Применение углеродно-полимерных подложек в изучении адсорбции вирусных частиц и определении этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей методами электронной микроскопии

Сироткин, Алексей Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение углеродно-полимерных подложек в изучении адсорбции вирусных частиц и определении этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей методами электронной микроскопии
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Применение углеродно-полимерных подложек в изучении адсорбции вирусных частиц и определении этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей методами электронной микроскопии"

На правах рукописи

СИРОТКИН Алексей Константинович

ПРИМЕНЕНИЕ УГЛЕРОДНО-ПОЛИМЕРНЫХ ПОДЛОЖЕК В ИЗУЧЕНИИ АДСОРБЦИИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ И ОПРЕДЕЛЕНИИ ЭТИОЛОГИИ ВИРУСНЫХ ГАСТРОЭНТЕРИТОВ У ДЕТЕЙ МЕТОДАМИ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте гриппа РАМН

Научный руководитель: кандидат медицинских наук

Сухинин Валерий Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Соколова Екатерина Дмитриевна

доктор биологических наук, профессор Рыбальченко Оксана Владимировна

Ведущая организация: Институт вирусологии

им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится « на заседании

диссертационного совета Д 001.043.01 при ГУ НИИ гриппа РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001.043.01 кандидат медицинских на Л п б о в а Тамара Геннадиевна

'Лс^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Вирусные гастроэнтериты (ВГЭ) у детей являются одной из важнейших проблем здравоохранения во всем мире Только от ротавирусных диареи умирает около 500 000 детей в год (Parashar U D et al, 2003) Второе место по этиологической значимости после ротавирусов занимают норовирусы, являющиеся наиболее распространенной причиной гастроэнтерита, связанного с употреблением контаминированных пищевых продуктов (Glass R I et al, 2000) Благодаря интенсивным исследованиям, список патогенных и условно-патогенных кишечных вирусов постоянно пополняется В настоящее время известно свыше десяти различных вирусов, вызывающих острый гастроэнтерит Некоторые из них, например, торовирусы человека были идентифицированы лишь недавно (JamiesonF В et al, 1998)

Ранняя диагностика ВГЭ имеет высокое значение при выборе оптимальных схем лечения заболевания В частности, ВГЭ не рекомендуется лечить с применением антибиотиков (Rhoads F А 1993, Rudolph J А , 1999) В связи с появлением на рынке новых противовирусных препаратов как широкого спектра действия, так и узконаправленных, точное определение этиологии заболевания приобретает все большую значимость

В настоящее время, по существу, единственным диагностическим методом, позволяющим одновременно выявить весь спектр патогенных кишечных вирусов, остается просвечивающая электронная микроскопия (ЭМ) Разнообразие этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов и их высокая изменчивость способствуют тому, что ЭМ продолжает интенсивно использоваться в крупных диагностических центрах наравне с иммуноферментным анализом (ИФА) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (Biel SS, Gelderblom HR, 1999)

Одним из недостатков ЭМ, снижающим эффективность ее применения, является относительно низкая чувствительность метода Традиционно для увеличения чувствительности электронно-микроскопической диагностики применяют концентрирование исследуемых препаратов с помощью ультрацентрифугирования, а также сенсибилизацию подложек антителами к искомому вирусу (иммуноэлектронная микроскопия) Указанные способы однако, не лишены целого ряда недостатков Ультрацентирифугирование требует наличия дорогостоящего оборудования и связано со значительными временными затратами Для иммуноэлектронной микроскопии необходим, в свою очередь, набор сывороток ко всему спектру выявляемых вирусов, что не всегда возможно

В работе был избран оригинальный подход к увеличению чувствительности ЭМ, основанный на повышении адсорбционной способности углеродных подложек при помощи их модификации синтетическими полимерами

Другим существенным фактором, влияющим на результат электронно-микроскопической диагностики, является умение выделить характерные морфологические особенности кишечных вирусов В 1980-х годах в НИИ полиомиелитов и вирусных энцефалитов (г Москва) проводилось изучение этиологии вспышек острого гастроэнтерита с использованием ЭМ в качестве основного метода детекции (Дроздов С Г. 1983, Хаустов В И с соавт , 1989) Применялась ЭМ и в исследованиях, проводимых в те же годы в Ленинграде (Васильев Б Я с соавт, 1986, 1989, 1990, 1991) Исследования тех лет фокусировались в основном на этиологической роли ротавирусов Прочие вирусные агенты были выявлены в ряде случаев, но их роль в кишечной патологии у детей исследована недостаточно Из-за неполноты данных по этиологии ВГЭ. в отечественной литературе отсутствует морфологическое описание некоторых патогенных кишечных вирусов, в частности, торовирусов и норовирусов Поэтому важной задачей настоящего исследования было подробное изучение этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге и составление морфологического описания всех обнаруженных этиологических агентов

Для того чтобы оценить достоверность данных по этиологии ВГЭ, полученных при помощи ЭМ, необходимо было также провести сравнительное исследование по выявлению ВГЭ различными методами В настоящей работе такое исследование проведено на примере ротавирусной инфекции, выявляемой методами ЭМ, иммуноферментного анализа (ИФА) и РНК- электрофореза в полиакриламидном геле

С учетом всего вышесказанного были сформулированы следующие цепи и задачи

Цель исследования

Разработать метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц и помощью данного метода изучить этиологию вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге

Задачи исследования:

1 Изучить адсорбцию вирусных частиц на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами

2 Разработать метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции агентов ВГЭ

3 Изучить этиологическую структуру и сезонное распределение ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге

4 Описать особенности морфологии патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника

5 Провести сравнительный анализ эффективности выявления ротавирусной инфекции методами ИФА и ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек

Научная новизна.

Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами. Впервые выявлено избирательное сродство кишечных вирусов к различным синтетическим полимерам. Впервые показано, что частицы норовирусов, саповирусов, ротавирусов и торовирусов обладают отрицательным электростатическим зарядом при нейтральных значениях pH.

В исследовании впервые было обнаружено, что адсорбционные свойства кишечного аденовируса 41 типа (Ad41) и респираторного аденовируса 5 типа (Ad5) существенно различаются. Показано, что частицы Ad5 имеют выраженный отрицательный заряд, в то время как заряд вирионов Ad4l близок к нейтральному.

Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики, позволяющий увеличить эффективность выявления этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов на 20% - 50%. По эффективности разработанный метод не уступает концентрированию исследуемых препаратов при помощи ультрацентрифугирования, но значительно быстрее и проще последнего.

Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полимером ПДМАЭМ. Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавируса в клетки-мишени происходит «прямым» путем с «раздеванием» вирусных частиц непосредственно на наружной мембране (Tihova М. й а1, 2001).

Расширены представления об этиологической структуре вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге. Установлена этиологическая значимость ротавирусов (46,1%), норовирусов (13,4%), торовирусов (11,5%). кишечных аденовирусов (2,3%), коронавирусов (1,2%), астровирусов (0,6%) и саповирусов (0,2%) в кишечной патологии детей, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит». Впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы.

Впервые в России выявлена существенная этиологическая значимость торовирусной инфекции. Обнаружено значительное число (6% от общего количества обследованных детей) сочетанных вирусных кишечных инфекций с участием торовирусов, что свидетельствует о возможности внутрибольничного распространения торовирусной инфекции.

Получены оригинальные электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника. Выявлены новые морфологические особенности строения норовирусов.

С использованием ЭМ в качестве референс- метода впервые подробно охарактеризованы отечественные тест-системы ИФА для выявления ротавирусного антигена.

Практическая значимость работы

Предложенная экспериментальная модель позволила получить качественно новую информацию об адсорбционных свойствах различных вир) сов Данная информация может найти применение в вирусологической диагностике, а также при разработке противовирусных препаратов, блокирующих инфекцию на стадии адсорбции

Разработан новый метод, позволяющий существенно повысить эффективность выявления различных кишечных вирусов Метод обладает наиботьшей эффективностью при выявлении норовирусов, что имеет особое значение, поскольку тест-системы ИФА для выявления норовирусной инфекции в России не выпускаются

Уникатьлые адсорбционные свойства аденовируса 41 типа выявленные в исследовании, позволяют определять принадлежность кишечных аденовирусов к подгруппе F в отсутствие иммунных сывороток

Проведенное исследование позволило врачам-педиатрам, участвующим в исследовании выявить клинические особенности вирусных гастроэнтеритов различной этиологии и сформулировать критерии симптоматической диагностики вирусных ОКИ у детей

Подготовлен материал для издания атласа этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов включающий в себя оригинальные электронно-микроскопические изображения и описание всех известных на сегодняшний день патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника

Показано, что ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек может использоваться в качестве эффективного референс- метода для оценки чувствительности и специфичности иммуноферментных тест-систем

Основные положения, выносимые на защиту

Предложена новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц методами просвечивающей электронной микроскопии при помощи подложек, модифицированных различными синтетическими полимерами

Разработан новый метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц Показана эффективность метода в диагностике вирусных гастроэнтеритов у детей, в особенности при выявлении калицивирусной инфекции

Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге в 20012003 гг отличалась разнообразием циркулирующих агентов Наибольшее значение в кишечной патологии детей имели (в порядке значимости) ротавирусы норовирусы торовирусы, аденовирусы, коронавирусы и астровирусы

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на международных симпозиумах и конференциях "Molecular Order and Mobility in Pol>mer Systems", Санкт-Петербург, 3-7 июня 2002г, «Ликвидация и этиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4-5 сент 2003г, «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», Санкт-Петербург, 16-18 апр 2001, «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций», Санкт-Петербург, 16-18 апр 2002, а также на заседаниях общества эпидемиологов России

Сведения о внедрении

Усовершенствованный метод электронно-микроскопической диагностики применяется в расшифровке этиологии ОКИ в НИИ детских инфекций и других больницах Санкт-Петербурга Подана заявка на патент

Электронные микрофотографии вирусов и другие материалы работы используются на лекциях и практических занятий по вирусологии на биолого-почвенном факультете СПбГУ, а также на сертификационных курсах для вирусологов при ГУ НИИ гриппа РАМН

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 22 научные работы в том числе 9 статей в реферируемых российских научных журналах

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста содержит 8 таблиц, 17 рисунков, 25 электронных микрофотографий Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения, включающего электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника Список литературы включает 32 отечественных и 266 зарубежных источников

Ключевые слова: электронная микроскопия, адсорбция вирусных частиц, синтетические полимеры, вирусный гастроэнтерит

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Контингент обследованных пациентов В период с октября 2001 г по ноябрь 2003 г были обследованы 485 детей в возрасте от 2-х месяцев до 14-ти лет, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит» в клинику НИИ детских инфекций (НИИДИ) и в Детскую инфекционную больницу №3 г Санкт-Петербурга (ДИБ-3) Средний возраст госпитализированных детей составит 2г Зм Преобладающими симптомами при поступлении были рвота, диарея лихорадочное состояние (Т> 38,0) Патогенных бактерий у обследованных детей обнаружено не было Контрольная группа состояла из 19 клинически здоровых детей в возрасте от 4 мес до 16 лет Средний возраст детей контрольной группы составил 3,5 года

Электронно-микроскопические исследования Образцы фекалий брали на 2-5 день заболевания Выявление вирусов в фекалиях проводили по метод) Doane FW (1994) Образцы фекалий разбавляли в 2-10 раз 1% раствором ацетата аммония и энергично встряхивали Суспензию фекалий в количестве 1,5 мт помещали в пластиковые пробирки и осветляли на настольной центрифуге при 8 000 об/мин в течение 15 мин Каплю надосадочной жидкости наносили на парафильм и сверху на каплю помещали медную сетку, покрытую углеродной подложной Сетку оставляли на капле в течение 30-60 сек для адсорбции вирусных частиц, затем 2 раза отмывали дистиллированной водой и контрастировали 1,5% раствором ФВК Просмотр препаратов осуществляли на просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония)

Полимеры Для модификации углеродных подложек использовали нейтральные полимеры - поливинилпирролидон (ПВП) молекулярной массы ЗОкД. 80кД и 120кД,

потожитетьно заряженные полимеры - полиаллитамин (ПААМ) 15кД, 28кД, 80кД поливиниламин (ПВАМ) 15кД, ЗОкД, поли-диметиламиноэтитметакрилат (ПДМАЭМ) 32кД, 80кД, сополимер ПДМАЭМ 32кД с поли-NNN-триметил-N-метакрилоилоксиэтил-аммоний подидом (ПДМАЭМ ПТМАЭМ),

отрицательно заряженные потимеры - полиметакриловую кислоту (ПМАК), ЗОкД 60кД Структурные формулы полимеров приводятся на рис 1 Потимеры были синтезированы в Институте высокомолекулярных соединений РАН (ИВС РАН)

Модификация подложек Готовили 0,2% растворы исследуемых полимеров на бидистиллированной воде Медные сетки 400mesh, покрытые \псродными подложками, помещали сверху на каплю раствора полимера Через 30 сек сетку снимали, удаляли избыток влаги фильтровальной бумагой и отмывали сетку в капле дистиллированной воды Влажные сетки немедленно использовали для приготовления электронно-микроскопических препаратов методом негативного контрастирования как описано выше

Рис. 1. Структурные формулы синтетических полимеров.

a. полиаллиламин (ПААМ),

b. поливиниламин (ПВАМ),

c. поливинилпирролидон (ПВП),

d. полидиметиламиноэтилметакрилат (ПДМАЭМ)

e. Сополимер ПДМАЭМ с поли-NNNтриметил-N-метакрилоилоксиэтиламмоний иодидом, m/n = 2/3 (ПДМАЭМ-сополимер)

f. полиметакриловая кислота (ПМАК)

Вирусы. Для изучения адсорбции использовали частично очищенные при помощи центрифугирования препараты различных вирусов (ротавирусов. аденовирусов, норовирусов, саповирусов и торовирусов), выделенных из

фекалий больных детей В качестве референс-препарата использовали также культуральную жидкость, содержащую аденовирус 5 типа из коллекции НИИ гриппа РАМН

Onpeделение коэффициентов адсорбции. Вируссодержащие препараты разводили физиологическим раствором (рН 6,8) до концентрации, удобной для подсчета частиц (5-20 частиц в поле зрения). Производили подсчет количества вирусных частиц на углеродных подложках и на подложках, модифицированных синтетическими полимерами Условные коэффициенты адсорбции (К) определяли по относительному увеличению количества вирусных частиц на единицу площади на модифицированных подложках по сравнению с традиционными углеродными подложками В среднем просчитывали по 50 полей зрения.

Иимуноферментная диагностика Для выявления ротавирусной инфекции методом ИФА использовали иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства фирмы «Аквапаст» (Санкт-Петербург). Иммуноферментный анализ осуществляли согласно рекомендациям производителя Учет результатов проводили путем измерения оптической плотности на длине волны 492 нм (ОП492) с помощью вертикального фотометра ЛпШс« 2010 (Австрия)

Электрофорез ротавирусной РНК. Для выделения РНК из фекалий использовали набор «Рибосорб» производства ЦНИИ эпидемиологии им Габричевского РНК выделяли из 200 мкл образца, соблюдая пропорции реагентов Диск-электрофорез ротавирусной РНК в полиакриламидном геле проводили по метод) Раетш1у.

Чувствительность ИФТС (5рт цфтс ) в пересчете на минимальную выявляемую концентрацию вирусных частиц определяли путем постановки реакции с серией разведений клинических образцов, количество частиц в которых было предварительно подсчитано методом ЭМ с помощью стандартной методики с использованием суспензии латекса Для постановки реакции были выбраны образцы с высокими значениями ОП492 (в пределах 15 - 2.5) Чувствительности ИФТС определялась как среднее значение для трех образцов

Чувствительность ЭМ (Б^ эм ) определяли при исследовании серии разведений тех же образцов Увеличение времени просмотра свыше 20 мин считалось нецелесообразным.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Изучение адсорбции вирусных частиц на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами.

На первом этапе исследования из всего количества синтезированных полимеров (около 30-ти) были отобраны соединения, удовлетворяющие следующим критериям: 1) хорошая растворимость соединения в воде в диапазоне концентраций от 0 до 10 мг/мл; 2) способность полимера равномерно распределяться на подложке без образования комков и сгустков; 3) минимальное воздействие полимера на морфологию различных вирусов.

Было найдено, что в наибольшей степени перечисленным критериям удовлетворяли линейные нейтральные и заряженные полимеры с молекулярной массой от 25 до 40 kDa. Алкилированные полимеры и полимеры с молекулярной массой выше 50 kDa были склонны к образованию мицелл и сгустков, полимеры с массой меньше 15 kDa легко отмывались от подложек и не удерживали вирусные частицы.

На втором этапе работы проводилось изучение адсорбции вирусов на подложках, модифицированных синтетическими полимерами. Условные коэффициенты адсорбции (К), полученные для различных вирусов и полимеров, приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Условные коэффициенты адсорбции (К) различных вирусов на углеродных подложках, модифицированных синтетическими полимерами*.

Полимеры Вирусы

Ad5 Ad41 RV AstV NV SV TV

а. ПААМ (+) 1.5 0,6 3,0 4,8 10,2 17,3 4,1

Ь. ПВАМ (+) 1,4 0,8 1,3 1,5 2.6 3,5 1.6

с. ПВП (нейтр.) 0,8 1,1 0,7 0,8 0,7 0,8 1,0

d. ПДМАЭМ (+) 2,2 0,7 и.о. 2,0 1,2 1,5 H.O.

е. ПДМАЭМ-сополимер(+) 0,4 3,0 и.о. 0,7 0,7 0,8 H.O.

f. ПМАК(-) 0,3 0,9 0,1 <0,1 <0,1 <0,1 0,2

погрешность в определении коэффициентов адсорбции в среднем составила 12% А<15 - аденовирус 5 типа. Ad41 - аде>ювир\с 41 типа. RV - ротавир) с. AstV - астровирч с. NV - IIopoBupjc. SV — Саповир}с. TV - торовир>с. Г1ВИ - полившшл-пярролндои ПААМ - поли-аллиламин. ПВАМ -поливиниламтш. Г1ДМЛ>.\1 - поли-дичепи-аминоэтил-метакрилат, IIД M Л Э M -с о п о л н м е р " сополимер ПДМА'ЭМ с поли-N.N.N-триметнл-Ы-метакрилоилоксиэтил-аммоний иодидом. II МАК - полиметакриловая кислота, и.о. - не определят. В скобках \ качан заряд полимера при нейтральном pli

Как видно из сравнения коэффициентов адсорбция, нейтральный полимер ЛВП не указывал существенного влияния-, на адсорбцию исследованных вирусов (К,,77 J)- Отрицательно заряженный полимер ПМАК значительно снижал сорбционную способность подложек для всех исследованных вирусов кроме Ad41 (К=0,9). Положительно заряженные полимеры в целом повышали адсорбционную способность углеродных подложек в отношении различных вирусов.

Полученный результат свидетельствует о том, что частицы всех исследованных вирусов при нейтральных значениях pH заряжены отрицательно, кроме аденовируса 41 типа (Ad41), который, вероятно, имеет заряд, близкий к нейтральному.

В исследовании впервые было обнаружено, что адсорбционные свойства кишечного аденовируса 41 типа (Ad4I) и респираторного аденовируса 5 типа (Ad5) существенно различаются (см. табл. 1). В частности, из сравнения коэффициентов адсорбции на подложках с отрицательно заряженным полимером ПМАК следует, что частицы Ad5 имеют выраженный отрицательный заряд, в то время как заряд вирионов Ad4l близок к нейтральному.

Логично предположить, что основной вклад в заряд частиц аденовируса дают наружные домены гексонов. В поисках объяснения обнаруженных различий в заряде частиц Ad5 и Ad41 было проведено сравнение аминокислотных последовательностей гексонов Ad5 и Ad41, имеющихся в базе данных GenBank (access numbers DAA00653 и HXAD41, соответственно). Оказалось, что суммарный условный заряд (число положительно заряженных аминокислот минус число отрицательно заряженных аминокислот) наружного участка петли LI (а.к. 131-170) гексона Ad5 составляет минус 15, в то время как заряд аналогичного участка гексона Ad41 • близок к нейтральному и составляет плюс 1. Таким образом, обнаруженные различия в заряде частиц Ad5 и Ad41 подтверждаются имеющимися данными о структуре соответствующих гексонов. Интересно отметить, что заряд петли L1 аденовируса 40 типа, также принадлежащего к подгруппе F, при другой аминокислотной последовательности составляет также плюс 1 (access number AAC13967).

Было обнаружено, что все исследованные вирусы, несмотря на различия в заряде и размерах частиц, проявляли выраженное сродство к одному из положительно заряженных полимеров. Так, саповирусы, норовирусы, астровирусы и ротавирусы эффективно адсорбировались на подложках с ПААМ (К=17,3; К=Ю,2; К=4,8 и К=3,0, соответственно), аденовирус Ad5 обладал наибольшим сродством к ПДМАЭМ (К=2,2), в то время как Ad41 проявлял повышенное сродство к сополимеру ПДМАЭМ (К=3,0). Наибольшие значения коэффициентов адсорбции были получены для норовирусов и саповирусов на подложках, модифицированных ПААМ (К~10 и К-17. соответственно).

Морфология частиц всех исследованных агентов кроме ротавирусов существенно не изменялась при адсорбции на подложках,

модифицированных различными полимерами в пределах используемых концентраций полимеров (0,05-0,2%) При исследовании адсорбции ротавирусов на подложках, модифицированных ПДМАЭМ, было обнаружено превращение трехслойных частиц в двухслойные, что, по-видимому, бьло обусловлено частичной декапсидацией вирионов (Рис 2)

Рис 2 Частичная декапсидация вирионов ротавируса на подложках модифицированных ПДМАЭМ Вверху трехслойные частицы ротавируса в фекалиях ребенка с острым гастроэнтеритом Использовалась обычная углеродная подложка Вниз} тот же препарат адсорбированный на подложке, модифицированной ПДМАЭМ Видно скопление двухслойных частиц Негативное контрастирование Масштабный отрезок - ЮОнм

Поскольку положительно заряженые группы ПДМАЭМ напоминают аминогруппы пикосфинголипидов в raft- микродомснах клеточных мембран

"ík¡v ктчоч jоторь'х ротавирус проникает в клетки чншепи, ооиару женнын факт явзяется косвенным поллвержтением гипотезы, согласно которой проникновение ротавируса в клетки происходит «прямым» путем с «раневанием» частиц непосредственно на клеточной мембране (Falconer ММ et al 1995, Bass DM etal, 1995, Hhova M et al,2001)

Из всех исследованных полимеров, ПААМ зарекомендовал себя как универсальное соединение, повышающее адсорбционные свойства подложек в отношении широкого спектра агентов ВГЭ Fía дальнейшем этапе работы бы то проведено исследование эффективности использования подложек, мотифицнрованных ПААМ, в детекции патогенных кишечных вирусов Счайным образом были отобраны 83 образца фекалий детей с диагнозом «острый 1аегроэнгерит» Образцы были нанесены на обычные углеродные под юлки и на попожки, модифицированные ПААМ, и исследованы под э тектронныч микроскопом

Оказалось, что суммарное число выявленных случаев вир>сной инфекции с испо 1ьзованием модифицированных подложек возросло на 25° о (таблица 2) В частности применение подложек, модифицированных ПААМ, позволило уветичить число выявленных случаев норовирусной инфекции в 2 5 раза по сравнению с контролем Одним из важных результатов нее тетования было обнаружение саповируса (SV) в одном из препаратов Применение традиционных углеродных подложек не позволило выявить слповирус в фекалиях больного ребенка

Таблица 2

Реп льтаты пектронно-микроскопической детекции вирусных частиц с использованием традиционных углеродных подложек и с помощью подложек, модифицированных ПААМ

По иожки Число выявленных случаев вирусной инфекци (всего обследовано 83 больных) и

RV AclV TV AstV i i MV SV Ho Итого оби

С полимером IIAAM 27 л 23 ! 2 i i 14 1 13 70 (84.3)*

Без полимера (контроль) 20 j 19 ' I 6 0 34 49 (59,0)*

*в скобках указан процент выявленных случаев вирусной инфекции от общего чиста обследованных детей

RV - ротавирусы, AdV - аденовирусы, IV - торовирусы, AstV - астровирусы, МУ- норовирусы, SV - саповирусы, Но - патогенных вирусов не обнаружено

Для определения эффективности применения модифицированных подложек по сравнению с концентрацией препаратов при помощи ультрацентрифугирования, было проведено исследование серии образцов (N=36), полученных во время вспышки норовирусной инфекции в больнице. С помощью углеродно-полимерных подложек норовирусы были обнаружены в 27 случаях из 36-ти, в то время как исследование осадка, нанесенного на традиционные углеродные подложки, позволило выявить норовиурусы в 25 случаях. (Предварительно осветленные препараты объемом 5 мл были сконцентрированы в 50 раз осаждением при 120 000 g в течение 1,5 час). В 34 случаях (24 положительных и 8 отрицательных) результаты обоих методов совпадали. В одном случае норовирусы были выявлены с использованием ультрацентрифугирования препарата и не были выявлены при помощи модифицированных подложек. В трех случаях, напротив, норовирусы были обнаружены при помощи углеродно-полимерных подложек и не были выявлены при исследовании осадка препарата. Таким образом, чувствительность нового метода по сравнению с ультрацентрифугированием составила 27/25 = 108%. Относительно низкую эффективность ультрацентрифугирования можно объяснить тем, что вместе с вирусными частицами осаждается также большое количество клеточного детрита, маскирующего частицы норовирусов и затрудняющего просмотр препаратов.

Следует отметить также, что новый метод с использованием модифицированных подложек значительно быстрее и экономичнее ультрацентрифугирования.

2. Изучение этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей.

Разработка метода повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц позволила перейти к подробному изучению этиологии ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге.

За период с октября 2001 г. по ноябрь 2003 г. было обследовано 485 детей. При этом было обнаружено 11 морфологически различных патогенных и условно-патогенных вирусов (без учета бактериофагов) Электронно-микроскопические изображения обнаруженных вирусов приведены на рис. 3-6.

Были получены новые данные по этологической структуре вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге (таблица 3). Оказалось, что, среди моноинфекций доминировали ротавирусы, обнаруженные у 46,1°о обследованных детей. На втором месте по распространенности были норовирусы (13,4%), далее в порядке убывания следовали торовирусы (11,5%), аденовирусы (2,3%), коронавирусы (1,2%), астровирусы (0,6%) и все прочие вирусы (в сумме 1,4%).

Среди микст-инфекций доминировало сочетание: ротавирус+торовирус (6% от общего числа случаев). Одним из объяснений высокой частоты выявления сочетанных инфекций с участием торовирусов может быть повышенная распространенность торовир>сных инфекций в больницах и

клиниках, что согласуется с данными зарубежных исследователей (Jamieson F.B et а!, 1998). Патогенных бактерий у обследованных детей обнаружено не было.

Таблица 3.

Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт- Петербурге в 2001-2003гг по данным электронной микроскопии (N = 485).

Обнаруженные вирусы Число случаев (частота выявления %)

Моноинфекции

Ротавирусы 224(46,1%)

Норовирусы 65(13,4%)

Торовирусы 56(11,5%)

Аденовирусы 11 (2,3%)

Коронавирусы 6(1,2%)

Астровир>сы 3 (0,6%)

Флави-пояобные вирусные частицы (Пестивирусы?) 3 (0,6%)

Саповирусы 1 (0,2%)

SRSV. мелкий вирус, обладающий 1 (0,2%)

структурными особенностями

SRV, мелкий округлый вирус 1 (0,2%)

Пикорнавирусы 1 (0,2%)

Сочетанные инфекции

Ротавирус + Торовирус 28 (6%)

Ротавирус -1- Норовирус 1 (0,2%)

Ротавирус + Аденовирус 1 (0,2%)

Норовирус + SRV 1 (0,2%)

Норовирус + Торовирус 2 (0,4%)

В сумме у 405 из 485 обследованных детей были обнаружены один или несколько различных вирусов. Таким образом, разработанный метод позволил определить вирусную природу гастроэнтерита у 83% обследованных детей.

Вирусы, обнаруженные в фекалиях детей, принято разделять на три группы по патогенетической значимости (Atmar R, Estes M., 2001):

I) Общепризнанные этиологические агенты гастроэнтеритов человека. К ним относят ротавирусьт, норовирусы, саповирусы, астровирусы и аденовирусы. Все перечисленные вирусы были выявлены в настоящем исследовании.

2) Предполагаемые этиологические агенты гастроэнтеритов человека В настоящее время в эту группу включают коронавирусы, торовирусы и пестивирусы. В данной работе торовирусная и коронавирусная инфекция была выявлена в 11,5% и 1,2% случаев, соответственно В 3-х случаях были обнаружены вирусоподобные частицы, по морфологическим признакам соответствующие пестивирусам (рис. 6).

3) Сопутствующие вирусы К ним относят прежде всего энтеровирусы Echo и Coxsackie, принадлежащие к семейству пикорнавирусов. В настоящем исследовании пикорнавирусы были обнаружены только в одном случае

Кроме того, в двух случаях были обнаружены мелкие вирусоподобные частицы, по морфологическим признакам отличающиеся от всех перечисленных вирусов (рис. 5). Сокращенно подобные вирусоподобные частицы обозначают в зависимости от морфологии как SRV (small round viruses - мелкие округлые вирусы) или SRSV (small round structured viruses -мелкие вирусы, обладающие структурными особенностями поверхности) Определить таксономическую принадлежность обнаруженных вирусов по морфологическим признакам не представляется возможным

В фекалиях контрольной группы здоровых детей (n=19) патогенных вирусов не было обнаружено. Нормальная вирусная флора кишечника была представлена различными бактериофагами, среди которых преобладали бактериофаги семейств Podoviridae, Miovindae и Syphoviridae.

Подробное морфологическое описание вирусных частиц приводится в тексте диссертации Полученные микрофотографии патогенных вирусов в целом соответствовали изображениям, приведенным в руководствах и статьях зарубежных авторов (Doan FW & Anderson N, 1986, Doan FW. 1994; Duckmanton L, 1997)

В исследовании впервые были отмечены не описанные ранее особенности морфологии норовирусов, а именно, ромбовидная форма «пустых» частиц (рис 3 и 4) Поскольку частицы норовирусов обычно обнаруживаются в незначительном количестве, выявленные особенности морфологии способствуют более достоверной идентификации норовирусов в клинических образцах.

Было изучено сезонное распределение вирусных гастроэнтеритов v детей в Санкт-Петербурге. Ротавирусная инфекция проявляла выраженную сезонную зависимость с пиком активности в зимне-весенние месяцы Около 70% случаев ротавирусной инфекции в 2002 и 2003 гг. приходились на три месяца - февраль, март, апрель (рис. 6) Подобная же сезонная активность ротавирусной инфекции отмечена и в других странах северного полушария

Норовирусная инфекция не имела столь выраженной сезонности, однако, наблюдалась тенденция к росту заболеваемости в холодное время года. Подъем заболеваемости норовирусными гастроэнтеритами наблюдался с сентября 2002г. по апрель 2003 года и затем после летнего перерыва осенью 2003 г. Приблизительно в те же сроки отмечался подъем заболеваемости

норовирусными гастроэнтеритами в Европе и США (Lopman BA, 2003; CDC. MMWR, 2002 v 51, p. 1112-1115; CDC, MMWR, 2003, v.,52, p. 41-45).

Рис 3. Морфологические особенности норовирусов. Две «пустые» частицы ромбовидной формы отмечены стрелками. Масштабный отрезок - 50нм.

Что касается торовирусной инфекции, то она выявлялась в течение всего периода наблюдений без выраженной сезонной зависимости. В отдельные месяцы была отмечена повышенная активность торовирусных инфекции, например, в ноябре 2001 г. в апреле 2002г, в мае 2003г. Отсутствие сезонной зависимости в распространении торовирусной инфекции отмечено и в исследованиях канадских вирусологов (Jamieson F.B. et al, 1998).

Аденовирусная инфекция не проявляла выраженной сезонной зависимости Коронавирусная инфекция выявлялась преимущественно весной и осенью

Анализ полученных данных показал, что этиологическая структура и сезонное распределение ВГЭ у детей в Санкт-Петербурге в целом соответствуют тенденциям в распространении вирусных кишечных инфекций, наблюдаемым в развитых странах Северного полушария с \меренным климатом (Jamieson F.B. et al, 1998; Marie-Cardine A. et al, 2002; Pang X.L. et al, 2000; Waters V. et al, 2000).

Для того чтобы оценить достоверность информации, полученной с помощью ЭМ. о доли ротавирусной инфекции в этиологической структуре ВГЭ, было проведено сравнительное исследование по выявлению ротавирусной инфекции методами ЭМ и ИФА.

Рис 4 Вирусы, обнаруженные в фекалиях детей с острым гастроэнтеритом КУ - частицы ротавируса ЛёУ - частицы аденовируса ЛйУ - скопление частиц астровируса №У - скопление частиц норовируса Масштабный отрезок- ЮОнм Все вирусы приведены в одном масштабе

i t.

SRV PicV,

Рис 5 Вирусы, обнаруженные в фекалиях детей с острым гастроэнтеритом SaV - скопление вирионов саповируса SRSV - вирионы мелкого вируса, обладающего структурными особенностями поверхности, SRV - вирионы мелкого округлово вируса PicV-частицы пикорнавируса

Рис 6 Оболочечные вирусы в фекалиях детей с острым гастроэнтеритом СсУ - вирион коронавируса ТсУ - вирион торовируса КЬУ - частицы флави-подобного вируса (пестивируса2)

Ш в)

Я 30 * !

О 25 I О

О 20 15

□ Ротавирус

■ Торовирус

■ Норовирус

дЛ ...Л

< 2001 г. > <

СГ ^ ^ ^ ^ ^

о ^

2002 г.

2003 г

Рис 7 Сезонное распределение вирусных ысгроэшершов у дегеи в Санкт-Петербург

3. Сравнительная диагностика ротавирусной инфекции методами ЭМ и ИФА

Выявление ротавирусной инфекции методами ЭМ и ИФА производили на двух сериях образцов. Первая серия состояла из 73 образцов фекалий детей, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит» в сезон 2001-2002гг. Образцы исследовались при помощи ЭМ в НИИ гриппа РАМН, а также методом ИФА в НИИ детских инфекций (тест-система «ВЕКТОР-БЕСТ») и в б-це им. Боткина (тест-система «АКВАПАСТ»).

При сравнении результатов исследований оказалось, что ЭМ-диагностика с использованием углеродно-полимерных подложек по количеству выявленных случаев ротавирусной инфекции (52 случая) вдвое превосходила иммуноферментную диагностику (26 случаев) В 38 случаях результаты диагностики различными методами не совпадали. В 32 случаях ротавирусы были обнаружены при помощи ЭМ, но ротавирусный антиген не был выявлен в ИФА. В 6-ти случаях ротавирусный антиген был выявлен в ИФА, однако в соответствующих образцах были обнаружены торовирусы и аденовирусы, но не ротавирусы.

Для ответа на вопрос, чем было вызвано столь значительное расхождение результатов ЭМ и ИФА, при анализе второй серии образцов была поставлена задача: определить чувствительность и специфичность иммуноферментных тест-систем (ИФТС) в сравнении с ЭМ.

Вторая серия состояла из 177 образцов, собранных в сезон 2002-2003 гг Методом ЭМ ротавирусы были обнаружены в 121 случае (68%), торовир\сы в 14-ти, норовирусы в 16-ти, аденовирусы в 4-х, астровирусы в 3-х случаях, коронавирусы в 3-х случаях. В 7-ми образцах патогенных вирусов выявлено не было. В 9 случаях были выявлены сочетанные инфекции (ЯУ-ТУ в 7 случаях, ЯУ+№У - в 1сл„ ЯУ+Аё - в 1сл.). Всего ротавирусы методом ЭМ были выявлены в 130 случаях (73%). Образцы второй серии были исследованы в лаборатории НИИ гриппа РАМН при помощи ИФТС «АКВАПАСТ», поскольку в первом опыте данная тест-система показала лучшие результаты в сравнении с ИФТС «ВЕКТОР-БЕСТ».

Интерпретация результатов ИФА в значительной степени зависит от выбора критической оптической плотности ОПкрит («граница отсечки», сШ:-ой). Для исключения неспецифических реакций в ИФА методически наиболее правильным является определение ОПкритГ как удвоенной ОП492 в реакции с гетерологичными вирусными антигенами.

На рис. 7 представлены результаты определения ОП492 для образцов второй серии, сгруппированных по различным вирусам. Из приведенных данных видно, что наблюдались неспецифические реакции с гетерологичными антигенами, причем образцы, содержащие различные вирусы, существенно различались между собой по средним значениям ОП492

Рис 7 Средние значения ОП492 в иммуноферментном анализе (ИФА) образцов фекалий, содержащих различные кишечные вирусы В ИФА использовалась тест-система «Рота-антиген» (АКВАПАСТ)

Примечания ЯУ- ротавир>с. КУ - норовирус, ТУ - торовирус, СоУ -коронавирус, ЛёУ - аденовирус, ЯУ+У - ротавирус + какой-либо из кишечных вирусов К(-) - отрицательный контроль Вертикальными отрезками показаны средние квадратичные отклонения

Наиболее высокие значения ОП492 среди гетерологичных антигенов были получены для образцов, содержащих торовирусы (среднее значение -0,78) Одним из возможных объяснений неспецифических реакций в данном случае могло быть наличие антител к торовирусам в сыворотке телят, используемой в производстве ИФТС Данное объяснение вполне правдоподобно, поскольку торовирусы телят, обладающие антигенным родством с торовирусами человека, повсеместно распространены в стадах (БискшаПюп Ь Ы а!, 1998, Ной А Е Ы а1, 2002) Высокие значения ОП492 были получены также для образцов, содержащих аденовирусы (среднее значение - 0,67) Причина неспецифических реакций в данном случае могла быть той же самой Наименьшие значения ОП492 в реакции с гетерологичными антигенами были получены для образцов, содержащих норовирусы (среднее значение - 0,24)

По результатам ИФА целесообразно было определить ОПКрит как* ОПКрит = ОП(Норо) х 2 = 0,48, где ОП(Норо) - среднее значение ОП492 для образцов, содержащих норовиру сы При таком определении ОПкрит число поюжительных ответов ИФА во второй серии образцов было равно 109, а

чувствительность и специфичность ИФТС в сравнении с ЭМ оказались равны 81% и 91%, соответственно.

Для более полной характеристики сравниваемых методов была определена чувствительность ЭМ и ИФТС в пересчете на минимальную выявляемую концентрацию вирусных частиц в исследуемых препаратах (см. раздел «материалы и методы»).

Среднее значение чувствительности ЭМ оказалось равно:

SparOM = 0,8 х 10" ч/мл (±35%).

Среднее значение чувствительности ИФТС было равно-

Spar. ИФТС = 0,9 х 106 ч/мл (±30%).

Таким образом, чувствительность ЭМ в пересчете на концентрацию вирусных частиц оказалась приблизительно равна чувствительности ИФТС.

При исследовании второй серии образцов (N=177) в 21 случае (17% от числа выявленных случаев) ротавирусный антиген не был выявлен в ИФА, несмотря на то, что в соответствующих образцах вирусные частицы были обнаружены при помощи ЭМ. В большинстве подобных случаев концентрация вирусных частиц в препаратах была достаточно высока (около 109 - 1011 ч/мл), и, следовательно, ложноотрицательные результаты ИФА нельзя было объяснить низкой чувствительностью ИФТС

Следует подчеркнуть, что чувствительность ЭМ в отличие от ИФА не зависит от антигенных свойств возб>дителя. Использованные в исследовании тест-системы были предназначены для выявления ротавирусов группы А. поэтому ложноотрицательные результаты ИФА в принципе могли быть обусловлены циркуляцией ротавирусов других антигенных групп, например, В и С. Для исключения данной версии было проведено определение форетипов ротавирусов методом электрофореза РНК в полиакриламидном геле.

Было проанализировано 37 образцов фекалий, в которых методом ЭМ было показано наличие частиц ротавирусов. Из них в 12 образцах ротавирусная инфекция не была выявлена при помощи ИФТС. Все образцы показали типичный для ротавирусов группы А паттерн миграции сегментов РНК (так называемый 4,2.3,2, паттерн) Было выявлено два форетипа, оба т н «длинного» типа, различающиеся по характеру миграции триплета 7,8,9 сегментов РНК. Корреляции форетипирования с результатами ИФА обнаружено не было.

Можно предположить, что относительно низкая в сравнении с ЭМ выявляемость ротавирусной инфекции методом ИФА была обусловлена высокой антигенной изменчивостью ротавирусов группы А. Для подтверждения данного предположения в дальнейших исследованиях планируется определить G[P]- типы ротавирусов.

Т.о., диагностика ротавирусной инфекции при помощи ЭМ с использованием полимерно-) глеродных подложек показала преимущество данного метода по сравнению с ИФА, выражающееся в значительно большем количестве (20-50%) выявленных случаев

выводы

1 Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами, исследовать адсорбцию вирусных частиц методами электронной микроскопии Впервые показано, что частицы ротавирусов, норовирусов, саповирусов и торовирусов обладают отрицательным электростатическим зарядом при нейтральных значениях рН Выявтено избирательное сродство кишечных вирусов к различным полимерам

2 Впервые обнаружены различия в заряде и адсорбционных свойствах кишечного аденовируса 41 типа и респираторного аденовируса 5 типа Выявленные различия могут быть использованы для установления принадлежности кишечных аденовирусов к подгруппе Б в отсутствие имм>нных сывороток

3 Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полидиметиламиноэтилметакрилатом (ПДМАЭМ) Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавир>са в клетку происходит «прямым» путем с декапсидацией непосредственно на мембране клетки

4 Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц На к типическом материале показана высокая эффективность метода, позволившего выявить на 25-50% больше случаев вирусного гастроэнтерита у детей по сравнению с традиционно применяемыми методиками

5 Показано, что этиопогическая структура и сезонное распределение ВГЭ у детей в С -Петербурге в общих чертах соответствуют таковым в странах Северной Европы В частности, впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы Впервые в России выявлена существенная этиологическая значимость торовирусной инфекции Обнаружено значительное число (6% от общего количества обследованных детей) сочетанных вирусных кишечных инфекций с участием торовирусов, что свидетельствует о возможности внутрибольничного распространения торовирусной инфекции

6 Составлено морфологическое описание наиболее значимых агентов ВГЭ Выявлены новые морфологические особенности норовирусов, способствующие более достоверной идентификации вирусных частиц в клиническич образцах

7 Показано преимущество ЭМ с использованием полимерно-углеродных подложек в сравнении с ИФА, выражающееся в том, что методом ЭМ бьпо выявлено на 20 - 50% больше случаев ротавирусной инфекции

Список публикаций по теме диссертации.

1 Васильев Б Я , Семенов Н В , Пудовкина И Ф, Сироткин А К , Су хинин В П Разделение ротавирусов человека и животных в прерывистом градиенте сахарозы с помощью высокоскоростного центрифугирования // Вопр вирусологии, - 1991 - Т 36, №6 - С 516-5! 7

2 Васильев Б Я , Семенов Н В , Новикова Н А , Епифанова Н В , Сироткин А К, Сухинин В П Электрофоретическая гетерогенность популяции ротавирусов, выделенных в Ленинграде в осенне-зимний сезон 1986-1987гг//Вопросы вирусологии,- 1990 -Т35,№2 -С 156-157

3 Васильев БЯ, Семенов ИВ, Сухинин ВП, Сироткин А К, Горбачев Е Н , Артюхов А И, Вербов В Н . Носков Ф С Сравнение методов лабораторной диагностики ротавирусных гастроэнтеритов в условиях практической лаборатории// Вопр вирусологии -1989 - Т 34, №2 - С 247249

4 Васильев Б Я , Семенов Н В , Москвин А А , Сухинин В П , Сироткин А К , Горбачев Е Н , Артюхов А И , Вербов В Н , Носков Ф С Этиологическая роль ротавирусов в кишечной патологии взрослых и детей // Вопросы вирусологии, - 1989 - Т 34, № 1 - С 106-109

5 Васильев Б Я, Сухинин В П, Сироткин А К Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики ротавирусны\ инфекций // Сб трудов НИИ УАМН, Киев, - 1989 - С 35-36

6 Васильев Б Я, Сироткин А К, Сухинин В П Применение ПЭМ в диагностике небактериальных гастроэнтеритов// Сб "Острые кишечные инфекции",Л -1986 -С 16-18

7 Галко Н В , Макарова Г Н , Вашукова С С , Сафонова Н В , Су хинин В П Сироткин А К Обнаружение ротавируса в фекалиях четей больных диареей // Вопросы вирусологии, - 1984, - Т 29, №5,- С 596-599

8 Романовская-Романько Е А , Сироткин А К. Сравнительная диагностика ротавирусной инфекции с помощью ИФА и электронной микроскопии// Материалы X международной научной конференции студентов аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 15-18 апреля 2003 стр 47

9 Романовская-Романько Е А. Сироткин А К, Б)лавинов ИВ Высокая гетерогенность циркулирующих штаммов ротавирусов в Петербурге в сезон 2001-2002 гг // Материалы десятой молодежной конференции СПбГУ СПб,-2003 -С 138-140

10 Румель Н Б , Мурадян А Я , Осидак Л В , Сироткин А К , Голованова А К ЮрловаТ И Результаты серо-эпидемиологического изучения коронавирусной инфекции у детей и взрослых Санкт-Петербурга / ЖМЭИ (в печати)

11 Сергеева Н В , Тихомирова О В , Сироткин А К Аксенов О А Клиническое течение вирусных гастроэнтеритов у детей // Материалы научной конференции и VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням "Проблема инфекции в клинической медицине" СПб, 5-6 дек 2002, с 306-307

]2.Сироткин А.К., Голованова А.К., Румель Н.Б., Ныркова О.И., Сергеева Н.В Выделение коронавируса, фенотипически подобного коронавирусу SARS. от ребенка 5-ти лет с респираторно-кишечной симптоматикой. // Материалы международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4 -5 сент. 2003., стр. 118-1!9.

13.Сироткин А.К.,' Романовская-Романько Е.А., Третьякова Н.В. Циркуляция ротавирусов группы А в Санкт-Петербурге в 2001-2003 гг.// Материалы международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», СПб, 4 -5 сент. 2003., стр. 118.

И.Сироткин А.К.. Сергеева Н.В.. Тихомирова О.В., Воробьев М.М. Роль торовир\сов в этиологи ОКИ у детей. // Материалы второго конгресса педиатров-инфекционистов России, Москва. 8-10 декабря 2003г., С. 205.

15.Сироткин А.К., Сергеева Н.В., Тихомирова О.В.,. Воробьев М.М., Романовская- Романько ЕА Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге в 2001-2003 гг. II Материалы международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», Санкт-Петербург, 4 -5 сент. 2003., стр. 117-118.

16.Сироткин А.К., Сергеева Н.С., Тихомирова О.В., Воробьев М.М., Мурадян А.Я. Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Петербурге по данным электронно-микроскопических исследований// В сб. «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей». Мат.-лы первого конгресса педиатров-инфекционистов России. М., 4-6 декабря 2002г., с. 186.

17.Сироткин А.К., Сухинин В.П., Григорьева В.И., Часнык В.Г. Морфологические критерии электронно-микроскопической диагностики коронавирусных и торовирусных гастроэнтеритов у детей и взрослых// В сб. "Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций", материлы Всероссийской научн. конф., СПб, - 2001, - с. 37.

!8.Сироткин А.К., Сухинин В.П.. Назарова О.В., Гаврилова И.И., Панарин Е.Ф. Синтетические полимеры в изучении адсорбции вирусных частиц// Доклады Академии Наук, - 2003, - т. 388, №6, - с. 1-4.

19.Сироткин А.К, Сухинин В.П., Сергеева Н.В., Назарова О.В., Панарин Е.Ф, Мурадян А.Я. Эффективная электронно-микроскопическая диагностика калицивирусов разных геногрупп на основе общих электростатических свойств вирусных частиц// В сб.: "Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций". Материалы Всеросс. научн.-практ. конф., СПб, - 2002, - с. 103.

20.Тихомирова О.В., Сергеева Н.В., Сироткин А.К., Кветная A.C. Эффективность использования пробиотиков у детей с вирусными диареями // Материалы Первого Конгресса педиатров-инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей», Москва, 4-6'дек. 2002.-с. 194.

21 Тихомирова О В , Сергеева Н В , Сироткин А К , Аксенов О А , Кветная А С Вирусные диареи у детей особенности клинического течения и тактика терапии // Детские инфекции, - 2003, - №3, с 7-10

22 Sirotkin А К, Nazarova О V , Gavriova I I, Panann E F Synthetic Polymers in Visualisation and Investigation of Virus Adsorption// Abstracts of 4-th Internationa! Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems". St -Peterdburg, June 3-7, - 2002, - p 137

Благодарности

Исследования были частично поддержаны грантом И0549 федеральной целевой программы «ИНТЕГРАЦИЯ» Автор выражает глубокую признательность руководству программы за поддержку исследований по данному проекту

Проведенное исследование было бы невозможно без заинтересованного участия многих людей Не имея возможности поблагодарить всех участников, автор приносит искреннюю благодарность научному руководителю к м н Сухинину В П ,

зав отделением клиники НИИ детских инфекций, дм н Тихомировой О В , к б н Сергеевой H В , д м н Аксенову О А

зав отделением детской инфекционной больницы №3 г С-Петербурга Воробьеву M M ,

кхн Назаровой OB ст н сотр ИВС РАН, осуществлявшей синтез полимеров,

Панарину Е Ф , члену-корреспонденту РАН, директору ИВС РАН за неизменный интерес к совместным исследованиям и консультации по вопросам химии полимеров,

д м н, проф Сомининой А А за критический анализ рукописи профессору Университета г Торонто доктору Мартину Петрику (Dr Martin Petric) за любезные консультации по морфологической идентификации торовирусов

OTric'urrtiHo u гоговнч ерш инал-чакстой ИАЦ BPFMfl Санкт-Пстеро\рт \ i Ириф Попона И 17 Гирал 100 jki Заказчик Сиротхии А К

2422

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сироткин, Алексей Константинович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Вирусные гастроэнтериты (обзор литературы).

3.1 .Роль вирусов в этиологии ОКИ.

3.2.Этиологические агенты вирусных гастроэнтеритов.

1.1.1. Аденовирусы.

1.1.2. Астровирусы.

1.1.3. Коронавирусы.

1.1.4. Норовирусы.

1.1.5. Ротавирусы.

1.1.6. Саповирусы.

1.1.7. Торовирусы.

1.1.8. Прочие кишечные вирусы.

1.1.9. Нормальная вирусная флора кишечника человека.

1.2.Практическая значимость дифференциальной диагностики вирусных гастроэнтеритов.

1.4.Электронная микроскопия в диагностике вирусных гастроэнтеритов.

1.4.1. Методы повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики.

1.4.2. Адсорбция вирусных частиц.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение углеродно-полимерных подложек в изучении адсорбции вирусных частиц и определении этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей методами электронной микроскопии"

Актуальность проблемы.

Вирусные гастроэнтериты у детей являются одной из важнейших проблем здравоохранения во всем мире. Только от ротавирусных диарей умирают около 500 ООО детей в год (Parashar U.D., Hummelman E.G. et al, 2003). Второе место по этиологической значимости занимают норовирусные инфекции, ответственные за подавляющее количество вспышек ОКИ, связанных с употреблением контаминированных пищевых продуктов (см. спец. выпуск J. Infect. Dis., 2000, May, V.181, Supl. 2). Благодаря интенсивным исследованиям, список патогенных и условно-патогенных кишечных вирусов постоянно пополняется. В настоящее время известно свыше десяти различных вирусов, вызывающих острый гастроэнтерит. Некоторые из них, например, торовирусы человека были идентифицированы лишь недавно (Jamieson F.B. et al, 1998).

Диагностика вирусных гастроэнтеритов в России в настоящее время находится в стадии разработки. Отечественными производителями выпускаются тест-системы только на ротавирусы группы А. Торовирусы, норовирусы, саповирусы, кишечные аденовирусы, коронавирусы, астровирусы не диагностируются. Расшифровка случаев ОКИ бактериальной и вирусной этиологии вместе взятых в России не превышает 30% (Детские инфекции, 2003, №1, с. 3).

На данный момент единственным диагностическим методом, позволяющим выявить весь спектр кишечных вирусов, является просвечивающая электронная микроскопия (ЭМ). В 1980-х годах в НИИ полиомиелитов в Москве проводилось изучение этиологии вспышек острого гастроэнтерита с использованием ЭМ в качестве основного метода детекции (Дроздов С.Г., 1983; Хаустов В.И. с соавт., 1989). Использовалась ЭМ и в исследованиях, проводимых в те же годы в Ленинграде (Галко Н.В., с соавт, 1984; Васильев Б.Я. с соавт., 1986; 1989; 1990; 1991). Исследования тех лет фокусировались в основном на этиологической роли ротавирусов, однако уже тогда было отмечено, что вирусные гастроэнтериты отличаются значительных разнообразием этиологических агентов. В наших исследованиях, в частности, было выявлено довольно много случаев коронавируснош гастроэнтерита (Васильев Б.Я. с соавт., 1990). К сожалению, с распадом СССР исследования были прерваны, и значимость многих вирусов в условиях России не была установлена.

Одним из недостатков ЭМ, снижающим эффективность ее применения, является относительно низкая чувствительность метода. Недавно автором был разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции калицивирусов при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами (Сироткин А.К. с соавт., 2002; Sirotkin А.К. et al, 2002). В основе метода лежит использование адсорбционных свойств вирусных частиц. С учетом множественной этиологии вирусных гастроэнтеритов возникла необходимость доработки метода и проверки его эффективности в электронно-микроскопической детекции широкого спектра вирусных агентов.

Другим существенным фактором, влияющим на результат электронно-микроскопической диагностики, является умение выделить характерные морфологические особенности кишечных вирусов. В отечественной литературе отсутствует морфологическое описание некоторых патогенных вирусов, в частности, саповирусов и торовирусов. Поэтому важной задачей настоящего исследования было составление морфологического описания этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов и наиболее характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника.

С возобновлением в 2002г. регулярных исследований совместно с НИИ детских инфекций МЗ РФ, у автора появилась возможность более полно изучить весь спектр кишечных вирусов и усовершенствовать их диагностику.

Поскольку большинство диагностических лабораторий в России выявляет ротавирусную инфекцию с помощью иммуноферментных тест-систем, в процессе исследования необходимо было также сравнить электронно-микроскопические методы выявления ротавирусной инфекции с ИФА по различным параметрам.

С учетом всего вышесказанного были сформулированы следующие цели и задачи:

Цель исследования

Задачи исследования:

1. Изучить адсорбцию кишечных вирусов на углеродных подложках, модифицированных различными синтетическими полимерами.

2. Разработать метод повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики вирусных гастроэнтеритов.

3. Изучить этиологическую структуру и сезонное распределение вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге.

4. Описать особенности морфологии патогенных кишечных вирусов и характерных представителей нормальной вирусной флоры кишечника.

5. Провести сравнительный анализ эффективности выявления ротавирусной инфекции методами ИФА и ЭМ с использованием углеродно-полимерных подложек.

Научная новизна.

Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая исследовать адсорбцию вирусных частиц при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами. Впервые показано, что частицы норовирусов, саповирусов, ротавирусов и торовирусов обладают отрицательным электростатическим зарядом при нейтральных значениях рН; выявлено избирательное сродство кишечных вирусов к аминогруппам синтетических полимеров.

Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической диагностики, позволяющий увеличить эффективность детекции этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов (количество выявленных случаев) на 25%. В основе метода лежит использование обнаруженного сродства вирусных рецепторов к аминогруппам синтетических полимеров.

Впервые обнаружены различия в заряде и адсорбционных свойствах кишечного аденовируса 41 типа и респираторного аденовируса 5 типа. Обнаруженные различия могут быть использованы для установления принадлежности аденовирусов к подгруппе F в отсутствие иммунных сывороток.

Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полимером ПДМАЭМ. Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавируса в клетки-мишени происходит «прямым» путем с «раздеванием» непосредственно на наружной мембране (Tihova М. et al, 2001).

Определена наиболее полная в России этиологическая структура вирусных гастроэнтеритов у детей. Установлена этиологическая значимость ротавирусов (46,1%), норовирусов (13,4%), торовирусов (11,5%), кишечных аденовирусов (2,3%), коронавирусов (1,2%), астровирусов (0,6%) и саповирусов (0,2%) в кишечной патологии детей, госпитализированных с диагнозом «острый гастроэнтерит». Впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы.

Впервые в России проведена диагностика и выявлена этиологическая значимость торовирусной инфекции. Помимо торовирусных моноинфекций выявлено значительное количество случаев сочетанных инфекций с участием торовирусов (6% от общего количества обследованных детей), что является подтверждением вывода канадских исследователей о широком внутрибольничном распространении торовирусной инфекции (Jamieson F.B. etal, 1998).

Получены оригинальные электронно-микроскопические изображения патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника. Выявлены не отмеченные ранее морфологические особенности строения норовирусов.

Показано преимущество усовершенствованной ЭМ в сравнении с отечественными тест-системами ИФА на ротавирусный антиген, выражающееся в том, что методом ЭМ было выявлено на 35% больше случаев ротавирусной инфекции.

Практическая значимость работы

Разработанная экспериментальная модель с использованием подложек, модифицированных синтетическими полимерами, позволяет получить качественно новую информацию об адсорбционных свойствах различных вирусов. Данная информация может найти применение в вирусологической диагностике, а также при разработке противовирусных препаратов, блокирующих инфекцию на стадии адсорбции. В частности, разработан новый метод, который позволяет повысить суммарную эффективность электронно-микроскопической детекции кишечных вирусов на 25%. Новый метод наиболее эффективен в диагностике норовирусных гастроэнтеритов, что имеет особое значение, поскольку тест-системы ИФА на норовирусы в России не выпускаются. Эффективная диагностика вирусных гастроэнтеритов в свою очередь важна как для лечения заболевания, так и для своевременного осуществления противоэпидемических мероприятий.

Электронная микроскопия в усовершенствованной модификации может более эффективно использоваться в качестве референс-метода при разработке диагностических тест-систем на различные кишечные вирусы.

Полученные микрофотографии патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника могут использоваться в качестве практического пособия для диагностики вирусных гастроэнтеритов, а также в образовательном процессе при подготовке вирусологов.

Установленная в исследовании этиологическая структура вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге позволяет выбрать приоритетные направления в разработке отечественных диагностических препаратов на вирусные кишечные инфекции.

Проведенная работа также позволила клиницистам, участвующим в исследовании, выявить клинические особенности протекания вирусных гастроэнтеритов различной этиологии и сформулировать критерии симптоматической диагностики вирусных ОКИ у детей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Просвечивающая электронная микроскопия с использованием углеродно-полимерных подложек является эффективным диагностическим методом, позволяющим выявлять широкий спектр этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов и проводить их первичную идентификацию до уровня семейства.

2. Этиология вирусных гастроэнтеритов у детей в Санкт-Петербурге отличается большим разнообразием циркулирующих агентов. Наибольшее значение в кишечной патологии детей имеют (в порядке значимости) ротавирусы, норовирусы, торовирусы, аденовирусы, коронавирусы и астровирусы.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на международном симпозиуме "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems", проходившем в Санкт-Петербурге с 3 по 7 июня 2002г, а также на международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», проходившем в Санкт-Петербурге с 4 по 5 сентября 2003г.

Материалы исследований были также доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета НИИ гриппа РАМН, а также на Всероссийской научно-практической конференции, «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций», СПб, 2001 и на Всероссийской научно-практической конференции «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций», СПб, 2002.

Сведения о внедрении

Усовершенствованные в работе методы электронно-микроскопической диагностики применяются в расшифровке этиологии ОКИ в клинике НИИ детских инфекций МЗ РФ и в 3-ей детской инфекционной больнице г. Санкт-Петербурга.

Полученные в исследовании электронные микрофотографии вирусов, этиологическая структура, сезонное распределение и другие материалы используются автором в курсе лекций и на практических занятиях по вирусологии на биолого-почвенном факультете СПбГУ, а также на курсах повышения квалификации для вирусологов при НИИ гриппа РАМН.

Публикации

По результатам исследований опубликовано 22 печатных работы, из них 9 статей в ведущих российских научных журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 9 рисунков, 25 электронных микрофотографий. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложения. Список литературы включает 32 отечественных и 266 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Сироткин, Алексей Константинович

Выводы

1. Разработана новая экспериментальная модель, позволяющая при помощи подложек, модифицированных синтетическими полимерами, получить информацию о заряде вирусных частиц, выявить сродство вирусных рецепторов к функциональным группам полимеров, изучить морфологические изменения частиц, связанные с адсорбцией.

2. Впервые обнаружены различия в заряде и адсорбционных свойствах кишечного аденовируса 41 типа и респираторного аденовируса 5 типа. Выявленные различия могут быть использованы для установления принадлежности кишечных аденовирусов к подгруппе F в отсутствие иммунных сывороток.

3. Впервые обнаружено явление декапсидации частиц ротавируса на подложках, модифицированных полидиметиламиноэтилметакрилатом (ПДМАЭМ). Обнаруженный факт свидетельствует в пользу гипотезы, согласно которой проникновение ротавируса в клетку происходит «прямым» путем с декапсидацией непосредственно на мембране клетки.

4. Разработан оригинальный метод повышения чувствительности электронно-микроскопической детекции вирусных частиц. На клиническом материале показана высокая эффективность метода, позволившего выявить на 25-50% больше случаев вирусного гастроэнтерита по сравнению с традиционно применяемыми методиками.

5. Показано, что этиологическая структура и сезонное распределение ВГЭ у детей в С-Петербурге в общих чертах соответствуют таковым в развитых странах северного полушария. В частности, впервые в России показано, что вторыми по значимости возбудителями острых гастроэнтеритов у детей после ротавирусов являются норовирусы.

6. Впервые в России выявлена существенная этиологическая значимость торовирусной инфекции. Обнаружено значительное число (6% от общего количества обследованных детей) сочетанных вирусных кишечных инфекций с участием торовирусов, что свидетельствует о возможности внутрибольничного распространения торовирусной инфекции.

7. Составлено морфологическое описание всех наиболее значимых агентов ВГЭ. Выявлены новые морфологические особенности норовирусов, способствующие более надежной идентификации вирусных частиц в клинических образцах.

8. Показано преимущество ЭМ с использованием полимерно-углеродных подложек в сравнении с ИФА при выявлении ротавирусной инфекции, выражающееся в том, что методом ЭМ было выявлено на 20 -50% больше случаев.

Практические рекомендации

По результатам работы можно сформулировать следующие практические рекомендации для микроскопистов-вирусологов, специализирующихся в диагностике вирусных гастроэнтеритов:

1. Более эффективной ЭМ- диагностики вирусных кишечных инфекций можно добиться, применяя простой и дешевый метод, разработанный в настоящем исследовании. Метод основан на использовании углеродных подложек, модифицированных синтетическим поликатионом ПААМ. Метод в особенности эффективен для выявления норовирусов и саповирусов, но может быть использован для повышения чувствительности ЭМ-диагностики в отношении широкого спектра кишечных вирусов.

2. При диагностике вирусных гастроэнтеритов можно ориентироваться на электронные микрофотографии и описание морфологии патогенных вирусов и нормальной вирусной флоры кишечника, полученные в настоящем исследовании. В дальнейшем автор надеется опубликовать подробное руководство по морфологической идентификации патогенных кишечных вирусов, в которое войдут не только изображения этиологических агентов вирусных гастроэнтеритов, но также различные артефакты и нормальная вирусная флора кишечника человека.

3. При морфологической идентификации торовирусов необходимо обращать особое внимание на возможные артефакты, в частности, т.н. «опушенные» частицы (fringed particles). По единичным вирусоподобным частицам, напоминающим торовирусы, не рекомендуется делать заключение об обнаружении торовирусной инфекции. Необходимо найти не менее 8-10 частиц с хорошо различимыми поверхностными рецепторами. Следует иметь в виду, что торовирусы чувствительны к воздействию электронов, поэтому просмотр и фотографирование рекомендуется производить как можно быстрее и при минимальной интенсивности пучка.

4. Клинические образцы фекалий, в которых методом ЭМ были обнаружены частицы торовирусов, следует проверять более чувствительными методами на наличие ротавирусов, т.к. при сочетанных инфекциях типа торовирус+ротавирус количество частиц торовируса в препаратах намного превышает количество частиц ротавируса.

5. При идентификации норовирусов нужно обращать внимание на наличие «пустых» частиц и симметричное расположение капсомеров на поверхности частиц. Характерной морфологической особенностью норовирусов является ромбовидная форма «пустых» частиц.

6. В качестве контрастирующего вещества следует применять 1,5-2% раствор калиевой либо натриевой соли ФВК, но не 1 % ураниацетат, т.к. применение уранилацетата не позволяет выявить характерную морфологию норовирусов.

7. Образцы, отрицательные в ИФА на ротавирусный антиген, подлежат исследованию на ротавирус методами ЭМ, т.к. тест-системы ИФА выявляют далеко не все случаи ротавирусной инфекции.

8. Отрицательные в ИФА образцы с высоким содержанием частиц ротавирусов подлежат типированию, т.к. могут свидетельствовать о появлении новых серотипов ротавирусов.

9. Применение ультрацентрифугирования для концентрации вирусных частиц в суспензии фекалий не является целесообразным, поскольку затраты времени и использование дорогостоящего оборудования не оправдывают себя. Морфология торовирусов и коронавирусов при ультрацентрифугировании может быть нарушена.

В целом, по результатам исследования можно рекомендовать использование электронной микроскопии в тех учреждениях, где это возможно, для выявления широкого спектра возбудителей вирусных гастроэнтеритов у детей и взрослых.

Кроме того, при разработке тест-систем ИФА на ротавирусную инфекцию желательно в качестве референс-метода использовать ЭМ в усовершенствованной модификации для определения чувствительности и специфичности тест-систем.

Благодарности

Исследования были частично поддержаны грантом И0549 федеральной целевой программы «ИНТЕГРАЦИЯ». Автор выражает глубокую признательность руководству программы за поддержку исследований по данному проекту.

Проведенное исследование было бы невозможно без заинтересованного участия многих людей. Не имея возможности поблагодарить всех участников, автор приносит искреннюю благодарность: научному руководителю к.м.н. Сухинину В.П., зав. отделением клиники НИИ детских инфекций, д.м.н. Тихомировой О.В. к.б.н. Сергеевой Н.В., д.м.н. Аксенову О.А. зав. отделением детской инфекционной больницы №3 г. С-Петербурга Воробьеву М.М., к.х.н. Назаровой О.В. ст.н.сотр. ИВС РАН, осуществлявшей синтез полимеров,

Панарину Е.Ф., члену-корреспонденту РАН, директору ИВС РАН за неизменный интерес к совместным исследованиям и консультации по вопросам химии полимеров, д.м.н., проф. Сомининой А.А. за критический анализ рукописи, профессору Университета г. Торонто доктору Мартину Петрику (Dr. Martin Petric) за любезные консультации по морфологической идентификации торовирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сироткин, Алексей Константинович, Санкт-Петербург

1. Букринская А.Г., Грачева Н.М., Васильева В.И. Ротавирусная инфекция // М., «Медицина», 1989. 278 с.

2. Быковский А.Ф., Ершов Ф.И., Кармышева В.Я., Блюмкин В.Н., Миронова Л.Л. Атлас вирусной цитопатологии // М., «Медицина», 1975, 260 с.

3. Авакян А.А., Быковский А.Ф. Атлас анатомии и онтогенеза вирусов человека и животных // М., «Медицина», 1970, 270 с.

4. Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция // СПб, изд-во «Лань», 2000, 272 с.

5. Васильев Б.Я., Семенов Н.В., Москвин А.А., Сухинин В.П., Сироткин А.К., Горбачев Е.Н., Артюхов А.И., Вербов В.Н., Носков Ф.С. Этиологическая роль ротавирусов в кишечной патологии взрослых и детей // Вопросы вирусологии, -1989.- т.34, №1,- с. 106-109.

6. Васильев Б.Я., Сироткин А.К., Сухинин В.П. Применение ПЭМ в диагностике небактериальных гастроэнтеритов // Сб. "Острые кишечные инфекции", Л.-1986.-, с.37-39.

7. Галко Н.В., Макарова Г.Н., Вашукова С.С., Сафонова Н.В., Сухинин В.П., Сироткин А.К. Обнаружение ротавируса в фекалиях детей, больных диареей // Вопросы вирусологии, 1984. - Т.5, - с.596-599.

8. Гончарук Е.И., Шевцова З.В., Крылова Р.И., Румель Н.Б. Коронавирусная инфекция обезьян как модель инфекции человека // Доклады Акад Наук СССР, -1992.- т.325, №4, с. 845-849.

9. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за 2002 г., данные МЗ РФ// Детские инфекции, -2003. т. 1, №2. - с. 3.

10. Лурия С., Дарнелл Дж., Балтимор Д., Кэмпбелл Э. Общая вирусология// Пер с англ. М.: «Мир», -1981., 381с.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование// пер с англ.- М.: «Мир», 1984., 325с.

12. Мухина А.А., Шипулин Г.А., Боковой А.Г., Яцышина С.Б. Первый опыт изучения калицивирусной инфекции у детей в Москве// Вопросы вирусологии, -2002-, т.47, №6,- с.33-37.

13. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Фардзинова В.Ф., Чечуева Л.И., Февралева Е.Л., Кашников А.Ю. Обнаружение атипичных ротавирусов человека и их характеристика// Ж. Микр. Эпид. Иммун., -1994.-, №2, с. 103-106.

14. Романовская-Романько Е.А., Сироткин А.К., Булавинов И.В. Высокая гетерогенность циркулирующих штаммов ротавирусов в Петербурге в сезон 2001-2002 гг // Тезисы молодежной конференции СПбГУ. 2003, с. 138-140.

15. Румель Н.Б., Мурадян А .Я., Осидак Л.В., Сироткин А.К., Голованова А.К., Юрлова Т.И. Результаты серо-эпидемиологического изучениякоронавирусной инфекции у детей и взрослых Санкт-Петербурга // Ж. Микр. Эпид. Иммун. (в печати).

16. Сироткин А.К., Сухинин В.П., Назарова О.В., Гаврилова И.И., Панарин Е.Ф. Синтетические полимеры в изучении адсорбции вирусных частиц // ДАН, -2003.-, т.388, №6, с.1-4.

17. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных, М.: Изд-во ВНИТИБП, 1998, 928с.

18. Тихомирова О.В. Перспективы улучшения исходов острых кишечных инфекций у детей // Материалы Всеросс. научн-пр. конф. «Перспективы снижения инфекционной заболеваемости и летальности детей: патогенез, терапия, профилактика». СПб., 2001, с.4.

19. Тихомирова О.В., Сергеева Н.В., Сироткин А.К., Кветная А.С. Вирусные диареи у детей: особенности клинического течения и тактика терапии // Детские инфекции, 2003. - , №3, с. 7-10.

20. Тихомирова О.В., Сергеева Н.В., Сироткин А.К., Кветная А.С. Эффективность использования пробиотиков у детей с вирусными диареями // Материалы первого конгресса педиатров-инфекционистов России. Москва, 4-6 декабря 2002 г., с. 194.

21. Хаустов В.И., Шекоян JI.A.,Королев М.Б.,Миронова JI.JI., Донец М.А., Дроздов С.Г. Вирусологическая и серологическая характеристика вспышек и спорадических случаев острого гастроэнтерита// Вопросы вирусологии, -1989.- т.34, № 2, с.221-225.

22. Шевцова З.В., Иванов М.Т., Лапин Б.А., Федоринов В.В., Корзая Л.И., Крылова Р.И., Гончарук Е.И., Нинуа Г.А. Инфицированость коронавирусами обезьян сухумского заповедника// Вестн. Акад. Мед. Наук СССР, -1986, №3, - с. 26-28.

23. Abe О., Kimura Н., Minakami Н., Akami М., Inoue М., Saito A., Otsuki К. Outbreak of gastroenteritis caused by echovirus type 6 in an orphanage in Japan//J Infect.- 2000.- V.41, N.3, P.285-286.

24. Agnello V., Abel G., Elfahal M., Knight G.B., Zhang Q.X. Hepatitis С virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor// Proc Natl Acad Sci USA. -1999.- V.96, N.22.-P.12766-12771.

25. Albinsson В., Kidd A.H. Adenovirus type 41 lacks an RGD integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells // Vir. Res. -1999.- V.64, P. 125-136.

26. Allard A., Albinsson В., Wadell G. Rapid typing of human adenoviruses by a general PCR combined with restriction endonuclease analysis // J. Clin. Microbiol. -2001- V.39, N.2(Feb), -P.498-505.

27. Almeida J.D. Practical aspects of diagnostic electron microscopy // Yale J. Biol. Med.-1980.- V.53,N.1,-P. 5-18.

28. Almeida J.D. Rapid viral diagnosis by electron microscopy // Scand J Infect Dis Suppl -1982.- V.36, P.l 17-120.

29. Ando Т., Noel J.S., Fankhauser R.L. Genetic classification of "Norwalk-like viruses // J Infect Dis. 2000 - May; V.181, Suppl 2, - P.S336-S348.

30. Appleton H. Small round viruses: classification and role in food-borne infections// Ciba Found. Symp. -1987.- V.128, P.l08-125.

31. Arabia F.A., Rosado L.J., Huston C.L., Sethi G.K., Copeland J.G. 3rd. Incidence and recurrence of gastrointestinal cytomegalovirus infection ift heart transplantation// Ann. Thorac. Surg. -1993.- V.55, N.l, -P. 8-11.

32. Arias C., Isa P., Guerrero C.A. et al. Molecular biology of rotavirus cell entry // Arch. Med .Res.- 2002.-Vol. 33, №4.- P. 356-361.

33. Atmar R.L., Estes M.K. Diagnosis of Noncultivatable Gastroenteritis Viruses, the Human Caliciviruses // Clin Microbiol Rev, -2001.- Vol. 14, N.l P. 15-37.

34. Ball J.M., Tian P., Zeng C.Q., Morris A.P., Estes M.K. Age-dependent diarrhea induced by a rotaviral nonstructural glycoprotein // Science. -1996.- V. 272, N.5258. — P. 101 -104.

35. Bass D.M., Baylor M., Chen C., Upadhyayula U. Dansylcadaverine and cytochalasin D enhance rotavirus infection of murine L cells // Virology. -1995.- V. 212, N.2. P. 429-437.

36. Bass D.M., Qiu S. Proteolytic processing of the astrovirus capsid // J Virol. -2000- V.74, N.4, P. 1810-1814.

37. Bass D.M., Upadhyayula U. Characterization of human serotype 1 astrovirus-neutralizing epitopes // J Virol. -1997.- V. 71, N.l 1. P. 8666-8671.

38. Beards G.M., Hall C., Green J., Flewett Т.Н., Lamouliatte F., Du Pasquier P. An enveloped virus in stools of children and adults with gastroenteritis that resembles the Breda virus of calves // Lancet. -1984.- May 12; 1(8385), -P.1050-1052.

39. Becker K.M., Мое C.L., Southwick K.L., MacCormack J.N. Transmission of Norwalk virus during football game // N Engl J Med -2000.- V.343, N. 17. -P.1223-1227.

40. Beilharz M.W. Therapeutic potential for orally administered type 1 interferons. // PSTT -2000.- V. 3, N.6. P.36-42.

41. Bern C., Glass R.I. Impact of diarrheal diseases worldwide// In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., 1994. pp.1-18.

42. Bern C., Martines J., de Zoysa I., Glass R.I. The magnitude of the global problem of diarrhoeal disease: a ten-year update // Bulletin of the World Health Organization -1992.-V.70, P.705-714.

43. Biel S.S., Gelderblom H.R. Electron microscopy of viruses // In: Virus Culture. A Practical Approach., Ed. by Cann A.J., Oxford University Press, -1999.-pp.l 11-148.

44. Biel S.S., Gelderblom H.R. Diagnostic electron microscopy is still a timely and rewarding method // J. Clin. Virol. -1999.- V. 13, N.l-2, P. 105-119.

45. Bishop R.F., Davidson G.P., Holmes I.H., Ruck B.J. Virus particles in epithelial cells of duodenal mucosa from children with non-bacterial gastroenteritis // Lancet -1973.- N.2. P. 1281-1283.

46. Bishop R. Natural history of rotavirus infection // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994. P. 175-210.

47. Bridger J.C. Non group A rotaviruses// In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994.- p.369-408.

48. Campbell S.M., Crowe S.M., Мак J. Lipid rafts and HIV-1: from viral entry to assembly of progeny virions // J Clin Virol. -2001.- V.22, N.3. P.217-227.

49. Carter M.J., Willcocks M.M. The molecular biology of astroviruses // Arch. Virol. Suppl. -1996.- V.12,- P.277-85.

50. Caul E.O. Human enteric coronaviruses // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994.- P.409-458.

51. Cavanagh D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae // Arch. Virol. -1997.- V.142, N.3. P.629-633.

52. Cavanagh D. Coronaviruses and Toroviruses // In Principles and Practice of Clinical Virology. 4-th Edition., Ed. by A.E. Zuckeman, J.E. Banatvala, J.R. Pattison. -2000.- John Wiley & Sons, Ltd. Chichester etc. P. 345-356.

53. Centers for Disease Control and Prevention. Norovirus Activity — United States, 2002 // MMWR 2003.- V.52, - P. 41-45.

54. Centers for Disease Control and Prevention. Outbreaks of Gastroenteritis Associated with Noroviruses on Cruise Ships — United States, 2002 // MMWR -2002.-V.51,- P.l 112-1115.

55. Centers for Disease Control and Prevention. Withdrawal of rotavirus vaccine recommendation // MMWR -1999.- V.48, N.43. P. 1007.

56. Chakrabarti S., Collingham K.E., Stevens R.H., Pillay D., Fegan C.D., Milligan D.W. Isolation of viruses from stools in stem cell transplant recipients: a prospective surveillance study // Bone Marrow Transplant. -2000.- V.25, N.3, -P.277-282.

57. Chandra R. Picobirnavirus, a novel group of undescribed viruses of mammals and birds: a minireview // Acta Virol. -1997.- V.41, N.l. P. 59-62.

58. Chiba S., Nakata S., Numata-Kinoshita K., Honma S. Sapporo virus: history and recent findings // J. Infect. Dis. -2000.- V.181, Suppl 2, P.S303-S308.

59. Christopher P.J., Grohmann G.S., Millson R.H., Murphy A.M. Parvovirus gastroenteritis a new entity for Australia // Med. J. Aust. -1978.- V.l, N.3, -P.121-124.

60. Coria M.F., Schmerr M.J., McClurkin A.W. Characterization of the major structural proteins of purified bovine viral diarrhea virus // Arch Virol. -1983.-V.76, N.4. P.335-339.

61. Coulson B.S., Londrigan S.L., Lee D.J. Rotavirus contains integrin ligand sequences and a disintegrin-like domain that are implicated in virus entry into cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997.- V. 94, N.5. - P. 5389-5394.

62. Cuadras M.A., Greenberg H.B. Rotavirus infectious particles use lipid rafts during replication for transport to the cell surface in vitro and in vivo// Virology. -2003.- V.313, N.l. P.308-321.

63. Cubbit D. Human Caliciviruses // In A.Z.Kapikian (ed), Viral infections of the gastrointestinal tract, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc.,New York, N.Y.-1994.-P.356-375.

64. Doane F.W. & Anderson N. Electron Microscopy in Diagnostic Virology, a Guide and Atlas // Cambridge, -1986. 282p.

65. Doane F.W. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses // In A.Z.Kapikian (ed), Viral infections of the gastrointestinal tract, 2nd ed. Marcel Dekker, Inc., N.Y. -1994.- p. 101-130.

66. Dolin R, Blacklow N.R., DuPont H., Buscho R.F., Wyatt R.G., Kasel J.A., Hornick R., Chanock R.M. Biological properties of Norwalk agent of acute infectious nonbacterial gastroenteritis // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1972.-V.140, N.2, P.578-583.

67. Duckmanton L., Carman S., Nagy E. Petric M. Detection of bovine torovirus in fecal specimens of calves with diarrhea from Ontario farms // J. Clin. Microbiol.- 1998.- Vol.36, №5.- P.1266-1270.

68. Duckmanton L., Luan В., Devenish J., Tellier R., Petric M. Characterization of torovirus from human fecal specimens // Virology -1997.- V.239, N.l. P.158-168.

69. Ehrnst A., Erikson M. Epidemiological features of type 22 echovirus infection// Scand. J. Infect. Dis.-1993.-V.25, P.275-281.

70. Estes M.K. Rotaviruses and their replication // In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 3rd ed. Raven Press, Ltd., N.Y. -1996.-p. 1625-1655.

71. Falconer M.M., Gilbert J.M., Roper A.M., Greenberg H.B., Gavora J.S. Rotavirus-induced fusion from without in tissue culture cells // J. Virol. -1995.-V.69, N.9. — P. 5582-5591.

72. Falk P.G., Hooper L.V., Midtvedt Т., Gordon J.I. Creating and maintaining the gastrointestinal ecosystem: what we know and need to know from gnotobiology// Microbiol Mol Biol Rev. -1998.- V.62, N.4. P.l 157-1170.

73. Favier A.L., Schoehn G., Jaquinod M., Harsi C., Chroboczek J. Structural studies of human enteric adenovirus type 41 // Virology. -2002.- V.293, N.l. -P.75-85.

74. Flewett Т.Н., Bryden A.S., Davies H., Morris C.A. Epidemic viral enteritis in a long-stay children's ward // Lancet -1975.- N.l. -P.4-5.

75. Flewett Т.Н., Bryden A.S., Davies H. Diagnostic electron microscopy of faeces. I. The viral flora of the faeces as seen by electron microscopy // J Clin Pathol. -1974.-V.27, N.8. P.603-608.

76. Fong C.K. Electron microscopy for the detection of viruses in clinical specimens // In Hsiung GD. "Hsiung's Diagnostic Virology", fourth ed. Yale University Press, -1994.- P. 189-216.

77. Fong C.K. Electron microscopy for the rapid detection and identification of viruses from clinical specimens // Yale J. Biol. Med. 1989.- V.62, N.2. -P.l 15-130.

78. Gallimore C.I, Appleton H., Lewis D., Green J., Brown D.W. Detection and characterisation of bisegmented double-stranded RNA viruses (picobirnaviruses) in human faecal specimens // J. Med. Virol. -1995.- V.45, N.2. -P.135-140.

79. Gentsch J.R., Glass R.I., Woods P., Gouvea V., Gorziglia M., Flores J. et al. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction// J. Clin. Microbio.l -1992.-V.30. P.1365-1373.

80. Giangaspero M., Harasawa R., Verhulst A. Genotypic analysis of the 5'-untranslated region of a pestivirus strain isolated from human leucocytes// Microbiol. Immunol. -1997.-V.41, N.10. -P.829-834.

81. Giangaspero M., Vacirca G., Buettner M., Wolf G., Vanopdenbosch E., Muyldermans G. Serological and antigenical findings indicating pestivirus in man//Arch. Virol. Suppl. -1993a.-V.7. -P.53-62.

82. Giangaspero M., Vacirca G., Morgan D., Baboo K.S., Luo N.P., DuPont H.L., Zumla A. Anti-bovine viral diarrhoea virus antibodies in adult Zambian patients infected with the human immunodeficiency virus// Int. J. STD. AIDS. -1993b.- V.4, N.5. P.300-302.

83. Giangaspero M., Vacirca G., Harasawa R., Buttner M., Panuccio A., De Giuli Morghen C., Zanetti A., Belloli A., Verhulst A. Genotypes of pestivirus RNA detected in live virus vaccines for human use // J. Vet. Med. Sci. -2001.-V.63, N.7. — P.723-733.

84. Giordano M.O., Martinez L.C., Rinaldi D., Espul C., Martinez N., Isa M.B. et al. Diarrhea and enteric emerging viruses in HIV-infected patients // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -1999.- V.15, N.16. P.1427-1432.

85. Giordano M.O., Martinez L.C., Rinaldi D., Guinard S., Naretto E., Casero R. et al. Detection of picobirnavirus in HIV-infected patients with diarrhea in Argentina // J. Acquir. Immune Defic Syndr Hum. Retrovirol. -1998.- V.18, N.4. -P.380-383.

86. Glass R.I., Bresee J.S., Parashar U.D., Gentsch J.R. First rotavius vaccine licensed: is there really a need? // Acta Pediatr. Suppl, -1999.- i.426, P. 2-8.

87. Glass P.J., White L.J., Ball J.M., Leparc-Goffart I., Hardy M.E., Estes M.K. Norwalk virus open reading frame 3 encodes a minor structural protein // J.Virol. -2000.- V.74, N.14. P.6581-6591.

88. Goodgame R.W. Viral causes of diarrhea // Gastroenterol. Clin. North. Am. -2001.- V.3 0, N.3. P.779-795.

89. Goodgame R.W. Viral infections of the gastrointestinal tract // Curr. Gastroenterol. Rep. 1999.- N.4. - P.292-300.

90. Gordon, L., H. S. Ingraham, and R. F. Korns. Transmission of epidemic gastroenteritis to human volunteers by oral administration of fecal filtrates // J.Exp. Med. -1947.- V.86, P.409^122.

91. Gouvea V., Glass R.I., Woods P., Taniguchi K., Clark H.F., Forrester B. et al. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens // J. Clin. Microbiol. -1990.- V.28, P.276-282.

92. Graham K.L, Halasz P., Tan Y., et al. Integrin-using rotaviruses bind alpha2betal integrin alpha2 I domain via VP4 DGE sequence and recognize alphaXbeta2 and alphaVbeta3 by using VP7 during cell entry // J. Virol. -2003.-V.77, N. 18. — P.9969-9978.

93. Green K.Y., Ando Т., Balayan M.S., Berke Т., Clarke I.N., Estes M.K., Matson D.O., Nakata S., Neill J.D., Studdert M.J., Thiel H.J. Taxonomy of the caliciviruses //J. Infect. Dis. -2000.- V.181, Suppl 2, P.S322-S330.

94. Grohmann G.S., Glass R.I., Pereira H.G., Monroe S.S., Hightower A.W., Weber R., Bryan RT. Enteric viruses and diarrhea in HIV-infected patients. Enteric Opportunistic Infections Working Group // N. Engl. J. Med. -1993.-V.329, N.l. P. 14-20.

95. Guerrant, R.L., J.M. Hughes, N.L. Lima, and J.Crane. Diarrhea in developed and developing countries: magnitude, special settings, and etiologies. // Rev. Infect. Dis. -1990.-V.12, P.S41-S50.

96. Hamano M., Kuzuya M., Fujii R., Ogura H., Mori T. et al. Outbreak of Acute Gastroenteritis Caused by Human Group С Rotaviru in a Primary School// Jpn. J. Infect. Dis., -1999.- V.52, P. 35-38.

97. Hammond G.W., Hazelton P.R., Chuang I., Klisko B. Improved detection of viruses by electron microscopy after direct ultracentrifuge preparation of specimens // J. Clin. Microbiol. -1981.- V.14, N.2. P.210-221.

98. Harasawa R., Sasaki T. Sequence analysis of the 5' untranslated region of pestivirus RNA demonstrated in interferons for human use // Biologicals. -1995.- V.23, N.4. P.263-269.

99. Hayat M.A. Principles and Techniques of Electron Microscopy. Biological applications. 4-th ed // Cambridge University Press. -2000.

100. Hedlund K.O., Rubilar-Abreu E., Svensson L. Epidemiology of calicivirus infections in Sweden, 1994-1998// J Infect Dis. -2000.- V.181, Suppl 2. -P.S275-S280.

101. Hensley L.E., Fritz E.A., Jahrling P.B., Karp C.L., Huggins J.W., and T.W. Geisbert. Interferon-betha la and SARS coronavirus replication // Emerg. Infect. Dis. -2004.-Vol. 10, No. 2, p. 317-319.

102. Hewish M.J., Takada Y., Coulson B.S. Integrins alpha2betal and alpha4betal Can Mediate SA11 Rotavirus Attachment and Entry into Cells // J.Virol. 2000.- V.74, N. 1. - P.228-236.

103. Hoet A.E., Cho K.O., Chang K.O. et al. Enteric and nasal shedding of bovine torovirus (Breda virus) in feedlot cattle // Am. J. Vet. Res.- 2002.-Vol.63, №3.- P.342-348.

104. Holmes J.L., Kirkwood C.D, Gerna G.et al. Characterization of unusual G8 rotavirus strains isolated from Egyptian children // Arch. Virol.- 1999.-Vol.144, №7.-1381-1396.

105. Horzinek M.C. Molecular evolution of corona- and toroviruses // Adv. Exp. Med. Biol.-1999.-V.473, -P.61-72.

106. Hoshino Y. Kapikian A.Z. Rotavirus serotypes: classification and importance in epidemiology, immunity, and vaccine development // J. Health Popul. Nutr. -2000.- V.18, N.l. P.5-14.

107. Hyams K.C., Bourgeois A.L., Merrell B.R., et al. Diarrheal disease during Operation Desert Shield//N. Engl. J. Med. -1991.- V.325, P. 1423-1428.

108. Hyams K.C., Malone J.D., Kapikian A.Z., et al. Norwalk virus infection among Desert Storm troops // J.Infect. Dis. -1993.- V.167, P.986-987.

109. Isa P., Realpe M., Romero P., Lopez S., Arias C.F. Rotavirus RRV associates with lipid membrane microdomains during cell entry // Virology. -2004.- V.322, N.2. P.370-381.

110. Iturriza-Gomara M., Isherwood В., Desselberger U., Gray J. Reassortment in vivo: driving force for diversity of human rotavirus strains isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999 // J. Virol. 2001.- V.75, N.8. -P.3696-3705.

111. Jamieson F.B., Wang E.E., Bain C., Good J., Duckmanton L., Petric M. Human torovirus: a new nosocomial gastrointestinal pathogen // J. Infect. Dis. -1998.- V. 178, N.5. P. 1263-1269.

112. Joki-Korpela P., Marjomaki V., Krogerus C., Heino J., Hyypia T. Entry of human parechovirus 1 // J. Virol. -2001.- V.75, N.4. P. 1958-1967.

113. Joki-Korpela P. and Hyypia T. Diagnosis and epidemiology of Echovirus 22 infections.// Clin. Infect. Dis. -1998.- V.26. -P.129-136.

114. Kang G., Srivastava A., Pulimood A.B., Dennison D., Chandy M. Etiology of diarrhea in patients undergoing allogeneic bone marrow transplantation in South India // Transplantation. -2002.- V.73, N.8. P.1247-1251.

115. Kapikian A.Z. Norwalk and Norwalk-like viruses // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994. pp 471-518.

116. Kapikian A.Z., Wyatt RG, Dolin R, Thornhill TS, Kalica AR, Chanock RM. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis // J. Virol. -1972,- V.10, N.5. — P. 1075-1081.

117. Kelkar S.D., Ayachit V.L. Circulation of group A rotavirus subgroups and serotypes in Pune, India, 1990-1997 // J. Health Popul. Nutr. -2000.- V.18, N.3. -P.163-170.

118. Kidd A.H., Chroboczek J., Cusack S., Ruigrok R.W. Adenovirus type 40 virions contain two distinct fibers // Virology. -1993.- V.192, N.l. -P.73-84.

119. Kidd A.H., Erasmus M.J, Tiemessen C.T. Fiber sequence heterogeneity in subgroup F adenoviruses // Virology. -1990.- V.179, N.l. P. 139-150.

120. Kidd A.H. and C. R. Madeley. In vitro growth of some fastidious adenoviruses from stool specimens//J. Clin. Pathol. -1981.- V.34. -P.213-216.

121. Kidd A.H., Tiemessen C.T. Characterization of a single SA7-like VA RNA gene in subgroup F adenoviruses // J. Gen. Virol. -1993,- V.74, Pt. 8. P. 16211626.

122. Kilgore, P.E., and R. I. Glass. Gastrointestinal syndromes // In D. D. Richman, R. J. Whitley, and F. G. Hayden (ed.), Clinical virology. Churchill Livingstone Inc., New York, N.Y. -1997.- p. 55-67.

123. Kitahashi Т., Tanaka Т., Utagawa E. Detection of HAV, SRSV and astrovirus genomes from native oysters in Chiba City, Japan // Kansenshogaku Zasshi -1999.- V.73. N.6. P.559-564.

124. Kjeldsberg E., Mortensson-Egnund K. Comparison of solid-phase immune electron microscopy, direct electron microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of rotavirus in faecal samples // J. Virol. Methods -1982.- V.4, N.l. -P.45-53.

125. Koopmans M.P., Goosen E.S., Lima A.A., McAuliffe I.T., Nataro J.P., Barrett L.J., Glass R.I., Guerrant R.L. Association of torovirus with acute and persistent diarrhea in children // Pediatr. Infect. Dis. J. -1997.- V.16, N.5. — P.504-507.

126. Koopmans M.P., Petric M., Glass R.I., Monroe S.S. Enzyme-linked immunosorbent assay reactivity of torovirus-like particles in fecal specimens from humans with diarrhea // J. Clin. Microbiol. -1993.- V.31, N.10. P.2738-2744.

127. Koopmans M, Vinje J, de Wit M, Leenen I, van der Poel W, van Duynhoven Y. Molecular epidemiology of human enteric caliciviruses in The Netherlands // J. Infect. Dis. 2000. — V.181, Suppl 2.-P.S262-S269.

128. Kosek M., Bern C., Guerrant R.L. The magnitude of the global burden of diarrhoeal disease from studies published 1992-2000 // Bulletin of the World Health Organization -2003.- V.81, N.3. P. 197-204.

129. Kotler D.P. Characterization of intestinal disease associated with human immunodeficiency virus infection and response to antiretroviral therapy // J. Infect. Dis. -1999.- V.179. Suppl 3. -P.S454-S456.

130. Kroneman A., Cornelissen L.A., Horzinek M.C., de Groot R.J., Egberink H.F. Identification and characterization of a porcine torovirus // J. Virol. -1998.-V.72, N.5. P.3507-3511.

131. Kurtz J.B. Astroviruses // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994.- p.569-580.

132. Kurtz J.B., Lee T.W. Astroviruses: human and animal // Ciba Found. Symp. -1987.-V.128. P.92-107.

133. Laird A.R., Ibarra V., Ruiz-Palacios G., Guerrero M.L., Glass R.L, Gentsch J.R. Unexpected Detection of Animal VP7 Genes among Common Rotavirus Strains Isolated from Children in Mexico // J.Clin. Microbiol. -2003.- V.41, N.9. P.4400-4403.

134. Lawton J.A., Estes M.K., Prashad B.V. Rotavirus structure revealed by cryo-electron microscopy // Nat. Struct. Biol.- 1997.- Vol.4, № 2.- P. 118-121.

135. Lecomte J.M. An overview of clinical studies with racecadotril in adults// Int J Antimicrob Agents. -2000.- V.14, N.l. -P.81-87.

136. Lee T.W. and Kurtz J.B. Serial propagation of astrovirus in tissue culture with the aid of trypsin // J. Gen. Virol. 1981.- V. 57. - P.421-424.

137. Leung W.K., To K.F., Chan P.K., Chan H.L., Wu A.K., Lee N., Yuen K.Y., Sung J.J. Enteric involvement of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection // Gastroenterology. -2003.- V.125, N.4. P.1011-1017.

138. Lew J.F., Petric M., Kapikian A.Z., Jiang X., Estes M.K., Green K.Y. Identification of minireovirus as a Norwalk-like virus in pediatric patients with gastroenteritis //J. Virol. -1994,- V.68, N.5. -P.3391-3396.

139. Lopman B.A., Adak G.K., Reacher M.H., Brown D.W. Two epidemiologic patterns of norovirus outbreaks: surveillance in England and wales, 1992-2000// Emerg. Infect. Dis. -2003.- V.9. N.l. -P.71-77.

140. Lopman B.A., Reacher M., Gallimore C., Adak G.K., Gray J.J., Brown D.W. A summertime peak of "winter vomiting disease": surveillance of noroviruses in England and Wales, 1995 to 2002 // BMC Public Health. -2003.- V.3, N.l. P.13.

141. Lopman B.A., Reacher M.H., Van Duijnhoven Y., Hanon F.X., Brown D., Koopmans M. Viral gastroenteritis outbreaks in Europe, 1995-2000 // Emerg. Infect. Dis. -2003.- V.9, N.l. -P.90-96.

142. Ludert J.E., Abdul-Latiff .L, Liprandi A., Liprandi F. Identification of picobirnavirus, viruses with bisegmented double stranded RNA, in rabbit faeces// Res Vet Sci. -1995.- V.59, N.3. P.222-225.

143. Ludert J.E., Liprandi F. Identification of viruses with bi- and trisegmented double-stranded RNA genome in faeces of children with gastroenteritis // Res.Virol. -1993.- V.144, N.3. -P.219-224.

144. Ludert, J.E., Michelangeli F., Gil F., Liprandi F., and J. Esparza. Penetration and uncoating of rotaviruses in cultured cells// Intervirology -1987.- V.27. -P.95-101.

145. Lukashov V.V., Goudsmit J. Evolutionary relationships among Astroviridae//J. Gen. Virol. -2002.- V.83, Pt 6. P. 1397-1405.

146. MacRae J., Srivastava M. Detection of viruses by electron microscopy: an efficient approach // J. Virol. Methods -1998.- V.72, N. 1. P. 105-108.

147. Madeley C.R., Cosgrove B.P. 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis // Lancet -1975.- N.2. P.451-452.

148. Madeley C.R., Cosgrove B.P. Caliciviruses in man // Lancet -1976.- N.l. -P. 199-200.

149. Marie-Cardine A., Gourlain K., Mouterde O., Castignolles N., Hellot M.F., Mallet E., Buffet-Janvresse C. Epidemiology of acute viral gastroenteritis in children hospitalized in Rouen, France // Clin. Infect. Dis. -2002.- V.34, N.9. — P.l 170-1178.

150. Marra M.A., Jones S.J.M., Astell C.R., Holt R.A. et al. The genome sequence of the SARS-associated coronavirus // Science. 2003.- V.300, N.5624.-P. 1399-1404.

151. Marshall JA, Salamone S, Yuen L, Catton MG, Wright JP. High level excretion of Norwalk-like virus following resolution of clinical illness// Pathology 2001.- V.33, N.l - P.50-52.

152. Martin A.L., Kudesia G. Enzyme linked immunosorbent assay for detecting adenoviruses in stool specimens: comparison with electron microscopy and isolation // J. Clin. Pathol -1990.- V.43, N.6. P.514-515.

153. Martinez L.C., Giordano M.O., Isa M.B., Alvarado L.F., Pavan J.V., Rinaldi D., Nates S.V. Molecular diversity of partial-length genomic segment 2 of human picobirnavirus // Intervirology. -2003.- V.46, N.4. P.207-213.

154. Mastromarino P., Conti C., Petruzziello R., Lapadula R., Orsi N. Effect of polyions on the early events of Sindbis virus infection of Vero cells // Arch. Virol. -1991.- V.121, N(1-4). P.19-27.

155. Mattion N.M., Cohen J., Estes M.K. The rotavirus proteins // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994.-p. 169-250.

156. Maunula L. Von Bonsdorff C.H. Frequent reassortments may explain the genetic heterogeneity of rotaviruses: analysis of Finnish rotavirus strains // J. Virol. 2002.- V.76, N.23. - P.l 1793-11800.

157. McCaughey C., O'Neill H.J., Wyatt D.E., Coyle P.V. Rationalised virological electron microscope specimen testing policy // J. Clin. Pathol. -2000.- V.53, N.2. P. 163-165.

158. Mclver C.J., Palombo E.A., Doultree J.C., Mustafa H., Marshall J.A., Rawlinson W.D. Detection of astrovirus gastroenteritis in children // J. Virol. Methods. -2000.- V.84, N.l. -P.99-105.

159. Miguel В., Pharr G.T., Wang C. The role of feline aminopeptidase N as a receptor for infectious bronchitis virus. Brief review // Arch. Virol. -2002.-V.147, N.l 1.-P. 2047-2056.

160. Monroe S.S., Jiang В., Stine S.E., Koopmans M., Glass R.I. Subgenomic RNA sequence of human astrovirus supports classification of Astroviridae as a new family of RNA viruses // J. Virol. -1993.- V.67, N.6. P.3611-3614.

161. Moon H.W. Pathophysiology of viral diarrhea // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994.- p.27-52.

162. Moore P.L., Steele A.D., Alexander J.J. Relevance of commercial diagnostic tests to detection of enteric adenovirus infections in South Africa // J. Clin. Microbiol. -2000.- V.38, N.4. P. 1661-1663.

163. Mori I., Matsumoto K., Sugimoto K., Kimura M., Daimon N., Yokochi Т., Kimura Y. Prolonged shedding of rotavirus in a geriatric inpatient // J. Med. Virol. 2002.- V.67, N.4. - P.613-615.

164. Murphy T.V., Gargiullo P.M., Massoudi M.S., Nelson D.B. et al. Intussusception among infants given an oral rotavirus vaccine // N. Engl. J. Med., -2001.- Vol. 344, N.8. P.564-572.

165. Nemerow G.R., Stewart P.L. Role of alpha(v) integrins in adenovirus cell entry and gene delivery // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1999.- V.63, N.3. -P.725-734.

166. Nemerow G.R. Cell receptors involved in adenovirus entry // Virology. -2000.- V.274, N.l. P. 1-4.

167. Nichols B.J., Lippincott-Schwartz J. Endocytosis without clathrin coats // Trends Cell Biol. -2001.- V.l 1, N.10. P.406-412.

168. Offit P.A. The rotavirus vaccine // J. Clin. Virol.- 1998.- Vol.11, № 3.-P.155-159.

169. Oh D.Y., Gaedicke G., Schreier E. Viral agents of acute gastroenteritis in German children: Prevalence and molecular diversity // J. Med. Virol. -2003.-V.71, N.l. — P.82-93.

170. Oh D., Schreier E. Molecular characterization of human astroviruses in Germany // Arch. Virol. -2001.- V.146, N.3.- P.443-455.

171. Ohmann H.B. Electron microscopy of bovine virus diarrhoea virus // Rev. Sci. Tech. -1990.- V.9, N.l. -P.61-73.

172. Okada J., Urasawa Т., Kobayashi N., Taniguchi K., Hasegawa A., Mise K., Urasawa S. New P serotype of group A human rotavirus closely related to that of a porcine rotavirus // J. Med. Virol. 2000.- V.60, N.l. - P.63-69.

173. Okada M., Shinozaki К., Ogawa Т., Kaiho I. Molecular epidemiology and phylogenetic analysis of Sapporo-like viruses // Arch. Virol. 2002. — V.147, N.7. -P.1445-1451.

174. Otsu R. Outbreaks of gastroenteritis caused by SRSVs from 1987 to 1992 in Kyushu, Japan:four outbreaks associated with oyster consumption // Eur. J. Epidemiol. 1999. - V.15, N.2. - P.175-180.

175. Otsu R., Ishikawa A., Mukae K. Detection of small round structured viruses in stool specimens from outbreaks of gastroenteritis by electron microscopy and reverse transcription-polymerase chain reaction // Acta Virol. 2000. - V.44, N.l. -P.53-55.

176. Page M.J., Dreese J.C., Poritz L.S., Koltun W.A. Cytomegalovirus enteritis: a highly lethal condition requiring early detection and intervention // Dis. Colon Rectum 1998.-V.41. - P.5619-5623.

177. Palombo E.A. Genetic analysis of Group A rotaviruses: evidence for interspecies transmission of rotavirus genes // Virus Genes.- 2002.- Vol.24, №1.- P. 11-20.

178. Pang X.L., Honma S., Nakata S., Vesikari T. Human caliciviruses in acute gastroenteritis of young children in the community // J. Infect. Dis. 2000. -V. 181, Suppl 2. - P.S288-S294.

179. Parashar U.D., Bresee J.S., Gentsch J.R., Glass R.I. Rotavirus // Emerg. Infect. Dis. 1998. - V.4. P.561-570.

180. Parashar U.D., Bresee J.S., Glass R.I. The global burden of diarrhoeal disease in children // Bull. World Health Organ. 2003. - V.81, N.4. - P.236.

181. Parashar U.D., Hummelman E.G., Bresee J.S., Miller M.A., Glass R.I. Global illness and deaths caused by rotavirus disease in children // Emerg. Infect. Dis. 2003. - V.9, N.5. - P.565-572.

182. Patton J.T., Spencert E. Genome replication and packaging of segmented double-stranded RNA viruses // Virology.- 2000.- Vol.277, № 2.- P.217-225.

183. Peiris J.S., Chu C.M., Cheng V.C., Chan K.S. et al. Clinical progression and viral load in a community outbreak of coronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective study // Lancet. 2003. - V.361, N.9371. - P.1767-1772.

184. Peiris J.S., Lai S.T., Poon L.L., Guan Y. et al. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome // Lancet. — 2003. V.361, N.9366.-P.1319-1325.

185. Pereira H.G., Linhares A.C., Candeias J.A., Glass R.I. National laboratory surveillance of viral agents of gastroenteritis in Brazil // Bull. Pan Am. Health Organ. 1993. - V.27, N.3. - P.224-233.

186. Peter G., Myers M.G. National Vaccine Advisory Committee.; National Vaccine Program Office. Intussusception, rotavirus, and oral vaccines: summary of a workshop // Pediatrics 2002. - V.l 10, N.6. - P. e67.

187. Pollok R.C. Viruses causing diarrhoea in AIDS // Novartis Found. Symp. — 2001. -V.238, P.276-283.

188. Pollok R., Farthing M. Enteric viruses in HIV-related diarrhoea // Mol. Med. Today 2000. - V.6. - P.483-487.

189. Poutanen SM, Low DE, Henry B, Finkelstein S et al. Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada // N. Engl. J. Med. 2003. - V.348, N.20.-P. 1995-2005.

190. Prasad B.V., Hardy M.E., Estes M.K. Structural studies of recombinant Norwalk capsids // J.Infect Dis. 2000. - V. 181, Suppl 2. - P.S317-S321.

191. Prasad B.V., Rothnagel R., Zeng C.Q., Jakana J., Lawton J.A., Chiu W., Estes M.K. Visualization of ordered genomic RNA and localization oftranscriptional complexes in rotavirus // Nature. 1996. - V.382, N.6590. -P.471-473.

192. Prasad B.V., Wang G.J., Clerx J.P., Chiu W. Three-dimensional structure of rotavirus // J. Mol. Biol. 1988. - V.l99, N.2. - P.269-275.

193. Putzker M., Sauer H., Kirchner G., Keksel O., Malic A. Community acquired diarrhea the incidence of astrovirus infections in Germany // Clin. Lab. -2000. - V.46, N.(5-6). - P.269-273.

194. Quan, С. M., and F. W. Doane. Ultrastructural evidence for the cellular uptake of rotavirus by endocytosis // Intervirology 1983. - V.20, - P.223-231.

195. Ramachandran M., Gentsch J.R., Parashar U.D., Jin S., Woods P.A., Holmes J.L. et al. Detection and characterization of novel rotavirus strains in the United States // J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36, N.l 1. - P.3223-3229.

196. Reid J.A., Breckon D., Hunter P.R. Infection of staff during outbreak of viral gastroenteritis in an elderly persons' home // J. Hosp. Infect. 1990. - V.16, N.l. -P.81-85.

197. Reimann, H. A., A. H. Price, and J. H. Hodges. The cause of epidemic diarrhea, nausea and vomiting (viral dysentery?) // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1945.-V.59.-P.8-9.

198. Resta S., J.P. Luby, C. R. Rosenfeld, and J. D. Siegel. Isolation and propagation of a human enteric coronavirus // Science 1985. - V.229. — P.978-981.

199. Rhoads F.A. Oral rehydration therapy for viral gastroenteritis // JAMA — 1993. V.270, N.5. - P.578-579.

200. Rice S.J. & Philips A.D. Rapid preparation of faecal specimens for detection of viral particles by electron microscopy // Med. Lab. Sci. 1980. - V.37. -P.371-372.

201. Risco C., Carrascosa J.L., Pedregosa A.M., Humphrey C.D., Sanchez-Fauquier A. Ultrastructure of human astrovirus serotype 2 // J. Gen. Virol. -1995.- V.76, Pt. 8. P.2075-2080.

202. Rockx В., De Wit M., Vennema H., Vinje J., De Bruin E., Van Duynhoven Y., Koopmans M. Natural history of human calicivirus infection: a prospective cohort study // Clin. Infect. Dis. 2002. -V.35, N.3. - P.246-253.

203. Roelvink P.W., Lizonova A., Lee J., et al. The Coxsackievirus-Adenovirus Receptor protein can function as a cellular attachment protein for adenovirus serotypes from subgroups A, C, D, E, and F // J. Virol. 1998. - V.72, N.10. -P.7909-7915.

204. Rosa E., Silva M.L., Pires De Carvalho I., Gouvea V. 1998-1999 Rotavirus Seasons in Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil: Detection of an Unusual G3P4. Epidemic Strain // J. Clin. Microbiol. 2002. - V.40, N.8. - P.2837-2842.

205. Rosen B.I., Fang Z.Y., Glass R.I., Monroe S.S. Cloning of human picobirnavirus genomic segments and development of an RT-PCR detection assay // Virology. 2000. -V.277, N.2. - P.316-329.

206. Rudolph J.A., Cohen M.B. New causes and treatments for infectious diarrhea in children // Curr. Gastroenterol. Rep. 1999 - V.l, N.3. - P.238-244.

207. Saderi H, Roustai MH, Sabahi F, Sadeghizadeh M, Owlia P, De Jong JC. Incidence of enteric adenovirus gastroenteritis in Iranian children // J. Clin. Virol. 2002. - V.24, N.(1-2). - P. 1-5.

208. Saif L.J., Rosen B.I., Parwani A.V. Animal rotaviuses // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., 1994.- p.279-367.

209. Sakai Y., Nakata S., Honma S., Tatsumi M., Numata-Kinoshita K., Chiba S. Clinical severity of Norwalk virus and Sapporo virus gastroenteritis in children in Hokkaido, Japan // Pediatr. Infect. Dis J. 2001. - V.20, N.9. - P.849-853.

210. Salanueva I.J., Carrascosa J.L., Risco C. Structural maturation of the transmissible gastroenteritis coronavirus // J. Virol. 1999. - V.73, N.10. -P.7952-7964.

211. Salazar-Lindo E., Santisteban-Ponce J., Chea-Woo E., Gutierrez M. Racecadotril in the treatment of acute watery diarrhea in children // N. Engl. J. Med. 2000. - V.343, N.7. - P.463-467.

212. Santos N., Volotao E.M., Soares C.C., Albuquerque M.C., da Silva F.M., Chizhikov V., Hoshino Y. VP7 gene polymorphism of serotype G9 rotavirus strains and its impact on G genotype determination by PCR // Virus. Res. -2002. V.90, N.(1-2). - P.l-14.

213. Sapin C., Colard O., Delmas O. et al. Rafts promote assembly and atypical targeting of a nonenveloped virus, rotavirus, in Caco-2 cells // J. Virol.- 2002.-Vol.76, №9.- P. 4591-4602.

214. Sharp T.W., Hyams K.C., Watts D., Trofa A.F. et al. Epidemiology of Norwalk virus during an outbreak of acute gastroenteritis aboard a US aircraft carrier // J. Med. Virol. 1995. - V.45, N.l. -P.61-67.

215. Shieh Y., Monroe S.S., Fankhauser R.L., Langlois G.W., Burkhardt W. 3rd, Baric R.S. Detection of norwalk-like virus in shellfish implicated in illness // J.Infect. Dis. -2000.- V.181, Suppl 2. -P.S360-S366.

216. Schmidt W., Schneider Т., Heise W., Weinke Т., et al. Stool viruses, coinfections, and diarrhea in HIV-infected patients. Berlin Diarrhea/Wasting Syndrome Study Group // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. -1996.-V.13,N.l.-P.33-38.

217. Schuffenecker I., Ando Т., Thouvenot D., Lina В., Aymard M. Genetic classification of "Sapporo-like viruses" // Arch. Virol. 2001. - V. 146, N.l 1. -P.2115-2132.

218. Simpson R., Aliyu S., Iturriza-Gomara M., Desselberger U., Gray J. Infantile viral gastroenteritis: on the way to closing the diagnostic gap // J. Med. Virol.- 2003. V.70, N.2. - P.25 8-262.

219. Sitbon M. Human-enteric-coronaviruslike particles (CVLP) with different epidemiological characteristics//J. Med. Virol. 1985.-V. 16, N.l.-P.67-76.

220. Smith A.W., Skilling D.E., Cherry N., Mead J.H., Matson D.O. Calicivirus emergence from ocean reservoirs: zoonotic and interspecies movements // Emerg. Infect. Dis. 1998. -V.4, N.l. -РЛ3-20.

221. Snyder, J. D., and M. H. Merson. The magnitude of the global problem of acute diarrhoeal disease: a review of active surveillance data // Bull. WHO. -1982. V.60, - P.605-613.

222. Sobsey M.D., Jones B.L. Concentration of poliovirus from tap water using positively charged microporous filters // Appl. Environ. Microbiol. -1979.-V.37, N.3. — P.588-595.

223. Studer E., Bertoni G., Candrian U. Detection and characterization of pestivirus contaminations in human live viral vaccines // Biologicals. 2002. -V.30, N.4. — P.289-296.

224. Sullivan A., Edlund Ch., Nord C.E. Effect of antimicrobal agents on the ecological balance of human microflora // The Lancet Infectious Diseases, -2001,- V.l, N.9. -P.101-114.

225. Tai J.H., Ewert M.S., Belliot G., Glass R.I., Monroe S.S. Development of a rapid method using nucleic acid sequence-based amplification for the detection of astrovirus // J. Virol. Methods. 2003. - V.l 10, N.2. - P.l 19-127.

226. Takao S., Shimazu Y., Fukuda S., Noda M., Miyazaki K. Seroepidemiological study of human Parechovirus 1 // Jpn. J. Infect. Dis. -2001.- V.54, N.2. P.85-87.

227. Taniguchi К., Urasava S. Diversity of rotavirus genomes // J. Virol.- 1995.-Vol.6.- P.123-131.

228. Ternak G. Epstein-Barr virus reactivation // Lancet Infect. Dis. 2003. -V.3,N.5.-P.271.

229. Thomas P.D., Pollok R.C., Gazzard B.G. Enteric viral infections as a cause of diarrhoea in the acquired immunodeficiency syndrome // HIV Med. 1999. -V.l, N.l. — P. 19-24.

230. Tihova M., Dryden K.A., Bellamy A.R., Greenberg H.B., Yeager M. Localization of membrane permeabilization and receptor binding sites on the VP4 hemagglutinin of rotavirus: implications for cell entry // J. Mol. Biol. -2001. V.314, N.5. - P.985-992.

231. Tiemessen C.T., Kidd A.H. Adenovirus type 40 and 41 growth in vitro: host range diversity reflected by differences in patterns of DNA replication // J. Virol. 1994-V.68,N.2.-P.1239-1244.

232. Tiemessen C.T., Kidd A.H. Sensitivity of subgroup F adenoviruses to interferon // Arch. Virol. 1993. - V.l28. - P. 1-13.

233. Tiemessen C.T., Kidd A.H. The subgroup F adenoviruses // J. Gen. Virol. -1995.-V.76.-P.481-497.

234. Tiemessen C.T., Ujfalusi M., Kidd A.H. Subgroup F adenovirus growth in foetal intestinal organ cultures // Arch. Virol. -1993. V.l32, N.(1-2). - P. 193200.

235. Tiemessen C.T., Wegerhoff F.O., Erasmus M.J., Kidd A.H. Infection by enteric adenoviruses, rotaviruses, and other agents in a rural African environment // J. Med. Virol.- 1989. V.28, N.3. - P. 176-182.

236. Toogood C.I.A., Hay R.T. DNA sequence of the adenovirus type 41 hexon gene and predicted structure of the protein // J. Gen. Virol 1988, - V.69, -P.2291-2301.

237. Toogood C.I.A., Murali R., Burnett R.M., Hay R.T. The adenovirus type 40 hexon: sequence, predicted structure and relationship to other adenovirus hexons // J. Gen. Virol. 1989. - V.70, Pt. 12. - P.3203-14.

238. Tresnan D.B., Holmes K.V. Feline aminopeptidase N is a receptor for all group I coronaviruses // Adv. Exp. Med. Biol. -1998. V.440. - P.69-75.

239. Tucker A.W., Haddix A.C., Bresee J.S., Holman R.C., Parashar U.D, Glass R.I. Cost-effectiveness analysis of a rotavirus immunization program for the US //J. Am. Med. Assoc.,- 1998. V.297, - P. 1885-1891.

240. Turck D., Berard H., Fretault N., Lecomte J.M. Comparison of racecadotril and loperamide in children with acute diarrhoea // Aliment Pharmacol Ther. -1999.- V.13, Suppl 6, P.27-32.

241. Uziel Y., Laxer R.M., Petric M. Torovirus gastroenteritis presenting as acute abdomen // Clin. Infect. Dis. 1999. - V.28, N.4. - P.925-926.

242. Vesikari T. Rotavirus vaccines: development and use for the prevention of diarrhoeal disease // Ann. Med. 1999 - V.31, N.l. - P.79-85.

243. Vinje J., Deijl H., van der Heide R., Lewis D., Hedlund K.O., Svensson L., Koopmans M.P. Molecular detection and epidemiology of Sapporo-like viruses // J. Clin. Microbiol. -2000. V.38, N.2. - P.530-536.

244. Vipond I.B., Pelosi E., Williams J., Ashley C.R., Lambden P.R., Clarke I.N, Caul E.O. A diagnostic EIA for detection of the prevalent SRSV strain in United Kingdom outbreaks of gastroenteritis // J. Med. Virol. 2000. - V.61, N.l. -P.132-137.

245. Volotao E.M., Soares C.C., Albuquerque M.C., Da Silva F.M., Carvalho T.R., Marins L.P., D'Oliveira I.C., Santos N. First evidence of a trisegmented double-stranded RNA virus in canine faeces // Vet. J. 2001,- V.161, N.2. -P.205-207.

246. Wadell G., Adenoviruses // In Principles and Practice of Clinical Virology. 4-th Edition., Ed. by A.E. Zuckeman, J.E. Banatvala, J.R. Pattison. 2000. John Wiley & Sons, Ltd. Chichester etc. pp 307-327.

247. Wadell G., Allard A., Johansson M., Svensson L., Uhnoo I. Enteric adenoviruses // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994. p.519-548.

248. Walter J.E., Briggs J., Guerrero M.L., Matson D.O., Pickering L.K. et al. Molecular characterization of a novel recombinant strain of human astrovirus associated with gastroenteritis in children // Arch. Virol. 2001. - V. 146, N.12. -P.23 57-23 67.

249. Wang Q.H., Kakizawa J., Wen L.Y., Shimizu M., Nishio O., Fang Z.Y., Ushijima H. Genetic analysis of the capsid region of astroviruses // J. Med. Virol. 2001. - V.64, N.3. - P.245-255.

250. Waters V., Ford-Jones E.L., Petric M., Fearon M., Corey P., Moineddein R. Etiology of community-acquired pediatric viral diarrhea: a prospective longitudinal study // Pediatr. Infect. Dis. J. 2000. - V.19, N.9. - P.843-848.

251. Weiss M., Steck F., and Horzinek, M. C. Purification and partial characterization of a new enveloped RNA virus (Berne virus) // J. Gen. Virol. -1983.-V.64,-P.1849-1858.

252. Whitby H.J., Rodgers F.G. Detection of virus particles by electron microscopy with polyacrylamide hydrogel // J. Clin. Pathol. 1980. - V.33, N.5. -P.484-487.

253. Wilhelmi I., Roman E., Sanchez-Fauquier A. Viruses causing gastroenteritis// Clin. Microbiol. Infect. 2003. - V.9, N.4. - P.247-262.

254. Woode G.N. The toroviruses: bovine (Breda virus) and equine (Berne virus) and the torovirus-like agents of humans and animals // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., -1994, P. 581-602.

255. Woode G.N., Reed D.E., Runnels P.L. et al. Studies with an unclassified virus isolated from diarrheic calves // Vet. Microbiol. 1982. - N.7. - P.221-240.

256. Xu W., McDonough M.C., Erdman D.D. Species-specific identification of human adenoviruses by a multiplex PCR assay // J. Clin. Microbiol. 2000. -V.38, N.l 1.-P.4114-4120.

257. Yamashita Т., Kobayashi S., Sakae K., Nakata S., Chiba S., Ishihara Y., Isomura S. Isolation of cytopathic small round viruses with BS-C-1 cells from patients with gastroenteritis // J. Infect. Dis. 1991. - V. 164. -P.954-957.

258. Yolken R., Dubovi E., Leister F., Reid R., Almeido-Hill J., Santosham M. Infantile gastroenteritis associated with excretion of pestivirus antigens // Lancet 1989. - V. 11, N. 1 (8637). - P.517-20.

259. Yolken R.H., Wilde J.A. Assays for detecting human rotavirus // In Viral Infections of the Gastrointestinal Tract., Ed. by Kapikian A.Z., N.Y., 1994. p.251-278.

260. Zerda K.S., Gerba C.P., Hou K.C., Goyal S.M. Adsorption of viruses to charge-modified silica // Appl. Environ. Microbiol. -1985. V.49, N.l. - P.91-95.

261. Zhang X.M., Herbst W., Kousoulas K.G., Storz J. Biological and genetic characterization of a hemagglutinating coronavirus isolated from a diarrhoeic child // J. Med. Virol. 1994. - V.44, N.2. - P. 152-161.

Информация о работе

Сироткин, Алексей Константинович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Применение углеродно-полимерных подложек в изучении адсорбции вирусных частиц и определении этиологии вирусных гастроэнтеритов у детей методами электронной микроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы