Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Профилактика микотоксикозов лошадей табунного содержания с применением пробиотика сахабактисубтил в условиях Якутии

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Профилактика микотоксикозов лошадей табунного содержания с применением пробиотика сахабактисубтил в условиях Якутии"

На правах рукописи

ЖИРКОВ АЛЕКСЕЙ ДМИТРИЕВИЧ

ПРОФИЛАКТИКА МИКОТОКСИКОЗОВ ЛОШАДЕЙ ТАБУННОГО СОДЕРЖАНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПРОБИОТИКА САХАБАКТИСУБТИЛ В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1 АПР 2015

Новосибирск 2015

005566572

005566572

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» Россельхозакадемии.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Неустроев Михаил Петрович

Официальные оппоненты: Чхенкели Вера Александровна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия», заведующая кафедрой;

Синицын Василий Андреевич

доктор ветеринарных наук, ФГБНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока», ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»

Защита состоится «14 » мая 2015 г. в «13-00 » часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01, созданного на базе ФГБНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ФГБНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62, E-mail: dis.ievsidv@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке и на сайте ИЭВСиДВ: www.ievsidv.ru: автореферат размещен на сайте ВАК РФ: www.vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан « А- _» МЯаттс/ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. ветеринар, наук, доц. ¿у^ Г.М. Стеблева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Табунное коневодство является одной из основных и перспективных отраслей сельского хозяйства Республики Саха (Якутия).

Увеличение поголовья и продуктивности табунного коневодства сдерживает ряд факторов, среди которых наиболее распространенными и причиняющими значительный экономический ушерб являются микотоксикозы (стахиботриотоксикоз, дендрохиотоксикоз, фузариотоксикоз, аспергиллез, аспергиллотоксикоз) лошадей.

Заражение кормов микотоксинами, являющимися продуктами плесневых грибов рода Fusarium, Pénicillium и Aspergillus, представляет значительную проблему, так как микотоксикозы — болезни, возникающие в результате поедания таких кормов, могут привести к гибели животных (А.В. Иванов и др., 2008). Имеется около 250 видов различных грибов, продуцирующих до 300 типов микотоксинов. Основные микотоксины, представляющие интерес в животноводстве, можно разделить на три группы: первая производные грибов рода Aspergillus (Афлатоксин); вторая — Fusarium (Зеараленон, Фумонизин, ДОН, Т-2), третья - Pénicillium и Aspergillus (Охратоксин). Наиболее благоприятный период для развития грибов: засушливое, дождливое, холодное лето, недостаток удобрений, наличие вредителей посевов (зерна). (JI.E. Матросова и др., 2005).

В связи с этим важное значение имеет санитарно-микологическая оценка пастбищ. При повышении урожайности посевных кормовых трав в зависимости от метеорологических условий, особенно в дождливые годы, при высокой влажности, повышается степень испорченности убираемого сена и уходящей под снег отавы, предназначенной для тебеневки. В таких случаях могут появиться микотоксикозы среди лошадей, которые наносят хозяйствам существенный экономический ущерб. То, что грибы являются причиной токсикоза сельскохозяйственных животных в условиях Якутии доказано П.И. Николаевым (1989) и А.А. Былгаевой (2004).

Степень разработанности темы исследования. В настоящее время разработаны физические, химические и биологические способы профилактики контаминации кормов токсигенными грибами. Большинство физических и химических методов детоксикации дорогостоящие, требуют определенных производственных затрат, влияют на показатели качества кормов и незначительно снижают количество микотоксинов. Перспективными считаются биологические способы профилактики микотоксикозов (обработка кормов живыми бактериальными культурами), при этом определенный интерес представляют аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus, как наиболее распространенные в природе антагонисты ко многим патогенным микроорганизмам и которые успешно используются в различных отраслях сельского хозяйства (А.В. Иванов, В.И. Фисинин и др., 2010).

Цель н задачи работы. Целью исследований является разработка способов применения пробиотика Сахабактисубтил, изготовленного на основе

3

Ч

штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, для профилактики микотоксикозов лошадей табунного содержания в условиях Якутии.

Для достижения цели нами поставлены следующие задачи:

- изучить грибную флору кормов тебеневочных пастбищ;

- определить фунгицидиую активность штаммов бактерий Bacillus subtilis к микроскопическим грибам, выделенным из тебеневочных пастбищ;

- обосновать способ применения пробиотика Сахабактисубтил для профилактики микотоксикозов лошадей табунного содержания.

Научная новизна. Установлено значительное распространение микроскопических грибов Mucor, Aspergillus и Fusarium в растительности тебеневочных пастбищ.

Доказано, что бактерии Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 обладают выраженным фунгицидным действием в отношении микроскопических грибов Aspergillus niger, Mucor ramosissimus, Candida albicans, Fusarium semitectum. Впервые разработан способ применения пробиотического препарата Сахабактисубтил, на основе бактерий — пробионтов из природных штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, выделенных из мерзлотных почв Якутии, при микотоксикозах лошадей табунного содержания.

Получен патент Российской Федерации на изобретение «Способ профилактики микотоксикозов лошадей» (№ 2534345 от 29.09.2014 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы. Проведен микологический мониторинг тебеневочных пастбищ, который показал высокую распространенность токсигенных грибов рода Aspergillus, Fusariu а также плесневого гриба Mucor romasissimus. Впервые установлена фунгицидная активность Вас. subtilis ТНП-3 и Вас. subtilis ТНП-5 по отношению токсигенных и плесневых грибов, выделенных из тебеневочных пастбищ. Разработанные новые способы борьбы с плесневыми и токсигенными грибами на основе пробиотического препарата Сахабактисубтил, в качестве составной части ветеринарно-профилактических мероприятий, предложены для борьбы с микотоксикозами лошадей табунного содержания.

Впервые в условиях Республики Саха (Якутия) проведены производственные испытания препарата Сахабактисубтил для профилактики микотоксикозов лошадей табунного содержания.

Разработано методическое пособие «Профилактика микотоксикозов лошадей табунного содержания в условиях Якутии», утвержденное Ученым советом Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства (протокол № 1 от 24 января 2014 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 19 марта 2014 г.), и предложено для внедрения в производство.

Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований — анализ и синтез информации по проблеме микотоксикозов,

представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной дели проведен .микологический мониторинг кормов тебеневочных пастбищ в Республике Саха (Якутия), изучено действие пробиотика Сахабактисубтил на плесневые и токсигенные грибы, а также обработанных пробиотиком сена и овса на организм лошадей при микотоксикозах. С этой целью нами были проведены отбор проб сена, овса, кормов тебеневочных пастбищ, бактериологические, микологические, гематологические, биохимические и иммунобиологические исследования, изучение кишечного микробиоценоза, фунгицидных свойств штаммов бактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Результаты микологических исследований тебеневочных пастбищ Центральных и Заречных районов РС(Я).

- Результаты испытаний препарата Сахабактисубтил для профилактики микотоксикозов лошадей табунного содержания.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается большим объемом исследований, проведенных в динамике с 2010 по 2013 гг., анализом производственных ситуаций, моделированием микотоксикозов в экспериментальных условиях, испытанием эффективности кормов, подвергнутых обработке препаратом Сахабактисубтил, при скармливании лошадям, а также статистической обработкой полученных цифровых данных.

Материалы диссертации доложены и обсуждены: на заседаниях Ученого совета Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства Россельхозакадемии (2009-2012); Объединенного ученого совета по сельскохозяйственным наукам Академии наук Республики Саха (Якутия) (20122013); на XV Международной конференции «Аграрная наука -сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии» (Петропавловск, 2012), научной конференции, посвященной 95-летию профессора М.Г. Сафронова (Якутск, 2012).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 — в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Аграрный вестник Урала», «Вестник Башкирского государственного аграрного университета») и 1 патент РФ.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на 152 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 8 рисунками, 31 таблицей. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собстве1шых исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Библиографический список включает 255 источников, из них отечественных авторов 221, зарубежных - 34.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы

Работа выполнена в 2010-2013 гг. в лаборатории по разработке микробных препаратов ГНУ Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии. Производственные опыты проведены в сельскохозяйственных кооперативах «Уруйэ» и «Соморсун» Амгинского улуса Республики Саха (Якутия).

Объектами лабораторных исследований были пробы сена, овса, корма тебеневочных пастбищ, собранные в зимний период (ноября - апрель) на местах тебеневки лошадей из под глубокого снега, а также пробы крови, сыворотки крови, фекалии лошадей разновозрастных групп и пробы почвы.

Органолептический, микологический анализы собранных образцов тебеневочных кормов проводили согласно «Методическим указаниям по санитарно-микологическому исследованию кормов», утвержденным Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 14 мая 1969 г. Микологический анализ поступивших проб почвы проводили по методам, описанным в брошюре «Методы изучения почвенных микроскопических грибов» М.А. Литвинова, утвержденные Ботаническим институтом им. B.JI. Комарова АН СССР 21 октября 1969 г. Родовую и видовую идентификацию выделенных микроорганизмов проводили согласно «Определителю бактерий Берджи» (1997) и «Определителю патогенных и условно-патогенных грибов», Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди (2001).

При исследовании кишечного микробиоценоза лошадей разновозрастных групп использованы питательные среды, приготовленные по общепринятому ГОСТу: MRS (deMan, Rogosa и Sharpe) для лактобактерий, ГМС (Гидролизатно-молочная среда) для учета стафилакокков, среда с бромтимоловым синим для иерсиний, скошенный МПА (мясо-пептонный агар) для выделения протея по Щукевичу. Выделение микроскопических грибов проведено методом непосредственного посева на агаризованные среды Сабуро и Чапека. Для спорообразующих бактерий (после прогрева до 80°С в течение 15 минут) использован МПА. При посеве применен метод разведений. Подсчет выросших колоний проводился в счетчике колоний. Учет результатов посева проведен через 18-24 часа для бактерий, а для грибов — до 110 часов.

Изучение антагонистических свойств спорообразующих бактерий рода Bacillus subtilis ТНП-3, ТНП-5 проводили методом диффузии в агар. В качестве тест-культур были использованы плесневые грибы рода Aspergillus, Fusarium, Мисог и Candida.

Для изучения влияния обработанных препаратом Сахабактисубтил кормов на организм лошадей разновозрастных групп определяли уровень общего белка — рефрактометрически; общее количество эритроцитов и лейкоцитов — путем подсчета в камере Горяева; содержание гемоглобина — гемометром Сали. Лизоцимную активность сыворотки крови рассчитывали по отношению к

Micrococcus Lyzodeicticus; бактерицидную активность - по отношению к Escherichia coli (М.П. Неустроева, В.И. Малышева 1995).

Биохимические исследовшшя на содержание общего белка и его фракций, каротина, кальция, фосфора, магния проводили в лаборатории биохимии ГНУ Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии. Анализы проведены на спектральном анализаторе NIRSCANER mo LCE 4250 производства США.

В опытах использован пробиотический препарат Сахабактисубтил, а также пробиотик на основе лакто- и бифидобактерий Лактобифадол.

Пробиотический препарат Сахабактисубтил изготовлен из штаммов бактерий Вас. subtilis ТНП-3 и Вас. subtilis ТНП-5 (утвержден Россельхознадзором, 2006 и 2012 гг).

Лактобифадол — пробиотик ветеринарного назначения, состоящий из живых ацидофильных и бифидобактерий, высушишых сорбционным методом на естественном растительном носителе.

Расчет экономической эффективности проводили согласно «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», одобрешюй Министерством сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации и утвержденной Департаментом ветеринарии МСХ и ПП РФ (1997).

Полученные данные обрабатывали с использованием прикладных программ SNEDECOL, MICROSOFT EXEL, а также подвергали статистической обработке по методу Стьюдента (1988).

2.2 Результаты исследований 2.2.1 Изучение распространенности плесневых и токснгенных грибов в Республике Саха (Якутия)

По отчетным данным Департамента ветеринарии PC (Я) за последние 10 лет (2003-2012 гг.), из 53126 исследованных проб сена, пораженность плесневыми грибами отмечена в 6936 пробах. При микологическом исследовании 1904 проб сочных кормов, положительный результат зарегистрирован в 360 пробах; при исследовании 18159 проб концентрированных кормов, положительный результат - у 1354 проб, что составляет соответственно сено - 13,01%, сочные корма -18,09% и концентрированные корма — 7,45% от исследованных проб.

Из результатов исследований видно, что наибольшее выделение микроскопических грибов отмечено из сочных - 18,09% и грубых кормов -13,05%.

Проведенный расчет соотношения числа изолятов из выделенных и идентифицированных видов микроскопических грибов, в процентах к общему-числу грибных инфекций показал что, чаще всего встречаются плесневые грибы рода Мисог (44,21%), Aspergillus (22,1%) и Fusarium (9,36%).

Результаты анализа микологических данных показали, что выделение грибов, относящихся к роду плесневых, имеет доминирующий характер.

2.2.2 Микологические исследования тебеневочных пастбищ Республики

Саха (Якутия)

Всего санитарно-микологическому исследованию подвергнуто 283 пробы растительности из тебеневочных пастбищ. Материалы для изучения собраны из Центральных районов Республики Саха (Якутия) в зимний период, из них 39 проб из Амгинского, 25 - Чурапчинского, 42 - Мегино-Кангаласскош, 30 -Усть-Алданского, 17 - Татгинского, 29 - Хангаласского, 66 - Намского, 14 -Сунтарского и 21 — Горного районов.

В исследованных тебеневочных пастбищах преобладают злаково-разнотравные луга, развитые на пойменных дерновых почвах. Фоновое растение этих лугов — ячмень луговой. Повышенные гряды (кырдалы) заняты сухими разнотравно-злаковыми лугами и состоят из мятлика лугового, овсяницы якутской, полыни заменяющей и других.

В растительности тебеневочных пастбищ районов Республики Саха (Якутия) чаще всего выделяются плесневые грибы рода Мисог — 72,4% (205 проб), токсигенные грибы рода Aspergillus - 67,1% (190 проб), Fusarium -51,9% (147 проб), а также выделяются грибы рода Pénicillium - 7,4 % (21 проба) и другие микроскопические грибы - 6,3% (18 проб).

В отличие от данных Департамента ветеринарии PC (Я) нами отмечено значительное распространение токсигенных грибов Aspergillus и Fusarium в кормах из тебеневочных пастбищ. Данные Департамента ветеринарии показывают общее исследования заготовленных кормов для всех видов животных, а не пробы от тебеневочных пастбищ.

Полученные результаты исследований позволяют заключить, что токсигенные грибы Aspergillus nidulans и Aspergillus niger являются доминантными в комплексе грибов-контаминантов растительности тебеневочных пастбищ.

Можно предположить, что в условиях Якутии одной из причин недостаточной продуктивности лошадей табунного содержания (низкий деловой выход 45-52%) является низкое качество кормов (2-3 класса качества), пораженных плесневыми и токсигенными грибами.

Следовательно, полученные нами результаты указывают на необходимость разработки мер борьбы с плесневыми и токсигенными грибами для профилактики микотоксикозов лошадей табунного содержания.

2.2.3 Изучение фунгициднон активности штаммов бактерий Bacillus subtiUs по отношению к токсигенным и плесневым грибам

Корма растительного происхождения, контамипированные токсигенными грибами (микромицетами), представляют реальную опасность для здоровья сельскохозяйственных животных и человека. При загрязнении кормов микромицетами существует возможность накопления микотоксинов, вторичных метаболитов плесневых грибов, кроме того, угнетается полезная

микрофлора самих растений. Поэтому вопросы детоксикации кормов от микотоксинов и их продуцентов остаются актуальными (М.П. Неустроев и др., В.А. Антипов и др., 2004; 2007).

Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus рассматриваются как перспективные против болезней растений в силу' их широко распространенного антагонизма ко многим патогенным грибам. Отмечена высокая эффективность применения клеток культур бацилл-антагонистов в отношении возбудителей ржавчинных болезней зерновых культур (Л.Ю. Кузьмина и др., 2003).

Штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-З-ДЕП и Bacillus subtiiis ТНП-5-ДЕП депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) (справки о депонировании штаммов от 6 февраля 2001 г., № 180/15 и № 181/15).

Штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-З-ДЕП и Bacillus subtilis ТНП-5-ДЕП выращивали в мясопептонном агаре рН 7,0-7,2 в течение 5-7 суток при 37 С, затем суспензируют в физиологическом растворе хлористого натрия в концентрации 5x109 КОЕ/мл.

Антагонистическую активность штаммов бактерий Bacillus subtilis в отношении токсинообразующих плесневых грибов определяли методом диффузии в агар на средах Чапека и МПА. В качестве тест-кулыур использовали токсигенные грибы Aspergillus niger, Mucor ramosissimus, Candida albicans, Fusarium semitectum\ выделенные из фекалии лошадей. Микологической иглой осторожно захватывали кусочек мицелия (инокулят) и помещали на поверхность среды. Посевы культивировали при температуре 2225 С в течение 10 дней, вели учет по зоне задержки роста вокруг ииокулята. Для контроля использовали среду без штаммов бактерий.

Результаты проведенных опытов позволяют отметить, что штаммы бактерий Вас. subtilis ТНП-3 и ТНП-5, несомненно, обладают выраженным фунгицидным действием в отношении плесневых грибов родов Aspergillus, Mucor, Candida, Fusarium. Следует отметить, что наиболее выраженной антифунгалыюй активностью обладает штамм бактерий Вас. subtilis ТНП-3 (табл. 1).

Таблица 1 - Результат изучения фунгицидных свойств бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и ТНП-5

Срок наблюдения (дтги) Штамм бактерий Тест-культура

Aspergillus niger Fusarium semitectum Mucor ramosissimus Candida albicans

2 3 4 5 6

На 2-й день Вас. Subtilis ТНП-3 Вас. sub. Вас. sub + Вас. sub Вас. sub

Вас. Subtilis ТТШ-5 Вас. sub. Вас. sub Вас. sub Вас. sub

контроль ++ -t—r 4"Г

Продолжение таблицы 1

! 1 2 3 4 5 6

Вас. Suhtilis ТНП- + - - +

1 3 Вас. sub. Вас. sub Вас. sub Вас. sub

: На 3-й день Вас. Subtilis ТНП- + - - +

5 Вас. sub Вас. sub Вас. sub Вас. sub

контроль +++ +++ +++

Вас. Subtilis ТНП- + - - +

3 Вас. sub. Вас. sub Baa sub Вас. sub.

; На 4-й день Вас. Subtilis ТНП- + - - +

1 5 Вас. sub Вас. sub Вас. sub Вас. sub

1 контроль +++ +++ +++

Вас. Subtilis ТНП- + - - +

1 3 Вас. sub Вас. sub Вас. sub Вас. sub

; На 6-й день Вас. Subtilis ТНП- ++ - - +

5 Вас. sub Вас. sub Вас sub Вас. sub

i контроль +++ +++ +++ +++

Вас. Subtilis ТНП- + - - +

3 Вас. sub Вас. sub Baa sub Baa sub

На 8-й день Вас. Subtilis ТНП- +++ - - +

5 Вас. sub Вас. sub Baa sub Вас. sub

контроль + +Т + lin I I I i -1H-++

! Вас. Subtilis ТНП- + - - -f-

; з Вас. sub Вас. sub Вас sub Bac. sub

! На 10-день Вас. Subtilis ТНП- +++ - - +

5 Вас. sub Вас. sub Baa sub Вас. sub

контроль ++++ ++++ ++++

Примечание: «-» — отсутствие роста; «+» — рост вокруг инокулята 1 мм; «++» — рост вокруг инокулята 2 мм; «+++» — рост вокруг инокулята 6 мм, «III!» - разрастание колонии.

Изучение фунгицидной активности штаммов бактерий Вас. subtilis ТНП-3 и Вас. subtilis ТНП-5 по отношению к токсигенным и плесневым грибам родов Aspergillus, Mucor, Candida, Fusarium показывает перспективность их использования для профилактики микотоксикозов в табунном коневодстве.

2.2.4 Разработка способа борьбы с плесневыми и токснгенными грибами

При обеззараживании кормов после применения профилактических методов и средств не должны образовываться токсичные и канцерогенные вещества. Споры и мицелий грибов должны быть разрушены во избежание вторичной контаминации, но, самое главное, не должны изменяться питательные свойства кормов (А.В. Иванов, В.И. Фисинин и др., 2010).

Для разработки способа борьбы с плесневыми грибами пробиотик Сахабактисубтил адсорбировали на овсе.

Для адсорбции 10 мл пробиотика Сахабактисубтил (с содержанием 50x109 КОЕ) обрабатывали 1 кг овса путем опрыскивания и выдерживали 24 ч. при температуре 18-22С. Затем обработанный пробиотиком овес выдерживали при колебании температуры от -47 до +37 С в течение 9 месяцев, с января по октябрь (срок наблюдения).

Как показывают результаты микробиологического исследования, при обработке овса препаратом Сахабактисубтил, отмечено высокое содержание количества аэробных спорообразующих бактерий в феврале (32х109), в марте (3,0x10й), в апреле (1,0x10"), в мае (4,2хЮ8), в июне (1,5х109), в июле (7,4х108) и в сентябре (4,0x107), в сравнении с необработанным овсом. Следует отметить, что в течение опыта исходное количество штаммов бактерий Bacillus subtilis -5,1x10' КОЕ/г в обработанном овсе повышается в феврале-июле, к сентябрю месяцу число их чуть меньше исходного (4,ОхЮ7КОЕ/г).

Таким образом, в течение срока наблюдения (9 месяцев) штаммы бактерий Bacillus subtilis, адсорбированные на овсе при колебаниях температуры от -47 до +37°С сохраняются в количестве от 5,1х107до 4,ОхЮ7КОЕ/г.

При биохимическом анализе опытного образца (обработанного) овса по сравнению с контрольным (необработанным), не выявлено существенных различий в химическом составе и в макроэлементах.

По микробиологическим данным, овес, обработанный препаратом Сахабактисубтил, оказался более качественным.

Так, бактериологические исследования овса на 30-ый день наблюдения показали уменьшение условно-патогенных микроорганизмов в опытном образце (обработашюм) овса, в контрольном образце овса количество стафилококков - 1,0x10б, а в опытном - 2,5x104; содержание лактозоотрицательных эшерихий в контрольном образце составило 1,4х105, в опытном — 7,6х103 КОЕ/г.

В опытном образце овса в результате жизнедеятельности бактерий рода Bacillus, количество плесневых грибов значительно сократилось. При микологическом исследовании обработанного препаратом Сахабактисубтил овса отмечено, что количество выделяемых колоний грибов снизилось, если в контрольном образце были обнаружены 1,0 х106 КОЕ/г, то в опытном было уже меньше - 2,5 х104 КОЕ/г (или уменьшилось в 40 раз).

Следовательно, штаммы бактерий Bacillus subtilis, адсорбированные на овсе, можно использовать для борьбы с плесневыми и токсигенными грибами.

2.2.5 Испытание препарата из штаммов бактерий Bacillus subtilis, адсорбированных на овсе для борьбы с плесневыми и токсигеннымн

грибами

Работу проводили в СХПК «Уруйэ» Амгинского улуса. Опыт проведен в течение трех месяцев (февраль, март, апрель). В хозяйстве дополнительный рацион лошадей состоял из сена (заливные луга, аласное) и из овса.

При изучении влияния препаратов из штаммов бактерий Bacillus subtilis на организм лошадей применяли препарат Сахабактисубтил в дозе 10 мл (50x10S КОЕ) на 1 кг овса, внутримышечное введение культуралыюй жидкости штамма бактерий Вас. subtilis ТНП-3 в дозе 2 мл 1 раз в месяц. Было сформировано 6 групп - 5 опытных и 1 контрольная. В опыте использованы 60 голов кобыл (табл. 2).

Таблица 2 — Схема научно-хозяйственного опыта в СХГТК «Уруйэ» Амгинского улуса PC (Я)

Группа Япварь-февраль Март Апрель

1 группа 10 гол Овес+СБС в течение 10 дней Овес+СБС в течение 10 дней Овес+СБС в течение 10 дней

2 группа 10 гол Овес с СБС в течение 10 дней+2мл КЖ в/м 1 раз в месяц Овес с СБС в течение 10 дней+2мл КЖ в/м 1 раз в месяц Овес с СБС в течение 10 дней+2мл КЖ в/м 1 раз в месяц

3 группа 10 гол Овес с СБС в течение 3 дней Овес+СБС в течение 3 дней Овес+СБС в течение 3 дней

4 группа 10 гол Овес с СБС в течение 3 дней+2мл КЖ в/м 1 раз в месяц Овес с СБС в течение 10 дней+2мл КЖ в/м 1 раз в месяц Овес с СБС в течение 10 дней+2мл КЖ в/м 1 раз в месяц

5 группа 10 гол 2мл КЖ в/м ] раз в месяц 2мл КЖ в/м 1 раз в месяц 2мл КЖ в/м 1 раз в месяц

6 контрольная группа 10 гол овес овес овес

Примечание: СБС — Сахабактисубтил, КЖ - Кулыуральная жидкость штамма бактерий Вас. subtilis ТНП-3.

За животными вели наблюде1те. После начала опыта на 10, 30 и 68 дни у лошадей опытных и контрольной группы брали кровь и фекалий для исследований.

При изучении кишечного микробиоценоза опытных и контрольной групп до и после опыта, отмечено, что в опытных группах, принимавших препарат Сахабактисубтил с кормом в дозе 10 мл (50x109 КОЕ) в течение 10 дней н культуральную жидкость одновременно увеличивается содержание нормофлоры: лакто- и бифидобактерий, вместе с тем снижается количество условно-патогенных микроорганизмов: эшерихий, энтерококков, исчезают токсигенные и плесневые грибы, по сравнению с показателями кишечного микробиоценоза лошадей до опыта и контрольной группой, где присутствуют стафилококки, токсигенные грибы Aspergillus niger и плесневые Мисог romasissimus.

По результатам исследований, все показатели крови до опыта, в опытной и контрольной группах находились в пределах физиологической нормы, но в опытных группах лошадей, принимавших препарат Сахабактисубтил с кормом и обработанных культуральной жидкостью штамма бактерий Bacillus subtilis ТНП-3, повысилось количество лейкоцитов, эритроцитов и концентрация гемоглобина, что свидетельствует об активизации транспортной функции крови в опытных группах лошадей. Также наблюдалось повышение у7ровня бактерицидной, лизоцимпой активности по сравнению с показателями крови до опыта и контрольной группой, что связано с влиянием препарата на неспецифические факторы иммунитета.

Результаты исследований кишечной микрофлоры лошадей через 30 дней показали, что в опытных группах также преобладали представители нормофлоры, отсутствовали стафилококки, плесневые грибы по сравнению с контрольной группой, где присутствовал Mucor ramosissimus, что указывает на явление дисбактериоза в кишечном тракте.

В кишечной микрофлоре лошадей опытной группы на 68 день исследования не отмечены плесневые грибы.

При изучении кишечного микробиоценоза лошадей до опыта и в контрольной группе, в зимний период отмечается дисбактериоз, который выражается уменьшением количества представителей нормофлоры, при одновременном увеличении роста плесневых и токсигенных видов грибов рода Мисог и Aspergillus.

Нами установлено, что из сена тебеневочных пастбищ Центральной Якутии наиболее часто выделяются токсигенные грибы родов Aspergillus и Fusarium, а также постоянно — плесневые грибы Mucor ramosissimus. Из них два вида токсигенных грибоЕ Aspergillus nidulans и Aspergillus niger можно считать доминантными в комплексе грибов — контаминантов сена из тебеневочных пастбищ. Применение препарата Сахабактисубтил, адсорбированного на овсе, подавляет негативное влияние на организм токсинообразующих грибов, нормализует кишечный микробиоценоз и стимулирует иммунобиологическую реактивность организма и может быть использован в качестве способа профилактики хронических микотоксикозов лошадей.

По результатам исследований получен патент Российской Федерации «Способ профилактики микотоксикозов лошадей» (№ 2534345 от 29.09.2014 г.).

2.2.6 Санитарно-микологнческие исследования обработанного сена

В зимний период жеребых кобыл подкармливают сеном и овсом. Большинство хозяйств Республики Саха (Якутия) из-за отсутствия средств на приобретение овса ограничиваются дачей сена. Заготовленное сено, как отмечено нами и другими исследователями, обсеменяется плесневыми грибами.

Для профилактики микотоксикозов сено обрабатывали препаратом Сахабактисубтил из расчета 50хЮ9КОЕ/кг. Препарат наносили методом мелкокапельного распыления с помощью прибора «Росинка». Микологические и биохимические исследования проводили через 30 дней после обработки сена.

Опытные образцы сена (обработанное препаратом Сахабактисубтил) имело более высокое содержание протеина (11,44±3,81%), клетчатки (31,83±10,61%), фосфора (0,24±0,08%), углеводов (11,05±3,6%), и низкое содержание влаги (5,76±1,92%) и золы (5,74±1,91%). Содержание углеводов в сене снижается во время хранения, а в опытных образцах сена содержание углеводов выше показателей контрольного сена (4,72±1,57%), что говорит о позитивном влиянии препарата Сахабактисубтил в период хранения кормов.

В результате жизнедеятельности плесневых грибов на кормах, происходят глубокие изменения в химическом составе, приводящие, к потере питательной

ценности. В опытном сене в результате жизнедеятельности бактерий рода Bacillus, количество плесневых грибов значительно сократилось. Так при микологическом исследовании обработанного препаратом Сахабактисубтил сена отмечено, что количество выделяемых колоний грибов снизилось почти в 10 раз по сравнению с контрольным необработанным сеном. Так, при исследовании контрольного (необработанного) образца сена, были выделены микроскопические грибы в количестве 9,Зх103 КОЕ/г, а в опытном (обработанном) - 1,1 х103 КОЕ/г.

Бактериологические исследования сена показали уменьшение условно-патогенных микроорганизмов в опытном (обработанном), при значительном росте их в необработанном сене: стафилококк — на 95,1%, эшерихии — на 83%.

Таким образом, в результате обработки сена препаратом Сахабактисубтил, значительно сокращается развитие плесневых грибов и условно-патогенных микроорганизмов, а также сохраняется питательная ценность корма.

2.2.7 Изучение влияния сена, обработанного препаратом Сахабактисубтил,

на организм лошадей

Производственные опыты проведены на базе СХПК «Уруйэ» Амгинского улуса. Были созданы методом аналогов 2 группы молодняка лошадей от 6 до 10-месячного возраста: контрольная (25 голов) и опытная (25 голов).

Обработанное сено (3-5 кг на 1 голову) включили в рацион лошадей опытной группы ежедневно 10 дней подряд в течение 3-х зимних месяцев (январь-март). Рацион контрольной группы молодняка состоял из необработанных кормов удовлетворительного качества (3-5 кг на 1 голову).

До и после постановки опыта у лошадей брали пробы фекалия для изу чения влияния обработанного сена на кишечный микробиоценоз животных.

При этом учитывали рост па селективных средах представителей нормофлоры, условно-патогенных микроорганизмов.

Отмечено, что в опытной группе лошадей, получавшей сено обработанное препаратом Сахабактисубтил, регистрируется увеличение представителей нормальной микрофлоры: бифидобактерий, количества спорообразующих (2,0x10 КОЕ/г) и значительное повышение молочнокислых бактерий (3,2х105), при одновременном снижении количества лактозоотрицательных эшерихий (1,0x10 КОЕ/г), энтерококков (1,5x105 КОЕ/г), а также условно-патогенных .микроорганизмов — протея, по сравнению с показателями микробиоценоза животных контрольной группы.

Повышение количества бифидо- и лактобактерий, а также спорообразующих бактерий, относящихся к нормофлоре, снижение количества лактозоотрицательных эшерихий, протея, относящихся к группе энтеропатогенов, а также снижение числа энтерококков согласуется с данными А.И. Калмыковой (2001), П. Григорьева, Э. Яковенко и др. (2003) и считается благоприятным показателем нормализации кишечной микрофлоры животных.

В контрольной группе в конце опыта отмечено небольшое увеличение лактобактерий (от 1,0x105 до 1,5x105 КОЕ/г) - это почти в 2 раза меньше, чем в опытной группе и уменьшилось количество бифидобактерий. Лактозонегативные (потенциальные энтеропатогены -3,8х104 КОЕ/г) преобладали над лактозоположительными эшерихиями (1,6х102 КОЕ/г), а количество стафилококков (в начале -2,5х105, в конце -4,8х105 КОЕ/г) увеличилось почти в 2 раза. Эти данные указывают, что при употреблении кормов даже удовлетворительного качества, без видимых признаков плесневения, у лошадей развиваются признаки дисбактериоза. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что обработка кормов препаратом Сахабактисубтил не только уменьшает в них количество плесневых грибов, но и при его употреблении корректирует микрофлору кишечника животных.

В конце опыта (апрель) проведено взвешивание молодняка. В опытной группе, получавшей сено, обработанное пробиотиком Сахабактисубтил, привес 5 голов составил 33 кг или на 1 голову 6,6 кг. В контрольной группе этот показатель составил только 1,9 кг (или ниже на 3,4 раза).

Производственные испытания способа профилактики микотоксикозов проведены в СХПК «Уруйэ» и СХПК «Болугур» Амгинского улуса Республики Саха (Якутия) на вакцинированных ассоциированной вакциной против ринопневмолии, сальмонеллезного аборта и мыта кобылах (240 голов), и молодняке (65 голов).

В корм (сено, овес) вносили препарат Сахабактисубтил в дозе 50 млрд. КОЕ/голову ежедневно, 5 дней подряд, каждый месяц, в течение 3-х зимних месяцев.

Назначение пробиотика Сахабактисубтил в зимний период молодняку лошадей, иммунизированного трехвалентной вакциной, способствует повышению резистентности организма, напряженности иммунитета, которое, подтверждается 100% эффективностью вакцинации.

Введение в рацион жеребых кобыл кормов, обработанных пробиотиком Сахабактисубтил, обеспечивает удовлетворительное преодоление трудной зимовки, получить достаточный для данного момента приплод (деловой выход 56,06%) по сравнению с группой контроля (деловой выход 46%)

При внедрении способа борьбы с плесневыми грибами экономический эффект на одну голову при повышении среднесуточных привесов и делового выхода на 10% составил 1694 руб. Экономический эффект на 1 рубль затрат — 3,8 руб.

Таким образом, разработанный и испытанный способ применения пробиотика Сахабактисубтил для борьбы с плесневыми грибами в табунном коневодстве является экономически эффективным.

2.2.8 Испытание биопрепаратов Сахабактисубтил и Лактобифадол для борьбы с плесневыми и токсигенными грибами

Для профилактики микотоксикозов обрабатывали овес местного производства препаратами Сахабактисубтил и Лактобифадол, из расчета 1 доза

на 1 кг овса. Одна доза препарата Сахабактисубтил (10мл) содержит 50 млрд, КОЕ, одна доза препарата Лактобифадол - 25 граммов. Обработанный овес выдерживали 24 ч при 18-22°С.

На основании лабораторных, токсикологических и микологических исследований кормов, фекалий лошадей и анализа гематологических показателей у всех исследованных животных СХПК «Уруйэ» и «Соморсун» Амгинского улуса установлен хронический микотоксикоз лошадей. Из них же сформировано 3 группы по 10 голов каждая: 1-ая опытная группа получала 1 кг овса, обработанного Сахабактисубтилом (СБС), 2-ая опытная группа - 1 кг с Лактобифадолом (ЛБ), 3-я контрольная группа - 1 кг без обработки (в течение 10 дней).

До и после скармливаний кормов, на 10, 37 и 68 дней у лошадей опытных и контрольных групп были исследованы пробы сыворотки крови, фекалии для определения влияния скармливания обработанных разными способами овса на иммунобиологический статус и микробиоценоз лошадей.

При изучении кишечного микробиоценоза опытных и контрольных групп до и после опыта отмечено, что в опытных группах, принимавших препарат Сахабактисубтил с кормом (овес) 10 мл (50х109 КОЕ) и Лактобифадол по 25 г вместе с овсом, увеличивается содержание нормофлоры: лакто- и бифидобактерий, вместе с тем снижается количество условно-патогенных микроорганизмов: эшерихий и энтерококков, по сравнению с показателями кишечного микробиоценоза лошадей контрольной группы, где присутствуют стафилококки, токсигенные грибы Aspergillus niger и Fusarium semitectum, плесневые Mucor romasissimus. Следует отметить, что у животных, получавших Лактобифадол, количество лактобактерий уступало в группе лошадей, принимавших Сахабактисубтил.

Результаты микологических исследований проб фекалий лошадей 1-ой группы, показали снижение выделения плесневых грибов на 10 день скармливания овса с Сахабактисубтилом и отсутствие роста на 37 и 68 день. Во 2-ой группе, получавшей овес с Лактобифадолом, отмечено отсутствие влияния на уровень роста плесневых грибов.

Следует отметить более выраженное стимулирующее действие пробиотика Сахабактисубтил на полезную микрофлору (на количество лакто- и бифидобактерий) чем Лактобифадол.

Результаты гематологических исследований сыворотки крови лошадей 1-ой группы показали незначительный подъем количества лейкоцитов на 10,4% на 10-ый день скармливания, оптимизацию количества эритроцитов и гемоглобина на уровень физиологических норм, тогда как во второй и контрольной группах данные показатели снижались (эритроциты: контрольная группа на 10-ый день на 14%, на 37-ой день - 21%, на 68-ой день - 8%; 2 группа на 37-ой - 6%, на 68-ой -8%), что характерно при развитии микотоксикозов лошадей.

По результатам иммунобиологических исследований отмечено повышение бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови в подопытных группах лошадей. Данный факт свидетельствует о повышении

иммунобиологической реактивности организма, обусловленной гуморальными факторами естественной резистентности лошадей подопытных групп.

Таким образом, результаты исследования кишечного микробиоценоза групп лошадей, которым скармливали овес с Сахабактисубтилом, показали увеличение количества лакто- и бифидобактерий, а также спорообразующих аэробных микроорганизмов, относящихся к нормофлоре, снижение количества лактозоотрицательных эшерихий, микроскопических грибов, стафилококков, относящихся к группе энтеропатогенов. Данный факт считается благоприятным показателем нормализации кишечной микрофлоры лошадей. Тем более что при изучении кишечного микробиоценоза лошадей до опыта и в контрольных группах в зимний период, отмечены явления дисбактериоза, в результате уменьшения количества представителей нормофлоры при одновременном увеличении роста плесневых и токсигенных грибов рода Mucor, Aspergillus и Fusarium.

Именно в период ранней весны, в начале развития дисбактериозов целесообразно использовать обработанные пробиотиком Сахабактисубтил корма. Тем более что при длительном хранении обработанного овса, полезные свойства штаммов бактерий рода Bacillus не теряются.

3 ВЫВОДЫ

1. При микологическом исследовании тебеневочного корма пастбищ Центральных районов республики Саха (Якутия) установлено значительное распространение микроскопических грибов рода Mucor, Aspergillus и Fusarium, процент пораженности от исследованных проб составил 72,4%, 67,1% и 51,9%.

2. Штаммы бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5 обладают выраженным фунгицидным действием в отношении микроскопических грибов Aspergillus niger, Mucor ramosissimus, Candida albicans, Fusarium semitectum. Наиболее выраженной антифунгальной активностью обладает штамм бактерий Bacillus subtilis ТНП-3.

3. Установлено, что пробиотик Сахабактисубтил, адсорбированный на овсе, можно использовать в качестве препарата для борьбы с плесневыми грибами кормов. Обработка овса пробиотиком Сахабактисубтил (из расчета 50x10 КОЕ/кг) снижает количество плесневых грибов в 40 раз, подавляет рост и развитие грибов, нормализует кишечный микробиоценоз, стимулирует иммунобиологическую активность во время длительного зимнего тебеневочного содержания лошадей.

4. При обработке сена, контамтшрованного плесневыми грибами, пробиотиком Сахабактисубтил значительно сокращается количество микроскопических грибов рода Aspergillus (на 8,8%), Mucor (на 51,6%) и условно-патогенных микроорганизмов (стафилококков — до 20 раз, эшерихий — до 5,9 раз) при сохранении питательной ценности корма, способствует нормализации кишечного микробиоценоза лошадей (увеличивается количество лакто-, бифидобактерий, спорообразующих аэробных бактерий, снижается число потенциальных энтеропатогенов).

5. Установлена более высокая эффективность препарата Сахабактисубтил в профилактике микотоксикозов лошадей по сравнению с пробиотиком на основе лакто- и бифидобактерий.

6. Обработка сена пробиотиком Сахабактисубтил способствует повышению прироста живой массы молодняка в 3,4 раза, удовлетворительному преодолению кобылами периода трудной зимовки и повышению делового выхода жеребят на 10%. Экономическая эффективность от применения разработанных способов борьбы с микроскопическими грибами составляет на 1 рубль затрат - 3 рубля 80 копеек, на 1 голову — 450 руб.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертации вошли в методическое пособие «Профилактика микотоксикозов лошадей табунного содержания в условиях Якутии» (утв. Ученым советом ГПУ ЯНИИСХ Россельхозакадемии от 24 января 2014 года, протокол №1 и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 2 от 19 марта 2014 года), которое предложено для внедрения в производство.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жпрков, А.Д. Фунгицидная активность штаммов бактерий Bacillus subtilis по отношению к токсигенным грибам / А.Д. Жирков, С.С. Татаринова, Н.П. Тарабукина, М.П. Неустроен // Аграрный вестник Урала. - 2013. - № 7. - С. 20-21.

2. Жирков, А.Д. Профилактика микотоксикозов лошадей табунного содержания препаратом Сахабактисубтил в условиях Якутии / А.Д. Жирков // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. — 2014. — № 1. — С. 34-36.

3. Пат. 2534345 Российская Федерация, МГЖ51 А61К 35/74, C12N 1/20, C12R 1/25. Способ профилактики микотоксикозов лошадей / Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Жирков А.Д., Татаринова С.С., Павлова А.И.; заявитель и патентообладатель Якутск, науч.-исслед. ин-т сельского хозяйства. -№2013102613/10; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.11.2014, Бюл. № 33. -4с.: ил.

4. Жпрков, А.Д. Микологические исследования кормов центральной Якутии / А.Д. Жирков, С.С. Татаринова, Н.П. Тарабукина, М.П. Неустроев // Аграрная наука — сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии: материалы XV Международ, конф. -Петропавловск, 2012. — С. 226-227.

5. Жпрков, А.Д. Микотоксикозы лошадей / А.Д. Жирков, С.С. Татаринова // Материалы науч. конф., посвящ. 95-летию проф. М.Г. Сафронова. — Якутск, 2012. — С . 160.

ЖИРКОВ АЛЕКСЕЙ ДМИТРИЕВИЧ

ПРОФИЛАКТИКА МИКОТОКСИКОЗОВ ЛОШАДЕЙ ТАБУННОГО СОДЕРЖАНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИРОБИОТИКА САХАБАКТИСУБТИЛ В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Подписано в печать 02.03Л5. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Тайме. Печать трафаретная. Усл. п. л. 1,25. Тираж 100.

Отпечатано в ФГБНУ ЯПИИСХ г. Якутск, ул. Бестужева-Марлинского, 23/1 Тел.: (4112) 21-45-74, e-mail: agronii@sakha.ru