Пронуклеозидные ингибиторы репликации ВИЧ и вируса герпеса: стабильность и превращения в культурах клеток и в животных

Карпенко, Инна Леонидовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Пронуклеозидные ингибиторы репликации ВИЧ и вируса герпеса: стабильность и превращения в культурах клеток и в животных
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пронуклеозидные ингибиторы репликации ВИЧ и вируса герпеса: стабильность и превращения в культурах клеток и в животных"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

КАРПЕНКО ИННА ЛЕОНИДОВНА

ПРОНУКЛЕОЗИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ И ВИРУСА ГЕРПЕСА: СТАБИЛЬНОСТЬ И ПРЕВРАЩЕНИЯ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК И В ЖИВОТНЫХ.

Специальность 03.00.03, 03.00.04 - молекулярная биология, биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В,А.Энгельгардта РАН (Москва)

Научный руководитель

Доктор биологических наук М.К. Куханова.

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук И.А. Гривенников,

(Институт молекулярной генетики РАН)

Доктор биологических наук B.C. Прасолов,

(Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН) Ведущая организация

Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва)

Защита состоится » 2006 года в ¿Учас на заседании Диссертационного совета

Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Эпгельгардта РАН

АЛО:

Автореферат разослан «3» IV2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы и направление исследования. Дизайн антивирусных препаратов основывается на создании соединений, способных воздействовать на различные стадии развития вируса. Основными требованиями являются высокая эффективность, низкая токсичность соединений и медленное развитие резистентности к препарату. Аналоги вуклеозидов играют большую роль в создании препаратов против таких вирусов как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус герпеса (HSV), цитомегаловирус (HCMV) и ряда других. Несмотря на достаточно высокую эффективность препаратов, они имеют ряд существенных недостатков. В частности, наиболее широко используемый для мояотералии и в составе "коктейлей" анти-ВИЧ препарат Ретровир™ (3'-азидо-2 ',3 '-дидезокситимидин, AZT) имеет достаточно высокую токсичность, проявляющуюся в подавления функции костного мозга и дисфункции печени, неэффективное прохождение гематоэнцефалического барьера и короткое время жизни в организме, требующее частого введения препарата [Tan X. ei al.,1999, Kukhanova MJC et al, 2003]. Развитию ВИЧ-инфекции сопутствует ряд других вирусных заболеваний, в частности, вызываемых вирусами группы герпеса. В настоящее время количество одобренных антигерпетических препаратов весьма ограничено. Широкопрнменяемый анти-HSV препарат Ацшсловир™ (9-[(2-гидроксиэтокси) метил] гуанин, ACV) обладает низкой биодоступностью при оральном применении. Кроме того, при длительном применении препаратов развитие инфекции становится неконтролируемым из-за возникновения резистентных вариантов вируса. Поэтому задача создания новых высокоэффективных и малотоксичных соединений, а также улучшение терапевтических характеристик уже одобренных препаратов весьма актуальна.

Одним из подходов улучшения свойств препаратов является создание их депо-форм. Депо-формы - это фармакологически неактивные соединения, претерпевающие после проникновения в клетки химическую или ферментативную трансформацию с образованием фармакологически активной формы. Депо-формы аналогов нуклеозидов должны иметь высокую антивирусную активность и низкую токсичность, улучшенные биодоступность и фармакокинетические характеристики, а также пролонгированное действие по сравнению с соответствующими аналогами нуклеозидов. Необходимым этапом в изучении потенциальных антивирусных препаратов является изучение их метаболизма.

Изучение метаболизма депо-форм препаратов включает определение химической стабильности и направления гидролиза в различных биологических средах. Исследование динамики накопления и превращения соединений в клеточных культурах и на животных моделях, идентификацию метаболитов и ферментов, участвующих в метаболизме.

Цель п задачи исследования. Целями и задачами исследований являлись 1) изучение превращений анти-ВИЧ препарата 5'-Н-фосфоната AZT (Никавир™, HpAZT) в культуре клеток и на животных моделях; 2) изучение распределения продуктов метаболизма HpAZT в крови и органах животных; 3) изучение проникновения в клетки Н-фосфоната АСУ (HpACV) и определение стабильности и возможных путей превращения HpACV и фосфонатных эфиров ацикловира; 4) определение стабильности и возможных путей превращения 5'-фосфатных производных 4 -тио-5-этил-2 -дезоксиуридина (TEDU), проявляющего антигерпетическую активность.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые детально изучены превращения HpAZT с применением радиоактивно меченого препарата. Определена динамика накопления метаболитов в крови и органах животных при введении HpAZT или AZT. Показано, что низкая токсичность HpAZT по сравнению с AZT объясняется медленным проникновением препарата в клетки и пониженным содержанием его монофосфата. Показана разница в распределении в крови и органах животных метаболитов, образующихся при введении HpAZT и AZT. Определены кинетические параметры реакций гидролиза HpAZT и HpACV, катализируемого 5' -нукл еотид азой. Показано, что активность фосфонатных эфиров антигерпетических препаратов, явлющихся депо-формами АСУ и TEDU, зависит от скорости их гидролиза в различных биологических средах. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XII международной конференции "Chemistry of Nucleic Acid Components" (Spindleruv Mlyn, Чехия, 2002), на международных конференциях молодых ученых «Молекулярная биология и генетика» (Киев, Украина, 2001 и 2003 гг.).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 8 работах Структура и объем работы. Диссертация изложена на ... стр., содержит ... схемы, ... таблиц, ... рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, представления полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( ... ссылок на литературные источники).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В первой части работы были изучены превращения в культуре клеток и на животных моделях радиоактивно меченого [6-3H]-HpAZT, являющегося латентной формой AZT. В качестве контрольного препарата использовали [6-3H]-AZT. [6-JII]-AZT любезно предоставлен Г. В. Сидоровым (ИМГ РАН). [6-3H]-IlpAZT синтезирован Ю.С. Скобловым (ИМБ РАН). Определены кинетические параметры реакции гидролиза HpAZT,

катализируемого 5'-ну клеотидазой, предположительно играющей роль в гидролизе НрАЗТГ до АСТ. Вторая часть работы посвящена изучению депо-форм антигерпетических препаратов АСУ и ТЕ011, определению путей их гидролиза в различных биологических жидкостях и изучению превращения 5-этоксикарбонилфосфоната ТЕОи - наиболее активной депо-формы ТЕОи. Определены кинетические параметры гидролиза НрАСУ 5'-нуклеотидазой и изучено накопление и превращения в культуре клеток радиоактивно меченого [8-3Н]-НрАС\г.

Стабильность и превращения [6-3И1-НрА7Т

Для улучшения терапевтических характеристик анти-ВИЧ препарата АЭТ синтезированы различные его депо-формы. Созданный в нашей лаборатории анти-ВИЧ препарат НрАЭТ (№саук™, фосфазид) [Тагизоуа N3 ег а!., 1989,1991> Кгауеуэку А.А. е1 я/, 1992], утвержденный для применения при лечении ВИЧ, обладает лучшими по сравнению с АХТ терапевтическими характеристиками.

НрАгТ структурно подобен 5'-монофосфату 3'-азидо-2' ,3'-дидезокситимидина (АгТМР), но в отличие от АЛТМР, гидролитически устойчив в плазме крови. НрАСТ проникает через клеточную мембрану за счет более низкой полярности, чем у АгТМР.

azt azimp h>azt

Преимуществами HpAZT по сравнению с AZT являются пониженная токсичность и пролонгированное действие в организме. Для объяснения этих эффектов были исследованы стабильность HpAZT в биологических жидкостях, сравнительные скорости накопления HpAZT и AZT и их метаболитов в клеточной культуре, распределение метаболитов в органах и крови на животных моделях.

Стабильность [6-3II]-HpAZT в PBS, сыворотке крови человека, культуральнон среде, лизате клеток и гомогенате печени мышей. Мы исследовали стабильность и возможные пути превращения [6-3H]-HpAZT при гидролизе в PBS (фосфатный буфер по Дальбекко, рН 7,2), в 10% и 100% сыворотках крови человека и в культуральной среде RPMI 1640 с 10% содержанием фетальной сыворотки теленка (FCS). Анализ проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в псевдо ион-парном режиме. Радиоактивно меченые препараты

и их метаболиты идентифицировали на основании их ко-элюции с аутентичными перадиоактивпыми соединениями (рис.1).

i~V,'."A i

Рис. 1. Профиль хроматографнческого разделения смеси тимина, А2Т, АХТМР и НрАгТ. Времена удерживания: Тимии: 1= 9 мин; лгТМР: р* 18 мин; НрАЭТ: Р= 25 мин; А2Т: 1= 27 мин. Условия зяюции: преколонка С-18 (40 мкм, 4x5мм), колонка №с1ео$Ц С-18 (7 мкм, 4x150мм); градиент 66% ЕЮН в 50 мМ ТЕАВ (триэтиламин бикарбонат, рН 7.5): 0% - 5 мин , 0010% - 5 мин; 10025% - 15 мин, 25030% -12 мин; 300100% -13 мин.

Едашствепным продуктом гидролиза [6-3H]-IIpAZT в PBS в 10% и в 100% сыворотке был [6-3H]-AZT, время полужизни препарата составляло 50 часов, 22 часа и б часов, соответственно. Время гидролиза HpAZT согласуется с ранее опубликованными данными [Tamsova N.B. et at, 1991]. В культуральной среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, только 12 ±2% [6-3H]-HpAZT превращались в AZT через 25-часов инкубации при 37° (кривая 4, рис. 2).

I ■ т Т

10 4}

I ■ I < I ■ Т и Jo « « 7J Врвщмнн

Время* мкн

Рис. 2. Накопление радиоактивных продуктов: А - при инкубации [6-эН]-НрАХГ (12 мкМ, 2 мкКи) с лизатом клеток НЬ-60; кривые 1 - [б-3Н>НрАХТ; 2 - [6-5Н]-АгТ; 3 - [б-3Н]-АЭТМР; кривая 4 - инкубация [6-3Н]-НрАгТ в ЯРММ640, содержащей 10% ГС5; В - при инкубации [б-*Н]-НрАгТ (12 мкМ, 2 мкКн) с гомогенатом печени мыши : кривые 1 - [б-^-НрАгТ; 2 - [6-3Н]-АгТ; 3 - [6-'Н]- АЭТМР.

На рис. 2А представлен гидролиз НрА2Т в лизате промиепоцитов НЬ-б0 (АТСС ССЬ-240). Через 1.5-часа инкубации [6-3Н]-НрА2Т гидролизовался на 40% (1) с образованием двух продуктов: [6-3Н]-АгТ (2) и [б-3Н]-АгТМР (3) в соотношении 3:1. В гомогенате печени мышеи гидролиз проходил на 50% за 30 мин (рис. 2В). Основным

метаболитом был [б-3Н]-А2Т (2), его доля составляла й 45 %. Другие радиоактивные продукты - [6-3Н1-АгТМР (3) и неидентифнцированный продукт гидролиза М1 (время удерживания 2-4 мин) присутствовали в количествах менее 2 %.

В гомогенате печени мыши [б-3Н]-НрА2Т гпдролизуется примерно в 4 раза быстрее, чем в лизате клеток НЬ-60. Количество вносимого в реакцию белка было 1,7 мг/мл и 1,6 мг/мл,

соответственно, т.е. суммарная гидролитическая активность ферментов в гомогенате печени мыши выше, чем активность ферментов клеточного лизата. Изменение количественного соотношения основных метаболитов и образование дополнительного продукта М1 в гомогенате печени мыши позволяет предположить, что гидролитическая активность обусловливается различным соотношением ферментов в лизате клеток НЬ-60 и гомогенате печени мыши, а также присутствием в гомогенате других гидролизующих ферментов.

Превращении (б-3Н]-НрА2Т в культуре клеток НЬ-бО. Основным этапом было изучение метаболизма [б-3Н]-ИрАгТ в культуре клеток НЬ-60. В течение первых пяти часов общее количество радиоактивного материала (рис. ЗА) после инкубации с [6-3Н]-НрАСТ (1) составляло 20-30% от количества радиоактивности при инкубации с [6-3Н]-АгТ (2). Через 25 часов внутриклеточное содержание [6-3Н]-НрАХТ и его метаболитов составляло 50-60% от внутриклеточного содержания АСТ-индуцированных продуктов.

Через 1 час инкубации культуры клеток с [6-эН]-НрАХТ доля НрАСТ (4, рис. ЗВ) составляла всего несколько процентов от общего содержания радиоактивности и

Рис. 3. А - Накопление в клетках НЬ-60 радиоактивно меченых продуктов. При инкубации с 23 мкМ (10 мкКи) [6->Н]-ИрАгТ - кривая 1; при инкубации с 25 мкМ (10 мкКи) [б-3Н]-АгТ - кривая 2. В - Накопление радиоактивных метаболитов в клетках НЬ-60. При инкубации с [6-1Н]-А2Т: кривая 1 - [6-3Н]-А£ТМР; 3 -[б-3Н]-А2Т; при инкубации с [6-'Н]-НрАгТ: кривая 2 - [6-'Н]-АгТМГ; 4 - [6-3Н]-АХТ.

практически не изменялась в течение всего эксперимента. Это показывает, что НрАХТ быстро метаболизирует внутри клетки. Основным метаболитом был А2ТМР (1), его содержание через 25 часов инкубации культуры клеток с НрАСТ составляло 20 + 5 пмоль/106 кл (80 + 15% общей радиоактивности). Доля [6-3Н]-Агт (3) среди внутриклеточных продуктов метаболизма [6-3Н]-НрЛХТ была очень мала. При инкубации культуры клеток с AZT основным метаболитом также был АХТМР, количество которого было в три раза больше, чем после инкубации с НрЛгТ.

Т.о. скорость накопления радиоактивного материала в клетках при инкубации с [б-Нэ]-НрА2Т ниже, чем с [б-эН]-АСТ. Основным продуктом превращения [6-3Н]-НрА2Т в культуре клеток был АгТМР. Эти результаты соответствуют предположению о возможном окислении НрА2Т до АСТМР, высказанному в работе [Воа11.Н. е/ а1, 1993]. Однако, как

было показано выше, при гидролизе в лизате клеток HL-60 и гомогенате печени мыши основным продуктом был AZT. Среди продуктов в шпате клеток и гомогенате печени также присутствовал AZTMP, но в значительно меньшем количестве, чем при инкубации клеток с AZT. Наиболее вероятным нам представляется гидролиз HpAZT ассоциированными на мембране эктонуклеазамн, включая 5 '-нуклеотидазу, до AZT, который затем фосфорилируется до AZTMP. Однако мы не исключаем возможности прямого окисления IIpAZT до AZTMP в некоторых клеточных культурах. Как показано ранее [Torvenevik Y. et ai, 1995], токсичность AZT в клеточных культурах связана с высокой концентрацией AZTMP, приводящей к ингибированию тимидин/тимидилат киназы и вызывающей дисбаланс в содержании фосфатов пуклеозидов в клетке. Понижение количества образующегося AZTMP при инкубации с IIpAZT может объяснять уменьшение цитотоксичностн препарата по сравнению с AZT.

Определение кпиетнческнх параметров реакции AZTMP и HpAZT с 5'-нуклсотидазой. Как показано в работе [Кухапова М.К. и др. 1992], соединения, модифицированные по фосфатной группе, не подвергаются гидролизу, катализируемому фосфатазами. Также показало, что 5'-нуклеотидаза способна отщеплять ряд фосфонатных остатков с образованием соответствующего нуклеозида. Нами была показана способность 5-нуклеотидазы из Crotalus aîrox venom гидролизовать AZTMP и HpAZT. В качестве реперного соединения использовали dTMP. Кт и каталитическую константу keat определяли построением графика Лаинуивера-Берка (табл. 1).

Таблица 1. Кинетические параметры реакции dTMP, AZTMP, HpAZT с 5'-нуклеотидазой.

Субстрат Km, MKM kcal (МИН) kcat/ Km

dTMP ltl± 15 ол 1,8x10*3

AZTMP 714 ±30 0,16 2,2xl04

HpAZT 1420 ±100 0,012 8,5x10**

Введение азидогруппы в З'-положение дезоксирибозного остатка тимидина (АХТМР у.г <1ТМР) понижало сродство субстрата к ферменту примерно в 10 раз. Скорость образования продукта понижалась незначительно. Замещение фосфатной группы на 5-фосфонат (НрАгТ АЖТМР) слабо сказывается на сродстве субстрата к ферменту, но уменьшает скорость гидролиза почти на полтора порядка. Полученные результаты позволяют предположить, что, несмотря на низкую эффективность реакции, 5'-нуклеотидаза может участвовать в гидролизе НрАгт.

Превращения [6-3H]-HpAZT в крови и органах мыши. Мы изучили динамику накопления и превращения НрАгт в крови и тканях животных после пероралъного,

внутривенного и внутрибрюшинного способа введения препарата. Работа проводилась на белых нелинейных мышах. Изучались накопление и превращения препарата в крови, печени, почках, селезенке, мышцах, желудке, тонком и толстом кишечнике, В качестве контроля сравнения использовали [6-3Н]-АгТ,

Распределение [6-3Н]-НрАгт метаболитов в крови и органах мыши при пероралыюм {р.о.) введении. Мышам р.о. вводили [6-3Н]-НрАгТ или [6-3Н]-А2Т, Гистограммы распределения суммарного радиоактивного материала в крови и органах через 2 минуты и 20 минут после введения препаратов представлены на рис. 4. Через две минуты после введения [6-эН]-НрАгт основная часть радиоактивного материала была обнаружена в желудке (72-75%) и топком кишечнике (12-15 %). В крови содержалось 5% суммарного радиоактивного материала, что соответствует 8-10 мкМ концентрации препарата и его метаболитов (рис. 4А). Через 20 мин количество продуктов в крови уменьшалось в 5 раз и составляло 1-2 мкМ (рис. 4В). В желудке содержалось 15-20% радиоактивного материала, а в тонком кишечнике - около 60%. Примерно по 5-8% радиоактивности было в печени, почках и толстом кишечнике. После введения [б-3Н]-АХТ доля радиоактивных продуктов в крови через две минуты (рис. 4С) была в 4 раза выше, чем в случае [6-3Н]-НрАгТ. Содержание радиоактивных метаболитов [б-3Н]-АгТ в крови через 20 мин (рис. 4Б) уменьшалось в два раза, хотя и оставалось выше, чем для [б-3Н]-НрА7Т. В органах распределение радиоактивного материала несущественно отличалось от распределения после введения [6-

3н]-нрАгт.

Рнс. 4. Гистограммы распределения суммарного количества

радиоактивных метаболитов в органах и крови мыши. После перорального введения 180 нмоль (300 мкКи) [6-3H]-HpAZT: А - через 2 мин, В — через 20 мин; после введения 180 нмоль (300 мкКи) [6-}H]-AZT: С - через 2 мин, D - через 20 мин. За 100 % принято суммарное количество радиоактивности в органах и крови.

Орган

Через 30 мин после введения [б-3Н]-НрАгТ около 60% радиоактивного материала содержалось в тонком кишечнике, в крови было обнаружено не более 3%. По 8-10% радиоактивных продуктов было локализовано в желудке, толстом кишечнике, печени и

почках. Через 90 мин 97% материала накапливалось в толстом кишечнике. В мозге, мускульной ткани и селезенке содержание радиоактивного материала не превышало 0.01% на протяжении всего эксперимента (данные не приводятся).

Согласно анализу ВЭЖХ (данные не приводятся), значительная доля радиоактивного материала после введения [6-3Н]-НрАгТ была связана с А2.Т. В печени показано образование пеидентифицированного продукта метаболизма М1, доля которого через 7 мин составляла 80 + 10% от общего содержания радиоактивного материала (рис. 5А). Доли НрАГГ (]), АгТМР (2) и А2.Т (3) не превышали 7% от суммарной радиоактивности. Для [6-3Н]-АгТ-индуцированпых продуктов в печени наблюдалась сходная картина (рис. 5В).

Время, мин Время, мне

Рве. 5. Зависимость накопления метаболитов в печени мыши от времени при пероральном введении препаратов. А - [6-*Н]-НрАгГ-индуцированных; В - [6-'Н]-АгТ-индудироваяных. М1 -неидентифицированный метаболит. Кривые: 1 - НрАХТ; 2 - А2ТМР; 3 - А2Т. За 100 % принято суммарное количество радиоактивного материала в печени.

В желудке через 2 мин после введения [6-3Н]-НрА2Т основным метаболитом был АЭТ, Его количество составляло 50% от радиоактивного материала, определяемого в желудке» далее доля А2Т снижалась до < 20%, Содержание АЖТМР и М1 возрастало от 35% до 48% и от 4% до 22%, соответственно. Изменение содержания этих двух продуктов коррелирует с уменьшением количества А¡СТ. Доля НрАХТ в начальных точках эксперимента не превышала 6%. Через 20 мин содержание НрАЭТ возрастало до 14% за счет поступления из других органов. После введения [б-3Н]-А7Т в желудке с AZT было связано 90% радиоактивного материала. Количество А2ТМР составляло 5 ± 2%, продукт М1 определялся в количестве £ 3%.

В тонком кишечнике как при введении [6-3Н]-А2Т, так и [6-3Н]-НрА2Т доля М1 составляла 50% ± 10%, а доля АХГМР составляла 25 ± 2% радиоактивного материала. Доля НрАСТ непосредственно после введения составляла 20%, затем, за счет выведения из организма и метаболических процессов, его количество снижалось. Содержание АЭТ, образующегося из [б-3Н]-НрАСТ, не превышало 13%. При введении [6-3Н]-АгТ доля АХТ в тонком кишечнике в начальных точках была 24 ± 4%, через 20 мин его количество уменьшалось в два раза.

Распределение [6-3Н]-НрАХТ метаболитов в крови и органах мыши при внутривенном (¿V.) введении. Мышам в хвостовую вену вводили [б-3Н]-НрА2Т или [б-3Н]-А2.Т. Через 2 мин после введения [6-3Н]-НрАХТ в крови содержалось 98% радиоактивного материала (рис. 6А). Через 12 мин доля радиоактивности в крови понижалась до 11 ± 2%, а основное её количество содержалось в кишечнике - 45 ±5% (рис. 6В). Между печенью, почками и желудком было распределено по 10-15% радиоактивно меченых продуктов.

100-1 so «о

20 о

г i

ЮО-ч 80-«04030-

Орган

£ I

--1- «И^м»

Рис. 6. Распределения суммарного количества радиоактивно меченых метаболитов в крови и органах мыши. После внутривенного введения 180 нмоль С20 мкКи) [6-JH]-HpAZT: А - через 2 мин, В — через 12 мин; после введения ISO нмоль (20 мкКи) [б-*П]-АЭТ: С - через 2 мин, D - через 12 мин. За 100 % принято общее количество радиоактивности в органах и крови.

Орган

После введения 1б-3Н]-АХТ содержание радиоактивного материала в крови было ниже, а в желудке выше, чем для [б-3Н]-НрАгТ (рис. 6С). Через 12 мин распределение радиоактивного материала становилось сопоставимым с введением [6-3Н]-НрА2Т (рис. бО). Однако, если для [б-3Н]-НрА2Т возрастало количества радиоактивно меченых продуктов в желудке, то для [6-3Н]-АХТ увеличивалось содержание радиоактивности в печени и почках. Это позволяет предположить, что метаболизм А2Т в мыши захватывает большее количество органов по сравнению с метаболизмом ПрАХТ.

После введения [6-3Н]-НрАгТ более 90% радиоактивного материала в крови было связано с А2Т, далее его содержание незначительно понижалось. Доля [6-311]-НрА7/Г в крови не превышала 10%. Содержание АСТМР и М1 в крови было <4%.

Распределение 16-3Н|-11рЛ7-.Т метаболитов в крови в органах мыши при внутрнбрюшшшом (¿р.) введении. Мышам ¡.р. вводили [6-3Н]-НрА£Т. Через две минуты после введения [6-3Н]-НрАгТ более 80% радиоактивного материала содержалось в кишечнике, П% материала - печени. Содержание радиоактивных продуктов в других

органах н кровн было < 2%. Через 7 мин количество радиоактивности в почках и крови возрастало, а в кишечнике понижалось на несколько процентов.

Около 90% радиоактивного материала в крови после инъекции [6-3H]-HpAZT было связано с AZT. Доли [6-3H]-HpAZT, [6-3Н]-AZTMP и Ml составляли не более 3%. В печени, как и в двух вышеописанных случаях, основным метаболитом был М1. Через 7 мин количество М1 было около 30%, а доли AZT, AZTMP и HpAZT - по 22±2%. Б кишечнике доля AZT через 2 мин составляла 72%, далее понижаясь до 60%, а содержание AZTMP, соответственно, возрастало с 9% до 17%. Количество HpAZT составляло 16%, а доля М1 не превышала 7%.

Нами показано, что HpAZT быстро превращается в AZT in vivo после р.о, i.V. и i.p. введения. Таким образом HpAZT является депо-формой AZT. Содержание радиоактивных метаболитов [6-3H]-HpAZT в крови мыши не зависело от метода применения препарата. Исключением были первые минуты после i.v инъекции, когда весь радиоактивный материал находится в крови, и первые минуты после i.p. инъекции, когда количество радиоактивности в крови было очень малым. Концентрация AZT в крови после р. о и i.v. применения [6-3Н]-HpAZT составляла 1-2 мкМ. Распределение [6-3Н]-НрАХТ-индуцированных продуктов в крови, печени, почках, тонком и толстом кишечниках было подобно распределению продуктов при использовании [6-3H]-AZT. Некоторые отличия наблюдались при i.p. введении, при котором доля HpAZT в органах была выше, чем при двух других методах введения. Показано также, что концентрации AZT и AZTMP, образующиеся после введения HpAZT» ниже, чем при использовании AZT, что может являться одной из причин понижения токсичности препарата.

Превращения HpAZT в крови кролика. Недостатком изучения накопления и превращения препаратов на мышах является высокая скорость метаболизма животных. Поэтому на следующем этапе мы изучили дипамику накопления радиоактивного материала в крови кролика и зависимость количественного состава метаболитов в крови от дозы (1мг и 10 мг) введенного препарата. Животным весом 2 кг орально вводили 2,67 мкмоль или 26,7 мкмоль [6-3H]-HpAZT и 3,33 мкмоль или 33,3 мкмоль [6-3H]-AZT, с содержанием радиоактивной материи в количестве 1 мКи. При введении [6-3H]-AZT, независимо от количества препарата, через 30 мин наблюдался максимум накопления радиоактивного материала в крови (рис. 7А).

10 мм к 30 как 1 че 2 шея Зч»н

М.» ивжНцлЭТ (ЙЦ Е£Д 1(7 машНрЛСТ (1 *>

Рис. 7. Суммарно« количество радиоактивного материала в крови кролика в зависимости от времени и количества введенного препарата. Л — при введении [6-3Н]-АгТ; В - при введении (6-*Н]-НрАгТ.

После введения 2,67 мкмоль (1 мг) [6-3Н]-НрАгТ максимум накопления радиоактивности достигался через 120 мин. При использовании 26,7 мкмоль [6-3Н]-НрАгТ выраженного максимума накопления радиоактивности не наблюдалось (рис. 7В), уменьшение количества радиоактивности отмечалось через 21 час (данные не приводятся).

По данным ВЭЖХ анализа после введения [6-3Н]-НрА£Т через 10 мин доля А2Т составляла 95% от суммарного радиоактивного материала, далее его доля падала. Доли НрАЭТ и АСТМР во всех экспериментальных точках не превышали 10%. В течение эксперимента после введения [6-3Н]-НрАгТ накапливался продукт М1, доля которого через 5 часов составляла 46% и 61% для 1мг и 10 мг препарата, соответственно. После введения [6-3Н]-АгТ 94±4% радиоактивного материала было связано с АХТ в течение всего эксперимента, независимо от дозы введенного препарата. Доли АЭТМР и продукта М1 составляли 2%.

Максимальная концентрация ХЪТ в крови после введения как 2,67 мкмоль, так и 26,7 мкмоль [6-3Н]-НрА£Т определяется через 120 мин (кр. 1 и 2, рис. 8А). Содержание АгТ

Рис. 8. Зависимость накопления А2Т в крови кролика от времени. А -содержание АЭТ при введении: 1 - 2,67 мкмоль [6-*Н]-НрАгТ; 2 - 26,7 мкмоль [б-5н]-нрАгт. в содержание А2Т при введении: 1 - 3.33 мкмоль [6-5Н]-АгТ; 2 - 33,3 мкмоль [б-

Л0 110 «о 300 з ' Вршя. мин .

в этой точке составляло 13 нмоль/мл и 47 нмоль/мл для 1 мг и 10 мг введенного HpAZT, соответственно. Т.о. десятикратное увеличение дозы введенного препарата не влияет на скорость превращения НрАХТ в А£Т. Как сказано выше, при введении 26,7 мкмоль ПрА2Т доля образующегося неидентифицированного продукта гидролиза М1 увеличивается в 1,2 1,5 раза (61 % и 46% через 5 часов). После введения [б-3Н]-А2Т максимум накопления азидотимидина в крови совпадал с максимумом накопления суммарного радиоактивного

материала. Концентрация А2Т в крови через 30 мин составляла 7$ нмоль/мл а 440 нмоль/мл для 1 мг и 10 мг введенного азидотимидина, соответственно (кр, 1 и 2, рис, 8В).

Мы показали различия в динамике накопления А7,Т в крови кролика для НрАХТ или АгТ. При р.о. введении [6-3Н]-НрА2;Т максимум определялся через 120 мин, тогда как для [6-эН]-АгТ он определялся через 30 мин. Концентрация АгТ в максимуме при применении НрАгТ была примерно в 5 раз ниже, чем при введении АСТ, а время выведение препарата увеличивалось. Полученные результаты согласуются с данными по сравнительному изучению фармакокинетики А2Т и НрА2Т в крови собаки при оральном введении, где было показано смещение максимума накопления А&Т в крови с 3 часов до б часов и уменьшение его концентрации в максимуме в три раза [КикЬапоуа М.К. ег а1, 2003]. Отличия в динамике накопления АЭТ в мыши, кролике и собаке после введения НрАЭТ можно объяснить различиями в метаболизме животных. Кроме того, мы показали, что десятикратное увеличение дозы [6-эН]-А7Т или [б-3Н]-НрАгТ не влияет ни на скорость накопления АХТ в крови, ни на его долю в сумме продуктов.

Развитию ВИЧ-инфекции сопутствует ряд других вирусных заболеваний, в частности, вызываемых вирусами группы герпеса. В настоящее время количество одобренных антигерпетических препаратов весьма ограничено.

Стабильность и возможные пути превращения фосфонатных эфиров АСУ

9-[(2-Гидроксиэтокси) метил] гуанин (ацикловир, АСУ) (рис. 9) один из самых широко применяемых и хорошо изученных анти-НЗУ препаратов.

но

? о О III: Л-Н, 1Г-II,

и II IV: 1*'« II,

I Г) НО-О-Р-О—АСУ V: И./Рг, И'-Н,

АСУ ¿к. М^Е^'-.Тг,

VII: К-К*- /Рг,

О I: Н-Н, о 0 VIII; Я-1Г- н,

II II II IX: 1г=Н, Я»- Е1,

II-Р О—АСУ Ц:К../рг КО—С- СНз Р О АСУ X: К-Е1, К'- II,

ОК ОК' XI: Я=1Г-

Рис. 9. АСУ; I, II - Н-фосфонат АСУ и его эфир; Ш-УП - карбонилфосфонат АСУ и его эфиры; УШ-Х1 -этоксикарбонилфосфонат АСУ и его эфиры.

АСУ последовательно фосфорилируется тимидин киназой вируса герпеса до АСУМР, и клеточными киназами до трифосфага, который встраивается во вновь синтезируемую цепь ДНК под действием ДНК-полимеразы вируса герпеса и терминирует элонгацию вирусной ДНК [Реп£аи(1 С еГ а/., 1999], Недостатком АСУ является его низкая биодоступность при оральном применении. Использование его депо-формы Ь-валинового эфира АСУ

(валацикловира) - позволило увеличить содержание препарата в плазме крови при пероральном введении [De Clercq Е. et я/., 2001]. В работе [Галегов Г.А. и др., 1997] на культуре клеток Vero было показано, что Н-фосфонат ACV (HpACV) обладает антигерпетической активностью, в том числе и против штамма, резистентного к ACV, В нашей лаборатории М.В. Ясько и А.В. Ивановым был синтезирован ряд фосфонатных производных ACV (рис. 9).

Определение антивирусной активности, гидролитической стабильности и направления химического и ферментативного гидролиза. В рамках нашей совместной работы В, JI. Андроновой (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) были определены токсичность синтезированных соединений и их способность подавлять цитопатогенное действие различных штаммов HSV-1 в культуре клеток Vero (табл. 2).

Таблица 2. Действие фосфонатов I-IV, VI и XI на репродукцию HSV-1 в культуре клеток Vero (и.о.* — не определяли).

Соединение CTDjo, мкМ HSV-1/LÍ HSV-l(AVD) HSV-1/WR

Ш)(ь мкМ SI ГОяь мкМ S1 IDjo, мкМ SI

I (HpACV) 3922 20,4 192 20,4 192 40,8 96

п >3021 0,45 >6713 1>9 >1590 181 >16,7

III >2857 35,7 >80 143 > 20 286 >10

IV >2646 330,7 >8 н.о. * н.о. • 331 >8

VI >2481 0,37 >6705 0,77 >3222 149 >16,7

VII 2396 8,6 279 н.о. * н.о. * н.о. * -

XI >682 85,5 8 н.о. * и.о.» н.о. ♦ -

ACV >2226 1,82 >1223 6,3 353 486 >4,6

HSV-1/Lj - вирус герпеса простого, тип 1; HSV-l(AVD) - вирус герпеса простого, тип 1, клинический изолят частично резистентный к ACV; HSV-1/Lj/R - вирус герпеса простого, тип 1, резистентный к ACV; СТО» - 50% щгготоксическая доза для («инфицированных клеток Vero; Ш$о — доза, ингкбирующая вирусное цитопатогенное действие на 50 SI - индекс селективности (отношение CTDjc/IDso).

Все соединения были низкотоксичны. Незаряженные эфиры II и VI на культуре клеток, инфицированной HSV-I/L2, превосходили ACV по значению индекса селективности (SI) более, чем в 5 раз. Остальные соединения были в этих условиях малоэффективны. Единственным соединением, проявившим активность на штамме HSV-l/Lj/R, резистентном к АСУ, был HpACV, значение его SI превосходило SI ACV почти в 20 раз, Эфиры II и VI превосходили ACV по активности на штамме клинического изолята HSV-l(AVD) частично резистентного к ACV. Значение SI для соединения II в 4 раза, а для эфира VI в 9 раз выше, чем для ACV.

Разная эффективность соединений I - XI может определяться различными путями превращения препаратов и образующимися продуктами (схема 1). Мы предположили, что

эти соединение являются депо-формами АСУ. Для НрАСУ также рассматривалась возможность окисления с образованием монофосфосфага АСУ.

еюос-Р-О ACV ¿IPr

-f-OJ

etooc-p-oacv IV ¿H

\1ЁП

HOOcJ-o асу ш OH

H-P-0 -ACV JPtOOC-í-O ACV

CKPr VH iiPr \

П I 4

i 1

H-P-O -ACV I

OH I

Í /

iPrOOC-P-O ACV

V OH

Схема 1. Возможные пути химического н ферментативного гидролиза:

А - Н-фосфоната AC V, его эфира и эфироа карбонилфосфоната AC V; В - эфиров этоксикарбонилфосфояата ACV.

EtOOC-CHi—í-О-ACV X ¿H

HOOC-CH}-^~O ACV -„ 1 ACV I ........... EíOOC-CHi-í -O- ACV

— ta 1-1 ¿Et

ч.

НООС-СНГ-КО AC? DC OCt

Анио1щые фосфонаты I, IV, III, V, этоксикарбонилфосфонат VIII и его эфиры IX, X и XI были очень стабильны в PBS. Соединения IX, III и VIII гидролизовались только с образованием АСУ. Следовые количества АСУ при гидролизе карбоксифосфоната 1П и эгоксикарбонилфосфоната VIII обнаруживались лишь после 72 ч инкубации. При гидролизе эфира эгоксикарбонилфосфоната XI образовывался эфир X, при этом ACV не был обнаружен (табл. 3).

Таблица 3. Стабильность соединений I-VI и XI в PBS и сыворотке крови человека

Соедкн. t " ' ЗИМИН PBS Нормальная сыворотка крови человека

Время инкуб. Относительное кол-во компонентов в пробе Время инкуб. Относительное кол-во компонентов в пробе

I S 72 ч I:ACV 98:2 72 ч I:ACV 82:18

II 30 90 мин II: АСУ 53:47 35 мин II: АСУ 48:52

Ш 12 72 ч 1П -100* 72 ч III -100*

IV 35 72 ч IV:ACV:III 84:7:9 72 ч IV:ACV:III 38:8:54

VI 42 45 мин VI:ACV:IV 54:36:10 10 мин VIíACV: IV 35:47:18

VII 44 50 мин VH:ACV:V 53:27:20 7 мин VII:ACV:V 37:20:43

XI 46 72 ч XI:X 73:27 21ч XI :Х 44:56

• ACV определялся в следовых количествах.

♦•Порезультатам ВЭЖХ анализа. Условияэлюции: колонка LÍChrosorb-RP-18(7 мкм, 4x150мм);градиент 66% МЕОН в 5мМ натрий-фосфатном буфере (рН 4,8): А: 0% 5 мин, 0010% 5 мин, 10025% 25 мин, 25080% 5 мин, 800100% 5 мин, и 100% В течение 5 мин; В: 0% 5 мин, 0010% 5 мин, 10025% 25 мин, и 250100% 5 мин.

Стабильность соединений П, VI и VII в PBS была существенно ниже, чем стабильность IX, III и VIII. Эфир II гидролизовался с образованием АСУ. Для соединений IV, VI и VII реализовывались два пути гидролиза. При гидролизе эфира карбоксифосфоната

IV происходило образование ACV и карбоксифосфоната III в соотношении примерно 1:1. При гидролизе эфира VI получали ACV и фосфонат IV в соотношении примерно 4:1. При гидролизе диэфира карбонилфосфоната Vn образовывались ACV и соедипеиие V в соотношении 1:1.

Скорость гидролиза соединений I, III, V и VIII в нормальной сыворотке крови человека незначительно возрастала по сравнению со скоростью их гидролиза в PBS (табл.3). При гидролизе III в следовых количествах присутствовал ACV. Скорость гидролиза соединений II и эфира этоксикарбонилфосфоната XI в сыворотке крови человека по сравнению со скоростью в PBS увеличивалась в 2-3 раза, что свидетельствует о вкладе ферментативного гидролиза, хотя ACV и X оставались единственными продуктами превращения для эфиров II и XI, соответственно. Т.е. направление химического и ферментативного гидролиза были одинаковы.

Скорости превращения соединений в нормальной сыворотке крови человека по сравнению с гидролизов в PBS соединений IV, VI и VII увеличивались, а соотношения образующихся продуктов изменялись (табл. 3). При гидролизе фосфоиата IV превалировал карбоксифосфонат III. Поскольку скорости накопления ACV и III при гидролизе IV в PBS сравнимы, то можно предположить, что карбоксифосфонат III является продуктом л'ш л^ Рис. 10. Профили хроматографнческого

ферментативного гидролиза, a ACV - продуктом химического гидролиза (рис. 10А). В случае эфира VI (рис, 10В) и диэфира VII увеличивалась скорость накоплепия фосфоната IV и карбонилфосфонат V, соответственно, что также обусловлено вкладом ферментативного гидролиза.

Мы показали, что соединения, обладающие низкой антивирусной активностью, устойчивы к гидролизу в сыворотке крови. Соединения II, VII и VI в сыворотке крови стабильны менее одного часа, а фосфонаты XI, IV и III гидролизуются в тех же условиях примерно на 2-3 порядка медленнее. Т.о., низкая антивирусная активность для фосфонатов XI, IV и Ш в большей степени связана с их чрезвычайно высокой стабильностью и, соответственно, низкой скоростью высвобождения ACV в клетках. Кроме того, низкая антивирусная активность фосфоноацетата XI может объясняться тем, что продуктом его гидролиза является не ACV, а анионный фосфонат IX.

разделения продуктов гидролиза соединений IV и VI в сыворотке крови человека.

А - соединение IV, 72 часа инкубации; В-соединение VI, 10 мин. инкубации.

АСУ

Высокая антивирусная активность соединений П и VI на культуре клеток Vero,

инфицированных HSV-I/L2, соотносится с их высокой скоростью гидролиза до АСУ. Хотя соединение VI гидролизуется ферментами сыворотки крови с образованием двух альтернативных продуктов: ACV и этоксифосфоната IV, основной продукт гидролиза - АСУ - накапливается быстро, чем и можно объяснить высокую антивирусную активность VI. Низкая антивирусная активность соединения VII, сравнительно лабильного и в буфере, и в сыворотке объясняется образованием в качестве основного продукта неактивного соединения V. Как отмечено выше (табл. 2), соединения II и VI по индексу селективности в несколько раз превосходят ACV при испытаниях на пггамме HSV-I/L2, что подтверждает перспективность выбранного направления модификации ACV.

Превращения [8-3Hl-HpACV в культуре клеток Vero. Этот эксперимент проводился с использованием [8-3H]-ACV, любезно предоставленным Г. В. Сидоровым (ИМГ РАН), и [8-3H]-HpACV, синтезированным Ю.С. Скобловым (ИМБ РАН). Перевиваемую культуру клеток Vero (0.8 хЮ6 клеток/мл), объемом 5 мл инкубировали с 38 мкКи (0,3 мкМ) [8-3Н]-НрАСУ или 38 мкКи (0,3 мкМ) [8-3H]-ACV в течение 1, 3, б и 24 часов. На рис. 11 приведена зависимость накопления в клетках суммарного радиоактивного материала от времени инкубации [8-3H]-ACV (кривая 1) или [8-3H]-HpACV (кривая 2) с культурой клеток. В течение всего эксперимента общее количество радиоактивного

о ) « » а и и й ы Время, ч

материала внутри клеток при инкубации с [8-3Н]-НрАСУ составляло около 30% от

По данным ВЭЖХ анализа в течение всего времени инкубации основная доля внутриклеточной радиоактивности была связана с НрАСУ. Количество образующегося АСУ не превышала 5%, также в незначительном количестве накапливались АСУМР и неидентифицированный продукт метаболизма М1 (1уд= 4 мин) (рис. 12). Как для НрАСУ, так и для АСУ было показано образование продукта с ^д™ 9 мин (рис. 12), содержание которого через 24 часа достигало около 20 % и 30%, соответственно.

Рис. 11 Накопление в клетках Vero радиоактивно меченых продуктов. Кривая 1 - при инкубации с 38 мкКи (0,3 мкМ) [8-3Щ-ACV; кривая 2 - при инкубации с 38 мхКи (0,3 мкМ) [ft-'HI-HpACV.

количества радиоактивности при инкубации с [8-3Н]-АСУ.

Рис. 12. Профиль хроматографнческого разделения продуктов в лизате культуры клеток Vero после инкубации с [$-3HJ-HpACV, Времена удерживания: Гуанин (GuaB): 9 мин; ACVMP: 17 мин; HpACV: 19 мин; ACV: 21 мин. Условия злюции: преколонка С-18 (40 мкм, 4x5мм), колонка Nucleosil С* 18 (7 мкм, 4* 150мм), Градиент 40% ЕЮН в 50 мМ ТЕАВ (триэтиламин бикарбонат, рН 7,5): 0%, 24 мин; 0—И0%, 24- 25 мин; 0—»-100%, 25- 30 мин; 100 % в течение 5 мин.

Идентификация этого продукта ТСХ на кизельгеле и ВЭЖХ в на обращеной фазе, позволяет предположить, что, по-видимому, это гуанин (Guall), являющийся продуктом деградации ACV.

Скорость накопления [8-3H]-HpACV в клетках в несколько раз ниже, чем скорость накопления [8-3H]-ACV, при этом количество индуцируемого ACV очень мало. Т.е. HpACV не эффективен в качестве депо-формы ACV в культуре клеток Vero.

Определение кинетических параметров гидролиза ACVMP и HpACV в реакции с 5'-нуклеотидазой. Антивирусная активность исследуемых соединений определяется их способностью служить депо-формой ACV, Одним из ферментов, способных катализировать их превращение с образовааием АСУ, является ассоциированная на мембране 5'-нуклеотидаза. Нами была показана способность 5-нуклеотидазы из Crotalus atrox venom гидролизовать ACVMP и HpACV. Кт и каталитическую константу Км определяли построением графика Лаинуивера-Берка (табл. 4).

Таблица 4. Кинетические параметры реакции гидролиза ACVMP и HpACV, катализируемого 5'-нуклеотидазой.

Субстрат Кт мкМ ¿„((мин1)

ACVMP 970 ±200 0,002 2 хЮ-4

HpACV 4000 ±300 0,001 2,5х10*т

Эффективность гидролиза АСУМР на два порядка ниже, чем для АХТМР (кш /Кт в 2,2х 10"4). Замена фосфатной группы на Н-фосфонатную (АСУМР уз НрАСУ) понижает эффективность реакции на порядок. Т.о., несмотря на низкую эффективность гидролиза, 5'-нуклеотидаза может катализировать превращение НрАСУ в АСУ.

Нами показано, что НрАСУ не является эффективной депо-формой АСУ в культуре клеток. В согласовании с низкой эффективностью гидролиза НрАСУ как сывороткой крови, так и при катализе 5>-нуклеотидазой, эти результаты могут объяснять значительное понижение антигерпетической активности НрАСУ по сравнению с АСУ,

I СттК ÁtVM>

ии

HpACV АСУ

V »—i

Стабильность и превращения 5'-<Ьосфатных производных 4'-тио-5-этил-2'-дезокспурилпна

4'-Тио-2'-дезоксинуклеозиды изучаются как потенциальные антигерпетические агенты

с 1978г. Среди них наиболее широким спектром активности против вирусов, входящих в

семейство вирусов герпеса, обладает 4 '-тио-5-этил-2 -дезокснуридин (TEDU) (рис. 13)

[Walker R.T. et at., 1994, Dyson M.R. et al, 1991, Rahim G.S. et al, 1996].

Рис. 13. TEDU и его производные. XII: R = H, 5'- Н-фосфонат; ХШ: R = П0С(0)-, 5'-карбоксифосфонат; XIV: R = CiHsOC(0)-, б'-этоксикарбонилфосфонат; XV: R = NHjC(O)-,- 5'-аминокарбонилфосфонат; XVI: R- F-, 5'-Р-фосфат.

TEDU последовательно фосфорилируется тимидинкиназой вируса и клеточными нуклеотид и нуклеозидцифосфат киназами до трифосфата, который встраивается во вновь синтезируемую цепь вирусной ДНК под действием ДНК-полимеразы вируса герпеса, что приводит к терминации элонгации вирусной ДНК [Dyson M.R. et al, 1991; Rahim G.S. et at., 1996]. Несмотря на то, что in vitro TEDU показал высокую антивирусную активность и низкую цитотоксичность [Verri A. et al, 2000], предварительные исследования на лабораторных животных выявили высокую токсичность соединения [Littler Б., 1994]. Применение депо-форм позволило понизить токсичность ряда антивирусных препаратов. Для этих целей Л. А, Александровой с сотр. был синтезирован ряд 5'-фосфонатных производных TEDU (XII-XVI) (рис.13).

Антивирусная активность, стабильность и возможные пути превращения 5'-фосфатных и 5'-фосфонатных производных TEDU. В нашей работе с ВЛ. Андроновой были определены цитотоксичность соединений XII-XVI и их способность подавлять цитопатогенное действие HSV-I/L2 и клинического изолята вируса, резистентного к ACV, в культуре клегок Vero (табл. 5),

Таблица 5. Цитотоксичность и анти-HSV активность соединений XII-XVI.

,сгн8

¿J

НО-Ч s. I R-P-O-TEDI)

V iH

tedu xii-xvi

Соединение CTDjq.mkM HSV-l/Lj HSV-l/Lj/R

ID30. мкМ ID«, мкМ SI го50, мкМ SI

XIV >1200 0,7 19,6 >1700 24,5 >50

XII >1400 29 59 >50 566 >2,5

XV >1300 1,3 5,3 >1000 52,8 >25

XVI >1300 269 269 >5 269 >5

TEDU >1800 1.1 3,86 >1650 4,7 >380

НБУ-1/1^ • вирус герпеса простого, тип I; ШУ-1/1^/11 - вирус герпеса простого, тип I, резистентный к АСУ, множественность инфицирования 0,1 БОЕ/кл.; СГО^ - 50% цитотоксическая доза для неннфицированных клеток Уего\ Ши и ГО« - дозы, ингибирующие вирусное цитопатогенное действие на 50 и 95%, соответственно; -индекс селективности (отношение СТО^ГО»)-

Как видно из таблицы, токсичность соединений XII, XIV и XVI была несколько выше, чем у TEDU. 5'-Карбоксифосфонат XIII не был ни токсичен, ни активен. 5'-Н-Фосфонат XII и 5'-Р-фосфат XVI были в 10 и 100 раз менее активны, чем TEDU, соответственно. Активность 5'-аминокарбонилфосфоната XV незначительно ниже, чем у TEDU, но из-за большей токсичности соединение проигрывает в значении SI. Антивирусная активность 5*-этоксикарбонилфосфоната XIV была сравнима с активностью TEDU или превышала её.

Эффективность производных TEDU может зависеть от стабильности и пути метаболизма соединения. Мы определили стабильность и направление гидролиза в PBS и сыворотке крови человека соединений XII-XVI.

Единственным продуктом гидролиза соединений XII, XIII, XV и XVI был TEDU. Времена полужизни соединений в условиях химического гидролиза превышали 1 неделю. В сыворотке крови соединения XII, XIII, XV и XVI также были стабильны. Степень гидролиза 5*-карбоксифосфоната ХП1 через 24 часа не превышала 3%. Время полужизни 5*-фторфосфата XVI в сыворотке было 8 часов.

Более подробно мы изучили гидролиз наиболее активного 5'-этоксикарбонилфосфоната XIV (табл. 6). В PBS через 24 часа соединение гидролизовалось на 13 % с образованием 5'-карбоксифосфоната XIII и TEDU.

Таблица б. Стабильность соединения XIV в PBS и нормальной сыворотке крови человека.

Время PBS Нормальная сыворотка крови

инкуб., Относительное содержание Относительное содержание

часы компонентов в пробе * компонентов в пробе*

3 XIV:XI1I:TEDU 97:3:0 XIV:XIH:TEDU 72:26:2

7 X1V:XIII:TEDU 92:8:0 XIV:XIII:TEDU 47:50:3

24 XIV:XIII:TEDU 87:9:4 XIV:XI1I:TEDU 40:51:9

♦По результатам ВЭЖХ анализа. Условия элюции: преколонка С-2 (40 мкм, 4x5мм); колонка Nucleosil С-18 (7 мкм, 4x150мм); градиент 66% МеОН в 5мМ калий-фосфатном буфере (рИ 5.8); 0% 5 мин, 00100% -40 мин, 100% в течение 5 мин. Времена удерживания: TEDU: t "21 мин; ХГП: t**4,5 мин; XIV: t" 23 мин.

При инкубации соединения XIV в сыворотке крови скорость гидролиза возрастала, а соотношение образующихся продуктов изменялось. Разная скорость накопления TEDU при гидролизе фосфоната XIV в PBS и в сыворотке, а также очень низкая скорость превращения образующегося при гидролизе XIII в TEDU, позволяет предположить что: 1) образующийся TEDU является продуктом гидролиза только XIV, а не гидролиза XIV и XIII; 2) увеличение степени превращения 5*-этоксикарбонилфосфоната XIV в TEDU обусловлено ферментативным гидролизом.

Т.о., основной причиной низкой активности соединений XII, XIII, и XVI является их высокая гидролитическая стабильность.

Превращения 5'-этоксикарбонилфосфоната TEDU (XIV) в культуре клеток Vero,

Мы надеялись, что скорость гидролиза TEDU увеличится при прохождении через клеточную

мембрану, как было показано нами на примере HpAZT. Мы сравнили проникновение и

превращения TEDU и соединения XIV в неиифицированной и инфицированной HSV-1

культурах клеток Vero. Оба соединения проникают в клетку в количестве не менее 50 пмоль

на 106 клеток, причем скорости проникновения TEDU и соединения XIV сопоставимы. В

лизате неинфицированных клеток Vero после их инкубации с соединением XIV

присутствовали соединение XIV и TEDU. Относительное содержание образующегося TEDU

существенно повышалось по сравнению с гидролизом в сыворотке (табл. 7).

Таблица 7. Относительное содержание соединения XIV и его метаболита (TEDU) в культуре клеток Vera,

Время инкубации, часы Неинфицированная культура клеток Инфицированная культура клеток

X1V:TEDU,% XIV:TEDU,%

7 50:50 96:4

24 17:83 98:2

Соединение XIII в лизате клеток не найдено. Сравнение продуктов, образующихся при гидролизе в сыворотке и при инкубации с культурой клеток, позволяет предположить, что гидролиз соединения XIV в культуре клеток Vero и сыворотке крови человека катализируется разными ферментами. Доля TEDU в инфицированной культуре клеток при инкубации с XIV была значительно ниже, чем при инкубации XIV с неиифицированной культурой клеток, что может объясняться его утилизацией.

Превращения S'-этоксикарбонилфосфоната TEDU в мышах. Мы предположили, что медленное высвобождения TEDU при деградации соединения XIV может понизить токсичность препарата in virn В работе, проведенной совместно с В.Л. Андроновой, была определена острая токсичность препарата на мышах и показано, что XIV менее токсичен, чем TEDU (табл. 8).

Таблица 8, Значения острой токсичности для TEDU и соединения XIV,

Соединение LDjo*, мг/кг

TEDU 736,71

XIV 1014,20

*1ЛЭ}<> - доза препарата, вызывающая при однократном введении гибель 50% животных. Мы изучили накопление XIV в различных органах и крови мыши. Животным внутрибрюшинно вводили соединение XIV в количестве 4 мкмоль (200 мг/кг веса) и

определяли содержание препарата и его метаболитов в легких, печени, мозге, селезепке и крови (табл.9).

Таблица 9. Накопление и превращение XIV в крови и органах мыши через 24 часа.

Источник Содержание XIV * Относительное содержание компонентов, Х1У:ТЕБи,%*

Кровь 0,6 мкмоль 92:8

Печень 0,8 мкмоль 50:50

Мозг 0,01 мкмоль 80:20

♦По результатам ВЭЖХ анализа Через 4 часа после введения препарата в крови присутствовал как 5'-этоксикарбонилфосфонат XIV, так и ТЕОи. Далее в течение 20 часов относительное содержание соединения XIV в крови росло. В мозге через 4 часа и до окончания эксперимента присутствовали и XIV и ТЕОи. В печени также были обнаружепы оба соединения, причем степень превращения XIV в ТЕИХ! была наибольшей. Т.о. 5'-этоксикарбонилфосфонат XIV является депо-формой ТЕОи, накапливающейся в печени и гидролизующейся под действием ферментов печени.

5'-Этоксикарбонилфосфонат XIV является депо-формой ТЕИи, позволяющей понизить уровень его накопления в организме. Накопление препарата в мозге позволяет предположить, что фосфонат XIV способен преодолевать гематоэнцефалический барьер, что важно при лечении герпесвирусных инфекций.

ВЫВОДЫ.

1. С использованием радиоактивно меченого 5'-[6-3Н]-фосфоната 3*-азндо 2\3'-дидезокситимидина (IIpAZT) показано, что препарат является депо-формой З'-азидо-2 ',3 *-дидезокситим идина (AZT) в культуре клеток и на животных моделях.

a) Найдено, что скорость накопления 5*-монофосфата 3*-азидо-2\3'-дидезокситимидина (AZTMP) в клетках HL-6G при инкубации с HpAZT ниже, чем при инкубации с AZT, что может объяснять пониженую токсичность IIpAZT in vitro по сравнению с AZT. Определены значения Кт и kca, для реакций гидролиза AZTMP и HpAZT 5 '-нукл еотидаз ой из Crotalus atrox venom.

b) Скорость накопления AZT и AZTMP в крови и органах мыши при различных методах введения HpAZT ниже, чем при введении AZT, что может являться одной из причин понижения клинической токсичности препарата.

c) Показано различие динамики накопления AZT в крови кролика при пероральном введении [6-3H]-AZT или [6-3Н]-HpAZT. Десятикратное увеличение дозы [ó-^J-AZT или [S-^l-HpAZT не изменяет скорости накопления AZT в крови и не влияет на относительную долю образующегося AZT.

2. Определены стабильность и направления гидролиза серии фосфонатных эфиров ацикловира, проявляющих антигерпетическую активность in vitro. Показано, что эфиры фосфоната и фосфоноформиата 9-[(2-шдроксиэтокси)метил]гуанина (ACV) являются депо-формами ACV и найдена корреляция между стабильностью соединений в сыворотке крови и их антивирусной активностью. Определены значения Кт и кем реакций гидролиза монофосфата 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (ACVMP) и Н-фосфоната 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (HpACV), катализируемого 5'-нуклеотидазой из Crotalus atrox venom. С использованием радиоактивно меченого [8-3Н]-фосфонат 9-[(2-шдроксиэтокси)метил]гуанина (HpACV) показано, что соединение не эффективно в качестве депо-формы ACV в культуре клеток Vero, что может объяснять значительное понижение его антигерпетической активности.

3. Определены стабильность и направления гидролиза серии эфиров 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина (TEDU), проявляющих антигерпетическую активность. Изучение превращений S'-этоксикарбонилфосфоната TEDU показало, что соединение является депо-формой TEDU и позволяет снизить токсичность препарата in vivo.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Skoblov Yu., Karpenko I., Shirokova E., Popov K., Andronova V„ Galegov G., Kukhanova M. Intracellular metabolism and pharmacokinetics of 5*-hydrogenphosphonate of 3'-azido-2'(3*-dideoxythymidine, a prodrug of 3*-azido-2\3'-dideoxythymidine. Antiviral Research, 2004, 63, 107-113.

2. Андронова В.Л., Карпенко И. Л., Александрова Л. А.,Скоблов Ю.С., Адани А., Галегов Г.А. 5'-Фосфонаты 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина: синтез и антивирусные свойства. Биоорган. Химия, 2002, 28,455-461

3. Hyicheva T.N., Fedyuk N.V., Karpenko I.L.^Uexandrova L.A., Pokrovsky A.G. 4'-Thio-5-ethyl-2'-deoxyuridine 5-phosphonates: synthesis and antiviral properties. Collection Symposium Series "Chemistry of Nucleic Acid Components ", 2002,5, 295-298

4. Katpenko I.L., Jasko M.V., Andronova V.L,, Ivanov A.V., Kukhanova M.K., Galegov G.A., Skoblov Y.S. Synthesis and antiherpetic activity of acyclovir phosphonates. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003,22, 3,319-328

5. Ясько M.B., Уланова Н.Ю., Андронова В.Л., Карпенко И.Л., Иванов А.В., Кухапова М.К., Галегов Г.А., Скоблов Ю.С. Синтез и антигерпетическая активность фосфопатных эфиров ацикловира. Биоорган. Химия, 2004, 30, б, 1-8

6. Андронова В.Л., Карпенко ИЛ., Александрова Л.А., Скоблов Ю.С. Изучение эффективности 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиурйдгта (ТЭДУ) и его производашх при экспериментальной инфекции мышей, вызванной вирусом герпеса простого. Антибиотики и химиотерапия, 2003,48, 3-6

Тезисы:

1. Karpenko I.L., Andronova V.L, Ivanov A.V., Skoblov Yu.S. Acyclovir phosponates: metabolic pathway and antiviral properties. Abstract Book of Conference for young scientists PhD students and students on mot. biology & genetics, 2003, 77

2. Karpenko I.L., Andronova V.L, Alexandreva L.A., Skoblov Yu.S. 5*-phosponates derivatives оf 4'-thio-5-ethyl-2'deoxynridine: metabolic pathway and antiviral properties. Abstract Book of Conference for young scientists PhD students and students on mol. biology & genetics, 200], 96

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01Л 2.99 г. Подписано к печати 13.09.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 609. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-Й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Карпенко, Инна Леонидовна

Список сокращений.

Введение.В

Обзор литературы

I. Депо-формы модифицированных нуклеозидов - ингибиторов репликации ВИЧ.

Производные цикло 5 '-О-карбоксикислот.

Производные бицикламкарбоксикислоты AZT.

Производные L-сминокислот.

5'-О-производные на основе алифатических жирных кислот.

5 '-О-(со-гидроксиалкил) производные AZT и ЗТС.

И. Модифицированные по фосфатному остатку аналоги нуклеотидов как депо формы аналогов нуклеозидов и соответствующих 5'-монофосфатов.

Депо-формы AZTMP с транспортерными заместителями.

Конъюгаты аналогов dNMP на основе эфиров э/сирных кислот.

Депо-формы на основе PFA-коныогатов.

Депо-формы на основе фосфодиамидов.

Депо-формы на основе фосфотриэфиров.

Депо-формы на основе фосфоамидатов.

5 '-Н-фосфонаты модифицированных нуклеозидов.

S'-F-фосфат AZT.

Депо-формы FLT.

Депо-формы нуклеотидов на основе bis-POM и сталогичныхмаскирующих групп.

Депо-формы hú основе тиазамещенных маскирующих групп.

Депо-формы на основе арилоксифосфоамидсипов (РРА).

Депо-формы на основе циклосалигениловых (cycloSal) производных.

III. Депо-формы фосфонатных аналогов ациклических нуклеозидов.

Депо-форма РМЕА на основе моно- и ди-(алкил- и арил-)эфиров.

Депо-формы ациклических нуклеотидов на основе bis(POM) и bis(POC) производных.

РРА депо-формы ациклических нуклеотидов.

IV. Депо-формы ациклических аналогов гуанозина, обладающие анти-HSV активностью.

Bis (SATE) депо-формы ациклических аналогов гуанозина.

CycloSal депо-формы ациклических аналогов гуанозина.

РРА- производные.

Депо-формы ACVua основе фосфолипидов.

Депо-формы GCV.

V. Пути метаболизма депо-форм модифицированных нуклеозидов и нуклеотидов.

Материалы и методы

Реактивы и препараты.

Клеточные культур.

Приборы и методы анализа.

Определения гидролитической стабильности.

Изучение метаболизма [б- HJ-HpAZT и [б- Щ-AZTua культуре клеток.

Изучение метаболизма [8-3H]-HpACVна культуре клеток.

Изучение превращений TEDU и его производных в культуре клеток.

Изучение накопления и превращения [б- H]-HpAZT и б-3 HJ-AZT на животных. р. Превращение производных TEDUв органах мыши.

Статистическая обработка результатов измерений.

Результаты и обсуждение

I. Стабильность и превращения HpAZT.

Стабильность [б-3И]-HpAZT в PBS, сыворотке крови человека, кулътуральной среде, лизате клеток и гомогенсипе печени мышей.

Метаболизм [б-3И]-HpAZT в культуре клеток HL-60.

Определение кинетических параметров реакции гидролиза

Ч> HpAZT и AZTMP катализируемого 5 '-нуклеотидазой.

Превращения [6-3Ii]-HpAZT в крови и органах мыши.

Преврагцеиия HpAZT в крови кролика.

И. Стабильность и метаболизм фосфонатных эфиров ACV.

Определение антивирусной активности, гидролитической стабильности и направления химического и ферментативного гидролиза.

Метаболизм [8-3Н]-НрАCV в культуре клеток Vero.

Определение кинетических параметров реакции гидролиза

ACVMP и HpACV, катализируемого 5'нуклеотидазой.

III. Метаболизм 5'-фосфатных производных 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина.

Антивирусная активность, стабильность и возможные пути метаболизма 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина и его эфиров.

Метаболизм 5 '-этоксикарбонилфосфоната TEDU в культуре клеток Vero, инфицированных HSV-1.

Превращения 5 '-этоксикарбонилфосфоната TEDU in vivo.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пронуклеозидные ингибиторы репликации ВИЧ и вируса герпеса: стабильность и превращения в культурах клеток и в животных"

Дизайн антивирусных препаратов основывается на создании соединений, способных воздействовать на различные стадии развития вируса. Основными требованиями являются высокая эффективность, низкая токсичность соединений и медленное развитие резистентности к препарату. Успех в создании антивирусных препаратов зависит от накопления информации о строении, «жизненном цикле» вируса, стадий его репликации, а также от информации об эффективности проникновения препарата, механизме его действия, метаболизме и катаболизме [2].

Соединения, проявляющие антивирусную активность, можно разделить на несколько групп в соответствии с механизмом действия. Первая группа состоит из аналогов нуклеозидов и нуклеотидов. После фосфорилирования вирусными нуклеозид- и нуклеотидкиназами до трифосфатов они становятся субстратами обратных транскриптаз или ДНК-полимераз вирусов и включаются в качестве терминаторных субстратов в вирусную ДНК, прерывая ее дальнейший синтез [3,4].

Вторая группа включает соединения ненуклеозидной природы, для которых характерно "несубстратное" связывание с вирусными ферментами, участвующими в репликации вирусов, и ингибирование фермента за счет изменения конформации егоактивного центра. К третьей группе соединений можно отнести ингибиторы рецепторов клеточной мембраны, обеспечивающие узнавание и проникновение вируса в клетку. Дизайн этой группы соединений основан на структурной гомологии препарата с соответствующими белками вируса. Четвертая группа включает ингибиторы вирусной протеазы, созданные на основе соединений пептидной природы [1,2].

Основной мишенью при создании анти-ВИЧ препаратов является обратная транскриптаза (ОТ) ВИЧ, ключевой фермент, участвующий в репликации вируса. [4,5]. На рисунке 1 представлены модифицированные нуклеозиды, ингибиторы ОТ ВИЧ, применяемые в клинике для лечения ВИЧ инфицированных людей: 3'-азидо2'3'-дидезокситимидин (AZT, зидовудин, Retrovir™); 2',3'-дидезоксицитидин (ddC, залцитабин, Hivid™); 2'3'-дегидро-3'-дезокситимидин (сЦТ, ставудин, Zerit™); 2',3'-дидезокси-З'-тиацитидин (ЗТС, ламивудин, Epivir'™); 2',3'-дидезоксиинозин (ddl, диданозин, Videx™); (И1,48)-4-[2-амино-6-(циклопропиламино)-9Н-пурин-9-ил]-2-циклопентен-1-метанол (ABC, абакавир, Ziagen™) [6].сн,.чоI 4NHлN ОНОNiAZTRH,г»**'110о' VddCи^ ЛY NHLan' -оно"КW4,ТNHjО'' "N"L<--------n"N' "Г-Oil HQ.О.

Г'>—ira1 I.H)NпоэтеddlABCРис. 1Несмотря на достаточно высокую эффективность препаратов (особенно при одновременном применении нескольких препаратов, "коктейлей"), все аналоги нуклеозидов имеют ряд существенных недостатков. В частности, это высокая токсичность и короткое время выведения препарата, требующее частого введения препарата. Кроме того, после долговременного применения препаратов развитие инфекции становится неконтролируемым изгза возникновения резистентных вариантов вируса [5,7].

Все препараты нуклеозидной природы после проникновения в клетки должны пройти каскад фосфорилирования до соответствующих 5'-трифосфатов, чтобы стать субстратами обратной транскриптазы вируса и включиться в З'-конец растущей вирусной ДНК. Эффективность препарата определяется эффективностью фосфорилирования клеточными^ киназами и взаимодействием с ОТ вируса. Скорость образования фосфорилированныхформ аналогов нуклеозидов зависит от структуры аналога [6]. Так, первая стадия фосфорилирования кТХ, первого утвержденного для клинического применения анти-ВИЧ препарата, проходит • со скоростью, равной скорости фосфорилирования природных нуклеозидов, в то время как скорость второй стадии составляет примерно 0,3% по сравнению с фосфорилированием природного сПЧМР. При фосфорилировании с14Т наблюдается обратная ситуация: наиболее медленной и малоэффективной стадией► ■является первая стадия образования сЦТМР, в то время как вторая стадия фосфорилирования до с14ТВР высоко эффективна. Накопление AZTMP в клетках является одной из причин токсичности препарата: АЕТМР ингибирует клеточные тимидин- и тимидилаткиназы, что приводит к дисбалансу в соотношениях сГЫТР, понижает активность некоторых клеточных ферментов, включая 3'—5' экзонуклеазу, играющую важную роль в репарации ДНК [8, 9]. Кроме того, токсичность К1Х связана с образованием одного из метаболитов AZT в печени, а именно З'-аминотимидина [10, 11, 12]. Короткое время жизни AZT в организме определяется быстрым образованием впечени его метаболита - 5'-глюкоронида азидотимидина, который выводится из организма с мочой [13].

Для улучшения терапевтических характеристик препаратов нуклеозидной природы была выработана стратегия создания депо-форм нуклеозидов (пронуклеозиды) или нуклеотидов (пронуклеотиды) [2]. Депо-формы - это фармакологически неактивные соединения, претерпевающие после проникновения в клетки химическую или ферментативную трансформацию с образованием фармакологически активной формы, Депо-формы аналогов.нуклеозидов должны иметь высокую антивирусную активность при низкой токсичности, улучшенные биодоступность и фармакокинетические характеристики, а также пролонгированное действие по сравнению с соответствующими аналогами нуклеозидов. Дизайн депо-форм нуклеотидов (пронуклеотиды) направлен на создание таких форм аналогов (ШМР, которые должны быть стабильны в плазме крови, но после проникновения в клетки химически или ферментативно превращаться в аналоги ёКМРэ. Такой подход позволит сократить путь превращения аналога нуклеозида в соответствующий сНМТР и избежать первой, наиболее неэффективной стадии кинирования для большинства аналогов нуклеозидов. Применение 5'-монофосфатов аналогов нуклеозидов невозможно из-за их высокой лабильности в плазме крови и низкой способности заряженных соединений к проникновению в клетку. В разделах 1.1 и 2.1-2.10 будут рассмотрены подходы к созданию депо-форм аналогов нуклеозидов (пронуклеозидов), а в разделе 2.11-2.14 депо-форм аналогов нуклеотидов (пронуклеотидов). В разделах 3 и 4 рассматриваются возможные депо-формы ациклических аналогов нуклеотидов и нуклеозидов. В разделе 5 рассмотрены пути метаболизма некоторых существующих антивирусных препаратов и их депо-форм.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Карпенко, Инна Леонидовна

выводы.

1. С использованием радиоактивно меченого 5'-[6-3Н]-фосфоната З'-азидо 2',3'-дидезокситимидина (HpAZT) показано, что препарат является депо-формой З'-азидо-2',3'-дидезокситимидина (AZT) в культуре клеток и на животных моделях. a) Найдено, что скорость накопления 5'-монофосфата 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина (AZTMP) в клетках HL-60 при инкубации с HpAZT ниже, чем при инкубации с AZT, что может объяснять пониженую токсичность HpAZT in vitro по сравнению с AZT. Определены значения Кт и kCat для реакций гидролиза AZTMP и HpAZT 5'-нуклеотидазой из Crotcilus atrox venom. b) Скорость накопления AZT и AZTMP в крови и органах мыши при различных методах введения HpAZT ниже, чем при введении AZT, что может являться одной из причин понижения клинической токсичности препарата. c) Показано различие динамики накопления AZT в крови кролика при пероральном введении

6-H]-AZT или [6- H]-HpAZT. Десятикратное увеличение дозы [6- H]-AZT или [6-3H]-HpAZT не изменяет скорости накопления AZT в крови и не влияет на относительную долю образующегося AZT.

2. Определены стабильность и направления гидролиза серии фосфонатных эфиров ацикловира, проявляющих антигерпетическую активность in vitro. Показано, что эфиры фосфоната и фосфоноформиата 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (ACV) являются депо-формами ACV и найдена корреляция между стабильностью соединений в сыворотке крови и их антивирусной активностью. Определены значения К,„ и kcal реакций гидролиза монофосфата 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (ACVMP) и Н-фосфоната 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (HpACV), катализируемого 5'-нуклеотидазой из Crotalus atrox venom. С использованием радиоактивно меченого [8-3Н]-фосфонат 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (HpACV) показано, что соединение не эффективно в качестве депо-формы ACV в культуре клеток Vero, что может объяснять значительное понижение его антигерпетической активности. Определены стабильность и направления гидролиза серии эфиров 4'-тио-5-этил-2'-дезоксиуридина (TEDU), проявляющих антигерпетическую активность. Изучение превращений 5'-этоксикарбонилфосфоната TEDU показало, что соединение является депо-формой TEDU и позволяет снизить токсичность препарата in vivo.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю самую искреннею благодарность М.К Кухановой за руководство при выполнении работы и терпение при редактировании текста диссертации, Ю.С Скоблову за консультативную помощь при выполнении работы и участие в критическом обсуждении результатов, В.Л Андроновой за многолетнее участие в совместной работе. М.В. Ясько за критические замечания по ходу работы и при совместном написании статей. Я очень признательна А.Л. Хандажинской, Л.А. Александровой, А.Р. Хомутову и другим сотрудникам ЛХБА за доброе отношение и готовность помочь.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Карпенко, Инна Леонидовна, Москва

1. De Clercq Е. Antiviral drugs: current state of the art., J. Clin.Vir. 2001, 22, 73-89.

2. De Clercq E; Strategies in the design of antiviral drugs., Nature Reviews/Drug Discovery, 2002, 1,13-25.

3. Sommadossi J-P. Nucleoside analogs: Similarities and Differences., AIDS, 1993, 16 (Suppl 1), S7-15.

4. De Clercq E. HIV Inhibitors targed at the Reverse Transcriptase., AIDS Research and Human Retroviruses, 1992, 8(2), 119-34.

5. Kukhanova M., Krayevsky A., Prussof W., Cheng Y-C., Design of Anti-Hiv Compounds: From Nucleoside to Nucleoside 5Triphosphate Analogsm., Problems and Perspectives Current Pharmaceutical Design, 2000, 6, 585-98.

6. Jones R.J., Bischofberger N., Minireview: nucleotide prodrugs, Antiviral Res., 1995, 27(1-2), 1-17.

7. Kukhanova M.K. and Shirokova E.A. 5'-0-Modified Nucleoside Analogues as Prodrugs of Anti-HIV Agents., Frontiers in Nucleosides and Nucleic Acids, Ed. Shinazi R. F. and Liotta D. C„ IHL Press, 2004, 341-63.

8. Zhou X.J., Sommadossi J.P., Comparative pharmacokinetics of zidovudine and its toxic catabolite 3'-amino-3'-deoxythymidme in HIV-infected patients., AIDS Res Hum Retroviruses. 1996,12(3), 229-33.

9. Eagling V.A., Howe J.L., Barry M.J., Back DJ.; The metabolism of zidovudine by human liver microsomes in vitro: formation of 3'-amino-3'-deoxythymidine., Biochem Pharmacol. 1994, 19,48(2), 267-76

10. Zimmerman T.P., Domin B.A., Mahony W.B., Inhibition of thymidine transport by 3'-azido-3'-deoxythymidine and its metabolites., Oncol Res., 1993, 5(12), 483-7

11. Cretonn E.M., Schinazi R.F., McClure M.F., Anderson D.C., Sommadossi J.-P., Pharmacokinetics of 3'-Azido-3'-Deoxythymidine and Its Catabolites and Interactions with Probenecid in Rhesus Monkeys., Antimicrob. Agents. Chemother., 1991, 35, 5, 801-807.

12. Parang K., Wiebe L.I., Knaus E.E., Novel approaches for design 5'-0-Ester Prodrugsof 3'-azido-2'3'-dideoxythymidine., Current Medicinal Chemistry, 2000,1, 995-1036.

13. Wiebe L.I., Knaus E.E., Concepts for the design of anti-HIV nucleoside prodrugs for treating cephalic HIV infection., Adv Drug Deliv Rev., 1999, 39(1-3), 63-80.

14. Sharma A.P., Ollapally A. P., Lee H., Synthesis and anti-HIV activity of prodrugs of azidothymidine., Antiviral Chem. Chemother., 1993, 4, 93-96

15. Balagopala M.L., Ollapally A.P., Lee H.J., Synthesis and anti-HIV activity of steroidal prodrugs of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT)., Cell Mol. Biol., 1995, 41, (Suppl 1), Sl-7.

16. Kozak SL, Heard JM, Kabat D. Segregation of CD4 and CXCR4 into distinct lipid microdomains in T lymphocytes suggests a mechanism for membrane destabilization by human immunodeficiency virus., J Virol. 2002, 76(4), 1802-15.

17. Markovic I, Clouse KA.Recent advances in understanding the molecular mechanisms of HIV-1 entry and fusion: revisiting current targets and considering new options for therapeutic intervention., Curr HIV Res., 2004,2(3), 223-34.

18. Dessolin J., Galea P., Vlieghe P., Chermann J.-C., and Kraus J.-L., New Bicyclam-AZT Conjugates: Design, Synthesis, Anti-HIV Evaluation, and Their Interaction with CXCR-4 Coreceptor., J. Med. Chem., 1999, 42,229-241

19. Lupia R.H., Ferencz N., Lertora J.J., Aggarwal S.K., George W.J., Agrawal K.C., Comparative pharmacokinetics of two prodrugs of zidovudine in rabbits: enhanced levels of zidovudine in brain tissue., Antimicrob. Agents Chemother. 1993, 37(4), 818 -24.

20. Aggarwal S.K., Gogu S.R., Rangan S.R.S., Agrawal K.C., Synthesis and biological evaluation of prodrugs of zidovudine., J.Med.Chem., 1990, 33, 1505-10.

21. Turk G., Moroni G., Pampuro S., Brinon M.C., Salomon H., Ahtiretroviral activity and cytotoxicity of novel zidovudine (AZT) derivatives and the relation to their chemical structure., International Journal of Antimicrobial Agents, 2002, 20, 282-288.

22. Han H.K., Oh D.M., Amidon G.L,. Cellular uptake mechanism of amino acid ester prodrugs in Caco-2/hPEPTl cells overexpressing a human peptide transporter., Pharm Res., 1998,15(9), 1382-6.

23. Torrence P.F., Kinjo J., Khamnei S., Greig N.H., Synthesis and pharmacokinetics of a dihydropyridine chemical delivery system for the antiimmunodeficiency virus agent dideoxycytidine., J. Med. Chem., 1993, 36(5), 529-37.

24. Gogu S.R., Aggarwal S.K., Rangan S.R., Agrawal KC., A pro-drug of zidovudine with enhanced efficacy against human immunodeficiency virus., Biochem Biophys Res Commun., 1989, 160(2), 656-61. Erratum in: Biochem Biophys Res Commun., 1989, 162(3), 1591.

25. Kawaguchi T., Ishikawa K., Seki T., Juni K., Ester prodrugs of zidovudine., J. Pharm. Sci., 1990, 79(6), 531-33.

26. Kawaguchi T., Endoh T., Seki T., Juni K., Plasma concentrations of zidovudine in rats via oral administration of its ester prodrugs., J. Pharm. Sci., 1991, 80(4), 404-05.

27. Parang K., Wiebe L.I., Knaus E.E., Pharmacokinetics and tissue distribution of (+/-)-3-azido-2',3'-dideoxy-5'-0-(2-bromomyristoyl)thymidine, a prodrug of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine (AZT) in mice., J Pharm Pharmacol., 1998, 50(9), 989-96.

28. Price H. P., Menon M.R., Panethymitaki C., Goulding D., McKean P.G., Smith D.F., Myristoyl-CoA:protein A^-myristoyltransferase, an essential enzyme and potential drug target in kinetoplastid parasites., J.B.C., 2003,278,9,7206-14

29. Hornych A., Oravec S., Girault F., Forette B., Horrobin D.F., The effect of gamma-linolenic acid on plasma and membrane lipids and renal prostaglandin synthesis in older subjects., Bratisl. Lek. Listy., 2002, 103(3), 101-07.

30. Gosselin G., Girardet J.L., Perigaud C„ Benzaria S„ Lefebvre I„ Schlienger N„ Pompon A„ Imbach J.-L., New insights regarding the potential of the pronucleotide approach in antiviral chemotherapy., Acta Biochim. Pol., 1996,43(1), 196-208.

31. Egron D., Lefebvre I., Perigaud C., Beltran T., Pompon A., Gosselin G., Aubertin A.M., Imbach J.-L., Anti-HIV pronucleotides: decomposition pathways and correlation with biological activities., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8(9), 1045-50.

32. Wagner C.R., Iyer V.V., Mclntee E.J., Pronucleotides: toward the in vivo delivery of antiviral and anticancer nucleotides., Med. Res. Rev., 2000, 20(6), 417-51.

33. Namane A., Gouytte C., Fillion M.-P., Fillion G., Huynh-Dinh T., Improved brain delivery of AZT using a glycosyl phosphotreister prodrug., J.Med. Chem., 1992, 35, 30393044.

34. Hong C.I., Nechaev A., Kirisits A.J., Vig R„ West C.R., Manouilov K.K., Chu C.K., Nucleoside conjugates. 15. Synthesis and biological activity of anti-HIV nucleoside conjugates of ether and thioether phospholipids., J. Med. Chem., 1996, 39(9), 1771-7.

35. Meyer K.L., Marasco CJ.Jr., Morris-Natschke S.L., Ishaq K.S., Piantadosi C., In vitro evaluation of phosphocholine and quaternary ammonium containing lipids as novel anti-HIV agents., J. Med. Chem, 1991,34(4), 1377-83.

36. Hostler K.Y., Stuhmiller L.M., Lenting H.B.M., van den Bosch H., Richman D.D., Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral Nucleosides., J. Biol. Chem., 1990, 265,6112-17.

37. Rosowsky A., Saha J., Fazely F., Koch J., Ruprecht R.M., Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by phosphonoformate esters of 3'-azido-3'-deoxythymidine., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990, 172(1), 288-94.

38. Meier C, Aubertin A.M, de Monte M., Faraj A, Sommadossi J.P., Perigaud C., Imbach J.L.,Gosselin G., Synthesis and antiviral evaluation of SATE-foscarnet prodrugs and new foscarnet-AZT conjugates., Antivir. Chem. Chemother., 1998, 9(1), 41-52.

39. Phelps M.E., Woodmann P.W., Danenberg P.V.,Synthesis and biological activity of 5-fluoro-2'-deoxyuridine -5'-phosphorodiamidates., J. Med. Chem., 1980,23, 1229-32.

40. Shipitsyn A.V., Zakirova N.F., Belanov E.F., Pronyaeva T.R., Fedyuk N.V., Kukhanova M.K., Pokrovsky A.G. Phosphorodiamides as Prodrugs for Antiviral Nucleosides., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003, 22(5-8), 963-66.

41. Bodor,N. PCT INT. Appl. October 15, 1992, WO 92/17185, Chem. Abstr., 119, 80205j.

42. McGuigan C, Pathirana RN, Mahmood N, Devine KG, Hay AJ. Aryl phosphate derivatives of AZT retain activity against HIV1 in cell lines which are resistant to the action of AZT. Antiviral Res. 1992, 17(4), 311-21.

43. McGuigan C., Pathirana R.N., Balzarini J., De Clercq E., Intracellular delivery of bioactive AZT nucleotides by aryl phosphate derivatives of AZT., J Med Chem., 1993, 36(8), 1048-52.

44. McGuigan C., Davies M., Pathirana R., Mahmood N., Hay A.J., Synthesis and anti-HIV activity of some novel diaryl phosphate derivatives of AZT., Antiviral Res., 1994, 24(1), 69-77.

45. Devine K.G., McGuigan C., O'Connor T.J., Nicholls S.R., Kinchington D., Novel phosphate derivatives of zidovudine as anti-HIV compounds., AIDS. 1990, 4(4), 371-3.

46. Beltran T., Egron D., Lefebvre I., Perigaud C., Pompon A., Gosselin G., Aubertin A.M., Imbach J.-L., Anti-HIV pronucleotides: SATE versus phenyl as a protecting group of AZT phosphoramidate derivatives., Nucleosides Nucleotides, 1999,18(4-5), 973-5.

47. McGuigan C.,Cahard D., Salgado A., Balzarini J., De Clercq E., J Phosphoramidates as potent prodrugs of anti-HIV nucleotides studies in amino region., Antivir Chem Chemother., 1996, 7,31-36.

48. Mclntee E.J., Remmel R.P., Schinazi R.F., Abraham T.W., Wagner C.R., Probing the mechanism of action and decomposition of amino acid phosphomonoester amidates of antiviral nucleoside prodrugs., J Med Chem., 1997, 40(21), 3323-31.

49. Chang S., Griesgraber G.W., Southern P.J., Wagner C.R., Amino acid phosphoramidate monoesters of 3'-azido-3'-deoxythymidine: relationship between antiviral potency and intracellular metabolism., J. Med. Chem., 2001, 44, 223-31.

50. Song H., Griesgraber G.W., Wagner C.R., Zimmerman C.L., Pharmacokinetics of amino acid phosphoramidate monoesters of zidovudine in rats., Antimicrob Agents Chemother., 2002, 46(5), 1357-63.

51. Song H., Johns R., Griesgraber G.W., Wagner C.R., Zimmerman C.L., Disposition and oral bioavailability in rats of an antiviral and antitumor aminoacid phosphoramidate prodrug of AZT-monophosphate., Pharm Res. 2003,20(3), 448-51.

52. Tarusova N.B., Khorlin A.A., Krayevsky A.A., Korneeva M.N., Nosik D.N., Kxuglov I.V., Galegov G.A., Bibilashvili R.S., Inhibition of HIV reproduction in cell culture by 5'-phosphonates of 3'-azido-2'3'-dideoxynuleoside., Mol.Biol., 1989, 23, 1716-24.

53. Krayevsky A. A., Tarusova N.B., Zhu Q.Y., Vidal P., Chou T.C., Baron P., Polsky B.,

54. Jiang X.J., 5'-Hydrogenphosphonates and 5'-methylhydrogenphosphonates of sugar modified pyrimidine nucleoside'as potential anti-HIV agents., Nucleosides Nucleotides, 1992, 11, 17796.

55. Gosselin G., Perigaud C., Lefebvre I., Pompon A., Aubertin A.M., Kirn A., Szabo T., Stawinski J., Imbach J.-L., 5'-Hydrogenphosphonates nucleoside anti-HIV analoges revisited: controversial mode of action., Antiviral Res., 1993, 22, 143-53.

56. McGuigan C., Bellevergue P., Jones B.C.N.M., Mahmood N., Hay A.J., Petrik J., Karpas A., Alkyl hydrogen phosphonate derivatives of anti-HIV agent AZT may be less toxic than the parent nucleoside analogue., Antivir. Chem. Chemother., 1994, 5(4), 271-77.

57. Boal J.H., Radhakrishnan I.P., Egan W. The 5'-Hydrogen phosphonate analog as a potensial prodrug of 3'-azido-2'3'-dideoxythymidine (AZT)., Nucleosides & Nucleotides, 1993, 12(10), 1075-84.

58. Machado J., Salomon H., Oliveira M., Tsoukas Ch., Krayevsky A.A., Wainberg A.M., Antiviral activity and resistance profile of phosphazid a novel prodrug of AZT., Nucleosides Nucleotides, 1999,18(4-5), 1025-26.

59. Cardona V.M.F., Ayi A.I., Aubertin A.M. and Guegj R., Synthesis and anti-HIV activity of some novel arylphosphate and H-phosphonate derivatives of 3'-azido-2'3'-dideoxythymidine and 2'3'-didehydro-2'3'-dideoxythymidine., Antiviral Res., 1999, 42,18998.

60. Dyatkina N.B., Arzumanov A.A., Kraevsky A.A., O'Hara B., Gluzman Y., Baron P., MacLow C., Polsky B., Synthesis and antiviral activity of some fluorinadate nucleoside derivatives., Nucleoside and Nucleotides, 1994,13, 325-37.

61. Egron D., Arzumanov A.A., Dyatkina N.B., Aubertin A.M., Imbach J.-L., Gosselin G., Kraevsky A.A., Perigaud C., Synthesis, anti-HIV activity, and stability of 5'-phosphorofluoridate derivatives of AZT., Bioorg.Chem., 2001, 29, 333-44.

62. Balzarini J., Baba M., Pouwels R., Herdewijn P., De Clerq E., Anti-retrovirus activity of 3'-fluoro- and 3'-azido-sustituted pyrimidins 2'3'-dideoxynucleotide ahaloges., Biochem. Pharmacol., 1988, 37, 2847-56.

63. McGuigan C., Colin N.M.J., Devine K.G., Nicholls S.R., O'Conner T.J., Kinchington D., Attepts to introduce chemotherapeutic nucleotides into cells: studies on the anti-HIV agent FdT., Bioorg. and Med. Chem. Lett., 1991, 1(12), 729-32.

64. Routledge A., Walker I., Freeman S., Hay A., Mahmood N., Synthesis, bioactivation and anti-HIV activity of 4-acyloxybenzyl bis(nucleosid-5'-yl) phosphates, Nucleosides Nucleotides, 1995, 14, 1545-58.

65. Puech F., Gosselin G, Lefebvre I, Pompon A, Aubertin AM, Kirn A, Imbach JL. Intracellular delivery of nucleoside monophosphates through a reductase-mediated activation process., Antiviral Res., 1993, 22(2-3), 155-74.

66. Schlienger N., Peyrottes S., Aubertin A.M., Gosselin G., Imbach J.-L., Perigaud C,, New series of mixed pronucleotides. Synthesis and anti-HIV activities of mononucleoside phenyl SATE phosphotriesters., Nucleosides Nucleotides, 1999, 18(4-5), 1025-26.

67. Peyrottes S., Gosselin G., Aubertin A.M, Perigaud C., SATE (aryl) phosphotriester series. I. Synthesis and biological evaluation., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids., 2003, 22(5-8), 903-05.

68. Zemlicka, J., Lipophilic phosphoramidates as antivaral pronucleotides, BBA Review, 2002, 1587(2-3), 276-86.

69. Egron D., Perigaud C., Gosselin G., Aubertin A.M., Imbach J.-L., Synthesis and study of a new series of phosphoramidate derivatives as mononucleotide prodrugs., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2001,20(4-7), 751-54.

70. Beltran T, Egron D, Pompon A, Lefebvre I, Perigaud C, Gosselin G, Aubertin A, Imbach J. Rational design of a new series of pronucleotide., Bioorg Med Chem Lett. 2001, 11(13), 1775-77.

71. Tobias SC, Borch RF., Synthesis and biological studies of novel nucleoside phosphoramidate prodrugs., J. Med, Chem., 2001, 44(25), 4475-80.

72. Ballatore C., McGuigan C., De Clerq E., Balzarini J. An in situ pig liver esterase assay as a useful predictive tool for the likely in vitro antiviral activity of phosphoramidate pro-drug. Nucleosides Nucleotides, 1999,18(4-5), 971-72.

73. Siddiqui A., McGuigan C., Ballatore C., Srinivasan S., De Clercq E., Balzarini J., Enhancing the aqueous solubility of d4T-based phosphoramidate prodrugs., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2000, 10(4), 381-84

74. Egron D, Imbach J.L, Gosselin G, Aubertin A.M., Perigaud C, S-acyl-2-thioethyI phosphoramidate diester derivatives as mononucleotide prodrugs, J Med Chem, 2003, 46(21), 4564-71.

75. Meier C, Lomp A, Meerbach A, Wutzler P, Synthesis, hydrolysis and anti-EBV activity of a series of 3'-modified cycloSal-BVDUMP pronucleotides. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 307-14.

76. Balzarini J, Aquaro S, Rampazzo C, Bianchi V, Perno C.-F, De Clercq E, and Meier Ch. Cyclosaligenyl-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine monophosphate: efficient intracellular delivery of d4TMP, Mol. Pharmacol, 2000, 58(5), 928-35.

77. Lorey M, Meier C, A new cyclyc phosphoramidate d4T prodrug approach cycloAmb-d4T- phosphoramidates, Nucleosides Nucleotides, 1999, 18(4-5), 947-48

78. De Clercq E, Descamps J, De Somer P, Holy A, (S)-9-(2,3-Dihydroxypropyl)adenine: an aliphatic nucleoside analog with broad-spectrum antiviral activity. Science, 1978,200, 5, 4341-49.

79. De Clercq, E., Broad-spectrum anti-DNA virus and anti-retrovirus activity of phosphonylmetoxyalkylpurines and pyrimidenes, Biochemical Pharmacology., 1991, 42(5), 963-72.

80. Oliyai R., Shaw J.-P., Sueko-Lennen C.M., Cundy K.C., Arimilli M.N., Jones R.J., Lee W.A., Aryl ester prodrug of cyclic HPMPC. Physicochemical characterization and in vitro biological stability. Pharmaceutical Research, 1999, 16, 11, 1687-93.

81. Robbins B.L., Greenhaw J., Connelly M.C., Fridland A., Metabolic pathways for activation of th antivaral agent 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine in human lymphoid cells, Antivir. Chem. Chemother., 1995,39(10), 2304-08.

82. Naesens L., Neyts J., Balzarini J., Holy A., Rosenberg I., De Clercq E., Efficacy of oral 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)-2,6-diaminopurine (PMEDAP) in the treatment of retrovirus and cytomegalovirus infections in mice, J Med Virol., 1993, 39(2), 167-72.

83. Ballatore C., McGuigan C., De Clercq E., Balzarini J., Synthesis and evaluation of novel amidate prodrugs of PMEA and PMPA. Bioorg Med Chem Lett., 2001,11(8), 1053-56.

84. Balzarini J, Haller-Meier F, De Clercq E, Meier C. Antiviral activity of cyclosaligenyl prodrugs of acyclovir, carbovir and abacavir, Antivir. Chem. Chemother., 2001, 12(5), 301-06

85. Welch C.J., Larsson A., Ericson A.C., Oberg B., Datema R., Chattopadhyaya J., The chemical synthesis and antiviral properties of an acyclovir-phospholipid conjugate. Acta Chem ScandB. 1985, 39(1), 47-54.

86. Andrei G., Snoek R., Neyts J., Sandvold M.L., Myhren F., De Clercq E., Antiviral activity of ganciclovir eladic acid ester against herpesviruses., Antviral Res., 2000, 45, 157-67.

87. Gao W.Y., Shirasaka T., Johns D.G., Broder S., Mitsuya H., Differential phosphorylation of azidothymidine, dideoxycytidine, and dideoxyinosine in resting and activated peripheral blood mononuclear cells., J Clin. Invest. 1993 May, 91(5), 2326-33.

88. Sidorov G.V., Zverkov Yu. В., Myasoedov N. F., Jasko M. V., Skoblov Yu. S., The synthesis of tritum-labelled 3'-azido~3Teoxythymidine, J. Labelled Comp. Rad., 2003, 46, 1-8.

89. Sidorov G.V., Myasoedov N.F., Yasko M.V., The synthesis of some tritium-labelled terminators of DNA synthesis, J. Labelled Comp. Rad., 1994, 34, 339-51.

90. Галегов Г.А., Шобухов В. М., Леонтьева Н. А., Ясько М.В., Синтез и антигерпетическая активность фосфорных эфиров ацикловира. Биорган. химия, 1997, 23, 906-09.

91. Walker R.T., Whale R.F.,Dyson,M.R., Coe P.L., Alderton W., Collins P., Ertil P., Lowe D., Rahim G.S., Snowden W., Littler E., Antiviral properties of 4'-S-ETDU, Nulceic Acid Res., 1994, 31 (Symp. Ser), 9-10.

92. Dyson M.R., Coe P.L., Walker R.T., The synthesis and antiviral activity of some 4'-thio-2'-deoxynucleoside analogues, J. Med. Chem., 1991, 34,2782-86.

93. Littler E., 2'-Deoxy-5-ethyl-4'thiouridine (4'-S-EtdU). A nucleoside analog with improved antiherpesvirus activity. Abstracts of the 34th ICAAC Meeting, 1994, H53, 205.

Информация о работе

Карпенко, Инна Леонидовна
кандидата химических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Пронуклеозидные ингибиторы репликации ВИЧ и вируса герпеса: стабильность и превращения в культурах клеток и в животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы