Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ДНК-гидролизующей активности антител при различных аутоиммунных и иммунных патологиях. Локализация каталитической активности в доменной структуре аутоантител

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование ДНК-гидролизующей активности антител при различных аутоиммунных и иммунных патологиях. Локализация каталитической активности в доменной структуре аутоантител"



и»

< о Г. !.•• , ин г,:-' '

лнстлтут молекулярной биологии им. е.л. :<нгельг ардт а академии наук россии

На праЕах рукописи УДК 577.083.3

рана пратап ядае

Исследование днк-гидролизуютеи активности антител при различных аутоиммунных и иммунных патологиях. Локализация каталитической активности в доменной структуре аутоактител.

03.00.03 - молекулярная Оиолсгия

автореферат !

диссертации на соискание ученой степени кандидата Оиологических наук

Москва - 1994

Работа еиг.олке!:а г лаборатории химических основ оиокатализа института молекулярной оиологии им. В.АЛ-шгелыардта

Научные руководители:»"1гоктор хим. наук А.Г.ГаОибов канд.хим.наук Г.Е.ГололоОов Официальные оппоненты: доктор хим.наук, проф. С.Н.Кочетков доктор хим.наук. В.И.Тишков

Еедушая организация: Институт сиоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Зашита состоимся " "7" " ' в "!$ "часоЕ на'заседании

специализированного совета по защите докторских диссертации Л 002.79.01 при Институте молекулярной Оиологии им. В.А.Энгелгардта РАН по адресу:' 117984. Москва В-334. ул. Вавилова.32

С диссертацией модао ознакомиться в библиотеке Института молекулярной оиологии им. В.А.Энгельгардта.

Реферат разослан " мая 1994 г.'"""

Ученый секретарь Спг

и

канд.хим.наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Б последнее время наряду с развитием традиционных биохимических энзимологических исследовании возникло направление. связанное с изучением .новых биокатализаторов, каталитических РНК, рибэзимов и каталитических антител, аозимов. В настоящее время в абзимологии, новой области, возникшей на стыке иамунологми, классической биохимии, энэимологии и молекулярноа биологии, наметились значительные успехи, связанные с выяснением механизма действия конкретных каталитических антител. Это стало возможным во многом в связи с гсстижениями синтетической органической химии, предоставивкея подходы для создания модельных структур, потенциальных аналогов переходного состояния ферментативных реакции,

совершенствованием техники получения моноклояальных антител на аналоги переходных состоянии и методик отбора позитивных клонов, обладающих каталитической активностью, развитием методов работы с рекомбинантными ДНК. позвояаЕкаги получать сайт-направленные мутанты антител с измененной каталитической активностью.

Круг полученных и исследованных каталитических антител постоянно расширяется, но по сея день не получены каталитически активные антитела, способные катализировать превращения ДНК. Такие антитела были выявлены в нашей лаборатории ранее впервые из сывороток крови больных системной красной волчанкой (CKBHShuster et al.. Science 1992). Эти антитела, наряду с протеолитлческ» активными

антителами е. вазоактивному интестинальному пептиду i YIP. Paul et al. Science 1989) до недавного времени являлись единстеенньаа .примерами природных каталитических антител. В настоящее время число реакции, катализируемых природными каталитичесгами антителами,, также расширилось. Появилось сообщение о казеинкиназнои активности IgA фракции антител человеческого молока I.Kit et al. Blomed. Scl. 19921 и PHK-азнои актигкости антител при СКВ (Невинския и др. Мол. биология 1994).

Изучение природных каталитических антител пред«являет к исследователи дополнительные требования, связанные с необходимостью " детального доказательства отсутствия соответствусси загрязняющей ферментативной активности в препаратах антител. В большинстве случаев приходится разрабатывать чувствительные методы детекции обычно невысокой каталитической активности природных каталитических антител. 2а--зстую возникновение природной каталитической активности аат^гел было зарегистрировано при патологических состояниях организма. Это не~ исключает возникновения активности а в норме, но - исследование взаимосвязи уровня каталитический- активности с глубиной патологического состояния несомненно представляет значительный интерес.

Предметом настоящей диссертационной работы явились ДНК-гидролизувЕ» антитела, выделенные из сывороток крови больных разгачкшш аутоиммунными и иммунными патологиями. В круг наших внтресов входило исследование ДНК-гидролизуюшеи активности ври .патологическом состоянии организма, а так.ке локализации каталигическои активности в доменной структуре

аутоактител.

Цель и задачи исследования. В задачи диссертационнек работы вводила детекция .природном каталитической активности при аутоиммунных и иммунных поражениях организма и сраееение с таковой при СКВ. Необходимо было также ответить на гспрос о локализации каталитической активности в цепях антитег. Научная новизна и практическая ценность. Б настоящее работе впервые проведено расширенное исследование сывороток оольных целым рядом аутоиммунных заболевании: системной красной волчанкой (СКВ), склеродермой (СКЛ). ревматоидным артритом РА), хронической лимфоиднои лейкемией (XJIJ1). Крой? того, исследованы сыворотки крови больных гаммаглооу.'зяемиеи. Предметом специального исследования явились сыворотга крови больных СПИД. Впервые удалось продемонстрировать каталитическую активность в сыворотках крова ВИЧ-инфицированных больных и исследовать наличие этой активности в зависимости от стадии заболевания. Наличге ДНК-гидролкзуюиея активности в сыворотках крови больнет СПИЛом было доказано с помощью иммунохимически'х и биохгаических' методов. Показано различие ЛНК-гидролизуошея активности этих антител и ДНКазы I. Продемонстрирована каталэтическая активность Fab фрагмента антител и ее отсутствяв у Fc фрагмента.

В работе исследовалась также доменная структура каталитических аутоантмтел при СКВ. В ходе исследования удалось локализовать каталитическую активность в легкой цепи антител, при этом тяжелая цепь не проявляла кгталятическои активности.

с.

Полученные данные позволили вплотную подойти к проблемам взаимосвязи природной каталитической активности с развитием патологического процесса. Сегодня мыеше не можем говорить о прямой связи, но накопленный материал позволяет использовать ЛНК-гидролиэующую активность как один из критериев заболевания. Проведенные исследования могут послужить основой для изучения других аутоиммунных и иммунных патологии, а возможно в последующем разработать прогностические критерии развития заболевания. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: 1 . Международной конференции " Ферменты в органическом синтезе" Нью Дели 1992. "ДНК-гидролизуюшие антитела".

2. Международной конференции "Современная энзимология, Проблемы и направления" Санкт-Петербург, 1992.

3. Международной конференции " Каталитические антитела и белковая ивгр.черия " . Москва, 1993 г.

4. 22 конгресса ФЕБО. Стокгольм, 1993 г.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, оозора литературы, описания материалов и методов, результатов • собственных "исследовании и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. '

Работа содержит страниц машинописного текста,

рисунков, схеи. Библиография включает литературных

источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Обьектаыи исследования служили антитела к ЛНК. полученные из сывороток крови больных с аутоиммунными заболеваниями и здоровых дойоров.

л

Сыворотки КРОВИ СОЛЬНЫХ с РАЗЛИЧНЫМИ аутоиммунными заболеваниями были предоставлены Институтом ревхатол^гии АМН России. Сыворотки сольных СПИДом .любезно предоставлены А.И.Старовым ¡НИИ вирусных препаратов РАМН). В качестве контроля использовали сыворотки крови здоровых доноров. Высокоэффективную ■■кидкостнуо хроматографию проводили на приборе Beckman-Model 332 с использованием колонок Superóse б и 12. Mono Q HR 5/5.

аффинную хроматографию проводили на колонке с протеин-А сефарозой CL-4B 1x4 см, ДНК-иеллюлозоя с ДНК, обработанной глутаровым альдегидом, и на колонке с антитела« против человеческих легких и тяжелых цепей.

РаЬ-Фрагмект антител получали протеолитическим расцеплением молекул IgG человека папаином с последующей очисткой ее на колонке с протеин А сефарозой и гель-фильтрацией на колонке Superóse 12.

Легкие и тяжелые цепи антител получали путем восстановления дисульфидных связей молекул IgG человека 8 меркаптоэтанолом с. последующей очисткой гель-фильтрациеи на Superóse бис помощью аффинной хроматографии на колонке с антителами -"против легкой и тяжелой цепей. Электрофоретическое разделение белков проводили во методу iLaetnmli et al.,1970) в 12,5% полиакриламидноы геле. Окрашивание проводили 0,25% кумасси G-250 (Бегуа.Германия), либо серебром (Bio-Rad, Австрия).

Двухцепочечный Фрагмент ДНК получали рашеплением J¡HK pUC19 эндонуклеазой рестрикции EcoPiI. Радиоактивное мечение Фрагментов ДНК осуществляли с помоиь» Фрагмента Кяадова ДНК-

полимераза I Е.соЛ в присутствии {а32 Р1ЙАТР. затем ДНК подвергали расщеплению эндонуклеазои РуиП . Продукты реакции разделял!; в 10% ПААГ с последующей агторадиографиеи. Лля дальнейшей работы использовали Фрагмент риС19/ЕсоН1-Руи11 длиной 96 п.о.

Обусловленный антителами гидролиз ДНК проводился на коротких

*>о *

1т Р 1АТР-меченных олигонуклеотидах и суперспирализованнои плазмиднои ДНК рЦС19. В обоих случаях условия реакции гидролиза были одинаковыми. Реакционная смесь содержала 25 тМ Тг1з-НС1 рН 7,5. 50 тМ НаС1 и 10 тМ МаСХ2. Электррфоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в IX агарозном геле и 102 полиакриламидном. геле,содержащем 7М мочевину. Агарозные гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали. Гели, содержавшие радиоактивно меченые ■фрагменты ЛНК, радиоавтографировапи с помощью рентгеновской пленки РМВ-1 (Тасма).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ГЛАВА I. Локализация ДНК-гидролизующеи активности в доменной структуре каталитических антител.

В настоящей работе мы предприняли попытку локализовать ДНК- гидролизуюшув активность в доменной структуре ЛНК-гидролизуюших антител. В ходе работы было проведено аналитическое выделение антител из 10 сывороток пациентов^ с СКВ. В двух случаях полученные препараты проявили значительный уровень • ДНК-гидролизуюшеи активности Субстратом для определения активности являлась суперспирализованная плазмидная ДНК рЧС19

Электрофореграмма продуктов гидролиза препаратами антител представлена на рис.1. Препараты 1 и 10 являлись наилучшими . потенциалышми источниками длч проведения исследовании локализации каталитической активности в доменной структуре антител.

Необходимо было выяснить вопрос о наличии каталитической ДНК- гидролизующея активности у легкой и тяжелой цепей антител. Активность могла быть сосредоточена как в каждой из цепей по отдельности -независимо, так и вполне вероятно, что для реализации ДНК-гяаролизуюшеи активности необходим активный комплекс легкой и тяжелой цепей.

Метод выделения легкой и тяжелой цепей включал традиционные для аффинной очистки молекул IgG стадии: гель-фильтрацию на Superóse 6, аффинную хроматография на протеин-G сефарозе,- и стадию гель-фильтрации, используемую для отделения легкой и , тяжелой uenen, а также аффинную хроматографию на колонке с иммобилизованными антителами против легких и тяжелых цепей. Общая схема разделения цепей представлена на рис.2.

Хроматограмма разделения тяжелых и легких цепей представлена на рисунке 3.

На рис.4 1а) и 16) представлены данные электрофореза и иммуноблотинга препаратов легкой (рис.4, а- дорожка No 3, б-дорожка No 4) и тяжелой (рис.4, а- дорожка Ыо 1, (5-дорожка No 1) цепей. Как следует из рисунка, в результате выделения нами получены злектрофоретически чистые препараты цепей, которые характеризуются одной полосой, соответствующей

о

1" 2 "ГЗ * 5 б 7 8 9 10 11

Рис Л. Электрофореграмма плазмидноя ДНК р1)С19, инкубировавсэйся с аутоантителами из разных сывроток крови больных СКВ. Условия фореза: 11% агарозныя гель, ТАЕ-Суфер), напряжение бв/см. Условия инкубации во всех случаях были одинаковы: 100 нг супер'скрученнои ДНК р1)С19 с 10 нг исследуемого препарата в 50 мМ трис-НСХ буфере рН-7,5; 100 мМ ИаС1. 10 мМ М5С1,;

1-10. плазмидная ДНК риС19 с антителами из разных сывроток крови больных с СКВ. 11. контроль без антител

; п

Рис. 2

СХЕМА РАЗДЕЛЕНИЯ ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПНИ

сыворотка !

с

трехкратное высаливание 40% сульфатом аммония

I

нанесение на колонку Protein G буфера: 50 тМ Трис HCl, рН-7,5 100 гаМ NaCl элюция: 100 тМ глицин-HCl рН-2.7

I

диализ

буфер ¡^(HniM трис-HCl, рН-7.5 100 ИМ NaCl

I

гель-фильтрация буфер: 50 тМ_трис HCl, рН-7,5 100 им NaCl

I

обработка IgG 3 часа при 24°С с 0,2 М 2-меркаптоэтанояом в 50 мМ трис HCl, рН-а, 0,025% Tween 20

через 3 часа был добавлен 0,2М иодаиетамид и инкубация было продолжена 30 мин.

гель-фильтрация буфер: 100 шМ NaCl, IM CHjCOOH 0,0255 Tween 20

I

диализ

буфер: 20 шМ трис HCl рН-7,5 50 шМ NaCl

I .

аффинная хроматография аффинная хроматография

на колонке с антителами на колонке с антителами против легкой цепи против тяжелой цепи

Эуфер: 20 Ш трис НС1 рН-7.5 Оуфер: 20мМ трис НС1 рН-7,5

Ьй сМ НаС1 Элшшя: 100 шМ глишш-НС1 рН-2.5 1

чистыя препарат легких цепей

50 тМ НаС1 элюция: ЮОмМ глицин-НС1 рН-2,5 •■

I

чистый препарат тяжелых иепея

Рис.3. Хроиатогракма разделения легких и тяжелых цепей. Гель-фильтрация на колонке Эирех-ове 6.

условия хроматографии: буфер- 0.1М №С1. 1Ы С^СООН, 0,0252

Тыееп 20; скорость потока- 0,5 ыл/ммн: скорость бумаги-2 мм/мин;

12 3

Рис.4. (А» Электрофореграмма очищенных препаратов в 12.55 ЗВЭ-полиакриламидном геле.

0.12 окраска кумасси;

1. тяжелая цепь 2. 1еС 3. легкая цепь

з 2 3 4

а ~ о

\ Б. Иммуноблотинг антителами против;

а. тяжелой цепи 1еС а. легкой цепи ' 1. тяжелая цепь 2. легкая цепь 3. тяжелая цепь 4. легкая цепь

молекулярная массам около 23 кДа и 55 кДа. Это соответствует молекулярный массам легком и тяжелой цепей антител. Образотка нитроцеллюлозного -блота. с электрофореграммы антителами против легкой и тяжелой цепей продемонстрировала отсутствие загрязняющих примесеи в соответствующих препаратах. Таким образом, нами были выделены электрофоретически и иммунологически чистые препараты легкой и тяжелой цепей аутоантител, обладающих ДНК-гидролиэукжеи активностьо. Предстояло исследовать каталитическую активность этих препаратов.

Эти опыты были проведены с суперскрученнои плазмидноя ДНК pUC 19 в качестве субстрата для определения гидролитической активности* . Результаты исследования показали, что легкие цепи ДНК-гидролизуюших антител обладают ДНК- гидролитической активностью, причем удельная активность легкой цепа Eiane по сравнению с Fab фрагментом и целой молекулой IgC. .s'HK-гидролизуюшая активность у тяжелых цепей этих антител практически отсутствует. Удельные активности для полной IgG молекулы. Fab фрагмента и L-цепи равнялись: 133, 1041 к 8333, соответственно.

Эти данные, по всей видимости, свидетельствуют о наличии стерических препятствии, которые' имеют место при взаимодействии высокомолекулярного субстрата (ДНК) с \ ■

За единицу удельной активности принято количество биокатализатора, переводящего 0,1 ug суперскрученнои плазмиды з кольцевую форму за 1 час в условиях: 50мМ Трис-HCl. рН-7,5, ЮОвМ NaCl. 10mM MgClg.

молекулой антитела.

ГЛАВА-II АНТИТЕЛА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЯХ, ИМЕЮЩ1Е ДНК-ГИДРОЛИЗУЮШУЮ АКТИВНОСТЬ.

В этой части работы мы попытались исследовать ДНК-гидролизуюшую активность антител, продуцированных при различных иммунных и аутоиммунных патологиях. Нами были исследованы антитела из следующих сывороток: системная красная волчанка (СКВ), Ревматоидный артрит. (РА), Склеродерма, Хроническая лимфоидная лейкемия (ХЛЛ), СПИЛ на разных стадиях болезни, Гаммаглобулинемия и здоровые доноры в качестве контроля.

Результаты наших исследований показывает, что разные иммунные и аутоиммунные расстройства характеризуются разной частотой продукций ЛНК-гидролизуюших антител (таблица 1). Также из данных таблицы следует, что гидролитическая активность зависит от характера болезни: так. максимальная активность была обнаружена в сыворотках больных с СКВ и ХЛЛ (Таблица 1). Высокий 'уровень анти-ДНК антител и их активность а анализированных сыворотках связана со стадией заболевания. Сыворотки из крови здоровых доноров и больных с гаммаглобулинемиея практически не содержали ДНК связывающих антител и не имели каталитической активности. Данные наших исследования показывают, что уровень активности ДНК-гидролизуюших антител различен при разных заболеваниях. Этот факт является дополнительным подтверждением, что ДНК-гидролизуюшая активность' является свойством антител. а не связана с присутствием каких-либо нуклеаз.

Таблица 1

ЧАСТОТА АНТ11-ЛНК АУТОАНТИТЕЛ ПРИ НЕКОТОРЫХ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Заболевание

Частота ЛНК-связы-

ваюших антител

Частота ЛНК-гидролизу-юших антител

СКВ РА

Склеродерма

УЛЛ

СПИД

Здоровые доноры ГамиаглоОулинемия

*/-

+++ .

«V-++

*/-

не обнаружена */- 0-5 г + 5-15 г

15-30 X +++ более 30 5

Таблица II

КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ О ПАЦИЕНТАХ С ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ

Шифр Еоз- Поп Стадия Титр AT

сыв. раст ВИЧ-ин- в ИФА _

Но б-ного фекшш (EIAJ ИБ г

Данные

Наличие ИНК-г

_ ВИЧ-Аг дрол.

РИП в крови ахтиЕ ноет;

I 39 М II В 1:8100 р17,24.31. р24.55;

55.65:gp41. gpl20/160 120

2 36 М IV 1:24000 р24.31.55. р53.65

65:gp41. gpl20/160 120/160

♦ +

3 30 X II В 1:24000 р24.31.40. р55;

55,65;gp41,ер120/160 120/160

4 29 Ж III А 1:2700 р24.55,65;

gp41. н.и.

120/160

А 35 М II В 1:8100 р24.31/33', р24

40.55,65; gpl20 gp41.120

В 26 II ИВ "

С 28 М II Б" 1:2700 р17.24.55.

65;ер41, 120

н.и.

D • 18 U 1ПБ 1:24000 р7.17.40. р24,55.

65,24. 65:

31/33:gp41, ер41.

+■

120/160

120/160

Р 31

М II Б 1:6100 pl7.24.33, р24,55;

55.65; £р41. ер41,120 120/160

М II В 1:2700 р24,33,55;•р24,55;

№41,120 ер120/160

С 32 Ж ША 1:8100 р17,24,33. р24,55;

55,65; ер120/160

ер41______

120/160

Н 32

Ж II Б

р24,33,40, р24;гр120 55;ер120

I 27

Ж II Б

р24,33,55, н.и. 65;ер41/120

Примечания: Класификация ВИЧ-инфекции дана по В.И. Покровскому (Тер. архив, 1989, N11, с.3-6)

ПБ- бессимптомная фаза; ИВ- персистирувшая генерализованная лимфоаденопатия; П1А,Б,В- прогрессирующие стадии вторичных заболевании; И- терминальная стадия; н.и.- не исследовали.

Антитела, выделенные из сывороток сольных СПИДом, имеют корреляцию между продукцией ДНК- гидролизуюших антител и стадиен золезнн. В таблиц» 2 суммированы данные по ДНК-гидролиэуюшэя активности . аутоантител, выделенных из сывороток кроЕи сольных СПИДом. Как следует из данных таблицы, большинство из исследуемых препаратов проявляли ДНК- гидролиэующую активность, в то время как таковая практически отсутствовала у антител из сывороток здоровых доноров. Из представленных данных следует, что уровень активности зависит от стадии заболевания. Так, антитела из сывороток крови больных, находящихся на терминальной стадии заболевания, характеризующейся аутоиммунным поражением организма, обладали наибольшей каталитической активностью по сравнению с антителами, выделенными на ранних стадиях болезни.

Г ЛАВА-III. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНК-ГИДРОЛИЗУЮШИХ АНТИТЕЛ. ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ СЫВОРОТОК КРОВИ БОЛЬНЫХ СПИДОМ.

. Целью исследования являлось изучение ДШ-гидролизуюинй активности антител, выделенных из 13 сывороток крови ВИЧ-инфицированных больных и пациентов с развернутой клинической картиной СПИД. Антитела к ДНК также были получены из сывороток крови здоровых доноров. ДНК-активность была проанализирована на суперскрученноя плазмиднои ДНК риС 19. Результаты исследования показали, что антитела только 2-ух сывороток из 13.-й обладали высоким уровенем ДНК-гидролизуюшей активности, тогда как остальные имели сравнительно низкую активность или активность отсутствовала.

Антитела, голадающие высоким уровенем каталитическом активности, оыли использованы для дальнейших исследований. Доказательство того, что каталитическая активность относится к фракции антител, а не к прочно связанному с антителом ферменту, проводили по следующим критериям:

1 ) Гомогенность использованных препаратов антител, проверенная с помошью SDS-электрофореэа' с окрашиванием серебром;

2) Сохранение активности в эксперименте по"кислотному шоку"".

31 Ингибироеание каталитической активности иммобилизованными препаратами Protein А и антителами к IgG-фракции антител человека;

4! Активность РаЬ-фрагмента антител и ее отсутствие у Рс-фрагмента;

5) Отличие в характере деградации по сравнению с ДНК-гидролизуюшими ферментами.

ДНК-гидролизуюшие антитела были подвергнуты кислотному шоку, после которого все возможные комплексы молекулы антител, нековалентно - сорбированные ДНК-абзимами, разрушались. Было показано, что антитела сохраняли" ДНК-гидролиэувщую активность.

Как описано в работе ( Shuster et al. Science 1992- ) опыт no "кислотному шоку" заключался в инкубации Fab фрагмента каталитических антител в 0,1М глицин-HCl, рН-2,5 в течение 1 часа с последующей хроматографией на гель-фильтрадирннои колонке TSK-3000 sw.

На рис. 5 представлены данные, свидетельствующие о гомогенности использованных препаратов антител. Как видно из рисунка, препараты IgG характеризуются двумя полосами, соответствующими молекулярным массам 25 кДа и 50 кДа. A~Vab Фрагмент в денатурирующих условиях характеризуется одной полосой с молекулярной массой около 25 кДа. ДНК-гидролизующая активность была исследована на плаэмиде p(JC19 и на двухцепоченои ДНК длиной 96 пар оснований. На рис.б продемонстрировано наличие ДНК- гидролизуюшея активности у IgG и РаЬ-фрагмента ДНК- гидролизуюших антител.

Как следует из рисунка, взаимодеиствие вариабельного Фрагмента молекулы антитела (Fat)) с ДНК приводило к более полной деградации последней по сравнению с целым антителом. ДНК-гидролизуюшая активность антител сохранялась после кислотного шока, хотя она меньше по сравнению с антителами до кислотного шока на 205 от исходного значения. Константная часть молекулы антител iFc) гидролитической активностью не обладала. ДНК-гидролизуюшая активность этих антител исчезала после обработки иммобилизованным Protein А.

На рисунке 7 представлены результаты исследований гидролиза ДНК длиной 96 пар основании Fab фрагментом ДНК-гидролизуюших антител и ДНКазоя I . На рис. 8 представлены результаты исследования ДНК-гидролизующея активности на олигонуклеотидном субстрате dA14. Как видно из рисунков, характер гидролиза антителами ДНК длиной 96 пар основания отличается от такового для ДНКазы I (рис.7 > и нуклеазы S I, фосфодизстеразы I и микрококковой нуклеазы (рис.б !. Таким образом , полученные результаты представили

1 2

№

И

-&JKD& 6ÖKDa

^ ^ ^-ЗбКСа fc^ ~l8KDa

Рис.5. Электрофореграмма 12,5% ЗВЭ-полиакриламидном геле антител из крови больных СПИДом.

1. РаЪ фрагмент 2. 3. маркер молекулярных весов

} А 5

Рис.6. Электрофорез ДНК "pUC19 в 1% агарозном геле с антителами из сывроток крови больных СПИДом, условия фореза: US агарозный гель, ТАЕ-буфер), напряжение 5В/см. Условия инкубации: реакционная смест содержала: iMg ДНК pUCl9,. исследуемый белок, 10 тМ MgClj, 50 мМ трис HCl, рН-7,5, 100 шМ NaCl. реакция проходила 5 чассов при 37®С. 1. антитела после связывания с Protein А 2. Fab фрагмент 3. Fe фрагмент 4. антитела после кислотного шока 5. антитела 6. контроль без антител

ñ ш

Wfi Й..1

í- ^V'; И V

lít^a у

kiví.-Ч г., 7 Б 7iU ,. • t. i. )

ыт)

fan.

-4-JUj

#r5

Рис.7 . Электрофореграмма двухцепочечной ДНК длиной 96 пар основании из плазмидной ДНК pUC19.

условия фореза: (105 полиакриламидный гель, ТВЕ-буфер), условия, реакции: реакционная, смесь содер.чала двухцепочечную ДНК', исследуемый белок. 50 мМ трис-HCl рН-7,5, 100 шМ NaCl, 10 mM MgCl0, инкубация проходила ночь при 37 С. номера лунок:' 1. контроль без антител 2. ДНКаза I 3. Fab фрагмент

о?

i 34 5 6 7 ^ЭО*4»«

-- . О .

«v • -

сь-у^СЬ*. •

■ оО» Vi"

О»

@D

I.

Рис.8. Изучение субстрата dAH

характера гидролиза олигонуклеотидного Fati-фрагментом, lgG-фракциеи ДНК-

гидролиэуюыих антител в сравнении с другими нуклеазами. 0,1 10

пМоль 5'-С'PI-меченого олигонуклеотида инкубировалось с 8 мкг Fab в течение 16 ч. в 20мМ Трис-HCl буфере, рН 7.5, содержащем 50мМ NaCl и ЮмМ MgC^ ; микрококковой нуклеазой, фосфодиэстеразоп I и нуклеазой S1 в стандартных условиях, . Продукты реакции подвергались электрофорезу в 20* ПААГ (19:1), напряжение 75 В/см, с последуюшеея авторадиографией. 1- контрольная реакция ; 2,3- микрококковая нуклеаза ; 4-РаЬ-фрагмент ; 5,6- фосфодиэстераза I: 7- нуклеаза S1.

дополнительные доказательства в пользу наличия каталитической активности антител, выделенных из крови сывороток Сольных', инфицированных БИЧ.

Выводы

1. Локализованна ДНК-гидролизувшая активность аутоантител в их доменной структуре. Показано, что она сосредоточена в легкой цепи и отсутствует в тяяглой цепи. Показано, что удельная активность препарата легкой цепи в 62 раза превышает активность IgG фракции.

2. Исследована ДНК-гидролизуюшая активность при аутоиммунных и иммунных патологиях. Показано ее наличие при СКВ, ХЛЛ, Склеродерме, Ревматоидном артрите и СПИДе. Показано, что ДНК-гидролизуюшая активность проявляется на IV стадии СПИД.

3. Выделены ДНК-гидролизуюшле аутоантитела из сывороток крови больных , инфицированных1. ЕИЧ. Показано, что Fab фрагмент антител обладает ДНК-гидролизующеи активностью.

Список публикации по теме диссертации.

1. Gololobov G.Y., Shuster A.M., Bogoßolova A.E., Yadav R.P., Kvashuk O.A., Gablbov A.G. Proceedings of International .symposium on " Enzymes in Organic synthesis" New Delhi,. India 1992. DNA-hydrolyzlng autoantibodies. 2.4 Г.В.Гололобов, А.Б.Богомолова, Р.П.Ядав. М.В.Ермолаева, К.М.Белостоская, Т.Б.Прокаева, A.M.Шустер и А.Г.Габибов Выделение и характеристика ДНК-специфических каталитических антител из сывроток крови больных СКВ. Биохимия 1993, Т.58.

ешп.2, стр. 313-316.

3. Go le lo bo v G.V.. Eogoicolova A.E., Yadav R.P.. DNA-hydrolyzlng activity of autoantibodies. 22nd Meeting or the federation of European Biochemical Societies. Stockholm, Sweden 1993. P.201.

4. В.И.Бунева, 0.А.Андреевекая,- И.В.Романникова, Г.В.ГололоОов, Р.П.Ядав, В.И.Ямков, Г.А.Невинскип. Взаимодействие каталитически активных антител с олигонуклеотидами. Молекулярная биология 1994, Т.28, вып.2, стр.738-743.

5. G.A.Cablbov, G.Y.Gololobov, O.I.Makarevlch, D.V.Schourov, E.A.Ciiernova and R.P.Yadav. DNA-hydrolyzlng autoantibodies. Appl.Blochem.Biotechno 1., V. 47, P. , 1994.

6. Dmitry V.Schourov, Gennadi V.Gololobov, Oksana I.Makarevich, Rana P. Yadav, Elena' E.Chernova,' Georgy A.Nevinsky, Tatyana B.Prokaeva, - Zemphlra S.Alekberova and Alexander G. Gablbov. DNA-hydrolyzlng autoantibodies In autolmaune pathologies. Proc.New York Acad.Scl. In press, 1994.

7. Г.В.Гололобов, Р.П.Ядав, Д.В.Шуров, О.И.Макаревич, А.И.Старов, А.Г.Габибов, Г.Р.Мацевич, О.Г.Анджапаридже. ДНК-гидролизуюшая активность антител выделенных из сывороток крови больных СПИД. Докл.Акад.Наук России , 1994, в печати.

2S

(

I

/

Подписано к печати Отпечатано на ротапринте в Производственном комбинате Литературного фонда России

1394 г. Формат Фуыаги 33x42/4 ОбъеыЗД п. л. / Зак.дутир. 100