Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка эритроцитарного антительного диагностикума и его применение в реакции непрямой гемагглютинации для лабораторной диагностики ротавирусного гастроэнтерита

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка эритроцитарного антительного диагностикума и его применение в реакции непрямой гемагглютинации для лабораторной диагностики ротавирусного гастроэнтерита"

А 1 и -

АШЕШ ЩЩИНСШ НАУК СССР ИНСТИТУТ ПШЮШЕЛИТА И ВИРУСНЫХ энцефалитов

На правах рукописи

КОШАХОВ Сергей Анатольевич

УДК 616.34-616.988.1-616.07-578/579

РАЗРАБОТКА ЭШТРСЦИТАИЮГО АНТИТЕШОГО ДШН0ОТШИ1 И ЕГО ПЙИШЕНИЕ В РЕАКЦИИ НШРШДОЙ ШШШВШЩЩ ДЛЯ ЛАБОРАТОНЮЙ ДИАШОСТИКИ РОТАБЙРУСНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1930

/

! с-:

Работа выполнена в Ростовском НШ эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены МЗ РСФСР

Научные руководители: доктор медицинских наук,

академик АМН СССР С.Г.Дроздов

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В.Я.Зарубинекий

Официальные оппоненты: член-корреспондент АМН СССР,

доктор медицинских наук, профессор

В.А.Пашкевич

доктор медицинских наук, профессор

В.А.Зуев

Ведушее учреждение: Ленинградский Институт им. Л.Паетера

Зашита диссертации состоится У^"" /«¿¿¿о/^^ТЬО.^ 1991 г, в 10 часов на заседании специализированного Совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР по адресу: 142782, Московская область, Ленинский р-он, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР. ,

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук ^[¡Л,,О.А.Ыедведкина

ОВЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Острые кишечные инфекции из-за их широкой распространенности составляют значительную проблему здравоохранения. Однако большинство случаев этих заболеваний (до 60-80$) остается этиологически нерасшифрованными, хотя клиническое и эпидемиологическое изучение свидетельствует об их инфекционной природе (Дроздов С.Г. с соавт., 1982). Применение современных методов диагностики позволило обнаружить целый рад неизвестных ранее вирусов и установить их этиологическую роль при гастроэнтеритах. Как показали многочисленные исследования отечественных и зарубеяных авторов, проведенные. в последние годы, ведущая роль в этиологии кишечных инфекций принадлежит рогавирусам Яос/е* /У., 1977; /¿олпо Т.е/о^ 1978; И., 1978, 1980; Дроздов С.Г. с соавт., 1982 ж др.).

Для ранней лабораторной диагностики ротавцрусного гастроэнтерита предложен ряд методов, из них наибольшее распространение получили электронная микроскопия (Ш) или ишуноферментный анализ (ША) (Дроздов С.Г. с соавт., 1982; БукринскаяА.Г. с соавт., 1983). Однако эти методы в настоящее врегля мало доступны практическому здравоохранению, что не позволяет диагностировать заболевание и проводить рациональное лечение, изучать особенности эпидемиологии инфекции и планировать профилакигеские мероприятия.

В связи с этим разработка и внедрение простых в исполнении, быстрых и надежных методов лабораторной диагностики этого заболевания являются актуально! задачей. Среди известных методов диагностики вирусных инфекций данным требованиям полностью удовлетворяет реакция непрямой гемагглютинаади (ШГА) - высокочувствительный и специфичный тест, пригодный для индикации возбудителя

непосредственно в исследуемом материале- Главное ее достоинство - высокая чувствительность: по атому показатели ГНГА превосходит методы РСК, двойной и радиальной ишунодийфузии и близка к методам нового поколения - ишунос&ерыентному и радаоишунно-му (-Носков Ф.С., 1985). Выявление вирусных антигенов в НГГА заншает всего 2,5-3 ч от момента доставки пробы клинического материала, что такке выгодно отличает ее от других, более про-долнительннх по времени постановки методов исследования.

Цель работы

Целью наших исследований бнла разработка ротавирусного эри-троцитарного антптельного диагностнкума и изучение возыояности его применения в ЕНГА для лабораторной диагностики ротавирусного гастроэнтерита.

Основные задачи исследования

1. Выбор методик и отработка оптимальных условий получения лабораторных серий эритроцитарного ротавирусного диагностикума.

2. Изучение свойств полученного препарата и разработка методов его контроля.

3. Изучение диагностической ценности разработанного диагностикума для быстрого выявления ротавируса у больных гастроэнтеритом.

4. Изучение диагностической ценности препарата для серологической диагностики ротавирусной инфекции.

5. Применение разработанного диагностикума для изучения распространения ротавирусной инфекции среди больных гастроэнтеритами детей раннего возраста.

Научная новизна

- Впервые в качестве иммунного сырья для получения ротави-русных диагностических препаратов предложена иммунная асцитная

жидкость (ЙА2) белых крыс.

- Впервые на основе иммуноглобулина, полученного из ИМ, разработан высокоактивный и стабильный препарат для лабораторной диагностики ротавирусннх заболеваний ладей и животных - диагностикам эритроцитарный ро<гавнрусный тшуноглобуяинсвый сухой для РНГА.

- Установлена высокая частота заболеваний ротавирусной этиологии у больных остригли кишечными инфекциями детей раннего возраста в г. Ростове-на-Дону.

Практическая ценность и внедрение

Показана высокая диагностическая ценность РНГА с полученным диагностикумом при выявлении ротавирусов у больных.

Установлена возможность применения диагностикума в РТНГА для выявления и титрования антител к ротавирусу в сыворотках крови больных и реконвалеедентов.

На основании проведенных исследований разработана и согласована с ГЙСК имЛ.А.Тарасевича "Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума эригроцитарного ротавирусного шмувогло-булинового сухого для РНГА". Получено разрешение Комитета вакцин и сывороток МЗ СССР {Л 4 от 10.08.88 г.) на разработву технологии промышленного производства препарата.

В Ростовском НИИ эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены организовано экспериментальное производство, что позволило разработать проект временной фармакопейной статьи (ВФС) и экспериментально-производственный регламент (ЭПР).

Основные полоаения, выносимые на защиту

- Обоснована возможность использования ИАЖ белых крыс против ротавируса в качестве высокоактивного иммунного сырья для

получения диагностических препаратов.

- На основе ИАЖ получен стабильный и специфичный диагностикам эритроцитарный ротавирусный ишуноглобулиновый сухой, позво-

С' 7

ляющий выявлять 2,4-10 - 2,2-10 частиц гомологичного вируса в I м л.

- Применение даагностикума позволило выявить широкое распространение ротавцрусного гастроэнтерита среди больных острыми кишечными инфекциями детей раннего возраста в г. Ростове-на-Дону.

Апробация работы

Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, были доложены и обсувдены на 5 научных конференциях союзного и регионального значения. CI98S-I988 гг.). Апробация завершенной диссертационной работы црошла в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР в марте 1990 г.

Публикация материалов исследования

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2главы), собственных исследований (4 главы), заключения и выводов. Указатель литературы содержит 181 наименование отечественных и зарубежных источников.

Работа изложена на 139 страницах машинописного текста и иллюстрирована 20 таблицами и 9 элеетрошсшшроскопическими фотографиями. •

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛВДОВАНШ

Материалы и методы

Штаммы ротавируса, культуры клеток. В работе использовали штамм ротавируса обезьян SA-II, любезно предоставленный д-рси

]екоян Л.А. (Институт полиомиелита я вирусных энцефалитов АШ !ССР). Использование данного штамма обусловлено наличием антигенных перекрестных связей за счет группоспецпфического антиге-1а УР6, имеющегося у ротавирусов человека и навозных. Вирус пас->ировали на культуре перевиваемых клеток почек зеленых марты-аек 4647 и культуре перевиваемых меток почек эмбриона сеиньп :СПЭВ), любезно предоставленной нагл д-ро;л Л.Л.Мироновой (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АШ СССР).

Материалы. использованные для выявления ротавпрусов. Всего гсследовано в РИГА ЫС2 пробы фекалий от детей, больных остриги кишечными инфекциями. Из них в 657 пробах наличие ротавиру-:а параллельно определяли истодом электронной микроскопии (31Д). Летод&чя РНТА и ЗМ исследовано 3 серии концентрированного рота-зируса 5А-11, использованного для иммунизации лабораторных ш-зотных и для контроля активности дпагностикума. Концентрацию вируса определяли методом электронной микроскопии (Королев ГЛ - Б., ЕЭ86).

Материалы, использованные для выявления специфических анти-гел к ротавирусу. Исследовано на наличие антител з реакции тор-¿онения непрямой гемагглюткнации (РШГА) 60 проб ПАИ белых крас, 203 сывороток крови детей, больных ротавируснш гастроэнтеритом, Т 32 из них сыворотку крови исследовали повторно. 3 13 пробах 1А2 антитела определяли параллельно методом шмупоэлектрокной ликроскошш.

Методика электронной микроскопии. Для обнаружения ротавиру-оов применяли прямую просвечивающую электронную микроскопию. Зрепараты готовили методом флотации на сетках, покрытых нитро-целлшозной подложкой. Негативное контрастирование проводили

1% водным раствором уранилацетата.

Иммуноэлекгроннуа микроскопию проводили по методике, предложенной Дроздовым С.Г. с соавт. (1982). При полозительных результатах исследования ротавирусы были видны в препаратах в вице специфических скоплении, тлеющих разную степень покрытия антителами.

Реакцию непрямой гемагглютинацин применяли для выявления ро-тавируса в исследуемом материале. HITA и РЖГА проводили микро-методш в соответствии с методикой, предложенной С.Я.Гайда'лович с соавт. (1974). Постановку ШГА сопровождали следующими контро-лямк: а) контроль на отсутствие спонтанной агглютинации; б) контроль специфичности HITA. Во второй ряд лунок с двукратными разведениями того se антигена добавляли HAS и после 20 мин контакта добавляли во все лунки эритроцитарный диагаостикум. Титром материала считали его наибольшее разведение, вызывающее агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов интенсивностью не менее чем на 3+. Отсутствие агглютинации или скитание титра антигена в присутствии ИАЕ к ротавирусу не менее чел в 4 раза считали подтверждением специфичности реакции.

Реакцию торможения непрямой гемагглютинации (РШГА) пригленя-ли для выявления и количественного определения (титра) антител к ротавирусу в ИАЖ и в сыворотках крови больных. При постановке РЖГА использовали антиген рогавнруса обезьян в рабочем разведении (4АЕ). Постановка РЖГА сопрововдалась следующими контролями: а) контроль на неспецифическую агглютинацию диагностикума; б) контроль сыворотки на отсутствие неспецифических гемагглюти-нинов. Б случае полокительного контроля результат РЖГА с данной сывороткой не учитывали.

Разработка ротаптгруспого эрпгроцитаоното иммуноглобулинового диагностшсунз

Получение антигена ротавируса. Птшм ротавируса SA-II выращивали в перевиваемых культурах клеток П5И 4647 и СПЗВ с добавлением трипсина в конечной концёнтрацни 1,5 мкг/мл. Вирус концентрировали осавдением при 120 000^ на ультрацентрифуге К-32 в течение

5 ч. Надосадочную жидкость удаляли, оставляя 1/25 часть от исход-

тт

ного объема и ресуспендировали осадок, содержащий около 2,5.НгА вирусных частиц в I мл. Концентрат ротавируса использовали для иммунизации животных и в качестве антигена для постановки РИГА.

Получение иммунной асцитной кидкости (ИАЮ белых крнс. ймму-низировали белых беспородных крыс I раз з 7 дней, чередуя внут-римыисчяое и внутрпбршшное введение смеси равных количеств ротавируса и полного адыованта Фрейнда в течение 6 недель. Через 1-2 дня после последней инъекции антигена для образования асцит-ной яидкости иммунизированным еивотным вводили внутрибркшшнно ас-цитную квдкость, содеркащуа клетки опухоли яичника крыс (птамм ОЯ). Через 10-12 дней собирали ИА2 и определяли содержание антител в ИНГА. Большинство проб ИАЖ имело титр в РПП'А с гомологичным вирусом в пределах от 1:512 до 1:2000. НАЕ использовали для получения иммуноглобулина, а таккз для контроля специфичности НГГА.

Выделение иммуноглобулина из НАД проводили методом многократного осаздения различными концентрациями охлааденного этанола (А.С.Нечаева, Н.А.Пономарева, 1956). В процессе работы бцло получено 6 серий иммуноглобулина к ротавирусу обезьян. Специфическая активность иммуноглобулинов разных серий в РШГА находилась' в пределах 1:5000-1:10000. Эритроциты барана фиксировали глюта-ровкм альдегидом по fj.biOj с соавт. (1967) или формалздегидом по

методу Вайнбаха (1958).

Таннизацкю и сенсибилизацию фиксированных эритроцитов проводили по методу Боадена (1951) в модификации Т.Ркцай. На конечном этапе суспендировали сенсибилизированные эритроциты в фосфатном буферном растворе с добавлением 0,5% нормальной лошадиной сыворотки, получая таким образом кпдкий диагностику«.

Сублимации диагностикума, антигена ротавируса и ЙАЖ проводили на экспериментальной установке ГИЭМ-4 при глубине вакуума 50-70 микрон без контактного подогрева при комнатной температуре в течение 24 ч. Ампулы с сухшл диагностикумш запаивали под вакуумом. Всего было изготовлено 88 серий жидкого и 6 серий сухого ротавирусного эритроцитарного диагностику;.!а, для чего использовали 5 серий фиксированных эритроцитов и 6 серий иммуноглобулина.

Результаты изучения свойств диагностикума

Все серии диагностикума реагировали с антигеном ротавируса

5А-П в разведенш от 1:512 до 1:4000, что соответствовало кон-6 7

центрацш 2,4-10 - 2,2-10 частиц вируса в I мл. Диагностику^ не реагировал с суспензиями фекалий больных, у которых методом электронной микроскопии были обнаружены в высоких концентрациях адено-, корона- или энтеровирусы, а также с антигенами из не инфицированных культур клеток (табл. I).

Несколько серий лиофилизированного диагностикума были проверены в ШГА со штаммом "К" ротавируса свиней, полученным из музея вирусов Института вирусологии ем.Д.И.Ивановского- Дяатости-кум реагировал с этим ротавирусом, разведенным не менее чем 1:32 с подавлением агглютинации иммунной асцитной здцкостью.

Контроль диагностикума на специфичность в РИГА проводили,

Таблица I

Результаты изучения активности п специфичности кидкого и лпосйилизирозанного дгапюстикума в РИГА

Активность диагностикума в РИГА с антигеном

ш пп Серия диагнос-тнкума ; : ; : незара-: незатэа- рота-: пттрнп_:к0т,0чя_:едтрт1п_: генной : -.зкнои вируса: fr^vca :культуры:культуры SA-II ; вируса .вируса .вируса . клет0~ • тСЛет0к : : : : спзв :ns,i 4647

I 61 1:1000 0 0 0 0 0

2 72 1:2000 0 0 0 0 0

3 72 лиофил. 1:2000 0 0 0 0 0

4 77 1:2000 0 0 0 0 0

.5 77 лиофил. 1:2000 0 0 0 0 0

6 79 1:512 0 • 0 0 0 0

7 82 1:2000 0 0 0 Q 0

8 82 лиофил. 1:2000 0 0 0 0 0

9 84 1:4000 0 0 0 0 0

10 84 лиофил. 1:4000 0 0 0 0 0

О - отсутствие агглютинации с неразведенннм антигеном.

используя: ИАЗ к ротавкрусу; асцятную пылкость непшунизпровап,-ных кивотних; ишушше сыворотки, содеркащяе антитела к вирусам других антигенных груш.

Во всех случаях активность агглютинации в присутствии рота-вирусной иммунной асцитной гпдкости снижалась в 128-256 раз и не снижалась в присутствии асцитной шщкости неишукизированных нивотных и сывороток, содержащих гетерологачные антитела (табл.2).

Таблица 2

Результаты изучения специфичности вдкого и лиофилизированного диагностикуш в РТНГА .

Актив-: 'ность : Серия :диагно- :-

Активность диагностикума в РТНГА с сыворотками

пп диагностикума :стикума: : в РНГА :с рота-: :вирусом: ИАЖ к рота-: вирусу: аденовирусной КоксакиВ вено : пояио-:миелитной : поливалентной

I 49 1:2000 1:8 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000

2 61 1:1000 1:4 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000

3 72 1:2000 1:8 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000

4 72 лиофил. 1:2000 1:8 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000

5 77 1:2000 1:8 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000

6 77 лиофил. 1:2000 1:8 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000

7 . 82 1:2000 1:4 I:2000 1:2000 1:2000 1:2000

•8 82 лиофил. 1:2000 1:4 1:2000 1:2000 1:2000 1:2000

9 84 1:4000 1:4 1:4000 1:4000 1:4000 1:4000

10 84 лиофил. 1:4000 1:4 I:4000 1:4000 1:4000 1:4000

II 85 1:2000 1:8 1:2000 1:2000 I:2000 1:2000

Установлено, что хранение вдкого и лиофилизированного диагностикума в течение 18 месяцев (срок наблвдения) при температуре +4 -г +Ю°С не влияет на первоначальные свойства диагностикума. Результаты исследований приведены в табл. 3.

Такт.« образом, в результате проведенной работы создан новый агностический препарат для РНГА с ротавирусаш человека и зш-

вотных - диагностику!! эрктроцитарный ротавирусный ишуноглобули-новый сухой. Диагностику».! имеет высокую активность и специфичность. Препарат сохраняется длительное время как в пидкш, так и в сухом ввде, не теряя своих первоначальных свойств.

Таблица 3

Изучение активности кидкого и лиофплизпрованпого диагносгикуш в зависимости от сроков хранения

JáIS

Серия :диагнос-:

Активность в ШГА с антигеном ротавнруса при хранении в течение:

ш. ; тикума : 2 дней: I мес. : 4 мэс.; : 6 мес.: 8 мес.! ; 12 мес. : 18 мес.

I 6 2000 2000 2000 - - - 2000

2 7 4000 2000 - 2000 - - 2000

. 3 8 2000 1000 - - 1000 - 1000

4 9 1000 1000 1000 - - - 1000-

5 51 1000 1000 - 512 - 512

6 60 2000 1000 1000 - - 1000 -

7 72 2000 2000 - 2000 - - 1000

8 72 лиофил. 2000 2000 - 2000 - - 2000

9 73 2000 2000 2000 - - 1000 - -

10 74 2000 -2000 2000 - - - -

II 74 лиофил. 2000 2000 2000 - - сооо -

12 77 лиофил. 2000 2000 2000 - - 2000 -

13 83 лиофил. 2000 2000 - - 2000 - -

Примечание. Представлены обратные величины титров антигена.

Применение РИГА для диагностики ротавирусного гастроэнтерита Для изучения диагностической ценности РИГА с разработанным диагностзкумом было проведено параллельное исследование методами Н1ГА и электронной микроскопии 657 цроб фекалий от детей,больных остригли кишечными инфекциями в возрасте от 2 недель до 2 лет, поступивших в инфекционные отделения больницы скорой медицинской помощи г. Ростова-на-Дону.

Для постановки реакции использовали 10% суспензии фекалий больных. Специфичность РИГА при постановке каздой пробы подтверждали ее подавлением НАЛ, разведенной 1:20. Сравнительные результаты выявления ротавируса методами электронной микроскопии и РИГА представлены в табл. 4.

Таблица 4 Сопоставление результатов выявления ротавлрусов методами электронной микроскопии в ГНГА

Результаты ЭИ : Коли-: Результаты РИГА : Процент .•совпадения результатов ; ЗМ и РЕГА

гчество: : проб : положительные отрицательные

Ротавирус 227 227 0 100,0

Капсомерв ротавируса 284 169 115 59,5

Вирусы не обнаружены 146 5 141 96,6

Всего 657

Все пробы, в которых методом электронной микроскопии был обнаружен ротавирус, пологительно реагировали в РИГА, 69,9$ из них имели титры от 1:16 до 1:8000.

.Методал ишуноэлекгроннпй микроскопии с ИА2 :: ротавпрусу

обезьян подтверждена ротавирусная природа обнаруженных частиц.

При исследовании 146 проб, отрицательных при микроскопии, 5 из них 13,4$) реагировали в РИГА в невысоких титрах, но с подавлением агглютинации в РТНГА, что позволяет интерпретировать их как положительные.

В ходе этой работы мы столкнулись с интересным явлением: большое число проб, отрицательных на ротавирус при электрон-номикроскопическом исследовании, реагировали в РИГА в невысоких титрах: от 1:2 до 1:8. Реакция была специфичной, что под-твервдалось подавлением агглютинации ИАЖ не менее чем в 4 раза . При тщательной повторной электронной микроскопии с большим увеличением под бинокуляром (суммарное увеличение 650000-850000) в этих пробах были обнаружены субъединицы внутреннего капсида ротавируса (капсомеры), которые часто образовывали большие со-топодобные структуры. Ротавирусная природа каясдаеров была подтверждена методом иымуновлектрошой микроскопии. ■

Такшл образом, РИГА позволяет выявлять как целые, так и разрушенные вирионы ротавирусов, что подтверждает высокую диагностическую ценность этого метода.

Применение разработанного диагаостикума дает возможность не только диагностировать спорадические заболевания, но и в кратчайше сроки проводить расшифровку вспышек ротавируского гастроэнтерита.

" Во время двух вспышек острой кишечной небактериальной инфекции (одна имела место в детской больнице г. Ростова-на-Дону, а вторая - в родильном доме г. Донецка Ростовской области) у 1 большинства детей и матерей был обнаружен антиген ротавируса, что позволило установить ротавирусную этиологию этих вспышек.

Результаты РНГА в дальнейшем были подтверждены электронномшсро-скопическим исследованием.

Результаты применения РТНГА для серодиагностики ротавирус-ной инфекшш

Для оценки чувствительности РТНГА последовали парные сыво-роткп крови детей, больных ротавпруснвм гастроэнтеритом. У детей первого года шзни нарастание титра антител нередко не происходило, что, видимо, связано с несовершенством иммунной системы в этом возрасте (табл. 5).

Таблица 5

Титры антител к ротавирусу в парных сыворотках крови больных ротавирусным гастроэнтеритом детей первого года еизни

пп Номер анализа Возраст, мес. Срок обследования от начала болезни, в днях Титры антител к ротавирусу в парных сыворотках

I сыв-ка ; 2 сыв-ка I сыв-ка : 2 сыв-ка

I 1089 4 6 12 1:2 1:8

2 1134 4 4 26 1:16 1:32

3 1229 4,5 5 13 1:16 1:16

4 1212 5,5 5 21 1:8 1:32

5 1090 5,5 5 10 1:4 1:8

6 1095 6 2 12 1:2 1:8

7 1098 7 4 II ОТР 1:4

8 1152 9 3 9 1:32 1:64

Нарастание титра антител в 4 раза во вторых сыворотках под 'й!р I, 4, 6, 7 позволило серологически подтвердить диагноз рота-вирусного гастроэнтерита. У переболевши ае детей более старшего возраста обнаругено нарастание титра антител в 4-Е и более раз.

Исследование парных сывороток в РТНГА позволило ретроспективно расшифровать вспышку ротавирусного гастроэнтерита, имевшую место в 1986 г. в детском дошкольном учреждении г. Краснодара. Данные бактериологического анализа показали отсутствие патогенной микрофлоры в фекалиях больных. Исследование парных сывороток 1фови в РИГА (табл. 6) показало нарастание титра антител к рогавируоу во второй сыворотке крови как у детей, так и у обслуживающего персонала в 16-32 раза, что и позволило установить ротавируснун этиологию этой вспышки.

Таблица 6

Тигры антител в парных сыворотках крови больных ротавирусныл гастроэнтеритом (вспышка в г. Краснодаре)

Срок обследования : Титры антител от начала болезни, : к ротавирусу

в днях : в парных сыворотках

I сыв-ка : 2 сыв-ка : I сыв-ка : 2 сыв-ка

I 1г. 6 мес. 3 19 1:8 1:128

2 2 г. 6 мес. 3 21 0 1:8

3 2г.7 мес. 2 21 0 1:8

4 Зг. 2 21 1:16 1:512

5 1г.7 мес. 3 19 1:32 ' 1:256

6 21 г. 3 19 1:64 1:128

7 3 г. 2 19 1:16 1:256

8 2 г. I 19 1:16 1:128.

9 2 г. 6 мес. I 21 1:32 1:128

10 1г. 9 мес. I 21 1:16 1:256

II 1г. 7 мес. I 19 1:16 1:128

12 2 г. 6 мес. I 21 1:8 1:512

пп

Возраст

Таким образом, установлена возыоаность использования РШГА с эритроцитарным рогавпруснны диагностикумом для определения антител в сыворотках кровп больных е реконвалесцентов.

Изучение возрастного и сезонного распределения частоты рота-вирусной инйекцш у больны:-: гастроэнтеритами детей раннего возраста

Обследовали больных острыми кииечнюга инфекциями в возрасте от 2 недель до 3 лет (табл. 7), госпиталпзировашых в стационары г. Ростова-на-Дону. Всего обследовано на наличие ротавпруса в фекалиях методом РИГА 842 человека. Антиген ротавпруса обнаружен у 387 больных всех возрастных групп, что составило 45,9*1,7$ рт всех обследованных. Частота рогавирусной инфекции распределялась очень неравномерно. Наименьшее количество случаев заболеваний отмечено в возрастных группах от 0 до 4 мес. - 33,0*2,9$ и от 2 до 3 лет - 32,4*7,9$.

У.детей первого года еизни с увеличением возраста частота заболевания увеличивается, достигая своего максимального значения в 11-месячном возрасте - 73,3-5,7/5. На втором и третьем году низни частота случаев ротавирусного гастроэнтерита составила 32,4*7,9?.

При анализе частоты случаев ротавирусного гастроэнтерита по сезонам года наш выявлена вырагекная сезонность в распространении этой инфекции. Наиболее часто ротазирус выделяли в ноябре-марте - 58,3*2,3$ среди всех обследованных, что в 1,8 раза чаце, чем за летний период (31,2*2,4$). Максимальная частота инйекщш в осенне-зимний период отмечена у детей I1-ыесячного возраста -88,6*5,4/5, а минимальная - у детей 2-3 лет - 38,1*10,6$. В теплый период года нам не удалось выявить значительных различий частоты

Таблица. 7

Возрастное и овзоннов распределение частоты ротавцрусной инфекции у больных гастроэнтеритами детей раннего возраста

Месяц года Возраст

0-4 мес. 5-6 мес. 7-10 мес. II мес. всего : всего ; 9 о 0-11 иео. мес". 0-23 мес.; 2~л года всего

Ноябрь-март

Апрель-октябрь

Всего

125/52 60/47 152/106 35/31 392/236 45/23 437/259 21/8 458/267 41,6-4,4$ 58,7*5,5$ 69,7*3,7$ 88,6*5,4$ 60,2*2,5$ 51,1*7,4$ 59,3*2,3$ 38,1*10,$ 58,3*2,3$

132/32 72/20 102/34 25/13 331/100 39/17 370/117 14/3 384/120 24,2*3,7$ 27,8*5,3$ 33,3*4,6$ 52,0*9,9$ 30,2*2,5$ 43,6*7,9$ 31,6*2,4$ 21,4*10,9$ 31,2*2,4$

257/84 152/68 254/140 60/44 723/336 84/40 807/376 35/Н 842/387 33,0*2.9$ 44,7*4,1.$ 55,1*3,1$ 73,3*5,7$ 46,5*1,8$ 47,6*5,4$ 46,6*1,7$ 32,4*7,9$ 45,9*1,7$

В числителе - количество обследованных больных гастроэнтеритами. В знаменателе - количество больных, у которых обнаружен антиген ротавпруса.

ротавирусной инфекции в разных возрастных грушах, за исключением II-месячной группы, в которой отмечено статистически достоверное увеличение частоты инфекции до 52,0-3,3%.

Таким образом, установлено, что ротавирусный гастроэнтерит составляет почти половину (46,6-1,1%) всех случаев острых кишечных заболеваний у детей в возрасте до двух лет, что свидетельствует о его ведущем значении в этиологии острых кишечных инфекций в г. Ростове-на-Дону.

Практические рекомендации

Полученные результаты позволяют рекомендовать разработанный препарат к промышленному производству и широкому применению для научно-исследовательских и практических целей.

вывода

1. Разработан новый диагностический препарат - даагностикум эритроцитарный ротавирусный иммуногдобулиновый сухой для ШГА. Диагностикуы шеет высокую активность, специфичность и стабильность при длительном хранении.

с п

Препарат позволяет выявлять в РИГА 2,4-10° - 2,2-10 частиц гомологичного ротавируса.

2. Установлена высокая диагностическая ценность РИГА с разработанным препаратом для выявления ротавирусов у больных гастроэнтеритами.

По чувствительности РНГА не уступает методу электронной микроскопии. ШГА выявляет как цельные, так и разрушенные вирионы ротавируса и позволяет получить ответ в течение 2-3 ч.

3. Установлена высокая чувствительность РТНГА как метода обнаружения и титрования антител к ротавирусу в сыворотках крови.

4. Установлено наличие антигена ротавируса у 45,9^1,7$ обследованных больных гастроэнтеритами, что свидетельствует о широком распространении ротавирусной инфекцш среди детей в возрасте до двух лет в г. Ростове-на-Дону. Установлены возрастные и сезонные особенности распределения частоты инфекции в данной возрастной группе.

5. На основании проведенных исследований, определены требования к эритроцит арному диагностикуму, методы его контроля и разработана нормативно-техническая документация на его производство .

Материалы диссертации отражены в 9 печатных работах.

1. Разработка эритроцитарного препарата для диагностики ро-тавирусных инфекций / Колпаков С.А., Зарубинский В.Я. // Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города: Тез. дота: обл. конференции. - Ростов н/Д, 1987. С.23-24.

2. Разработка и применение эритроцитарного диагностикума для обнаружения ротавирусов и специфических антител у больных / Колпаков С.А., Зарубинский В.Я. // Острые кишечные инфекции: Респ. сб. науч. тр. - I., 1988. Вып.12.

3. Реакция непрямой гемагглютинацш для экспресс-диагностики ротавирусного гастроэнтерита / Колпаков O.A., Зарубинский В.Я. И Рук. деп. во ВНИИШИ ЫЗ СССР, 1988. I? Д-14Э07.'

4. Клинико-лабораторная характеристика ротавирусной инфекции у детей раннего возраста / Симованьян Э.Н., Ловердо Р.Г., "Зарубинский В.Я., Колпаков С.А., Авроров В.П. // Ш Всесоюз. съезд детских врачей: Тез. докл. - М., 1988. С.271-272.

5. Серологическая диагностика ротавирусной инфекции у детей

раннего возраста / Ловердо Р.Г., Плескачев А.Д., Зарубшский З.Я., Колпаков С.А. // Актуальные вопросы изучения кишечных инфекций: сб. научн. тр. - Нальчик, 1988. С.144-146.

6. Определение ротавпрусов в воде / Ыирович И.О., Головина C.B., Колпаков С.А. // Гигиенические аспекты охраны окруаающей среды: сб. тр. 7-й Сев.-Кав. научн.-практ. конференции - Ростов н/Д, 1988.

7. Клиника, диагностика и лечение ротавирусной инфекции у детей раннего возраста / Симованьян Э.Н., Ловердо Р.Г., Заруби-нский В.Я., Колпаков O.A., Авроров В.П. //Педиатрия. - 1989. -ß 2. - С.47-51.

8. Применение реакции непрямой геыагглвтинацни для диагностики ротавпрусного гастроэнтерита / Зарубинский В.Я., Колпаков С .А. //'Воцр. вирус ол. - 1989. - Jê 2. -'С.250-254.

9. Ротавирусная инфекция / Дроздов С.Г., Покровский В.И., Секоян I.A., Ыашшюв В.П., Королев М.Б., Казанцева В.А., Гинев-скаяВ.А., Еирман Г.А., Хаусгов В.И., Миронова Л.Л., Хангаев Ю.Х., Ивашпжова Т.А., Еремеева Т.П., ¡Дазанкова Л.Н., Волохо-вич Т.Т., Курносова H.A., Пантелеева Л.Г., Зарубинский В.Я., Колпаков С.А., Яний В.Б., Голубева H.H., Солодовников Ю.П., П1у-льцева Е.К. // Метод, рекомендации. - ¡Л., 1989. - 32 с.

Соискатель

Подписано к печати 06.12.90 г. Заказ № 217. Тираж 100 экз.

Бюро множительной техники Института полиомиелита АМН СССР.