Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Принципы конструирования малых интерферирующих РНК для подавления экспрессии терапевтически значимых генов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Принципы конструирования малых интерферирующих РНК для подавления экспрессии терапевтически значимых генов"

На правах рукописи

ЧЕРНОЛОВСКАЯ ЕЛЕНА ЛЕОНИДОВНА

ПРИНЦИПЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК ДЛЯ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ГЕНОВ

03.01.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный консультант:

д.б.н., профессор Зенкова Марина Аркадьевна

Официальные оппоненты:

Меркулова Татьяна Ивановна, д.б.н., профессор Институт цитологии и генетики СО РАН, зав. отделом

Габибов Александр Габибовнч, д.х.н., профессор, чл.-корр. РАН

Институт биоорганической химии имени академиков

М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, зав. лабораторией

Загребельнын Станислав Николаевич, д.б.н., профессор Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, зав. лабораторией

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «9» ноября 2012 г. в 10:00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан «08» октября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В. В.

российская госудлг'тнпчндя I библиок кл OI ЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуилвиос^ь-1цшш|емы. Вся необходимая информация для правильного развития и функционирования организма человека, зашиты его от повреждающих факторов внешней среды и патогенных микроорг анизмов закодирована в его геноме. В идеале геном не только содержит информацию обо всех белках, необходимых организму, но и информацию о том, когда и в каком количестве должен быть сиитезирован каждый белок. Система регуляции генетической 'жспрессии очень сложна и, несмотря на наличие дублирующих сигнальных систем и механизмов исправления повреждений генетической информации, в ней нередко происходят необратимые повреждения, которые приводят к развитию заболеваний или патологических состояний организма. Повреждения генетической информации могут вызывать разные последствия: отсутствие необходимого организму белка, избыток белка, либо синтез «неправильного» белка, который наносит вред организму. В первом случае для коррекции патологии необходимо ввести в клетку «правильный» ген, кодирующий недостающий белок, и тут па помощь может прийти гено-терапия. в двух других - требуется применение терапевтических средств, которые ограничат или блокируют синтез данного белка, не затрагивая при этом остальные системы клетки.

Прямым подходом к получению селективных ингибиторов экспрессии генов является использование терапевтических нуклеиновых кислот, способных избирательно связываться с мРНК гена-мишени и инактивировать её. Наиболее перспективными агентами для такого воздействия, действующими в наномолярных концентрациях, являются siPHK (малые интерферирующие РНК) [Fire el а!., 1998]. siPHK представляют собой дуплексы длиной 21-25 п.н.. которые в составе белкового комплекса связываются с комплементарной им РНК-мишенью и вызывают ее направленную деградацию.

siPHK широко применяются в функциональной геномике для идентификации генов, вовлеченных в такие основополагающие клеточные процессы как дифференцировка, апоптоз, физиологические процессы, а также генов, определяющих клеточную морфологию. Возможность направленно регулировать экспрессию любого гена позволяет не только исследовать их функции, но и вести поиск потенциальных мишеней для лекарственных препаратов на генном уровне. Любой ген может выступать в роли потенциальной мишени, поэтому перспектива использования siPHK в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых, нейродегенеративных и вирусных заболеваний является многообещающей. В настоящее время проводятся клинические испытания ряда препаратов на основе siPHK, однако широкое применение siPHK в терапии пока не представляется возможным из-за их чувствительность к рибонуклеазам. сложности выбора высокоэффективных последовательностей, возможности возникновения ряда побочных эффектов и проблемы доставки siPHK в клетки и ткани. Создание регуляторов экспрессии генов на основе siPHK, действующих по механизму РНК-интерференции, открывает новые возможности для получения широкого спектра высокоэффективных терапевтических препаратов, поэтому разработка принципов дизайна нового поколения siPHK. лишенных указанных недостатков, является исключительно актуальной.

Целью настоящей работы являлась разработка принципов конструирования ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов на основе химически модифицированных малых интерферирующих РНК. оказывающих пролонгированное действие и способных проникать в клетки без помощи носителя.

В ходе выполнения исследования необходимо было решить следующие задачи:

изучить влияние выбора специфической мРНК-мишени и последовательности-мишени в составе выбранной мРНК на способность siPHK тормозить пролиферацию

опухолевых клеток человека и разработать комплексный подход для поиска перспективных молекулярных мишеней для лечения опухолевых заболеваний.

• исследовать влияние количества и распределения химических модификаций в составе з1РНК на ее стабильность в присутствии сыворотки, биологическую активность и длительность интерферирующего действия и разработать универсальный экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых аналогов 81РНК, содержащих минимальное количество модифицированных звеньев и оказывающих длительное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени.

определить влияние нуклеотидных замен в составе химически модифицированных 31РНК на ее биологическую активность и предложить подход, позволяющий конструировать высокоэффективые Б^РНК, направленные к любым последовательностям, в том числе к последовательностям с неблагоприятной термодинамической ассиметрией.

• изучить влияние природы липофильных заместителей на способность з1РНК проникать в разные типы клеток в отсутствие трансфецирующего агента и проявлять интерферирующую активность и создать аналог э!РНК, способный проникать в клетки, ингибировать экспрессию гена-мишени и вызывать терапевтически значимое изменение фенотипа клетки.

• определить влияние длины и последовательности коротких и длинных двуцепочечных РНК на спектр их биологических активностей и оценить потенциал их антипролиферативного, иммуностимулирующего, противоопухолевого и антиметастатического действия.

Научная новизна и практическая значимость работы. Данная работа представляет собой первое комплексное исследование, в результате которого сформулированы принципы конструирования ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов на основе химически модифицированных малых интерферирующих РНК.

Разработан универсальный экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых химически модифицированных аналогов з1РНК, содержащих минимальное количество модифицированных звеньев, который может быть использован для конструирования селективных ингибиторов экспрессии генов, оказывающих длительное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени.

Впервые проведено систематическое исследование влияния количества и расположения нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных з1РНК на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия и предложен универсальный подход, позволяющий конструировать высокоэффективные «¡РНК, направленные к произвольным последовательностям, в том числе к последовательностям с неблагоприятной термодинамической асимметрией. Разработанный подход может быть использован для получения селективных ингибиторов экспрессии химерных и мутантных генов с сохранением экспрессии аллеля дикого типа.

Изучено влияние структуры липофильных аналогов з1РНК на их способность проникать в разные типы клеток без помощи трансфецирующего агента и их интерферирующую активность и впервые показано определяющее влияние на эти параметры длины алифатического линкера между з1РНК и липофильным остатком.

Использование разработанных принципов дизайна позволило идентифицировать ряд перспективных молекулярных мишеней для лекарственных препаратов и сконструировать высокоэффективные ингибиторы экспрессии терапевтически значимых генов, которые могут быть использованы как прототипы лекарственных средств нового поколения.

Публикации и апробация работы. Основные результаты работы отражены в 34 статьях (из них 3 обзора) и 1 патенте. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: всероссийская конференция "Фундаментальные науки -медицине" (Новосибирск, 2005.. 2006, 2007, 2010), "Cell Signaling World" (Люксембург. 2006), Биотехнология и медицина (Москва, 2006). "Nucleic Acids as Targets and Tools" (Новосибирск, 2006), "Физико-химическая биология" (Новосибирск, 2006, 2011), 2nd Russian-German Conference of the Koch-Metchnikov-Forum (Томск. 2007), XVIII Менделеевский съезд (Москва, 2007). "Apoptosis 2008" (Люксембург, 2008), Г/ съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008). International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology" (Туапсе, 2008), ARCUS Symposium "Development of new tools for fundamental research in health and disease" (Страсбург, 2008), WCG-2008, (Фошан, 2008), "RNAi Europe" (Берлин, 2009), International symposium "Control of Gene Expression and Cancer" (Москва, 2010), First Symposium "Supramolecular Chemistry for Materials and Life Science" (Новосибирск, 2010), International roundtable on nucleosides, nucleotides and nucleic acids (Лион, 2010), «Cell Signal-omics 2011: Integrated cellular pathology Systems biology of human disease» (Люксембург, 2011), Российско - немецкая конференция в рамках российско - немецкого года образования, науки и инноваций «Молекулярные основы инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2011), 6th Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology (Кэмбридж, 2011), Международная конференция «Молекулярная биология — медицине» (Киев, 2011), Фармацевтические и медицинские биотехнологии (Москва, 2012). Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 330 страницах, содержит 84 рисунка и 18 таблиц. Библиография охватывает 644 публикации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выбор мишеней для siPHK в составе мРНК

Дня того, что бы определить влияние вторичной структуры мРНК-мишени на эффективность действия siPHK мы сравнили эффективность действия антисмысловых олигонуклеотидов и siPHK, направленных к одним и тем же мишеням в составе мРНК гена MDR1 человека. Для исследования эффективности подавления экспрессии гена MDR1 с помощью siPHK и влияния на эффективность их действия структуры мишени были выбраны 5 siPHK (Табл. 1), адресованные к различным областям мРНК гена MDR1. Все использованные в дайной работе siPHK и их производные были синтезированы в Лаборатории химии РНК ИХБФМ СО РАН.

siE, siD и siB были гомологичны участкам MDR1 мРНК, включающим в себя мишени для антисмысловых олигонуклеотидов Е, В и D, использованных в работах [Kostenko et al., 2001; 2002]. В качестве контроля специфичности действия мы использовали sil, гомологичную области первого интрона гена MDRI. Мишенью для siU была 3'-нетранслируемая область мРНК гена MDR1, поскольку для некоторых генов показано, что именно эта область наиболее чувствительна к действию siPHK. siM, направленная на кодирующую область мРНК, была выбрана с помощью программы BioPredSi.

Ингибирование экспрессии гена MDRJ с помощью siPHK происходит за счет расщепления РНК-мишени, поэтому эффективность действия используемых siPHK может быть определена по снижению уровня целевой мРНК в клетках, однако, учитывая данные об изменении стабильности Р-гликоротеина в различных условиях, для оценки терапевтической значимости полученных эффектов необходимо определять уровень

снижения белка - продукта 'экспрессии гена, устойчивость клеток к ранее переносимым концентрациям цитостатика и тестировать функциональную активность Р-гликопротеина по изменению накопления в клетках субстратов Р-гликопротеина. Физиологическая важность таких модельных систем несомненна, поскольку именно функциональные гесты позволяют судить о приобретении или о преодолении Р-гликопротеин опосредованной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

Таблица 1. siPHK, использованные для подавления экспрессии гена MDR1 (GcnBank № Ml4758).

siPHK Последовательность1' мРНК мишень Функциональный участок мРНК

В 5'-UUCCAAGGAGCGCGAGGUCGG-3' 3' -GCAAGGUUCCUCGCGCUCCAG-5' 403-423 АиС-кодон

Е 5'-AUCAUCCAUGGGGCUGGACUU-3' 3'-GGUAGUAGGUACCCCGACCUG-5' 598-618 кодирующая область

D 5'-GGCUUGACAAGUUGUAUAUGG-3' 3'-AACCGAACUGUUCAACAUAUA-5' 557-577 кодирующая область

М 5'-CUUCCGAACCGUUGUUUCUUU-3' 3'-UUGAAGGCUUGGCAACAAAGA-5' 3133-3143 кодирующая область

и 5'-UGCAGACUUAAUAGUGGUGUU-3' 3'-UUACGUCUGAAUUAUCACCAC-5' 4141-4161 3' иТЯ район

1 5'-GUGUCAGGCUUUCAGAUUUCC-3' 3'-UUCACAGUCCGAAAGUCUAAA-5' нет область интрона (контроль)

"Жирным шрифтом выделена последовательность, соответствующая последовательности

антисмыслового олигонуклеотида.

Изменение уровня экспрессии MDR1 мРНК в клетках лекарственно-устойчивой карциномы человека КВ-8-5, обработанных siPHK, измеряли с помощью метода ОТ-ПЦР с использованием в качестве внутреннего стандарта гена ß-актина. Исследование кинетики процесса показало, что снижение уровня mdrl мРНК происходит через 16-18 часов после добавления siPHK, а минимальный уровень мРНК MDRI детектируется через 24 часа, sil, гомологичная последовательности нитрона и не имеющая мишени в составе мРНК, в концентрациях 1-100 нМ не влияла на уровень MDR1 мРНК в клетках (Рис. 1), что свидетельствует о специфичности действия выбранных siPHK.

Данные, приведенные на рисунке 1, показывают, что после 24-часовой инкубации клеток в присутствии siE в концентрации 5 нМ в них наблюдается снижение количества MDR1 мРНК до 30% от контроля. При увеличении концентрации siPHK до 20 нМ в клетках наблюдается минимальный уровень мРНК-мишени (10%). Дальнейшее повышение концентрации siPHK до 100 нМ не оказывает значительного влияния на эффективность ее действия.

Восстановление чувствительности клеток к винбластину под действием siPHK определяли с помощью МТТ теста. Инкубация клеток в присутствии винбластина в течение 24 - 72 ч после обработки siPHK приводила к снижению количества живых клеток лишь на 20% (Рис. 2), что. по-видимому, связано с довольно большим временем жизни Р-гликопротеина. Инкубация клеток в течение 96 ч после трансфекции si РНК приводила к снижению количества живых клеток до 30% относительно контроля. Как видно из данных, приведенных на рис. 2, при инкубации клеток в среде, содержащей винбластин в концентрации 300 нМ, наблюдалась постепенная гибель клеток, обработанных siE в комплексе с Олигофектамином. Инкубация клеток в присутствии siE без Олигофектамина

не вызывала изменения жизнеспособности клеток. Аналогичные результаты были получены и при инкубации клеток только в присутствии Олигофектамина: трансфектант вызывал лишь небольшое снижение жизнеспособности клеток, находящееся в пределах ошибки эксперимента, что свидетельствует о его незначительном токсическом действии.

§

i5 т-

се м Q

А

я

м1

й

■К 1 нМ 5 ИМ 10 НМ 20 им 50 нМ 100 нМ

[б!РНКЗ, нм

Рис. 1. Влияние зМК на уровень мРНК гена АЮШ в клетках КВ-8-5 через 24 ч после трансфекции Б1РНК. 51РНК Е (белые столбики); 51РНК 1 (серые столбики). Соотношение мРНК МОКЛ/актин в контроле (черные столбики) принимали за 1, стандартное отклонение определяли по результатам трёх независимых экспериментов.

Рис. 2. Кинетика изменения чувствительности клеток КВ-8-5 к винбластину под действием 100 нМ Клетки КВ-8-5 обрабатывали б1е в комплексе с Олигофектамином и инкубировали в присутствии 300 нМ винбластина. За 100% принимали количество клеток в момент добавления Я1РНК.

Сравнение данных, полученных с помошыо ОТ-11ЦР и МТТ методов, показало, что снижение уровня мРНК наблюдается уже тогда, когда фенотипические проявления подавления экспрессии гена MDR1 еще не детектируются. Поскольку для терапевтических целей важны именно фенотипические и функциональные проявления подавления экспрессии гена MDR1, проявляющееся в снижении уровня белкового продукта этого гена - Р-гликопротеина и в гибели клеток, в дальнейшей работе для оценки эффективности действия используемых анти-MDR1 siPHK использовались такие методы тестирования как МТТ тест, Вестерн-блот анализ и родаминовый эффлюкс, несмотря на то, что метод ОТ-ГПДР позволяет зафиксировать эффект на более ранней стадии.

Для исследования влияния положения мишени в структуре мРНК на эффективность действия siPHK клетки линии КВ-8-5 трансфицировали различными siPHK в концентрации 5-150 нМ и инкубировали в течение 96 ч. По окончании инкубации количество живых клеток определяли с помощью МТТ теста. За 100% принимали количество живых клеток в контроле, где клетки были инкубированы только с Олигофектамином. Через 96 ч инкубации в присутствии siE, siM, siB, siD и винбластина наблюдалось концентрационно-зависимое увеличение чувствительности клеток к винбластину и. как следствие, их гибель (Рис. 3).

Двукратное снижение количества живых клеток происходило уже при 20 нМ концентрации дуплекса для siE, siM и siD. При повышении концентрации этих siPHK до 100 нМ количество живых клеток снижалось до 30% от контроля, а при увеличении времени инкубации клеток в присутствии винбластина до 120 ч после добавления siE. siB, siM или siD в концентрации более 100 нМ происходила гибель всех клеток, sil и siU не оказывали никакого влияния на жизнеспособность клеток в присутствии винбластина даже при длительной (120 ч) инкубации, что еще раз подтверждает специфичность действия выбранных siPHK.

m l

g O'l.............i......i r " > i-■............>""

§ o 20 40 60 80 100 120 140

Рис. 3. Изменение чувствительности клеток КВ-8-5 к винбластину под действием siPHK. Клетки КВ-8-5 инкубировали в присутствии siPHK и 300 нМ винбластина в течение 96 ч (♦ - siE, ■ - siM, • - siB, А - siD, о - s¡U, □ - sil ). За 100% принимали количество живых клеток в контроле: клетки инкубировали с Олигофектамином в отсутствие siPHK. Ошибка эксперимента не превышала 10%. Представлены средние значения, определенные по результатам трех экспериментов.

[SÍ РНК], НМ

Таким образом, из исследованных шести siPHK четыре - siE, siD, siB и siM -оказались способны восстанавливать чувствительность лекарственно-устойчивой линии раковых клеток человека к винбластину.

Подавление экспрессии гена MDRI с помощью siPHK подтверждали путем определения количества продукта этого гена - белка Р-гликопротеина (P-gp). Д.яя этого, клетки линии КВ-8-5 транфецировали 20 нМ siPHK. Клетки инкубировали в течение 72 ч, лизировали и определяли количество Р-гликопротеина методом Вестерн-блот анализа, используя в качестве внутреннего стандарта, также как и в экспериментах по определению изменения уровня мРНК с помощью ОТ-ПЦР, [i-актин. Из данных, приведенных на рисунке 4, видно, что действительно, через 72 ч после трансфекции клеток siE количество Р-гликопротеина снижается до 17% от количества этого белка в необработанных клетках.

К ол siF. sil) siM siB sil1 sil ШР £Él£ i Р-глнкопротеин

Рис. 4. Снижение количества Р-гликопротеина в клетках линии КВ-8-5 через 72 ч после трансфекции siE, siD, siM, siB, siU и sil в концентрации 20 иМ (результаты Вестерн блот-гнбридизацни). В качестве контроля использовали интактные клетки (К) и клетки, инкубированные в присутствии Олигофектамина без добавления siPHK (ол).

Трансфекции клеток siB. siD и siM вызывает сходное снижение количества Р-гликопротеина. В то же время, обработка клеток Олигофектамином, siU или sil в присутствии Олигофектамина, не оказывавшая влияния на жизнеспособность клеток в присутствии винбластина, не влияла и на количество Р-гликопротеина в клетках.

Одним из способов тестирования фенотипа МЛУ и активности P-gp является функциональный тест, определяющий накопление родамина-123 в клетке, так как этот краситель является субстратом P-gp. Клетки, в мембране которых содержится P-gp, выводят из цитоплазмы родамин 123 в межклеточное пространство, и, наоборот, подавление экспрессии гена MDR1 и снижение уровня P-gp приводит к аккумуляции родамина 123 в цитоплазме.

Фотографии препаратов клеток, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, представлены на рисунке 5. Из приведенных данных видно, что в родительской линии КВ-3-1 (Рис. 5 А) родамин 123 эффективно накапливается в цитоплазме и клетки становятся «красными», тогда как клетки КВ-8-5 с фенотипом МЛУ остаются «синими» (Рис. 5 В). siE и siD, под действием которых наблюдалось значительное снижение уровня P-gp (Рис. 4), в концентрации 20 нМ вызывают в клетках КВ-8-5 накопление родамина 123 и клетки становятся «красными», то есть приобретают

(З-актин

фенотип лекарственно - чувствительных клеток (Рис. 5 Г и Д). Аналогичный эффект оказывали на клетки КВ-8-5 siB и siM (данные не приведены). siU и контрольная sil, не влияющие на уровень мРНК и белка, также не влияют и на транспорт красителя и клетки остаются «синими» (Рис. 5 Е и Ж), то есть клетки сохраняют фенотип лекарственной устойчивости. На фотографиях отчетливо видно появление фенотипа МЛУ - клетки КВ-3-1, в которых экспрессия гена MDR1 была активирована с помощью небольшой (3 нМ) концентрации винбластина, занимают промежуточное положение между отчетливо «красными» и отчетливо «синими» клетками (Рис. 5 А, Б и В).

Таким образом, подавление экспрессии гена MDR1, выражающееся в снижении уровня белка, восстановлении чувствительности клеток к цитостатику и обращении фенотипа МЛУ под действием siE, siB, siM и siD происходит со сходной эффективностью для всех четырех siPHK, в то время как эффективность действия антисмысловых олигонуклеотидов, направленных к тем же участкам, что и siPHK, существенно отличается (Табл. 2).

Таблица 2. Сравнение эффективности действия антисмысловых олигонуклеотидов и

Обозначение Эффективность ингибирования

siPHK* Антисмысловои олигонуклеотид** гKostenko et al., 2002]

В 75% 40%

Е 90% 90%

D 80% 0%

* - за эффективность ингибирования принимали % снижения уровня Р-глнкопротеина через 72 ч после трансфекции 20 нМ 51РНК относительно контроля.

** - за эффективность ингибирования принимали снижение уровня экспрессии мРНК гена МОЯ! через 24 ч после инкубации с 50 мкМ антисмысловым олигонуклеотидом.

Рис. 5. Накопление родамина 123 в клетках линии КВ-8-5 после обработки 81РНК. Фотографии клеток в поле флуоресцентного микроскопа, увеличение 400х. Синий цвет - ядра, окрашенные Хехст 33258, красный цвет -родамин 123, накапливающийся в цитоплазме. А -клетки линии КВ-3-1, культивируемые в отсутствие винбластина и э1РНК; Б - клетки линии КВ-3-1, активированные добавлением 3 нМ винбластина; В -клетки линии КВ-8-5, культивируемые в отсутствие з1РНК. Г, Д, Е, Ж - клетки линии КВ-8-5, через 72 ч инкубации в присутствии 20 нМ $1РНК Е (Г), з1РНК О (Д), 51РНК и (Е), 51РНК I (Ж).

КВ-8-5 после обработки sil

Несмотря на то, что максимальный уровень подавления экспрессии гена MDR1 достигал 90% при использовании siPHK и антисмыслового олигонуклеотида, направленных к области Е MDR1 мРНК, используемые концентрации ингибиторов различались на несколько порядков (20 нМ и 50 мкМ для siPHK и антисмыслового олигонуклеотида, соответственно). Эффективность действия siD оказалась сравнима с

эффективностью - действия siE, в то время как антисмысловой олигонуклеотид D не оказывал влияния на экспрессию гена MDR1.

Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что подавление экспрессии генов с помощью siPHK менее требовательно к выбору последовательности мишени в составе мРНК и гибридизационным свойствам используемых олигорибонуклеотидов по сравнению с «антисмысловым» подходом.

2. Выбор генов в опухолевых клетках человека в качестве мишеней для терапевтических siPHK

Нарушение регуляции экспрессии генов, кодирующих регуляторы клеточного цикла, считается ключевым фактором развития различных типов опухолей у человека, однако, при ингибировании одного и того же гена терапевтический эффект может существенно отличаться. Это определяет необходимость сравнения антипролиферативного действия siPHK на разных линиях опухолевых клеток человека.

Гены Her2, CCNB1, РКС и C-MYC кодируют белки, относящиеся к разным группам регуляторов клеточного цикла. Ранее было показано экспериментально и подтверждено клинически, что нарушения экспрессии этих генов могут приводить к возникновению злокачественных опухолей у человека, поэтому мы выбрали мРНК этих генов в качестве мишеней для siPHK.

В качестве моделей различных типов опухолевых заболеваний человека нами были выбраны клетки линий КВ-3-1 (карцинома шейки матки), SK-N-MC (нейробластома), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) и HL-60 (промиелоцитарный лейкоз) (Рис. 6). Во всех исследованных клетках обнаружен высокий уровень мРНК гена CCNB1 и гораздо меньший уровень мРНК гена Нег2. Повышенный уровень мРНК гена РКС наблюдался в клетках MCF-7. Гиперэкспрессия гена C-MYC была обнаружена в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC. Последовательности siPHK, гомологичные мРНК генов-мишеней, были выбраны с помощью программы BioPredSi (Табл. 3).

КВ-3-1

SK-N-MC

HL-60

MCF-7

О

с-тус

р>-актин

Рис. 6. А. Уровни мРНК генов Her2, CCNB1 (CvclinBl) и РКС в клетках линий КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 н HL-60. Б. Уровни мРНК гена C-MYC в клетках линий КВ-3-1 и SK-N-MC. Продукты реакции ОТ-ПЦР разделяли методом электрофореза в 1.5% агарозном геле и детектировали с помощью окрашивания бромистым этидием.

Таблица 3. siPHK, направленные к мРНК генов Her2, CCBN1, РКС, C-MYC

Обозначение Последовательность* Мишень

siHer 5'-GCAGUUACCAGUGCCAAUAUU-3' 3 " -CCCGUCAAUGGUCACGGUUAU-5 ' 1299- 1319 н. мРНК Her2

siCyc 5'-CACCAGGAACUCGAAAAUUUU-3' 3'-CAGUGGUCCUUGAGCUUUUAA-5' 190 - 210 h. мРНК CCNB1

siPKC 5"-GCGGCCAGAGAAGGAAAAAUU-3' 3"-GUCGCCGGUCUCUUCCUUUUU-5' 1080- 1100 h. мРНК PKC

siMyc 5'-GAGGUGCCACGUCUCCACAUU-3' 3'-UUCUCCACGGUGCAGAGGUGU-5' 1452- 1470 н. мРНК C-MYC

siScr 5'-CAAGUCUCGÜAUGUAGUGGUU-3' 3'-UUGUUCAGAGCAUACAUCACC-5' -

* С - 2'-0-метил-цитозин, U — 2 -О-метил-уридин

к

S

3"

га

ю

>.

Ї

X

S

sc ___

X £ о U

'¡л

:£

О 1Л

1-

ш и

с

2 г>

т

к

5

X

ш

■©•

и

X

го

о.

н

В качестве параметров для исследования действия .ч1РМ1\ мы выбрали 01 [ределсние относительного уровня экспрессии генов-мишеней. скорости клеточной пролиферации, доли живых, мёртвых и находящихся в стадии апоптоза клеток, и выборочный анализ

морфологии клеток. Обшая схема исследования приведена на Рис. 7.

Рис. 7. Схема исследования.

2.1. Подавление экспрессии генов Her2 (c-erh-B2), CCNBI, РКС и C-MYC в клеточных шниях КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 под действием siPHK

Влияние siPI IK па уровень целевой мРНК исследовали по следующей схеме: siPHK и концентрациях 50-200 нМ трансфецировали в клетки, используя в качестве трансфектанта Элигофектамин для клеток SK-N-MC и Липофектамин 2000 для других клеточных линий. 4ерез 48 ч после трансфекции из клеток выделяли суммарную РНК и определяли уровень специфичных мРНК с помощью метода О'Г-ГЩР. используя ß-актин в качестве знутреннего стандарта. Специфичность действия siPHK проверяли по сохранению уровней мРНК р-актина и негомологичных генов-мишеней.

Поскольку из литературных данных известно, что эффект снижения уровня целевой vi РНК под действием siPHK наблюдается уже через сутки после доставки siPHK в клетку. а в опубликованных работах по подавлению экспрессии генов Her2. CCNB1, РКС максимальное снижение уровня мРНК фиксировали через 48 ч после трансфекции, то для того, чтобы можно было сопоставить наши данные с литературными, относительный уровень мРНК целевых генов в данной работе определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном зремени через 48 ч после трансфекции siPHK. Нами было обнаружено, что siCyc, siHer и siPKC вызывают существенное ипгибироваиие экспрессии генов-мишеней в клетках КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 (Рис. 8).

Трансфекция siHer вызывает значительное снижение уровня мРНК гена Нет2, лричем этот эффект мало зависел от концентрации siHer в диапазоне концентраций от 50 то 200 пМ. Через 48 ч после трансфекции siHer уровень мРНК гена Нег2 составлял 28 -40% в клетках линии КВ-3-1, 33 - 53% в SK-N-MC. 44 - 58% в MCF-7 и 48 - 63% в клетках линии HL-60 относительно уровня этой мРНК в клетках контрольной популяции, которая была обработана только трансфецирующим агентом (Рис. 8).

Трансфекция клеток siCyc в концентрации 50 — 200 нМ снижает уровень мРНК гена CCNBI копцептрационно-зависимым образом, что особенно сильно проявляется в клетках пиний MCF-7 и SK-N-MC. Наименьшие по сравнению с контролем уровни экспрессии

мРНК reim CCNB1 составили 23% и 29% для клеток КВ-3-1 и HL-60 при концентрации siCyc 100 нМ (Рис. 8 Л, Г) и 23% и 47% для клеток МСТ-7 и SK.-N-MC при концентрации siCyc 200 пМ (Рис. 8 Б. В). Аналогичные данные были получены для siPHK. направленной к мРНК гена РКС: трансфекция siPKC в концентрации 200 пМ вызывает снижение уровня этой мРНК в клетках линии MCF-7 до 42%-го уровня по сравнению с контрольной популяцией (Рис. 8 В).

Эффективное и специфичное ингибирование экспрессии гена C-MYC было достигнуто с помощью siPHK siMyc: под действием этой siPHK в концентрации 75-150 нМ уровень мРНК гена С-МУС снижался на 65 - 90% в клетках К.В-3-1 (Рис. 8 Д) и па 60% в клетках SK-N-MC (Рис. 8 Е).

SK-N-MC

д-

»fScr SlHor? sCycfn stPKC

stScr

siHer2 iiCycBI

E.

75 150 [siPHK], HM

Рис. 8. Подавление экспрессии генов-мишеней под действе,\i siPHK. Относительные уровни мРНК генов Her2, C.CNBJ и РКС в клетках KB-3-I (A), SK-N-MC (Б), MCF-7 (В) и III.-60 (Г) и уровни мРНК гена C-MYC в клетках КВ-3-1 (Д) п SK.-N-MC (Е) через 48 ч после трансфекцин siPHK в концентрации от 5Ü до 200 пМ. Представлено среднее значение ± стандартное отклонение, рассчитанное по результатам трех независимых экспериментов. Относительную экспрессию геиов-мишеней определяли как отношение уровня их мРНК к уровню мРНК ß-актииа или к уровню мРНК Р2-микроглобулина (для г'ена C-MYC'), использованных в качестве внутренних стандартов.

Наблюдаемое подавление экспрессии генов-мишеней под дейс твием siPHK является ген-специфичным, поскольку после добавления, например, комплекса siCyc с трапсфекциоииым реагентом происходило снижение экспрессии только гена CCNBJ, а экспрессия генов Herl, РКС и гена домашнего хозяйства ß-актииа оставалась на прежнем уровне. Специфичность других siPHK, использованных в работе, была проверена аналогичным образом (данные не приведены). Как и ожидалось, siPHK со случайной последовательностью siScr практически не влияет на экспрессию генов-мишеней (Рис. 8).

2.2. Пролиферация клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 после подавления экспрессии генов Her2, CCNB1, РКС и C-MYC

Ввиду того, что гены Her2. CCNB1, РКС и С-МУС играют важную роль в регуляции клеточного деления, а их гиперэкспрессия ведет к неконтролируемой пролиферации, мы предположили, что снижение уровня экспрессии этих генов будет приводить к подавлению деления клеток и, следовательно, замедлять скорость пролиферации. Зависимость скорости пролиферации клеток в линиях КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 и HL-60 от уровня экспрессии генов-мишеней определяли с помощью МТТ-теста (Табл. 4).

Полученные данные показывают, что обработка клеток siHer в концентрациях 50 и 200 нМ (во всех экспериментах использовали комплексы siPHK с трансфицирующим агентом) приводит к снижению скорости пролиферации клеток КВ-3-1 до 84 и 75%, SK-N-MC - до 93 и 79%, MCF-7 - до 82 и 65% от скорости роста клеток в контроле, соответственно. Несмотря на значительное подавление экспрессии гена Нег2 под действием siHer во всех клеточных линиях, скорость пролиферции заметно снижалась лишь в клетках MCF-7 (до 65%), в то время как в остальных клеточных линиях антипролиферативный эффект был выражен слабо.

Подавление экспрессии гена CCNB1 с помощью siCyc снижает скорость деления клеток КВ-3-1 до 75 и 61% от контроля, SK-N-MC - до 82 и 4%, MCF-7 - до 77 и 53%, при концент-рации 50 и 200 нМ, соответственно. Несмотря на значительное снижение экспрессии гена CCNB1 под действием siCyc в клетках HL-60, это снижение не сопровождается достоверным снижением скорости их роста. Подавление экспрессии гена С-МУС практически полностью блокирует деление клеток КВ-3-1 и вдвое снижает скорость деления клеток SK-N-MC.

Таблица 4. Влияние siHer, siCyc, siPKC, siMyc на пролиферацию клеток КВ-3-1, SK-___N-MC, MCF-7 и НЬ60.__

siPHK, концентрация Скорость пролис іерации, %*

КВ-3-1 SK-N-MC MCF-7 HL-60

Контроль** 100 ±5 100 ±1 100 ±3 100±3

siScr, 50 нМ 89 ±2 105 ±5 94 ±4 99 ±2

sïScr, 200 нМ 90 ±2 68 ±2 92 ±3 101 ±1

siHer, 50 нМ 84 ±8 93 ±4 82 ±5 97 ±2

siHer, 200 нМ 75 ±9 79 ±1 65 ±1 100 ±4

siCyc, 50 нМ 75 ±2 82 ±4 77. ±3 . ■ 99 ±2

siCyc, 200 нМ 61 ±4 4 ±2 53 ±4 98 ±4 ; ;

siPKC, 50 нМ - - 57 ±3 -

siPKC, 200 нМ - - 11 ±2 -

siMyc, 50 нМ 90 ±3 95 ±2 68 ±2 80±5 ..:•

siMyc, 200 нМ 2 ±1 46 ±3 20 ±5 37 ±3 -

"Средние значения по результатам трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. ** Клетки, обработанные только трансфецирующим агентом.

Очень важной информацией для разработки препаратов на основе siPHK является длительность их ингибирующего действия. Однако, большинство экспериментов ограничивается временами инкубации до 96 часов, в то время как сниженный под действием siPHK уровень мРНК гена-мишени сохраняется до 4 - 5 суток.

Данные по длительности влияния siPHK на экспрессию генов Her2, CCNB1 и РКС в литературе отсутствуют, поэтому нами была впервые исследована кинетика изменения относительного уровня экспрессии этих генов под действием siPHK (200 нМ) на протяжении первых 12 суток после трансфекции клеток КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7.

Как видно из Рис. 9, снижение уровня экспрессии генов-мишеней наблюдается уже через 24 ч после трансфекции клеток, а эффективность снижения уровня специфической мРНК различается в зависимости от клеточной линии и гена-мишени. Все siPHK эффективно и специфично подавляют экспрессию своих генов-мишеней в использованных клеточных линиях, причём максимальное подавление (до 1 - 3% от контроля) наблюдается через 72 ч после трансфекции. Через 72 ч после трансфекции уровень мРНК гена Her2 составил 15% в клетках К.В-3-1, 4% в клетках SK-N-MC и 7% - в клетках линии MCF-7 относительно контроля. Уровень мРНК гена CCNB1 через 72 ч после трансфекции siCyc понижался до 22% по сравнению с контролем в клетках КВ-3-1, до 16% - в SK-N-MC и до 18% - в клетках MCF-7. Трансфекция siPKC снижает уровень мРНК гена РКС в клетках MCF-7 до 14% (Рис. 9). Полученные данные свидетельствуют о том, что siHer, как ингибитор экспрессии гена Нег2 наиболее эффективен в клетках линий SK-N-MC и MCF-7, а siCyc наиболее эффективно снижает уровень мРНК гена CCNB1 в клетках SK-N-MC и MCF-7 (Рис. 9). Начиная с 4-го дня после трансфекции, уровень мРНК всех генов постепенно увеличивался и возвращался к исходному значению к 7 -12 суткам после трансфекции (Рис. 9).

Е ä

£ 3

а 5

- Кон трал UH«r2.

CCNB1 -tlScffltorS

—»Irter/MerJ

•IScrfCCNBI

-SICyc/CCNB1

0 1 2 3 4 5

7 0 9 10 11 12

сутки

— KoMTparWH«r2. CCNB1, РКС mtScrftterJ

— mlHefOiert

KlScrfCCNBI -•iCyc/CCNBI -•lÄtrfPHC

— kiPMCfPKC

0 12 3 4

В S 10 11 12

сутки

• Коитралъ/Н*г2, CCNB1 »iscffltara Е '18 Sl

■•1Н«г/Н*г2 g 11.4 G и.:

•¡Scr/CCNBI

••ICyc/CCNBI

2 3 4 5 в 7 8 9 10 11 12

сутки

iL.

сутки

Рис. 9. Относительный уровень мРНК генов Her2, CCNB1 и РКС в клетках KB-3-l (А), SK-N-MC (Б) и MCF-7 (В) н мРНК гена С-Л/УС в клетках KB-3-l (Г) через I - 12 суток после трансфекции siPHK (200 нМ). Уровни мРНК ß-актина пли р2-мчкрог:юбу:шна использовали в качестве внутренних стандартов. Приведены данные по результатам трех независимых экспериментов. Стандартное отклонение не превышает 10%. Контроль/ген - относительный уровень мРНК соответствующего гена в контрольных клетках. siPHK/ген - относительный уровень мРНК соответствующего гена в клетках после трансфекции указанной siPHK.

Как видно из Рис. 9. кинетика изменения относительного уровня мР11К генов 11ег2, CCNB1 и РКС после трансфекции специфическими siPHK носят U-образиый характер. Визуально в каждой кривой можно выделить участок снижения уровня специфической мРНК (1-3 день), участок возрастания ее количества (3-7 день) и участок, на котором количество мРНК мишени стабилизируются на уровне, соответствующем уровню специфической мРНК в контрольных клетках (7-12 день). Постепенное восстановление исходного уровня мРНК в клетках может быть связано с клеточным делением, которое приводит к снижению концентрации siPHK в цитоплазме, и. как следствие, к ослаблению эффекта РНК-интерференции. Другой причиной снижения биологической эффективности может бы ть расщепление siPHK под действием рибонуклеаз в цитоплазме.

Снижение числа живых клеток в популяции может происходить как в результате задержки клеточного деления, так и в связи с гибелью части клеток по механизму апоптоза. Для выяснения механизма антипролиферативного действия исследованных siPHK мы проанализировали их влияние на индукцию апоптоза через 72 ч после трансфекции siPHK, используя для этого метод селективного окрашивания живых, мертвых и находящихся в стадии апоптоза клеток.

Все образцы, включая контрольные клетки, подвергнутые действию только трансфектанта, содержали определенный процент мертвых клеток (от 11 до 58%), в то время как исходная популяция клеток содержала менее 10% мёртвых клеток. Это связано с определенной токсичностью самого трансфецирующего агента. После трансфекции siScr, siller и siC'yc доля мёртвых клеток была различна для разных клеточных линий: минимальное их содержание обнаружено в популяции клеток HL-60 (10.4 - 15.2%), несколько больше в клетках КВ-3-1 (17.1 - 20.2%) и SK-N-MC (23.7 - 28%), а наименее жизнеспособными оказались клетки линии MCF-7 (36.3 - 50.5% погибших клеток). Клетки, находя-щиеся в стадии апоптоза. обнаружены только в популяциях клеток линий КВ-3-1 (1.6 - 3.9%) и HL-60 (1.7 - 2.6%).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в клетках, обработанных контрольной siPI IK или siPHK. направленной на мРНК генов CCNB1, Нег2 или РКС. не происходит увеличения количества мертвых и находящихся в стадии апоптоза клеток по сравнению с препаратами клеток, обработанных только трансфектантом. Можно предположить, что в используемых клеточных линиях не клеточная гибель, а подавление клеточного деления лежит в основе антипролпферативной активности исследованных siPHK.

Поскольку данные по селективному окрашиванию живых, мёртвых и находящихся в стадии апоптоза клеток свидетельствуют о том, что причиной наблюдаемого антипролиферативного действия исследуемых siPHK является не гибель клеток, а замедление их деления, то необходимо было определить, как изменяется скорость клеточного деления после восстановления исходного уровня экспрессии гепов-мишеней. Скорость пролиферации клеток линий КВ-3-1, SK-N-MC и MCF-7 оценивали с помощью МТТ-теста в период с 7 по 12 день после трансфекции соответствующей siPHK (200 нМ) (Табл. 5).

Как видно из Табл. 5. использованные клеточные линии можно условно разделит], на три группы: клетки, скорость пролиферации которых полностью восстанавливается (КВ-3-1); скорость пролиферации которых остается значительно сниженной (SK-N-MC): и клетки, скорость пролиферации которых остается незначительно сниженной после восстановления исходного уровня мРНК генов-мишеней. Вероятно, временное подавление экспрессии генов Her2. CCNB1, РКС не приводит к необратимым изменениям в регуляторных системах клеток КВ-3-1. поэтому при восстановлении уровней мРНК этих генов восстанавливается и скорость пролиферации клеток.

Несмотря па обнаруженный нами выраженный аитипролиферагивиый эффект препаратов siPHK, для ограничения роста клеточных линий MCF-7 и SK.-N-MC необходимо поддерживать сниженный уровень экспрессии генов-мишеней. Этого можно добиться, повторно вводя в клетки соответствующие siPHK или используя шпилечные интерферирующие РНК (sliPHK). которые экспрессируются непосредстванно в клетках-мишенях.

В культуре клеток SK.-N-MC временное выключение экспрессии генов Her2, CCMBI и РКС приводит к значительному замедлению деления клеток даже после восстановления исходного уровня мРНК генов-мишеней (Табл. 5). Выраженный антипролиферагивиый эффект (5-10 раз) кратковременного выключения экспрессии этих генов сохраняется до 12 суток инкубации. Этот феномен можно объяснить, принимая во внимание специфический паггерп экспрессии генов в клетках пейронального происхождения, изменением паттерна экспрессии генов в результате временного выключения геиов-мишеней и его последующей реактивации. В силу этого, вероятно, даже кратковременное ннгмбирование экспрессии гена CCNB1 или РКС может привести к очень медленному восстановлению скорости пролиферации клеток (или полному блокированию) даже после восстановления исходного уровня продуктов каждого из генов-мишеней. Таким образом, гены CCNB1 и РКС могут рассматриваться как перспективные терапевтические мишени для препаратов, предназначенных для лечения нейробластом и рака молочной железы.

Таблица 5. Скорость деления клеток КВ-3-1, SK-N-MC, MCF-7 после восстановления исходного уровня экспрессии генов-мишеней_

siPHK, 200 нМ Скорость пролиферации*, %

КВ-3-1 SK-N-MC MCF-7

Контроль** 1.00±7 100±6 100±3

siScr 113±10 90±7 93±6

siHer 123±8 36±9 78±2

siCyc 112±9 14±4 73±2

siPKC 117±14 9±3 79±2

* Средние значения по результатам трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

** Клетки, обработанные только трансфектантом.

Проведенное исследование показало, что наиболее эффективное ингибироваиие экспрессии генов СС.МВ1 и РКС наблюдается в клетках нейробластомы человека 5К-Ы-МС. поэтому мы провели микроскопическое изучение изменений морфологии и деления клеток этой линии под действием 5)Сус и 81 РКС (анализ проведен совместно с д.б.н. Е. И. Рябчиковой).

Установлено, что культура 8К-Ы-МС, обработанная олигофектамином (контроль), через 24 ч инкубации представлена разными тинами клеток: "островные", распластанные нейроноподобные. веретеновидные клетки. При одинаковой посевной дозе за 3 дня инкубации контрольные клетки культуры и клетки трансфииированные .^¡Зсг. практически полностью заполняли площадь стекла, тогда как трансфекция ,ч1Сус и ы! РКС' резко замедляла размножение клеток, их число на стекле в это же время было несравнимо меньше (Рис. 10). Также наблюдалось резкое уменьшение числа митозов в клетках ( Табл. 6). Даже через 12 дней после трансфекции ¿¡С'ус количество клеток на стеклах было существенно меньше, чем в контроле через 3 дня после трансфекции. Количество клеток на стекле через 12 дней после трансфекции $1РКС превышало их количество после

трансфекции Б^ус. Таким образом, результаты микроскопического изучения клеток БК-Ь1-МС после трансфекции этими з1РНК согласуются с данными по их влиянию на скорость пролиферации этих клеток.

Изучение морфологии клеток БК-Ы-МС через 3-12 дней после трансфекции показало, что временное ингибирование экспрессии генов ССУД/ и РКС не приводит к их гибели или дифференцировке, на что указывает сохранение разных типов клеток в популяции, а приводит к задержке деления. Постепенное увеличение в препаратах, трансфицированных специфическими 51РНК, к 10 - 12 суток инкубации суммарного количества клеток и клеток в стадии митоза (Табл. 6), указывает на то, что длительность антипролиферативного действия этих э1РНК в клетках БК-Ы-МС, по-видимому, ограничена 12- 15 сутками.

Таким образом, нами была предложена и опробирована схема исследования влияния интерферирующих РНК на пролиферацию опухолевых клеток на примере й;РНК, гомологичных мРНК генов Нвг2, €¿N111, РКС и С-МУС. Обнаружено, что данные интерферирующие РНК с разной эффективностью замедляют деление опухолевых клеток различного происхождения, что указывает на необходимость идентификации индивидуальных молекулярных мишеней для терапии каждого типа опухолевого заболевания.

¡¡ШШ 'ШтШ ЩШй

тщ 'жШш^Щ

Рис. 10. Клетки нейробластомы БК-Ы-МС на стекле (тотальные препараты). Контрольные клетки (обработка только трансфектантом): А - 1 сутки инкубации, Б - 3 суток инкубации. Трансфекция 200 нМ 51$сг: В - 1 сутки инкубации, Г - 3 сутки инкубации. Трансфекция зЮус: Д - 3 суток инкубации, Е - 12 суток инкубации. Трансфекция Э1РКС: Ж - 3 суток инкубации, 3-12 суток инкубации. Окраска гематоксилином. Длина масштабной линии 200 мкм.

Таблица 6. Количество клеток SK-N-MC в фазе митоза через 1-12 суток после __трансфекции siCyc и siPKC (200 нМ)_

Дни Количество митозов на 1000 клеток

Контроль* siScr siCyc siPKC Контроль без трансфектанта

1 14 ± 5 16 ± 8 - - -

2 40 ± 16 25 ±7 - - 22 ± 15

3 21 ± 10 33 ± 12 15 ± 11 16 ± 7 -

5 - - 30 ± 12 20 ± 11 -

7 - - 28 ±6 35 ±5 -

12 - - 30 ±6 49 ± 14 -

* Клетки, обработанные только трансфектантом. (-) - не определяли.

Сконструированные нами ингибиторы экспрессии генов Нег2, ССА'ВI и РКС могут рассматриваться как прототипы лекарственных средств для сдерживания роста опухолевых клеток, переживших химиотерапию, и, таким образом, могуг стать одним из компонентов комплексной терапии при опухолевых заболеваниях. Идентифицированные молекулярные мишени могуг быть использованы для поиска низкомолекулярных ингибиторов функций этих белков с целью получения лекарственных средств нового поколения. Опробированная нами технологическая платформа может использоваться для скрининга молекулярных мишеней для противоопухолевых препаратов и может быть использована для расширенных исследований различной целевой направленности.

3. Получение нуклеазоустойчивмх химнческн-модифнцнрованных ¡¡РНК

Одним из важных факторов, влияющих на эффективность подавления экспрессии гена-мишени под действием эИ'НК и обеспечивающих длительность достигнутого эффекта, является сохранность б1РНК в клетке и культуральной среде. Замена большого числа нуклеогидов или всех нуклеотидов в составе з1РНК на их химически модифицированные аналоги обычно существенно снижает или даже полностью блокирует их интерферирующую активность. Поэтому создание паттернов или алгоритмов модификации, позволяющих минимизировать число модифицированных звеньев в составе б1РНК, необходимое для повышения ее нуклеазоустойчивосги. представляет собой актуальную задачу. Для того, чтобы выявить нуклеазочувствительные сайты в составе з1РНК и ввести минимально-необходимое количество 2'-ОМе модификаций мы решили исследовать распределение нуклеазочувствительных сайтов в составе «¡РНК отличающихся по последовательности.

Для исследования специфичности расщепления з1РНК в присутствии сыворотки мы использовали две 21-звенные «¡РНК «¡Э и «¡Е, которые были выбраны ранее (Табл. 7). Исследование расщепления (Рис. 11, А-Г) и б1Е (данные не приведены) показало, что в присутствии сыворотки происходит специфическое эндорибонуклеазное расщепление и дефосфорилирование з1РНК.

Анализ продуктов деградации бЮ показал, что расщепление происходит, в основном, по СрА, ирО и ирА сайтам. Набор типичных продуктов деградации появляется уже через 3 минуты инкубации и некоторые из них сохраняются интактными в реакционной смеси до конца инкубации (24 ч). Скорость деградации не позволила нам различить сайты первичного и вторичного расщепления. Следует отметить, что расщепления по сайтам 1ЛЗ-014 в составе смысловой цепи и Ш1-012 в составе антисмысловой цепи не наблюдалось. Укорочение продуктов расщепления сопровождалось усилением степени их дефосфорилирования. В случае «¡К паттерн расщепления оказался более сложным. Прежде всего, следует отметить, что эта з1РНК оказалась более устойчивой к деградации и интактный дуплекс полностью не диссоциировал в процессе электроферетического разделения в присутствии 7 М мочевины. Сравнение температур плавления дуплексов Е и О показывает, что Я1Е существенно термостабильнее (Тш 81.5°С) чем з1П (Тт 71.8 °С), что может быть причиной ее повышенной нуклеазоустойчивосги. Во вторых, при расщеплении этой з1РНК обнаружены новые мотивы, по которым происходит основное расщепление (СрС, ир1_1) и сайты минорного расщепления (ОрО, 1ЛрС, АрЫ). Расщепление по этим мотивам зависело от их расположения в структуре дуплекса и окружающего контекста, тогда расщепление по найденным нами ранее в составе «¡1) мотивам (СрА, ирА и ирв) происходило во всех местах, где они встречались.

Таблица 7. Последовательности и температуры плавлення 5ІРНК

Обозначение Последовательность' Тт, "С2

яЕ 5'-АОСАиССАОСССЄСиССАСОО-З' 3'-ССиДСОАССОАСССССАССОЄ-З' 81.5

зіЕт 5'-АОСАиССАиСССЬСиССАСии-З' 3'-ССиАйиАССиДСССССАССиС-5' 83.0

вівг 5' -АОСАиССАиЄССССиССАСии-З' 3'-ССиАСиАССиАСССССАССиС-5' 84.0

ьіЕгт 5'-АиСАиССАОСССЄСиССАСии-З' 3'-СОиАСиАЄбиАСССССАССиО-5' 83.5

БІО 51-СССиаСАСААСиисиАЦАиСС-З' 3"-ААССЄААСисииСААСАиАиД-51 71.8

БШІ 5'-СССОиСАСААСиисиАийТСС-З' 3'-ААСССААСиЄииСААСА0АиА-5' 74.5

5Ю2 5 4-СССииСАСААСиОСиАидиСС-З' 3 ~-ААССЄААСиСииСААСАиА0А-5' 74.9

зіОт 5 ' - ЄОСииСАСААСиисиАиАиСС- 3 ' 3"-ААСС6ААСТОииСААСАиАиА-5' 77.5

віМ 5'-СССииСАСААСииєиАиАиСС-З' 3 4 -ААСССААСиЄииСААСАЦАиА- 5 ' 76.0

5Ю5 5 ~-СССииСАСААСиисиАЦАиСС-З " 3 1 -ААССЄААСОСОиСААСАиАиА-5 1 75.0

N.-2"-ОМе аналоги С, II и А ; Тгп измерена к.т.н.

А Б

мин ч

1 К Ч 1Ч 40 1

мин ч к 4 і чо і

Ш5ч, 1113-с8-115" С2~

фосфат .

В

мин ч

¿-к я 15 301

і 15ч а

П7-І

'фосфат.

г

I,

СІ4-5

019,5

К 4 15 40 1 ?

Ломзовым А. А. (ИХБФМ СО РАН).

Рис. 11. Картирование нуклеазо-чувствительных сайтов в бЮ, содержащей 5'-|32Р]-меченые (А, Б) и З'-меченные (В, Г) смысловые (А, В) или антисмысловые (Б, Г) иепи. Авгорадиограф 10%-ного

денатурирующего ПААГ. Дорожка Ь -имидазольный ледаер; дорожка К, 51'РНК, после инкубации в 1МЭМ без сыворотки, .я¡РНК (3 нМ) инкубировали в 1МОМ с 10% РВ5 при 37°С. Время инкубации указано сверху. Д - Схема расщепления Маленькие и

большие стрелки указывают на интенсивность расщепления.

фпгфа і _

д

фосфат _

5" — С-Є—С—и—и-Є—А-С-А—А—Б-и-и-С—и—А-ї і-Ч-С-О-З' З ' -А-А-С-С-С-А-А-С-и-Є-и-и-С-А-А-С-А-и-і 1-А-5 '

т

т

Мы сконструировали серию 8|РЫК (Табл. 7), содержащих разное количество модифицированных нуклеотидов: э¡О 1 и з1Еш содержали 2'-ОМе остатки во всех экспериментально обнаруженных нуклеазочувствительных сайтах, зЮ2 и 3(Е2 содержали моди(|)икации в нуклеазочувствительных сайтах, расположенных только во фланкирующих участках дуплекса, эЮт содержала ге же модификации, что и зЮ1 плюс дополнительные модификации, определенные по контексту ШрО и ирА). В составе был модифицирован каждый второй нуклеотид (всего 19 модификаций, только 3 из них совпадают с нуклеазочувствигельными сайтами, подвергнутыми модификации в составе йЮЗ) и эГОб, в которой каждый второй нуклеотид во фланкирующих районах был модифицирован (всего 12 модификаций, только 1 модифицированный сайт совпадает с зЮЗ) и я!Епп с таким же количеством модификаций, что содержится в составе но

расположенных в других сайтах. С учетом механизма действия РНКазы А 2'-ОМе-аналоги нуклеотидов были включены с 5'-стороны нукпеазочувствительной связи для того, чтобы обеспечить ее стабильность. Расщеплеиие химически модифицированных з1РНК в присутствии сыворотки исследовали по такой же экспериментальной схеме, которая была использована для картирования расположения нуклеазочувствительных сайтов. Результат электрофоретического анализа продуктов расщеплеиия бИЛ, 02. От и 04. содержащих 5'-меченые антисмысловые цепи, показан, что модификация нуклеазочувствительных сайтов существенно повысила стабильность вП'НК в присутствии сыворотки.

Данные показали (Рис. 12), что все нуклеазочувствигельные связи, защищенные введением с 3'-стороны 2'-0Ме аналогов, кроме Ст19-А20 в составе бЮш, стабильны в течении всего времени инкубации. Этот сайг расположен вблизи конца дуплекса, поэтому можно предположить, что расщепление этой связи происходит под действием экзонуклеаз, которые не используют 2'-положение рибозы для отщепления концевого нуклеотида. Наблюдаемая медленная кинетика постепенного укорочения олигорибонуклеотидпой цепи на 1 п., которая наблюдается при анализе продуктов деградации (Рис. 12), подтверждает правомерность этого предположения. В составе нуклеазоустойчивых з1Р11К были обнаружены следующие сайты расщепления: Ш-А5, А20-А21 в составе бЮК Ш-А5 в з1П2 и минорные сайты С9-1Л0, 1ЛЗ-С14 и А20-А21 в яЮЗ. Очевидно, что во всех исследованных з1РНК расщепление связи А20-А21 происходит под действием экзонуклеаз. Следует отметить, что ^модифицированный нуклеазочувствительный сайт С6-А7. расположенный в центральной части дуплекса бЮ2 является сайтом первичного расщепления и модификация сайтов, расположенных во фланкирующих районах не защищает его от разрезания. Из полученные данных следует, что связь Т14-А5 так же принадлежит к нуклеазочувствительным сайтам, однако из-за быстрого расщепления связи Ш-АЗ в составе немодифицированной эЮ (при исследовании 5'-мечепой цепи) и связи С6-А7 в составе З'-меченой цепи этой же 51РНК, этот сайт не был обнаружен в составе яЮ экспериментально. Модификация этого сайта в составе вЮт защищает дуплекс от деградации и позволяет ему оставаться интактным в присутствии сыворотки в течении длительного времени. При инкубации этого дуплекса наблюдается только незначительное расщепление по минорным сайтам и медленное укорочение на 1 нуклеотид выступающих 3"-концов. Учитывая эти данные, следует заключить, что дополнительная защита 3'-концов дуплекса с помощью химических модификаций позволила бы еще больше увеличить устойчивость я1РНК в присутствии сыворотки к действию экзонуклеаз. Расщепление контрольной з1В4 (Рис. 12 Г) показывает, что случайное распределение модифицированных аналогов в структуре дуплекса не увеличивает стабильность 31РГ1К в присутствии сыворотки, тогда как защита всех нуклеазочувствительных сайтов (как в случае яЮт) необходима для получения нуклеазоустойчивой з1Р11К.

А.

Б.

5-g-g-c-u-u-g-a-c-a-a-g-u-u-g-u-a-u-a-u-g-g-.v 3'-a;a-c-c-g-a-ä-c-u-g-u-u-c-a-a-c-a-iu-ä-u-ä-s'

А

t

з -g-g-c-u-u-g-a-c-a-a-g-ij-u-g-u-a-u-a-u-g-g-3' 3'-a-a-c-c-g-a-a-c-u-g-u-u-c-a-a-ic-a-;u-a-u-a-5

Г .

TT

5'-g-g-c-u-u-g-a-c-a-a-g-u-u-g-u-a-u-a-u-g-g-3' 3-a-a-c-c-g-a-a-c-u-g-u-u-c-a-a-c-a-u-a-u-a-5'

ЛЖ 4ч А

Рис. 12. Схема расположения нуклеазочувствительных сайтов в составе 5"-меченной антисмысловой цепи siDl (А), siD2 (Б), siDm (В) и siD4 (Г). siPHK (3 нМ) инкубировали в IMDM с 5% FBS при 37°С.

Анализ продуктов деградации siEm не выявил расщепления по сайтам, защищенным введением 2'-ОМе аналогов (данные не приведены).

Был выявлен ряд сайтов минорного расщепления: A1-U2, U5-C6, С6-С7 в составе смысловой цепи siEm и U2-C3, С7-С8 в составе антисмысловой цепи siEm, однако расщепление этих сайтов происходило с намного меньшей эффективностью, чем расщепление основных сайтов в составе siE и интактные модифицированные дуплексы наблюдались в реакционной смеси в течении длительного времени. Исследование деградации siE2 происходило аналогичным образом: были выявлены те же самые минорные сайты, что и в случае siEm. Расщепление незащищенных нуклеазочувствительных сайтов в центральной части дуплекса siE2 происходило с существенно более низкой эффективностью (С7-А8 в смысловой цепи, U12-013 в антисмысловой цепи) или не происходило вовсе (U9-G10 смысловой цепи и С10-А11 в антисмысловой цепи). Этот результат показывает, что эти сайты являлись сайтами вторичного расщепления и модификация фланкирующих районов, которая предотвращает появление более коротких продуктов деградации дуплекса и их диссоциацию, защищает эти сайты от расщепления.

Для того, что бы сравнить кинетики деградации полученных siPHK в присутствии 5% и 50 % сыворотки мы останавливали реакцию расщепления добавляя равный объем уравновешенного водой фенола с последующим выделением продуктов реакции и их анализом в ПААГ в неденатурирующих условиях. Стабильность немодифицированных siPHK существенно отличалась: деградация siE происходила довольно медленно и после 8 ч инкубации в присутствии 5% сыворотки в реакционной смеси оставалось около 50% исходной siE (Рис. 13 А). Немодифицированная siD полностью расщеплялась менее чем за 15 мин. Этот результат может объясняться различием в термостабильности дуплексов: измеренные температуры плавления для этих siPHK составили 81.5°С для siE и 71.8°С для siD (Табл. 13). Контрольные эксперименты показали (данные не приведены), что антисмысловая цепь siE в одноцепочечном состоянии расщеплялась по тем же сайтам, но значительно быстрее, чем та же цепь в составе дуплекса. Найдена прямая корреляция между количеством защищенных иуклеазо-чувствительных сайтов и стабильностью siPHK в присутствии сыворотки. siEm и siDm в которых все иуклеазочувствительные сайты (как найденные экспериментально, так и предположенные на основе анализа последовательности) были подвергнуты модификации оказались наиболее стабильными и сохранялись в реакционной смеси до конца инкубации (8 ч).

5'-g-g-c-u-u-g-a-c-a-a-g-u-u-g-u-a-u-a-u-g-g-3' 3'-a-a-c-c-g-a-a-c-u-g-ü-u-c-a-a-c-a-u-a-7j-a-s'

К ir Ж In !ч 4ч «ч

«¡1)2 ilDm чЦЫ ч1Р>

•и;

m М! vIErm

«1П5

Кол-во Кол-во

Г-ОМе 2'-ОМе

! ) н/ч сайтах

О 0

11 11

7 7

11 0

0 0

8 8

6 6

12 12

19 3

12 1

Кол-во Кол-во

2'-ОМе У-ОМе

э н/ч сайтах

0 0

11 11

7 7

11 0

0 0

8 8

6 6

12 12

19 3

12 1

Рис. 13. Определение пуклеачоуетойчпвости 2'-О-метильпых аналогов эИ'НК в ростовой среде 1МОМ с 5 %-иой (.А) и 50 %-пой (Б) 1В8. Электрофорстичсскпй анализ образцов проводили в 15 %-пом ПААГ. К - не инкубированная $1РНК

vir

ML1 dkrm

И|1|И|!ШЯ1в О 0 Наличие только двух незащищенных

sii)i 3 g нуклеазочувсгвительных сайтов (U-G и С-

А) в составе siO 1 существенно снижает ее устойчивость по отношению к рибонуклеазам сыворотки по сравнению с siDm: время гюлужизни для siDl и siD2 составило 1 и 2 ч. соответственно. В то же время, 50% исходной siE2 с к 1у ж 1ч :<г л кч " ' вн/ч сайтах модификациями нуклсазочувствительных

сайтов во фланкирующих районах оставалось в реакционной смеси после 4 инкубации, то есть она тоже была менее стабильна чем siEm.

Повышение концентрации сыворотки ® О в реакционной смеси до 50% выявило еще 411,1 8 8 более существенные отличия в

»ни ******* ^ 5 б стабильности случайно модифи-

,!!)«. __. „ . ,__,,, .... 2.2 12 цированных, селективно модифици-

jirw та а рованных и ^модифицированных siPUK

(Рис. 13 Б).

siD, как и ожидалось, полностью расщеплялась менее, чем за 15 мин, однако времена полужизни немодифицированной siE и частично модифицированных siDl и siD2 сократились до 30 мин - 1 ч. Напротив, селективно модифицированные siPI IK, в которых все нуклеазочувствительные сайты были защищены (siEm и siDm), были стабильны по крайней мере до 4 ч инкубации в присутствии 50% сыворотки. Полученные данные показали, что введенные случайным образом модификации в составе siD4, siD5 и siE3 не увеличили существенно их стабильность в присутствии сыворотки. Таким образом, можно сделать вывод, что более термостабильный дуплекс среди дуплексов с однотипным распределением модификаций (селективным или случайным) может быть более устойчив к действию рибонуклеаз. однако именно распределение модификаций определяет устойчивость к рибонуклеазам, при этом простого повышения термосгабилыюсти недостаточно для повышения стабильности в присутствии сыворотки.

Для оценки интерферирующей активности siPHK использовали модельную систему, в которой плазмиду pEGFP-MDRl, содержащую 293-751 н. фрагмент кДНК гена MDR1 слитый с последовательность EGFP ко-трансфецировали с siPHK в клетки ПЕК 293. siD, siE и их химически модифицированные аналоги специфически подавляли экспрессию химерного гена EGFI'-MDRl, тогда как sil не влияла па его экспрессию (Рис. 14 А).

Селективная модификация нуклеазочувсгвительных сайтов оказывает лишь незначительное (siDl - 8 модификаций, siDm - 12 модификаций, siEm и siE3 - И

модификаций) или вообще пе влияет- (siD2 - 6 модификаций) на интерферирующую активность исследуемых siPHK.

Снижение интерферирующей активности четко коррелирует с количеством модифицированных оснований в составе siPHK: наиболее низкой активностью обладала siD4, содержащая 19 модифицированных оснований. Следует отмстить, что s¡E3 была существенно менее активна, чем содержащая такое же количество модификаций и имеющая сходную температуру плавления siEm при концентрации 100 нМ. Это может свидетельствовать о неблагоприятном расположении модифицированных оснований в структуре дуплекса, изменяющем его термоасимметрию и, таким образом, негативно влияющем на его интерферирующую ак тивность.

Для того, что бы определить длительность интерферирующего действия siPHK. мы исследовали изменение уровня экспрессии гена EGFP-MDRI в клетках НЕК 293 в течении 6 дней после ко-трансфекции плазмиды pEGFP-MDRl вместе с I нМ siD или ее аналогами, или 50 нМ siE, или siEm. Трансфекция 2'-ОМе-аналогов s¡D эффективно ипгибируег экспрессию гена-мишени (на 90-95% через 24 ч) по сравнению с пробами, трансфецированиыми sil или обработанными только трансфекционным агентом (Рис. 14 В).

Наиболее длительный ингибирующий эффект наблюдается после трансфекции siDm: 72% снижение экспрессии гена-мишени было зафиксировано через 144 ч после чрансфекции. Наименее длительное подавление экспрессии наблюдалось под действием siD5: уровень экспрессии гена-мишени начинал увеличиваться уже через 48 ч после начала эксперимента. Немодифицировапная siD и часгично модифицированная siD2 продемонстрировали сходную длительность иигибирующего действия: сниженный уровень экспрессии гена EGFP-MDR1 наблюдался до 96 ч после трансфекции. однако через 144 ч он был на 40% ниже, чем в контроле. Таким образом, полученные данные показывают, что довольно существенное повышение нуклеазоустойчивости siD2 в присутствии сыворотки не сопровождается увеличением длительности интерферирующего действия в клетках. Только модификация всех пуклеазочувствительных сайтов (как выявленных экспериментально, так и предсказанных на основе анализа последовательности) предотвращает деградацию siDm и существенно увеличивает длительность ее иигибирующего действия. Длительность иигибирующего действия siDm была сравнима с длительностью иигибирующего действия плазмиды. кодирующей shPHK. направленную в той же последовательности в составе MDRI мРНК (данные не приведены), поэтому можно предположить, что снижение эффективности интерферирующего действия в обоих случаях происходит за счет снижения внутриклеточной концентрации siPHK или плазмиды в результате клеточного деления или/или деградации клеточными пуклеазами. Интерферирующие активности siE, siEm и siE3 были существенно ниже, чем активности siD и ее модифицированных аналогов, однако длительное подавление экспрессии гена мишени (примерно на 45% после 144 ч инкубации) наблюдалось только под действием siEm, которая содержала модификации в пуклеазочувствительных сайтах, тогда как активность siE и siE3 через 144 ч после трансфекции снижалась до 25 %.

Таким образом, полученные нами данные указывают на то. что тщательное картирование расположения пуклеазочувствительных сайтов является необходимым для конструирования siPHK, оказывающих продолжительное ингибирующее действие. В результате проведенного исследования нами разработан экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых аналогов siPHK, обладающих высокой стабильностью в присутствии сыворотки и получены химически- модифицированные аналоги анти-MDRl

siPHK, способные эффективно и длительно подавлять экспрессию этого терапевтически-

значимого гена. А

Рис. 14. Интерферирующая активность 2'-ОМе- аналогов 5Ш (А) и зШ (Б) через 24 ч после трансфекции. (В) Длительность ингибирующего действия 2'-ОМе- аналогов -Б10 (1 нМ) и (50 нМ). Клетки ПЕК 293 ко-трансфицировали РНК и плазмидами рЕСРР/МОШ и рЕВРР-Ы 1. Через 24 ч с момента трансфекции

проводили оценку соотношения интенсивности сигналов

зеленого (ЕОРР) к синему (ЕБРР).

sit sil> siDl siDm slD4 siDS slE €m si lain

4. Исследование влияния структуры химически модифицированных siPHK на эффективность РНК-интерференции

В литературе описан ряд расчетных алгоритмов, которые предназначены дая выбора последовательностей высокоактивных siPHK с учётом термодинамических свойств дуплексов, тем не менее, нуклеотидная последовательность мРНК мишени может не содержать 19 н. последовательностей с благоприятной термодинамической асимметрией (далее термоасимметрией), отвечающих требованиям алгоритмов. Для решения проблемы неблагоприятной термоасимметрии мишени Hohjoh с соавторами было предложено использовать нуклеотидные замены в составе 3'-конца смысловой цепи для дестабилизации этой части дуплекса [Hohjoh, 2004]. Введение таких замен в состав siPHK с низкой или средней активностью позволяет получить более активные гак называемые «вилкоподобные» siPHK («fork-like» siRNA, далее по тексту - fsiPHK). К сожалению, присутствие мисматчей и длинных одноцепочечньгх концов в составе fsiPHK резко повышают их чувствительность к рибонуклеазам, что ограничивает их применение. Поэтому мы предложили объединить подход, использующий введение нуклеотидных замен в состав siPHK, с разработанным нами экспериментальным алгоритмом получения нуклеазоустойчивых siPHK.

Введение нуклеотидных замен в состав siPHK для увеличения термоасимметрии дуплекса позволяет повысить эффективность действия siPHK. обладающих средней и низкой интерферирующей активностью, поэтому в наших экспериментах для конструирования «вилкоподобных» анапогов была выбрана siEm. Данная siPHK характеризуется относительно высокой температурой плавления (Табл. В), неблагоприятной термоасимметрией и термостабильным центром, а эффективность ее ингибирующего действия не превышает 70% при концентрации 100 нМ.

Таблица 8. Последовательности и температуры плавления 51РНК и Г$1РНК

м РНК-мишень (м14758) э^РНК " Последовательность 21 Тш, СС

гч1р-1111 5'- лисАисслиоооосиосАсии -3' З'-ССиАСиАОСиАССССОАССиО -5' 83

5'- Аислисслшооосисоссии -3' 3'- соиАоилссилссссолссио -5' 84

5'- А иС А НС С А ив О ООС и и А СвИ 1! -3' 3 - саилаилооилссссс лссис -5' 75

1'5|е-4п1 5'- АиСАиССАиОССССиК4ССии -3' З1- ООиАОиАООиАССССОАССиО -5' 76.8

¡'51п-4ш+ 5'- АисАисс'Ашооасиклссии -3' 3'- ОСиАОидаОиЛССССаАССиО -5' 77

5'- ЛиСАиССАиССтСЮСи^ССии -3' З1- ООиАОиАООиАСС'ССОАССиС -5' 79.8

5'- АиСАиССАиСОООСи^.4СОии -3' З1- СОиАСиЛССиАССССОАССиО - 5' 80

^¡е-бт 5'- лислисслиоооолстассии -3' з'- ооилоилооилссссоАссио -5' 71

1йЕ+4т 5'- сслсисслиссоасиооАсии -3' 3'- СЮилсиАСОиАССССОАССиО -5' 84

«¡Е/ЗОит 5'- АиСЛиССАШОООСиООАСШ -3' 3'- ОСиЛОиЛСаиАСб^МЗЛССШ -5' 64.5

«¡ЕАЮит 5'- лислиссАисаоосиооАсии -3' 3'- а0иАСиА00иА6/£/£/£ЛЗАССШ -5' 59

«¡Е/ЗОАт 5'- АиСАиССАШОООСиООАСии -3' з'- ооилоилаоилслл.-юлссио -5' 63

«¡Е/ЗАСт 5'- АиСАиССАиОЛ/ЫСШОАСии -3' 3'- ОСиАСиАООиАССССОАССиС -5' 60

598-618 н. ыЕ/4АСт 5'- АиСАиССАиЛ4/ЫСШСАСии -3' 3'- ССиАОиАООиАСССССАССиО -5' 52.5

424^44 н. э^Рт 5'- АиСОАиСииОААОСООАССОС -3' 3'- СииАССиАОААСииССССЧГСО -5' 81

1^К-4т 5'- ЛиОСАиСииОААОООб/СССОС -3' 3'- СииАССиАОААСииССССШО -5' 68.3

586-606 н. 5|Нт 5'- acuuuggcugccaucaucc.au -3' З'-СииСАААССОАСООиАСиАСО -5' 80.2

ГвП-Мт 5'- АСиииООСиОССАиСССОСАи -3' З'-СииСАААСССАССОиЛСиАСО -5' 72.4

652-672 п. «пт 5'- ОАилисииШСАААиОСАООА -З1 3'- ОиСилиАОАААССиииАСОиС -5' 68.4

5'- САилисиииССАААЩ/ССША -3' 3'- ОисиАиАОАААСОиииАССгиС -5' 58

" Буква «Л> указывает на «пилкоподобную» («1'огк»-Нке) структуру «¡РНК. буквой «т» обозначены «¡РНК, содержащие 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов в нуклеазочувствительных сайтах, «т+» -«¡РНК, содержащие модификации в нуклеазочувствительных сайтах, включая дополнительные сайты, картированные для «т*» - 5|РНК, содержащие полпостыо модифицированную смысловую

цепь, «т**» - 51Р11К, обе цепи которой полностью модифицированы. -1,-2,-3,^ и -6 соответствуют количеству иуклеотидных замен с З'-коица смысловой цепи ГзЛ'НК, +4 соответствует четырем заменам с 5'-конца смысловой цени Курсивом обозначены нуклеотидные замены в смысловой или антисмысловой цепях.

2,-С и и - 2'-0-метнльные аналоги С и и соответственно.

Для исследования влияния структуры в ¡РНК на ее активность были получены дуплексы Л^Е-Ьп. 1^Е-2т, 1мЕ-4т и (мЕ-бт, содержащие 1, 2, 4 и 6 неспаренных оснований с З'-коица смысловой («пассажирской») цепи, соответственно (Таблица 8). В качестве отрицательного контроля использовали дуплекс, содержащий 4 замены с 5-коица смысловой цепи — Гк!Е+4гп. что усугубляет неблагоприятную термоасимметрию этой «¡РНК. При этом данные «вилкоподобные» в1РНК содержали 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов в нуклеазочувствительных сайтах, выявленных нами в составе Е.

При исследовании с помощью проточной цигофлуорометрии биологической активности «вилкоподобных» Б1РНК было показано, что Е51Е+4т. содержащая 4 нуклеогидных замены с 5'-конца смысловой цепи, не проявляла интерферирующую активность (Рис. 15). Формирование одного или двух «мисмагчей» с 3'-конца смысловой цепи не приводило к увеличению активности я!РНК. тогда как «вилкоподобные» .41 РНК с четырьмя и шестью нуклеотидными заменами подавляли экспрессию гена-мишени более эффективно по сравнению с исходной Б1Ет при концентрациях 20 - 100 нМ и 50 - 100 нМ, соответственно (Рис. 15).

р <0005

р < 0.0Ï р < 0.001

i

%

К 100 нМ £3Sü»M а этим □ 10 нМ

Рис. 15. Влияние изменения термоасимметрии дуплекса 2'-0-метильных аналогов siPI-IK на их интерферирующую активность. siPHK и рекомбинантную плазмиду pEGFP/MDRl ко-транефнцировали в клетки НЕК 293, используя Липофек-тамин 2000 (далее по тексту, Липофектамин). Через 24 ч измеряли уровень сигнала EGI-P с помощью проточной цитофлуорометрии. В качестве контроля использовали siSCRm.

ICSO.tíW- 13.6 30 5С 13.5 2/5 >100 ->1CC Я2.5 >1C0 1Ü0 >100 A2.5

Сравнение Tm исследуемых дуплексов показало, что термостабильность fsiE-lm и fs!E-2m практически не отличалась от термостабильности исходной siEm (Tm 84.5 °С). тогда как введение четырех и шести «мисматчей» в состав siEm снижает температуру плавления дуплекса (ДТт 7.7 °С для fsiE-4m и 13.5 "С для fsiE-бт) и приводит к усилению его термоасимметрии (Таблица 8). Несмотря на меньшую разницу в термостабильности. более высокой активностью обладала fsiE-4m: 75%-ное подавление флуоресцентного сигнапа EGFP наблюдалось при концентрации 20 нМ, тогда как сходный уровень подавления гена-мишени под действием fsiE-6m наблюдался только при концентрации siPHK 50 нМ (Рис.15). Концентрация fsiE-6m, при которой наблюдалось 50 %-ное ингибирование экспрессии гена-мишени (IC50), составила 27.5 нМ, тогда как IC50 siEm -18.5 нМ. Снижению интерферирующей активности fs¡E-6m могли способствовать конформационные изменения, вызванные заменами и приводящие к нарушению узнавания siPHK компонентами комплекса RISC. Значительная дестабилизация siPHK также могла способствовать диссоциации дуплекса.

При сравнении биологической активности серии селективно модифицированных siPHK, направленных к участкам F. Н и J mPEIK гена MDR1 (Таблица 8), с акгивностыо их «вилкоподобных» вариантов с 4 «мисматчами» было показано, что «вилкоподобные» siPHK более активны (рис. 15).

Эти данные коррелируют е данными по подавлению синтеза Р-гликопрогеина в клетках КВ-8-5 (данные не приведены), согласно которым, эффективность действия «вилкоподобных» siPHKn 1.2- 1.8 раза превышала активность «классических» siPHK.

Исследование пуклеазоустойчивости siPHK показало, что в большинстве случаев стабильность «вилкоподобных» siPHK ниже, чем стабильность «классических» siPHK. Тем не менее, при сравнении стабильности немодифицированиой fsiE-4 (полностью деградировала в течение 15 мин) и ее селективно модифицированного аналога fsiE-4m (превращался в стабильный более короткий продукт через 15 мин инкубации) (Рис. 16), показано, что 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов защищают «вилкоподобные» siPHK от действия рибонуклеаз. Мы сравнили характер расщепления смысловых цепей siEm и fsiE-4m в присутствии сыворотки (данные не приведены). При картировании нуклеазо-чуветвительиых сайтов были выявлены три дополнительных сайта расщепления в составе lsiE-4m. Один из них располагался, как и ожидалось, в одноцепочечном районе с 3'-конца смысловой цепи дуплекса, тогда как два других (С6-С7 и Us-C6) соответствовали минорным сайтам расщепления, картированным в siEm. Введение трех 2'-0-мстильных аналогов нуклеотидов в данные сайты позволило получить «вилкоподобную» siPHK, fsiE-4m+, стабильную при инкубации в присутствии сыворотки до 8 ч (Рис. 16). Данная siPHK была несколько менее активна по сравнению с fsiE-4m: величина IC50 fsiE-4m+ составила 47 нМ.

Для определения влияния дополнительной модификации в fsiE-4m+ на продолжительность ее ингибирующего действия было проведено исследование кинетики подавления экспрессии EGFP/MDRI (Рис. 17 А). Показано, что через 2 суток с момента •грансфекции эффективность действия «вилкоподобных» siPHK была сопоставима и составляла порядка 70 % (Рис. 17 Б). Активность немодифицированиой fsiE-4 значительно снижалась через 6 суток инкубации, тогда как ингибирующая активность селективно модифицированных аналогов проявлялась до 15 суток. В то же время, активность селективно модифицированной siEm заметно снижалась уже через 8 суток инкубации. Таким образом, комбинация модификации структуры дуплекса и химических модификаций позволила получить нуклеазоустойчивые siPHK, способные индуцировать РНК-интерференцию в течение 15 дней после однократной трансфекции, что превышает длительность действия всех синтетических siPHK, описанных в литературе ранее.

Комбинированный подход, включающий введение нуклеотидных замен и селективную модификацию был успешно применен для конструирования селективных ингибиторов экспрессии химерного гена AML-ETO с сохранением экспрессии аллеля дикого типа и для коррекции неблагоприятной термоасимметрии дуплекса после селективной модификации, направленного на подавление экстрессии гена LMP2 (данные не приведены). Считается, что низкая термостабильность центральной части дуплекса обеспечивает формирование предпочтительной конформации при расщеплении мРНК-мишени. а также облегчает диссоциацию «направляющей» цепи после расщепления мишени, позволяя тем самым RISC* приступить к поиску нового субстрата. Несмотря на то, что центральная часть siPHK является чувствительной к модификациям, мы предположили, что дестабилизация данного района путем введения нуклеотидных замен, приводящих к образованию неканонических пар или «мисматчей», может способствовать увеличению интерферирующей активности siPHK. Мы исследовали влияние нуклеотидных замен в составе дуплекса селективно модифицированной siEm на ее интерферирующую активность. Данная siPHK содержит 4 GC-пары в позициях 7 - 10 н. с 5'-конца аитисмысловой цепи. В работе использовали ее структурные варианты, содержащие в данном районе 3 или 4 «мисматча» или неканонических GU-пары (Табл. 8), полученные в результате нуклеотидных замен в смысловой или аитисмысловой цепи

дуплекса. Показано, что введение нуклеотидных замен привело к значительному снижению температуры плавления 51РНК. При исследовании биологической активности обнаружено, что дестабилизация центральной части дуплекса не блокирует интерфер1грующую активность 51РНК (Рис. 18).

Более того, активность $1РНК с 3 Ои-парами превышает активность siPHK «классической» структуры: 90% подавление экспрессии гена-мишени наблюдалось при использовании ее в концентрации 100 нМ (Рис. 18). Аналогичные данные были получены при снижении уровня Р-гликопротеина (данные не приведены): активность 31Е/ЗОит в 2 раза превышала активность з1Ет.

Введение замен в центральной части дуплекса, приводящих к образования ви пар, было успешно использовано нами для конструирования з1РНК, направленной на два гена-мишени С-МУС и Ы-МУС, имеющих участок высокой гомологии. Таким образом, полученные нами данные показали, что введение неканонических ви-пар в центральную часть селективно модифицированных дуплексов является перспективным подходом для оптимизации структуры 81РНК.

віЕ

БІЕт

БІЕт"

К 15' 30' 1ч 2ч 4ч 8ч-

Время инкубации, сутки

Посадка НЕК 293

Трансфскция Проточная рЕСРР/МРЯ! цитофлуоромотрия

БІЕ-4 —• зіЕ-4т — э1Е-4т+ —

зіЕ-4т" БІЕ-Дт"

БІРт — -

БІР-4т — —

БіНт зіН-4т эит эиМт

1 2 З Л 5 6 7 В 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Время инкубаиии, сутки

Рис. 17. Длительность подавления экспрессии гена £С/*7УЛЖ>Й/ селективно модифицированными 2'-0-метильными аналогами «вилкоподобных» віРНК. А. Схема эксперимента. Клетки НЕК 293 трансфи-цировали 5ІРНК (100 нМ) и инкубировали (N-1) день (где Ы: 2 - 17 дней), после чего трансфицировалп рекомбинантнои плазмидой рЕОРР/МОШ. Через N диен инкубации оценивали уровень экспрессии ЕвРР методом проточной цитофлуорометрии (Б).

Рис. 16. Определение нуклеазо-устоичивости 2'-0-метильных аналогов БІРНК в ростовой среде РМЕМ с 10%-ной РВБ. Электрофоретическни анализ образцов проводили в 15 %-ном ПААГ. К -не инкубированная віРНК.

'•ОС j $<5 -j

* I

é «i

о

и !

j

га Í

tes

5. Липофильные производные siPHK

Основным фактором, который ограничивает биомедицинское примененние siPHK, является неэффективная доставка в клетки и ткани. Конъюгирование siPHK с липофильными молекулами, такими как холестерин, желчные и жирные кислоты, является перспективным подходом к решению проблемы доставки siPHK in vivo. В настоящем исследовании мы сравнили способность проникать в клетки без использования носителя и биологическую активность различных липофильных конъюгатов нуклеазоустойчивой анти-MDR1 siDm. Для присоединения к 5'-концу смысловой цепи были использованы следующие липофильиые молекулы: холестенин (Chol-), олеиловый спирт (Oleyl-), литохолевая кислота (Lit-) и ее олеиламид (Oleyl-Lit-). Липофильные молекулы были присоединены напрямую или через алифатический амиио-пропильный, -гексильный, -октильный, -децильный или -додецильный линкеры.

Накопление липофильных siPHK, содержащих остаток флуоресцеина на 5"-конце антисмысловой цепи, в клетках КВ-8-5. HepG2 и НЕК 293 определяли с помощью цитофлуорометрии через 4 ч после добавления соответствующих siPHK. Полученные данные показали, что эффективность накопления в клетках siPHK зависит от типа клеточной линии, однако во всех случаях конъюгаты, содержащие остатки холестерина или олеиламида лигохолевой кислоты накапливались в клетках значительно эффективнее, чем остальные конъюгаты аналогичного строения (Рис. 19). Немодифицированная siPHK и конъюгаты siPHK и литохолевой кислоты практически не накапливались в клетках КВ-8-5 и HepG2 (Рис. 19 А, В), в отличие от клеток НЕК293, где эффективность трансфекции для этих siPHK достигала 90% при концентрации 5 цМ (Рис. 19 Д). Накопление конъюгатов siPHK с олеиловым спиртом было незначительно. Сравнение средних уровней флуоресценции клеток выявило существенное преимущество холестерин-содержаших siPHK по сравнению со всеми остальными конъюгатами (Рис. 19 Б. Г, Е).

Было обнаружено, что длина линкера между siPHK и липофильным остатком существенно влияает на накопление конъюгатов в клетках. Конъюгаты, содержащие б и более углеродных атомов накапливались в клетках более эффективно, чем конъюгаты без линкера или содержащие более короткий линкер (Рис. 19). Оценка эффективности трансфекции при более низких концентрациях конъюгатов (0.2 - 1 цМ) показала, что процент трансферированных клеток так же увеличивается с удлинением линкера (Рис. 19 А, В, Д). Эффективность трансфекции клеток НЕК293 составила 0%, 20%, 50% и 70% для клнъюгатов siPHK с холестерином, присоединенным напрямую (без линкера) и соединенным через аминонропильный, аминогексильный и аминододецильный линкер, соответственно (Рис. 19 Д). Такая же зависимость наблюдается и при сравнении уровней средней флуоресценции клеток (Рис. 19 Б, Г, Е).

«ДОЗОДс «ШЦЦК> ЧІІГГЇСЛ» X«f«ÄCM

22,5 Є2 10ІЗ П.5 Ai

Рис. 18. Интерферирующая активность селективно модифицированных 2'-0-ме-тильных аналогов анти-Д'/ЛЛ/ віРНІч с дестабилизированной центральной частью дуплекса. 5ІРНК и рекомбннантную плаз-миду рЕОРР/МОКІ ко-траисфицировали в клетки ИСК 293, через 24 ч измеряли уровень сигнала ЕОРР с помощью проточной цитофлуорометрии.

00.2|!М Е2цМ «6||М

Исследование кинетики накопления в клетках конъюгатов С1ю1-6-зЮт, СЬо1-12-з1Вт и 01еу1-У 1-6-51 От показало, что максимальный средний уровень флуоресценции наблюдается в клетках через 8 ч после добавления конъюгатов. при этом накопление конъюгатов холестерина происходит в 2.5 — 3 раза более эффективно, чем 01еу1-Ьк6-.5Ют. Через 24 ч инкубации липофильных з1РНК с клетками средняя флуоресценция последних существенно снижается по сравнению с 8-часовым уровнем.

Локализацию холестерин-содержащих з1РНК в клетках КВ-8-5 исследовали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Показано, что через 8 ч с момента начала инкубации холестерин-содержащие з1РНК действительно накапливаются в клетках (Рис. 20 Б, В). При этом наблюдается дисперсное распределение соединений в цитоплазме, которое достигает наибольшей плотности с наружной стороны ядра. В отличие от холестерин-содержащих з1РНК, исходная зЮт-Р1и не проникала в клетки (Рис. 20 А). Таким образом, нами получены липофильные производные »¡РНК. способные проникать в клетки без использования трансфекционных агентов.

Исследование КИНеТИКИ ИНГНбируЮЩеГО ДеЙСТВИЯ ХОЛеСТерИН-СОДерЖаЩИХ 51РНК проводили на лекарственно-устойчивой линии клеток КВ-8-5 по определению уровня продукта гена МОЯ1 Р-гликопротеина (Р-§р) с помощью Вестерн блот анализа через 3-8 дней инкубации клеток с конъюгатами (5 цМ). Эффективность подавления экспрессии гена-мишени МОЯ! увеличивается с увеличением длины линкера от 0 до 6-10 атомов углерода и коррелирует с эффективностью накопления конъюгатов в клетках (Рис. 21).

Рис. 19. Эффективность накопления Р1ТС-меченых липофильных производных Л-вЮт-РЫ в клетках НЕК293 (А, Б;, К.В-8-5 (В, Г) и НерС2 (Д, Е) в среде без сыворотки.

Эффективность трансфекции (%) (А, В, Д); соотношение среднего уровня флуоресценции (ЯРЦ) популяции клеток в образце, обработанном производным з1РНК, к среднему уровню автофлуоресценции клеток в необработанном контроле (Б.Г.Е).

в

Ъ 100

!

Б.

В.

—Контроль -•"SiDm/Липофектамин -+-siDm —Chol-0-slDm —Chol-3-siDm Chol-6-slDm -•-Chol-8-siDm —Chol-10-siDm —Chol-12-slDm

/

Рис. 20. Локализация 51РНК (2 мкМ) в клетках КВ-8-5 через 8 ч инкубации с 510т-Р1и (А), СЬо1-6-510ш-Р1и (Б) и СЬоМг^От-Пи (В). Зеленый фильтр (Р1ТС-меченые з1РНК); синий фильтр (окрашивание ядер с помощью ЭАР1); красный фильтр (окрашивание актпновых филаментов с'помощыо Родамина-Фаллоидина).

Рис. 21. Уровень Р-гликопротеина в клетках КВ-8-5, обработанных холестерин-содержащими анти-ЛЯЗЛ/

э1РНК. А. Кинетика подавления синтеза Р-глнкопротеина

производными анти-МО!?1 э1РНК и холестерина (5 мкМ) и з10т (0.1 мкМ) в комплексе с Липофектамином. Б. Уровень Р-гликопротенна через 5 дней с момента начала инкубации клеток КВ-8-5, трансфнци-рованных производными з1РНК и бЮш / Липофектамин.

Дальнейшее увеличение длины линкера до додецильного приводит к снижению эффективности ингибирующего действия и задержке снижения уровня P-gp . 40% снижение уровня P-gp было зафиксировано на 4-й день после добавления Chol-6-siDm к клеткам, действие Chol-8-, Chol-10- и Chol-12-siDm в той же временной точке было менее выраженным (30, 25 и 18% снижение уровня P-gp, соответственно), уровни P-gp в клетках, инкубированных с Chol-0- и Chol-3-siDm не отличались от уровней в контроле. Максимальное снижение уровня P-gp наблюдалось в клетках, инкубированных с холестерин-содержащими siPHK с линекрами длиной 3-10 атомов углерода на 5-й день эксперимента (60% для Chol-6-, Chol-8- и Chol-10-siDm и 50% для Chol-3-siDm).

Следует отметить, что статистически достоверного отличия между ингибирующим действием этих конъюгатов обнаружено не было, хотя действие Chol-3-siDm было несколько менее эффектиным.

Активность Chol-12-siDm была достоверно ниже, чем активность Chol-6-, Chol-8- и Chol-10-siMDRs: этот конъюгат снижал уровень P-gp только на 30% через 4 дня инкубации (р<0.02, Chol-12-siDm vs. Chol-6-, Chol-8- или Chol-10-siDm). Через 6 дней инкубации уровень Р-гликопротеина был практически одинаков в образцах клеток, обработанных Chol-6-, Chol-8- и Chol-10-siDm (Рис. 21 А). Ингибирующее действие Chol-12-siDm, напротив, усилилось и уровень P-gp снизился до 57% что практически не отличается от уровня этого белка в клетках, инкубированных с Chol-3-, Chol-6- и Chol-10-siDm в течении такого же времени , активность Chol-8-siDm была несколько выше (р<0.05, Chol-8-siDm vs. Chol-12-siDm). Ингибирующее действие всех конъюгатов снижалось к 7 -8 дням инкубации и не превышало в этот период 15 - 20% (Рис. 21 А). Chol-0-siDm не обладал биологической активностью. Таким образом, длина линкера между siPHK и холестерином критически важна для биологической активности таких конъюгатов.

Сравнение уровней Р^ после инкубации с липофильными конъюгатами без носителя и после трансфекци «¡РНК с помощью Лигюфектамина 2000 выявило сущесгвенные отличия в кинетике ингибировапия: в первом случае уровень Р^р через 3 дня инкубации клеток с конъюгатами практически не отличался от уровня этого белка в контроле (Рис. 21 А), тогда как во втором случае (трансфекция с Липофектамином 2000) в это время уже наблюдалось 65% снижение уровня Р-£р. На 5 - 6 суткн эксперимента ингибируюшее действие «¡От (200 нМ) трансфецированной в клетки с помощью Липофекгамина 2000 было сравнимо с действием С1ю1-3-, СЬо1-6-. СЬо1-8-, С1ю1-10-«Ют (5 цМ) использованным без грансфекциоиного агента.

Способность холестерин-содержащих .«¡РНК (1-5 |чМ) обращать фенотип МЛУ клеток исследовали, определяя количество живых клеток в популяции в присугстнии 300 нМ винбластина с помощью МТТ теста. Полученные результаты показали, что контрольная «¡8ст и ее коныогаты с холестерином (СЬо1-0-. СЬо1-3-. С1ю1-6-. С1ю1-8-. С1ю1-10- и С1ю1-12-б!8сг) не влияют на устойчивость клеток к цитосгатику и на жизнеспособность клеток (по сравнением с контролем), что указывает на нетоксичность таких производных и специфичность действия. Инкубация клеток с винбластином и «¡От или с С1ю1-0-«10т так же не влияла на их жизнеспособность. И наоборот, количество клеток инкубированных с СЬо1-6-«10т (5 цМ) снижалось до 45% по сравнению с контролем, действие СЬо1-3-«Ют и С'1ю1-12-яЮт (5 цМ) было менее выражено: примерно 65 - 70% живых клеток по сравнению с контролем оставалось после инкубации с этими конъюгатами. Данные по количеству живых клеток в популяции на 6 день инкубации хорошо коррелируют с данными по снижению уровня Р^р через 5 дней инкубации.

Таким образом, оптимизация структуры липофильных «¡РНК путем варьирования типа липофильного остатка и длины линкера между липофильным остатком и «¡РНК позволила нам получить серию анти-ДУОЛУ «¡РНК (Ою1-6-, С1ю1-8- и С1ю1-10-«Ют), которые эффективно проникают в клетки без помоши трансфекционного агента, подавляют экспрессию Р-£р и восстанавливают чувствительность опухолевых клеток к винбластину. Полученные липофильные «¡РНК можно рассматривать как прототипы лекарственных средств для повышения эффективности химиотерапии лекарственно-устойчивых опухолей.

6. Иммуностимулирующее действие длинных дцРНК

Одним из перспективных подходов к созданию средств подавления опухолевого роста является создание иммуномодулирующих препаратов на основе интерферонов. Однако применение существующих препаратов интерферонов ограничено такими факторами как их пирогенность, аплергенность, опасность возникновения аутоиммунных процессов. Этих недостатков в значительной степени лишены препараты, содержащие иммуностимулирующие РНК (¡эРНК) - молекулы РНК определенного строения, которые индуцируют синтез эндогенных интерферонов.

Использование дцРНК, действующих одновременно по двум различным механизмам подавления экспрессии онкогенов: РНК-интерференции и активации синтеза интерферонов, в дальнейшем может найти применение в противоопухолевой терапии.

Мы исследовали антипролиферативную активность и влияние на экспрессию гена С-МУС протяженных дцРНК. отличающихся по последовательности. Для ингибирования клеточной пролиферации была выбрана длинная дцРНК с^Мус, соответствующая 11591631 н. участку второго и третьего экзонов мРНК гена С-МУС. В качестве контрольных индукторов интерферона использовали дцРНК аналогичной длины скЕОРР. соответствующую району 1 - 448 н. мРНК гена ЕйРР и препарат поли-инозиновой-поли-

цитидиловой кислоты поли(1:С). Длинные дцРЫК получали с помощью Т7 РНК полимеразы.

Исследование изменения уровня экспрессии гена c-MYC после трансфекции в клетки КВ-3-1 препаратов дцРНК (dsMyc, dsEGFP и поли(1:С)) показало (Рис. 22). что все исследуемые препараты вызывают концентрационно-зависимое снижение уровня мРНК гена C-MYC, причем максимальное воздействие оказывает препарат dsMyc, а поли(1:С) наименее эффективен. Аналогичное исследование было проведено на клетках нейробластомы SK-N-MC (данные не приведены).

Антипролиферативное действие препаратов дцРНК на раковые клетки может осуществляться путем реализации трех независимых механизмов: специфического подавления экспрессии генов, ответственных за пролиферацию, по механизму РНК-интерференции; индукции сиситемы врожденного иммунитета т.н. "интерфероновый ответ" и за счет активации PKR и OAS.

Иигибирование пролиферации двуцепочечными РНК исследовали с помощью МТТ-теста на клетках карциномы КВ-3-1 и нейробластом SK-N-MC и IMR-32 (устойчива к а-интсрферону). Суммарные результаты по ингибированию клеточной пролиферации с помощью длинных дцРНК представлены в таблице 9. Показано, что при трансфекции исследуемых клеток длинными дцРНК наблюдается значительное ингибирование пролиферации клеток, причем максимальный эффект наблюдается под действием дцРНК с нерегулярной структурой (препараты dsMyc и dsEGFP), тогда как гомополимер поли(1:С) наименее эффективен.

Для разделения сиквенс-специфических и неспецифических эффектов siPHK и протяженных дцРНК мы исследовали динамику экспрессии генов-маркеров интерферонового ответа 2',5'-олигоаденилат синтазы (OASI) и дцРНК-зависимой протеин киназы R (PKR), а также интерферон-чувствительного гена |3-актина в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC. Обнаружено, что при трансфекции клеток с помощью Олигофектамина препаратами dsMyc и поли(1:С) в концентрации 0.05 мкг/мл уровень мРНК гена OAS1 повышается в 5 - 9 раз через 24 ч после трансфекции, и возвращается к исходному уровню после 72 ч инкубации. Исследование кинетики активации экспрессии PKR под действием протяженных дцРНК показало, что наблюдается колоколообразная зависимость с максимумом в районе 48 ч. Таким образом, длинные дцРНК вызывают эффективную, но кратковременную активацию экспрессии генов OAS1 и PKR.

dsMvc

dsGFP

поли(1:С)

0,05

0,25

0,05

0,25

0,05 0,25 [дцРНК], мкг/мл

Рис. 22. Иигибирование экспрессии гена С-МУС под действием длинных дцРНК с^Мус, и«ЕОРР или поли(1:С) в клетках КВ-3-1. Уровень мРНК гена С-ШС в клетках определяли с помощью ОТ-ПЦР через 24 ч (белые столбцы). 48 ч (серые столбцы) и 72 ч (черные столбцы) после добавления препаратов дцРНК (0,05 - 5 мкг/мл) в комплексе с

Олигофектамином. Соотношение С-МУС/^т в контроле принимали за 1. стандартное отклонение определяли по результатам трёх независимых экспериментов.

Таблица 9. Ицгибмрование пролиферации клеток карциномы КВ-3-1 к нейробластом SK-N-MC, IMR-32 под действием длинных дцРНК

Концентрация препарата дцРНК Препараты дцРНК Степень ингибировапия пролиферации

КВ-3-1 SK-N-MC IMR-32

0.005 мкг/мл dsMyc 6.5 >10 Не влияет

dsEGFP >10 >10 Не влияет

гіоли(І:С) Не влияет Fie влияет Не влияет

0.05 мкг/мл dsMyc >10 >10 Не влияет

dsEGFP >10 >10 Fie влияет

поли(І:С) 3.5 >10 Не влияет

0.5 мкг/мл dsMyc >10 >10 2.5

dsEGFP >10 >10 2

поли(1:С) >10 >10 Не влияет

В клетках SK-N-MC после трансфекции препаратов dsMyc. dsEGFP и поли(1:С) наблюдается незначительное повышение уровня мРНК PKR в 1.5-2 раза на первые -третьи сутки после трансфекции . Повышения уровня мРНК OASI в клетках SK-N-MC под действием исследуемых дцРНК не было отмечено (данные не приведены).

Таким образом, исследование изменения экспрессии генов OASI и РКП под действием дцРНК не дает однозначного ответа о специфичности действия препаратов дцРНК и siPHK. Мы предположили, что уровень экспрессии интерферон-чувствительных генов будет более надежным маркером интерферонового ответа клетки на введение дцРНК. поэтому мы исследовали изменение уровня экспрессии fl-актнна. являющегося интерферон-чувствительным геном, под действием разных препаратов siPHK и длинных дцРНК в клетках КВ-3-1 и SK-N-MC. Показано, что уровень мРНК ^-актина значительно снижается через 24 - 72 ч после трансфекции длинных дцРНК dsMyc. dsEGFP, поли(1:С), в то время как siMyc, s¡Ex2 и siScr не оказывали значительного влияния на экспрессию этого гена.

Таким образом, ¡З-актин может служить дополнительным маркером неспецифического интерферонового ответа, так как уровень его экспрессии значительно снижается под действием индукторов интерферона в клетках разного происхождения, кроме того, наблюдается корреляция между изменением экспрессии генов С-МЇС и Д-актина под действием дцРНК и антипролиферативным действием этих дцРНК.

8. Иммуностимулирующее действие 22-звеииых двуцепочечиых РНК с 3 выступающими нуклеотидами на З'-концах

Нами было обнаружено, что полученная ферментативным путем с помошыо Т7 РНК полимеразы короткая двуцепочечная РНК (sil), которую мы выбрали в качестве отрицательного контроля, эффективно подавляет пролиферацию клеток карциномы и ингибирует экспрессию ряда интерферон чувствительных генов. В то же время ее химически синтезированный аналог не оказывает такого действия. Электрофоретический анализ полученного препарата isPHK выявил присутствие побочного продукта, электрофоретическая подвижность которого соответствует дуплексу длинной 22 пары нуклеотидов. который образуется в результате безматричного добавления случайного нуклеотида на 3'-конец синтезируемой цепи Т7 РНК полимеразой. Мы предположили, что этот продукт активирует систему врожденного иммунитета и оказывает антипролиферативное действие па опухолевые клетки. Для выяснения того, как влияет

последовательность выступающих концов на иммуностимулирующие свойства isPHK, мы исследовали антипролиферативное действие химически синтезированных 22 п.н. дуплексов со случайными нукпеотидами, А, G, С или U, добавленными на 3'-концы обоих цепей (isPHK-N, -А, -G, -С, -U), а так же гетеродуплексов, образованных цепями 21 и 22 п.н. РНК (isPHK-N/0, isPHK-0/N). В качестве параметра сравнения использовали концентрацию дуплекса, при которой количество живых клеток КВ-3-1 через 96 ч после трансфекции сокращалось на 50% - IC50. Данные показали (Рис. 23), что добавочные нукпеотиды на обеих цепях важны для проявления антипролиферативного эффекта. Сравнение антипролиферативной активности 22 п.н. дуплексов, отличающихся нуклеотидами на 3'-концах цепей показало, что только дуплексы isPHK-U и isPHK-А ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, тогда как isPHK-G и isPHK-C неактивны. Сравнение активности одноцепочечных РНК: ssPHK-A (А на З'-конце цепи 2), -U (U на 3'-конце цепи 1) и образованных ими гетеродуплеков показало, что наиболее выраженное антипролиферативное действие оказывают isPHK-U и isPHK-U/A (цепь 1 содержит U на З'-конце, цепь 2 - А). Для этих дуплексов IC50 составило 36 и 30 нМ, соответственно. Антипролиферативная активность isPHK-A, isPHK-A/U и одноцепочечных ssPHK-A и -U была менее выражена: IC50 около 100 нМ и даже при максимальной из использованных концентраций (200 нМ) эффективность ингибирования не превышала 55%.

Для того, чтобы определить консенсусную последовательность иммуностимулирующего мотива мы сравнили антипролифративную активность isPHK-U с активностью серии дуплексов, содержащих замены в разных частях (Рис. 23). .Замены вводили в обе цепи дуплекса таким образом, что бы не нарушить комплементарные взаимодействия. Данные показали, что замены в средней части дуплекса isPHK-U затрагивающие позиции 10 - 12 (isPHK-U(10-12): UUU-мотив в цепи 1 на AGA) и позиции с 13 по 16 (isPHK-U(13-16): CAGA-мотив цепи 1 заменен на UUUU) не снижают, а даже несколько увеличивают антипролиферативную активность (IC50 15.5 нМ и 17.5 нМ, соответственно). Разрушение потенциально иммуностимулирующего GUGU мотива в позициях 1 - 4 (isPHK-U(2,4): UGU-мотив в цепи 1 заменен на AGA) лишь незначительно снижает активность: IC50 ~40 нМ по сравнению с 36 нМ для исходной isPHK-U. Напротив, введение единичной замены, прерывающей олигои мотив на З'-конце цепи 1 (isPHK-U(20): U заменен на С), практически блокирует антипролиферативную активность дуплекса. Удлинение выступающих 3'-концов до 4 - 11 н. (isPHK-U2-9) существенно не влияет на антипролиферативную активность, тогда как укорочение 3'-олигои «хвоста» приводит к увеличению IC50. Таким образом, иммуностимулирующая активность исследуемых дуплексов не чувствительна к заменам в их центральной части, однако последовательность 3'-концов isPHK важна для этой функции. Можно предположить, что олигои мотив на З'-конце цепи 1 является иммуностимулирующим мотивом.

Рис. 23. Влияние замен на антипролиферативную активность isPHK-U. Замены, которые усиливают активность, показаны зеленым цветом, ингибируюшие активность замены красным. Величина стрелок отражает уровень наблюдаемого эффекта.

Полученные данные позволяют определить консенсусную последовательность иммуностимулирующей РНК следующим образом: цепь 1 - 3'-A/UUUUUUN8N9N10N11N12N13N14CGGACUGUG-5' и цепь 2 - 5'-

иси

ааал |

с Г I

uuuuaJa

AAAN1N2N3N4N5N6N7GCCUGACACUUU/A-3где N1 - N7 комплементарны, соответственно, N8 - N14.

Для выяснения механизма антипролиферативного действия мы исследовали возможное проапоптотическое действие isPHK путем селективного окрашивания живых, мертвых и находящихся в стадии апоптоза клеток. Полученные данные показали, что в отличие от поли(1:С), комплекс isPHK-U/A/Липофектамин лишь незначительно увеличивает количество «апоптотическнх» (8%) и мертвых клеток (6.5%) по сравнению с популяцией клеток обработанных только трансфекционным агентом. Поскольку антипролиферативное действие isPHK-U/A и поли(1:С) в тех концентрациях, которые были использованы в данном эксперименте, практически одинаково, то можно предположить, что в отличие от поли(1:С) isPHK-U/A не вызывает апоптоз, а ингибирует клеточное деление.

Для подтверждения этого предположения мы проанализировали распределение клеток КВ-3-1 по фазам клеточного цикла через 48 ч после трансфекцин isPHK-U/A (100 нМ) или поли(1:С) (50 нг/мп). Показано (Рис. 24), что под действием isPHK-U/A происходит увеличение количества клеток в GO/Gl-фазе и сокращение количества клеток в фазе G2/M, в то же время число клеток в S-фазе существенно не меняется. Увеличение количества клеток в суб01-фазе, то есть, клеток в стадии апоптоза и апототических телец, до 22% под действием поли(1:С), указывает на проявление токсического действия этого препарата, напротив, только 6 - 7% клеток в фазе cy6Gl было обнаружено после трансфекции isPHK-U/A или действия самого трансфекционного агента. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными с помощью селективного окрашивания. Несмотря на увеличение клеток в фазах G0/G1 и S, под действием поли(1:С) существенно сокращается количество клеток в фазе G2/M. Этот результат свидетельствует о том, что индукция апоптоза под действием поли(1:С) происходит в основном в делящихся клетках. Полученные нами результаты подтверждают предположение о том, что антипролиферативное действие isPHK осуществляется путем торможения клеточного деления и его механизм отличается от механизма поли(1:С).

Чтобы определить связаны ли антипролиферативные свойства isPHK с активацией системы врожденного иммунитета мы проанализировали влияние isPHK на продукцию цитокинов IFN-a, TNF-a и IL-6 адгерентных мононуклеарных клеток, выделенных из периферический крови человека (РВМС). Данные показали, что isPHK-U/A индуцирует секрецию IFN-a клетками РВМС концентрационно-зависимым образом. Трансфекция клеток 100 нМ isPHK-U/A вызывает 4-х кратное повышение уровня IFN-a в среде клеток РВМС, по сравнению с клетками, подвергнутыми действия только трансфецирующего агента. Под действием isPHK происходит так же активация синтеза TNF-a и, в меньшей степени, IL-6. Введение в клетки контрольного активатора системы врожденного иммунитета поли(1:С) вызывает повышение уровней цитокинов TNF-a и IL-6 в 15- и в 2-раза, соответственно, при этом уровень IFN-a в среде обработанным этим индуктором клеток остаётся сопоставимым с контролем. Таким образом, полученные нами isPHK обладают очевидным преимуществом как индукторы интерферона I типа по сравнению с поли(1:С), который повышает уровень секреции цитокинов воспаления и вызывает связанный с ними токсический эффект.

Для определения иммуностимулирующего потенциала isPHK in vivo, мы определили IFN-a и IL-6 в крови мышей после внутривенного (i.v.) или интраперитонеапьного (i.р.) введения препаратов в комплексе с Липофектамином. Полученные данные показали (Рис. 25), что уровни IFN-a и IL-6 в сыворотки крови существенно зависят от способа введения препаратов.

1'ис. 24. Влияние isPHK и поли(1:С) на прогрессию клеточного цикла в клетках К.В-3-1. Анализ клеточного цикла проводили с помощью флуоцигометрии через 48 ч после трансфекции isPHK (100 нМ~1,4 мкг/мл) или поли(1:С) (50 нг/мл) с помощью Липофектамина. Стандартное отклонение определяли по результатам трех независимых опытов. Черные столбцы - Mock, серые столбцы - siPHK-U/A, белые столбцы -поли(1:С).

Наиболее выраженная активация секреции IFNa была зафиксирована после i.v. введения комплекса isPHK-U/A/Липофектамин (5-кратное повышение), при этом введение одноцепочечной ssPHK-U оказывало лишь незначительный эффект. isPHK-G, которая не показывала антипролиферативной и цитокин-активирующей активности в экспериментах in vitro, напротив, индуцировала 3-кратное повышение уровня IFNa в сыворотки крови мышей после i.v. введения. После интраперитонеального введения исследуемых препаратов существенных изменений уровня IFNa не было обнаружено. Повышенный уровень IL-6 в сыворотке крови мышей был зафиксирован после i.p. введения каждой из исследованных isPHK и даже после введения Липофектамина без isPHK ("Mock"). Наибольший эффект наблюдался после введения двуцепочечной isPHK-U/A и одноцепочечной ssPHK-U, наименее активна была isPHK-G.

А.

100 , so 1

80 'I

q 70 1 •i 50 i с 50 1

»Г 40 i ¿ 30 ■[

u. 20

Б.

ю........Hi]

I

MOCK ¡sPHK-U/A ssPHK-U ¡sPHK-G MOCK ¡sPHK-U/A ssPHK-U ísPHK-G

Рис. 25. Стимуляция системы врожденного иммунитета препаратами isPHKs in vivo. Комплексы isPHKs/Липофектамин вводили внутривенно (черные столбцы) или интраперитонеально (белые столбцы) мышам CBA/LacSto, из расчета 2 мг isPHK на кг веса. Уровни IFN-u (А) и IL-6 (Б) определяли в сыворотки крови мышей с помощью ELISA через 6 ч после введения препаратов. Mock - мыши, получившие инъекцию трансфекционного агента (35 j.ilj в среде OptiMEM без isPHK.

Противоопухолевые и антиметастатические свойства препаратов isPHK исследовали на самцах мышей линии CBA/LacSto с внутримышечно привитой гепатокарциномой G-29 и на мышах C57BL с подкожно или внутривенно привитой меланомой В16.

Исследование противоопухолевой активности показало, что инъекции препаратов isPHK-U/A и isI'HK-O&N приводят лишь к незначительному снижению размера гепатокарциномы G-29 у мышей. Морфометрический анализ препаратов печени, выполненный д.б.н. Рябчиковой Е.И. показал, что лечение препаратами isPHK-U/A и isPHK-O&N приводит к уменьшению размеров и степени развития метастазов в печени, сердце и легких у мышей, rio сравнению с контрольными группами животных и группой животных, получавших инъекции препарата поли(1:С). Анализ срезов первичного узла опухоли показал, что препарат isPHK-U/A вдвое сокращает зону недифференцированных клеток, вызывает почти двукратное сокращение количества делящихся клеток в периферической зоне первичного узла, уменьшение толщины самой периферической зоны

и значительное увеличение интенсивности некротических процессов в центре первичного узла опухоли. Однако, несмотря на некоторую противоопухолевую и антиметастатическую активность, препараты ¡яРНК-и/А и ¡зРНК-О&Ы не увеличивали продолжительность жизни мышей с гепатомой С-29.

При исследовании мышей с подкожно привитой меланомой В16 при помощи магнитно-резонансной томографии было обнаружено, что у опытных животных размер опухолевого узла был снижен относительно контрольных. Однако, достоверных отличий между группами, получавшими инъекции препаратами ¡вРНК, поли(1:С) и между контрольными группами не было выявлено.

Исследование антиметастатического действия препаратов ¡бРНК на модели внутривенно привитой меланомы В16 у мышей линии С57ВЬ показало, что в легких мышей из контрольных групп много крупных поверхностных метастазов, также как и в легких мышей, получавших лечение препаратом поли(1:С), характер метастазирования сходен. В легких мышей, получавших лечение препаратами вРНК, метастазов существенно меньше и они более мелкие. Количественная оценка уровня метастазирования (Рис. 26) показала, что у мышей, получавших лечение препаратами ¡вРНК. количество метастазов в 5 раз меньше (р<0.005), по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечение. Примечательно, что у группы мышей получавшей лечение препаратом поли(1:С) нет достоверных отличий от обеих контрольных групп.

Р'О.ГН35

Рнс. 26. Количество поверхностных метастазов в легких мышей линии С57ВЬ на 60 ' 15-й день после внутривенной имплантации

опухолевых клеток (1x10' клеток/мышь). Данные обработаны по критерию Манна-ДО III Уитни.

2

Контроль Моек ІБРНК-и/А кРИК-ІІ/А' поли(І:С)

Эти ібРНК обладают высокой

Таким образом, нами получена серия 22-звенных двуцепочечных ібРНКб с 3 выступающими нуклеотидами на 3'-концах, которые активируют систему врожденного иммунитета зависимым от последовательности образом, антипрол и феративной и имм уности м ул ирующей

активностями и могут быть использованы как адыованты в противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

Данная работа представляет собой фундаментальное исследование, в результате которого сформулированы принципы конструирования ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов на основе химически модифицированных малых интерферирующих РНК. Использование этих принципов дизайна позволило идентифицировать ряд перспективных молекулярных мишеней для лекарственных препаратов и сконструировать высокоэффективные ингибиторы экспрессии терапевтически значимых генов.

1. Разработан комплексный подход для поиска перспективных молекулярных мишеней для лечения опухолевых заболеваний:

• изучены кинетические и концентрационные зависимости эффективности

действия ингибиторов на основе 5ІРНК и длинных дцРНК;

• исследовано влияние селективного выключения экспрессии генов Нег2, С.СМВ1.

РКС и С-МЇС на пролиферацию, распределение по фазам клеточного цикла и гибель

различных опухолевых клеток человека. Показано, что селективное выключение генов-мишеней не вызывает гибель клеток, а с разной эффективностью ингибирует деление опухолевых клеток разных линий, что позволяет идентифицировать наиболее эффективные молекулярные мишени для каждой клеточной линии;

• впервые изучено изменение скорости пролиферации исследованных клеточных линий после восстановления экспрессии генов Нег2, ССЫВ1 и РКС. Показано, что скорость деления большинства клеточных линий восстанавливается после достижения исходного уровня экспрессии генов-мишеней, в то время как скорость деления клеток нейробластомы 8К-Ы-МС остается в значительно сниженной в течение длительного времени после воздействия «¡Нег. «¡Сус и «¡РКС, а также длинных дцРНК:

• предложена универсальная технологическая платформа, включающая синтез «¡РНК, определение эффективности и специфичности действия, исследование кинетики изменения скорости пролиферации, количества клеток в стадии апоптоза и распределение клеток по фазам клеточного цикла, которая позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов экспрессии генов на различных типах опухолевых клеток человека для поиска новых терапевтических препаратов.

2. Разработан универсальный экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых химически модифицированных аналогов «¡РНК. содержащих минимальное количество модифицированных звеньев и оказывающих длительное и эффективное иигибирующее действие на экспрессию гена-мишени:

исследована деградация «¡РНК в присутствии сыворотки крови, идентифицированы мотивы последовательности, которые подвергаются быстрому расщеплению в составе «¡РНК с разными последовательностями, и мотивы, нуклеазоустойчивость которых зависит от контекста последовательности:

исследовано влияние количества и расположения 2'-0-аналогов нуклеотидов в составе «¡РНК на ее стабильность и интерферирующую активность; показано, что 2'-0-метильные аналоги нуклеотидов, расположенные в нуклеазочувствительных сайтах дуплекса «¡РНК, не изменяют ее интерферирующую активность и защищают от деградации нуклеазами эмбриональной бычьей сыворотки;

доказано, что только модификация всех нуклеазочувствительных сайтов в составе «¡РНК позволяет увеличить длительность ее ингибирующего действия.

3. Проведено систематическое исследование влияния количества и расположения нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных «¡РНК на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия и предложен универсальный подход, позволяющий конструировать высокоэффективные «¡РНК. направленные к любым последовательностям, в том числе к последовательностям с неблагоприятной термодинамической асимметрией:

показано, что замена четырех нуклеотидов на 3'-конце смысловой цепи «¡РНК с неблагоприятной термоасимметрией, приводящая к образованию «мисматчей» и формированию структуры типа «вилка», увеличивает эффективность подавления экспрессии гена-мишени;

установлено, что введение нуклеотидных замен в центральную часть селективно модифицированного дуплекса, приводящее к образованию СТЛ-пар, может способствовать увеличению эффективности подавления экспрессии гена-мишени;

селективная модификация нуклеазочувствительных сайтов в составе «¡РНК, имеющих структуру «вилки», существенно увеличивает длительность их ингибирующего действия, что позволило впервые получить «¡РНК. способные снижать экспрессию гена-мишени в клетках в течение 15 суток после однократной

трансфекции.

4. Изучено влияние природы липофильных заместителей в составе siPHK на их способность проникать в разные типы клеток без помощи трансфецирующего агента и их интерферирующую активность и сконструирован модифицированный аналог анти-MDRl siPHK, способный проникать в цитоплазму клетки, ингибировать экспрессию гена-мишени и вызывать терапевтически значимое изменение фенотипа клетки:

показано, что эффективность накопления липофильных производных siPHK в клетках зависит от типа липофильной молекулы и значительно увеличивается при удлинении алифатического линкера между siPHK и липофильным остатком от 0 до 12 атомов углерода;

обнаружено, что интерферирующая активность холестерин-содержащей siPHK увеличивается при удлинении алифатического линкера между siPHK и липофильным остатком от 0 до 6 - 10 атомов углерода, однако при дальнейшем удлинении линкера до 12 атомов углерода происходит снижение эффективности ингибирующего действия и ухудшение кинетики ингибирования.

5. Исследовано действие коротких и длинных иммуностимулирующих дцРНК как неспецифических ингибиторов экспрессии интерферон-чувствительных генов и пролиферации раковых клеток человека:

• показано, что длинные дцРНК стимулируют синтез интерферона-a и цитокинов воспаления, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, вызывая их гибель по механизму апоптоза, тогда как короткая isPHK активирует преимущественно секрецию интерферона-a, но не цитокинов воспаления и оказывает антипролиферативное действие, замедляя деление опухолевых клеток.

• идентифицирована серия 22-звенных двуцепочечных иммуностимулирующих РНК с 3 выступающими нуклеотидами на 3'-концах, которые способны ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в культуре, стимулировать синтез интерферона-a in vilro и in vivo и оказывать умеренное противоопухолевое и выраженное антиметастатическое действие при введении в организм животных-опухоленосителей.

Список публикаций по теме диссертации

Обзоры:

1. Chernolovskaya, E.L., Zenkova, М.А. Chemical modification of siRNA // Curr. Opin. Mol. Ther. - 2010. - V. 12(2). - P. 158-167.

2. Черноловская, E.JI., РНК-интерференция: клин клином... // Наука из первых рук. -2008.-№1. - С. 54-60.

3. Кабилова, Т.О., Черноловская, E.JÏ. Онкогены семейства туе как терапевтические мишени // Бюллетень сибирской медицины. - 2008. - приложение 3. - С. 11-25.

Патент:

4. Кабилова, Т.О., Черноловская, E.JL, Зенкова, М.А., Власов. В.В. Фрагменты двуцепочечной РНК, обладающие антипролиферативной и интерферон-индуцирующей активностями II Патент на изобретение №2391405. - рег. 10.06.2010.

Статьи:

5. Kabilova, Т. О., Meschaninova, M.I., Venyaminova, A.G., Nikolin. V.P.. Zenkova, M.A.. Vlassov, V.V., Chernolovskaya, E.L. Short dsRNA with Immunostimulatory Activity: Sequence Dependence // Nucleic Acid Therapeutics. - 2012. - V. 22. - No. 3. - P. 196-204.

6. Petrova, N., Chemikov, I., Meschaninova, M., Dovydenko, I., Venyaminova, A., Zenkova, M., Vlassov, V., Chernolovskaya, E. Carrier-free cellular uptake and the gene-silencing activity of the lipophilic siRNAs is strongly affected by the length of the linker between siRNA and

lipophilic group // Nucl. Acids Res. - 2012. - V. 40. - P. 2330-2344.

7. Акимов, И.А., Черноловская, E.JI., Спицына, Ю.Е., Рябчикова, Е.И., Зенкова, М.А. Подавление экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС с помощью siPHK снижает скорость пролиферации клеток нейробластомы человека на длительное время // Acta naturae. - 2011. -Т. З.-С. 6-16.

8. Petrova, N.S., Meschaninova, M.I., Venyaminova, A.G., Zenkova, M.A., Vlassov, V.V., Chernolovskaya, E.L. Silencing activity of 2'-0-methyl modified anti-MDRl siRNAs with mismatches in the central part of the duplexes// FEBS Lett. -2011. - V. 585. - P. 2352-2356.

9. Кабилова, Т.О., Владимирова, А.В., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г., Зенкова, М.А., Черноловская, E.JI., Власов, В.В. Создание противоопухолевых и иммуномодулирутощих препаратов на основе коротких двуцепочечных РНК // Докл. Акад. Наук. - 2011. - Т. 436. - С. 412-416.

10. Petrova (Kruglova), N.S., Meschaninova, M.J., Venyaminova, A.G., Zenkova, M.A., Vlassov, V.V, Chernolovskaya, E.L. 2'-0-Methyl-Modified Anti-MDRl Fork-siRNA Duplexes Exhibiting High Nuclease Resistance and Prolonged Silencing Activity // Oligonucleotides. -2010.-V. 20.-P. 297-308.

П.Спирин, П.В.. Баскаран, Д., Орлова, Н.Н., Рулила, А.В., Никитенко, Н.А., Черноловская, E.JI., Зенкова, М.А., Власов, В.В., Рубцов, П.М., Чумаков, П.М., Стокинг К., Прасолов, B.C. Подавление экспрессии лейкозных онкогенов AMLJ-ETO и RUNX1(K83N) с помощью РНК-интерференции // Молекулярная биология. - 2010. - Т. 44. -С. 876-888.

12. Круглова, Н.С., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г., Зенкова, М.А., Власов, В.В., Черноловская, E.JI. Холестерин-модифицированные малые интерферирующие РЕПС, направленные на мРНК гена MDR1: внутриклеточная доставка и биологическая активность // Молекулярная биология. - 2010. - Т. 44. - С. 284-293.

13. Акимов, И.А., Черноловская, E.JI. Подавление экспрессии генов CCNBI, HER2 и РКС с помощью малых интерферирующих РНК с разной эффективностью замедляет деление раковых клеток человека различного происхождения // Молекулярная биология. - 2010. -Т. 44.-С. 98-106.

14. Спирин, П.В., Баскаран, Д., Рубцов, П.М., Зенкова, М.А., Власов, В.В., Черноловская, Е.Л., Прасолов, B.C. Сравнение эффективности подавления экспрессии целевых генов с помощью синтетических модифицированных siPHK и shPHK, экспрессируемых рекомбинаптными лентивирусными векторами // Acta Naturae. - 2009. №. 2. - С. 98-103.

15. Дыгало, Н.Н., Калинина, Е.Л., Черноловская Е.Л., Зенкова, М.А., Шишкина, Г.А., Угрюмов, М.В. Модель изучения функции гонадотропин-рилизинг гормона в онтогенезе путем подавления его экспрессии интерферирующей РЕПС // Докл. Акад. Наук. - 2009. - Т. 426. - С. 828-830.

16. Volkov, A.A., Kruglova, N.S., Meschaninova, М.1., Venyaminova, A.G., Zenkova, M.A., Vlassov, V.V., Chernolovskaya, E.L. Selective protection of nuclease-sensitive sites in siRNA prolongs silencing effect // Oligonucleotides. - 2009. - V. 19. - P. 191-202.

17. Akiinov, I.A., Kabilova, Т.О., Vlassov, V.V., Chernolovskaya, E.L. Inhibition of Human Cancer Cells Proliferation by Long Double-Stranded RNAs // Oligonucleotides. - 2009. - V. 19(1).-P. 31-40.

18. Круглова, H.C., Мещанинова, М.И., Веньяминова, А.Г., Власов, В.В., Черноловская, Е.Л. 2'-0-метильные аналоги одноцепочечных и двуцепочечных малых интерферирующих PFIIC: нуклеазо-устойчивость и биологическая активность // Фундаментальные науки - медицине. - 2008. - С. 129-133.

19. Логашенко. Е.Б.. Волков, А.А., Черноловская, ЕЛ., Зенкова, М.А., Власов, В.В. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости раковых клеток с

помощью siPHK // Вестник ВОГИС. - 2006. - Т. 10. - С. 342-351.

20. Логашенко. Е.Б.. Владимирова, А.В., Волков, А.А, Репкова. М.Н.. Веньяминова, А.Г.. Зенкова. М.А., Черноловская, E.JI., Власов, В.В. Подавление экспрессии гена MDRI с помощью химически модифицированных аналогов siPHK // Известия АН, серия химическая. - 2006. - № 7. - С. 1227-1235.

21. Kabilova, Т.О., Vladimirova, A.V., Chernolovskaya, E.L., Vlassov, V.V. Arrest of cancer cells proliferation by dsRNAs // Annals of NY Acad, of Sci. - 2006. - V. 1091. - P. 425-236.

22. Кабилова. Т.О., Черноловская, E.JI. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток человека двуцепочечными рпк, направленными на подавление экспрессии онкогенов семейства MYC // Вестник ВОГИС. - 2006. - Т. 10. - С. 373-382.

23. Кабилова, Т.О.. Владимирова, А.В., Репкова. М.Н., Веньяминова. А.Г.. Черноловская, E.JL, Власов. В.В. Подавление экспресси гена c-MYC с помощью ферментативно и химически синтезированных siPHK // Молекулярная Биология. - 2006. - Т. 40. - С. 10371046.

24. Kabilova, Т.О., Chernolovskaya, E.L.. Vladimirova, A.V., Vlassov, V.V. Inhibition of Human Carcinoma and Neuroblastoma Cell Proliferation by anti c-Myc siRNA // Oligonucleotides. - 2006. - V. 16. - P. 15-25.

25. Власов, В.В., Зенкова. М.А., Черноловская, Е.Л. Лекарства, адресованные генам // Наука в России. - 2005. - №2. - С. 41-44.

26. Логашенко. Е.Б., Владимирова. А.В.. Зенков, А.Н., Репкова, М.Н.. Веньяминова, А.Г.. Черноловская, Е.Л.. Власов, В.В. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с помощью малых интерферирующих РНК // Известия АН, серия химическая. - 2005. - № 2. - С. 41-44.

27. Зенков, А.Н., Скворцова, Н.В., Черноловская, Е.Л., Зенкова, М.А., Поспелова, Т.И., Лосева, М.И., Власов, В.В. Экспрессия генов MDRI и MRP с первичным поражением костного мозга // Бюллетель СО РАМН. - 2004. - № 4. - С. 43-48.

28. Поспелова, Т.И., Лосева, М.И., Ковынев. И.Б.. Агеева, 'Г.А., Зенкова, М.А., Черноловская, Е.Л., Зенков, А.Н., Скворцова, II.В., Власов. В.В. Основы опухолевой прогрессии гемобластозов // Бюллетель СО РАМН. - 2004. - № 2. - С. 73-76.

29. Логашенко, Е.Б.. Кабилова. Т.О., Владимирова, А.В.. Власов, В.В., Черноловская, Е.Л. Подавление экспрессии генов с-щ>с и mc/rI в линиях опухолевых клеток человека короткими двуцепочечными РНК (siRNA) // Вестник НОЦ. - 2004. - № 5-6. - С. 22-25.

30. Zenkov, A.N., Scvortsova, N.V., Chernolovskaya, E.L., Pospelova, Т.1., Vlassov, V.V. Expression of the MDRI and MRP genes in patients with lymphoma with primary bone marrow involvement // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. - 2004. - V. 23. - P. 843-847.

31. Kabilova, Т.О., Chernolovskaya, E.L., Vladimirova, A.V., Vlassov, V.V. Silencing of c-myc expression in tumor cells by siRNA // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. - 2004. -V. 23. - P. 867-872.

32. Logashenko, E.B., Vladimirova, A.V., Chernolovskaya, E.L., Repkova, M.N., Venyaminova, A.G., Vlassov, V.V. Silencing of multiple drug resistance gene in cancer cells by short double stranded RNA // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. - 2004. - V. 23. - P. 861-866.

33. Черноловская, Е.Л., Зенков, A.H.. Зенкова. M.A., Власов, В.В. Подавление множественной лекарственной устойчивости с помощью синтетических олигонуклеотидов // Наука производству. - 2003. - № 3. - С. 57-62.

34. Логашенко, Е.Б., Черноловская, Е.Л., Владимирова, А.В., Репкова. М.Н., Веньяминова, А.Г., Власов, В.В. Подавление экспрессии гена множественной лекарственной устойчивостив опухолевых клеткахс помощью короткой двуцепочечной РНК // Доклады Академии Наук, серия химическая. - 2002. - Т. 386. - С. 274-276.

Подписано в печать 03.10.2012г. Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 2.5 Объем 40 стр. Тираж 160 экз. Заказ № 178 Отпечатано ООО «Омега Принт» 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6

•"> - 2 1 2 64

2012340486

2012340486

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Черноловская, Елена Леонидовна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Интерферирующие РНК - селективные ингибиторы экспрессии генов 16 (Обзор литературы).

1.1. Механизм РНК интерференции

1.2. Природные интерферирующие РНК

1.2.1. РНК интерференция и противовирусная защита

1.2.2. Регуляторные РНК

1.2.3. Особенности механизма РНК интерференции у разных организмов

1.3. Способы получения интерферирующих РНК

1.4. Химические модификации в составе siPHK

1.4.1. Типы химических модификаций

1.4.2. Выбор «направляющей цепи» в модифицированных дуплексах

1.4.3. «Включаемые» интерферирующие РНК

1.4.4. Нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия 39 интерферирующих РНК

1.4.5. Внутриклеточная локализация и биораспределение химически 41 модифицированных siPHK

1.4.6. Биоконъюгаты siPHK

1.5. Интерферирующие РНК с измененной структурой дуплекса

1.6. Влияние нуклеотидных замен на интерферирующую активность siPHK

1.7. Эффекты двуцепочечных РНК в клетке не связанные с интерференцией

1.8. Неспецифические эффекты siPHK и способы их преодоления

1.9. Терапевтические мишени интерферирующих РНК

1.9.1. Ген множественной лекарственной устойчивости MDR

1.9.2. Гены семейства MYC

1.9.3. HER2 (c-erb-B2/Neu)

1.9.4. Циклин В

1.9.5. Протеинкиназа С (РКС)

1.10. Перспективы использования интерферирующих РНК в медицине

Введение Диссертация по биологии, на тему "Принципы конструирования малых интерферирующих РНК для подавления экспрессии терапевтически значимых генов"

Вся необходимая информация для правильного развития и функционирования организма человека, защиты его от повреждающих факторов внешней среды и патогенных микроорганизмов закодирована в его геноме. Геном не только содержит информацию обо всех белках, необходимых организму, но и информацию о том, когда и в каком количестве должен быть синтезирован каждый белок. Система регуляции генетической экспрессии очень сложна и, несмотря на наличие дублирующих сигнальных систем и механизмов исправления повреждений генетической информации, в ней нередко происходят необратимые повреждения, которые приводят к развитию заболеваний или патологических состояний организма. Повреждения генетической информации могут вызывать разные последствия: отсутствие необходимого организму белка, избыток белка, либо синтез «неправильного» белка, который наносит вред организму. В первом случае для коррекции патологии необходимо ввести в клетку «правильный» ген, кодирующий недостающий белок, и тут на помощь может прийти гено-терапия, в двух других -требуется применение терапевтических средств, которые ограничат или блокируют синтез данного белка, не затрагивая при этом остальные системы клетки.

Прямым подходом к получению селективных ингибиторов экспрессии генов является использование терапевтических нуклеиновых кислот, способных избирательно связываться с мРНК гена-мишени и инактивировать её. Наиболее перспективными агентами для такого воздействия, действующими в наномолярных концентрациях, являются б1РНК (малые интерферирующие РНК) [1-4]. з1РНК представляют собой дуплексы длиной 21-25 п.н., которые в составе белкового комплекса связываются с комплементарной им РНК-мишенью и вызывают ее направленную деградацию. з1РНК широко применяются в функциональной геномике для идентификации генов, вовлеченных в такие основополагающие клеточные процессы, как дифференцировка, апоптоз, физиологические процессы, а также генов, определяющих клеточную морфологию [5]. Возможность направленно регулировать экспрессию любого гена позволяет не только исследовать их функции, но и вести поиск потенциальных мишеней для лекарственных препаратов на генном уровне. Ввиду того, что любой ген может выступать в роли потенциальной мишени, перспектива использования з1РНК в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых [6], нейродегенеративных заболеваний

7, 8], вирусных инфекций [9] является многообещающей. В настоящее время проводятся клинические испытания ряда препаратов на основе з1РНК [10, 11], однако широкое применение 51РНК в терапии пока не представляется возможным из-за их

13 чувствительность к рибонуклеазам, сложности выбора высокоэффективных последовательностей, возможности возникновения ряда побочных эффектов и проблемы доставки з1РНК в клетки и ткани. Создание регуляторов экспрессии генов на основе б1РНК, действующих по механизму РНК-интерференции, открывает новые возможности для получения широкого спектра высокоэффективных терапевтических препаратов, поэтому разработка принципов дизайна нового поколения з1РНК, лишенных указанных недостатков, является исключительно актуальной.

Целью настоящей работы являлась разработка принципов конструирования ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов на основе химически модифицированных малых интерферирующих РНК, оказывающих пролонгированное действие и способных проникать в клетки без помощи носителя.

В ходе выполнения исследования необходимо было решить следующие задачи: изучить влияние выбора специфической мРНК-мишени и последовательности-мишени в составе выбранной мРНК на способность з1РНК тормозить пролиферацию опухолевых клеток человека и разработать комплексный подход для поиска перспективных молекулярных мишеней для лечения опухолевых заболеваний.

• исследовать влияние количества и распределения химических модификаций в составе б1РНК на ее стабильность в присутствии сыворотки, биологическую активность и длительность интерферирующего действия и разработать универсальный экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых аналогов б1РНК, содержащих минимальное количество модифицированных звеньев и оказывающих длительное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени. определить влияние нуклеотидных замен в составе химически модифицированных з1РНК на ее биологическую активность и предложить подход, позволяющий конструировать высокоэффективые э^РНК, направленные к любым последовательностям, в том числе к последовательностям с неблагоприятной термодинамической ассиметрией.

• изучить влияние природы липофильных заместителей на способность з!РНК проникать в разные типы клеток в отсутствие трансфецирующего агента и проявлять интерферирующую активность и создать аналог б1РНК, способный проникать в клетки, ингибировать экспрессию гена-мишени и вызывать терапевтически значимое изменение фенотипа клетки.

• определить влияние длины и последовательности коротких и длинных двуцепочечных РНК на спектр их биологических активностей и оценить потенциал их антипролиферативного, иммуностимулирующего, противоопухолевого и антиметастатического действия.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Черноловская, Елена Леонидовна

выводы

Данная работа представляет собой фундаментальное исследование, в результате которого сформулированы принципы конструирования ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов на основе химически модифицированных малых интерферирующих РНК. Использование этих принципов дизайна позволило идентифицировать ряд перспективных молекулярных мишеней для лекарственных препаратов и сконструировать высокоэффективные ингибиторы экспрессии терапевтически значимых генов.

1. Разработан комплексный подход для поиска перспективных молекулярных мишеней для лечения опухолевых заболеваний:

• изучены кинетические и концентрационные зависимости эффективности действия ингибиторов на основе siPHK и длинных дцРНК;

• исследовано влияние селективного выключения экспрессии генов Her2, CCNB1, РКС и C-MYC на пролиферацию, распределение по фазам клеточного цикла и гибель различных опухолевых клеток человека. Показано, что селективное выключение генов-мишеней не вызывает гибель клеток, а с разной эффективностью ингибирует деление опухолевых клеток разных линий, что позволяет идентифицировать наиболее эффективные молекулярные мишени для каждой клеточной линии;

• впервые изучено изменение скорости пролиферации исследованных клеточных линий после восстановления экспрессии генов Her2, CCNB1 и РКС. Показано, что скорость деления большинства клеточных линий восстанавливается после достижения исходного уровня экспрессии генов-мишеней, в то время как скорость деления клеток нейробластомы SK-N-MC остается в значительно сниженной в течение длительного времени после воздействия siHer, siCyc и siPKC, а также длинных дцРНК;

• предложена универсальная технологическая платформа, включающая синтез siPHK, определение эффективности и специфичности действия, исследование кинетики изменения скорости пролиферации, количества клеток в стадии апоптоза и распределение клеток по фазам клеточного цикла, которая позволяет проводить скрининг потенциальных ингибиторов экспрессии генов на различных типах опухолевых клеток человека для поиска новых терапевтических препаратов.

2. Разработан универсальный экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых химически модифицированных аналогов siPHK, содержащих минимальное количество модифицированных звеньев и оказывающих длительное и эффективное ингибирующее действие на экспрессию гена-мишени:

• исследована деградация з1РНК в присутствии сыворотки крови, идентифицированы мотивы последовательности, которые подвергаются быстрому расщеплению в составе б1РНК с разными последовательностями, и мотивы, нуклеазоустойчивость которых зависит от контекста последовательности;

• исследовано влияние количества и расположения 2'-0-аналогов нуклеотидов в составе з1РНК на ее стабильность и интерферирующую активность; показано, что 2'-О-метильные аналоги нуклеотидов, расположенные в нуклеазочувствительных сайтах дуплекса з1РНК, не изменяют ее интерферирующую активность и защищают от деградации нуклеазами эмбриональной бычьей сыворотки;

• доказано, что только модификация всех нуклеазочувствительных сайтов в составе э1РНК позволяет увеличить длительность ее ингибирующего действия.

3. Проведено систематическое исследование влияния количества и расположения нуклеотидных замен в составе селективно модифицированных з!РНК на их интерферирующую активность, нуклеазоустойчивость и длительность ингибирующего действия и предложен универсальный подход, позволяющий конструировать высокоэффективные $1РНК, направленные к любым последовательностям, в том числе к последовательностям с неблагоприятной термодинамической асимметрией:

• показано, что замена четырех нуклеотидов на 3'-конце смысловой цепи з!РНК с неблагоприятной термоасимметрией, приводящая к образованию «мисматчей» и формированию структуры типа «вилка», увеличивает эффективность подавления экспрессии гена-мишени;

• установлено, что введение нуклеотидных замен в центральную часть селективно модифицированного дуплекса, приводящее к образованию ви-пар, может способствовать увеличению эффективности подавления экспрессии гена-мишени;

• селективная модификация нуклеазочувствительных сайтов в составе з!РНК, имеющих структуру «вилки», существенно увеличивает длительность их ингибирующего действия, что позволило впервые получить з!РНК, способные снижать экспрессию гена-мишени в клетках в течение 15 суток после однократной трансфекции.

4. Изучено влияние природы липофильных заместителей в составе з1РНК на их способность проникать в разные типы клеток без помощи трансфецирующего агента и их интерферирующую активность и сконструирован модифицированный аналог анти-МОШ 81РНК, способный проникать в цитоплазму клетки, ингибировать экспрессию гена-мишени и вызывать терапевтически значимое изменение фенотипа клетки:

• показано, что эффективность накопления липофильных производных з1РНК в

283 клетках зависит от типа липофильной молекулы и значительно увеличивается при удлинении алифатического линкера между siPHK и липофильным остатком от 0 до 12 атомов углерода;

• обнаружено, что интерферирующая активность холестерин-содержащей siPHK увеличивается при удлинении алифатического линкера между siPHK и липофильным остатком от 0 до 6 - 10 атомов углерода, однако при дальнейшем удлинении линкера до 12 атомов углерода происходит снижение эффективности ингибирующего действия и ухудшение кинетики ингибирования.

5. Исследовано действий "коротких и длинных иммуностимулирующих дцРНК как неспецифических ингибиторов экспрессии интерферон-чувствительных генов и пролиферации раковых клеток человека:

• показано, что длинные дцРНК стимулируют синтез интерферона-a и цитокинов воспаления, ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, вызывая их гибель по механизму апоптоза, тогда как короткая isPHK активирует преимущественно секрецию интерферона-a, но не цитокинов воспаления и оказывает антипролиферативное действие, замедляя деление опухолевых клеток.

• идентифицирована серия 22-звенных двуцепочечных иммуностимулирующих РНК с 3 выступающими нуклеотидами на 3'-концах, которые способны ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в культуре, стимулировать синтез интерферона-а in vitro и in vivo и оказывать умеренное противоопухолевое и выраженное антиметастатическое действие при введении в организм животных-опухоленосителей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Малые интерферирующие РНК в настоящее время широко используются для ингибирования экспрессии генов в молекулярной биологии и экспериментальной фармакологии. Они являются наиболее эффективными и специфичными ингибиторами экспрессии генов, действующими в наномолярных концентрациях. Однако, их чувствительность к рибонуклеазам, сложность выбора высокоэффективных последовательностей, возможность возникновения ряда побочных эффектов и проблема доставки з1РНК в клетки и ткани существенно ограничивают их биомедицинское применение. Проведенное нами комплексное исследование позволило сформулировать принципы конструирования ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов на основе химически модифицированных з!РНК, лишенных указанных недостатков.

Для решения проблемы низкой стабильности в1РНК в присутствии сыворотки нами предложен экспериментальный алгоритм получения нуклеазоустойчивых аналогов б1РНК. Этот алгоритм включает картирование расположения нуклеазочувствительных сайтов, их защиту путем введения 2'-ОМе-модификации, проверку стабильности полученной б1РНК и, при необходимости, модификацию выявленных минорных сайтов расщепления. Применение этого алгоритма позволяет получить з1РНК с минимальным числом модифицированных звеньев, что обеспечивает сохранение ее интерферирующей активности. Эффективная защита нуклеазочувствительных сайтов в составе з1РНК обеспечивает ее стабильность в течении длительного времени в присутствии сыворотки и существенно увеличивает длительность ее ингибирующего действия после однократного введения.

Для конструирования высокоэффективных $1РНК, направленных на районы мРНК с неблагоприятной термоасимметрией или термостабильным центром, мы объединили подход, предложенный ранее НоЬуоИ для немодифицированных з1РНК и разработанный нами алгоритм селективной модификации. Суть подхода Но^оЬ состоит в ведении нуклеотидных замен со стороны 3'-конца смысловой цепи, которые превращают каноническую $1РНК в так называемую «вилкоподобную» Гз1РНК, что улучшает термоасимметрию дуплекса, однако приводит к его ускоренной деградации. Применение селективной модификации позволяет защитить дуплекс от ускоренной деградации и обеспечить рекордную длительность интерферирующего действия. Для увеличения биологической активности б1РНК с ОС-богатой центральной частью дуплекса нами предложено использовать замены, приводящие к образованию ви пар. Такие замены,

279 даже в составе антисмысловой цепи, не ингибируют, а даже повышают эффективность действия siPHK. Таким образом, использование этих приемов позволяет сконструировать siPHK, направленную к любой последовательности.

Для решения проблемы доставки siPHK в клетки нами использованы липофильные аналоги siPHK. Впервые показано, что длина линкера между липофильной группой и siPHK оказывает определяющее влияние на связывание siPHK с клетками и ее биологическую активность. Полученные липофильные siPHK с оптимизированным линкером способны проникать в клетки без помощи трансфекционного агента и ингибировать экспрессию гена-мишени. Следует отметить, что пока кинетика ингибирующего действия «самодоставляющихся» siPHK уступает кинетике действия комплексов siPHK с трансфекционным агентом, что оставляет открытым вопрос разработки подходов к улучшению биодоступности таких агентов, однако очевидно, что этот вопрос напрямую связан с фармакокинетикой и фармакодинамикой siPHK и его необходимо решать на уровне организма, в экспериментах на лабораторных животных.

Длинные и некоторые короткие двуцепочечные РНК активируют в клетках млекопитающих систему врожденного иммунитета, что в случае необходимости селективного выключения экспрессии гена-мишени является нежелательным побочным действием и ставит вопрос о необходимости использования четких критериев, которые доказывают специфичность действия или необходимости использовать химическую модификацию для предотвращения иммуностимуляции. Тем не менее, сама по себе иммуностимуляция имеет большое терапевтическое значение и может быть использована в терапии опухолевых и вирусных заболеваний. Нами получены иммуностимулирующие РНК, обладающие интерфероногенной, антипролиферативной, антиметастатической и умеренной противоопухолевой активностями и установлены закономерности влияния длины и последовательности этих РНК на спектр их биологической активности.

В процессе выполнения данной работы был получен целый ряд селективных ингибиторов экспрессии терапевтически значимых генов: MDR1, C-MYC, N-MYC, Нег2, РКС, CCNB1, AML-ETO, LMP2 которые могут рассматриваться как потенциальные терапевтические препараты. Примененная нами схема тестирования антипролиферативного действия siPHK на примере ограниченного числа генов и клеточных линий показала, что даже такое небольшое исследование позволяет идентифицировать очень привлекательные молекулярные мишени, для создания препаратов, направленных на определенные типы опухолевых заболеваний. Следует отметить, что исследование долгосрочных последствий селективного выключения экспрессии гена-мишени является обязательной составной частью такого тестирования.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Черноловская, Елена Леонидовна, Новосибирск

1. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. II Nature. 1998. - V. 391. - P. 806-811.

2. Rana T.M. Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. -2007. -V. 8. P. 23-36.

3. Collins R.E., Cheng X. Structural domains in RNAi // FEBS Lett. 2005. - V. 579. - P. 58415849.

4. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA // Nature. -2004. -V.431.-P. 343-349.

5. Schauer S.E., Jacobsen S.E., Meinke D.W., Ray A. DICER-LIKE1: blind men and elephants in Arabidopsis development // Trends in Plant Science. 2002. - V. 7. - P. 487-491.

6. Lee Y.S., Nakahara K., Pham J.W., Kim K., He Z.Y., Sontheimer E.J., Carthew R.W. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways // Cell. -2004.-V. 117.-P. 69-81.

7. Gagnon K.T., Corey D.R. Argonaute and the Nuclear RNAs: New Pathways for RNA-Mediated Control of Gene Expression // Nucleic Acid Ther. 2012. - V. 22. - P. 3-16.

8. Sasaki T., Shiohama A., Minoshima S., Shimizu N. Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome small star, filled // Genomics.- 2003.- V. 82. P. 323330.

9. Lingel A., Simon B., Izaurralde E., Sattler M. Nucleic acid 3'-end recognition by the Argonaute2 PAZ domain //Nat. Struct. Mol. Biol. 2004.- V. 11. - P. 576-577.

10. Wang Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Tuschl T., Patel D.J. Structure of an argonaute silencing complex with a seed-containing guide DNA and target RNA duplex // Nature. 2008. -V. 456. - P. 921-926.

11. Frank F., Sonenberg N., Nagar B. Structural basis for 5'-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AG02II Nature. 2010. -V. 465. - P. 818-822.

12. Hock J., Meister G. The Argonaute protein family // Genome Biol. 2008. - V. 9. - P. 210.

13. Liu Y., Ye X., Jiang F., Liang C., Chen D., Peng J., Kinch L.N., Grishin N.V., Liu Q. C3PO, an endoribonuclease that promotes RNAi by facilitating RISC activation // Science. 2009. - V. 325. - P. 750-753.

14. Ye X., Huang N., Liu Y., Paroo Z., Huerta C., Li P., Chen S., Liu Q., Zhang H. Structure of C3PO and mechanism of human RISC activation // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. - V. 18. - P. 650-657.

15. Kim D., Rossi J. RNAi mechanisms and applications // Biotechniques. 2008. - V. 44. - P. 613-616.

16. Matranga C., Tomari Y., Shin C., Bartel D.P., Zamore P.D. Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes // Cell. 2005. V. 123.-P. 607-620.

17. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev. 2001. - V. 15. - P. 188-200.

18. Leuschner P.J., Ameres S.L., Kueng S., Martinez J. Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells // EMBO Rep. 2006. - V. 7. - P. 314-320.

19. Chu C.Y., Rana T.M. Translation repression in human cells by microRNA-induced gene silencing requires RCK/p54 // PLoS Biol. 2006. - V. 4. - P. e210.

20. Nykanen A., Haley B., Zamore P.D. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway // Cell. 2001. - V. 107. - P. 309-321.

21. Aronin N. Target selectivity in mRNA silencing // Gene Therapy. 2006. - V. 13. - P. 509516.

22. Khvorova A., Reynolds A., Jayasena S.D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias // Cell. 2003. - V. 115. - P. 209 -216.

23. Brown K.M., Chu C.Y., Rana T.M. Target accessibility dictates the potency of human RISC. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. - V. 12. - P. 469-470.

24. Gredell J. A., Berger A.K., Walton S.P. Impact of target mRNA structure on siRNA silencing efficiency: A large-scale study // Biotechnol. Bioeng. 2008. - V. 100. - P. 744-755.

25. Holen T., Amarzguioui M., Wiiger M.T., Babaie E., Prydz H. Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger Tissue Factor // Nucleic Acids Res.-2002. V. 30. - P. 1757-1766.

26. Westerhout E.M., Berkhout B. A systematic analysis of the effect of target RNA structure on RNA interference //Nucleic Acids Res. 2007. - V. 35. - P. 4322-4330.

27. Amarzguioui M., Brede G., Babaie E., Grotli M., Sproat B., Prydz H. Secondary structure prediction and in vitro accessibility of mRNA as tools in the selection of target sites for ribozymes // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 4113-4124.

28. Berkhout B., Haasnoot J. The interplay between virus infection and the cellular RNA interference machinery // FEBS Letters. 2006. - V. 580. - P. 2896-2902.

29. Sabin L.R., Sheri L.H., CherryS. Innate antiviral immunity in Drosophila // Current Opinion in Immunology. 2010. - V. 22. - P. 4-9.

30. Voinnet О. Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections // Nat. Rev. Genet. 2005. - V. 6. - P. 206-220.

31. Wilkins C., Dishongh R., Moore S.C., Whitt M.A., Chow M., Machaca K. RNA interference is an antiviral defence mechanism in Caenorhabditis elegans // Nature. 2005. - V. 436. - P. 1044-1047.

32. Ronald P. R., Raul A. The silent treatment: RNAi as a defense against virus infection in mammals //Trends in Biotechnology. 2006.- Vol. 24, N.4. - P. 186-193.

33. Jeang K.T. RNAi in the regulation of mammalian viral infections // BMC Biol. 2012. - V. 10.-P. 58.

34. Lichner Z., Silhavy D., Burgyan J. Double-stranded RNA-binding proteins could suppress RNA interference-mediated antiviral defences // J. Gen. Virol. 2003. - V. 84. - P. 975-980.

35. O'Neill L.A., Bowie A.G. Sensing and signaling in antiviral innate immunity // Curr. Biol.2010. V. 20, N.7. - P. 328 - 333.

36. Katze M.G., He Y., Gale M. Jr. Viruses and interferon: a fight for supremacy // Nat. Rev. Immunol. -2002. V.2. - P. 675-687.

37. Bennasser Y., Le S.Y., Benkirane M., Jeang K.T. Evidence that HIV-1 encodes an siRNA and a suppressor of RNA silencing // Immunity. 2005. - V. 22. - P. 607-619.

38. Sullivan C., Ganem D. A virus-encoded inhibitor that blocks RNA interference in mammalian cells // J. Virol. 2005. - V.79. - P. 7371-7379.

39. Lecellier C.H. Dunoyer P., Arar K., Lehmann-Che J., Eyquem S., Himber C., Sai'b A., Voinnet O. A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells // Science. 2005. -V. 308. - P. 557-560.

40. Djuranovic S., Nahvi A., Green R. A parsimonious model for gene regulation by miRNAs // Science. 2011. - V. 331. - Iss. 6017. - P.550-553.

41. Wapinski O., Chang H.Y. Long noncoding RNAs and human disease // Trends Cell Biol.2011. -V. 21, N. 6. P.354-361.

42. Harries L.W. Long non-coding RNAs and human disease // Biochem Soc Trans. 2012. - V. 40. - P. 902-906.

43. Martin J., Jennifer A. Doudna A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference // Nature. 2009. - V. 457. - P. 405-412.

44. Krol J., Loedige I., Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay // Nature Reviews Genetics. 2010. - V.l 1, Iss. 9. - P. 597-610.

45. Flynt A.S., Lai E.C. Biological principles of microRNAmediated regulation: shared themes amid diversity // Nat. Rev. Genet.- 2008. V. 9. - P. 831-842.

46. Katsutomo O. Diversity of animal small RNA pathways and their biological utility // Wires RNA.-2012. V. 3.-P. 351-368.

47. Friedman R.C., Farh K.K., Burge C.B., Bartel D.P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs // Genome Res. 2009. - V. 19. - P. 92-105.

48. Garzon R., Calin G.A., Croce C.M. MicroRNAs in Cancer // Ann. Rev. Med. 2009. - V. 60.-P. 167-179.

49. Al-Ali B.M., Ress A.L., Gerger A., Pichler M. MicroRNAs in Renal Cell Carcinoma: Implications for Pathogenesis, Diagnosis, Prognosis and Therapy // Anticancer Res. 2012. - V. 32.-N. 9.-P. 3727-3732.

50. Rutnam Z.J., Yang B.B. The involvement of microRNAs in malignant transformation // Histol. Histopathol. -2012. V. 27, N. 10. P. 1263-1270.

51. Aigner A. MicroRNAs (miRNAs) in cancer invasion and metastasis: therapeutic approaches based on metastasis-related miRNAs // J. Mol. Med. 2011. - V. 89, N.5. - P. 445-457.

52. Peng W.J., Tao J.H., Mei B., Chen B., Li B.Z., Yang G.J., Zhang Q., Yao H., Wang B.X., He Q., Wang J. MicroRNA-29: a potential therapeutic target for systemic sclerosis // Expert. Opin. Ther .Targets. -2012. V. 16, N.9. - P. 875-879.

53. Cho W.C. MicroRNAs as therapeutic targets and their potential applications in cancer therapy // Expert. Opin. Ther. Targets. 2012. - V. 16., N. 8. - P. 747-759.

54. Gentner B., Naldini L. Exploiting microRNA regulation for genetic engineering // Tissue Antigens. 2012. - V. 80. - P. 393-403.

55. Ruegger S.,GroBhans H. MicroRNA turnover: when, how, and why // Trends in Biochemical Sciences. 2012. - V. 37.- N 10. - P. 436 - 446.

56. Sijen T., Fleenor J., Simmer F., Thijssen K.L., Parrish S., Timmons L., Plasterk R.H., Fire A. On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing // Cell. -2001. V.l07, N. 4.- P. 465-476.

57. Vaistij F.E., Jones L., Baulcombe D.C. Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase // Plant Cell. 2002. - V.l4, N 4. - P. 857-867.

58. Tabara H., Yigit E., Siomi H., Mello C.C. The dsRNA binding protein RDE-4 interacts with RDE-1, DCR-1, and a DExH-box helicase to direct RNAi in C. elegans // Cell. 2002. - V.109, N7.-P. 861-871.

59. Cogoni C., Macino G. Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase // Nature. 1999. - V. 399, N 6732. - P. 166-169.

60. Dalmay T., Hamilton A., Rudd S., Angell S., Baulcombe D.C. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus // Cell. 2000. - V.101, N 5. - P. 543-553.

61. Smardon A., Spoerke J.M., Stacey S.C., Klein M.E., Mackin N., Maine E.M. EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-line development and RNA interference in C. elegans // Curr. Biol. 2000. - V. 10, N 4. - P. 169-178.

62. Martens H., Novotny J., Oberstrass J., Steck T.L., Postlethwait P., Nellen W. RNAi in Dictyostelium: the role of RNA-directed RNA polymerases and double-stranded RNase // Мої. Biol. Cell. 2002. - V.13, N 2. - P. 445-453.

63. Palauqui J.C., Elmayan T., Pollien J.M., Vaucheret H. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions // EMBO J. 1997. - V.16. - P. 4738-4745.

64. Voinnet O., Vain P., Angell S., Baulcombe D.C. Systemic spread of sequence-specific transgene RNA degradation in plants is initiated by localized introduction of ectopic promoterless DNA // Cell. 1998. - V.95. - P. 177-187.

65. Winston W.M., Molodowitch C., Hunter C.P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1 // Science. 2002. - V. 295. - P. 2456-2459.

66. Roignant J.Y., Carre C., Mugat B., Szymczak D., Lepesant J.A., Antoniewski C. Absence of transitive and systemic pathways allows cell-specific and isoform-specific RNAi in Drosophila // RNA. 2003. - V. 9. - P. 299-308.

67. Timmons L., Fire A. Specific interference by ingested dsRNA // Nature. 1998. - V. 395. - P. 854.

68. Feinberg E.H., Hunter C.P. Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1 // Science. 2003. - V. 301. - P. 1545-1547.

69. Lipardi C., Wei Q., Paterson B.M. RNAi as random degradative PCR: siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs // Cell. 2001. - V.107. -N. 3. - P. 297-307.

70. Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., Sanger H.L. RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants // Cell. 1994. - V. 76. - P. 567-576.

71. Matzke M., Kanno T,. Daxinger L., Huettel B., Matzke A.J. RNA-mediated chromatin-based silencing in plants // Curr. Opin. Cell Biol. 2009. - V. 21. - P. 367-376.

72. Wierzbicki A., Haag J., Pikaard C.S. Noncoding transcription by RNA polymerase Pol IVbPol V mediates transcriptional silencing of overlapping and adjacent genes // Cell. 2008. -V. 135.-P. 635-648.

73. Wierzbicki A.T., Ream T.S., Haag J.R., Pikaard C.S. RNA polymerase V transcription guides Argonaute4 to chromatin // Nat. Genet. 2009. -V. 41. - P. 630-634.

74. He X.J, Hsu Y.F., Zhu S., Liu H.L., Pontes O., Zhu J., Cui X., Wang C.S., Zhu J.K. A conserved transcriptional regulator is required for RNA-directed DNA methylation and plant development // Genes Dev. 2009. - V. 23. - P. 2717-2722.

75. He X. J., Hsu Y.F., Zhu S., Wierzbicki A.T., Pontes O, Pikaard C.S., Liu H.L., Wang C.S., Jin H., Zhu J.K. An effector of RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis is an ARGONAUTE 4- and RNA-binding protein // Cell. 2009. - V. 137. - P. 498-508.

76. Gao Z., Liu H.L., Daxinger L., Pontes O., He X., Qian W., Lin H., Xie M., Lorkovic Z.J., Zhang S. An RNA polymerase II- and AG04-associated protein acts in RNA-directed DNA methylation // Nature. 2010. - V. 465. - P. 106-109.

77. Morris K.V., Chan S.W., Jacobsen S.E., Looney D.J. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells // Science. 2004. - V. 305. - P. 1289-1292.

78. Castanotto D., Tommasi S., Li M., Li H., Yanow S., Pfeifer G.P., Rossi J.J. Short hairpin RNAdirected cytosine (CpG) methylation of the RASSF1A gene promoter in HeLa cells // Mol. Ther. 2005. - V. 12. - P. 179-183.

79. Janowski B.A., Huffman K.E., Schwartz J.C., Ram R., Hardy D., Shames D.S., Minna J.D., Corey D.R. Inhibiting gene expression at transcription start sites in chromosomal DNA with antigene RNAs // Nat. Chem. Biol. 2005. - V. 1. - P. 216-222.

80. Volpe T.A., Kidner C., Hall I.M., Teng G., Grewal S.I., Martienssen R.A. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi // Science. 2002. V. 297.-P. 1833-1837.

81. Verdel A., Jia S., Gerber S., Sugiyama T., Gygi S., Grewal S.I., Moazed D. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex // Science. 2004. - V. 303. - P. 672-676.

82. Nakayama J., Rice J.C., Strahl B.D., Allis C.D., Grewal S.I. Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly // Science. 2001. - V. 292. - P. 110-113.

83. Sadiaie M., Iida T., Urano T., Nakayama J. A chromodomain protein, Chpl, is required for the establishment of heterochromatin in fission yeast // EMBO J. 2004. - V. 23. - P. 3825-3835.

84. Brower-Toland B., Findley S.D., Jiang L., Liu L., Yin H., Dus M., Zhou P., Elgin S.C., Lin H. Drosophila PIWI associates with chromatin and interacts directly with HP la // Genes Dev. -2007. V.21. - P. 23 00-2311.

85. Pal-Bhadra M., Leibovitch B.A., Gandhi S.G., Rao M., Bhadra U., Birchler J.A., Elgin S.C. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery // Science. 2004. - V. 303. - P. 669-672.

86. Kataoka K., Mochizuki K. Programmed DNA elimination in Tetrahymena: a small RNA-mediated genome surveillance mechanism // Adv. Exp. Med. Biol. 2011. - V. 722. - P. 156— 173.

87. Amarzguioui M., Rossi J.J., Kim D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi // FEBS Lett. 2005. - V. 579. - P. 5974-5981.

88. Poliseno L., Mercatanti A., Citti L., Rainaldi G. RNA-based drugs: from RNA interference to short interfering RNAs // Curr. Pharm. Biotechnol. 2004. - V. 5. - P. 361-368.

89. Stevenson M. Therapeutic potential of RNA interference // N. Engl. J. Med. 2004. - V. 351. -P. 1772-1777.

90. Tuschl T. Expanding small RNA interference // Nat. Biotechnol. 2002. - V. 20. - P. 446 -448.

91. Papadakis E.D., Nicklin S.A., Baker A.H., White S.J. Promoters and control elements: Designing expression cassettes for gene therapy // Curr. Gene Ther. 2004. - V. 4. - P. 89 - 113.

92. Takahashi Y., Yamaoka K., Nishikawa M., Takakura Y. Quantitative and temporal analysis of gene silencing in tumor cells induced by small interfering RNA or short hairpin RNA expressed from plasmid vectors // J. Pharm. Sci. 2009. - V. 98. - P. 74 - 80.

93. Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Shank P.R., Ramratnam B. Promoter choice affects the potency of HIV-1 specific RNA interference // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 5033-5038.

94. Choy E.Y.W., Kok K. H., Tsao S. W., Jin D. Y. Utility of Epstein-Barr virus-encoded small RNA promoters for driving the expression of fusion transcripts harboring short hairpin RNAs // Gene Ther. 2008. - V. 15. - P. 191 - 202.

95. Zhou H., Xia X.G., Xu Z., An RNA polymerase II construct synthesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator and mediates highly efficient RNAi // Nucleic Acids Res. 2005. -V. 33, N. 6. - e 62.

96. Giering J. C., Grimm D., Storm T. A., Kay M. A. Expression of shRNA from a tissuespecific pol II promoter is an effective and safe RNAi therapeutic // Mol Ther. 2008. - V. 16.-P. 1630- 1636.

97. Grimm D., Streetz K. L., Jopling C. L., Storm T. A., Pandey K., Davis C. R., Marion P., Salazar F., Kay M. A. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways // Nature. 2006. - V. 441. - P. 537 - 541.

98. Donze O., Picard D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7 RNA polymerase // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. e46.

99. Sohail M., Doran G., Riedemann J., Macaulay V., Southern E.M. A simple and cost-effective method for producing small interfering RNAs with high efficacy // Nucleic Acids Res.-2003.-V. 31.-P. e38.

100. Myers J.W., Jones J.T., Meyer T., Ferrell J.E. Recombinant dicer efficiently converts large ds RNAs into siRNAs suitable for gene silencing // Nat. Biotechnol. V. 21. - P. 324-328.

101. Buchholz F., Kittler R., Slabicki M., Theis M.Enzymatically prepared RNAi libraries // Nat. Methods. 2006. - V. 3. - P. 696-700.

102. Braasch D. A. and Corey D. R. (2002) Novel antisense and peptide nucleic acid strategies for controlling gene expression. Biochemistry. 41,4503-4510.

103. Braasch D.A., Paroo Z., Constantinescu A., Ren G., Oz O.K., Mason R.P., Corey D.R. Biodistribution of phosphodiester and phosphorothioate siRNA // Bioorg. Med. Chem. Lett.-2004.-V.14.-P. 1139-1143.

104. Chiu Y.L. and Rana T.M. siRNA function in RNAi: a chemical modification analysis // RNA. -2003. V. 9. - P. 1034-1048.

105. Haupenthal J., Baehr C., Kiermayer S., Zeuzem S., Piiper A. Inhibition of RNAse A family enzymes prevents degradation and loss of silencing activity of siRNAs in serum // Biochem. Pharmacol. 2006. - V. 71. - P. 702-710.

106. White P.J. Barriers to successful delivery of short interfering RNA after systemic administration // Clin. Exp. Pharmacol Physiol. 2008. - V. 35. - P. 1371-1376.

107. Manoharan M. RNA interference and chemically modified small interfering RNAs // Curr. Opin.Chem. Biol. -2004. V. 8. - p. 570-579.

108. Watts J.K., Deleavey G.F., Damha M.J. Chemically modified siRNA: tools and applications // Drug Discovery Today. 2008. - V. 13, N. 19/20. - P. 842-855.

109. Behlke M.A. Chemical Modification of siRNAs for In Vivo Use // Oligonucleotides. 2008. -V. 18. P.305-320.

110. Terrazas M., Kool E.T. RNA major groove modifications improve siRNA stability and biological activity // Nucleic Acids Research. 2009. - V. 37. - N. 2. - P.346-353.

111. Czauderna F., Fechtner M., Dames S., Aygun H., Klippel A., Pronk G.J., Giese K., Kaufmann J. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 2705-2716.

112. De Paula D., Bentley M.V., Mahato R.I. Hydrophobization and bioconjugation for enhanced siRNA delivery and targeting // RNA. 2007. - V. 13. - P. 431-456.

113. Hall A.H., Wan J., Shaughnessy E.E., Ramsay S.B., Alexander K.A. RNA interference using boranophosphate siRNAs: structure-activity relationships // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32.-P. 5991-6000.

114. Layzer J.M., Mccaffrey A.P., Tanner A.K., Huang Z., Kay M.A., Sullenger B.A. In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs // RNA. 2004. - V. 10. - P. 766-771.

115. Dowler T., Bergeron D., Tedeschi A.L., Paquet L., Ferrari N., Damha M.J. Improvements in siRNA properties mediated by 2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleic acid (FANA) // Nucleic Acids Res.- 2006. -V. 34. P. 1669-1675.

116. Bank S. Treating respiratory viral diseases with chemically modified, second generation intranasal siRNAs//Methods Mol. Biol. -2009. -V. 487. P. 331-341.

117. Jensen T.B., Langkjer N., Wengel J. Unlocked nucleic acid (UNA) and UNA derivatives: Thermal denaturation studies //Nucleic Acids. Symposium Series. -2008. -V. 52. P. 133-134.

118. Fisher M., Abramov M., Van Aerschot A., Xu D., Juliano R.L., Herdewijn P. Inhibition of MDR1 expression with altritol-modified siRNAs // Nucleic Acids Research. 2007. -V. 35.-P. 41064-41074.

119. O'Toole A.S., Miller S., Serra M.J. Stability of 3' double nucleotide overhangs that model the 3' ends of siRNA // RNA. 2005. - V. 11, N. 4. - P. 512-516.

120. O'Toole A.S., Miller S., Haines N., Zink M.C., Serra M.J. Comprehensive thermodynamic analysis of 3' double-nucleotide overhangs neighboring Watson-Crick terminal base pairs // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34, N. 11. - P.3338-3344.

121. Nakano S.I., Uotani Y., Uenishi K., Fujii M., Sugimoto N. Site-selective RNA cleavage by DNA bearing a base pair-mimic nucleoside//J. Am. Chem. Soc.-2005. V. 127.-P. 518-519.

122. Murao S., Diala I., Fujii M. Suppression of bcr-abl mRNA by chemically modified siRNA // Nucleic Acids. Symposium Series. 2008. - V. 52. - P. 499-500.

123. Zhang N., Tan C., Cai P., Zhang P., Zhao Y., Jiang Y. RNA interference in mammalian cells by siRNAs modified with morpholino nucleoside analogues // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2009. - V. 17. - P. 2441-2446.

124. Potenza N., Moggio L., Milano G., Salvatore V., Di Blasio B., Russo S., Messere A. RNA Interference in Mammalia Cells by RNA-3'-PNA Chimeras // Int. J. Mol. Sci. 2008. - V. 9. - P. 299-315.

125. Mikat V., Heckel A. Light-dependent RNA interference with nucleobase-caged siRNAs // RNA.-2007.-V. 13.-P. 2341-2347.

126. Shah S., Rangarajan S., Friedman S.H. Light activated RNA interference // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. - V. 44. - P. 1328-1332.

127. Poehlmann T. Development of small interfering RNA, selectively activated in target cells // RNAi Europe. 2009.

128. Eder P.S., Devine R.J., Dagle J.M., Walder J.A. Substrate specifi city and kinetics of degradation of antisense oligonucleotides by a 3' exonuclease in plasma // Antisense Res. Dev. -1991.-V. l.-P. 141-151.

129. Kennedy S., Wang D., Ruvkun G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans // Nature. 2004. - V. 427. - P. 645-649.

130. Zou Y., Tiller P., Chen I.W., Beverly M., Hochman J. Metabolite identifi cation of small interfering RNA duplex by high-resolution accurate mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008. - V. 22. - P. 1871-1881.

131. Haupenthal J., Baehr C., Zeuzem S., Piiper A. RNAse A-like enzymes in serum inhibit the anti-neoplastic activity of siRNA targeting polo-like kinase 1 // Int. J. Cancer. 2007. - V. 121, N. l.-P. 206-210.

132. Turner J.J., Jones S.W., Moschos S.A., Lindsay M.A., Gait M.J. MALDI-TOF mass spectral analysis of siRNA degradation in serum confirms an RNAse A-like activity // Mol. Biosyst. 2007. - V. 3. - P. 43-50.

133. Corey D.R. Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? // J. Clin. Invest. -2007. -V. 117. P. 3615-3622.

134. Logashenko E.B., Vladimirova A.V., Volkov A.A., Repkova M.N., Ven'Yaminova A.G., Zenkova M.A., Chernolovskaya E.L., Vlassov V.V. Suppression of MDR1 gene expression by chemically modified siRNAs // Russ. Chem. Bull. 2006. - V. 55. P. 1275-1283.

135. Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T. Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate // EMBO J.-2001.-V. 20.-P. 6877-6888.

136. Braasch D.A., Jensen S., Liu Y., Kaur K., Arar K., White M.A., Corey D.R. RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA // Biochemistry. 2003. - V. 42. -P. 7967-7975.

137. Gondi C.S., Rao J.S. Concepts in vivo siRNA delivery for cancer therapy // J. Cell. Physiol. -2009. V. 220.-P. 285-291.

138. Takahashi Y., Nishikawa M., Takakura Y. Non-viral vector mediated RNA interference: its gene-silencing characteristics and factors to achieve RNAi-based gene therapy // Advanced Drug Delivery Rev. 2009. V. 61. - P. 760 - 766.

139. Tseng Y.-Ch., Mozumbar S., Huang L. Lipid based system delivery of siRNA // Advanced Drug Delivery Rev. 2009. - V. 61. - P. 721 - 731.

140. Lu J.J., Langer R., Chen J. A novel mechanism is involved in cationic lipid-mediated functional siRNA delivery // Molecular Pharmaceutics. 2009. V. 6, N. 3. - P. 763-771.

141. Ohrt T., Schwille P. siRNA modifications and sub-cellular localization: a question of intracellular transport. // Current Pharmaceutical Design. 2008. - V. 14. - P. 3674-3685.

142. Ohrt T., Merkle D., Birkenfeld K., Echeverri C.J., Schwille P. In situ fluorescence analysis demonstrates active siRNA exclusion from the nucleus by Exportin 5 // Nucleic Acids Res. -2006.-V. 34.-N. 5.-P. 1369- 1380.

143. Liu N., Ding H., Vanderheyden J.L., Zhu Z., Zhang Y. Radiolabeling small RNA with technetium-99m for visualizing cellular delivery and mouse biodistribution // Nucl. Med. BioL-2007. V. 340. - P. 399-404.

144. Ge Q., Filip L., Bai A., Nguyen T., Eisen H.N., Chen J. Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -V. 101.-P. 8676-8681.

145. Seth S., Johns R., Templin M.V. Delivery and biodistribution of siRNA for cancer therapy: challenges and future prospects // Ther Deliv. 2012. - V. 3. - P. 245-61.

146. Gaglione M., Messere A. Recent progress in chemically modified siRNAs // Mini Rev. Med. Chem. -2010. -V. 10.-P. 578-595.

147. Burnett J.R., Barrett P.H. Apolipoprotein B metabolism: tracer kinetics, models, and metabolic studies // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2002. - V. 39. - P. 89-137.

148. Lorenz C., Hadwiger P., John M., Vornlocher H. P., Unverzagt C. Steroid and lipid conjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in liver cells // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. - V. 14. - P. 4975-4977.

149. Chiu Y.L., Ali A., Chu C.Y., Cao H., Rana T. M. Visualizing a correlation between siRNA localization, cellular uptake, and RNAi in living cells // Chem. Biol. 2004. - V. 11. - P. 11651175.

150. Potocky T.B., Menon A.K., Gellman S.H. Cytoplasmic and nuclear delivery of a TAT-derived peptide and a beta-peptide after endocytic uptake into HeLa cells // J. Biol. Chem. -2003.-V. 278.-P. 50188-50194.

151. Richard J.P., Melikov K., Vives E., Ramos C., Verbeure B., Gait M.J., Chernomordik L.V., Lebleu B. Cell-penetrating peptides. A réévaluation of the mechanism of cellular uptake // J. Biol. Chem. -2003. -V. 278. P. 585-590.

152. Muratovska A., Eccles M.R. Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells // FEBS Lett. 2004. - V. 558. - P. 63-68.

153. Hicke B.J., Stephens A.W. Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy // J. Clin. Invest. 2000. - V. 106. - P. 923-928.

154. McNamara J.O., Andrechek E.R., Wang Y., Viles K.D., Rempel R.E., Gilboa E., Sullenger B.A., Giangrande P.H. Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras // Nat. Biotechnol. -2006. V. 24. - P. 1005-1015.

155. Xia C.F., Boado R.J., Pardridge W.M. Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology // Mol. Pharm. 2009. - V. 6. - P. 747751.

156. Haley B. and Zamore P. D. Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex // Nat Struct Mol Biol. 2004. - V. 11. - P. 599-606.

157. Manoharan M. and Vornlocher H. P. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004. - V. 432. P. 173-178.

158. Xia C. F., Zhang Y., Boado R.J., Pardridge W. M. Intravenous siRNA of brain cancer with receptor targeting and avidin-biotin technology // Pharm Res. 2007. - V. 24. - P. 2309-2316.

159. Xia W., Low P. S. Folate-targeted therapies for cancer // J. Med. Chem. 2010. - V. 53. - P. 6811-6824.

160. Thomas M., Kularatne S. A., Qi L., Kleindl P., Leamon C. P., Hansen M. J., Low P. S. Ligand-targeted delivery of small interfering RNAs to malignant cells and tissues // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 2009. - V.l 175. - P. 32-39.

161. Zhang K., Wang Q., Xie Y., Mor G., Sega E., Low P. S., Huang Y. Receptor-mediated delivery of siRNAs by tethered nucleic acid base-paired interactions // RNA. 2008. - V. 14. -P. 577-583.

162. Jeong J. H., Mok H., Oh Y. K. and Park T. G. siRNA conjugate delivery systems // Bioconjug Chem. -2009. -V. 20. P. 5-14.

163. Kawakami S., Hashida M. Targeted delivery systems of small interfering RNA by systemic administration // Drug Metab. Pharmacokinet. 2007. - V. 22. - P. 142-151.

164. Leng Q., Woodle M.C., Lu P.Y., Mixson A.J. Advances in Systemic siRNA Delivery // Drugs Future. 2009. - V. 34. - P. 721.

165. Lv H., Zhang S., Wang B., Cui S., Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery // J. Control. Release. 2006. - V. 114. - P. 100-109.

166. Rose S.D., Kim D.H., Amarzguioui M., Heidel J.D., Collingwood M.A., Davis M.E., Rossi J.J., Behlke M.A. Functional polarity is introduced by Dicer processing of short substrate RNAs //Nucleic Acids Res. -2005. -V. 33. -P.4140-4156.

167. Lin S.L., Ying S.Y. Gene silencing in vitro and in vivo using intronic microRNAs // Methods Mol. Biol. 2006. - V. 342. - P. 295-312.

168. Chu C.Y., Rana T.M. Potent RNAi by short RNA triggers // RNA. 2008. - V. 14, N. 9. -P. 1714-1719.

169. Samarsky D. Development of novel RNAi therapeutic compounds and in vivo delivery approaches // RNAi Europe. 2009.

170. Guo S., Kemphues K. J. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed // Cell. 1995. - V. 81.-P. 611-620.

171. Tijsterman M., Ketting R. F., Okihara K. L., Sijen T. and Plasterk R. H. RNA helicase MUT-14-dependent gene silencing triggered in C. elegans by short antisense RNAs // Science. -2002.-V. 295.-P. 694-697.

172. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi // Cell. 2002.- V. 110. - P. 563-574.

173. Schwarz D. S., Hutvagner G., Haley B., Zamore P. D. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways // Mol. Cell. 2002. - V. 10. -P. 537-548.

174. Turner J. J., Jones S. W., Moschos S. A., Lindsay M. A., Gait M. J. MALDI-TOF mass spectral analysis of siRNA degradation in serum confirms an RNAse A-like activity // Mol. Biosyst. 2007. - V. 3. - P. 43-50.

175. Schwarz D. S., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P. D. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex // Cell. 2003. - V. 115. - P. 199-208.

176. Masquida B., Westhof E. On the wobble GoU and related pairs // RNA. 2000. - V. 6/9. -P. 15.

177. Ding H., Liao G., Wang H., Zhou Y. Asymmetrically designed siRNAs and shRNAs enhance the strand specificity and efficacy in RNAi // J RNAi Gene Silencing. 2007. - V. 4. -P. 269-280.

178. Hohjoh H. Enhancement of RNAi activity by improved siRNA duplexes // FEBS Lett. -2004.-Y. 557.-P. 193-198.

179. Hohjoh H. RNA interference (RNA(i)) induction with various types of synthetic oligonucleotide duplexes in cultured human cells // FEBS Lett. 2002. - V. 521. - P. 195-199.

180. Ma J. B., Yuan Y. R., Meister G., Pei Y., Tuschl T., Patel D. J. Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein // Nature. 2005. - V. 434. -P. 666-670.

181. Patzel V., Rutz S., Dietrich I., Koberle C., Scheffold A. and Kaufmann S. H. Design of siRNAs producing unstructured guide-RNAs results in improved RNA interference efficiency // Nat. Biotechnol. -2005. V. 23. - P. 1440-1444.

182. Kini H. K., Walton S. P. Effect of siRNA terminal mismatches on TRBP and Dicer binding and silencing efficacy // FEBS J. 2009. - V. 276. - P. 6576-6585.

183. Patzel V. In silico selection of active siRNA // Drug Discov Today. 2007. - V. 12. - P. 139-148.

184. Hu X., Hipolito S., Lynn R., Abraham V., Ramos S., Wong-Staal F. Relative gene-silencing efficiencies of small interfering RNAs targeting sense and antisense transcripts from the same genetic locus // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 4609-4617.

185. Goodbourn S, Didcock L, Randall RE. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral responses and virus countermeasures // Journal of General Virology. 2000. - V. 81. - P. 2341-2364.

186. Samuel CE. Antiviral actions of interferons // Clinical Microbiology Reviews. 2001.- V. 14.-P. 778-809.

187. Sen G.C. Viruses and interferons // Annual Review of Microbiology. 2001. - V. 55. - P. 255-281.

188. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R.G., Silverman R.H., Schreiber R.D. How cells respond to interferons // Annual Review of Biochemistry. 1998. - V. 67. - P. 227-64.

189. Castelli J.C., Hassel B.A., Wood K.A., Li X.L., Amemiya K., Dalakas M.C. Torrence P.F., Youle R.J. A study of the interferon antiviral mechanism: Apoptosis activation by the 2-5A system // Journal of Experimental Medicine. 1997. - V. 186. - P. 967-72.

190. Clemens M.J. PKR A protein kinase regulated by double-stranded RNA // International Journal of Biochemistry & Cell Biology. - 1997. - V. 29. - P. 945-949.

191. Matsumoto M., Funami K., Oshiumi H., Seya T. Toll-like receptor 3: A link between tolllike receptor, interferon and viruses // Microbiology and Immunology. 2004. - V. 48. - P. 14754.

192. Sen G.C., Sarkar S.N. Transcriptional signaling by double-stranded RNA: role of TLR3 // Cytokine & Growth Factor Reviews. 2005. - V. 16. - P. 1-14.

193. Meurs E., Chong K., Galabru J., Thomas N.S.B., Kerr I.M., Williams B.R.G., Hovanessian A.G. Molecular-Cloning and Characterization of the Human Double-Stranded-Rna Activated Protein-Kinase Induced by Interferon // Cell. 1990. - V. 62. - P. 379-90.

194. Gil J., Esteban M. Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): Mechanism of action // Apoptosis. 2000. - V. 5. - P. 107-14.

195. Hartmann R., Justesen J., Sarkar S.N., Sen G.C., Yee V.C. Crystal structure of the 2 specific and double-stranded RNA-activated interferon-induced antiviral protein 2 '-5 oligoadenylate synthetase // Molecular Cell. 2003. - V. 12. - P. 1173-85.

196. Dong B.H., Silverman R.H. 2-5A-Dependent Rnase Molecules Dimerize During Activation by 2-5A // Journal of Biological Chemistry. 1995. - V. 270. - P. 4133-4137.

197. Li X.L., Blackford J.A., Hassel B.A. RNase L mediates the antiviral effect of interferon through a selective reduction in viral RNA during encephalomyocarditis virus infection // Journal of Virology. 1998. - V. 72. - P. 2752-2759.

198. Takeda K., Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors // Annual Review of Immunology. -2003. -V.21.-P. 335-376.

199. Alexopoulou L., Holt A.C., Medzhitov R., Flavell R.A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by Toll-like receptor 3 // Nature.- 2001. V. 413. - P. 732738.

200. Zeng Y., Yi R., Cullen B.R: MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003.-V.100. P. 9779-9784.

201. Doench J.G., Petersen C.P., Sharp P.A. siRNAs can function as miRNAs // Genes Dev.-2003.-V. 17.-P. 438-442.

202. Lim L.P., Lau N.C., Garrett-Engele P., Grimson A., Schelter J.M., Castle J., Bartel D.P., Linsley P.S., Johnson J.M. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs // Nature. 2005. - V. 433. - P. 769-773.

203. Minks M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of 2',5'-01igo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa-cells // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 180-183.

204. Robinson M., Judge A., MacLachlan J. siRNA and Innate Immunity // Oligonucleotides. -2009.-V. 19.-P. 89-101.

205. Hornung V., Ellegast J., Kim S., Brzozka K., Jung A., Kato H., Poeck H., Akira S., Conzelmann K.K., Schlee M., Endres S., Hartmann G. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I // Science. 2006. - V. 314. - P. 994-997.

206. Schlee M., Hornung V., Hartmann G. siRNA and isRNA: two edges of one sword // Mol. Ther. -2006. V. 14. - P. 463-470.

207. Marques J.T., Williams B.R.G. Activation of the mammalian immune system by siRNAs // Nat. Biotechnol. -2005. V. 23. P. 1399-1405.

208. Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., Mcclintock K., Maclachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA // Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 457-462.

209. Kim D.H., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J.J. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase // Nat. Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 321-325.

210. Reynolds A., Anderson E.M., Vermeulen A., Fedorov Y., Robinson K., Leake D., Karpilow J., Marshall W.S., Khvorova A. Induction of the interferon response by siRNA is cell typeand duplex length-dependent // RNA. 2006. - V. 12. P. 988-993.

211. Diebold S.S., Massacrier C., Akira S., Paturel C., Morel Y., Reis E., Sousa C. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defi ned by the presence of uridine ribonucleotides // Eur. J. Immunol. 2006. -V. 36. - P. 3256-3267.

212. Judge A., MacLachlan I. Overcoming the innate immune response to small interfering RNA // Hum. Gene Ther. 2008. - V. 19. - P. 111-124.

213. Judge A.D., Bola G., Lee A.C., Maclachlan I. Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo // Mol. Ther. 2006. - V. 13. - P. 494-505.

214. Cekaite L., Furset G., Hovig E., Sioud M. Gene expression analysis in blood cells in response to unmodified and 2'-modified siRNAs reveals TLR-dependent and independent effects //J. Mol. Biol. -2007. -V. 365. P. 90-108.

215. Kariky K., Buckstein M., Ni H., Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA // Immunity. 2005. -V. 23. P. 165-175.

216. Robbins M., Judge A., Liang L., Mcclintock K., Yaworski E., MacLachlan I. 2'-0-methylmodified RNAs act as TLR7 antagonists // Mol Ther. 2007.- V. 15, N. 9. - P. 16631669.

217. Jackson A.L., Bartz S.R.", Schelter J., Kobayashi S.V., Burchard J., Mao M., Li B., Cavet G., Linsley P.S. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi // Nat. Biotechnol. -2003.-V. 21.-P. 635-637.

218. Jackson A.L., Burchard J., Schelter J., Chau B.N., Cleary M., Lim L., Linsley P.S. Widespread siRNA "off-target" transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity // RNA. 2006. - V. 12. - P. 1179-1187.

219. Chen P.Y., Weinmann L., Gaidatzis D., Pei Y., Zavolan M., Tuschl T., Meister G. Strand-specific 5'-0-methylation of siRNA duplexes controls guide strand selection and targeting specificity // RNA. 2008. - V. 14. - P. 263-274.

220. Miller V.M., Gouvion C.M., Davidson B.L., Paulson H.L., Targeting Alzheimer's disease genes with RNA interference: an efficient strategy for silencing mutant alleles // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 661-668.

221. Miller V.M., Xia H., Marrs G.L., Gouvion C.M., Lee G., Davidson B.L., Paulson H.L. Allele-specific silencing of dominant disease genes. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. - V. 100.-P. 7195-7200.

222. Ding H., Schwarz D.S., Keene A., Affar B., Fenton L., Xia X., Shi Y., Zamore P.D., Xu Z. Selective silencing by RNAi of a dominant allele that causes amyotrophic lateral sclerosis // Aging Cell. V. 2. - 2003. - P. 209-217.

223. Schwarz D.S., Ding H., Kennington L., Moore J.T., Schelter J., Burchard J., Linsley P.S., Aronin N., Xu Z., Zamore P.D. Designing siRNA that distinguish between genes that differ by a single nucleotide // PLoS Genet. 2006. - V. 2, N. 9. - e 140.

224. McCaffrey A.P., Nakai H., Pandey K., Huang Z., Salazar F.H., Xu H., Wieland S.F., Marion P.L., Kay M.A. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference // Nat. Biotechnol. 2003. - V. 21. - P. 639-644.

225. Randall G., Grakoui A., Rice C.M. Clearance of replicating hepatitis C virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. - V. 100. - P. 235-240.

226. Kapadia S.B., Brideau-Andersen A., Chisari F.V. Interference of hepatitis C virus RNA replication by short interfering RNAs // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. - V. 100. - P. 20142018.

227. Skye J. Zeller, Priti Kumar. RNA-based Gene therapy for the treatment and Prevention of HiV: From Bench to Bedside // Y. J. of Biol, and Med. 2011. -V. 84. - P. 301-309.

228. Boden D., Pusch O., Lee F., Tucker L., Ramratnam B. Human immunodeficiency virus type 1 escape from RNA interference // J. Virol. -2003. V. 77. - P.l 1531-11535.

229. Surabhi R.M., Gaynor R.B. RNA interference directed against viral and cellular targets inhibits human immunodeficiency Virus Type 1 replication // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 12963-12973.

230. Novina C.D., Murray M.F., Dykxhoorn D.M., Beresford P.J., Riess J., Lee S.K., Collman R.G., Lieberman J., Shankar P., Sharp P.A. siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection // Nat. Med. 2002. - V. 8. - P. 681-686.

231. Bishop J.M. Retroviruses and Cancer Genes // Advances in Cancer Research. 1982. - V. 37.-P. 1-32.

232. Dive C. Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance // Journal of Internal Medicine. 1997. - V. 242. - P. 139-45.

233. Campbell S.L., Khosravi-Far R., Rossman K.L., Clark G.J. Der C.J. Increasing complexity of Ras signaling // Oncogene. 1998. - V. 17. - P. 1395-413.

234. Albertson D.G., Collins C., McCormick F., Gray J.W. Chromosome aberrations in solid tumors //Nature Genetics. 2003. - V. 34. - P. 369-76.

235. Bernhard E.J., Muschel R.J., Hughes E.N. Mr 92,000 Gelatinase Release Correlates with the Metastatic Phenotype in Transformed Rat Embryo Cells // Cancer Research. 1990. - V. 50.-P. 3872-3877.

236. Dvorak H.F., Brown L.F., Detmar M., Dvorak A.M. Vascular-Permeability Factor Vascular Endothelial Growth-Factor, Microvascular Hyperpermeability, and Angiogenesis // American Journal of Pathology. 1995. - V. 146. - P.1029-39.

237. Sulic S., Panic L., Dikic I., Volarevic S. Deregulation of cell growth and malignant transformation // Croatian Medical Journal. 2005. - V. 46. - P. 622-38.

238. Gurzov E.N., Izquierdo M. RNA interference against Heel inhibits tumor growth in vivo // Gene Ther.-2006.-V. 13.-P.1-7.

239. McNamara J.O., Andrechek E.R., Wang Y., Viles K.D., Rempel R.E., Gilboa E., Sullenger B.A., Giangrande P.H. Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras // Nat. Biotechnol. -2006. V. 24. - P. 1005-1015.

240. Takei Y., Kadomatsu K., Yuzawa Y., Matsuo S., Muramatsu T. A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics // Cancer Res. 2004. - V. 64. -P. 3365-3370.

241. Saad M., Garbuzenko O.B., Minko T. Co-delivery of siRNA and an anticancer drug for treatment of multidrug-resistant cancer // Nanomedicine. 2008. - V. 3. - P.761e76.

242. Kaneshiro T.L., Lu Z.R. Targeted intracellular codelivery of chemotherapeutics and nucleic acid with a well-defined dendrimer-based nanoglobular carrier // Biomaterials. 2009. - V.30. -P. 5660e6.

243. Schneider E., Paul D., Ivy P., Cowan K.H. Multidrug resistance. // Cancer Chemother. Biol. Response Modif. 1999. -V. 18. - P. 152 - 177.

244. Gottesman M. M., Fojo T., Bates S. E. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters // Nat. Rev. Cancer. 2002. - V.2, № 1. - P. 48-58.

245. Kruh G. D., Belinsky M. G. The MRP family of drug efflux pumps // Oncogene. 2003.-V.22, № 47. - P. 7537-7552.

246. Doyle L. A., Ross D. D. Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP (ABCG2) // Oncogene. 2003. - V.22, № 47. - P. 7340-7358.

247. Scotto K.W. // Oncogene. 2003. - V. 22. - P. 7496.

248. Stavrovskaya A.A. // Biochemistry. 2000. - V. 65. - P. 95.

249. Tsuruo T., Iida H., Tsukagoshi S., Sakurai Y. Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil // Cancer Res. 1981. - V. 41. - P. 1967-1972.

250. Twentyman P.R., Fox N.E., White D.J. Cyclosporine A and its analogues as modifiers as adriamycin and vincristine resistance in a multidrug resistant human lung cancer cell line // Br. J. Cancer. 1987. - V. 56. - P. 55-57.

251. Twentyman P.R., Bieehen N.M. Resistance modification by PSC-833, a novel non-immunosuppressive cyclosporine // Eur. J. Cancer. 1991. - V. 27. - P. 1639-1642.

252. Krishna R., Mayer L.D. Multidrug resistance (MDR) in cancer. Mechanisms, reversal using modulators of MDR and the pharmacokinetics of anticancer drugs // Eur. J. Pharm. Sci. 2000. -V. 11.-P. 265-283.

253. Wandel C., Kim R.B., Kajiji S. et. al. P-glycoprotein and cytochrome P-450 3A inhibition: dissociation of inhibitory potencies // Cancer Res. 1999. - V. 59. - P.3944-3948.

254. Dantzig A.H., Law K.L., Starling J.J. Reversal of multidrug resistance by the P-glycoprotein modulator, LY335979, from the bench to the clinic // Curr. Med. Chem. 2001. -V. 8.-P. 39-50.

255. Kuppens I.E.L.M., Witteveen E.O., Jewell R.C. et. al. A Phase I, randomaized, open-label,parallel-cohort, dose-finding study of elacridar (GF120918) and oral topotecan in cancer patients // Clin. Cancer Res. -2007. -V. 13. P. 3276-3285.

256. Oldham R.K., Reid W.K., Barnett D. Phase I study of CBT-1 and Taxol in patients with Taxol resistant cancers // Cancer Biother. Radiopharm. 2000. - V. 15. - P. 153-159.

257. Agrawal M., Abraham J., Balis F.M. et. al. Increased 99mTc-sestambi accumulation in normal liver and drug-resistant tumors after the administration of the glycoprotein inhibitor, XR9576 // Clin. Cancer Res. 2003. - V. 9. - P. 650-656.

258. Wu H., Hait W.N., Yang J.-M. Small interfering RNA-induced suppression of MDR1 (P-Glycoprotein) restores sensitivity to multidrug-resistant cancer cells // Cancer Res. 2003. - V. 63.-P. 1515-1519.

259. Duan Z., Brakora K.A., Seiden M.V. Inhibition of ABCB1 (MDR1) and ABCB4 (MDR3) expression by small interfering RNA and reversal of paclitaxel resistance in human ovarian cancer cells // Mol. Cancer Ther. 2004. - V. 3. - P. 833-838.

260. Ee P.L., He X., Ross D.D., Beck W.T. Modulation of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) gene expression using RNA interference // Mol. Cancer Ther. 2004. - V. 3. -P.1577-1583.

261. Stierle V., Laigle A., Jolles B. Modulation of MDR1 gene expression in multidrug resistant MCF7 cells by low concentration of small interfering RNAs // Biochem. Pharmacol. 2005. -V. 70.-P. 1424-1430.

262. Stein U., Walther W., Stege A. et. al. Complete in vivo reversal of the multidrug resistance phenotype by jet-injection of anti-MDRl short hairpin RNA-encoding plasmid DNA // Mol. Ther.-2008.-V. 16.-P. 178-186.

263. Xiao H., Wu Z., Shen H. et. al. In vivo reversal of P-glycoprotein-mediated multidrugresistance by efficient delivery of stealth RNAi // Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 2008. - V. 103.-P. 342-348.

264. Sepp-Lorenzino L., Ruddy M.K. Challenges and opportunities for local and systemic delivery of siRNA and antisense oligonucleotides // Nature. 2008. - V. 84. - P. 628-632.

265. Dang C.V. C-MYC target genes involved in cell growth, apoptosis, and metabolism // Mol. Cell Biol.-1999. -V. 19.-P. 1-11.

266. DePinho R.A., Schreiber-Agus N., Alt F.W. myc family oncogenes in the development of normal and neoplastic cells // Adv. Cancer Res. -1991. -V. 57. P. 1-46.

267. Felsher D.W., Bishop J.M. Reversible tumorigenesis by MYC in hematopoietic lineages // Mol. Cell. 1999. - V. 4. - P. 199-207.

268. Shachaf C.M., Kopelman A.M., Arvanitis C., Karlsson A., Beer S., Mandl S., Bachmann M.H., Borowsky A.D., Ruebner B., Cardiff R.D., Yang Q., Bishop J.M., Contag C.H., Felsher

269. Pelengaris S., Khan M., Evan G.I. Suppression of Myc-induced apoptosis in beta cells exposes multiple oncogenic properties of Myc and triggers carcinogenic progression // Cell. -2002.-V. 109.-P. 321-334.

270. Jonkers J., Berns A. Oncogene addiction: sometimes a temporary slavery // Cancer Cell 2004.-V. 6.-P. 535-538.

271. Felsher D.W., Bishop J.M. Transient excess of MYC activity can elicit genomic instability and tumorigenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 3940-3944.

272. Jain M., Arvanitis C., Chu K., Dewey W., Leonhardt E., Trinh M., Sundberg C.D., Bishop J.M., Felsher D.W. Sustained loss of a neoplastic phenotype by brief inactivation of MYC // Science. 2002. - V. 297. - P. 102-104.

273. Iversen P.L., Arora V., Acker A.J., Mason D.H., Devi G.R. Efficacy of antisense morpholino oligomer targeted to C-MYC in prostate cancer xenograft murine model and a Phase I safety study in humans // Clin. Cancer Res. 2003. - V. 9. - P. 2510-2519.

274. Karlsson A., Deb-Basu D., Cherry A., Turner S., Ford J., Felsher D.W. Defective doublestrand DNA break repair and chromosomal translocations by MYC overexpression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - P. 9974-9979.

275. Fest T., Mougey V., Dalstein V., Hagerty M., Milette D., Silva S., Mai S. C-MYC overexpression in Ba/F3 cells simultaneously elicits genomic instability and apoptosis // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 2981-2990.

276. Wang Y.H., Liu S., Zhang G., Zhou C.Q., Zhu H.X., Zhou X.B., Quan L.P., Bai J.F., Xu N.Z. Knockdown of C-MYC expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo // Breast Cancer Res. 2005. - V. 7. - P. R220-R228.

277. Demeterco C., Itkin-Ansari P., Tyrberg B., Ford L.P., Jarvis R.A., Levine F. C-MYC controls proliferation versus differentiation in human pancreatic endocrine cells // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. - V. 87. - P. 3475-3485.

278. Gao X., Wang H., Sairenji T. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation by short interfering RNAs targeting p38 mitogen-activated protein kinase or C-MYC in EBV-positive epithelial cells // J. Virol. 2004. - V. 78. - P. 1798-11806

279. Shen L., Zhang C., Ambrus J.L., Wang J.H. Silencing of human C-MYC oncogene expression by poly-DNP-RNA // Oligonucleotides. 2005. - V. 15. - P. 23-35.

280. Yarden Y. Biology of HER2 and Its Importance in Breast Cancer // Oncology. 2001. -V.61.-P. 1-13.

281. Jardines L., Weiss M., Fowble B., Greene M. Neu (c-erbB-2/HER2) and the epidermal growth factor receptor (EGFR) in breast cancer // Pathobiology. 1993. - V. 61. - P. 268-282.

282. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., Mcguire W.L. Human-Breast Cancer Correlation of Relapse and Survival with Amplification of the Her-2 Neu Oncogene // Science. - 1987. - V. 235. - P. 177-82.

283. Khasraw M., Bell R. Primary systemic therapy in HER2-amplified breast cancer: a clinical review // Expert Rev Anticancer Ther. 2012. - V. 12. - P. 1005-1013.

284. Ren S., Wang J., Zhang L. Effects of Her-2/neu siRNA-mediated gene silencing on cell cycle and apoptosis of lung adenocarcinoma cells // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2005. - V. 85. -P.1530-1534.

285. Kern J.A., Robinson R.A., Gazdar A., Torney L., Weiner D.B. Mechanisms of P185(Her2) Expression in Human Non-Small-Cell Lung-Cancer Cell-Lines // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1992. - V. 6. - P. 359-63.

286. Roh H., Pippin J., Green D., Boswell C.B., Hirose C.T., Mokadam N., Drebin J.A. HER2/neu antisense targeting of human breast carcinoma // Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 6138-6143.

287. Roh H., Pippin J., Drebin J. Down-regulation of HER2/neu expression induces apoptosis in human cancer cells that overexpress HER2/neu // Cancer Res. 2000. - V. 60. P. 560-565.

288. Ross J., Fletcher J. The HER-2/neu oncogene in breast cancer: prognostic factor, predictive factor, and target for therapy // Stem Cells. -1998. V. 16. - P. 413^428.

289. Faltus T., Yuan J., Zimmer B., Krämer A., Loibl S., Kaufmann M., Strebhardt K. Silencing of the HER2/neu gene by siRNA inhibits proliferation and induces apoptosis in HER2/neu-overexpressing breast cancer cells // Neoplasia.- 2004. V. 6. - P. 786-795.

290. Li J., Meyer A.N., Donoghue D.J. Nuclear localization of cyclin B1 mediates its biological activity and is regulated by phosphorylation. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. - V. 94. - P. 502-507.

291. Toyoshima F., Moriguchi T., Wada A., Fukuda M., Nishida E. Nuclear export of cyclin B1 and its possible role in the DNA damage-induced G(2) checkpoint // EMBO Journal. 1998. - V. 17.-P. 2728-35.

292. Yang J., Song H.B., Walsh S., Bardes E.S.G., Kornbluth S. Combinatorial control of cyclin B1 nuclear trafficking through phosphorylation at multiple sites // Journal of Biological Chemistry. 2001. - V. 276. - P. 3604-3609.

293. Lehner C.F., Ofarrell P.H. The Roles of Drosophila Cyclin-A and Cyclin-B in Mitotic Control // Cell. 1990. - V. 61. - P. 535-547.

294. Shen M.L., Feng Y.D., Gao C., Tao D.D., Hu J.B., Reed E., Li Q.Q., Gong J. Detection of cyclin B1 expression in G(l)-phase cancer cell lines and cancer tissues by postsorting western blot analysis // Cancer Research. 2004.- V. 64. - P. 1607-1610.

295. Park M„ Chae H.D., Yun J., Jung M., Kim Y.S., Kim S.H., Han M.H., Shin D.Y. Constitutive activation of cyclin B1 -associated cdc2 kinase overrides p53-mediated G(2)-M arrest // Cancer Research. -2000. V. 60. - P. 542-545.

296. Yin X.Y., Grove L., Datta N.S., Katula K., Long M.W., Prochownik E.V. Inverse regulation of cyclin B1 by C-MYC and p53 and induction of tetraploidy by cyclin B1 overexpression // Cancer Research. 2001. - V. 61. - P. 6487-6493.

297. Sarafan-Vasseur N., Lamy A., Bourguignon J., Le Pessot F., Hieter P., Sesboue R., Bastard C., Frebourg T., Flaman J.M. Overexpression of B-type cyclins alters chromosomal segregation // Oncogene. 2002. - V. 21. - P. 2051-2057.

298. Korenaga D., Takesue F., Yasuda M., Honda M., Nozoe T., Inutsuka S. The relationship between cyclin B1 overexpression and lymph node metastasis in human colorectal cancer // Surgery. 2002. - V. 131. - P. S114-S120.

299. Soria J.C., Jang S.J., Khuri F.R., Hassan K., Lin D., Hong W.K., Mao L. Overexpression of cyclin B1 in early-stage non-small cell lung cancer and its clinical implication // Cancer Research. 2000. - V. 60. - P. 4000-4004.

300. Hassan K.A., El-Naggar A.K., Soria J.C., Liu D., Hong W.K., Mao L. Clinical significance of cyclin B1 protein expression in squamous cell carcinoma of the tongue // Clinical Cancer Research. 2001. - V. 7. - P. 2458-62.

301. Hassan K.A., Ang K.K., El-Naggar A.K., Story M.D., Lee J.I., Liu D.,.Hong W.K., Mao L. Cyclin B1 overexpression and resistance to radiotherapy in head and neck squamous cell carcinoma // Cancer Research. 2002. - V. 62. - P. 6414-6417.

302. Takeno S., Noguchi T., Kikuchi R., Uchida Y., Yokoyama S., Muller W. Prognostic value of cyclin B1 in patients with esophageal squamous cell carcinoma // Cancer. 2002. - V. 94. - P. 2874-81.

303. Dong Y.Y., Sui L., Watanabe Y., Sugimoto K., Tokuda M. Clinical relevance of cyclin B1 overexpression in laryngeal squamous cell carcinoma // Cancer Letters. 2002. - V. 177. - P. 1319.

304. Nishizuka Y. Intracellular Signaling by Hydrolysis of Phospholipids and Activation of Protein-Kinase-C // Science. 1992. - V. 258. - P. 607-14.

305. Parekh D.B., Ziegler W., Parker PJ. Multiple pathways control protein kinase C phosphorylation // EMBO Journal. 2000. - V. 19. - P. 496-503.

306. Ikuta S., Edamatsu H., Li M., Hu L., Kataoka T. Crucial role of phospholipase C epsilon in skin inflammation induced by tumor-promoting phorbol ester // Cancer Res. 2008. - V. 68. P. 64-72.

307. Weichert W., Gekeler V., Denkert C., Dietel M., Hauptmann S. Protein kinase C isoform expression in ovarian carcinoma correlates with indicators of poor prognosis // International Journal of Oncology. 2003. - V. 23. - P. 633-639.

308. Sharif T.R., Sharif M. Overexpression of protein kinase C epsilon in astroglial brain tumor derived cell lines and primary tumor samples // International Journal of Oncology. 1999. - V. 15.-P.237-43.

309. Alvaro V., Touraine P., Vozari R.R., Baigrenier F., Birman P., Joubert D. Protein-Kinase-C Activity and Expression in Normal and Adenomatous Human Pituitaries // International Journal of Cancer. 1992. - V. 50. - P. 724-30.

310. Castanotto D., Rossi J.J. The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics //Nature. 2009. - V. 457. - P. 426-433.

311. Lares M.R., Rossi J.J., Ouellet D.L. RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications // Trends in Biotechnology. 2010. - V. 28. - P. 570-579.

312. Kaufmann J., Ahrens K., Santel A. RNA interference for therapy in the vascular endothelium // Microvascular Research. 2010. - V. 80. - P. 286-293.

313. Dejneka N.S., Wan S.H., Bond O.S., Kornbrust D.J., Reich S.J. Ocular biodistribution of bevasiranib following a single intravitreal injection to rabbit eyes. // Molecular Vision. 2008. -V. 14.-P. 997-1005.

314. Davis M.E., Zuckerman J.E., Yuk

315. C.H., Seligson D., Tolcher A., Alabi C.A., Yen Y., Heidel J.D., Ribas A. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles // Nature. 2010. - V. 464. - P.1067-U140.

316. Keller M. Nanomedicinal delivery approaches for therapeutic siRNA // International Journal of Pharmaceutics. 2009. - V. 379. - P. 210-211.

317. Lam J.K., Liang W., Chan H.K. Pulmonary delivery of therapeutic siRNA // Adv. Drug Deliv. Rev. 2011. - V. 64, N. 1. - P. 1 - 15.

318. Oh Y.K., Park T.G. siRNA delivery systems for cancer treatment // Advanced Drug Delivery Reviews. -2009. V. 61. - P. 850-62.

319. Dannull J., Lesher D.T., Holzknecht R, Qi W., Hanna G., Seigler H., Tyler D.S., Pruitt S.K. Immunoproteasome down-modulation enhances the ability of dendritic cells to stimulate antitumor immunity // Blood. 2007. - V. 110. - P. 4341-50.

320. Fojo A. T., Ueda K., Slamon D. J., Poplack D. G., Gottesman M. M., Pastan I. Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84, № 1. - P. 265-269.

321. Fojo A.T., Whang-Peng J., Gottesman M. M., Pastan I. Amplification of DNA sequences in human multidrug-resistant KB carcinoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V.82, № 22.-P. 7661-7665.

322. Bellon L. Oligoribonucleotides with 2'-0-(tert-butyldimethylsilyl) groups // Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem. 2000. - Ch. 3, Unit 3.6.

323. Milligan J.F., Groebe D.R., Witherell G.W., Uhlenbeck O.C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 РНК polymerase and synthetic DNA templates // Nucleic Acids Res. 1987. - V. 15. -P. 8783-8798.

324. Власов А. В., Власов В. В., Жьеже Р. Катализируемый имидазолом гидролиз РНК как реакция для исследования вторичной структуры РНК и комплексов РНК с олигонуклеотидами // Докл. АН. 1996. - № 349. - С. 411-413.

325. Donis-Keller Н., Maxam А. М., Gilbert W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in РНК // Nucleic Acids Res. 1977. - V.4, № 8. - P. 2527-2538.

326. Пирс Э. // Гистохимия. М.:Иностранная Литература, 1962. - 962 с.

327. Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. Inexpensive SDS Phenol Method for РНК Extraction from Tissues // Biotechniques. 1993. - V. 15. - P. 24-27.

328. Overhoff M., Aiken M., Far R. K., Lemaitre M., Lebleu В., Sczakiel G., Robbins I. Local RNA target structure influences siRNA efficacy: a systematic global analysis // J. Mol. Biol. -2005. V.348, № 4. - P. 871-881.

329. Heale B. S., Soifer H. S., Bowers C., Rossi J. J. siRNA target site secondary structure predictions using local stable substructures // Nucleic Acids Res. 2005. - V.33, № 3. - P. e30.

330. Ding Y., Chan C. Y., Lawrence С. E. Sfold web server for statistical folding and rational design of nucleic acids //Nucleic Acids Res. 2004. - V.32, № W135-141.

331. Ding Y., Lawrence С. E. Statistical prediction of single-stranded regions in RNA secondary structure and application to predicting effective antisense target sites and beyond // Nucleic Acids Res. 2001. - V.29, № 5. - P. 1034-1046.

332. Demeterco C., Itkin-Ansari P., Tyrberg B., Ford L. P., Jarvis R. A., Levine F. C-MYC controls proliferation versus differentiation in human pancreatic endocrine cells // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. - V.87, № 7. - P. 3475-3485.

333. Harborth J., Elbashir S. M., Bechert K., Tuschl T., Weber K. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs // J. Cell Sci. 2001. - V.114, Pt 24. - P. 4557-4565.

334. Cohen D., Yang C. P., Horwitz S. B. The products of the mdrla and mdrlb genes from multidrug resistant murine cells have similar degradation rates // Life Sci. 1990. - V.46, № 7. -P. 489-495.

335. Richert N. D., Aldwin L., Nitecki D., Gottesman M. M., Pastan I. Stability and covalent modification of P-glycoprotein in multidrug-resistant KB cells // Biochemistry. 1988. - V.27, №20. -P. 7607-7613.

336. Muller C., Laurent G., Ling V. P-glycoprotein stability is affected by serum deprivation and high cell density in multidrug-resistant cells // J. Cell Physiol. 1995. - V.163, № 3. - P. 538-544.

337. Krishan A., Fitz C. M., Andritsch I. Drug retention, efflux, and resistance in tumor cells // Cytometry. 1997. - V.29, № 4. - P. 279-285.

338. Kretschmer-Kazemi Far R., Sczakiel G. The activity of siRNA in mammalian cells is related to structural target accessibility: a comparison with antisense oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 2003. - V.31, № 15. - P. 4417-4424.

339. Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W. S., Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference // Nat. Biotechnol. 2004. - V.22, № 3. - P. 326-330.

340. Chaudhary P. M., Roninson I. B. Activation of MDR1 (P-glycoprotein) gene expression in human cells by protein kinase C agonists // Oncol. Res. 1992. - V.4., № 7. p. 281-290.

341. Chaudhary P. M., Roninson I. B. Induction of multidrug resistance in human cells by transient exposure to different chemotherapeutic drugs // J. Natl. Cancer Inst. 1993. - V.85, № 8 - P. 632-639.

342. Christians U., Spiekermann K., Bader A., Schottmann R., Linck A., Wonigeit K., Sewing K. F., Link H. Cyclosporine metabolite pattern in blood from patients with acute GVHD after BMT // Bone Marrow Transplant. 1993. - V. 12, № 1. - P. 27-33.

343. Nieth C., Priebsch A., Stege A., Lage H. Modulation of the classical multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi) // FEBS Lett. 2003. - V.545, № 2-3. - P. 144150.

344. Holm P. S., Dietel M., Krupp G. Similar cleavage efficiencies of an oligoribonucleotide substrate and an mdrl mRNA segment by a hammerhead ribozyme // Gene. 1995. - V.167, № 1-2.-P. 221-225.

345. Holm P. S., Scanlon K. J., Dietel M. Reversion of multidrug resistance in the P-glycoprotein-positive human pancreatic cell line (EPP85-181RDB) by introduction of a hammerhead ribozyme // Br. J. Cancer. 1994. - V.70, № 2. - P. 239-243.

346. Sulic S, Panic L, Dikic I, Volarevic S. Deregulation of cell growth and malignant transformation // Croatian Medical Journal. 2005. - V. 46. - P. 622-38.

347. Sandhu C, Slingerland J. Deregulation of the cell cycle in cancer // Cancer Detection and Prevention. 2000. - V. 24. - P. 107-18.

348. Yarden Y. Biology of HER2 and its importance in breast cancer // Oncology. 2001. - V. 61.-P. 1-13.

349. Aaltonen K, Amini RM, Heikkila P, Aittomaki K, Tamminen A, Nevanlinna H, Blomqvist C. High cyclin B1 expression is associated with poor survival in breast cancer // British Journal of Cancer. 2009. - V. 100. - P. 1055-60.

350. Kang J.H., Rychahou P.G., Ishola T.A., Qiao J.B., Evers B.M., Chung D.H. MYCN silencing induces differentiation and apoptosis in human neuroblastoma cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. - V. 351. - P. 192-197.

351. Yuan J.P., Yan R.L., Kramer A., Eckerdt F., Roller M., Kaufmann M., Strebhardt K. Cyclin B1 depletion inhibits proliferation and induces apoptosis in human tumor cells // Oncogene. -2004.-V. 23.-P. 5843-5852.

352. Nishizuka Y. The Role of Protein Kinase-C in Cell-Surface Signal Transduction and Tumor Promotion//Nature. 1984. - V. 308. - P. 693-698.

353. Wu T.T., Hsieh Y.H., Hsieh Y.S., Liu J.Y. Reduction of PKC alpha decreases cell proliferation, migration, and invasion of human malignant hepatocellular carcinoma // Journal of Cellular Biochemistry. 2008. - V. 103. - P. 9-20.

354. Roh H., Pippin J., Drebin J.A. Down-regulation of HER2/neu expression induces apoptosis in human cancer cells that overexpress HER2/neu // Cancer Research. 2000. - V. 60. - P. 560-5.

355. Roh H., Pippin J.A., Green D.W., Boswell C.B., Hirose C.T., Mokadam N., Drebin J.A. HER2/neu antisense targeting of human breast carcinoma // Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 6138-43.

356. Ross J.S., Fletcher J.A. The HER-2/neu oncogene in breast cancer: Prognostic factor, predictive factor, and target for therapy // Stem Cells. 1998. - V. 16. - P. 413-28.

357. Ross J.S., Fletcher J.A. The HER-2/neu oncogene: prognostic factor, predictive factor and target for therapy // Seminars in Cancer Biology. 1999. - V. 9. - P. 125-38.

358. McKenzie S.J. Diagnostic utility of oncogenes and their products in human cancer // Biochim Biophys Acta. -1991. V. 1072. - P. 193-214.

359. Konopka J.B., Witte O.N. Detection of c-abl tyrosine kinase activity in vitro permits direct comparison of normal and altered abl gene products // Mol. Cell. Biol. 1985. - V. 5. - P. 311623.

360. Konopka J.B., Witte O.N. Activation of the abl oncogene in murine and human leukemias // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - V. 823. - P. 1-17.

361. Davis R.L., Konopka J.B., Witte O.N. Activation of the c-abl oncogene by viral transduction or chromosomal translocation generates altered c-abl proteins with similar in vitro kinase properties // Mol. Cell. Biol. 1985. - V. 5. - P. 204-13.

362. Blankinship M.J., Gregorevic P., Chamberlain J.S. Gene therapy strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing recombinant adeno-associated virus vectors // Molecular Therapy. -2006.-V. 13.-P. 241-249.

363. Gao G.P., Wilson J.M., Wivel N.A. Production of recombinant adeno-associated virus // Advances in Virus Research. Vol 55. - 2000. - V. 55. - P. 529-543.

364. Choi M.S., Yuk D.Y., Oh J.H., Jung H.Y., Han S.B., Moon D.C., Hong J.T. Berberine Inhibits Human Neuroblastoma Cell Growth through Induction of p53-dependent Apoptosis. // Anticancer Research. 2008. - V. 28. - P. 3777-3784.

365. Tuschl T., Borkhardt A. Small interfering RNAs: a revolutionary tool for the analysis of gene function and gene therapy // Mol. Interv. 2002. - V.2, № 3. - P. 158-167.

366. Findlay D., Herries D. G., Mathias A. P., Rabin B. R., Ross C. A. The active site and mechanism of action of bovine pancreatic ribonuclease // Nature. -1961. V.190. - P. 781-784.

367. Amarzguioui M., Holen T., Babaie E., Prydz H. Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA //Nucleic Acids Res. 2003. - V.31, № 2. - P. 589-595.

368. Elbashir S. M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells // Nature. 2001. -V.411, № 6836. - P. 494-498.

369. Kawasaki F.M., Casper M.D., Freier S.M., Lesnik E.A., Zounes M.C., Cummins L.L., Gonzalez C., CookP.D. //J. Med. Chem. -1993 V. 36. P. 831.

370. Hamada M., Ohtsuka T., Kawaida R., Koizumi M., Morita K., Furukawa H., Imanishi T., Miyagishi M., Taira K. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. - V. 12. - P. 301.

371. Choung S., Kim Y.J., Kim S., Park H.-O. and Choi Y.-C. Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy // BBRC J. 2006. - V. 342. - P. 919-927.

372. Raemdonck K., Remaut K., Lucas B., Sanders N. N., Demeester J., De Smedt S. C. In situ analysis of single-stranded and duplex siRNA integrity in living cells // Biochemistry. 2006. -45.-P. 10614-10623.

373. Amarzguioui M., Prydz H. An algorithm for selection of functional siRNA sequences // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004. V.316. - P. 1050-1058.

374. Patzel V. In silico selection of active siRNA // Drug Discov. Today. 2007. - V. 12. - P. 139-148.

375. Ohnishi Y., Tamura Y., Yoshida M., Tokunaga K. and Hohjoh H. (2008) Enhancement of allele discrimination by introduction of nucleotide mismatches into siRNA in allele-specific gene silencing by RNAi. PLoS One. 3, e2248.

376. Choung S., Kim Y. J., Kim S., Park H. O., Choi Y. C. Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006 . -V. 342.-P. 919-927.

377. Braasch D. A., Jensen S., Liu Y., Kaur K., Arar K., White M. A., Corey D. R. RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA // Biochemistry. 2003. - V. 42. -P. 7967-7975.

378. Richert N. D., Aldwin L., Nitecki D., Gottesman M. M., Pastan I. Stability and covalent modification of P-glycoprotein in multidrug-resistant KB cells // Biochemistry. 1988. - V. 27. -P. 7607-7613.

379. Peterson L.F., Zhang D.E. The 8;21 translocation in leukemogenesis // Oncogene. 2004. -V. 23. P. 4255-4562.

380. Nechipurenko O., Rossi L., Moore B. Comparison of approaches for rational siRNA design leading to a new efficient and transparent method // Nucleic Acids Res. 2007. - V. 35. - P. 110.

381. Murata S., Yashiroda H., Tanaka K. Molecular mechanisms of proteasome assembly. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2009. - V. 10, N. 2. - P. 104 - 115.

382. Somoza A., Chelliserrykattil J. and Kool E. T. The roles of hydrogen bonding and sterics in RNA interference // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. - V. 45. - P. 4994-4997.

383. Pan Y., Priyakumar U. D., MacKerell A. D. Conformational determinants of tandem GU mismatches in RNA: insights from molecular dynamics simulations and quantum mechanical calculations // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 1433-1443.

384. Varani G., McClain W. H. The G x U wobble base pair. A fundamental building block of RNA structure crucial to RNA function in diverse biological systems // EMBO Rep. 2000. -V.l.-P. 18-23.

385. Rosenbaum H., Webb E., Adams J.M., Cory S., Harris A.W. N-MYC transgene promotes B lymphoid proliferation, elicits lymphomas and reveals cross-regulation with C-MYC // EMBO J.- 1989. V. 8. - P. 749-755.

386. Du Q., Thonberg H., Wang J., Wahlestedt C., Liang Z. A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. 1671-1677.

387. Fagot D., Buquet-Fagot C., Lallemand F., Mester J. Antiproliferative effects of sodium butyrate in adriamycin-sensitive and -resistant human cancer cell lines // Anticancer Drugs. -1994. V. 5. - P. 548-556.

388. Feo S., Di L.C., Jones T., Read M., Fried M. The DNA region around the C-MYC gene and its amplification in human tumour cell lines // Oncogene 1994. - V. 9 P. 955-961.

389. Hemmi H., Yamada K., Yoon U.H., Kato M., Taniguchi F., Tsuchida Y., Shimatake H. Coexpression of the myc gene family members in human neuroblastoma cell lines // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995. - V. 36. - P.l 135-1141.

390. Holen T., Amarzguioui M., Babaie E., Prydz H. Similar behaviour of single-strand and double-strand siRNAs suggests they act through a common RNAi pathway. // Nucleic Acids Res.- 2003. V. 31. - P. 2401 -2407.

391. Martinez J., Patkaniowska A., Urlaub H., Luhrmann R., Tuschl T. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi // Cell. 2002. - V. 110. - P. 563-574.

392. Schwarz D.S., Hutvagner G., Haley B., Zamore P.D. Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways // Mol. Cell. 2002. - V. 10. -P. 537-548.

393. Raemdonck K., Remaut K., Lucas B., Sanders N.N., Demeester J., De Smedt S.C. In situ analysis of single-stranded and duplex siRNA integrity in living cells // Biochemistry. 2006. -V. 45.-P. 10614-10623.

394. Shabalina S. A., Spiridonov A. N. and Ogurtsov A. Y. Computational models with thermodynamic and composition features improve siRNA design // BMC Bioinformatics. 2006. -V. 7.-P. 65.

395. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi T., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R., Saigo K. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32. - P. 936-948.

396. Walton S. P., Wu M., Gredell J. A., Chan C. Designing highly active siRNAs for therapeutic applications // FEBS J. 2010. - V. 277. - P. 4806-4813.

397. Liu B. W., Goto J., Wang Y. L., Murata M., Wada K., Kanazawa I. Specific inhibition of Huntington's disease gene expression by siRNAs in cultured cells // Proc. Japan Acad. 2003. -V. 79.-P. 293-298.

398. Couto,L.B., High,K.A. Viral vector-mediated RNA interference // Curr. Opin. Pharmacol. -2010.-V. 10.-P. 534-542.

399. MowaM.B., Crowther C., Arbuthnot P. Therapeutic potential of adenoviral vectors for delivery of expressed RNAi activators // Expert. Opin. Drug Deliv. -2010. V. 7. - P. 13731385.

400. Leng Q., Woodle M.C., Lu P.Y., Mixson,A.J. Advances in Systemic siRNA Delivery // Drugs Future. 2009. - V. 34. - P. 721.

401. Posadas I., Guerra F.J., Cena,V. Nonviral vectors for the delivery of small interfering RNAs to the CNS //Nanomedicine. -2010. V. 5. - P. 1219-1236.

402. Shim M.S., Kwon,Y.J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo // FEBS J. 2010. -V. 277.-P. 4814-4827.

403. Bessis N., GarciaCozar F.J., Boissier M.C. Immune responses to gene therapy vectors: influence on vector function and effector mechanisms // Gene Ther. 2004. - V. 11. - P. SI0-17.

404. Check E. A tragic setback // Nature. 2002. - V. 420. - P. 116-118.

405. Kaiser J. Gene therapy. Seeking the cause of induced leukemias in X-SCID trial // Science. 2003. - V. 299. - P. 495.

406. Sinn P.L., Sauter S.L., McCray P.B.,Jr. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors—design, biosafety, and production // Gene Ther. -2005.-V. 12.-P. 1089-1098.

407. Song E., Lee S.K., Wang J., Ince N., Ouyang N., Min J., Chen J., Shankar P., Lieberman J. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis // Nat. Med. 2003. - V. 9. -P. 347-351.

408. Zender L., Kubicka S. Suppression of apoptosis in the liver by systemic and local delivery of small-interfering RNAs // Methods Mol. Biol. 2007. - V. 361. - P. 217-226.

409. Jeong J.H., Mok H., Oh Y.K., Park T.G. siRNA conjugate delivery systems // Bioconjug. Chem. 2009. - V. 20. - P. 5-14.

410. Lv H., Zhang S., Wang B., Cui S., Yan J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery // J. Control Release. 2006. - V. 114. - P. 100-109.

411. Thomas M., Kularatne S.A., Qi L., Kleindl P., Leamon C.P., Hansen M.J., Low P.S. Ligand-targeted delivery of small interfering RNAs to malignant cells and tissues // Ann. NY Acad. Sci. 2009. - V. 1175. - P. 32-39.

412. Nishina K., Unno T., Uno Y., Kubodera T., Kanouchi T., Mizusawa H., Yokota T. Efficient in vivo delivery of siRNA to the liver by conjugation of alpha-tocopherol // Mol. Ther. 2008. -V. 16.-P. 734-740.

413. Chu T.C., Twu K.Y., Ellington A.D., Levy M. Aptamer mediated siRNA delivery // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. e73.

414. Hicke B.J., Stephens A.W. Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy // J. Clin. Invest. 2000. - V. 106. - P. 923-928.

415. McNamara J.O., Andrechek E.R., Wang Y., Viles K.D., Rempel R.E., Gilboa E., Sullenger B.A., Giangrande P.H. Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras // Nat. Biotechnol. 2006. - V. 24. - P. 1005-1015.

416. Xia C.F., Boado R.J., Pardridge W.M. Antibody-mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin-biotin technology // Mol. Pharm. 2009. - V. 6. - P. 747-751.

417. EndohT., Ohtsuki T. Cellular siRNA delivery using cell-penetrating peptides modified for endosomal escape // Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. - V. 61. - P. 704-709.

418. Muratovska A., Eccles M.R. Conjugate for efficient delivery of short interfering RNA (siRNA) into mammalian cells // FEBS Lett. 2004. - V. 558. - P. 63-68.

419. Richert N.D., Aldwin L., Nitecki D., Gottesman M.M., Pastan I. Stability and covalent modification of P-glycoprotein in multidrug-resistant KB cells // Biochemistry. 1988. - V. 27. -P. 7607-7613.

420. Brown M.S., Goldstein J.L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor// Cell. 1997. - V. 89. - P. 331-340.

421. Plosch T., Kosters A., Groen A.K., Kuipers F. The ABC of hepatic and intestinal cholesterol transport // Handb. Exp. Pharmacol. 2005. - V. 170. - P. 465-482.

422. Burnett J.R., Barrett P.H. Apolipoprotein B metabolism: tracer kinetics, models, and metabolic studies // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2002. - V. 39.- P. 89-137.

423. Deckelbaum R.J., Shipley G.G., Small D.M. Structure and interactions of lipids in human plasma low density lipoproteins // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - P. 744-754.

424. Havekes L.M., De Wit E.C.M., Princen H.M.G. Cellular free cholesterol in Hep G2 cells is only partially available for down-regulation of low-density-lipoprotein receptor activity // Biochem. J. 1987. - V. 247. - P. 739-746.

425. Kambouris A.M., Roach P.D., Calvert G.D., Nestel P.J. Retroendocytosis of high density lipoproteins by the human hepatoma cell line, HepG2 // Arteriosclerosis. 1990. - V. 10. - P. 582-590.

426. Marsche G., Frank S., Raynes J.G., Kozarsky K.F., Sattler W., Malle E. The lipidation status of acute-phase protein serum amyloid A determines cholesterol mobilization via scavenger receptor class B, type I // Biochem. J. 2007. - V. 402. - P. 117-124.

427. Dominska M., Dykxhoorn D.M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape//J. Cell Sci. 2010. - V. 123.-P. 1183-1189.

428. Turner J.J., Fabani M., Arzumanov A.A., Ivanova G., Gait M.J. Targeting the HIV-1 RNA leader sequence with synthetic oligonucleotides and siRNA: chemistry and cell delivery // Biochim. Biophys. Acta. 2006. - V. 1758. - P. 290-300.

429. Farhood H., Serbina N., Huang L. The role of dioleoyl phosphatidylethanolamine in cationic liposome mediated gene transfer // Biochim. Biophys. Acta. 1995. -V. 1235. - P. 289295.

430. Jain M., Arvanitis C., Chu K., Dewey W., Leonhardt E., Trinh M., Sundberg C.D., Bishop J.M., Felsher D.W. Sustained loss of a neoplastic phenotype by brief inactivation of MYC // Science. 2002. - V. 297. - P. 102-104.

431. Kim D., Longo M., Han Y., Lundberg P., Cantin E., Rossi J. Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase // Nature Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 321-325.

432. Minks M.A., West D.K., Benvin S., Baglioni C. Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of 2',5'-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa cells // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 10180-10183.

433. Puthenveetil S., Whitby L., Ren J., Kelnar K., Krebs J.F., Beal P.A. Controlling activation of the RNA-dependent protein kinase by siRNAs using site-specific chemical modification // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. 4900-4911.

434. Ablashi D.V., Berneman Z.N., Williams M., Strayer D.R., Kramarsky В., Suhadolnik R.J., Reichenbach N., Hiltzges P., Komaroff A.L. Ampligen inhibits human herpesvirus-6 in vitro // In Vivo. 1994. - V. 8. - P. 587-591.

435. Булычев JI.E., Порываев В.Д., Рыжиков А.Б. и др. // Вопросы Вирусологии. 2003. - Т. 48. - № 4. - С. 45-47.

436. Oates А.С., Bruce А.Е., Но R.K. Too much interference: injection of double-stranded RNA has nonspecific effects in the zebrafish embryo // Dev. Biol. 2000. - V. 224. - P. 20-28.

437. Kimchi A. Cytokine triggered molecular pathways that control cell cycle arrest // J. Cell Biochem. 1992. - V. 50. - P. 1-9.

438. Castelli J.C., Hassel B.A., Wood K.A., Li X.L., Amemiya K., Dalakas M.C., Torrence P.F., Youle R.J. A study of the interferon antiviral mechanism: apoptosis activation by the 2-5A system // J. Exp. Med. 1997. - V. 186. - P. 967-972.

439. Clemens M.J. PKR—a protein kinase regulated by double-stranded RNA // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. - V. 29. - P. 945-949.

440. Matsumoto M., Funami K., Oshiumi H., Seya T. Toll-like receptor 3: a link between tolllike receptor, interferon and viruses // Microbiol. Immunol. 2004. - V. 48. - P. 147-154.

441. Sen G.C., Sarkar S.N. Transcriptional signaling by double-stranded RNA: role of TLR3 // Cytokine Growth Factor Rev. 2005. - V. 16. - P. 1-14.

442. Hemmi H., Yamada K., Yoon U.H., Kato M., Taniguchi F., Tsuchida Y., Shimatake H. Coexpression of the myc gene family members in human neuroblastoma cell lines // Biochem. Mol. Biol. Int. 1995.-V. 36.-P. 1135-1141.

443. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference // Nature. 2001. - V. 409. - P. 363-366.

444. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R., Silverman R.H., Schreiber R.D. How cells respond to interferons // Annu. Rev. Biochem. 1998. - V. 67. - P. 227-264.

445. Chang X.M., Chang Y., Jia A. Effects of interferon-alpha on expression of hepatic stellate cell and transforming growth factor-beta 1 and alpha-smooth muscle actin in rats with hepatic fibrosis // World J. Gastroenterol. 2005. - V. 11. - P. 2634-2636.

446. Milligan J.F., Groebe D.R., Witherell G.W., Uhlenbeck O.C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates // Nucleic Acids Res. 1987. - V.21. -P. 8783-98.

447. Robbins M., Judge A., Maclachlan I. siRNA and innate immunity // C^nronucleotides. -2009.-V. 19.-P. 89-102.

448. Schlee M., Hartmann E., Coch C., Wimmenauer V., Janke M., Barchet W., Hartmann G. Approaching the RNA ligand for RIG-I? // Immunol. Rev. 2009. - V. 27. - P. 66-74.

449. Hu Y., Conway T.W. 2-Aminopurine inhibits the double-stranded RNA-dependent protein kinase both in vitro and in vivo // J. Interferon Res. 1993. - V. 13. - P. 323-328.

450. Puthenveetil S., Whitby L., Ren J., Kelnar K., Krebs J. F., Beal P. A. Controlling activation of the RNA-dependent protein kinase by siRNAs using site-specific chemical modification // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34. - P. 4900-4911.

451. Zhang Z., Weinschenk Т., Guo K., Schluesener H. J. siRNA binding proteins of microglial cells: PKR is an unanticipated ligand // J. Cell Biochem. 2006. - V. 97. - P. 1217-1229.

452. Каледин В.И., Жукова H.A. Гепатокарцинома-29 метастазирующая перевиваемая опухоль мышей, вызывающая кахексию // Бюл. эксп. биол. и мед. - 2009. - Т. 148. - С. 664669.

453. Shang Y., Baumrucker C.R., Green M.H. C-MYC is a major mediator of the synergistic growth inhibitory effects of retinoic acid and interferon in breast cancer cells // J. Biol. Chem. -1998. V. 273. - P. 30608-30613.

454. Shimazaki Т., Honda M., Kaneko S., Kobayashi K. Inhibition of internal ribosomal entry site-directed translation of HCV by recombinant IFN-alpha correlates with a reduced La protein // Hepatology. 2002. - V. 35. - P. 199-208.

455. Sledz C.A., Holko M., de Veer M.J., Silverman R.H., Williams B.R. Activation of the interferon system by short-interfering RNAs // Nat. Cell Biol. 2003. - V. 5. - P. 834-839.

456. Persengiev S.P., Zhu X., Green M.R. Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs) // RNA. 2004. -V. 10.-P. 12-18.

457. Sioud M. Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single-stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization // J. Мої. Biol. 2005. - V. 348. - P. 1079-1090.

458. Judge A.D., Sood V., Shaw J.R., Fang D., McClintock K., MacLachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA // Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 457-462.

459. Kariko K., Bhuyan P., Capodici J., Weissman D. Small interfering RNAs mediate sequence-independent gene suppression and induce immune activation by signaling through tolllike receptor 3 // J. Immunol. 2004. - V. 172. - P. 6545-6549.

460. Einat M., Resnitzky D., Kimchi A. Close link between reduction of C-MYC expression by interferon and, G0/G1 arrest // Nature. 1985. - V. 313. - P. 597-600.

461. Yarden A., Kimchi A. Tumor necrosis factor reduces C-MYC expression and cooperates with interferon-gamma in HeLa cells // Science. 1986. - V. 234. - P. 1419-1421.

462. Wada R.K., Pai D.S., Huang J., Yamashiro J.M., Sidell N. Interferon-gamma and retinoic acid down-regulate N-MYC in neuroblastoma through complementary mechanisms of action // Cancer Lett. 1997.-V. 121.-P. 181-188.

463. Galderisi U., Di B.G., Cipollaro M., Peluso G., Cascino A., Cotrufo R., Melone M.A. Differentiation and apoptosis of neuroblastoma cells: role of N-MYC gene product // J. Cell Biochem. 1999. - V. 73. - P. 97-105.

464. Rehli M. Of mice and men: species variations of Toll-like receptor expression // Trends Immunol. 2002. - V. 23. - P. 375-378.

465. Diebold S. S., Massacrier C., Akira S., Paturel C., Morel Y., Reis E. Sousa Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides // Eur. J. Immunol. 2006. - V. 36. - P. 3256-3267.

466. Judge A. D., Sood V., Shaw J. R., Fang D., Mcclintock K., Maclachlan I. Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA // Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 457-462.

467. Shin D., Kim S. I., Park M., Kim M. Immunostimulatory properties and antiviral activity of modified HBV-specific siRNAs // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - V. 364. -P. 436442.