Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация вирусов и диагностика вирусных инфекций с помощью электронномикроскопических методов исследования

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Королев, Михаил Борисович

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. ИСТОРИЯ ВОПРОСА И ПРЕДМЕТ ОБСУЖДЕНИЯ

ГЛАВА П. СТРУКТУРА И МОРФОГЕНЕЗ ВИРУСОВ КАК ОСНОВА ИХ

ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ.

ГЛАВА Ш. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ МЕТОДОМ НЕГАТИВНОГО

КОНТРАСТИРОВАНИЯ.

3.1.0. Технические основы негативного контрастирования. Способы подготовки материала. . . 26 3.2.0. Выявление и идентификация вирусов методом негативного контрастирования . зх

ГЛАВА 1У. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ МЕТОДОМ ШШУНОЭЛЕК

ТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ.

4.1.0. Иммуноэлектронная -микроскопия вирусных суспензий . У . V".

4.1.1. Антигены и антисыворотки

4.1.2. Прямой метод иммуноэлектронной микроскопии

4.1.3. Методы иммуноэлектронной микроскопии с использованием техники фильтрации в агар

4.1.4. Методы иммуносорбентной электронной микроскопии

4.1.5. Техника декорирования.

4.1.6. Применение ИЭМ в вирусологии

4.2.0. Иммуноэлектронномикроскопическое выявление внутриклеточных антигенов.

ГЛАВА У. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ МЕТОДОМ

УЛЬТРАТОНКИХ СРЕЗОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация вирусов и диагностика вирусных инфекций с помощью электронномикроскопических методов исследования"

Актуальность проблемы. Прогресс вирусологии последних трех десятилетий в значительной мере связан с усовершенствованием методов исследований и внедрением новой техники. Среди них одно из первых мест принадлежит электронной микроскопии, с по -мощью которой исследуется макромолекулярное строение вирусов и их компонентов, морфогенез вирусов и ультраструктура пора -женных ими клеток. Электронномикроскопические данные являются основой современной системы таксономии и классификации вирусов.

Важнейшее значение приобрела в последние годы электронная микроскопия как метод идентификации вирусов и диагностики вирусных инфекций. Интенсивное развитие этого направления стало возможным благодаря накоплению знаний о морфологии вирусов, совершенствованию препаративной техники, доступности высокоразрешающих электронных микроскопов для более широкого крута лабо -раторий.

Преимущества морфологической идентификации вирусов заключаются, прежде всего, в быстроте и относительной простоте проведения диагностической работы. Идентификация вирусов с ис -пользованием электронной микроскопии может быть осуществлена в ряде случаев в течение 30-40 мин., в то время как примене -ние других методов ускоренной диагностики, не говоря уже о стандартных процедурах вццеления вируса в биологических системах, требует, как минимум, в несколько раз большего времени.

Активное использование электронномикроскопических методов идентификации вирусов обусловило новый качественный скачок теоретической и практической вирусологии, способствовало обогащению и расширению ее диагностических возможностей, открытию ряда новых групп вирусов. Особо впечатляющие успехи были достигнуты при выявлении этиологических агентов вирусных гепатитов, небактериальных гастроэнтеритов, некоторых других вирусных заболеваний /147, 187, 191/.

Основанная на практическом использовании электронной микроскопии серия блестящих достижений вирусологии последнего десятилетия вызвала широкий интерес к различным прикладным аспектам электронномикроскопического анализа. К настоящему времени стало совершенно очевидно, что электронномикроскопи-ческая диагностика вирусных инфекций - это не плод кратко -временного увлечения отдельных специалистов, а большая и серьезная проблема, и что возможности электронной микроскопии далеко не исчерпываются ее первоначальными областями применения. Об этом убедительно свидетельствуют многочисленные доклады на международных симпозиумах и конгрессах, нарастающее число публикаций и обзоров по этому вопросу / 65, 66, 102, 114, 144, 160-162, 188, 199, 221, 239, 248, 261, 295, 382, 404 /, внимание к нему со стороны Всемирной организации здравоохранения /279, 350/.

Все вышеизложенное говорит об актуальности темы данной работы и о том, что она связана с одной из основных проблем вирусологии - проблемой выявления и идентификации вирусов.

Цель работы состояла в том, чтобы всесторонне рассмотреть и проанализировать возможности применения электронной микро -скопии в целях идентификации вирусов и диагностики вирусных инфекций, изучить необходимые для этого структурно-морфогене-тические особенности различных групп вирусов, исследовать возможные пути повышения эффективности электронномикроскопичес-ких методов их выявления.

В задачи работы входило:

1. Изучение структуры и морфогенеза отдельных вирусов позвоночных, относящихся к семействам НегреБу1г1<1ае, Бео-уд.г1с1ае, То£ау1г1б.ае, Рагатухоу1г1б.ае, ВЬаЪйоу1г1б.ае, Ви~ п;у^1г1(1ае И Агепау±г1<1ае.

2. Проведение сравнительных исследований по эффективное -ти различных электронномикроскопических методов выявления вирусов в экспериментальных и клинических материалах.

3. Электронномикроскопическое изучение материалов от больных на содержание вирусов при вспышках и спорадических случаях острого небактериального гастроэнтерита, инфекционного гепатита и некоторых других вирусных заболеваний.

4. Морфологическая идентификация ряда вновь вццеленных или неклассифицированных вирусов, а также вирусов-контаминантов клеточных культур.

5. Изучение возможностей электронной микроскопии в целях титрования антител в сыворотках больных и реконвалесцентов.

6. Изучение возможностей электронной ми!фоскопии при анализе антигенных взаимосвязей близкородственных вкусов.

7. Разработка новых методов электронномшфоскопического изучения вирусов, расширяющих возможности их морфологической идентификации.

Научная новизна работы и положения, которые выносятся на защиту

В работе на основе обширных экспериментальных данных на -учно обоснованы возможности и доказана эффективность применения электронномикроскопических методов исследования в целях ускоренного выявления вирусов и быстрой диагностики вирусных инфекций, определены основные структурно-морфогенетические критерии, способствующие надежности и морфологической иден -тификации различных вирусов человека и животных, выработаны рекомендации по электронномикроскопическому обследованию материалов в целях обнаружения вирусов.

В процессе исследований выявлена роль ротавирусов в этиологии небактериальных гастроэнтеритов, регистрируемых спорадически или в виде вспышек в различных районах СССР. Впервые получены визуальные доказательства эффективной репродукции ротавируса человека в клеточной культуре и определены наиболее важные факторы, влияющие на первичное инфицирование культуры и серийное пассирование вируса.

Показана высокая эффективность, чувствительность и вое -производимость метода имыуноэлектронной микроскопии при индикации вируса гепатита А в экспериментальных и клинических материалах, в том числе при массовом обследовании материалов от больных инфекционным гепатитом.

Впервые осуществлена морфологическая идентификация и оп -ределено таксономическое положение вирусов крымской геморрагической лихорадки, Дхори, геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

С помощью электронномикроскопических методов идентифицированы вирусы, присутствующие в различных экспериментальных, клинических или патологоанатомических материалах; в ряде случаев установлена их этиологическая роль при тех или иных заболеваниях.

Получены новые данные об особенностях структуры и морфогенеза вирусов, зависящих от типа клетки-хозяина, штаммовых вариаций или степени адаптации вируса к клеточной системе.

Впервые показана возможность использования техники имцуно-электронной микроскопии для титрования антител в сыворотках больных и переболевших ротавирусным гастроэнтеритом и гепатитом А, а также при дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита, изучения антигенных взаимосвязей близкородствен -ных флави- и аренавирусов, антигенной структуры ротавирусов.

Разработан ряд новых методов и технических приемов, расширяющих возможности морфологической идентификации вирусов.

Научно-практическая ценность работы

Полученные в работе данные экспериментально обосновывают и конкретно развивают представления о рож и значении электронной микроскопии в вирусологической диагностике.

Полученные данные расширяют наши знания о структуре и морфогенезе вирусов, что способствует дальнейшей разработке во -просов их таксономии и систематики, а также идентификации новых изолятов и диагностики вирусных инфекций.

На основании проведенных исследований сделаны следующие практические рекомендации (внедрения), направленные на расширение, ускорение и обеспечение надежности вирусологической диагностики или совершенствование методов изучения вирусов.

Предложены методы морфологической идентификации ротавируса в материалах от больных и в клеточных культурах (Методические рекомендации, М., МЗ СССР, 1981; Вопросы вирусологии, 1981; Демонстрация на ВДНХ СССР, 1982),

Разработан и предложен метод иммуноэлектронномикроскопи -ческой индикации внутриклеточного вируса (Авторское свиде тельство № 840102; Методические рекомендации, М., МЗ СССР, 1981; Акты использования изобретения, 1981, 1982).

Разработан метод иммуноэлектронномикроскопического титрования антител в сыворотках больных и реконвалесцентов (Вопросы вирусологии, 1979).

Рекомендовано широкое применение методов электронной микроскопии при обследовании клинических и экспериментальных материалов на содержание вирусов (Итоги науки и техники, М., 1980; Вопросы вирусологии, 1982).

В процессе исследований использованы также разработанные нами способ электронной микроскопии с применением флуоресцирующих антител (Авторское свидетельство № 198543) и способ очистки и концентрации вирусов путем фильтрации через ядерные фильтры (Авторское свидетельство $ 520778).

Материалы исследований включены в программу лекций на кафедре вирусологии Центрального института усовершенствования врачей (Акт о внедрении, 1984).

X X X

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных эн -цефалитов АМН СССР в 1969-1983 гг.

Выражаю глубокую благодарность дирекции и сотрудникам института за постоянную поддержку, заинтересованность и дея -тельное содействие в проведении исследований.

ЧАСТЬ I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Королев, Михаил Борисович

Результаты исследований

Ротавируоы | | -1-1.

Мелкие частицы 27-30 нм

I. январь февраль 4м - 3 г 24 4-7 10(41,6%) I (4%) 2 (8,3%)

2. март апрель Зм - 60 л 27 6-8 11(40,7%) - 2 (4,7%)

3. май Юл-63 г 9 3-6 8(88,8%) —

4. март 19 л - 20 л 4 4-8 2(50%) -

5. !» I г - 69 л 10 4-8 4(40%) - I (10%)

6. февраль 9 - 15 л 5 5-8 2(40%) -

7. 12 - 55 л 8 2-3 8(100%) - —

8. 16 - 21 г 5 1-3 5(100%) -

9. март 2 м - 59 л 13 2-5 10(76,9%) - го а>

Всего:

105

60(57,1%)

I (0,9%) 5 (4,8%) лий детей содержали преимущественно целые ротавирионы, в то время как в фекальных экстрактах взрослых больных обнаруживались многочисленные частицы с разрушенным наружным капси-дом или пустые вирионы. Кроме того, при анализе некоторых материалов от взрослых или детей старше I года агрегаты ротавирусных частиц или отдельные вирионы, покрытые антителами, выявлялись и при использовании метода прямой электронной микроскопии.

Частота обнаружения ротавирусов в суспензиях фекалий колебалась в различных вспышках от 40 до 100% (см.табл.9). Причем наибольшей она была при вспышках № 3, 7 и 8, связанных с употреблением некипяченой воды из срубов речного льда в районах Сибири. При вспышках № I, 4, 5 и б, носивших контактный характер, частота обнаружения ротавирусов находи -лась в пределах 40-50%. Нельзя не обратить внимание и на тот факт, что при вспышках № 3, 7 и 8 большинство проб фе -калий были собраны в первые 3-4 дня после начала заболевания, в то время как при других вспышках забор материала проводили в более поздние сроки. В этом отношении показательны данные по вспышке № 2, связанной, по-видимому, с загрязнением ис -точника водоснабжения. Большинство проб фекалий забирались в этом случае на поздних сроках болезни - после пятого дня. Соответственно, частота обнаружения ротавирусов составляла 40,7%. В то же время, процент инфицированных был, судя по всему, значительно выше, поскольку при исследовании сывороток реконвалесцентов серологическое подтверждение ротави -русной этиологии было установлено впоследствии в 81,8% случаев.

Частота обнаружения других вирусоподобных частиц была неизмеримо ниже (см. табл.9). В одном случае был обнаружен аст-ровирус и в 5 случаях мелкие сферические частицы, сходные по морфологии с пикорнавирусами. С помощью метода ИЭМ не было выявлено каких-либо различий во взаимодействии этих частиц с антителами "острой" и конвалесцентной сывороток.

При исследовании методами прямой электронной микроскопии и ИЭМ 88 проб фекалий от больных при 4 летне-осенних вспышках ротавирусы ни в одном случае не были обнаружены. В 2 пробах (2,3%) были выявлены аденовирусы, в 3 (3,4%) - астровирусы, в 8 (9%) - пикорнавируеоподобные частицы.

Анализ материалов 915 спорадических случаев диарейных заболеваний позволил обнаружить в 226 образцах (25%) ротавирусы, в 16 (1,7%) - аденовирусы, в 5 (0,5%) - астровирусы, в 4 (0,4%) - калицивирусы, в 2 (0,2%) - коронавирусы, и в 34 пробах (3,8%) мелкие сферические частицы, морфологически подобные пикорнави-русам. Подавляющее большинство материалов (903 пробы) было взято при заболеваниях, регистрируемых в период с октября по май месяцы. При этом наибольшая заболеваемость отмечалась в январе-марте.

Таким образом, в результате массового обследования мате -риалов от больных людей была установлена ротавирусная природа значительного числа случаев небактериальных гастроэнтеритов, регистрируемых спорадически или в виде вспышек в различных районах СССР. Заболеваемость ротавирусным гастроэнтеритом характеризовалась выраженной зимне-весенней сезонностью, в то время как в летние месяцы циркуляция вируса, по-видимому, приостанавливалась. Следует еще раз подчеркнуть, что заболевае мость ротавирусным гастроэнтеритом отмечалась не только в детских коллективах, но и среди взрослых, в том числе при вспышках водного происхождения. В этой связи уместно сос -латься на данные некоторых недавних исследований, свидетельствующих о возможности длительного сохранения инфекционной активности ротавирусов в водной среде и их частом обнаружении в обработанных и необработанных сточных водах, в загрязненной сточными водами морской воде, а также в некоторых пробах стандартной питьевой воды /32, 226/. Все это вместе взятое указывает на то, что загрязнение источников водоснабжения может служить фактором, способствующим распространению ротавирусов. Почвой для длительного сохранения ротавирусов в окружащей среде и его массового распространения могут служить и холодные климатические условия на большей территории нашей страны. В этом отношении показательны исследованные нами вспышки, связанные с употреблением некипяченой воды из срубов речного льда.

Роль других вирусов, которые в незначительном проценте случаев встречались в пробах фекалий больных гастроэнтеритом, недостаточно ясна. Сходные с обнаруженными нами в отдельных материалах аденовирусы наблюдались при электронномикроскопи-ческом изучении в фекалиях 5-8% здоровых людей, причем у некоторых из них имело место длительное выделение этих вирусов /364/. В одном случае удалось показать специфическое взаимодействие антител реконвалесцента с подобным вирусом, но по -пытки его выделения и пассирования в клеточной культуре оказались безуспешными /197/. Об аналогичных наблюдениях сообщали и другие исследователи /277, 365, 432/. Таким образом,присутствие в некоторых случаях гастроэнтерита так называемых "некультивируемых" аденовирусов в фекалиях не нашло пока что обоснованной интерпретации.

Астровирусы как возможные возбудители некоторой части острых гастроэнтеритов привлекли внимание в самые последние годы в связи с широким использованием электронномикроскопи -ческих методов для обнаружения и изучения вирусов /47/. С астровирусами связывали две небольшие вспышки гастроэнтерита в яслях и родильном отделении больницы в Великобритании /364/, на основании более частого обнаружения этих вирусов в фека -лиях больных детей, чем у взрослых. Сообщения об обнаружении астровирусов в фекалиях новорожденных, грудных детей и под -ростков при явлениях диареи опубликованы рядом исследователей /89, 247, 370/.

Пока мало что известно о значении в возникновении заболе -ваний гастроэнтеритом калицивирусов /47/. Они были обнаружены в фекалиях отдельных больных с симптомами гастроэнтерита /193, 247, 278/ и группы заболевших детей во время одной из зимних вспышек /293/.

Периодическое обнаружение частиц коронавирусов в фекалиях больных гастроэнтеритом людей /118, 431/ послужили основанием для более детального изучения отношения коронавирусов к этиологии гастроэнтеритов человека. Эти исследования однако еще не дали возможность прийти к достаточно определенным выводам /47/.

Что касается различных сферических частиц диаметром около 27-30 нм, то их присутствие в ряде материалов скорее всего связано с циркуляцией тех или иных энтеровирусов. Убеди тельных доказательств роли последних в диарейной патологии до настоящего времени не получено /364/. Характерно в связи с этим, что наибольшая частота выявления в пробах фекалий пикорнавирусоподобных частиц отмечалась нами при анализе материалов летне-осенних вспышек. Из данных литературы хорошо известен факт наиболее частого выделения ряда энтеровирусов из объектов внешней среды (в частности, сточных и речных вод) именно в летне-осенний период /13/. Следует отметить также, что обнаружение в фекалиях детей частиц, морфологи -чески сходных с энтеровирусами, может быть связано с циркуляцией полиовируса как следствие применения живой полиомие-литной вакцины.

8.6.0. Выделение и пассирование ротавируса человека в культуре клеток. Электронномикроскопический контроль размножения ротавируса в клеточной культуре

Проблема культивирования ротавируса человека оказалась достаточно сложной, и попытки добиться его размножения во многих видах культур клеток долгое время оставались безрезультатными /47/. Эта проблема была успешно решена в нашем Институте в 1978 году /46/ в результате создания нами условий, повышающих интенсивность первичного инфицирования клеток культуры. С этой целью культуры клеток после нанесения на них вируссодер-жащего материала центрифугировали и к культуральной среде добавляли трипсин. При этом было установлено, что именно соче-танное воздействие этих двух факторов на начальную фазу взаимодействия ротавируса с клеткой обеспечивает активное размножение вируса в клетках приматов и его быструю адаптацию к этим клеткам, необходимую для последующего серийного пасси -рования вируса.

Для выделения вируса были взяты пробы фекалий больных гастроэнтеритом, в которых ранее электронномикроскопически был обнаружен ротавирус в высокой концентрации и установлена его специфичность методом ИЭМ. Для культивирования вируса использовали однослойную пробирочную культуру (первичную или вторичную) клеток почек зеленых мартышек. Клеточный монослой отмывали солевым раствором Хенкса, наносили вируссодержащий материал (обработанную суспензию фекалий) и раствор трипсина (до 10 мкг/мг). Пробирки с культурой центрифугировали в уг -ловом роторе в течение I часа при 800-1000 об/мин., ориентируя клеточный слой перпендикулярно к направлению силы тяжести. После центрифугирования добавляли поддерживающую среду (смесь равных объемов среды 199 и минимальной среды Игла с удвоенным содержанием витаминов и аминокислот без добавления сьюоротки), помещали культуры в роллерные установки и инкубировали при 37°С в течение 48 часов. После этого содержимое пробирок однократно замораживали и полученный материал ис -пользовали для пассажей. Наличие вируса в исследуемом мате -риале определяли прямой электронной микроскопией, а принад -лежность его к ротавирусам человека - методом ИЭМ.

Культуральные материалы на уровне 2-го и 4-го пассажей вируса в культуре клеток были обработаны сыворотками рекон -валесцентов после ротавирусного гастроэнтерита (специфич -ность заболевания установлена при помощи ИЭМ) и исследованы в электронном микроскопе. Были обнаружены типичные вирусные частицы в состоянии специфической агрегации иммунной съшороткой. Одновременно методом ИЭМ исследовали материал исходных фекальных суспензий. На рис. 35, 36 представлены микрофото -графии агрегированных имкгунной сывороткой частиц ротавируса, обнаруженные в исходном материале и в материале 4-го пассажа.

В фекальных суспензиях выявляли в основном двукапсидные частицы. В культуральном пассажном материале присутствовали как двукапсидные частицы диаметром 70-75 нм, так и однокал -сидные частицы диаметром около 60 нм (рис. 37). Последние выявлялись обычно в виде компактных агрегатов, а двукапсидные частицы располагались преимущественно одиночно или небольшими группами и их поверхностная структура была в большей степени маскирована иммуноглобулинами сыворотки (рис. 36). В препаратах пассажных материалов постоянно обнаруживались частицы, локализованные внутри мембранных образований (рис. 38). В препаратах контрольных незараженных культур описанные ви -русные частицы отсутствовали.

Полученные данные показали, что при использовании некоторых факторов, влияющих на инициацию инфекции культуры клеток почек зеленых мартышек, достигается активное размножение ро -тавируса человека. На размножение сохраняющего антигенную специфичность (по данным ИЭМ) вируса в культуре клеток указывало, в частности, видимое увеличение количества вирусных частиц в препаратах по сравнению с исходным материалом, выявление частиц, находящихся, по-видимому, на различных стадиях морфогенеза (одно- и двукалсидных), а также постоянное обнаружение частиц, локализованных внутри мембранных образований. Последние, судя по всему, являются фрагментами цистерн эндоплазма -тического ретикулума, в ассоциации с которыми протекает мор

Рис.35. Скопление агрегированных иммунной сыво -роткой частиц ротавируса в препарате фекальной суспензии. Ув. 175000 х.

Рис. 36. Скопление агрегированных иммунной сывороткой частиц ротавируса в материашс^ГУВ* С4"ый х.

Рис.37. Скопление однокап-сидных частиц ротавируса в материале клеточной куль-паосажК /в

Рис.38. Частицы ротавируса, локализованные в мембранных образованиях. Материал клеточной культуры (4-ый пассаж). Ув. 180000 х.

12.3.0. Заключение

Основными критериями для первоначального формирования семейства Bunyaviridae явились морфологические и морфо-генетические особенности вирусов /312/. Как показали наш исследования, морфогенез вирусов КГЛ и Дхори соответство -вал тому, что было известно для прототипных вирусов этого семейства и достаточно четко отличался от морфологических особенностей репродукции других РНК-содержащих вирусов. Первичным участком созревания вирионов являлся комплекс Гольджи, на мембранах которого протекало формирование вирусных частиц. При этом развитие инфекции сопровождалось расширением и пролиферацией цистерн и вакуолей комплекса Гольджи, в которых накапливались вирионы. Их выход из клетки осуществлялся путем экзоцитоза и, в некоторых случаях, в результате лизиса клетки.

Исходя из некоторых различий в морфологии внутри- и внеклеточных вирусных частиц, можно предполагать, что в процессе продвижения вируссодержащей вакуоли к клеточной поверхности происходит модификация суперкалсидной оболочки, в частности, составляющих ее гликопротеидов. Указанные различия позволяют также дифференцировать реадсорбированные частицы от заключенных в вакуолях комплекса Гольджи вновь образованных вирионов.

Важной дополнительной характеристикой изученных вирусов служит наличие спиральной укладки нуклеокалсида в вирионе, что указьюает и на обоснованность предположений о спиральном типе симметрии самого нуклеокалсида /437/.

Выявляемые на поздних стадиях инфекции кристаллоподоб-ные образования сходны в морфологическом отношении со структурами, описанными под различными наименованиями в клетках ряда патологических тканей /84, 119, 399, 423/. Присутствие таких структур чаще всего рассматривается как результат морфологического проявления патологических изменений в клетках в ответ на воздействие того или иного экзогенного фактора /84, 399, 423/. Можно привести ряд соображений, свидетельствующих о специфичности указанных образований для клеток культур, инфицированных вирусами КГ Л, Дхори, а также Бхан -джа. Во-первых, индукция этих структур никогда не отмечалась в контрольных культурах клеток СПЭВ или при их заражении какими-либо другими вирусами (флави-, арена-, орбивирусами и т.д.). Во-вторых, идентичные по морфологии образования на -блюдались в больших количествах при заражении вирусом КГЛ перевиваемой культуры клеток почек обезьян (6619).Примеча -тельно, что в этом случае инфекция носила абортивный характер, что выражалось в накоплении в клетках вирусных антигенов (до 75% антиген-содержащих клеток на 5-6 день инфицирования) в отсутствии формирования зрелых вирусных частиц.

Указанные соображения в совокупности с данными по титрам вируса на ранних и поздних стадиях инфекции и динамики накопления вирусспецифических антигенов дают основание предполагать, что сборка вирионов КГЛ, Дхори и Бханджа на мем -бранах комплекса Гольджи осуществляется в течение относительно короткого периода после заражения и впоследствии, в ре -зультате ряда причин (возможно, структурно-функциональных изменений мембран), механизм формирования зрелых частиц нарушается. Синтез же вирусспецифических белков в клетках культур продолжается, что приводит к их накоплению в цитоплазме в виде упорядоченных образований. К этому следует добавить, что согласно цитохимическим исследованиям выявляемые в препаратах ретикулярные или кристаллоподобные структуры состоят преимущественно из фосфолипидов и кислых гликопротеидов /369/.

Полученные в ходе наших исследований данные послужили основой для разработки морфологических критериев при форми -ровании рода Nairovirus семейства Bunyaviridae. Прото-типным вирусом этого рода стал вирус КГЛ-Конго /112/.

Результаты проведенных исследований указывают также на то, что при идентификации новых вирусов семейства Bmiyavi -ridae наибольшую информацию, необходимую для определения их групповой принадлежности, обеспечивает применение метода ультратонких срезов. При визуализации вирусных частиц в негативно контрастированных препаратах можно лишь предполагать буньявирусную природу ввделенного агента.

ГЛАВА ХШ. ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И РАЗМНОЖЕНИЯ АРЕНАВИРУСОВ В КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

Из всех групп вирусов, открытых и систематизированных в последние годы, группа аренавирусов привлекла наибольшее внимание. В течение многих лет предпринимались неоднократные, но безуспешные, попытки морфологической идентификации вируса лим-фоцитарного хориоменингита (ЛХМ). Лишь в 1968 году, спустя 35 лет после первичного вьщеления и культивирования в лабораторных условиях, были описаны своеобразные частицы этого вируса /301/ и представлены цитохимические, и, чуть позднее, имму-номорфологические /422/ доказательства того, что именно эти частицы являются этиологическим агентом ЛХМ. Установление морфологического сходства между вирусами ЛХМ и Мачупо (воз -будитель боливийской геморрагической лихорадки) /303/, а также другими серологически родственными вирусами /87/, позволило выдвинуть предположение о целесообразности создания новой таксономической группы, включающей вирусы ЛХМ, Мачупо и других представителей серологического комплекса Такарибе. Параллельно было показано наличие перекрестных реакций между антигеном вируса ЛХМ и антисыворотками к вирусам комплекса Такарибе /374/. Все эти вместе взятые морфологические, физико-химические и серологические особенности стали основой для вцделения группы аренавирусов в отдельный таксон, получивший первоначально статус рода /88/ и включающий вирус ЛХМ и 8 вирусов серогруппы Такарибе: Мачупо, Хунин, Амапари, Пичинде, Парана, Тамиами, Латино и Такарибе. Впоследствии в этот таксон был включен возбудитель лихорадки Ласса /257/. В качестве вероятных представителей группы аренавирусов в настоящее время рассматриваются также вирусы Мозамбик /230/ и Флескал /392/. В 1979 году таксон был выделен в отдельное семейство - Агепау1г1йае /285/.

На сегодняшний день известно /338/, что аренавирусы содержат 5 видов одноцепочечных РНК. Две из них - вирусспецифи-ческие молекулы, три других представляют собой РНК клеточного происхождения с коэффициентом седиментации 28 Б и 18 Б (рибосомальные РНК) и 4-6 Б . Вирусы включают 4 основные полипептида, два из которых гликозилированы. Своеобразная морфология вирионов выявляется в ультратонких срезах инфициро -ванных клеток /29/, Вирусные частицы плеоморфны или шарооб -разны с диаметром в пределах 50-300 нм. Они окружены одно -мембранной оболочкой, покрытой диффузным слоем шириной около 10 нм. Во внутренней полости частиц содержится различное число электронноплотных гранул диаметром 20-25 нм, морфологически не отличимых от рибосом, Рибосомальная природа этих гранул была установлена при биохимическом анализе РНК очищенных вирусов ЛХМ и Личинде /116, 337/, Созревание вирионов происходит путем почкования от плазматической мембраны инфи -цированных клеток.

Все аренавирусы связаны с хроническими инаппаратными инфекциями грызунов. Патогенные для человека аренавирусы (ЛХМ, Мачупо, Хунин, Ласса) циркулируют среди синантропных или по-лусинантропных грызунов; инфицирование человека носит случайный характер.

В задачу наших исследований входило изучение структуры и морфогенеза аренавирусов в клеточных культурах и апробирование на этой основе возможностей электронномикроскопической идентификации изолятов и анализа антигенных взаимоотношений между отдельными вирусами.

13.1.0. Электронномикроскопическое изучение размножения аренавирусов в культуре клеток 6619

Для изучения биологических свойств б представителей группы аренавирусов были использованы две перевиваемые линии по -чечных клеток: эмбриона свиньи (СПЭВ) и эмбриона зеленой мартышки (6619), а также первичная культура клеток почек зеленой мартышки (КПЗМ).

При заражении культур вирусами Такарибе (TP-II573),Ху-нин (НУ-15950), Мачупо (C-80/8I), Амапари (Ал 270563), Та-миами (СДС-10777) и ЛХМ (CA-I37I) цитопатогенный эффект был обнаружен только в культуре клеток 6619, которая и использовалась в дальнейших исследованиях. Вирусы Такарибе и Амапари вызывали ЦПД через 6-7 суток с момента инфицирования культуры. К 10—II суткам дегенерация превышала 75% клеток, л о 57 а титры вирусов составляли КГ»'--Кг*' ТЦПД^^. Более слабые цитопатологические изменения отмечались при заражении вирусами Хунин и Тамиами. Дегенерация клеток не имела такого выраженного характера, как у вирусов Такарибе и Амапари, ограничиваясь поражением лишь, приблизительно, 20% клеток. И совсем не вызывали видимых изменений инфицированных клеток вирусы Мачупо и ЛХМ.

Материал для электронномикроскопического исследования брали на 8-9 сутки после заражения. При изучении ультратон -ких срезов клеток культуры 6619, инфицированной различными аренавирусами, во всех случаях были выявлены характерные вирусные частицы (рис. 176) диаметром 60-170 нм (модальное значение 120 нм). Формирование частиц осуществлялось исключительно на клеточной поверхности. Морфологически зрелые формы вируса выявлялись во внеклеточном пространстве. При этом не обнаруживались крупные частицы диаметром более 200 нм и не наблюдались описанные другими авторами плеоморфные формы вируса.

В цитоплазме отдельных клеток инфицированных культур выявлялись включения, состоящие из скоплений рибосомоподоб-ных гранул и фиброзного матрикса (рис. 177). На или около поверхности таких клеток, как правило, обнаруживались вирусные частицы.

Количество частиц, выявляемых в препаратах, коррелировало с выраженностью цитопатического эффекта: наибольшее число вирионов обнаруживалось в культурах без видимых цито-патических изменений (вирусы ЛХМ и Мачупо), а наименьшее при наличии выраженной дегенерации монослоя (вирусы Такари-бе, Амапари, Тамиами и Хунин). В последнем случае вновь образованные вирионы содержали и относительно большее число рибосомоподобных гранул (4-6, иногда до 15-18 гранул, см. напр. рис. 178), в то время как в частицах вирусов ЛХМ и Мачупо выявлялось не более 1-3 таких гранул.

Таким образом морфологические проявления размножения вирусов в культуре клеток 6619 были в общих чертах идентичны таковым, описанным для аренавирусов в других клеточных системах /29/. Характерно, однако, что при репродукции аренавирусов в клетках культуры 6619 не обнаруживались крупные частицы диаметром более 200 нм и не наблюдались также описанные ранее плеоморфные формы вируса. Проведенные наблюдения по -зволяют кроме того предполагать, что присутствие множественных рибосомоподобных гранул в частицах аренавирусов может быть обусловлено их пассивным включением во внутреннюю структуру вирионов, что возможно является следствием нарушения или блокирования процессов трансляции вирусных РНК.

Более подробно морфология и морфогенез аренавирусов были изучены на модели вируса Амапари в клетках vero.

УвС*165000ВхеКЛвТОЧНОе СКОШ1ение ^стиц вируса Мачупо.

7 " ".иГ^

Рис. 177. Цитоллазматическое включение в инфицированной вирусом ЛХМ клетке культуры 6619. Ув. 44000 х. с к-*

• - ч V т ф ' • • г- . >

Рис. 178. Частицы вируса Хунин в межклеточном пространстве. Ув. 100000 х. г

13.2.0. Структура и морфогенез вируса Амапари в клетках vero

Клетки vero выращивали в 100 мл флаконах под слоем питательной среды (среда Игла с 10% телячьей сыворотки). По образовании монослоя клетки заражали вирусом Амапари (штамм А 270563), прошедшим предварительно 5 пассажей в клетках vero. Для заражения использовали различные разведения ви -руса. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла с 2% телячьей сыворотки. Максимальные титры инфекционного вируса достигались к 3-5 суткам после заражения и составляли 10^-10^ БОЕ/мл. Материал для исследования методом ультратонких срезов брали на 3-4 сутки после заражения, а для анализа методом негативного контрастирования - на 3 сутки. В последнем случае проводили предварительную концентрацию вируса ультрацентрифугировадаем при 100000 g.

В ультратонких срезах вирусные частицы имели вид округлых, овальных или плеоморфных форм диаметром около II0-I30 нм при индивидуальных колебаниях в плоскости сечения среза в пределах 50-200 нм. Внешний слой частиц состоит из диффузного материала, в отдельных участках которого часто просматриваются хорошо выраженные периферические отростки - пепломеры. Толщина этого слоя около 6-8 нм (рис. 179, 180). Оболочка частиц образуется из основной трехслойной плазматической мембраны. Ее изменения определялись по увеличению плотности обоих мембранных слоев к увеличению ширины и однородности электронно-прозрачного слоя в области набухания вирусной почки (рис.180),

Во внутренней полости частиц содержались электронно -плотные гранулы диаметром 20-25 нм, число которых в сечениях частиц значительно варьировало. Однако никогда не наблюдались частицы, содержащие необычно большое число гранул. Локализация гранул в частицах во многом зависела от плоскости сечения последних. В приполярных сечениях одиночные гранулы выявлялись, как правило, в центре частиц. В случае более экваториальных сечений большая часть гранул наблюдалась обычно ближе к оболочке вирионов. Кроме гранул внутри час -тиц обнаруживались многочисленные филаменты толщиной 10-15 нм. Некоторые из них были связаны с рибосомоподобными гранулами.

В негативно контрастированных препаратах встречались овальные или округлые частицы, поверхность которых была усеяна хорошо различимыми пепломерами (рис. 181, 182, 183).Какой либо регулярности в расположении пепломеров не отмеча -лось. В препаратах обнаруживались также более крупные плео -морфные частицы (рис. 184). В ряде случаев выявлялись упло -щенные формы вирионов, в которых, за счет проникновения контрастирующего вещества, достаточно хорошо просматривалась базальная мембрана, оболочки и покрывающий ее слой пепломеров. В некоторых частицах наблюдались небольшие вздутия, образуемые, вероятно, за счет осмотического набухания базальной мембраны. Отдельные пепломеры имели приблизительно цилиндрическую или булавовидную форму, их длина составляла 10 нм. Такие формы пепломеров просматривались в отдельных участках на периферии частиц. На изображениях пепломеров, снятых с торца иногда выявлялся осевой канал диаметром около 4-5 нм.

Детали внутренней структуры вирионов не определялись. Равным образом в них не обнаруживались рибосомоподобные гранулы, четко выявляемые в ультратонких срезах. Тем не менее характерная структура поверхности вирионов позволяла идентифицировать их методом негативного контрастирования в ли-затах клеточных культур (полученных в результате 3-х кратного замораживания и оттаивания). Хотя количество частиц, обнаруживаемых в препаратах, было в этом случае значительно меньше, чем в образцах, полученных при ультрацентрифугировании, наблюдавшиеся единичные водионы достаточно хорошо дифференцировались от фоновых структур и клеточных компонентов (рис. 185, 186).

Как уже отмечалось, созревание вирионов осуществлялось путем почкования от плазматической мембраны инфицированных клеток. При этом морфологические изменения мембраны ограни -чивались лишь теми ее участками, где происходило отпочковы -вание частиц (рис. 187, 188). Уплотнение и модификация значительных участков плазмолеммы /29/ не наблюдались. Ограни -ченность структурной модификации мембраны лишь областью вирусной почки обнаруживалась и при анализе негативно контрас-тированных препаратов. На рис. 189, 190, например, достаточно хорошо видно, что пепломеры распределены лишь по поверхнос ти почкующейся частицы и отсутствуют на соседних участках плазматической мембраны.

Цитопатические изменения, наблюдаемые в инфицированных клетках, включали разрежение и лизис участков цитоплазмы, уплотнение матрикса митохондрий, конденсацию хроматина.Наблюдались картины фагоцитоза вирусных частиц совместно с клеточным детритом (рис. 191). В редких случаях в цитоплазме обнаруживались включения, структура которых соответствовала