Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ВОЗБУДИТЕЛЬ СКРУЧИВАНИЯ ЛИСТЬЕВ , НА КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУРАХ (ЭТИОЛОГИЯ, ПАТОГЕНЕЗ)

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ВОЗБУДИТЕЛЬ СКРУЧИВАНИЯ ЛИСТЬЕВ , НА КОСТОЧКОВЫХ КУЛЬТУРАХ (ЭТИОЛОГИЯ, ПАТОГЕНЕЗ)"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

А-шт

На правах рукописи

БУБАКЕР АЛИ

ВОЗБУДИТЕЛЬ СКРУЧИВАНИЯ ЛИСТЬЕВ

НА косточковых КУЛЬТУРАХ

(этиология, патогенез)

06.01.11 — фитопатология и защита растений

Ч ' ' " '■'■ . • , . •

. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

\ .

МОСКВА - 1979

Работа выполнена на кафедре фитопатологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Научные руководители: доктор биологических наук К. В. Попкова и доктор сельскохозяйственных наук Ю. И. Помазков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Е. Проценко, кандидат сельскохозяйственных наук И. С. Узунов.'

Ведущее учреждение: Никитский ботанический сад.

Защита диссертации состоится « А . » ОМ^Зх^Я». . . 1979 г. в мп-.дЗ» часов на заседании Специализированного совета К. 120 35.03 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева. Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА. I

-/у >

Автореферат разослан «

1979 г-

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат сельскохозяйственных наук доцент

Н. К. Торянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Плодоводство — одна из ведущих отраслей сельского хозяйства субтропической зоны Туниса. Плоды служат не только ценным продуктом питания для местного населения, но в ряде случаев являются одной из основных статей экспорта. Поэтому площади под садами с каждым годом увеличиваются. В настоящее время в стране насчитывается около 5 млн. плодовых деревьев, которые занимают 50 тыс. га, как показывают статистические 'данные.

В ассортименте плодовых насаждений Туниса, преобладают косточковые, которые наряду с другими плодовыми де- • ревьями поражаются различными грибными, бактериальными, вирусными, микоплазменными болезнями. Среди заболеваний вирусного, происхождения наиболее распространены кольцевые пятнистости. В Тунисе, по данным института статистики, общее производство косточковых плодов составляет около 80 тыс. т. Потери же урожая от вирусных заболеваний нередко достигают 20%. Происходит это вследствие резкого снижения устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды, в частности к воздействию низких температур зимой или повышенных летом. С помощью метода искусственного промораживания нами установлено, что ткани пораженных растений обладают пониженной зимостойкостью по сравнению со здоровыми.

В настоящее время вирусные болезни наносят гораздо больший материальный ущерб, чем болезни, вызываемые бактериями и грибами.

Знание признаков и особенностей развития вирусных болезней плодовых позволяет своевременно распознавать и предупреждать их распространение. Организация профилактической борьбы с вирусными заболеваниями даст возможность уже в ближайшие годы наладить производство свободного от инфекции посадочного материала, заложить новые долговечные и высокоурожайные насаждения плодовых культур.

Научная новизна результатов исследований. Показано, что местный изолят, вызывающий признаки скручивания листьев

у косточковых культур, представлен смешанной инфекцией вирусами скручивания листьев черешни, с одной стороны, и , • ■' возбудителями кольцевой пятнистости малины — с другой.

Проведено разделение возбудителей и для каждого из них изучен круг растений-хозяев. Апробированы различные методы диагностики, разработаны режимы получения очищенных препаратов и приготовления высокоактивных сывороток. Об- ч наружен новый переносчик вируса скручивания листьев черешни— паразитическая нематода X. УиШепеэи

Проведено испытание районированных сортов вишни, сливы на.устойчивость к возбудителям. Установлен оптимальный . режим термического обеззараживания пораженных деревьев.

Практическая ценность. В результате проведенных исследований разработаны методы быстрой диагностики вируса скручивания листьев — индикаторный и серологический.

С помощью термического обеззараживания получены , 13 безвирусных клонов вишни и сливы.

Публикации- Основные результаты исследований по теме настоящей диссертации опубликованы в «Известиях ТСХА:» (1977).

Объем работы. Диссертация состоит из 5 глав, заключения и выводов. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, включает 31 таблицу, 14 рисунков, в том числе \ спектродиаграмму, 3 графика, диаграмму седиментации. Список литературы изложен на 11. страницах, содержит 134 источника, в том числе 124 иностранных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на научных конференциях молодых ученых и специалистов, и в лаборатории вирусологии НИЗИСНП (1979 г.), а также на кафедре фитопатологии Сельскохозяйственной академии К. А. Тимирязева.

Цели и задачи исследования. Большинство сведений о вирусных болезнях плодовых, в том числе косточковых культур, как было показано, получено зарубежными исследователями.

В нашей стране они изучены недостаточно: почти отсутствуют данные о целом ряде вредоносных вирусных заболеваний на сливе, вишне, персике, миндале, абрикосе и черешне. Не выяснена и этиология вирусоподобных заболеваний, встречающихся во многих районах страны и приносящих значительный ущерб. .

Изучение природы этих заболеваний, их вредоносности и распространения представляет большой практический интерес.

Получение здорового посадочного материала является в данное время одной из проблем, требующих быстрейшего решения.

В связи с вышеизложенным в задачу наших исследований

входило: '

<> 1 ,

. — изучение роли некоторых вирусов в заболеваниях косточковых. культур, вызывающих признаки скручивания листьев; . . ' ; '

— исследование различных свойств.возбудителей местных -изолятов и их идентификация;

— сравнительная оценка методов диагностики (индикаторного, серологического; электронномикроскопического);.

— выявление круга поражаемых видов и анализ зараженности районированного и перспективного сортимента вишни и сливы; "

— испытание приемов термического обеззараживания плодовых деревьев и получение здорового посадочного материала.

Материалы и методы исследований. Работа выполнена на кафедре .фитопатологии Московской сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева и в лаборатории вирусоло-^ гии (НИЗИСНП) в течение 1976—1979 гг.

Для, выявления и идентификации вирусов косточковых культур использовали набор индикаторных растений: Prunus Pérsica, GF-305, клоны Tomentosa, P. avim Mazzard F»/, , Pru-nusserrulata—Shirofugen сеянцы вишни, сливы и абрикоса.

В нашей работе применялись следующие способы индикаторных прививок: черешком листа, зеленым черенком в.рас-; щеп, окулировкой, кусочком коры (Chip buding; Ю. Помазков, 1968—1969)..

Оценка длительности инкубационного периода, характера проявления симптомов, определение точки инактивации возбудителя скручивания листьев и других показателей, характеризующих особенности его взаимодействия с растениями, выполнялись по методам, описанным Cropley, Posnette (1955), Nemeth (1968) и др.

Все экспериментальные работы по инфицированию проводились в теплице, поскольку в открытом грунте в условиях нечерноземной зоны большинство применявшихся древесных индикаторов вымерзало. В этих целях и подбирались те их виды,.которые специфично и быстро реагировали на заражение.

Биологическое титрование выполнялось весной (апрель-май) и осенью (сентябрь-октябрь) по «Методике СЭВ», 1971 г-

В набор травянистых растений-индикаторов для механической передачи инфекции входили различные виды табака (N. tabacum L.,-N. glutinosa L.), лебеды (Ch. amarantícolor, cost et Reyn, Ch. quinoa L.), огурца (Cucumus sativus, сорт Деликатес), петунии (Petunia hybrida Vilm).

-В опытах по биологическому титрованию в качестве стабилизирующей среды использовали 0,05М трис-буфер (Trihydro-xymethyl amino methane) с добавлением 0,02% сульфита наг ' 3

рия (МагБОз), 0,2% аскорбиновои кислоты и 1%' кофеина. Для сравнивания применяли фосфатный буфер рН-7,5 в смеси с 0,03М аскорбиновой кислоты, 0,03М ДИЭКА и двух частей' PEG на 100 мл дистиллированной воды- . ?

'При приготовлении инокулюма применяли фосфатныйjun 0,05 трис-буфер (рН = 7,5), добавляли различные стабилизирующие соединения: ДИЭКА, кофеин, 2-Меркаптанол '(ME), полиэтиленгликоль, активированный уголь, аскорбиновую, кислоту (Lister, 1958; Taylor, 1968). В качестве инфекционного материала брали молодые листья че^Йхши с признаками забо-. леваний, очистку н концентриование препаратов возбудителя: выполняли с помощью дифференциального и градиентного центрифугирования как из листьев черешни, так из листьев травянистых индикаторов (Brakke, 1958; Помазков, Мишина, 1968; Segueira, Lister, 1969).

Сыворотки к возбудителям получали после иммунизации кроликов (5 внутривенных инъекций с интервалом 5 дней); антиген приготовили из зараженных листьев лебеды. Серологические реакции ставили по методу Oushterlony (1962).\Вы-деление антисыворотки проводили выстаиванием. В качестве стандартных использовали сыворотки, специфичные к Венгерскому изоляту ВСЛ (Венгрия), вирусу оспы слив —Plum pox кольцевой пятнистости малины — Raspberry ring spot virus латентному вирусу кольцевой пятнистости земляники — Strawberry latent ring spot virus (Франция) и ■у-глобулиновую. фракцию сыворотки кольцевой пятнистости малины (НИЗИСНП, г. Москва).

Электронномикроскопические исследования проводили на микроскопе УМВ-ЮОЛ при участии Л. С. Литвиненко. Сетки готовили с использованием нолуочшценных и очищенных^ вирусных препаратов, которые фиксировались 2%-ной фосфор-новольфрамовой кислотой (ФВК). ,

Концентрация вируса в препаратах определялась на спек-' трофотометре СФ-4Л при 230—290 нм.

Работа с нематодами выполнялась совместно с С. В. Полозовым.

Суховоздушное прогревание проводили в термокамерах.с автоматическим регулированием температуры н освещения.

"Обеззараживанию подвергались искусственно зараженные двухлетние саженцы, испытания проходили при температуре от.32 до 38° С на протяжении шести недель.

Прививка безвирусной верхушки производилась следующим образом: на сеянце удалялись все листья, за исключением трех-четырех нижних, затем при помощи лезвия делали поперечный срез. Основание обработанной верхушки срезалось клинообразно, верхушка прикладывалась к разрезу и обвязывалась полоской пластыря.

- .. / Ч, ' -

Для изучения скорости седиментации-разных компонентов , вируса СЛЧ использовали метод аналитического ультрацен-Г трифугирования. Коэффициент; седиментации-частицы вируса :V рассчитали по формуле: - .

о;__(xn—xm) 2 : i

________(tn—tm) W? 10« (xn+ xm) '

где xn и xm — положение границ седиментации соответственно ' во время tn tm; W2 — угловая скорость вращения ротора в сек. в радианах. " Концентрацию нуклеиновых кислот, а также концентрацию вирусных частиц в экстракте определяли по степени поглощения ультрафиолетового света с помощью спектрофотометра. . "

Результаты исследований. Исследование вредоносности за: болевания «Скручивание листьев косточковых». ,

Вирус скручивания листьев (Cherry leaf roll virus) впервые . зарегистрирован на черешне (Posnette, Cropley, 1955). Наиболее характерным симптомом, давшим название возбудителю и самому заболеванию, является скручивание листьев, кото- . рые становятся жесткими и опадают при встряхивании. В кон: це вегетационного периода они приобретают буро-красный цвет, иногда наблюдается некроз вдоль,жилки. У пораженных деревьев F 12/1 длина цветоножкн вдвое меньше, чем у здоровых. У сильно пораженных деревьев обычно наблюдается выделение камеди через продольные трещинЕЛ на коре ствола и крупных ветвей. Рост побегов подавлен. Деревья восири- . имчивых сортов нередко погибают, обычно в течение четырех лет с момента появления симптомов скручивания листьев.

Согласно данным Т. Вердеревской (1973), вирус СЛЧ на вишне вызывает бледно-зеленую межжилковую мозаику и быстрое ее отмирание. У молодых деревьев вирус может ряд лет " оставаться латентным, а затем вызвать развитие розеточно-сти. . * -

Первая экспериментальная передача вируса скручивания . листьев на P. avuim Mazzard F 12/1 прививкой проведена Posnette и Cropley (1955).

В процессе исследований установлено, что возбудитель , скручивания листьев черешни поражает широкий набор растений различных родов — Betula sp.; Sambucus L-; Prunus L.; Ulmus L. (Jones, Mayo, 1972). Передается вирус как с пыльцой (15,8%), так и с семенами (до 22%) (Cooper, 1976). Переносчиками заболеваний являются ' нематоды X. coxi Tarjan, X. diversicaudatum Micoletzky, Thorhe X. americanum cobb- — • В настоящее время известно, что вирус способен поражать* ' не только древесные, но и травянистые растения.

Í3 результате исследований, проведённых Jones и Mayó (1972), установлена криптограмма -возбудителя скручивания

листьев::

1

2,1

40

2,4

43

S . S

S

Ne

Вирус имеет два сферических нуклепротенновых компонента с коэффициентами седиментации M=115S и B=;128S. Он относительно стоек при температуре 20° С, сохраняет инфек-ционность in vitro в течение 5—10 дней. Граница предельного разведения 10_3—Ю-4. Температура инактивации 52—55° С (Cropley, Tomlinson, 1971).. -

В нечерноземной зоне заболевание, сходное по ряду морфологических показателей со скручиванием листьев, обнаружено на вишне п НИЗИСНП. Нами была проверена возможность серологической диагностики вируса скручивания, листьев' у различных видов растений, которые экспериментально инокулировали изолятом НИЗИСНП. Серологический анализ растений, "проявивших визуальные признаки заражения, подтвердил наличие возбудителя скручивания листьев на вишне, сливе и лебеде." '/'.. . '.

Вместе с тем, с помощью гетерологическнх сывороток,' в ча-. стности сыворотки КПМ, выявлено присутствие в местном 'изо-' ляте на вишне, лебеде и персике вируса кольцевой пятнистости малины (табл. 1).

\

Таблица 1:

Серологический анализ различных растений, инокулированных изолятом вируса скручивания -

Сыворотки к возбудителям заболевания

5п

Анализируемые виды растений'

•и'З U 5<

,Е о

с

О, с

Скручивание листьев . ... . . Оспа слив ....... . . .

, Кольцевая пятнистость малины (Франция) . . . .

Кольцевая пятнистость малины

(НИЗИСНП) ...... . . ... .

Латентная кольцевая пятнистость земляники....... . .

+

+

+

;+

+

. Примечание. Знаками + и — показано соответственно наличие и отсутствие серологической реакции. V

В дальнейшем при изучении этиологии заболевания для прививки и механической передачи инфекции использовали 6

материал лишь из слипы, на' которой:после пассирования сохранился только один компонент местного нзолнта—возбудитель СЛЧ- , , "" V г . ч ;

Сравнительный анализ и диагностическое значение различных методов определения зараженности

Визуальная диагностика. Диагностика вирусных заболеваний плодовых культур по внешним симптомам является одним из наиболее распространенных методов, применяемых для идентификации возбудителей, выбраковки больных растений; отбора маточных деревьев и контроля за распространением заболеваний. * ■

Признаки заболеваний в большинстве случаев проявляются на молодых листьях в виде различно окрашенных пятен, колец, линий, а также скручивания и мозаики. При этом симптомы вирусных заболеваний могут обнаруживаться не на всех листьях кроны, а только на отдельных побегах. На некоторых сортах возбудитель заболевания длительное время (2—3 года) может находиться в скрытой форме. Кроме того, с наступлением жарких дней признаки заболевания,начинают маскироваться или проявляться в виде хлороза- Все это, безусловно, осложняет диагностику заболепання по визуальным признакам. Обследование садов лучше всего'проводить весной, когда листья на деревьях еще молодые и на них можно обна; ружить симптомы различных заболеваний. 1

В"опытах по изучению инфицирования некоторых - сортов сливы и.вишни возбудителем скручивания листьев нам удалось установить, что симптомы проявляются на листьях в виде слабозеленых пятен и скручивания. Помимо этих наиболее характерных признаков у ряда сортов вишни (Владимирская, .Молодежная, Загорьевская), отмечено отмирание побегов выше места прививки, иногда даже^усыхание всего растения. Нередко наблюдается пожелтение листовой ткани вдоль жилок. Однако, степень проявления признаков заболевания может быть различной, и в некоторых случаях симптомы хорошо заметны только в проходящем свете. , . \Л

У елнвы характерные признаки заболевания (сильная деформация листьев, отмирание побегов выше места прививки, камедетечение) зарегистрированы на сорте Сизый голубок. Обратный пассаж возбудителя скручивания листьев черешни с экспериментально зараженных сортов вишни и сливы на индикаторные растения персика йР-ЗОб, показал наличие типичного н общего возбудителя на сливе и вишне. На персике наблюдали симптомы деформации листьев и пожелтение ткани вдоль жилок. Изучаемые сорта сливы и вишни показали

.7*,

/ ..I

неодинаковую реакцию на возбудителя, о чем свидетельствует различная степень проявления визуальных признаков заболе-, вания (табл. 2). ' ', ' ' "\ •';

. 1 Г Т а б л и ц а 2

Поражаемость различных видов растений вирусом скручивания листьев • - черешни . (

- - : Вишня Слива ; ;

изучаемые ; сорта ' сте-• пень поражения изучаемые сорта степень поражения . ■ 1 изучаемые ' сорта сте- ' пень поражения

Тамбовская Малиновка Жуковская , Любская Владимирская + + + + + Ширпотреб Молодежная Гриот Московский Солнечная Загорьевская + + + + + + + + + + Венгерка московская Память Мичурина Скороспелка красная Фиолетовая Сизый голубок + + + + +

Примечания: 1. Знаками +, ++. и +++—обозначены соответственно слабая, средняя и сильная степень поражения; знаком — отсутствие поражения. * #

2. Процент заболевания растений вишни сорта Любская составлял. 84, сливы сорта Скороспелка красная — 75. 1 -

Диагностика с помощью индикаторного метода. Часто визуальная диагностика является недостаточной, так как проявление и сохранение симптомов варьирует в зависимости от возбудителя и вида растений, а также от внешних условий-В этом смысле более надежным представляется использование древесных индикаторов, хотя при этом время диагноза значительно увеличивается. Метод важен и'при идентифнка^ цни''вирусных болезней. Его применяют в практике при выращивании безвирусного посадочного материала. V-Для выявления и идентификации вирусных заболеваний косточковых культур в качестве древесных индикаторов нами применялись и испытывались следующие: Р. avium Mazzard F 12/1, Р. tomentosa. Р. armeniaca, Р. persiaca, Р. serrulata-* shirófugen.^TIpH тестировании местного изолята скручивания листьев черешни первые симптомы отмечались уже через 45 дней после прививки на листьях вишни Mazzard F 12/1. Сначала обнаруживали светло-желтые полосы вдоль жилок, а иногда хлоротическую пятнистость или хлороз. По мере развития болезни платннка листа на нижней части побега закручивалась книзу. Постепенно симптомы заболевания распро: странялись на весь побег, рост его земедлялся, почки формировались мелкие. В конце лета листья приобретали бурый

цвет и становились жесткими и только жилки сохранияли зеленую окраску в течение всего вегетационного периода.' ; ' Сходные визуальные признаки получены н от заражения Венгерским изолятом ВСЛ. На сеянцах GF-305 первые симптомы заболевания в виде линейного узора, сильной деформации края листовой пластинки постепенно наблюдались через 2 месяца после инокуляции. Рост побегов прекратился ив конце вегетационного периода наблюдалось их отмирание. Симптомы на листьях сеянцев сливы (Р. domestica) характеризуются диффузными хлоротическими кольцами и пятнами. Рост, побегов подавлен, листовые пластинки деформируются, и измельчаются, часто принимая чашевидную форму.

Абрикос (Р. armeniaca) и войлочная вишня (Р. tomentosa) реапфуют на заражение редукцией листовой пластинки, иногда нормальное развитие ее сохраняется, но листья сморщиваются по главной жилке; нередко наблюдается образование складчатых выростов — энаций.

Заболевание на Р. Serrulata-shirofugen обнаруживается на первых листьях прироста в виде желтой пятнистости; рост побегов замедлен; на месте прививки наблюдается камедетечение; листья в конце вегетационного периода становятся жесткими наощупь и деформируются-

Симптомы скручивания листьев черешни на . названных индикаторах позволяют деффиренцировать этого возбудителя как от группы Nepo-вирусов, так и от остальных вирусов из группы Наг. Следует отметить, что для диагностики изолята СЛЧ в нечерноземной зоне наряду с Mazzard F 12/1 также пригодны персик GF-305 и сеянцы сливы.

Использование биологического титрования для определения зараженности

При ранней диагностике заболевания особое место зани-мает-метод механической инокуляции с использованием растений-индикаторов, позволяющий за короткий период выявлять зараженность растений вирусами. Успешная передача вируса с соком больного растения на травянистые индикаторы зависит от свойств н особенностей возбудителя, а также от соблюдения специальных условий стабилизации возбудителей в ино-. кулюме. В клеточном соке плодовых культур содержится большое количество полифенольных соединений, денатурирующих вирусные нуклеопротеиды (Duriez; Marenaud, 1969); этому же способствует и его высокая оксидазная активность. Отмечено также, что большинство возбудителей вирусных болезней.на косточковых находятся в тканях растений в относительно низкой концентрации (Fulton, 1967). Все это затрудняет проведение диагностических работ методом биологического титрования, снижает его эффективность.

/. Сейчас.разработан-целый ряд методик, позволяющих выделять н очищать вирус,- сохраняя его иифекционность. Для снижения активности оксндаз все'работы -по механической передаче и очистке вирусных частиц обычно проводят на холоде (Bald,-1972). С этой же целью применяется ~предварительное замораживание инфекционного материала (листьев, лепестков, корней и др.).

В практике для предохранения вирусных частиц,от окислительной денатурации применяют аскорбиновую "г кислоту, (Viennot, Bourgin, 1968), а для блокирования действия хининов— фенольные соединения, типа фермента полифенолкси-дазы (ДИЭКА). ' ' ..;

( Таким образом, возможность механической передачи вирусов с соком в значительной степени определяется, выбором условий их стабилизации. ' ' ^

Весной 1977 и 1978 гг. нами были проведены опыты по механической передаче вируса скручивания листьев черешни на травянистые растения. Наиболее эффективное -заражение вирусами СЛЧ наблюдалось при использовании трнс-буфера (рН-7,5) на отрастающих листьях лебеды (Ch. amaranticolor и Ch. quinoa), через неделю после инокуляции на листьях появились желтые пятна, которые впоследствие некротизирова-лись. Кроме того, наблюдали посветление жилок и деформацию листовой пластинки, а у Ch. amaranticolor отмирание

ВерхуШКИ. ' ( • . V;

В результате проведенных исследований по механической; передаче вируса скручивания листьев черешни на травянистые растения установлено, что наиболее быстро реагируют на' заражение растения Ch. quinoa.

Однако оценку зараженности деревьев с помощью только механического способа заражения травянистых растений-индикаторов нельзя считать достаточно надежной, вследствие невысокого процента передачи заболевания даже в оптималь-, ные сроки. ; , , •

' При использовании стандартного препарата СЛЧ, получен-, ного из Венгрии, а также местного изолята НИЗИСНП нами обнаружены сходные симптомы. В результате биологического титрования обоих изолятов на листьях огурца (сорт Делика-; тес) через 10 дней после заражения появились хлоротические пятна, приводящие растение к преждевременной, гибели-. На листьях табака через 2 недели после инокуляции проявились некрозы, развившиеся впоследствии в концентрические' не-крозные пятна. На петунии (Petunia hybrida) наблюда^ти диффузную реакцию; окраска листовой пластинки становилась светло-зеленой, молодые листочки сильно • деформировались

'Таблица 3 Результаты биологического титрования различных изолятов

возбудителя скручивания листьев черешни ,. - ■

'« о з : «'0.&Е

г; с о О х а.

Растение- , индикатор ч Источник нифек-.ЦИИ § 5 1 В * * 5«' 33 о о я • Симптомы . • заболевания

3 5ч з 2 « 5 ш , Г- О Й я Г в и а О я С « сз £ о.' ^ о 1-« с

СЬ. атагап- Вншня 14/14 6 Желтые пятна, некрозные по-

' 11со1ог, вреждения, отмирание верхушек, деформация листьев, посветленне

жилок

СЬ. quirioa Слива - ¿1/5 6

Персик 10/4 6

'-.у • ■ Черешня 8/8 6

Вишня 6/0 0 Диффузная реакция на всем ра-

• ~ стении

Р. hybrida Слива • 7/0 , 0

Персик 4/3 , 7 Светло-зеленая окраска листовой

Черешня ' 5/2 7 пластинки, посветленне жилок Разрушение и пятнистость

Вишня 6/3 10

С.'^аН^чи Слива 6/2 10 Преждевременная гибель расте-

Персик 4/2 10 ния

Черешня 5/4 10

N. йМтоэа Вишня 4/3 15 Образование концентрических

Слива. 4/2 15 некрозных пятен, деформация ли-

Персик 4/3 15 стовой пластинки ' \ -

Черешня 4/3 15

\ -Серологическое изучение возбудителей заболевания

; ч Исходным "материалом для получения антигена в наших опытах служил вирус скручивания листьев, выделенный и очищенный из зараженных растений СИ. qшпoa. Местный изолят, ' пассированный на различные виды, растений, дал специфическую реакцию сыворотки с выделенным нами вирусом СЛЧ (табл. 4). Подобную реакцию обеспечивал и стандартный препарат, присланный из Венгрии (ЫешеШ).

Электронно-микроскопический анализ . вирусных частиц

" С целью доказательства вирусной природы заболевания, изучений морфологических свойств вируса скручивания листьев черешни и идентификации его, нами проводились элек-, троино-микроскопические исследования из плодовых и травянистых растений,

' . ' " --Таблица: 4-.

Серологическое определение вируса скручивания листьев в растениях

• V ' . < - -' Сыворотка

Ч L t ^ . , ' - Препарат, полученный из: ; " ' h-H ^ s гr¡ .'. С • ' C'

i , < — ~ t . - . c: ■ С Uí .* o t¿c

- . ., \ ■ - ч ч . ^ 1 . и ■ o '

Р. pérsica .......... . . + . . __ • ¡.. •.

Р. avium' .' . . . . . . -. .. - . - + : . — —.. -

Р. tomentosa . ..... . . .. . ' + •_ ._ - • ^ —I - ' _ -

Р. domestica • . ....-..■. . . ■:Г + _ _ ■ < ^_и i'

Р. eerasifera. .- .. ..'.. v . .. . + .- ... — " . — _ . ----

Р. armeniaca . . .,..<.... .. + — _ _ --,

Morus alba. . . . ; . + — _ ' -:_'

Ch. quinoa . ,'.-■' .:: . . . -. — _-1 — -.

Ch. amaranticolor .,. . -; . -. -. ■"•. + — . . ._ •■_r ■ ■ —■ ■

+ ;— . --- - . ' - —- *

Примечания: знаком +-и —обозначено соответственно.налн-■: ■ чие и отсутствие реакции. ■ "

Условные обозначения: . СЛЧ— скручивание . листьев черешни;

КПМ — кольцевая пятнистость малины; ЛКПЗ — латентная кольцевая -пятнистость земляники;-: ОС — оспа слив; ТКП — томатная • кольцевая

■ - ПЯТНИСТОСТЬ. '-.-• . ' •--'■.. • • » ■ .'

-■-»В.чистых препаратах были обнаружены вирусные частицы нкоеаидрической формьгс диаметром около 28 нм. Кроме того,в поле зрения наблюдалось в небольшом количестве деградированный'материал, [обусловленный, по-видимому, режимом выделения. Сферические структуры, наблюдаемые; в препаратах из огурцов и^табака, отличались от таковых из СЬ. дшпоа.

В препаратах из древесных растений нами не'удалось выявить характерные частицы СЛЧ. Несмотря на,сравнительно высокую интенсивность симптомов заболевания на . листьях этих растений.

■ Г-> .•: ';::*.'•.. - * - Таблица о

Электронно-микроскопический анализ инфекционных препаратов

Препарат из: . Срок анализа . (месяц) •Метод приготовления' Наличие ( + ) ; отсутствие (—) вирусных структур

Ch. quinoa. N. tabacum • P.'hybrida*: P. pérsica ', - . P..cerasifera . P. domostica ' -Март • Апрель , и Апрель . : .Май---август. . "„ Май- — август . Май- —август : Очищенные частицы Погружение . ч ■• Разбавленная суспензня Очищенные частицы Погружение Погружение • + . с -4- , ..

Идентификация возбудителя заболевания. (Некоторые.физико-химические свойства вирусов, выделенных из , больных растении). >

При изучении свойств местного изолята, выделенного из вишни, нами установлен смешанный тип инфекции, состоящий из собственно, вирусов скручивания листьев черешни и возбудителей кольцевой пятнистости малины.

Коэффициент седиментации. Согласно имеющимся данным (Jones и Mayo, 1972), вирус скручивания листьев черешни представлен двумя типами частиц с различным коэффициентом седиментации— соответственно M=115S и B = 128S; из них только нижний компонент обладал инфекционностью.

В наших опытах по аналитическому центрифугированию вирусный препарат, очищенный двумя циклами дифференциального центрифугирования, давал три максимума. Расчет "коэффициента седиментации показал, что (верхний) пик содержит частицы, имеющие 70S. Это указывает на возможную нримесьв препарате фракции рибосом (концентрация ее незначительна). Второй пик включает в себя первый компонент вируса скручивания листьев (110S), а третий — тяжелый его компонент (126S). Величины 1 IOS и 126S, полученные нами, близки к указанным выше данным Jones и Mayo (1972).

1 Коэффициент экстцнЬии мы находили по отношению величины поглощения в максимуме и минимуме. Полученная нами величина (А 260 : А 280=1,12) соответствовала 40% по калибровочной Сегала и др- (1970). По максимуму поглощения можно легко рассчитать концентрацию вирусных частиц в препарате. В наших исследованиях она составляла в среднем 1,3 мг вируса в 140 г листьев.

Набор поражаемых растений. Для выявления круга поражаемых растений как возможных резерваторов возбудителя СЛЧ'в природе мы испытывали растения различных видов и родов," в том числе распространенные в нечерноземной' зоне. Для искусственного заражения растений исиользовалн чистый изолят СЛЧ. На сливе и персике GF-305 симптомы в виде скручивания листьев и желтых пятен между жилками появились уже через !3 месяца. На листьях сеянцев яблони первые симптомы появились через 4 месяца после прививки: диффузные желтые пятна со временем сливались, вызывая общий хлороз. Симптомы оставались хорошо заметными в течение первых 3-—i недель, а затем маскировались- Шелковица реагировала на инфицирование появлением светло-зеленых нятен; при этом отмечались деформация листьев и также задержка роста побегов. На листьях остальных видов яблони, груши, сливы, вишни, как и на церападусе, черемухе и абрикосе, мы наблюдали симптомы в виде расплывчатых светло-зеленых пятен, на месте и вокруг прививки отмечено камедетечёние с

ярко;выраженным: пожелтением, ткани, вдоль .жилок. Замедленный'..рост/„побегов.иногда сопровождается их отмиранием: развивалась розеточность. .. • >

• . Таким "образом, подтверждено, что вирус СЛЧ< способен поражать широкий «набор древесной растительности. Выявлены (нами и ¡новые ранее неизвестные хозяева возбудителя из числа представителей родов Pjjris, Morus, Cerepadus padus, Malus. . \> '. 4 r^

Найдено, .что общим ;дляv, большинства видов являются признаки скручивания и хлороза:листьев, а также подавление ростовых.процессов (табл. 6). "" "

' : • • • Таблица 6

Симптомы, вызываемые возбудителем скручивания листьев ,' .' : I на различных видах растений ■ w1..

Вид растения

Симптомы заболевания

P. pérsica GF-305

P. domestica

P.aviuni'-

P. eerasifera

P. armeniaca

P. tomentosa

Malus domestica . Pyrus; domestica Cerapadus •••■■ ' \

Padus racemosa •

-Alorus alba.

Линейный узор, хлороз и деформация листьев ......V 1 :

Хлороз,,задержка роста, деформация, камедетечение ■ . . .

Хлороз, скручивание листьев, за-дсржка роста, розеточность ^

Хлороз, скручивание листьев, задержка роста, некротические пятна.

Скручивание листьев, хлороз, розеточность •::' ,. ......

Хлороз листьев, задержка роста, некротические пятна ..■.-■

Хлороз и скручивание листьев

Светло-зеленые пятна, • хлороз, розеточность ■ • :.: ..•; •

Мозаика вдоль жилок, задержка роста, расплывчатые свет.ю-зеле:'. ные пятна, отмирание побегов' .

Наряду е этнм нами изучалась возможность переноса вируса скручивания -листьев черешни нематодами из рода х!рЫпеша. Использовалась методика инфицирования по Уа1-,Лег, Вгошп (1972). Определение нематод проведено,Н- Д. Ро-маненко.; Первые признаки заболевания-в виде скручивания листьев, прижилковой мозаики и розеточности проявились на персике и абрикосе. - . ■ .

:,С- целью выявления;инфекционности заболевания на абрикосе. и персике, проводили;биологическое титрование на.травянистых растениях лебеде и табаке. Через 7 дней, на г листьях индикаторов наблюдались типичные симптомы — образование, желтых пятен, на лебеде;и концентрических колец на табаке.

• Оздоровление плодовых культур от вирусных ^болезней с помощью термотерапии. В настоящее время применяются разные методы ,суховоздушной обработки зараженных вирусами растении. Суть метода заключается в выдерживании растении в специальных термокамерах при температуре 32—-38° С в зависимости от вируса- Путем суховоздушнои термообработки оздоравливают только надземные части растений или верхуш-шки молодых побегов, появившиеся во время прогревания, ко-торые'затем прививают на безвирусные сеянцы или укореняют в условиях тумана. Выращивать их можно и на искусственных питательных средах., После повторной проверки на индикаторах, полученные безвирусные растения используют как суперэлиту (безвирусный материал).

* Согласно нашим наблюдениям, температурный режим обработки растений очень,влияет на рост и развитие побегов разных видов и сортов плодовых культур. Результаты исследования динамики роста побегов у церападуса, сливы, черемухи, войлочной вишни и вишни обыкновенной показали, что у всех названных растении наблюдается снижение энергии роста побегов при температуре от 34 до 38° С, а у.войлочной вишни отмечено даже отмирание приростков при температуре

. выше 34° С. Гибель побегов от повышенных температур влияет на общий выход здоровых верхушек, а поэтому число растении, отобранных для термообработки необходимо увеличивать. Верхний температурный предел выживания можно повысить путем обработки растений различными веществами. Известно, например, что цианистый калий снижает интенсивность дыхания (Cornuet, Morrou, 1961), а кинетин повышает . устойчивость тканей к высоким температурам и одновременно угнетает репликацию некоторых вирусов (Ellenberger, I960).

Все испытанные деревья, не обнаружившие признаков поражения в процессе предварительной проверки, затем проходят основную проверку в питомнике на древесных индикаторах. Наблюдение за индикаторами проводится в течение трех лет. Данная схема используется в южных районах в открытом грунте- *

' . При производстве здорового безвирусного посадочного материала. плодовых культур • установлена высокая эффективность термического обеззараживания растений."Согласно данным Кассаниса и Поснетта (Kassanis, Posnette, 1961; Van der meer, 1970), большинство вирусов, поражающих вегетативно размножаемые культуры, может быт уничтожено при. тепловой обработке. В случае заражения растений термостойкими вирусами применяют методы культивирования апикальной меристемы. (Lutz, 1969). У плодовых деревьев, как правило, во время термообработки в суховоздушных камерах свободными от вирусов бывают только отросшие за это время верхушки

побегов, путем размножения.которых ,можно получать вполне' здоровые растения.; \ - ; 4 • 1 - Т

Нашими опытами показано, что полное освобождение вер-^ хушек зараженных.растений.от., вируса скручивания".листьев ¡достигается прогревом прй'режиме 38® С в течение 60 дней.. " После тестирования здоровые растения передаются для за--кладки маточных насаждений/ При организации питомников необходимо^ учитывать особенности вирусных болезней плодовых; в часткости'возможность передачи некоторых »вирусов с •семенами, нематодами "и пыльцой." Во избежание , передачи некоторых вирусов с пыльцой закладку,маточных насаждений следует-проводить .в; пространственной изоляции (не менее 2 км) от промышленных.садов !(Ю. Помазков; 1978). Почва обязательно должна:проверяться на наличие паразитических нематод, в случае обнаружения которых проводится, ее обеззараживание" фунгицидами. ,) '- " ^ " , ' ■' ; Для лучшего-роста "побегов применяют различные стимуляторы, так, по данным *Литвиненко ( 1978), при опрыскивании'-. растений фитогормонами в период аккл иматизации интенсив- , ность" роста побегов увеличивалась вдвое. Результаты, приведенные в,таблице ,7, свидетельствуют о высокой эффективно-¡, сти предложенного нами*режима термообработки. Ни: на.. ■>одном из индикаторов симптомы заболевания не проявились, следовательно; вирус; был^инактивирован во -всех .образовавшихся прйобеззараживании верхушках.

.: - ■ . ■-."'■■.".■ •'...■' ■ ' , . Таблица- 7.

Обеззараживание косточковых культур от возбудителя скручивания . листьев черешни при режиме 38° в течение 6 недель .

; Растение > • * . • " . Число черенков :,. , -

-здоровых больных '.

Церападус . . . .. Слива .;. . . . . . Черемуха . '. . ! . . Войлочная вишня . . ; . . . . . Вишня обыкновенная ....... - 12 7 , •4 0 12' , о о о о о

• Примечание: Растения войлочной вишни не.выдерживали этот, 'режим и погибли.- . •-. . •

В настоящее время с помощью прогревания освобождают посадочный материал плодовых культур от целого-ряда распространенных "заболеваний.: ;; :/ > ' х С целью оевобожденйя от, латентных вирусов сеянцы ели-, вы и вишни подвергались термотерапии. В ходе исследований мы следили за ростом побегов, при разных режимах, обработки., /Тестирование? на-древесных, индикаторах в соответствии, • 16" - 1 - ■ "V - ; ....--.. • ■

с общепринятой схемой. (Помазков, 1978), показало, что нами получены безвирусные клоны'8 сортов вишни и 5 сортов сливы- ■ ' S.' • •

Общие выводы

На основании проведенных исследований нами сделаны следующие основные выводы.

1. Показано, что местный изолят, обнаруженный в насаждениях вишни и вызывающий скручивание и деформацию листьев,* представлен смешанной инфекцией — особенно вирусом скручивания листьев черешни (Cherry leaf roll virus) и вирусом кольцевой пятнистости малины (Raspberry ring spot virus). - '

2. В процессе изучения различных свойств возбудителей установлена полная тождественность нх со стандартными образцами названных вирусов по всем сравниваемым показателям— коэффициентам седиментации, размерам вибрионов 28:нм, точке температурной инактивации (57°С), предельному разведению (10_3), серологическим свойствам, а также на древесных (Mozzard F 12/1, персик GF-305, Shirofugen) и травянистых (Ch. quinoa, Ch. amaranticolor, P. hybrida, N. taba-cum) индикаторах.

3. Впервые в стране выявлена возможность передачи основного компонента заболевания — вируса скручивания листьеп черешни — паразитической нематодой X. Vuittenezi.

4. Сравнительное изучение различных методов диагностики заболевания позволило предложить наиболее быстрые и практически надежные приемы определения зараженности:

а) прививку кусочком,коры в течение всей вегетации,

-б) использование древесных индикаторов,

в) биологическое титрование на основе модифицированной стабилизирующей среды (трис-буфер 0,01 М+0,2% аскорбиновой кислоты + 1,%' кофеина + активированный уголь),

г) серологический анализ с помощью приготовленной нами высокоспецифической сыворотки. ■

5. Установлено также, что вирус скручивания листьев черешни способен поражать широкий набор плодовых культур— сливу, абрикос, персик, церападус, черемуху, а также шелковицу, яблоню, грушу.

. 6. Среди множества исследованных сортов вишни (Тамбовская, Малиновская, Жуковская, Любская, Владимирская, Ширпотреб, Молодежная, Гриот московский, Солнечная, Загорьевская) и сливы (Венгерка московская, Память Мичурина, Скороспелка красная, Фиолетовая, Сизый голубок) не выявлено устойчивых к вирусу скручивания листьев. У вишни к числу наиболее восприимчивых сортов отнесены Владн-

мирская, Молодежная,-Загорьевская, у сливы — Сизый голубок.' . 'V . . ,■/■■• - .. .■ ■.-■• ■

7. С помощью установленного нами оптимального режима обеззараживания (в течение 6 недель при температуре 38° С) .. и тестирования на индикаторах получены безвирусные клоны нескольких районированных сортов вишни и сливы. .. ■ л

Объем !'/♦ п. л.

Заказ 1516.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44