Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природные антитела с оксидоредуктазными активностями

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Природные антитела с оксидоредуктазными активностями"

На правах рукописи

ООЗОБвЗББ

НАМЖИЛ ЭРДЭНЭЧИМЭГ

ПРИРОДНЫЕ АНТИТЕЛА С ОКСИДОРЕДУКТАЗНЫМИ АКТИВНОСТЯМИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск,2007

003058365

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель

дхн, профессор Невинский Георгий Александрович

Официальные оппоненты

д б н , Таранин Александр Владимирович к б н , Ходырева Светлана Николаевна

Ведущая организация

Институт клинической иммунологии СО РАМН

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при

Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по

адресу 630090, Новосибирск-90, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «» (УпЛ^Я-Л- 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита состоится « » 2007 г в 41

часов

дхн

Федорова О С

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Известно, что окислительный стресс, а также действие мутагенов и канцерогенов, приводит к старению человека и развитию у него различных патологий таких, как раковые заболевания, инфаркт миокарда, атеросклероз, диабет, катаракта, эмфиземы, различные дегенеративные заболевания мозга, сердца, мышц, аутоиммунные заболевания (АИЗ) и т п Одной из основных причин окислительного стресса является накопление активированных форм кислорода (АФК) •02_, '02, Н202, НО', OCI~, R02* НО*2 NO" и др АФК являются потенциальными окислителями ДНК, белков, липидов и других компонентов клеток человека

Иммунная система высших организмов играет важную роль в их защите от патогенного влияния окружающей среды Центральную роль в этом процессе выполняют антитела (AT), основной функцией которых является взаимодействие со специфическими антигенами, приводящее к нейтрализации токсинов, чужеродных микроорганизмов и т д Исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов - их способности катализировать большое число различных химических реакций

В настоящее время в крови пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ), а также в крови и молоке здоровых рожениц обнаружены абзимы с фосфатазной, ДНК-, РНК-, АТР-, полисахарид- и белок-гидролизующими, а также липид-, протеин- и полисахаридкиназными активностями (см обзоры Nevmsky et al, 2000-2006) Показано, что AT здоровых человека и животных катализируют супероксиддисмутазные реакции, а также образование озона (Wentworth et al, 2000-2006), моноклональные AT с глутатионпероксидазной активностью получены химическим превращением цистеина в селеноцистеин (Ding et al, 1998, Su et al, 2001, Zhang et al, 2005) Эти данные свидетельствуют о возможном участии AT в защите млекопитающих от окислительного стресса

Группой И Генералова было показано, что препараты IgG крови здоровых доноров и пациентов с различными формами гепатита обладают пероксидазной активностью, но доказательств отнесения этой активности непосредственно к AT не были представлены

Крысы линий Wistar являются хорошей моделью для изучения каталитических свойств различных оксидоредуктаз, так как полученная из нее линия крыс OXYS зарегистрирована в международных базах данных с ключевой характеристикой «врожденная гиперпродукция свободных радикалов»

Цель работы Цель настоящей работы заключалась в исследовании оксидоредуктазных активностей иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови крыс линии Wistar В процессе выполнения работы необходимо было решить следующие задачи

• Доказать, что исследуемые оксидоредуктазные активности являются собственными свойствами антител

• Изучить влияние ионов двухвалентных металлов на ферментативные активности AT

• Провести анализ субстратной специфичности AT с оксидоредуктазными активностями

• Определить относительные удельные оксидоредуктазные активности антител в реакциях окисления субстратов

• Изучить ферментативные свойства (металл- и рН-зависимость, кинетические параметры реакции окисления субстратов) AT, а также провести их сравнение с соответствующими характеристиками пероксидазы хрена, катализирующей окислительные реакции в присутствии и отсутствие Н202

Научная новизна и практическая ценность работы Впервые показано, что Ig класса G из сыворотки крови крыс линии Wistar обладают оксидоредуктазными активностями подобно пероксидазе хрена, а так же доказано, что эги каталитические активности являются их собственным свойством Показано, что пероксидазную активность могут проявлять не только интактные IgG, но также изолированные легкие и тяжелые цепи поликлональных AT Установлено, что выделенные из крови разных крыс гомогенные препараты IgG сильно отличаются по содержанию связанных с ними ионов металлов Fe2+, Cu2+, Ni2+, Со2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Zn2+ и демонстрируют сильные различия относительных уровней оксидоредуктазных активностей Добавление экзогенных ионов металлов, особенно Fe2+ и Си2+, приводит к существенному увеличению относительных удельных активностей абзимов IgG крыс в присутствии и/или отсутствие пероксида водорода могут эффективно окислять не только 3,3'-диаминобензидин (DAB),но также и о-фенилендиамин, фенол, р-дигидрохинон, a-нафтол, и NADH

Апробация работы По материалам диссертации опубликовано 4 статьи Результаты работы были представлены на международной конференции The International Conference "Chemical & Biological Problems of Proteomics", 2004, Novosibirsk, Russia Объединенный иммунологический форум, Екатеринбург, 2004

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы Работа изложена на 122 страницах, содержит 26 рисунков и 7 таблиц Библиография включает 183 литературных источника

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение антител и тестирование пероксидазной активности

Для исследования оксидоредуктазных активностей AT пероксидазной (ПА, зависимой от Н202) и оксидоредуктазной (OPA, независимой от Н202,) активностей, были получены 12 электрофоретически гомогенных препаратов AT из крови крыс линии Wistar аффинной хроматографией на колонке с Protein A-Sepharose и последующей FPLC гель-фильтрацией на сорбенте Superdex 200 HR 10/30 Белок А обладает высоким сродством к Fe-участкам Ig класса G, что позволяет проводить селективную элюцию неспецифически связавшихся с сорбентом лигандов раствором соли и неионным детергентом (0,3 М КС1, 1%

Triton X-100), не затрагивая при этом комплексов Ig с белком А Количественную специфическую элюцию IgG проводили с помощью кислого буфера с рН 4,5, а

Рис 1 Профиль аффинной хроматографии белков из крови крыс на Protein A-Sepharose (а) и электрофоретический анализ

гомогенности (б) препаратов IgG (5-18% градиентный ПААГ) дор 1 и 2 - IgG до и после обработки ДТТ

смесь IgA + IgM элюировали буфером с рН 3,3, после чего полученный препарат сразу нейтрализовали Согласно окраске серебром полученные препараты IgG были электрофоретически гомогенными (рис 1,яи6)

Для тестирования ПА и OPA препаратов АТ на начальном этапе исследования использовали 3,3'-диаминобензидин (DAB), который является широко используемым субстратом пероксидазы хрена (ПХ) В работе использовали пероксидазу хрена с величиной RZ=3 8, выделенную из специального сорта хрена с повышенным содержанием ПХ (любезно предоставлена Хомовым В В) Наиболее активные коммерчески доступные препараты ПХ с величинами RZ>3 О характеризуются удельными активностями 250-330 ед акт /мг, измеренными с использованием пирогаллола Использованные нами для сравнения препараты ПХ имели удельную активность 1045 ед акт /мг

Удельные уровни ПА и OPA IgG варьировали в широких пределах в зависимости от животного

ПХ обладает высокой ПА, но на несколько порядков более низкой OPA Относительные скорости оксидоредуктазной и пероксидазной реакций, катализируемых IgG крыс при постоянной насыщающей концентрации пероксида водорода (10 мМ), варьировали в диапазоне 1 6-26% и 20-800%, соответственно, по сравнению с активностью ПХ, измеренной в тех же условиях (табл 1) Полученные данные свидетельствовали о том, что IgG из сыворотки крови крыс линии Wistar обладают пероксидаза- и оксидоредуктазаподобными и активностями

Оптимальные условия реакции окисления субстратов

Была исследована зависимость пероксидазной активности АТ от величины рН реакционной среды Кривые рН-зависимостей заметно отличались для разных препаратов АТ, причем они характеризовались несколькими пиками активности при различных рН

Таблица 1 Величины относительных удельных активностей, характеризующие пероксидазное и оксидоредуктазное окисление DAB препаратами IgG из крови крыс линии Wistar и с помощью ПХ

Препараты OA, %*

Пероксидазная активность Оксидоредуктазная активность

IgG 1 18,2 377,0

IgG 2 5,6 68,8

IgG 3 3,0 37,7

IgG 4 7,6 71,0

IgG 5 1,6 20,0

IfíG 6 26,0 800,0

IgG 7 5,6 68,8

IrG 8 9,1 22,2

IgG 9 4,1 33,3

IgG 10 H,0 129,0

ПХ 100** 100

*ОА - относительная активность препаратов АТ (в расчете на моль белка) по отношению к таковой для ПХ **Относительные ПА и OPA для ПХ в реакции окисления DAB были приняты за 100%

Как было показано ранее на примере большого числа абзимов с различными активностями, пулы поликлональных АТ больных различными АИЗ в зависимости от пациента и его заболевания очень сильно отличаются по содержанию моноклональных абзимов, которые демонстрируют различные оптимумы рН, лежащие в диапазоне рН от 5 до 9 (см обзоры Nevinsky et al, 2000-2006) Кроме того, показано, что моноклональные АТ больных АИЗ могут содержать различное число моноклональных абзимов, сильно отличающихся по сродству к субстратам Большое число оптимумов рН для абзимов с ПА и OPA

Рис. 2 Зависимости относительной ПА различных препаратов IgG от рН реакционной смеси при окислении DAB (я) и а-нафтола (1) и фенола (2) (б), а для DAB - от концентрации Н202 (в) На рис (а) и (в) зависимости для разных препаратов IgG обозначены различными символами

также свидетельствует о выраженной гетерогенности АТ с этими активностями по оптимальным значениям рН (рис. 2)

Как видно из рис. 2, а, большинство препаратов АТ демонстрируют наиболее высокий уровень активности окисления DAB при рН~6 8, также видно, что препараты АТ из крови четырех крыс катализируют эту реакцию в широком диапазоне рН, эти зависимости были индивидуальными для каждого препарата АТ Поликлональные АТ проявляли как минимум 4 выраженных пика активности в диапазонах рН 5,0-5,5, 6,8-7,1, 7,5-7,8 и 8,5-9,0 Как будет показано ниже, АТ окисляют не только DAB, но и другие ароматические амины и спирты Препараты IgG эффективно окисляли a-нафтол в широком диапазоне рН, проявляя максимальную активность в интервале 7,0-7,5, в случае окисления фенола было обнаружено несколько рН оптимумов в области 5,5, 6,8 и 7,5 рН (рис 2,6)

При исследовании зависимости скорости реакции от концентрации пероксида водорода при постоянной концентрации DAB (0,6 мг/мл, рН 6,8) было показано, что для препаратов АТ трех крыс имеет место несколько оптимумов, которые при каждом оптимальном значении имеют колоколообразную форму (рис 2, в) Эти данные свидетельствуют в пользу того, что, поликлональные АТ крыс также гетерогенны по содержанию субфракций Ig с пероксидазной активностью При этом каждое животное характеризуется своим репертуаром моноклональных абзимов, отличающихся по сродству к Н202

Доказательство принадлежности каталитической активности непосредственно антителам

Кислый шок препаратов АТ

Одной из наиболее важных задач при изучении каталитических функций АТ является доказательство того, что химические реакции катализируются непосредственно Ig, а не какими-либо примесями ферментов При доказательстве принадлежности каталитической функции АТ были использованы наиболее активные препараты IgG, поскольку гель-фильтрация при рН 2,6 или электрофорез в присутствии SDS ведут к сильной денатурации АТ и снижению их активности Инкубация препаратов IgG (30 мин) при кислых значениях рН с последующей гель-фильтрацией в таких же условиях обеспечивает диссоциацию нековалентных комплексов и последующее разделение их компонентов Из данных рис 3, а видно, что после FPLC гель-фильтрации в кислом буфере (рН 2,6) профили ПА в реакции окисления a-нафтола и OPA в окислении DAB совпадают с профилем оптического поглощения интактного IgG и нет каких-либо других пиков белков или активностей Аналогичные данные получены при анализе OPA АТ Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что препараты АТ проявляют ПА и OPA подобно пероксидазе хрена и окисляют различные субстраты Еще одним критерием отнесения каталитической активности IgG является их полная адсорбция на сорбентах с иммобилизованными специфическими АТ против IgG с последующей элюцией абзимов с сорбента кислым буфером Инкубация IgG крыс с таким сорбентом

Рис 3 Профиль FPLC гель-фильтрации IgG на колонке Superdex-200 при рН 2,6 (а), профиль аффинной хроматографии IgG на Sepharose с иммобилизованными IgG кролика против IgG крыс (б) За 100% принят максимальный уровень активности АТ (-) - оптическое поглощение элюата при X = 280 нм,

(□) - профиль OPA IgG в реакции с DAB, (о) - профиль ПА IgG в реакции с DAB, (•) - профиль ПА IgG в окислении а-нафтола

приводила к полной адсорбции АТ и исчезновению ПА и OPA в растворе При элюции сорбированных IgG кислым буфером (рН 2,6) профиль белковой плотности совпадал с профилями ПА и OPA в окислении различных субстратов (например, рис 3, б) Поскольку нековалентные белковые комплексы диссоциируют при кислых значениях рН, совпадение пиков OPA и ПА с белковыми пиками IgG крыс свидетельствует в пользу того, что Ig, а не другие белки крови, обладают этими активностями

Локализация активных центров антител

Одним из критериев доказательства принадлежности активности антителам является обнаружение каталитической активности у изолированных цепей АТ Кроме того, анализ активности отдельных цепей позволяет локализовать активный центр на олигомерных молекулах абзимов Как показано ранее, активные центры абзимов с различными активностями чаще всего расположены в вариабельных участках легких цепей АТ, но в их организации могут принимать участие и тяжелые цепи (см обзоры Nevinsky et al, 2000-2006) Кроме того, есть пример формирования ДНК-гидролизующего центра на тяжелой цепи IgG

Проведен анализ активности абзимов с ПА после их мягкой обработки ДТТ На рис 4 приведены данные анализа ПА препарата IgG (эквимолярная смесь АТ от 5 крыс) после FPLC гель-фильтрации АТ в кислом буфере до (а) и после (б) их мягкой обработки ДТТ До восстановления Ig пик активности совпадает с пиком белковой плотности АТ (рис 4, а) После восстановления дисульфидных связей небольшая ПА обнаруживается в пике, соответствующем не полностью восстановленным интактным АТ, но в основном она соответствует фракциям тяжелых и легких цепей Ig (рис. 46) Эти данные свидетельствуют в пользу того, что ПА могут обладать как легкие, так и тяжелые цепи IgG по отдельности

а

аз i ц

1 14

02 <р 1 :":

0.1 чр

<? ь °<1 9

0.0 щ/ « -

4 8 12 16 20 М 28

Рис. 4 Профили оптической плотности и ПА AT после FPLC гель-фильтрации IgG в кислом буфере (рН 2,6) до (я) и после {б) восстановления Ig с помощью ДТТ (-) -профиль гель-фильтрации AT при X = 280 нм,(о) - профиль пероксидазной активности

Однако нельзя исключить, что у некоторых субфракций абзимов активные центры могут быть расположены на легких, а у других - на тяжелых цепях Для поликлональных IgG не исключена и ситуация, которая наблюдается для моноклональных IgG мышей с ДНКазной активностью, когда вариабельные участки, как легких, так и тяжелых цепей способны с определенной эффективностью и связывать субстрат, и катализировать его гидролиз

Тестирование пероксидазной активности в полиакриламидном геле

Известно, что SDS разрушает даже очень прочные комплексы белков После электрофоретического разделения IgG для удаления из геля SDS, ренатурации AT и восстановления их ферментативной активности гель промывали буфером, а затем его инкубировали в реакционной смеси, содержащей DAB и пероксид водорода (или без Н202) В тех участках геля, где происходило окисление DAB, появлялись желто-коричневые пятна, соответствующие окисленному продукту Достоверно тестируемый уровень ПА и OPA у AT был обнаружен только для IgG с самой высокой активностью (рис 5) Как будет показано ниже, большая часть абзимов теряет связанные ионы металлов во время хроматографической очистки AT, а так же при SDS-ПААГ Поэтому добавление в реакционную смесь экзогенных ионов Си2+ или Fe2+ приводило к значительному увеличению

Рис 5 Тестирование пероксидазной активности IgG крыс с помощью метода in situ, после электрофоретического разделения AT в ПААГ

(а) Дор 1 - IgG + Fe2+, дор 2 - IgG, в отсутствие ионов металла, дор 3 -IgG (окраска кумасси R-250), дор 4 - белковые маркеры,

(б) ПА в присутствии Си2+ Дор I -IgG, дор 2-3 - 2 различных препарата IgG, + 50 мМ ДТТ, дор

4-5 - Ig после и до восстановления с помощью ДТТ, гель окрашен кумасси R-250

IgC-

- IgG

- н

интенсивности желто-коричневой полос в геле (дор 1)

Этот же подход был использован для анализа каталитической активности в случае изолированных легких и тяжелых цепей IgG, перед электрофорезом препараты AT обрабатывали с помощью ДТТ

Для ряда препаратов IgG крыс методом in situ была обнаружена активность как у легких, так и у тяжелых цепей, но для некоторых препаратов четко выявлялась активность только тяжелой цепи (рис. 5, б, дор 2-3) Таким образом, наличие у IgG крыс пероксидазной и оксидоредуктазной активностей подтверждено с использованием большого числа различных подходов, включая один из самых достоверных и наглядных критериев - анализ активности in situ

Полученные данные свидетельствуют о том, что препараты поликлональных IgG крыс гетерогенны по своему составу и могут содержать каталитически активные как легкие, так и тяжелые цепи Тем не менее, в случае некоторых животных, по-видимому, может происходить наработка АТс более активными тяжелыми цепями

Влияние ионов металлов на каталитическую активность антител

Известно, что все оксидоредутазы (каталаза, оксидазы, пероксидазы и дисмутазы), использующие в качестве субстратов АФК, являются ферментами, зависимыми от ионов металлов Проведен анализ влияния экзогенных ионов металлов на относительную активность препаратов AT Показано, что добавление Fe2+, Cu2+, Ni2+, Со2+, Mn2+, Mg2+ и Ca2+ непосредственно в реакционную смесь или предынкубация AT с солями этих металлов приводит к возрастанию ПА и OPA IgG, предынкубация AT с 5 мМ Си2+ или 1,4 мМ Fe2+ была оптимальной Для изучения влияния на ПА и OPA ионов металлов IgG, 4 препарата AT диализовали против буфера, содержащего ЭДТА и ЭГТА

Это приводило к полной потере активностей IgG, которые были восстановлены после добавления экзогенных Fe и Си2+ (табл. 2)

Относительные удельные ПА и OPA недиализованного препарата в отсутствие экзогенных ионов металлов были сопоставимы (106,3% и 93,8%) с активностью ПХ (100%) и увеличились в 4 раза после добавления Fe2+ и в 1,3 раза при добавлении Cu2+ OPA недиализованного препарата AT после добавления Fe2+ и Си2+ возрастали в -1,6 раз и были сопоставимыми

Следует отметить, что ПА диализованного препарата IgG в присутствии экзогенного Fe2+ была в 5,7 раз ниже, чем в присутствии Си2+, и в 3,9 раз ниже, чем активность в присутствии ионов Fe2+ перед диализом AT Причем, ПА диализованного препарата в присутствии Си2+ (625%) возрастала в 4,5 раза по сравнению с относительной активностью недиализованного препарата (137,5%) Относительная удельная OPA диализованного препарата IgG в присутствии Fe2+ и Си2+ была сопоставима и значительно выше, чем начальная удельная активность недиализованного препарата

Для определения количества ионов металлов, связанных с гомогенными препаратами AT, два препарата IgG повторно адсорбировали на Protein A-Sepharose и связанные с AT ионы металлов элюировали буфером, содержащим ЭДТА и ЭГТА, полученный элюат лиофилизовали

Таблица 2 Относительная активность ^012 в присутствии и в отсутствие ионов металлов до и после диализа АТ против буфера, содержащего ЭДТА и ЭГТА

Препарат ДО Относительная активность, %*

Пероксидазная Оксидоредуктазная

— Ме2+ + Си2+ + Бе2+ -Ме2+ + Си2+ + Ре2+

Диализо-ванный 0 625 ± 9,3 108,8 ± 10,3 0 299,4 ±21 243,8 ± 16,8

Недиализо-ванный 106,3 ± 10,7** 137,5 ± 12,5 425 ± 6,0 93,8 ±8,1 150 ± 12 147,5 ± 11,8

*Среднее значение трех экспериментов ^^Относительная удельная активность ПХ принята за 100%

Таблица 3 Относительное содержание металлов, связанных с очищенными по стандартной методике антителами из крови двух крыс \Vistar

Металл Содержание, %* Отношение величин (1)и(2)

Препарат (1) Препарат (2)

Си 9,7" 10~3 1,7* 10° 5,7

Ре 4,1* 10° 5,0*10"4 8,2

Са 1,2*10"3 2,2*10"3 0,55

Ъп 1,3*10"3 1,2*103 1,08

м6 1,0*10"4 1,1 * 10"3 0,09

Мп 2,7*10"4 9,0*10"5 3,0

N1 1,0*10-" 4,0*10'4 0,25

Со 5,0*1 О*5 1,0*10"4 0,5

*Ошибка определения величин не превышала 5-7 %, процентное содержание металлов в лиофилизованных препаратах рассчитывали по разнице величин для опытного и контрольного образцов Лиофилизованные препараты кроме ионов металлов содержали ЭДТА (см выше)

Относительное содержание ионов металлов в полученных образцах проанализировано с помощью спектрального атомно-эмиссионного метода (САЭМ) с возбуждением спектров в двухструйном дуговом плазмотроне, который позволяет определить, какие металлы и в каком количестве содержатся в анализируемых образцах, но не дает информации о заряде ионов этих металлов

В препаратах выделенных из крови двух крыс содержание металлов уменьшались в ряду Си > Ре > Са > > 2п >N1 > Со > Мп Относительное содержание Си и Ре в случае каждой из крыс было в 17-194 раза больше, чем N1 или Со, существенные отличия наблюдались и в содержании одного и то же металла в АТ от разных крыс

В целом, относительное количество Си2+ и Ре2+, связанных с было значительно выше, чем других металлов (табл 3)

Таблица 4. Величины ки„ окисления БАВ с помощью ПХ и из крови 10 крыс в присутствии и в отсутствие ионов двухвалентных металлов*

3 Величины кса, х 10"3 мин"1

Пероксидазная Оксидоредуктазная

с о Си С -Ме2+* + Ре2+" + Си2+ - Ме2+" + Ре2+" + Си2+

1 2,0 7,4 4,2 1,7 2,2 3 9

2 0,62 2,7 1,5 0,31 0,5 0,90

3 3,3 12,5 16,2 0,17 0,19 0,88

4 0,83 4,6 2,7 0,32 0,3 0,41

5 0,18 2,9 1,6 0,09 0,3 0,31

6 2,9 7,3 5,8 3,6 4,0 5,0

7 0,62 2,6 1,7 0,31 0,5 1,1

8 1,0 3,1 2,3 0,10 0,16 0,49

9 0,46 4,5 3,1 0,15 0,29 0,67

10 1,2 21,6 11,5 0,58 0,73 2,0

ПХ 22,0 - - 0,45 - -

*Приведены средние значения трех экспериментов, погрешность измерений не превышала 20-30 %

Эти данные свидетельствовали о возможности значительных вариаций содержания разных металлов, связанных с АТ, в крови одной и той же крысы и особенно различных крыс

Известно, что все известные пероксидазы, оксидазы и некоторые оксидоредуктазы - в основном Ре21"- или Си2+-зависимые ферменты С учетом этого, далее было проведено исследование увеличения активности 10 препаратов ^О при добавлении к ним ионов этих металлов 5 мМ Си2+ или 1,4 мМ Ре2+ (табл 4)

Относительная удельная ПА в присутствии Ре2+ в зависимости от препарата АТ увеличилась в 2,5—18 раз Удельные активности препаратов АТ достигали до 23,5-198% по сравнению с таковой для контрольного препарата ПХ (100%)

Ионы меди также по-разному активировали препараты но их эффект был заметно ниже, чем ионов Ре2+ Активность препаратов возрастала в 2,1-9,6 раза, а относительная активность увеличивалась до 13,4-105,6% по сравнению с удельной активностью ПХ (100%) Существенные различия в исходной активности препаратов АТ и большие вариации в возрастании активностей после

добавления экзогенных ионов металлов могут быть связаны с начальной разницей в содержании Fe2+, Cu2+, а также ионов других металлов в препаратах АТ

Хроматографическое разделение IgG на сорбенте, хелатирующем ионы металлов

Так как металл содержащие ферменты обычно имеют сродство к сорбентам, хелатирующим ионы металлов, была сделана попытка отделить фракции IgG, связанные с ионами металлов, от фракции поликлональных АТ, свободных от ионов металлов, с помощью хроматографии на сорбенте CheIex-100 Основная часть АТ (~88—91 %) не имела сродства к хелатирующему сорбенту и не обладала достоверно тестируемой ПА в отсутствие экзогенных ионов металлов, и проявляла пероксидазную активность только после добавления в реакционную смесь экзогенных Fe2+ или Си2+ Адсорбированные на сорбенте IgG (~9-12 %) элюировали с помощью 0,5-1,0 М NaCl в виде нескольких маленьких пиков (рис 6, а), и только эти фракции были каталитически активными в отсутствие экзогенных ионов металлов ПА была значительно выше, только сразу после выхода АТ с колонки, но она резко уменьшалась после хранения АТ в течение 1-3 дней После добавления в реакционную смесь экзогенных ионов металлов Fe2+ или Си2+, ПА фракций не зависела от времени хранения этих препаратов АТ Эти данные указывают на то, что в высоких концентрациях ионы Na+ могут конкурировать с ионами двухвалентных ме+аллов, связанных с IgG, и могут быть заменены на ионы одновалентных металлов, которые сами по себе не активируют реакций окисления Относительная удельная активность фракций IgG (~ 4,7*10"3 М"г/л"мин), измеренная сразу после хроматографии была в 1,2-1,5 раза ниже, по сравнению с начальной активностью препаратов IgG, нанесенных на колонку (6,7*10"3 М'г/л'мин) Так как молекулы IgG могут потерять ионы металлов во время хроматографии на колонке Chelex, было проведено сравнение относительной удельной активности фракций АТ, соответствующих различным пикам, в отсутствие и в присутствии ионов Си2+ и Fe2+ Относительная активность фракций IgG, имеющих низкое сродство к сорбенту, увеличивалась в 50-1000 раз после добавления экзогенных ионов Си2+ и Fe2+ Приблизительно такое же увеличение удельной активности (в 50-700 раз) наблюдалось для фракций IgG, имеющих самое высокое сродство к хелатирующему сорбенту (пики 3-5, рис. 6, Я)

Относительное количество ионов металлов в этих фракциях было значительно ниже, чем в исходных препаратах IgG, нанесенных на колонку Часть ионов металлов, связанных с Chelex, элюировались с сорбента только при 50-100 мМ ЭДТА, которая разрушает взаимодействие ионов металлов с этим сорбентом Эти данные подтвердили, что часть ионов металлов имеет относительно низкое сродство к IgG по сравнению с ПА и что потеря ионов металлов препаратами АТ может происходить как в процессе хроматографии, так

Рис 6 Хроматография IgG из крови крыс на сорбенте Chelex-100, не заряженном ионами металлов (а), и рехроматография IgG, не имеющих сродства к сорбенту, на колонке, заряженной Си2+ (б) и Fe2+ (в) (-) - оптическая плотность при X = 280 нм, (О) - относительная ПА в отсутствие экзогенных ионов металлов, (■) - OA в присутствии 5 мМ CuS04, (п) - OA в присутствии 1,4 мМ

FeS04

и при последующем выдерживании этих фракций в растворах, содержащих NaCl в повышенной концентрации

Полученные данные указывают на то, что сродство AT к ионам металлов относительно низкое и что они теряют эти ионы в процессе их выделения из крови Поэтому фракцию AT, не имеющую сродства к сорбенту (пик 1, рис. 6, а), повторно хроматографировали на колонках с Chelex-100, заряженных Fe2+ и Си2+ Примерно 16-17% IgG адсорбировались на Си2+-заряженном сорбенте (рис. 6, б), а на Ре2+-заряженном —25-27% AT (рис. 6, в) Фракции IgG, не имеющие сродства к этим сорбентам, не проявляли достоверно тестируемой ПА ни в отсутствие, ни в присутствии экзогенных ионов металлов А фракции, имеющие высокое сродство к металл заряженному Chelex-100 (элюированные с помощью 0,5-1,0 М NaCl) в отсутствие экзогенных ионов металлов, показывали относительно низкую ПА Полученные данные указывают на то, что с ионами двухвалентных металлов могут взаимодействовать примерно 30-40% субфракций IgG поликлональных AT крыс, но только 9-12% этих Ig остаются связанными с ионами металлов после их хроматографии на Protein A-Sepharose, при этом молекулы AT, потерявшие ионы металлов в процессе очистки, сохраняют способность взаимодействовать с ионами различных металлов

Элюция AT с колонки с Chelex-Fe2+ происходила позже (рис. 6, в), чем с колонки с Chelex-Cu2+ (рис 6, б) Таким образом, можно предположить, что некоторые фракции поликлональных IgG имеют более низкое сродство к Си2+,

с 2+

чем Fe

Величины кии в присутствии ионов металлов для фракций IgG с высоким сродством к незаряженному сорбенту {(6,6-8,3)'104 мин"1} были в 6,0-7,6 раз выше, чем для пероксидазы хрена (1,1*104 мин"1) Фракции IgG, проявляющие высокое сродство к сорбенту, заряженному ионами металлов в присутствии экзогенных Fe2+ или Си2+, обладали высокой относительной удельной активностью {кса, = (6,1-7,3)"104 мин'1}

Таким образом, результаты двух последовательных хроматографии АТ крыс на сорбенте, заряженном и незаряженном ионами металлов, свидетельствуют о том, что с ионами тяжелых металлов может связываться примерно 17-39% поликлональных АТ Полученные данные свидетельствовали о чрезвычайной гетерогенности поликлональных абзимов по типу связанных с ними ионами металлов и по сродству металл содержащих форм АТ к хелатирующему сорбенту Был проведен анализ соотношения оксидоредуктазной и пероксидазной активностей IgG после хроматографии АТ на колонке с Chelex-100 Адсорбированные на сорбенте IgG элюировали ступеньками концентрации NaCl и ЭДТА (рис. 7) Было показано, что некоторые подфракции моноклональных IgG, входящие в состав поликлональных АТ, обладают только пероксидазной (рис 7, а), а другие только оксидоредуктазной (рис 7, б) активностью При этом возможно, что некоторые из подфракции IgG, подобно ПХ, обладают обеими активностями Причем, фракция, содержащая IgG в очень маленьком количестве (менее 4-5% белка), обладала самой высокой активностью Величины кса, для фракций IgG с максимальными ПА и OPA составляли в присутствии ионов FeJ+ (7,7-8,1)4 О4 мин"1, и Си2+ (3,8-4,9)'104 мин 1 В среднем OPA фракций IgG, выделенных на колонке Chelex, была в ~2-2,5 раза ниже, чем их ПА, и разница в этих активностях корреллировала с разницей начальных значений этих активностей препаратов IgG, используемых для хроматографии

Рис 7 Анализ относительных пероксидазной (я) и оксидоредуктазной (б) активностей фракций обладающих различным сродством к СЬе1ех-100

(-) - оптическая

плотность белка при X = 280 нм, (О) - активность в отсутствие экзогенных ионов металлов, (а) - в присутствии Ре2+, (И) - в присутствии Си2+

Субстратная специфичность ^С в реакциях окисления различных

соединений

Характерной чертой большинства ранее описанных каталитических антител из крови больных АИЗ является их особая, отличная от классических ферментов, специфичность по отношению к субстрату Было обнаружено, что ^О крыс проявляют два типа активности - пероксидазную и пока точно не классифицированную оксидоредуктазную активность

Известно, что адреналин, компонент крови млекопитающих, является очень хорошим субстратом для всех известных растительных пероксидаз Достоверно тестируемого пероксидазного или оксидоредуктазного окисления адреналина препаратами крыс обнаружено не было Для определения кинетических параметров окисления ряда субстратов была использована эквимолярная смесь 10

различных препаратов IgG, обозначенная как IgGm Величины ка„ и Км для DAB в реакции, катализируемой IgGm, в присутствии пероксида водорода были 4,6*102 мин'1 и 1,8*10"4 М, соответственно, а без пероксида водорода, они составляли 5,8'Ю2 мин'1 и 5,0*10"4 М (табл 5) Таким образом, эффективность окисления DAB поликлональными IgGm в отсутствие пероксида водорода была в -2,8 раза ниже, чем в присутствии пероксида водорода

Препараты IgG в присутствии и в отсутствие пероксида водорода эффективно окисляют о-фенилендиамин (оФД) и NADH, более подробно была изучена пероксидазная активность AT для этих субстратов В присутствии Н202 оФД имел сопоставимое сродство к IgGm (6,6*10"4 М) и ПХ (5,4*10"4 М) При окислении этого субстрата ПХ скорость реакции была в 12 раз выше (2,ПО4 мин"1), чем в реакции, катализируемой IgGm (17,5 мин"')

Таблица 5 Величины кса, и /<"„, характеризующие окисление некоторых субстратов крыс и ПХ

IgGm* ПХ

Субстрат к„; 104,М кса,' Ю-2, мин"1 Кт'ю4, м *ш,*10"2 мин"'

DAB (- Н202) 5,0±0,3 5,8±0,5 10,0±2,5 4,5±0,2

DAB 1,8±0,2 4,6±0,4 0,7±0,03 110±30

о' о-Фенилендиамин 6,6±1,5 0,175±0,03 5,4±1,3 210±30

к а-Нафтол 1,3±0,2 25,0±5,0 1,0±0,2 30±4,0

+ Фенол 4,5±1,0 140±5,0 0,7±0,15 20±4,0

,0-Гцдрохинон 4,8±1,5 2,0±0,5 Неопр*** Неопред

NADH 0,067±0,03 0,006±0,002 0,29±0,05 0,002±0,03

_ эквимолярная смесь препаратов ^О из крови 10 различных крыс,**Среднее значение трех экспериментов,***3начение не определено

Таким образом, оФД является относительно плохим субстратом для IgGra по сравнению с DAB NADH обладал в ~23 раза более высоким сродством к IgGm и скорость реакции была в 3 раза выше (6,7*10 6 М, и 0,6 мин"1), чем в реакции, катализируемой ПХ В то же время величина кса, в присутствии пероксида водорода была низкой и для пероксидазы хрена и для AT (табл 5) Были оценены величины Ки и ка„ для а-нафтола в присутствии пероксида водорода в реакциях окисления, катализируемых IgGm (1,3*10"4 М и 2,5*103 мин"1) и пероксидазой хрена (1,0*104 М и 3,0*103 мин"1)

Величины Км (4,8* 10"4 М) и кса/ (2,0 10 мин ) в реакции окислении ^-гидрохинона в случае IgGm были сопоставимы с таковыми для а-нафтола Анализ дополнительного препарата IgGll показал, что окисление фенола в присутствии пероксида водорода протекает в ~7 раз быстрее (1,4*104 мин"'), чем для пероксидазы хрена (2,0"103 мин"1), в то время как относительные активности для других десяти препаратов IgG были сопоставимы с относительной

активностью для ПХ (см ниже) Сродство препарата 1§011 к фенолу (/^„=4,5*10"4 М) было в ~6,4 ниже, чем для ПХ (Я"ы=0,7*10"4 М) Следует отметить, что ПХ не может окислять а-нафтол, фенол, и рГХ в отсутствие пероксида водорода, в то время как эффективно окисляют эти вещества в таких условиях (см ниже)

Таким образом, совокупность полученных данных однозначно свидетельствует о том, что из крови крыс способны, подобно ПХ окислять различные ароматические амины и спирты Тем не менее, субстратная специфичность АТ существенно отличается от таковой для ПХ При этом особенно ярким различием в специфичности АТ и ПХ является неспособность окислять адреналин Кроме того, АТ и ПХ очень сильно отличаются по параметрам, характеризующим их взаимодействие с некоторыми из исследованных субстратов

Окисление различных субстратов препаратами АТ

Для сравнения субстратной специфичности АТ различных крыс было использовано 10, а в некоторых случаях 11 препаратов ^О Величины кса, в реакции окислении ОАВ различными препаратами в присутствии

(1,8-29)*102 мин'1 и в отсутствие Н202 (0,91—17,0)" I О2 мин"1 заметно варьируют

Таблица 6 Величины ксш, характеризующие окисление DAB, катализируемые IgG из сыворотки крови различных крыс и ПХ в присутствии и отсутствие пероксида водорода

й о. В присутствии Н202 В отсутствие Н202 Отношение величин

с <L> CU С кса,' Ю \ мин"1 (1) OA, %♦♦ (1) ксаЖ, мин 1 (2) ОЛ,%** (2) kJW W2) ОУА (2) / ОУА (1)

1 20,0" 18,2 17,0* 377 1,2 20,7

2 6,2 5,6 3,1 68,8 2,0 12,3

3 3,3 3,0 1,7 37,7 1,9 12,6

4 8,3 7,6 3,2 71,0 2,6 9,3

5 1,8 1,6 0,91 20,0 2,0 12,5

6 29,0 26,0 36,0 800 0,81 30,8

7 6,2 5,6 3,1 68,8 2,0 12,3

8 10,0 9,1 1,0 22,2 10 2,4

9 4,6 4,1 1,5 33,3 3,1 8,1

10 12,0 11 5,8 129 2,1 11,7

И 4,6 4,1 5,8 129 0,8 31,5

ПХ 110,0 юо*** 4,5 100*** 24,4 1,0

♦Ошибка определения величин кса была в пределах 10 - 30%, ♦♦Относительная удельная активность по сравнению с ПХ (100%), ♦♦♦Величина ксш, соответствующая пероксидазной и оксидоредуктазной активностям ПХ, принята за 100%

от препарата к препарату (табл. 6)

Следует отметить, что 9 из 11 препаратов IgG демонстрировали приблизительно в 1,2-3,1 раз более высокую активность в присутствии, чем в отсутствие пероксида водорода, в то время как препарат IgG8 и ПХ имели очень низкую активность в отсутствие пероксида водорода Для двух препаратов, IgG6 и IgG 11, скорость реакции была в 1,3 раз ниже в отсутствие, чем в присутствии пероксида водорода (табл 6)

Таким образом, видно, что каждый препарат AT характеризуется своей величиной /сса( в реакциях пероксидазного и оксидоредуктазного окисления DAB и различными соотношениями этих величин Как было показано выше, эквимолярная смесь 10 препаратов AT (IgGm) достаточно эффективно катализировала окисление a-нафтола и фенола

Были оценены относительные удельные OPA и ПА (Vr) для тех же самых препаратов IgG в окислении a-нафтола и фенола при постоянных концентрациях этих субстратов ([S]=ífM) Чтобы сравнить эти величины со значением kcaí для DAB, кажущиеся величины Ктах были рассчитаны как Vmix=2Vr, а кажущиеся величины ки„ для a-нафтола и фенола были рассчитаны как кса, = Fmax / [IgG] (табл 7) Величины кса, для a-нафтола в Н202-независимом окислении для

Таблица 7. Величины кса0 характеризующие окисление а-нафтола и фенола, катализируемое из крови различных крыс и ПХ*

Препа раты а-Нафтол Фенол

(+ Н,02) (-Н202) (+ Н202) (-Н202)

ки„' Ю"3, мин"' OA, %** ^са/, мин'1 kCat 10 3, мин"1 OA, %** к ЧО"2 мин"1

1 0,4 7,7 ~о*** 3,7 185 13,0

2 1,2 40,0 ~0 3,4 170 1,5

3 2,4 80,0 ~0 3,1 155 0

4 4,7 157 ~0 3,8 160 3,4

5 2,4 80,0 ~0 1,8 90 7,2

6 3,7 123 ~7,1 1,8 90 70,0

7 4,1 137 ~0 1,3 65 1,5

8 0,2 5,3 3,6Ч02 1,3 65 5,0

9 2,2 73,5 3,2"102 1,3 65 1,5

10 0,1 3,3 ~0 1,4 70 3,9

ПХ 3,0 100* ~0 2,0 100 ~0

*Величины ки„ рассчитаны с использованием значения скорости реакции V при

постоянной концентрации субстрата ([S] = К,„), погрешность измерений не

превышала 10-30 % **Относительная удельная активность пероксидазы хрена в реакции окисление DAB принято за 100% ***Не обнаружено достоверно тестируемой активности

десяти различных препаратов IgG, как и для DAB, варьировали в диапазоне (1,0-47)4 О2 мин"1, но в среднем эти величины (с некоторыми исключениями) были выше, чем величины kctlJ для DAB

В отличие от DAB, только три препарата IgG были способны окислять а-нафтол в отсутствие пероксида водорода (табл. 7)

Препараты IgG демонстрировали максимальную активность в реакции окисления фенола при Н202-зависимой реакции (1,3— 14)" 103 мин"1, в отсутствие пероксида водорода окисление фенола было менее эффективным (табл 7) Не было найдено выраженной корреляции между относительными активностями 10 препаратов IgG в окислении DAB, a-нафтола, и фенола в присутствии и в отсутствие пероксида водорода

Таким образом, полученные данные показывают, что удельные ПА и OPA поликлональных интактных IgG крыс в случае всех изученных субстратов на 1-3 порядка выше по сравнению с таковыми величинами для описанных в литературе природных абзимов

Кроме того, величины kta, (табл 5—7) в реакциях, катализируемых IgG, могут быть значительно выше, чем для ПХ Так как удельные активности были рассчитаны для поликлональных IgG, а только небольшие фракции IgG обладают оксидоредазными активностями, эти параметры каталитических фракций AT могут быть выше, чем приведены в табл 5-7

ВЫВОДЫ

1 Впервые показано, что электрофоретически гомогенные иммуноглобулины класса G из крови крыс линии Wistar обладают пероксидазной и оксидоредуктазной активностями подобно пероксидазе хрена На основании анализа выполнения ряда общепринятых критериев доказано, что эти активности являются собственным свойством антител

2 Показано, что пероксидазная и оксидоредуктазная активности IgG крыс являются зависимыми от ионов металлов с переменной валентностью Fe2+, Cu2+, Ni2+, Со2+, Мп2+ В процессе выделения антитела частично теряют связанные с ними ионы металлов, а удаление связанных с ними ионов помощью ЭДТА приводит к полной потере активности антител Антитела активируются при добавлении экзогенных ионов различных металлов

3 Показано, что IgG обладают широкой субстратной специфичностью и как в присутствии, так и в отсутствие пероксида водорода эффективно окисляют типичные субстраты пероксидазы хрена 3,3'- диаминобензидин, о-фенилендиамин, a-нафтол, р-гидрохинон hNADH

4 Показано, что удельные активности поликлональных препаратов IgG в зависимости от препарата варьируют в широких пределах при пероксидазном {¿«„=(0,18-2,0) 103 мин'1} и оксидоредуктазном {¿,.„,=(0,09-3,6) 103 мин"'} окислениях субстратов и возрастают после добавления экзогенных ионов металлов в 2,0-18,0 раз

5 Показано, что субстратная специфичность, содержание различных эндогенных ионов металлов и их влияние на ферментативную активность IgG, а

также кинетические параметры и оптимальные значения рН в реакциях окисления субстратов антителами являются индивидуальными для каждого животного, то есть, репертуар моноклональных антител с пероксидазной и оксидоредуктазной активностями, входящих в состав поликлональных иммуноглобулинов, сильно варьирует от животного к животному

Основные результаты диссертации опубликованы в работах.

1 Ikhmyangan Erdenechimeg Namzhil (Намжил Эрдэнэчимэг), Vasilenko N L , Buneva В N , Nevinsky G A IgG antibodies with peroxidase-like activity from the sera of healthy Wistar rals FEBS Letters 2005 V 579 P 3960-3964

2 Ikhmyangan Erdenechimeg Namzhil (Намжил Эрдэнэчимэг), Vasilenko N L, Buneva В N, Nevinsky G A Metal ions-dependent peroxidase and oxidoreductase activities of polyclonal IgGs from the sera of Wistar rats J Mol Recognit 2006 V 19 P 91-105

3 Ikhmyangan Erdenechimeg Namzhil (Намжил Эрдэнэчимэг), Vasilenko N L Buneva В N , Nevinsky G A Substrate specificity of rat sera IgG antibodies with peroxidase and oxidoreductase activities J Mol Recognit 2006 V 19 P 432-440

4 Ихмянган Эрдэнэчимэг Намжил, Василенко Н Л , Синицина О И , Бунева В И , Невинский Г А Каталитическая гетерогенность иммуноглобулинов класса G с пероксидазной активностью из крови здоровых крыс Wistar Иммунопатология, аллергология, инфектология 2006 Т 2, С 32-48

Изд лиц ИД № 04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 03 04 07 Формат бумаги 60 х 84/16 Бумага № 1 Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная Печ л 1.1 Уч-изд л 1,0 Тираж 100 зкз Заказ № 40 Институт неорганической химии им А В Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Намжил Эрдэнэчимэг

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Активные формы кислорода в организме

1.1.1. Пероксид водорода

1.1.2. Супероксидный анион - радикал

1.1.3. Синглетный кислород

1.1.4. Гидроксил радикал

1.1.5. Оксид азота

1.2. Цитотоксическое действие активных форм кислорода в организме

1.3. Антиокислительная защита организма

1.3.1. Механизмы внутриклеточной антиокислительной защиты

1.3.1.1. Супероксидцисмутаза

1.3.1.2. Каталаза

1.3.1.3. Пероксидаза

1.3.1.4. Глутатион зависимые ферменты

1.3.2. Механизмы неферментативной природы

1.4. Иммуноглобулины

1.5. Каталитически активные антитела

1.5.1. Природные каталитически активные антитела при различных аутоиммунных патологиях

1.5.2. Возможные механизмы образования природных абзимов

1.5.3. Природные абзимы с протеазной активностью

1.5.4. Природные абзимы с нуклеазными активностями

1.5.5. Природные абзимы с другими активностями

1.5.6. Абзимы с оксидоредуктазной активностью

1.6. Доказательство принадлежности каталитических активностей антителам 41 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Реактивы и материалы

2.2. Методы

2.2.1. Получение сыворотки крови

2.2.2. Выделение антител из плазмы крови крыс аффинной хроматографией на Protein A-Sepharose

2.2.3. Очистка IgG с помощью гель-фильтрации

2.2.4. Электрофоретический анализ белков

2.2.5. Концентрирование препаратов белка

2.2.6. Определение концентрации белка

2.2.7. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей антител

2.2.8. Иммунизация кроликов

2.2.9. Определение оптимального значения рН в реакции окисления 3,3'-Диаминобензидина (DAB) антителами

2.2.10. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей белков в полиакриламидном геле

2.2.11. Проведение рН-шока антител

2.2.12. Исследование влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител

2.2.13. Определение каталазной и глутатионпероксидазной активностей AT

2.2.14. Определение кинетических параметров реакции окисления субстрата антителами

2.2.15. Анализ содержания металлов в препаратах антител

2.2.16. Хроматография AT на сорбенте, хелатирующем ионы металлов

2.2.17. Определение пероксидазной и оксидоредуктазной активностей методом флуоресценции

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение препаратов антител из сыворотки крови крыс линии Wistar

3.2. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей в препаратах антител

3.3. Определение оптимальных условий реакции окисления

3,3диаминобензидина антителами

3.3.1. Исследование зависимости пероксидазной активности от рН среды

3.3.2. Зависимость пероксидазной активности от концентрации пероксида водорода

3.4. Доказательство принадлежности каталитической активности антителам 66 3.4.1. Кислый шок препаратов антител

3.5. Локализация активных центров антител 71 3.5.1. Тестирование пероксидазной и оксидоредуктазной активностей методом in situ

3.6. Влияние ионов двухвалентных металлов на пероксидазную и оксидоредуктазную активности антител

3.6.1. Анализ содержания металлов в препаратах антител

3.6.2. Хроматографическое разделение на сорбенте, хелатирующем ионы металлов

3.7. Субстратная специфичность при окислении различных соединений 97 3.7.1. Окисление различных субстратов препаратами антител

4. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Природные антитела с оксидоредуктазными активностями"

Известно, что окислительный стресс, а также действие мутагенов и канцерогенов приводит к старению человека и развитию у него различных патологий: раковых заболевании, инфаркта миокарда, атеросклероза, диабета, катаракт, эмфизем, различных дегенеративных заболеваний мозга, сердца, мышц, аутоиммунных заболеваний (АИЗ) т. д. [1]. Одной из основных причин окислительного стресса является накопление активированных форм кислорода (АФК): »02~, '02, Н202, НО*, ОСГ, К02\ Н0'2, N0* и др. АФК являются потенциальными окислителями ДНК, белков, липидов и других компонентов клеток человека [2, 3].

Все АФК обладают высокой цитотоксичностью для любых типов клеток и клеточных образований, что определяется их химической реактивностью, при этом концентрации АФК в тканях невысоки: Н202 - 10"8 М, *02~- 10'" М, Н0'<10"п М [4-6].

В процессе эволюции для защиты от АФК в клетках выработались специализированные системы ферментативных антиокислителей. Ферментативные антиокислители характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных АФК; специфичностью клеточной и органной локализации, которые зачастую перекрываются комплементарным образом, а также необходимостью присутствия в качестве катализаторов металлов, таких как Си2+, Ътх*, Ре2+ [7, 8].

Иммунная система высших организмов играет важнейшую роль в их защите от патогенного влияния окружающей среды. Центральную роль в этом процессе играют антитела, основной функцией которых является взаимодействие со специфическими антигенами, приводящее к нейтрализации токсинов, чужеродных микроорганизмов и т. д. Однако, исследования последних десятилетий привели к открытию новой функции иммуноглобулинов - их способности катализировать большое число различных химических реакций.

В настоящее время абзимология - наука, изучающая антитела, обладающие ферментативными активностями, интенсивно развивается, и число примеров химических превращений, катализируемых абзимами, превышает 100. Методами сайт-направленного мутагенеза и селективной химической модификации [9, 10] были получены абзимы, субстратная специфичность которых в ряде случаев выше, чем ферментов, а также абзимы, для которых нет аналогов среди природных ферментов [11].

Новые перспективы в области изучения каталитически активных антител возникли в 1989 году в связи с открытием группой С. Пола [12] первых природных абзимов с протеолитической активностью в сыворотке крови больных бронхиальной астмой. 6

Позднее, при ряде других аутоиммунных заболеваний, а также в молоке здоровых рожениц, были обнаружены абзимы с протеолитической, фосфатазной, ДНК- и РНК-гидролизующими, амилолитической, полисахарид-, протеин- и липидкиназной активностями. Недавно было показано, что АТ человека и животных обладают супероксиддисмутазной активностью и превращают синглетный кислород 'Ог в его восстановленную форму О2* [13,14].

Группой И. Генералова было показано, что препараты крови здоровых доноров и пациентов с различными формами гепатита обладают пероксидазной активностью [15], но доказательства отнесения этой активности непосредственно к АТ отсутствовали.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании пероксидазной активности препаратов из крови крыс линии \У1з1аг. В процессе выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Доказать, что исследуемые пероксидазная и оксидоредуктазная активности являются собственным свойством антител;

• Изучить влияние ионов двухвалентных металлов на ферментативные активности антител;

• Провести анализ субстратной специфичности АТ с пероксидазной и оксидоредуктазной активностями;

• Определить относительные удельные оксидоредуктазную и пероксидазную активности антител в реакциях окисления 3,3'- диаминобензидина (Е)АВ);

• Изучить ферментативные свойства (металл- и рН-зависимость, кинетические параметры реакции окисления субстратов), а также провести их сравнение с соответствующими характеристиками пероксидазы хрена.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Намжил Эрдэнэчимэг

выводы

1. Впервые показано, электрофоретически гомогенные что иммуноглобулины класса в из крови крыс линии ^^аг подобно пероксидазе хрена, обладают пероксидазной и оксидоредуктазной активностями. На основании выполнения ряда общепринятых критериев доказано, что эти активности являются собственным свойством ^О.

•2. Показано, что пероксидазная и оксидоредуктазная активности крыс являются зависимыми от ионов металлов с переменной валентностью: Ре2+, Си2+, 1\'г+, Со2+, Мп2+. В процессе выделения антитела частично теряют связанные с ними ионы металлов, а удаление их с помощью ЭДТА приводит к полной потере активности, антитела активируются в присутствии экзогенных ионов различных металлов.

3. Показано, что обладают широкой субстратной специфичностью и в присутствии пероксида водорода эффективно окисляют типичные субстраты пероксидазы хрена: 3,3'- диаминобензидин, о-фенилендиамин, а-нафтол,р-гидрохинон и КАОН.

4. Показано, что удельные активности поликлональных препаратов ^О в зависимости от препарата варьируют в широких пределах при пероксидазном {кса, = (0.18-2.0)-103 мин*1} и оксидоредуктазном {ксШ = (0.09-3.6)-103 мин"1} окислениях субстратов и возрастают после добавления экзогенных ионов металлов в 2.1 -18.0 раз.

5. Показано, что субстратная специфичность, содержание различных эндогенных ионов металлов и их влияние на ферментативную активность а также кинетические параметры и оптимальные значения рН в реакциях окисления субстратов антителами являются индивидуальными для каждого животного; то есть, репертуар моноклональных антител с пероксидазной и оксидоредуктазной активностями, входящих в состав поликлональных иммуноглобулинов, сильно варьирует от животного к животному.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Намжил Эрдэнэчимэг, Новосибирск

1. Allen R.G. Free radicals in aging. Boca Raton. FL: CPC Press. 1998. P.12-23.

2. Зенков H.K., Меныцикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах. Успехи современной биологии. 1993. Т. 113. С. 286-296.

3. Morel Y., Baruoki R. Repression of gene expression by oxidative stress. J. Biochem. 1999. V.342.P. 481-496.

4. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники: Сер. Биофизика. 1991. С. 29.

5. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы. Успехи современной биологии. 1993. Т. 113. Р. 107-122.

6. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биомембранах. М.: Наука. 1972.

7. Sies Н. Oxidative stress from basic research to clinical application. Amer. J. Med. 1991. V.91. Suppl. 3. S31-S38.

8. Wendel A. Enzymes acting against reactive oxygen. Enzymes-Tools and Targets. Basel: Karger.1988. P. 161-167.

9. Guo J., Huang W., Zhou G.W., Fletterick R.J., Scanlan T.S. Mechanistically different catalytic antibodies obtained from immunization with a single transition-site analog. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. V. 92. P. 1694-1698.

10. Miller G.P., Posner B.A., Benkovic S.J. Expanding the 43C9 class of catalytic antibodies using a chain-shuffling approach. Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5. P. 581-590.

11. Na J., Houk K.N., Hilvert D. Transition State of the Base-Promoted Ring-Opening of Isoxazoles. Theoretical Prediction of Catalytic Functionalities and Design of Haptens for Antibody Production. J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 18. P. 6462-6471.

12. Paul S., Voile D.G., Beach S.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science. 1989. V. 244. P.l 158-1162.

13. Langen R., Chang I., Germanas J.P., Richards J.H., Winkler J.R., Gray H.B. Electron tunneling in proteins: coupling through a beta strand. Science. 1995. V. 268. P. 1733-1735.

14. Wentworth P.Jr., lyn H,J., Wentworth A.D., Zhu X., Larsen N.A., Wilson I.A., Xu X., Goddart III W.A., Janda K.D., Eschenmoser L., Lemer R.A. Antibody catalysis of the oxidation of water. Science. 2001. V. 293. P. 1806-1811.

15. Генералов И.И., Новиков Д.К. Жильцов И.В. Взаимодействие поликлональных IgG человека с катионами металлов. Вести национальной академии наук Беларуссии. Сер. Биол. Наук. 1999. Т. 1. С. 90-96.

16. Naqui A., Chance В. Reaction oxygen intermediates in biochemistry. Ann. Rev. Biochem. 1986. V. 55. C. 137-166.

17. Bandy В., Davison A.J. Mitochondrial mutations may increase oxidative stress: implications for carcinogenesis and aging? Free Radical Biol. Med. 1990. V. 8. P. 523-535.

18. Mori H., Arai Т., Mori K. et al. Use of M4PO and oxygen -17 in the study hydroxyl radical generation in the hypoxanthine- xanthine oxidize reaction. Biochem, Mol. Biol. Int. 1994. V. 32. P. 523-529.

19. Brunory M., Rotilio G. Biochemistry of oxygen radical species. Methods Enzymol. 1984. V.105.P. 22-35.

20. Ioshida R., Hayaishi 0. Overview: Superoxygenase. Meth. Enzymol. 1984. V. 105. P.61-70.

21. Lovaas E. Free radical generation and coupled thiol oxidation by lactoperoxidase SCN-/Н202. Free Radical Biol. Med. 1992. V. 13. P. 187-195.

22. Болдырев A.A. Окислительный стресс и мозг. Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. С. 21-28.

23. Byczkowski J.Z., Gessner Т. Biological role of superoxide ion- radical. Int. J. Biochem. 1988. V. 20. P. 569-580.

24. Зенков H.K., Панкин B.3., Менщикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК Наука/Интерпериодика. 2001.343 с.

25. Berki Т., Nemeth P. Photo-immunotargeting with haematoporphyrinconjugates activated by a lowpower He-Ne laser. Cancer Immunol. Immunother. 1992. V. 35. P. 69-74.

26. Осипов Ф.Н., Азизова O.A., Владимиров Ю.В. Активные формы кислорода и их роль в организме. Успехи Биол. химии. 1990. Т. 31. Р. 180-208.

27. Vladimirov Y.A., Olenev V.I., Suslova N.B., Cheremissina Z.P. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane. Adv.Lipid.Res. 1980. V. 17. P. 173-249.

28. Leisman G.B., Daub M.E. Singlet oxygen yields, optical properties and photo toxicity of . reduced derivatives of the photosensitizer cercosporin. Photochem. Photobiol. 1992. V. 55. P.373-379.

29. Cadenas E., Boveres A., Chance B. Low-level chemiluminescence of biological systems. Methods in Enzymology N.Y.: Acad. Press. 1984. V. 105.P. 211-242.

30. Kim K.K., Whitin J.C., Sukhova N.M., Cohen H.J. Increase in extracellular glutathione peroxidase in plasma and lungs of mice exposed to hyperoxia. Pediatr. Res. 1999. V. 46. P. 715721.

31. Маеда X., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении ираке. Биохимия. 1998. Т. 63. С. 1007-1019.

32. Aust А.Е., Eveleigh J.F. Mechanisms of DNA oxidation. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999. V. 222. P. 246-252.

33. Sagone F.L., Greewald J., Kraut E.N.et al. Glucose: a role as a free radical scavenger in biological systems. J. Lab. Clin. Med. 1983. V. 101. P. 97-104.

34. Imlay J.A., Linn S. DNA damage and oxygen radical toxicity. Science. 1988. V. 240. P.1302-1309.

35. Vanabeck B.S. Involment of oxygen radicals and blood cells in the phatogenesis of ARDS by endotoxin and hyperoxia. Appl. Cardiopulm. Phatophysiol. 1991. V. 4. P. 127-138.

36. Klebanoff S.J. Reactive nitrogen intermediates and antimicrobiol activity: Role nitrite. Free Radic. Res. 1993. V. 14. P. 351-360.

37. Frei В., Stoker R., Ames B.N. Antioxidant defenses and lipid peroxidation in human blood plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 9748-9752.

38. Krinsky N.L. Membrane antioxidants. Ann. NY. Acad. Sci. 1988. V. 551. C. 17-33.

39. Stocker R., Frei B. Endogenous antioxidant defences in human blood plasma. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. London: Academic Press. 1991. P. 213-243.

40. Frei В., Gaziano J.M. Content of antioxidants, preformed lipid hydroperoxides and cholesterol as predictors of the susceptibility of human LDL to metal ion dependent and independent oxidation. J.lipid Res. 1993. V. 34. P. 2135-2145.

41. Mates J.M., Sanchez-Jimenez F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Front. Biosci. 1999. T. 4. P. 339-345.

42. Dhaunsi G.S., Gulati S., Singh A.K., Orak J.K., Asayama K., Singh I. Demonstration of Cu-Zn superoxide dismutase in rat liver peroxisomes. Biochemical and immunochemical evidence. J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 6870-6873.

43. Kirkman H.N., Gaetani G.F. Catalase: a tetrameric enzyme with four tightly bound molecules ofNADPH. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 4343-4347.

44. Kirkman H.N., Rolfo M., Ferraris A.M., Gaetani G.F. Mechanisms of protection of catalase by NADPH. J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 13908-13914.

45. Lardinois O.M. Reactions of bovine liver catalase with superoxide radicals and hydrogen peroxide. Free Radic. Res. 1995. T. 22. P. 251-274.

46. Gibson D.M., Liu E.N. The inhibition of peroxidase and indol-3-acetic acid oxidase activity by British Anti-Lewisite Arch. Biochem. Biophys. 1978. V. 186. P. 317-323.

47. Pang A., Gettison A.V., Francesch C., Rolando C., Goldberg R. On substrate specifity of peroxidases involved in the lignification process. J. Plant Physiol. 1989. V. 135 (2), P. 325-332.

48. Аммосова Т.Н., Упоров И.В., Рубцова М.Ю., Игнатенко О.В., Егоров A.M., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Антигенная картирования пероксидазы хрена (изофермент С). Биохимия. 1998. Т. 62 (4). Р. 516-524.

49. Schuller D.J., Ban N., van Huystee R.B., McPherson A., Poulos T.I. Propretie and structure of peroxidase. Structure. 1996. V. 4. P. 311-321.

50. Chance B. The kinetics of the enzyme- substrate compound peroxidase. J. Biol. Chem. 1943. V. 141 (2). P. 153-177.

51. Frei B. Ascorbic acid protects lipids in human plasma and low-density lipoprotein against oxidative damage. Amer. J. Clin. Nutr. 1991. V. 34. PS1113-S1118.

52. Jore D., Kaouadji M.N., Ferradini C. Bitamin E and correlated antioxidants: Ay-radiolysis study. Antioxidants in Therapy Preventive Medicine. NY.: Plenum Press. 1990. P. 151-154.

53. Guiteridge J.M.C., Quinlan G.J., Antioxidant protection against organic and inorganic oxygen radicals by normal human plasma The important primary role for iron-binding and iron-oxidising proteins. Biochim. Bioph. Acta. 1992. V. 1159. P. 248-251.

54. Душкин М.И. Биологическая роль окисленных производных холестерина в клетках млекопитающих. Успехи современной биологии. 1991. Т. 111. С. 845-857.

55. Davies K.J.A., Goldberg A.L. Oxygen radicals stimulate proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erythrocytes. J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 8220-8226.

56. Кения M.B., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе. Успехи современной биологии. 1993. Т. 113. Р* 456-470.

57. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология М. Мир. 2000. 580с.

58. Галактионов В.Г. Иммунология М.: Академия. 2004. 522с.

59. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Медицина. Москва. 2000.

60. Hasemann С.A., Capra J.D., Immunoglobulins: Structure and function. Fundamental immunology. Ed. Paul W. N.Y: Raven press. 1989. P. 209-214.

61. Schultz P.G., Lerner R.A., Benkovic S.J. Catalytic antibodies. Chem. Eng. News. 1990. V.68. P. 26-40.

62. Davies D.R., Padlan E.A., Sheriff S. Antibody-antigen complexes. Ann. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 439.

63. Jencks W. Catalysis in chemistry and Enzymology. N.Y. McGraw-Hill. 1969.

64. Slobin I.I. Preparation and some properties of antibodies with specifity toward p-nitrofenil esters. Biochemistry. 1966. V. 5. P. 2836-2841.

65. Кульберг А.Я., Дочева Ю.В., Тарханова И.А., Спивак В.А. О протеолитической активности в препаратах очищенного иммуноглобулина G и антител кролика. Биохимия. 1969. Т. 34. С. 1178.

66. Raso V., Stollar B.D. The antibody-enzyme analogy: Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry. 1975. V. 14. P. 591-599.

67. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A. Catalytic antibodies. Science. 1986. V. 234. P.1566-1570.

68. Pollack S J., Jacobs J.W., Schultz P.G. Selective chemical catalysis by an antibody. Science. 1986. V. 234. P. 1570-1573.

69. Earnshaw W.C., Rothfield N. Identification of a family of human centromere proteins using autoimmune sera from patients with scleroderma. Chromosoma. 1985. V. 91. P. 313-320.

70. Бойко A.H. Фаворова O.O. Рассеянный склероз: молекулярные и клеточные механизмы. Молекул, биол. 1995. Т. 29. С. 727-743.

71. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Kaveri S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. 1995. V. 154. P. 3328-3332.

72. Shoenfeld Y., Ben-Ehuda O., Messinger J., Bentwithc Z., Rauch J., Isenberg D.I., Gado N. Autoimmune diseases other than lupus share common anti-DNA idiotypes. Immunol. Lett. 1988. V. 17. P. 285-291.

73. Sugiyama Y., Yamamota T. Characterization of serum anti-phospholipid antibodies in patients with multiple sclerosis. Tohoku J. Exp. Med. 1996. V. 178. P. 203-215.

74. Бигаззи П.Е. Механизмы иммунологии (под ред. Коена С., Уозда П.Ф., Мак-Класки Р.Т.) М. Медицина. 1983. С. 181-206.

75. Gololobov G.V., Mikhalp S.V., Starov A.V., Kolesnikov A.V., Gabibov A.G. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. App. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47. P. 305-315.

76. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.I., Schourov D.V., Chernova E.A., Yadav R.P. DNA-hydrolyzing autoantibodies. Appl. Biochem. Biotechn. 1994. V. 47. P. 293-303.

77. Gilbert D., Brard F., Jovelin F., Tron F. Do naturally occurring autoantibodies participate in the constitution of the pathological B-cell repertoire in systemic lupus erythematosus. J. Autoimmun. 1996. V. 9. С. 247-257.

78. Krause I., Blank M., Shoenfeld Y. Idiotypic induction autoimmunity. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1998. V. 12. P. 49-52.

79. Shoenfeld Y., Teplizki H.A., Mendlovic S., Blank M., Mozzes E., Isenberg D.A. The role of the human anti-DNA idiotype 16/6 in autoimmunity. Clin. Immunol. Immunopathol. 1989. V.51. P. 313-325.

80. Raptis L., Menard H.A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normal and patients with systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 1980. V. 66. P. 1391-1399.

81. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Vlassov A.V., Gal'vita A.V, Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from of healthy human mother's milk catalyzes nucleic acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol, 2000. V. 83. P. 115-129.

82. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Buneva V.N. Natural catalytic antibodies (abzymes) in normalcy and pathology. Biochemistry (Moscow). 2000. V. 65. P. 1245-1255.

83. Nevinsky G.A., Favorova O.O., Buneva V.N. Natural Catalytic Antibodies New Characters in the Protein Repertoire. Protein-protein interactions; a molecular cloning manual (E. Golemis. Eds.). New York. Cold Spring Harbor. 2002. P. 523-534.

84. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies. J. Immunol. Methods. 2002. V. 269. P. 235-245.

85. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral pathologies. J. Cell. Mol. Med. 2003. V. 7. P. 265-276.

86. Nevinsky GA, Buneva V.N. Natural catalytic antibodies-abzymes. In Catalytic antibodies (Ed. Ehud Keinan). 2005. P. 503-567.

87. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system. Ann. Immunol. 1974. V. 125. P. 373-398.

88. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smirnov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science. 1992. V. 256. P. 665-667.

89. Шустер A.M., Гололобов Г.В., Квашук O.A., Габибов А.Г. Антиидиотипические и природные каталитически активные антитела. Молекуляр. Биология. 1991. Т. 25. С. 593601.

90. Avalle В., Thomas D., Friboulet A. Functional mimicry: elicitation of a monoclonal anti-idiotypic antibody hydrolizing beta-lactams. FASEB J. 1998. V. 12. P. 1055-1068.

91. Gololobov G.V., Rumbley C.A., Rumbley J.N., Schourov D.V., Makarevich O.I., Gabibov A.G., Voss E.W., Rodkey L.S. DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody BV 04-01: origins of catalytic activity. Mol. Immunol. 1997. V. 34. P. 1083-1093.

92. Gololobov G.V., Sun M., Paul S. Innate antibody catalysis. Mol. Immunol. 1999. V. 36. P. 1215-1222.

93. Сучков С.В., Наумова Т.Е., Третьяк Е.Б., Грачева Т.В., Алекберова З.С., Хитров А.Н., Габибов А.Г. Молекулярные основы патогенности ДНК-связывающих аутоантител. Иммунология. 2004. Т. 2. С. 115-119.

94. Friboulet A., Avalle В., Debat Н., Thomas D. A possible role of catalytic antibodies in metabolism. Immunology today. 1999. V. 20. P. 474-475.

95. Paul S., Mei S., Mody В., Eklund S.N., Beach C.M., Massey R.J., Hamel F. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibody. J. Biol. Chem., 1989. V. 266. P.16128-16134.

96. Mei S., Mody В., Eklund S.H., Paul S. Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 15571-15574.

97. Odintsova E.S., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Casein-hydrolyzing activity of slgA antibodiesfrom human milk. J. Mol. Recognit. 2005. V. 18. P. 1-9.

98. Одинцова E.C., Харитонова M.A., Барановский А.Г., Сизякина Л.П., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Протеолитическая активность IgG антител из крови больных синдромом приобретенного иммунодефицита человека. Биохимия. 2006. Т. 71 (3). Р. 320-332.

99. Бунева B.H., Андриевская O.A., Романникова И.В., Гололобов Г.В., Ядав Р.П., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Взаимодействие каталитически активных антител с олигорибонуклеотидами. Молекуляр. биология. 1994. Т. 28. С. 738-741.

100. Vlassov A., Florentz C., Helm M., Naumov V, Buneva V., Nevinsky G., Giege R. Characterization and selectivity of catalytic antibodies from human serium with RNase activity. Nucletide. Acid Res. 1998. V. 26. P. 5243-5250.

101. Власов A.B., Барановский А.Г., Канышкова Т.Г., Принц А.В., Забара В.Г., Наумов В

102. A., Бреусов А.А., Жьеже Р., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Субсратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом и аутоиммунным тиреоидитом. Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 559-569.

103. Барановский А.Г., Матюшин В.Г., Власов А.В., Забара В.Г., Наумов В.А., Бунева

104. B.Н., Невинский Г.А. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита. Биохимия. 1997. Т. 62. С. 1590-1599.

105. Kalaga R, Li L, O'Dell J.R., Paul S. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. ¿Immunol. 1995. V. 155. P. 2695-2702.

106. Kit Y.Y., Semenov D.V., Nevinsky G.A. Phosphorylation of different human milk proteins by human secretory immunoglobulin. A. Bioch. Mol. Biol. Internat. 1996. V. 39. P. 521-527.

107. Nevinsky G.A., Kit Y.Y., Semenov D.V., Khlimankov D.Y., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein phosphorylation. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 75. P. 77-91.

108. Kit Y.Y, Kim A.A., Sidirov V.N. Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphorylate human milk casein. Biomed Sci. 1991. V. 2. P. 201-204.

109. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Khlimankov D.Y., Buneva V.N., Nevinsky G.A DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. FEBS Lett. 1997. V. 416. P. 23-27.

110. Buneva V.N., Kanyshkova T.G., Vlassov A.V., Semenov D.V., Khlimankov D.Y., Breusova L.R., Nevinsky G.A. Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V.75. P. 63-76.

111. Семенов Д.В., Канышкова Т.Г., Кит Ю.Я., Хлиманков Д.Ю., Акимжанов A.M., Горбунов Д.А., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса G человека гидролизуют нуклеотиды. Биохимия. 1998. Т. 63. Р. 1097-1106.

112. Savel'ev A.N., Eneyskaya E.V., Shabalin K.A., Filatov M.V., Neustroev K.N. Antibodies with amylolytic activity. Protein Peptide Lett. 1999. V. 6. P. 179-184.

113. Gorbunov D.V., Karataeva N.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Lipid kinase activity of antibodies from milk of clinically healthy human mothers. Biochim. et Biophys. Acta. 2005. V.1738.P. 153-166.

114. Karataeva N.A., Gorbunov D.V, Prokudin I.V., Buneva V.N., Kulminskaya A.A., Neustroev K.N., Nevinsky G.A. Human milk antibodies with polysaccharide kinase activity. Immunology Letters. 2006. V. 103. P. 58-67.

115. Savel'ev A.N., Kanyshkova T.G., Kulminskaya A.A., Buneva V.N., Eneyskaya E.V., Filatov M.V., Nevinsky G.A., Neustroev K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. Clin. Chim. Acta. 2001. V. 314. P. 141-152.

116. Кит Ю.Я., Семенов Д.В., Невинский Г.А. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 519-526.

117. Кульберг А.Я., Петяев И.М., Замотаева Н.Г. Каталитические свойства продуктовкатаболитного распада клеточных рецепторов (R- белков). Иммунология. 1988. Т. 3. С. 37.119

118. Кульберг А.Я., Петяев И.М. Каталитические свойства антиидиотипических антител и антирецепторов. Иммунология. 1988. Т. 6. С. 10-13.

119. Петяев И.М., Кульберг А.Я. Ферментативные свойства антител и легочных рецепторов. Иммунология. 1988. Т. 5. С. 12-14.

120. Кульберг А.Я., Тараханова И.А., Маргулис Г.У., Бартова JI.M., Кулагина Н.Н Конформационное превращение антитела в его антиидиотипический эквивалент. Иммунология. 1990. Т. 1. С. 16-18.

121. Кульберг А.Я., Оганян P.P., Шибнев Б.А. Утилизация радикалов кислорода синтетическими пролин-богатыми олигопептидами. Биохимия. 1992. Т. 57 (11). С. 17441750.

122. Demcheva M.V., Nelen М.А., Deiko S.A. Monoclonal antibodies against palladium (II) coproporphyrin: hapten binding and peroxidase catalytic activity of complexes with iron (III) coproporphyrin. 11th Eur.Immunol.Soc. Helsinki. 1991. P. 10.

123. Iverson B.L., Iverson S.A, Roverts V.A. Metalloantibodies. Science. 1990. V. 249. P. 652662.

124. Luo G., Ding L., Liu Z. A selenium containing abzyme, the activity of which surpassed the level of native glutathione peroxidase. Ann. NY Acad. Sci. 1998. V. 864. P. 136-141.

125. Luo J.M., Qi D.H., Zheng Y.G., Mu Y., Yan G.L., Yang T.S., Chen J.C. ESR studies on reaction of saccharide with the free radicals generated from the xanthine oxidase/hypoxanthine system containing iron. FEBS Lett. 2001. V. 492 (1-2). P. 29-32.

126. Sun Y., Li Т., Chen H., Zhang K., Zheng K., Mu Y., Yan G., Li W, Shen J., Luo G Selenium-containing 15-Mer Peptides with High Glutathione Peroxidase-like activity. J.Biol.Chem. 2004. V. 279. P. 37235-37240.

127. Ricoux R., Sauriat-Dorizon H., Girgenti E., Blanchard D., Mahy J.P. Hemoabzymes: towards new biocatalysts for selective oxidations. J. Immunol. Methods. 2002. V. 269. P. 39-57.

128. Ricoux R., Lukowska E., Pezzoti F., Mahu J.P. New activities of catalytic antibody with peroxidase activity. Formation of Fe(II)-RNO complexes and stereoselective oxidation of sulfides. FEBS. 2004. V. 271. P. 1277-1283.

129. Kohda К., Kakehi M., Ohtsuja Y., Tagaka M., Imanaka T. Studies of high thermo stability and peroxidase activity of recombinant antibody L chain-porphyrin Fe(IIl) complex. FEBS Letters. 1997. V. 407. P. 280-284.

130. Langen R., Chang I., Germanas J.P., Richards J.H., Winkler J.R., Gray H.B. Electron tunneling in proteins: coupling through a beta strand. Science. 1995. V. 268. P. 1733-1735.

131. Datta D., Vaidehi N., Xu X. Goddard III. W.A. Mechanism for antibody catalysis of the oxidation of water by singlet dioxygen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 2636-2641.

132. Андриевская O.A., Бунева B.H., Забара В.Г., Наумов В.А., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК. Молекуляр. Биология. 1998. Т. 32. С. 908-915.

133. Фримелль Г. Иммунологические методы. Москва Медицина. 1987.

134. Tijssen P. Laboratory techniques in biochemistry and molecular Biology. Practice and theory of enzyme immunoassay. Elsevier, Amsterdam. New-York-Oxford. 1985. P. 15

135. Остерман JI.A. Методы исследование белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Москва. Наука. 1981.

136. Morrisey J.N. Silver stain for proteins in polyacrilamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitiviy. Anal. Biochem. 1981. V. 117. P. 307-310.

137. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: A laboratory manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.

138. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984. V. 105. P. 121-130.

139. Flohe L., Gunzler W.A. Assays of glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 1984. V. 105. P. 114-121.

140. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. Москва, Мир. 1982.1120 с.

141. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. Москва, Мир. 1980. С. 191 -210.

142. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. Москва, Мир. 1979.

143. Yudelevich I.G., Cherevko A.S., Engelsht V.S., Pikalov V.V., Tagiltsevand A.P., Zheenbajev Zh.Zh. A two-jet plasmatron for the spectrochemical analysis of geological samples. Spectrochimica Acta. 1984. V. 139B. P. 777-785.

144. Shelpakova I.R., Zaksas N.P., Komissarova L.N., Kovalevskii S.V. Spectral methods for analysis of high purity gallium with excitation of spectra in the two-jet arc plasmatron. J. Anal. At. Spectrom. 2002. V. 17. P. 270-273.

145. Amino N., Tado H., Hidaka Y. Postpartum autoimmune thyroid syndrome: a model of aggravation of autoimmune disease. Thyroid. 1999. V. 9. P. 705-713.

146. Dayan C.M., Daniels G.H. Chronic autoimmune thyroidites. New Engl. J. Med. 1996. V. 335. P. 99-107.

147. Tanaka A., Lindor K., Ansari A., Gershwin M. E. Fetal Microchimerisms in the Mother: Immunologic Implications. Liver Transpl. 2000. V. 6. P. 138-143.

148. Freeman R., Rosen H., Thysen B. Incidence of thyroid dysfunction in an unselected postpartum population. Arch. Int.Med. 1986. Y. 146. P. U61-1364.

149. Fey H.R., Burtler R., Marti F. The production in the pregnant cow of anti-human immuniglobulin to be used for the antiglobulin test. Vox Sang. 1973. V. 25. P. 245-253.

150. Mestecky J., McGhee J.R. Immunoglobulin A (IgA): molecular and cellular interactions involved in IgG biosynthesis and immune response. Adv. Immunol. 1987. V. 40. P. 153-245.

151. Inbred strains of rats: OXYS rat genome. 1996. P. 52-54.

152. Егоров A.M., Осипов А.П. Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва, Высшая школа. 1991.

153. Andrievskaya O.A., Buneva V.N., Zabara V.G., Naumov V.A., Iamkovoi V.I., Nevinsky G.A. Catalytic heterogenity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus. Med. Sci. Monit. 2000. V. 6. T. 460-470.

154. Golinelly-Pimpaneu B., Gigant B., Bizebard T„ Nazava J., Saludjian P., Zemel R., Tavvfik D.S., Eshhar Z., Green B.S., and Knossow M. Crystal structure of a catalytic antibody Fab with esterase-like activity. Structure. 1994. V. 2. P. 175-183.

155. Akagi K., Yamanaka M., Murai K., Omae T. Purification and properties of acid ribonuclease from human serum and leucocytes. Cancer Res. 1978. V. 38. P. 2163-2167.

156. Suzuki H. Recent advances in abzyme studies. J. Biochem. 1994. V. 115. P. 623-628.

157. Stewart J.D., Bencovic S.J. Mechanistic and practical considerations. Chem. Soc. Rev., 1993. V. 22. P. 213-219

158. Odintsova E.S., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Casein-hydrolyzing activity of slgA antibodies from human milk. J. Mol. Recognit. 2005. V. 18. P. 413-421.