличие от Селенгинского мелководья и Баргузинскош залива, где глубины в приустьевой области не превышают 50 м, в зоне смешения вод р. Верхняя Ангара уже в 2 км от берега глубина достигает 200 и более метров.

Река Баргузин - третий по величине приток оз. Байкал. Воды р. Баргузин непосредственно поступают в Баргузинский залив, а не проходят по многочисленным протокам дельты, как в зонах впадения рек Селенга и Верхняя Ангара. Изолированность вод залива от открытых вод озера предопределяет особенности распространения поступающих речных вод.

В весенне-летний период во всех барьерных зонах впадения отмечается развитие весеннего термобара, препятствующего свободному прохождению речных вод до акватории озера (Шимараев и др., 2000; Парфёнова и др., 2000; Шерстянкин и др., 2007).

Методы исследования

Температура и удельная электропроводность воды измерялась от поверхности до дна высокоточным CTD-зондом MCTD3 (Falmouth Scientific Inc., США) с точностью ±0.005°С и 0.0003 S/m. Органотрофные микроорганизмы культивировали на среде РПА:10 (Романенко и др., 1974). Функциональная активность микробных сообществ была определена радиоуглеродным методом по скорости гетеротрофной ассимиляции углекислоты (Романенко и др., 1974; Максимова и др., 1989). Определение общей численности микроорганизмов (ОЧМ) проводилось окрашиванием фильтров с пробами флюорохромным красителем ДАФИ (4,6-диамидино-2-фенилиндол), которые просматривались под эпифлюоресцентным микроскопом Olympus (Япония) с использованием автоматической системы подсчёта (Дроздов и др., 2006).

Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) с олигонуклеотидными зондами, мечеными флюоресцентным красителем - СУЗ, осуществлялась по стандартной методике, предложенной ранее (Glockner et al., 1999). Выделение ДНК и амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике, предложенной ранее (Денисова и др., 1999). Трансформацию и клонирование выполняли по стандартной методике (Sambrook et al., 1989). Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) проводился согласно методике (Overmann et al., 1999; Scliauer et al., 2000). Для сравнительного анализа полученных последовательностей использовали пакет программ BLASTA (Altschul et al., 1997) и ClustalW (Higgins et al., 1994). Филогенетический анализ выполняли с помощью пакета программ TREECON W (Van de Peer et al., 1994) и Mega ver. 5.01, Neighbor-Joining кластерного метода и Kimura two-parameters алгоритма. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в GenBank под номерами JN255165-JN255180. Статистическая обработка данных была проведена по стандартным методикам (Рождественский, Чеботарев, 1974) с использованием программного обеспечения Microsoft Excel для Windows 2003. Выводы сделаны с учётом уровня значимости р=0.05. Анализ многомерных данных проведён с применением метода главных компонент - principal component analysis (РСА) (Gorban et al., 2007) с использованием программы STATISTICA для Windows.

Глава 3. Структура микробных сообществ в барьерной зоне впадении р. Селенга

Температурный режим Июль 2006 г. характеризовался наиболее высокими значениями температуры воды в данном районе. В устье реки температура воды от поверхности до дна составляла 19.6°С, снижаясь по направлению в озеро до 7-8°С. Температура воды в начале июня 2007-2008 гг. была ниже - от 16°С в устье реки, постепенно снижаясь до 7-8°С на расстоянии 3 км от устья. Однако, если в 2006 г. тёплые речные воды были равномерно распределены по поверхности, то в последующие - холодный фронт озёрных вод не давал речным водам проникать вглубь озера. Подобное распределение температуры создавало условия для формирования и развития весеннего термобара -явления, типичного для всех озёр умеренных широт.

РяССТОЯНИС ОТ VI II.И КМ РЯСС IIIИIIIIс от устья, км Расстояние от устья, км

Рис. 1. Распределение температуры в барьерной зоне впадения р. Селенга в оз. Байкал в 2006-2008 гг.

I ^¿кЬп JnlctUnl« ел ко koii i.1

jC»0i'(ii IH(0K«t Me.JKOWhO^cjllHiiii I

Структурно-функциональная характеристика микробных сообществ в зоне впадения р. Селенга Основные микробиологические параметры структуры микробных сообществ зоны впадения р. Селенга представлены в табл. 1.

В июле 2006 г. и июне 2007 г. в данной зоне наиболее высокие значения ОЧМ регистрировались на расстоянии от 3 до 7 км от устья реки (3.6±0.21 и 3.20±0.23 млн.кл/мл, соответственно). Это, скорее всего, обусловлено тем, что весенний комплекс водорослей в открытом озере уже отвегетировал и происходило его разложение микроорганизмами. В 2008 г. максимумы ОЧМ отмечены в устьевой части реки, в зоне формирующегося термобара - 1.94±0.05 млн.кл/мл, распределение её коррелировало с температурой воды.

Таблица 1

Температура воды и микробиологические показатели в барьерной зоне впадения р. Селенга

в оз. Байкал в 2006-2008 гг.

Год Место отбора проб Т,°С ОЧМ, Органотрофные Гетеротрофная

отбора млн.кл/мл микроорганизмы ассимиляция

проб КОЕ/мл углекислоты, мкгС/л-суг

2006 устье р. Селенга, 0 м 19.6 2.40±0.09 645±112 6.04

устье р. Селенга, 4,5 м 19.6 1.60±0.07 395±78 6.04

3 км, 0 м 9.2 2.40±0.09 388±13 3.82

3 км,17 м 5.3 2.00±0.10 231±25 2.95

7 км, 0 м 7.5 2.40±0.09 114±10 3.21

7 км, 35 м 4.8 3.60±0.21 83±12 2.76

2007 устье р. Селенга, 0 м 16.2 1.50±0.07 2200±117 X

устье р. Селенга, 4,5 м 9.4 0.90±0.06 2270±232 X

3 км, 0 м 8.4 1.80±0.01 490±40 X

3 км,17 м 5.6 1.90±0.10 940±61 X

7 км, 0 м 6.4 3.20±0.23 170±28 X

7 км,35 м 4.1 3.00±0.17 50±9 X

2008 устье р. Селенга, 0 м 14.4 1.94±0.05 124±43 X

устье р. Селенга, 4,5 м 14.0 1.65±0.07 88±21 X

3 км, 0 м 5.9 1.46±0.05 115±19 X

3 км, 17 м 5.4 1.58±0.07 69±12 X

7 км, 0 м 4.5 0.84±0.04 21±5 X

7 км, 35 м 4.4 0.71±0.02 8±3 X

Примечание: х - не определяли.

Известно, что важным фактором, влияющим на развитие органотрофных микроорганизмов можно считать легкоокисляемое органическое вещество, поступающее с речного водосбора и автохтонное органическое вещество, продуцируемое водорослями (Кузнецов с соавт., 1963; Максимова с соавт., 1989). В 2006-2008 гг. максимумы численности органотрофных бактерий вьивлялись в устье р. Селенга в поверхностных слоях воды: в 2006 г. - до 645±112 КОЕ/мл, в 2007 г. -2270±232 КОЕ/мл, в 2008 г. - 124±43 КОЕ/мл. Следует отметить, что численность органотрофов положительно коррелировала с показателями температуры в данном районе, при снижении температуры до 4.0°С численность органотрофов уменьшалась в 7-10 раз.

Филогенетическая структура микробных сообществ

Оценку разнообразия и численности метаболически активных представителей отдельных филогенетических групп микроорганизмов в водной толще барьерных зон впадения проводили с помощью метода FISH с рРНК-специфичными флюоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами. Показано, что основным компонентом структуры микробных сообществ являлись Eubacteria. Они давали максимальный вклад в устьевой зоне впадения р. Селенга до расстояния 3 км - 50-56% от ОЧМ. По мере удаления от устья реки до расстояния 7 км их вклад снижался до 30-44% от ОЧМ. Полученные нами результаты сопоставимы с данными, приводимыми для пресноводных водоемов, в т.ч. отмеченными ранее в пелагиали оз. Байкал - 43-59% (Glockner et al., 1999).

Для исследования микробных сообществ водной толщи барьерных зон был использован зонд на представителей Archaea, как одного из компонентов микробной структуры (Pernthaler et al., 1998). В барьерной зоне впадения р. Селенга микроорганизмы, относящиеся к домену Archaea, были выявлены в минорных долях (до 4.5% от ОЧМ) на расстоянии 7 км от устья реки.

Наибольшие изменения в структуре микробного сообщества зоны впадения р. Селенга, образующей дельту, отмечались в устьевой зоне до расстояния 3 км. В микробной структуре на этом расстоянии преобладали представители Cytophaga-Flavobacterium (7% от ОЧМ), Actinobacteria (до 12% от ОЧМ), Alphaproteobacteria (11-22% от ОЧМ) и Gammaproteobacteria (15-17% от ОЧМ). В 2007 г. здесь же детектировались микроорганизмы классов Betaproteobacteria (15% от ОЧМ) и Gammaproteobacteria (15-17% от ОЧМ). Стоит отметить, что микроорганизмы, принадлежащие таксонам Actinobacteria и Cytophaga-Flavobacterium, играют существенную роль в микробном сообществе, минерализуя весьма устойчивые и труднодоступные для других бактерий органические вещества, которые попадают в водоем из окружающей среды или образуются при отмирании фитопланктона и высшей водной растительности (Горленко и др., 1977; Peczynska-Czoch et al, 1988; Crawford et al, 1993; Jiang et al, 1996). Учитывая, что с речного водосбора поступает большое количество органики различной природы, в т.ч. трудноразлагаемой, развитие в пределах приустьевой зоны бактерий перечисленных филогенетических таксонов вполне закономерно.

По мере смешения речных вод с озёрными, в структуре микробного сообщества отмечался более низкий вклад микроорганизмов, доминирующих на мелководье, за исключением представителей Betaproteobacteria, доля которых незначительно снижалась до 11-14% от ОЧМ. К данному классу микроорганизмов относится большинство групп облигатных и факультативных микроорганизмов с разными типами метаболизма (хемолитотрофы, фотосинтетики, паразиты).

На расстоянии 7 км от устья в филогенетическую структуру сообщества также основной вклад вносили планктонные микроорганизмы класса Betaproteobacteria (до 15% от ОЧМ), отмечено увеличение доли представителей Planctomyces до 7%. Микроорганизмы данного филума характеризуются как облигатные гетеротрофные аэробы, способные развиваться при концентрациях органических источников углерода менее 0.1% (Заварзин и др., 2001).

Таксономическое разнообразие микроорганизмов в барьерной зоне впадения р. Селенга

Для исследования таксономического разнообразия микробного сообщества зоны впадения р. Селенга был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 168 рРНК.

,-—-1

устье 52

СуипоЬаЫегш

. УеггисописгоЬш

ПеШргоиоЬаМегш Л !рИ ¡1рго1еоЬис1ег1ц

АсйпоЬасгегш

~ Езсксг'кк'ш сЫ1

,_00198157 АсИттоЬас1ег хуЬзохШт

Моо 3 км от устья 101

Т-|, РМ208^181 Ро!упис1еоЬас1ег ер.

о»! Хв426572 РЫупискоЬааег зр.

АВ376661 Виг/ЛоШепасеае ВасКгшт ^

Ве1арго!еоЬас&гш

Рис.2. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 163 рРНК микроорганизмов, изолированных из водной толщи барьерной зоны впадения р. Селенга. Масштаб соответствует 1 нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов.

Из суммарной ДНК водной толщи устья р. Селенга и на 3 и 7 км было получено 82 клона. Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (рис. 2) выявил 10 таксономических групп бактерий: Alpha-, Beta-, Deltaprateobacteria, Actinobacteria, Green Sulfer Bacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Cyanobacteria, Planctomyces, Fibrobacteres и Verrucomicrobia. Наиболее представительны оказались микроорганизмы, принадлежащие филумам Actinobacteria (бактерии с высоким содержанием Г+Ц пар) и Cyanobacteria, а также классу Betaproteobacteria. Следующей по разнообразию клонов была группа CFB. Сравнительный анализ фрагментов гена 16S рРНК показал, что в составе микробного сообщества треть клонов принадлежит некультивируемым бактериям, широко распространенным в водных экосистемах. Ближайшие родственники некультивируемых бактерий были изолированы из осадков и воды рек Китая, водной толщи пресноводных озер Европы, ледников Антарктиды и Делаверского и Чесапикского заливов США (Zeng et al., 2006; Elsaied et al., 2007, Pronk et al., 2008; Shaw et al., 2008, и др.). Особо следует отметить большое количество последовательностей, проявляющих наибольшее сходство с последовательностями цианобактерий из разных пресноводных озёр (до 99-100%). На филогенетическом дереве цианобактериальный кластер выявил два ветвления, в одном оказались клоны, полученные в устье р. Селенги, сходные некультивируемым цианобактериям (7 клонов), в другом - клоны, выделенные в районе 3 км от устья реки, сходные известным пикоцианобактериям Synechococus (11 клонов) и Cyanobium (4 клона). Их большое разнообразие в водной толще Селенгинского мелководья согласуется с литературными данными, когда численность этой группы, в т.ч. представителей доминирующих родов. Synechococus и Cyanobium достигала 3 млн.кл/мл (Белых О.И. с соавт., 2007).

Глава 4. Структура микробных сообществ в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара

Температурный режим

В июле 2006 г. температура воды была максимальной на поверхности в устье реки (15.5°С), прогретые воды распространялись по поверхности на расстояние 7 км от устья (]2.2°С). Далее 3 км от устья температура в залегающих ниже поверхностного слоях водах по всей исследуемой трансекте соответствовала температуре озёрных вод (3.5°С). В июне 2007-2008 гг. в данном районе наблюдалось формирование весеннего термобара, что отмечалось и в других исследуемых районах. Стоит отметить необычность его локализации в зоне впадения р. Верхняя Ангара, по сравнению с описанными ранее случаями (Shimaracv et al., 1993). Активное вертикальное смешение в зоне до 3 км от устья привело к заглублению речных вод с температурой больше 4°С до глубин около 20 м. Контакт этих вод с холодными озерными, температура которых ниже температуры максимальной плотности (3.96°С), вызвало образование термобара не на поверхности, а на глубинах от 4 до 20 м, что предопределило особенности пространственной динамики распределения микроорганизмов.

Структурно-функциональная характеристика микробных сообществ в зоне впадения р. Верхняя Ангара Анализ пространственной динамики ОЧМ в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара (табл. 3) показал, что ОЧМ в 2006 г. была максимальна в устье реки -7.0±0.43-7.5±0.80 млн.кл/мл. Повышенные значения ОЧМ совпали с паводком (данные Росгидромет), обусловленным таянием снегов Северо-Муйского хребта. При удалении от устья реки ОЧМ снижалась в 3-7 раз, ее значения положительно коррелировали с температурой воды (0.72). Высокие значения ОЧМ в 2007-2008 гг. наблюдались в зоне термобара, на расстоянии от устья реки до 3 км - 2.4±0.09 и 1.86±0.03 млн.кл/мл, соответственно. Непосредственно в устье реки ОЧМ была несколько ниже и колебалась от 1.24±0.50 до 1.48±0.09 млн.кл/мл. На расстоянии 7 км от устья ОЧМ была наиболее низкой и по глубине варьировала незначительно, составляя 0.42±0.01 -0.50±0.04 млн.кл/мл. Её значения в 7 км от устья реки сопоставимы с величинами, характерными для вод открытого Байкала (Glöckner et al., 1999). Характер распределения ОЧМ в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара соответствовал отмечаемому в зоне впадения р. Селенга, обе реки при впадении в оз. Байкал образуют расширенные дельты.

Таблица 3

Температура воды и микробиологические показатели в зоне впадения р. Верхняя Ангара

в оз. Байкал в 2006-2008 гг._

Год отбора проб Место отбора проб Т,°С ОЧМ, млн.кл/мл Органотрофные микроорганизмы, КОЕ/мл Гетеротрофная ассимиляция углекислоты, мкгС/л-сут

2006 устье р. В.Ангара, 0 м 15.5 7.50±0.80 285±38 0.80

устье р. В.Ангара, 4 м 15.4 7.00±0.43 328±14 0.90

3 км, 0 м 14.9 3.00±0.10 733±П0 1.30

3 км,200 м 3.5 1.30±0.01 40±10 0.06

7 км, 0 м 12.2 1.00±0.08 440±23 0.40

7 км, 400 м 3.5 1.20±0.12 3±1 0.06

2007 устье р. В.Ангара, 0 м 11.5 1.24±0.50 2100±150 X

устье р. В.Ангара, 4 м 11.6 1.48±0.09 1142±225 X

3 км, 0 м 4.0 2.40±0.09 17±9 X

3 км, 200 м 3.6 2.00±0.10 200±62 X

7 км, 0 м 3.3 0.85±0.02 142±30 X

7 км,400 м 3.5 0.93±0.01 136±28 X

2008 устье р. В.Ангара, 0 м 16.0 1.37±0.41 98±15 X

устье р. В.Ангара, 4 м 11.5 1.44±0.01 90±23 X

3 км, 0 м 5.2 1.86±0.03 80±20 X

3 км,200 м 3.5 1.54±0.07 27±8 X

7 км, 0 м 3.3 0.42±0.01 12±5 X

7 км,400 м 3.5 0.50±0.04 8±3 X

Примечание: х - не определяли.

Характер распределения органотрофных бактерий в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара в июле 2006 г. и июне 2007-2008 гг. был схож. Численность их в 2006 г. в поверхностных и придонных слоях в устье реки составляла 285±38 и 328±14

КОЕ/мл, соответственно. Наиболее высокие значения численности органотрофов отмечались в поверхностных водах на расстоянии 3 км от устья - до 733±110 КОЕ/мл. В 2007 г. численность органотрофных бактерий в устье по сравнению с данными июля 2006 г. была выше в поверхностной воде в 9 раз, в придонной - почти в 4 раза. Возможно, подобное увеличение численности органотрофов в зоне от устья до расстояния 3 км связано с влиянием формирующегося термобара и концентрированием органотрофных бактерий в слое поступающей речной воды. В 2008 г. значения численности органотрофов были ниже отмечаемых в 2006-2007 гг., однако характер их распределения был такой же, как и в 2007 г (см. табл. 3). Коэффициенты корреляции между температурой воды и численностью органотрофных бактерий составляли 0.61-0.87.

Филогенетическая структура микробных сообществ Филогенетическая структура микробных сообществ барьерной зоны впадения р. Верхняя Ангара схожа с таковой в зоне впадения р. Селенга. Вклад Eubacteria в структуру сообществ составлял 58-75% от ОЧМ, Archaea - 2.5%-5.3%. В устьевой зоне реки до расстояния 3 км в микробном сообществе доминировали представители Cytophaga-Flavobacterium, Actinobacteria, Alpha- и Gammaproteobacleria. На расстоянии 7 км от устья реки преобладали Betaproteobacteria (до 13.6% ОЧМ), Gammaproteobacleria (17-20% от ОЧМ) и Planctomyces (6-8% от ОЧМ). Отмечено, что филогенетическая структура микробного сообщества на расстоянии 7 км от устья р. Верхняя Ангара схожа с наблюдаемой ранее на глубоководных станциях Южного и Среднего Байкала (Glöckner et al., 1999; Белькова и др., 2003). Возможно, это обусловлено наличием больших глубин (до 400 м) в этом районе.

Таксономическое разнообразие микроорганизмов в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара Из суммарной ДНК водной толщи устья р. Верхняя Ангара и на 3 и 7 км было получено 65 клопов. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей (табл. 3) выявил 8 таксономических групп бактерий: Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Cytophaga-Flavobacteria, Cyanobacteria и Firmicutes.

Среди полученных последовательностей 12 сходны с некультивируемыми бактериями, изолированными из рек и озёр США, пресноводных озёр Европы, ледников Гималаев (Crump et al., 2005; Salcber et al., 2007; Shaw et al., 2008). В отличие от водной толщи барьерной зоны впадения р. Селенга, в зоне впадения р. Верхняя Ангара отмечен менее разнообразный генетический состав микроорганизмов. Результаты прямого секвенирования свидетельствуют, что большинство последовательностей, выделенных из водной толщи зоны от устья реки до расстояния 3 км, сходны микроорганизмам класса Betaproteobacteria.

Именно эта зона характеризуется наибольшей плотностью органотрофных микроорганизмов, высокой функциональной активностью микроорганизмов и преобладанием микроорганизмов, обладающих высокой метаболической активностью. Интересно отметить, что часть полученных клонов близкородственны последовательностям бактерий, выделенным из вод речных систем р. Паркер (США), р. Богота (Колумбия), р. Ксао (Китай) и осадков р. Данубер (Германия).

Таблица 3

Таксономическая Число Ближайший гомолог Идентичность,

группа последовательностей по 16S рРНК (%)

А1рИарго1еоЬас1ег1а 1 Un. alphaproteobacteria 100

ВеШрго1еоЬас1егт 5 Un. betaproteobacteria 94-97

Variovorax sp. 93-96

1 Un. Rhodoferax 98

1 Polaromonas sp. 93

1 Un. Flexibacteriacea 98

1 Polinucleobacíer necessarius 89

1 Acidovorax sp. 96

Iron-reduction bacteria 98

1 Comamonadaceae 91

1 Un. Curvibacter 93

1 Un. Alcaligenaceae 95

Саттарго1еоЬас1ег1а 1 Pseudomonas fluorescens 95

1 Acinetobacter johnsonii 96

СРВ Flavobacteria 94-96

1 Un. Sphingobacteriales 86

Р1апсЮтусез 1 Un. Planctomycetales 98

Ас1тоЬас1епа Un. actinobacteria 93

1 Actinomycetales 95

1 Micrococcineae 92

СуапоЬас1епа 3 Un. Synechococcus 90-97

1 Synechococcussp. 89

РгтяШея 2 Un. Firmicutes 95-100

другие 12 Un. bacteria 81-97

Глава 5. Структура микробных сообществ в барьерной зоне впадения р. Баргузин

Температурный режим

Температура воды в районе впадения р. Баргузин в оз. Байкал в исследуемый период изменялась от 4 до 16°С. Характер распределения температуры подобен таковому в других исследуемых нами реках, с максимальными значениями в устье реки и постепенным снижением по направлению открытой части озера. В июне 20072008 гг. отмечалось «запирающее» действие весеннего термобара, препятствующего проникновению теплых баргузинских вод в воды залива.

Структурно-функциональная характеристика микробных сообществ в зоне впадения р. Баргузин В июле 2006 г., в период максимального прогрева воды по всей исследуемой трансекте, в зоне впадения р. Баргузин ОЧМ составляла 2.3±0.05-2.7±0.12 млн.кл/мл в поверхностных слоях воды от устья реки и до расстояния 7 км от устья, незначительно снижаясь (до 2.0±0.06 млн.кл/мл) к придонным слоям. Динамика ОЧМ в 2007 г. была схожа с таковой в 2006 г. (табл. 4), значения её составляли 1.30±0.17-

2.0±0.08 млн.кл/мл по всей исследуемой зоне, с максимумами на расстоянии от 3 до 7 км в слоях воды ниже глубины 15 м и вдоль склона дна. В 2008 г. наиболее высокие значения выявлялись от устья до расстояния 3 км (1.1±0.03-1.54±0.07 млн.кл/мл).

Исследования пространственной динамики численности органотрофных бактерий в районах впадения рек Селенга и Верхняя Ангара показали, что зоны с максимальной численностью данных бактерий регистрируются от устьев рек до расстояния 3 км. В барьерной зоне впадения р. Баргузин в июле 2006 г. отмечалась несколько иная картина. Максимумы численности органотрофов были зарегистрированы на расстоянии от 3 км до 7 км от устья (124±34-160±19 КОЕ/мл), что, скорее всего, связано с какими-то локальными изменениями в динамике водных масс. В июне 2007-2008 гг. в изучаемом районе наблюдалась та же картина распределения органотрофных бактерий, что и отмечаемая в зонах рр. Селенга и Верхняя Ангара.

В районах с максимальными значениями численности органотрофных бактерий были зафиксированы и наибольшие значения гетеротрофной ассимиляции углекислоты. Ее значения составляли до 6.04 мкгС/л-сут в зоне впадения р. Селенга, до 1.30 мкгС/л-сут в зоне впадения р. Верхняя Ангара и 0.516 мкгС/л'сут в зоне впадения р. Баргузин. Полученные данные заметно ниже величин, отмеченных ранее в исследуемых районах, когда значения гетеротрофной ассимиляции углекислоты в устьях рек и их приустьевых зонах составляли до 20 и 5 мкгС/л-сут, соответственно (Максимов и др., 1984, 2002). Возможно, эти различия обусловлены тем, что отбор проб проводился нами в июне, а вышеупомянутыми авторами - в августе.

Таблица 4

Температура воды и микробиологические показатели в барьерной зоне впадения р. Баргузин

в оз. Байкал в 2006-2008 гг.

Год Место отбора проб Т,°С ОЧМ, Органотрофные Гетеротрофная

отбора млн. кл/мл микроорганизмы ассимиляция

проб КОЕ/мл углекислоты, мкгС/л-суг

2006 устье р. Баргузин, 0 м 18.1 2.30±0.05 97Ш 0.157

устье р. Баргузин, 2 м 18.1 2.30±0.05 28±9 0.157

3 км, 0 м 16.3 2.70±0.12 28±12 0.269

3 км,12 м 13.7 2.00±0.06 230±2 0.280

7 км, 0 м 15.9 2.40±0.09 160±19 0.516

7 км,35 м 5.4 2,30±0.20 124±34 0.142

2007 устье р. Баргузин, 0 м 11.5 1.50±0.03 596±16 X

устье р. Баргузин, 2 м 11.5 1.30±0.17 536±59 X

3 км, 0 м 5.5 1,60±0.07 730±91 ' X

3 км,12 м 4.9 1.80±0.04 425±13 X

7 км, 0 м 4.4 1.70±0.08 813±54 X

7 км,35 м 3.8 2,00±0.08 125±9 X

2008 устье р. Баргузин, 0 м 16.0 1.10±0.03 384±65 X

устье р. Баргузин, 2 м 15.6 1.54±0.07 440±40 X

3 км,0 м 5.2 1.11±0.04 50±11 X

3 км, 12 м 3.5 0.63±0.07 110±23 X

7 км, 0 м 3.3 0.53±0.05 76±10 X

7 км, 35 м 3.4 0.86±0.01 34±6 X

Примечание: х - не определяли.

Филогенетическая структура микробных сообществ

Филогенетическая структура микробных сообществ барьерной зоны впадения р. Баргузин имела свои особенности. Так, в июле 2006 г. и июне 2007 г. суммарный вклад представителей исследуемых филогенетических классов и групп бактерий в микробную структуру устья р. Баргузин составлял не более 20%, несмотря на достаточно высокую численность Eubacteria (60-66% от ОЧМ). Скорее всего, микробное сообщество представлено группами микроорганизмов, не детектируемыми используемыми в работе рРНК-зондами. Вклад Archaea в ОЧМ Баргузинского залива составлял 6.0-8.5% от ОЧМ и сопоставим с отмечаемыми значениями на глубоководной станции Южного Байкала в 2005-2006 гг. (Максименко и др., 2008), где их доля составляла 6%, а в подлёдный период - до 10% от ОЧМ. В поверхностных водах морей и океанов в летний период Archaea могут достигать до 45% от ОЧМ (Pernthaler et al., 2002, 2005; Bouvier et al., 2003), в водах пресных водоемов - не более 6% (Pernthaler et al., 1998; Kenzaka et. al., 1998).

По мере смешения речных вод с озерными на расстоянии 3 км от устья р. Баргузин основной вклад в структуру сообщества вносили представители классов Alpha- и Gammaproteobacteria (5-7% и 9-10% от ОЧМ, соответственно). В этой же зоне были зафиксированы и повышенные значения вклада представителей Cytophaga-Flavobacteria - до 6-7% от ОЧМ. Betaproteobacteria распределялись равномерно на всех станциях исследуемой трансекты, составляя 10-16% от ОЧМ.

В июне 2008 г. в микробной структуре устья р. Баргузин доминировали Gammaproteobacteria - 18-19% от ОЧМ, выявлялись также представители Alphaproteobacteria, но не более 4% от ОЧМ. По мере удаления от устья снижался вклад микроорганизмов Gammaproteobacteria до 12-13% от ОЧМ и увеличивалась доля представителей Alphaproteobacteria и Actinobacteria (до 10% и 11% от ОЧМ, соответственно). В филогенетической структуре сообщества на расстоянии 7 км от устья реки преобладали микроорганизмы, принадлежащие Betaproteobacteria, Cytophaga-Flavobacteria - до 18% и 6.5% от ОЧМ, соответственно, и Planctomyces -8% от ОЧМ. Стоит отметить, что представители Planctomyces во все исследуемые годы распределялись так же, как описано для барьерных зон впадения рек Селенга и Верхняя Ангара. Возможно, это связано с их способностью выживать при небольших концентрациях органических веществ.

Установлено, что в июле 2006 г. и июне 2007 г. в барьерной зоне впадения р. Баргузин наибольшие изменения в структуре микробных сообществ происходят на расстоянии от 3 до 7 км от устья, в июне 2008 гг. - от устья до расстояния 3 км. Скорее всего, эти отличия связаны с геоморфологическими особенностями данного района, в т.ч. изолированностью вод Баргузинского залива от открытых вод оз. Байкал.

Оценка класса качества воды и состояния водных экосистем

В соответствии с ГОСТ 17.1.3.07-82 о правилах контроля качества воды водоемов и водотоков, по средним значениям ОЧМ, численности органотрофных бактерий и их соотношению дана оценка качества воды в исследуемых районах.

В июле 2006 г. и июне 2007-2008 гг. по показателям ОЧМ воды барьерных зон впадения pp. Селенга, Верхняя Ангара и Баргузин характеризовались как «умеренно загрязнённые» (III класс качества), а воды устьев рек Селенга и Верхняя Ангара в

июле 2006 г. как «загрязненные» (IV класс). Учет общей численности микроорганизмов в данной работе осуществлялся с использованием универсального красителя ДАФИ, а не эритрозина, как выполнялось ранее. Возможно, применение ДАФИ повлияло на увеличение значений ОЧМ. По численности органотрофных бактерий качество воды исследуемых зон определялось как «очень чистые» (I класс). Соотношение ОЧМ/численность органотрофов в барьерной зоне впадения р. Селенга составляет 0.40* 103-88.75* 103, р. Верхняя Ангара - 0.6-400.0* 103, р. Баргузин - 2.0996.4* 103. Согласно этому показателю воды барьерных зон pp. Селенга и Верхняя Ангара отнесены к промежуточному положению между «очень чистой» (I класс) и «чистой» (II класс), воды зоны впадения р. Баргузин - к «очень чистой» (I класс).

Корреляционный анализ данных, полученных во всех исследуемых районах впадения, показал значимые положительные коэффициенты между температурой, численностью органотрофов и долей Eubacteria.

Методом главных компонент (РСА) был проанализирован значительный массив данных по структуре микробных сообществ барьерных зон впадения рек. Установлено, что наиболее значимыми и важными компонентами, определяющими структуру микробных сообществ во всех барьерных зонах, являются численность органотрофных бактерий и доля Eubacteria в ОЧМ.

Выводы

1. В барьерных зонах впадения крупных притоков оз. Байкал в 2006-2008 гг. оценены основные структурные показатели микробных сообществ: ОЧМ, численность органотрофных бактерий и гетеротрофная ассимиляция углекислоты. Величины данных показателей сопоставимы с результатами исследований конца двадцатого века.

2. Наиболее высокие значения исследуемых параметров микробной структуры зарегистрированы в зоне от устья реки до расстояния 3 км. Здесь выявлены максимумы ОЧМ (до 7.50±0.80 млн.кл/мл), численности органотрофов (до 2270 КОЕ/мл) и гетеротрофной ассимиляции углекислоты (до 6.04 мкгС/л сут), которые достоверно коррелировали с температурой воды. В соответствии с ГОСТ 17.1.3.07-82, полученные данные характеризуют воды устьев рек как «умеренно загрязнённые» (III класс качества), воды барьерной зоны впадения -как «очень чистые» (I класс) и «чистые» (II класс).

3. В филогенетическую структуру микробных сообществ всех исследуемых зон основной вклад вносят представители Eubacteria (50-75% от ОЧМ), их максимальные значения выявлены в устьях рек, на расстоянии 7 км от устьев рек регистрируются представители Archaea, вклад которых составляет 4-8% от ОЧМ.

4. Установлено, что соотношение между другими таксонами микроорганизмов зависит от гидрологических и геоморфологических особенностей районов. В устьевых районах всех исследуемых зон впадения рек в микробной структуре преобладали Cytophaga-Flavobacterium и Actinobacleria, при удалении от устья отмечалось увеличение вклада Planctomyces.

5. В устьях рек Селенга и Верхняя Ангара, образующих дельты, значителен вклад Alpha- и Betaproteobacteria, по направлению к глубоководной части -Gammaproteobacteria. В зоне впадения р. Баргузин, не образующей дельты, на

устьевом участке доминировали Gammaproteobacteria, при удалении от устья -Alpha- и Betaproteobacteria.

6. Сравнительный анализ фрагментов гена 16S рРНК нуклеотидных последовательностей суммарной ДНК барьерных зон впадения крупных рек выявил представителей следующих таксономических групп: Alpha-, Beta-, Gamma-, Deltaproteobacteria, Actinobacteria, Green Sulfer Bacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bactero ides, Cyanobacteria, Planctomyces, Fibrobacteres, Verrucomicrobia, которые были детектированы и с помощью FISH-метода. Выделенные последовательности имели высокий процент сходства с представителями Cyanobacteria (до 99%), Actinobacteria (до 97%) и Betaproteobacteria (до 97%), выделенными из различных пресноводных экосистем.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи в рецензируемых журналах ui списка ВАК:

1. Активность щелочной фосфатазы и динамика фосфора р. Селенга /

С.Ю. Максименко [и др.] // Биология внутренних вод. - 2007. - № 4. - С. 9-14.

2. Анализ микробного сообщества желудка байкальского эндемика Epischura baicalensis с помощью метода флюоресцентной in situ гибридизации /

С.Ю. Максименко [и др.] // Гидробиол. журнал. - 2008. - № 5. - С. 78-82.

3. Изучение видового состава культивируемых гетеротрофных микроорганизмов /

B.В. Парфенова, Н.Л. Белькова, С.Ю. Максименко [и др.] // Биология внутренних вод. -2006.-№ 1.-С. 8-15.

4. Качество вод в дельте реки Селенги / Л.М. Сороковикова, А.К. Тулохонов,

C.Ю. Максименко [и др.] // География и природные ресурсы. - 2005. - № 1. -С. 73-80.

5. Компьютерная система учета изображений флюоресцентно-окрашенных бактерий / В.Н. Дроздов, В.Н. Сергеева, С.Ю. Макснменко, Т.И. Земская Н Микробиология. - 2006. - № 6. - С. 861- 864.

6. Микробное сообщество водной толщи на биогеохимическом барьере «река Селенга-озеро Байкал» / С.Ю. Максименко [и др.] // Микробиология. - 2008. -№ 5-С. 660-667.

7. Butina T.V. Phylogenese diversity of T4-like bacteriophages in Lake Baikal, East Siberia / T.V. Butina, O.I. Belykh, S.Y. Maksimenko, S.I. Belikov // Microbiology Letters. - 2010. - V. 309 - № 2. - P. 122-129.

Авторское свидетельство:

8. Пет. № 2006620011 Российская Федерация. Бактериопланктон р. Селенги, ее дельты и барьерной зоны Селенгинского мелководья оз. Байкал (БД «Бактериопланктон Селенги и ее дельты») / И.Г. Никулина, С.Ю. Максименко, Т.П. Лаврентьева - Заявка № 2005620278. Дата регистрации 10.01.2006г.

Глава в монографии:

9. Никулина И.Г. Микробиологическая характеристика вод р. Селенги и проток ее дельты / И.Г. Никулина, С.Ю. Максименко // Дельта реки Селенги -естественный биофильтр и индикатор состояния озера Байкал. Серия «Интеграционные проекты СО РАН». 2008. Вып. 15. - С. 202-205.

Прочие публикации:

1. Активность щелочной фосфатазы и динамика фосфора в воде дельты реки Селенги / С.Ю. Максименко [и др.] // Материалы международной конференции «Основные факторы и закономерности формирования дельт и их роль в функционировании водно-болотных экосистем в различных ландшафтных зонах». Улан-Удэ, 2005.-С. 91.

2. Активность щелочной фосфатазы как показатель обеспеченности водоема ■ фосфором / С.Ю. Максименко [и др.] // Материалы межрегиональной научно-

практической конференции, посвященной 90-летию со дня рождения проф. Гриневич А.Г. «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование». Иркутск, 2004. - С. 169-171.

3. Активность щелочной фосфатазы как показатель обеспеченности водоема фосфором / С.Ю. Максименко [и др.] // Четвертая Верещагинская байкальская конференция: тезисы докладов. Иркутск, 2005 г. - С. 118-119.

4. Анализ микробного сообщества желудков байкальского Epischura baicalensis методом флуоресцентной in situ гибридизации / С.Ю. Максименко [и др.] // Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». Саратов, 2007. - С. 76.

5. Влияние активности щелочной фосфатазы на изменение концентрации фосфора в воде и донных осадках дельты р. Селенга / С.Ю. Максименко [и др.] // Тезисы международной конференции: Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами. Улан-Удэ-Улан-Батор, 2004. - Т. 2. - С. 116-117.

6. Дельта р. Селенги - естественный биофильтр в экосистеме озера Байкала (проблемы дельтообразования и их эволюция) / А.К. Тулохонов, J1.M. Сороковикова, С.Ю. Максименко [и др.] // Четвертая Верещагинская байкальская конференция: тезисы докладов. Иркутск, 2005 г. - С. 197-198.

7. Изучение сезонной динамики состава бактериопланктона методом гибридизации in situ (FISH) / С.Ю. Максименко [и др.] // Международное рабочее совещание «Происхождение и эволюция биосферы» (ВОЕ). Новосибирск, 2005. - С. 252-253.

8. Максименко С.Ю. Активность щелочной фосфатазы как показатель экологического состояния водоёма / С.Ю. Максименко, И.В. Томберг, В.Г. Иванов // Материалы VI Международного симпозиума «Контроль и реабилитация окружающей среды». - Томск, 2008. - С. 121-122.

9. Максименко С.Ю. Анализ структуры бактериопланктона методом гибридизации in situ в районах оз. Байкал, разных по экологической обстановке / С.Ю. Максименко [и др.] // Молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2005. — С. 30.

10. Максименко С.Ю. Исследование микробных сообществ зон впадения крупных притоков в оз. Байкал / С.Ю. Максименко, Т.И. Земская // Пятая Верещагинская байкальская конференция: тезисы докладов. Иркутск, 2010.-С. 142-143.

11. Максименко С.Ю. Микробные сообщества барьерных зон озера Байкал / С.Ю. Максименко / IX Съезд Гидробиологического общества РАН. Тольятти, Тезисы докладов, 2006. - Т.2. - С. 9.

12. Микробное сообщество барьерных зон озера Байкал / С.Ю. Максименко [и др.] // Материалы III международной научной конференции «Озерные экосистемы:

Биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды». Минск-Нарочь, 2007.-С. 231-232.

13. Микробные сообщества барьерных зон озера Байкал / С.Ю. Максименко [и др.] // Материалы Второго Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ». Иркутск, 2007. - С. 146-147.

14. Никулина И.Г. Некоторые микробиологические показатели воды проток р. Селенги в мае-октябре 2002 г. / И.Г. Никулина, С.Ю. Максименко // Материалы Байкальского симпозиум по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ». Иркутск, 2003. - С. 102.

15. Трансформация вещества в системе р. Селенга - дельта - оз. Байкал / Л.М. Сороковикова, В.Н. Синюкович, С.Ю. Максименко [и др.] И Материалы международной конференции «Основные факторы и закономерности формирования дельт и их роль в функционировании водно-болотных экосистем в различных ландшафтных зонах». Улан-Удэ, 2005.-С. 125.

16. Maksimenko S.Y. Studies of the microorganisms associated with the silicious walls of the water body and of the bottom sediments of lake Baikal / S.Y. Maksimenko, A.V. Likhoshvay, T.I. Zemskaya // 19th International diatom symposium. Listvyanka, Russia, 2006.-P.96.

17. Plankton and water chemistry in the mixing zone of the Selenga river and Lake Baikal waters / T.I. Zemskaya, L.M. Sorokovikova, S.Y. Maksimenko [et al.] // 1st International Symposium «Use of algae for monitoring rivers». Abstract book. - Luxembourg, 2009. -P. 123.

18. Studies on microbial structure in lake Baikal water with fluorescence hybridization in situ (FISH) / S.Y. Maksimenko [et al.] // The First Baikal Workshop on Evolutionary Biology. Abstracts. Irkutsk, 2004. - P. 11-12.

Подписано к печати 11.03.2012 г. Формат 60*84/16. Объем 1,2 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 550. Издательство Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН. 664033 г. Иркутск, ул. Улан-Баторская, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максименко, Светлана Юрьевна, Иркутск

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

ЛИМНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

Сибирского отделения Российской академии наук

Структура микробных сообществ

в барьерных зонах впадения основных притоков озера Байкал

Специальность 03.02.08 - экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

61 12-3/814

На правах рукописи

МАКСИМЕНКО

Светлана Юрьевна

Научный руководитель: доктор биологических наук Земская Т. И.

Иркутск - 2012

Оглавление

Введение..................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Исследования микробных сообществ в барьерных зонах..........10

1.2. Барьерные зоны «река - оз. Байкал».....................................15

1.3. Микробиологические исследования зон впадения рек

в оз. Байкал....................................................................17

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Физико-химическая характеристика объектов исследования

2.1.1. Зона впадения р. Селенга...................................................21

2.1.2. Зона впадения р. Верхняя Ангара........................................23

2.1.3. Зона впадения р. Баргузин.................................................24

2.2. Методы исследования.......................................................26

Глава 3. Структура микробных сообществ в зоне впадения

р. Селенга в оз. Байкал...........................................................36

3.1. Температурный режим........................................................37

3.2. Структурно-функциональная характеристика микробных сообществ в барьерной зоне впадения р. Селенга......................38

3.3. Филогенетическая структура микробных сообществ...................43

3.4. Таксономическое разнообразие микроорганизмов

в барьерной зоне впадения р. Селенга в оз. Байкал.....................50

Глава 4. Структура микробных сообществ в зоне впадения р. Верхняя Ангара в оз. Байкал

4.1. Температурный режим........................................................62

4.2. Структурно-функциональная характеристика микробных сообществ в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара.............64

4.3. Филогенетическая структура микробных сообществ...................69

4.4. Таксономическое разнообразие микроорганизмов

в барьерной зоне впадения р. Верхняя Ангара...........................72

Глава 5. Структура микробных сообществ в зоне впадения

Р. Баргузин в оз. Байкал........................................................82

5.1. Температурный режим.......................................................83

5.2. Структурно-функциональная характеристика микробных сообществ в барьерной зоне впадения р. Баргузин.....................84

5.3. Филогенетическая структура микробных сообществ..................89

Заключение.............................................................................98

Выводы..................................................................................101

Список литературы..................................................................103

Введение

Актуальность работы. Устьевые области рек - место контакта и взаимодействия двух водных масс (речной и озёрной) с различными физическими, химическими и биологическими свойствами. Одновременно устья рек представляют собой природные барьеры на пути поступления стока воды, наносов, растворённых веществ речного происхождения в озёра. Между этими водными массами располагается довольно обширная зона смешения (т.н. барьерная зона), в пределах которой происходит трансформация свойств воды. Исследования зон впадения рек в моря и океаны свидетельствуют о том, что наиболее активные процессы трансформации речной воды наблюдаются в устьевых областях рек и барьерных зонах (Liss, 1976; Лисицын, 1974, 1994; Емельянов, 1998; Гордеев, 2004; Лопатин и др., 2000). Подобные процессы происходят и в районах впадения рек в пресноводные водоёмы (Kenzaka et al., 1998; del Giorgio et al., 2002).

В процессах трансформации свойств воды большая роль принадлежит микробным сообществам, которые осуществляют круговорот биогенных веществ, обеспечивают функционирование пищевой цепи, благодаря чему органическое вещество вновь вовлекается в пищевые цепи водной толщи. В барьерных зонах бактериопланктон обеспечивает деструкцию 40-60% органического вещества водной толщи (Woodwell et al., 1973; Fuhrmam et al., 1982; Kirchman et al., 1985; Виноградов, 1987; и др.). Микроорганизмы осуществляют до 30-75% круговорота азота, показана их существенная роль и в преобразованиях соединений фосфора (Sorokin, 1971; Jackson, 1985).

Воды крупных притоков оз. Байкал (Селенга, Верхняя Ангара, Баргузин и др.) отличаются от вод Байкала по содержанию взвешенных и органических веществ, растворённых солей, биогенных элементов и планктонных организмов. В зоне смешения речных и озёрных вод отмечается постепенная смена речного комплекса водорослей на озёрный,

увеличивается численность фитопланктона и его первичная продукция (Вотинцев и др., 1963, 1965; Шимараев, 1971; Поповская, 1975; Богданов, 1978; Тарасова, 1992; Сороковикова и др., 2000, 2006). Общая численность микроорганизмов, численность органотрофов и бактериальная активность (гетеротрофная ассимиляция углекислоты) также претерпевает изменения в этих зонах (Максимов и др., 2002). Выполненные ранее микробиологические работы ограничивались определением количественных показателей бактериопланктона, а его филогенетический состав и таксономическое разнообразие оставались неисследованными. В связи с этим была поставлена цель работы:

Исследовать особенности количественной и филогенетической структуры микробных сообществ в барьерных зонах впадения трёх наиболее крупных притоков оз. Байкал и установить связь с некоторыми экологическими факторами.

Для ее достижения были поставлены следующие задачи;

1. Исследовать особенности распределения общей численности микроорганизмов, культивируемых органотрофных бактерий и гетеротрофную ассимиляцию углекислоты в зонах впадения рек и взаимосвязь данных параметров с экологическими характеристиками.

2. Оценить состояние водных экосистем барьерных зон впадения по количественным показателям бактериопланктона.

3. Провести количественную оценку распределения представителей основных филогенетических классов и групп микроорганизмов в зонах впадения крупных рек в оз. Байкал и оценить их вклад в структуру микробных сообществ.

4. Исследовать таксономический состав микроорганизмов, входящих в состав микробных сообществ изучаемых районов сравнительным анализом структуры нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16Б рРНК.

Научная новизна;

Впервые исследована филогенетическая структура микробных сообществ основных притоков оз. Байкал, оценен вклад различных классов и групп микроорганизмов в структуру сообществ.

Выявлены особенности распределения доминирующих представителей микробного сообщества с учётом конкретных экологических факторов, установлены наиболее значимые таксоны микроорганизмов в зонах с высокой функциональной активностью.

Получен банк данных рибосомальных последовательностей некультивируемых микроорганизмов, выделенных из водной толщи зон смешения речных вод с озёрными.

Практическая значимость; Проведённые комплексные исследования зон впадения крупных рек в оз. Байкал дают возможность оценить состояние бактериопланктона в данных зонах в современный период, выявить изменения в количественных показателях структуры микробных сообществ по сравнению с отмечаемыми ранее (База данных «Бактериопланктон р. Селенги, ее дельты и барьерной зоны Селенгинского мелководья оз. Байкал» - свидетельство № 2006620011 Роспатент РФ).

Данные по общей численности микроорганизмов, численности органотрофов и их соотношение позволяют охарактеризовать качество воды при различных гидрологических условиях, установить зоны, где происходят процессы деструкции органического вещества. Результаты работы могут быть использованы для оценки современного состояния микробных сообществ приустьевых зон и учтены при разработке рекомендаций по охране озера Байкал.

Выявленные таксоны микроорганизмов, доминирующие в зонах с наибольшей функциональной активностью, характеризуются как активные деструкторы органического вещества и различных химических соединений, поступающих с речного водосбора. Среди этих групп можно

более целенаправленно вести поиск активных штаммов микроорганизмов для биотехнологических целей.

Полученная в данной работе библиотека последовательностей фрагментов гена 16S рРНК (JN255165-JN255180) пополняет банк известных байкальских последовательностей и может быть использована для конструирования специфичных праймеров и зондов для быстрого и эффективного анализа структуры водного микробного сообщества.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В барьерных зонах впадения крупных притоков оз. Байкал основные структурные показатели микробных сообществ (общая численность микроорганизмов, численность культивируемых органотрофных бактерий и вклад Eubacteria в ОЧМ) коррелируют с температурой воды. Характер распределения данных показателей зависит от гидрологических и геоморфологических особенностей района.

2. Количественная структура микробных сообществ свидетельствует о стабильности качества вод в барьерных зонах основных притоков оз. Байкал.

3. В филогенетической структуре микробных сообществ зон впадения доминируют Eubacteria, Archaea характеризуются минорным вкладом. В устьях рек преобладают Cytophaga-Flavobacteria, среди Eubacteria с различным вкладом детектируются основные классы протеобактерий: Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria. При удалении от устья реки изменяется соотношение классов Proteobacteria, в зоне смешения доминируют представители филума Actinobacteria, в 7 км от устья - Planctomyces.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались на российских и международных конференциях и совещаниях: FEMS Congress of European Microbiologists (Slovenia, 2003); на трёх Международных байкальских Симпозиумах «Микроорганизмы в экосистемах озёр, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2004, 2008, 2011); The

First Baikal Workshop on Evolutionary Biology (Irkutsk, 2004); на IV и V Верещагинских Байкальских конференциях (2005, 2010); «Научные основы сохранения водосборных бассейнов: междисциплинарные подходы к управлению природными ресурсами» (Улан-Удэ-Улан-Батор, 2004); «Основные факторы и закономерности формирования дельт и их роль в функционировании водно-болотных экосистем в различных ландшафтных зонах» (Улан-Удэ, 2005); на IX Съезде Гидробиологического общества РАН (Тольятти, 2006); III Международная научная конференция «Озерные экосистемы: биологические процессы, антропогенная трансформация, качество воды» (Нарочь-Минск, 2007); 1st International Symposium «Use of algae for monitoring rivers» (Luxembourg, 2009); 1st International Conference «Survey of Mongolian aquatic ecosystems in a changing climate: Results, new approaches and future outlook» (Mongolia, 2010).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 27 научных работ, из них 7 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК, 1 глава в совместной монографии и 18 тезисов конференций. Российским агентством по патентам зарегистрирована база данных «Бактериопланктон р. Селенги, ее дельты и барьерной зоны Селенгинского мелководья оз. Байкал» (свидетельство № 2006620011 РОСПАТЕНТ РФ. Дата регистрации 10.01.2006г.).

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам НИР в отделе микробиологии Лимнологического института СО РАН, в рамках базовых проектов и проектов по программе Президиума РАН. Фактические данные получены автором при его непосредственном участии в экспедиционных и лабораторных работах, включая отбор проб, подготовку специальных сред, реактивов, анализ и обобщение полученных результатов. Измерение температуры и удельной электропроводности воды проведено сотрудником лаборатории гидрологии и гидрофизики н.с. В.Г. Ивановым, гетеротрофная ассимиляция углекислоты оценена сотрудником Института общей и

экспериментальной биологии СО РАН к.б.н., н.с. С.П. Бурюхаевым. Секвенирование проведено в ЦКП «Секвенирование ДНК» (г. Новосибирск).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, содержит 30 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 177 наименования, из которых 91 - отечественных и 86 - зарубежных изданий.

Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н. Т.И. Земской за научное руководство и поддержку в работе, сотрудникам отдела микробиологии за всестороннюю помощь, а также сотрудникам лаборатории гидрохимии: к.г.н. JI.M. Сороковиковой, к.г.н. И.В. Томберг, сотрудникам лаборатории гидрологии и гидрофизики: д.г.н. М.Н. Шимараеву, к.г.н. В.Н. Синюковичу, н.с. В.Г. Иванову, сотруднику лаборатории геносистематики н.с. Т.И. Трибой.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Исследование микробных сообществ в барьерных зонах

Исследования в зонах впадения крупных рек в моря и океаны позволили определить, что устьевые области рек выполняют функции природных «барьеров» между реками и морями. Здесь отлагается большая часть приносимых реками наносов (Лисицин, 1974; Михайлов и др., 1991, 1997; Шуйский, 1986), происходит аккумуляция и накопление части растворенных веществ (Турекян, 1979), находится гидробиологическая граница пресноводной и морской биоты (Хлебович, 1974, 1989).

Благодаря выносу рекой массы биогенных элементов, хорошо прогреваемому мелководью, подвижности вод, дельты и эстуарии относятся к наиболее биопродуктивным экосистемам планеты (Wolff, 1980). Нередко в этих областях сконцентрирована активная деятельность человека, а приустьевые пространства являются объектами разгрузки отходов промышленности, в том числе и токсичных веществ, поступающих с речным стоком. Поэтому, изучение биогеохимических процессов в районах поступления речных вод имеет важное экологическое значение (Артемьев, 1993).

Пресная речная вода при поступлении в солёные водоёмы, претерпевает изменения под воздействием солевого, гидродинамического, биологического барьеров (маргинального фильтра), при этом существенный вклад в процессы трансформации вносят микробные сообщества (Лисицын, 1994; Емельянов, 1998; Гордеев и др., 1978). Гораздо меньше сведений имеется о процессах, происходящих в зоне смешения речных вод с озёрными (Kenzaka et al., 1998; del Giorgio et al., 2002; Katano et al., 2008).

Общая численность микроорганизмов в зонах смешения существенно варьирует, значения её во многом определяются температурой воды как в реках, так и в приёмном водоёме, степенью антропогенной нагрузки на

реки, количеством биогенных элементов и др. Так, в зоне впадения реки Руж (Франция) значения ОЧМ изменяется от 0.013 млн.кл/мл при 12°С до 7.8 млн.кл/мл при 16°С (Tiqua, 2008). Исследования рек Такаяма и Китахаши, впадающих в залив Осака (Япония), показали большой диапазон значений ОЧМ в зонах впадения данных рек. При температуре речной воды 8°С ОЧМ составляла 0.3±0.17 млн.кл/мл, при увеличении температуры до 16°С - до 9.9±7.7 млн.кл/мл (Kenzaka et al., 1998). В эстуарии реки Шоптанк, впадающей в Чесапикский залив (США) ОЧМ варьировала от 4 млн.кл/мл в весенний период наблюдений до 7 млн.кл/мл в летний период (del Girgio et al., 2002).

Однако определение только ОЧМ в речных водах и водах приёмного водоёма не даёт представление об изменениях в структуре микробных сообществ в зонах впадения рек. В настоящее время возможность применения современных методов молекулярной биологии, таких как флюоресцентная in situ гибридизация, денатурирующий градиентный и температурный электрофорез, определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и др., открыло широкие перспективы в исследовании микробной структуры подобных зон (Findlay et al., 1988; Cole et al., 1993; Logue et al., 2008).

Наличие солевого, гидрологического и биологического барьеров характерно для большого числа рек, впадающих в солёные водоёмы. Так, в устье р. Колумбия (западное побережье США) наиболее чётко прослеживается солевой барьер - галоклин, через который соленые воды вовлекаются в процесс перемешивания. Шлейф низкой солёности распространяется далеко в море (Михайлова, 2008). Исследования микробных сообществ в эстуарии реки Колумбия (Crump et al., 1999) методом сравнительного анализа фрагмента гена 16S рРНК бактериопланктона выявило наличие последовательностей, обнаруженных ранее в различных зонах Тихого и вдоль побережья Атлантического океанов. Микроорганизмы были отнесены к классу Betaproteobacteria,

включая большое число метилотрофных бактерий, бактерий рода Duganella, и бактерий разных таксонов, обнаруженных ранее в континентальных водоемах (Rappé et al., 2000).

Выполненное ранее исследование бактериальных сообществ семи пресноводных озер в США методом ДНК-гибридизации показало, что Betaroteobacteria являются основным компонентом филогенетической структуры пресноводного бактериопланктона (Methe et al., 1998). Это значительно отличается от результатов, полученных в океанических зонах, когда представители Betaproteobacteria практически отсутствуют. Доля микроорганизмов данного филогенетического класса не коррелировала с их биохимическими способностями. Идентифицировано родство пресноводных бактерий к морским филогенетическим группам, в особенности САР 11 групп и Alphaproteobacteria, для Betaproteobacteria этого родства не обнаружено.

Доминирование микроорганизмов, принадлежащих классу Betaproteobacteria, филумам Bacteroide