Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная оценка эффективности препаратов для диагностики ротавирусной инфекции и их стандартизация

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная оценка эффективности препаратов для диагностики ротавирусной инфекции и их стандартизация"

российская академия медицинских наук институт полиомиелита И вирусных энцефалитов

На правах рукописи УДК 578.891 65.011.8:658 (562+516)

карпова Елена Викторовна

сравнительная опенка эиективности препаратов для диагностики ротавдусноя интенции . и их стандартизация .

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Государственном Научно-исследовательском

институте стандартизации и контроля медицинских Сиологических препаратов им.Л.А.Гарасевича Российского Государственного Комитета санитарно-эпидемиологического надзора

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Карпович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор М.С.Воробьева доктор Сиологических наук М.Б.Королев

Ведущая организация: Институт вирусологии им.Л-И.Ивановского РАМН

Защита состоится 'у? " ьЫЛУЛ^ 198^ г. ■ № час. на заседании Специализированного Совета (Д 001.27.01) при Институте полиомиелита м вирусных энцефалитов РАМН (142782, Московская область, Ленинский район, п/о Института полиомиелита). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Автореферат разослан " М •• Ш>СШ1 тЧг.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат Сиологических наук

О.А.Медведкина

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проОлемы. В настоящее время острые кишечные инфекции (ОКИ) являются актуальной проблемой здравоохранения. Вспышки диареи насчитывают до 5 миллиардов случаев в год (Maison 0., Este3 M.K.,1990), при этом регистрируется от 3.7 до 4,6 млн смертельных случае» (Black R.Е. ,1933). В экономически развитых странах заболеваемость острыми гастроэнтеритами (ОГЗ) еанимает второе место после респираторных инфекций (Ransome-Kutl, 1991).

Среди всех ОКИ наиболее частим этнологическим агентом тяжело протекающих ОГЭ у детей являются ротавигусы. В развивающихся странах ротавирусы являются причиной более 60 £ ОГЭ. а в развитых - до 50 X (Blshcp R,F.,1993; Cook S.M., GlassR.1..1990). Общее число только лабораторно подтверженных случаев с летальным исходом ротавирусного гастроэнтерита составляет до I ООО ООО случаев в год (Bishop R.F., 1993). В результате исследований, проведенных в нашей стране, установлено, что при спорадической заболеваемости ротавирусный гастроэнтерит составляет до 50 t у детей и 12 X у взрослых (Дроздов С.Г. 1909; Вукринская А.Г. 1989). Ротавирусная инфекция является гысококонтагиозным заболеванием с различными путями и мнс&есгвенными факторами распространения.

В этой связи становится очевидной все Солее возрастающая роль вирусологических исследований в расшифровке ротавирускых гастроэнтеритов и вопросы разработки и совершенствования методов лабороторной диагностики. аЭДективные апробированные средства н методы диагностики необходимы для контроля над эпидемиологической ситуацией при вспшках и спорадических случаях этого ¡заболевания.

В Haiaeft стране перзые разработки ротавирусных диагностические препаратов появились в 1968 году. Это били иммунофер-ментные тест-системы и эритроцитарные диагностику«», направленные на имвлсние антигена ротавирусов группы А. в фекалиях

Сольных и выявление специфических антител в сыворотке крови больных н реконвалесцентов.

Цель работы состояла в сравнительном изучении и оценке эффективности впервые разрабатываемых отечественных препаратов для диагностики ротавирусной инфекции и их стандартизации.

Задачами исследования являлось:

1. Лабораторное изучение и аттестация иымуноферментных и зритро-цитарных тест-систем, а также твердофазной реакции коаглютинации (ТРКОА) для диагностики ротавирусной инфекции на соответствие их качества требованиям НТД.

2. Сравнительная оценка диагностической эффективности исследуемых тест-систем в строго контролируемых шифрованных опытах в натурных условиях в рамках Государственных испытаний.

3. Разработка и аттестация отраслевых стандартных образцов (ОСО) подлинности и активности антигена ротавирусов группы А и соответствующей ротавирусной сыворотки дм контроля и стандарти-вации ротавирускых диагностических препаратов.

4. Составление унифицированной математической модели для оценки диагностической эффективности препаратов и испольаованио ее при совдании компьютерной программы для ускоренного обсчета большого массива данных, получаемых при натурных испытаниях.

Научная новизна работы. В результате сравнительного изучения разработанных в навей стране препаратов для диагностики ротавирусной инфекции (ишунофе-рментш/х, эритровдтариых и для ТРКОА). в условиях Государственных испытаний впервые дан^комплексная оценка их эффективности.

Впервые разработаны, аттестованы я допуоены к применению в практику ОСО активности ротавярусного антигена группы А и ротавирусной сыворотки к нему, необходимые для стандартигации и контроля как вновь разрабатываемых, так и выпускаемых на производственных предприятиях коммерческих препаратов для диагностики ротавирусной инфекции.

Предложен унифицированный подход к оценке эффективности диагностических тест-систем на основе математического алгоритма, легшего в основу составления компьотерной программы "ДИАТЕСТ" для обсчета показателей эффективности диагностических препаратоп.

Практическая значимость. Робота имеет практическую направленность и нацелена на изучение эффективности новых препаратов и усовершенствование методов их контроля и стандар^чзации. Так, лабораторная апробация впервые разработанных отечественных иыму-ноферментных тест-систем, тест-системы для ТРКОА и эритроцитар-шх диагностикушв а сопоставлении о референс-методом (электронной микроскопией) показала рьюокую информативность, специфичность и простоту использования этих препаратов для диагностики ротавкрусной инфекции.

Приказом ИЗ СССР вновь разработанные препараты: Тест-сис-теыа иммуноферментная монокдоналыгая для выявления антегена ротавирусов группы А - "РОТА-АНАЛИЗ"; Тест-система иммунофериент-ная для выявления антигенов ротавирусов группы А -"РОТА-АНТИГЕН"; Тест-система для выявления антигенов ротавирусов группы А в реакции коагглютинации - ТРКОА; Иммунодиагностику« ротавирусный зритроцитарный сухой для РИГА и РГНГА - "ИДОТОДИАГНССТИКУЫ"; Диагностику« зритроцитарный рставкрусный ищу«оглобулиновый сухой для РИГА и РТНГА - "РОТА-ТЕСТ'*; - были внедрены в систему практического здравоохранения.

Нами были разработаны отраслевые стандартные образцы рота-вирусного антигена группа А (ОСО 42-28-195-92) и ротавирусной сыворотки (ОСО 42-23-196-32) для повышения качества ротавнрусных диагностических тест-систем при их создании и производственном коммерческом выпуске. Составлена и утверждена нормативно-техническая документация (Свидетельства и Инструкции по применению). . ОСО виесечы в Реестр отраслевых стандартных образцов, допущенных К При»!?!!; К-СИ^ТЙМ." МШИД'Ка № 1! На ПрЭДПГЛМТИЯХ ДРУГИХ В8-

д омег в, выпускавших медицинские иммунобиологические препарат.

Проведена стандартизация методов оценки диагностической эффективности препаратов, при этом бьи предложен математический алгоритм, который лег в основу компьютерной программ "ДИАТЕСГ'.раз-работанной в ГИСК им. Л.А.Тарасовича для обсчета показателей, характеризующие эффективность различных диагностических препаратов.

На защиту выносятся следующие основные положения: .

1. Результаты лабораторных и полевых (натурных) исследований, проведенных в рамках Государственных испыталий. полагали.что впервые разработанные для диагностики ротавирусной инфекции отечественные тест-системы (иымуноферменткыо. эритроцитарнь» и ТРКОА) обладают различной диагностической эффективность»:.

2. Диагностическая эффективность юыуяофермектных твст-скс-тем "РОТА-АНАЛИЗ", "РОТА-АНТИГЕН", а также ТРКОА достоверно выве эффективности эритроцитарных препаратов.

3. Разработанные и аттестованные ООО подлинности и активности антигена ротавирусов группы А к ротавирусной сыворотки способствуют стандартизации тост-систем м позволяет влиять на качество их при разработке и последующем коммерческой выпуске.

4. Предложенный наш математический алгоритм оценки показателей диагностической эффективности исследуемы! тест-систем подвалил унифицировать их обсчет к лег • основу разработанной компьютерной программы "ДИАТЕСТ".

Апробация работы состоялась на васедании конференции вирусологического отдела ГИСК им Л.А.Тарасевича 07.07.93 г.. а также на заседании Ученого Совета Государственного Научно исследовательского института им. Л. А. Тарасевича 13.07.1993 года.

Материалы диссертационной работы Шли представлены на конференции молодых ученых в ГИСК им.Л.А. Тарасевича (Москва, 1991 г.); Всесоюзной конференции " Энтеровнрусы. С<5щэ теоретические и медицинские аспекты." (Киев, 1991 г.); Конференции молодых уче-

- б -

тле "Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционных болезней", посвященной 30-та легию ЦНИИ эпидемиологии (Астрахань,1992 г.);

Публикации ревультатов исследований. Материалы проведенных исследований отражены в 12 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация нал ese на на 160 страница! малшописиого текста я состоит из введения, обзора литературы (3 главы), раалела собственных исследований (4 главы), обсуждения регультагов и выводов. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель содержит 54 отечественных я 187 варубежных источников.

СОВСТВМОЯ НССЛЕД08ШИ

Млтериалы и методы. За период с 1989 по 1992 гг. обследовано 10Г0 лиц больных ротавнрусншя гастроэнтеритами, гастроэнтеритами веротавирусной зтиологии и моровых лиц. Материалом для исследования служили 10 I фокальные экстракты и сыворотки крови. Биоматериалы поступали ив инфекционных Детских больниц НН 5,?3 города Москвы и Московской области, СЭС JI0Ó, детского

оздоровительного санатория и детского сада N Л7 г.Москвы.

*

ИСПЫТУЕМЫЕ ТКСТ-СИСГЕШ: Иыыуноферирнгкые: "РОТА-АНАЛИЗ", разработанная иа основе моклоналъных ротавирусных антител (ЦМИиЛ г.Москва); "РОТА-АНТИГЕН", разработанная ив основе полнелокальных антител с двум различньам субстрат-индикаторными р&створаыа (вначале 5 АСК, затеи СФД) (НИЮМ им. Пасгера); препарат дм ТРКОА - ИПЮ АМН РФ г.Москва и эритроцитарнью диагностику»«:"РОТА-ТЕСТ" (сухая и жидкая Форш). (НПО Р00ТЭ1ЩК0ШЛЕКС г. Ростов-на-Дону) н •ШМУНСаИАПЮСТИКУМ", (НЮШИ г.йсатеринбург).

МЕТОДЫ - прямой электронной и иммунно-электронной микроскопии (ПЭМ и Ж») использовали в качестве референтных при оценке диагностической эффективности исследуемых ротавирусных тест-систем. Препараты изучали в электронном микроскопе JQM00B при усксрлкзем »апрядении 60 кат. Электронномикроскопические иссле-

- в -

доь&лия проводили на Баге КЛВЭ РАМН совместно со о.н.с. В.И.Ха-устовш.

Метод электрофореза (ЭФ) ротавирусной РНК в ПААГе испольво-вали для дополнительной характеристики анткгеисодержадего биоматериала, а также как дополнительный метод сравнения при определении диагностической эффективности исследуемых тест-систем. ЭФ проводили в 10 г ПААГе, в буферной системе laemll. Экстракция вирусной РНК - фенол-хлороформная. Гель окрашивали нитратом сервера.

Для разработки ООО и их аттестации использовали: ротавируо телят - штамм РМ, полученный ив ВНИИ экспериментальной Еетерина-рии ЧСХ РФ (для ОСО антигена) и сыворотку кроликов, иммунизированных ротавирусом обезьян (штамм SA И) трехкратно о интервалом 2-3 недели (для ОСО сыворотки).

При статистической обработка результатов применяли методы определения относительных величин, среднего квадратичного отклонения (О, ошибки средней (»), критерия JT*, коэффициента вариации 7. Достоверность результатов определяли путем вычисления критерия Стывденга, использовали метод альтернативной корреляции с применением таблиц 4-х полей (B.C.Бессмертный. 1967; Н.БеАли, 1964, Д. В.Голубев, 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для внедрения тест-систем в практику здравоохранения помимо лабораторного контроля и оценки их качества была проведены Государственные испытания их диагностической эффективности в строго контролируемых, шифрованных опытах оо программам, согласовавши с эпидотделом ГИСК и утвержденный Комитетом ШЕЛ. В работе использовали серии тест-систем, прошедшие лабораторный контроль к соответствующие требованиям НТД.

Для оценки диагностической эффективности препаратов были сформированы опытные и два вида контрольных групп. В состав опытных групп были включены бальные ротавирусным гастроэнтери-

том, клинический диагноз которых Сыа подтвержден обнаружением ротавирусов в фекалиях наиболее чувств и темным и общепринятым в качестве референтного метода ПЭЫ (30О чел.). В одну из контрольных групп были включены здоровые дети (225 чел.), в другую -больные гастроэнтеритом нерогавирусной этиологии, у которых бактериологически были выделены возбудители килечных инфекций и не были обнаружены.ротавирусы референтным методом - ГШ. (ЭСЮ чел).

За период.наших исследований методами ИФА, ТРКОА и РИГА параллельно с ПТУ было исследовано 8Г5.образцов фекальных экстрактов.. (Таблица t).

; Телица 1.

. ПиЯВДЯЁ^ОСТЬ АНТИГЕНА РСГАЕКРУСОВ В ГГУШ1АХ ОБСЛЕДУЕМЫХ . С ПОМОИЫО ШИТУЕШОС- ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ

. ИММУНФШ'ШШЬЕ тркоа ' ; . ЭРИТРОЦИТАРНЬЕ

Группы обследуемых лиц рота- mwt- РОТА-^ЛТКГБК.,. субстрат ; 6-аск от иштю ДИЛГНОС ТИКУМ РОТА ТЕСТ сухой РОТА ТЕСТ жидкий

Вольные ротн вирусным ГЭ ООО чел 06.15 ' .12.43- 73.45 71.79 H.Z ¿5.1 60.14 ¿4. i 52.66 {6.65 53.10 14.6 34.62 . *5.39

Рольные ГЭ иной этиологии '.■00 чел. 0 . 0 0 Г.65 11,3. 1.61 И.б 1.39 И.1 4.84 i2.7

Г"5 чел :\и ■■■ ti-"/ 0 о : 0. ?.б5 ♦".о? 1.91 il.9 8.64 ♦3.09

Как козне, кс гчслииы, табельсий прокат .'У5.15 и 73.45 - 71.79) .Биягля^ь'Ьсти çoratKpyçcB в групп«», больтог-гтечек при кспользо-

riv.wt шмуноч- pmî-htkux ?';ст-си;теи hi '>.(гя- моно- и 'поликло-нзлных 1Г'Г::т'-.: ТОТЛ-ЛКЛЛЙЗ" и 'ТгГЛ-ЛПТШ'ЕН", соответственно.

что достоверно выше (р<0.05) выявляемое™ ротавирусного антигена эритроцитарными диагностиками. Наименьшая чувствительность и специфичность была у жидкой формы эригроцитарного диагностикума "РОТА-ТЕСТ".

При статистическом анализе прослеживается достоверная разница (р<0.05) между процентом выявления позитивных проб в опытной и двух контрольных группах при использовании всех тест-систем.

Согласно литературным данным (В.С.Бессмертный, 1967; Н.Еей-ли 1970; К.И.Журавлева, 1081), подходы к оценке диагностической эффективности у отдельных авторов различны и не всегда сопоста-. вимы. В ходе работы нами был выбран математический алгоритм, позволяющий подойти к унифицированной оценке эффективности испытуемых препаратов.

Диагностическая эффективность оценивалась и определялась нами методом альтернативной корреляции с использованием таблиц 4-х полей, которые позволяют определить не только показатели чувствительности и специфичности, ко и вероятность установления положительного и отрицательного диагнозов, а также суммарный показатель совпадения результатов диагностики с референтным методом. Комплексный подход исключает возможность получения односторонних сведений о данном препарате, так как несколько »фитериев даю? более объективную оценку диагностической эффективности чем отдельно рассматриваемые показатели. Применение таблиц 4-х полей решает вопрос о сопряженности референтного и испытуемого методов при определении коэффициента соответствия^. Однако^указывает только наличие сопряженности между двумя препаратами, но не на ее величину. Удобной мерой определения величины сопряженности яв- л дяегся величина средний квадрат сопряженности равная рАо — ' где Л*- коэффициент соответствия & - общее число всех измерений

- в -

урА^мохет принимать »начения от 0 до 1, где условно выделяются Б степеней взаимосвязи: 0.00 - 0.04 - слабая: 0.05 - 0.16 - легкая; 0.17 - 0.33 - умеренная 0.37 - 0.64 - существенная; 0.65 -1.00 - сильная. Наибольшее соответствие между испытуемым и референтным препаратами наблюдается при "супестгенной" и "сильной" степени взаимосвязи.

Таким обравом, на основании наяих исследований и анализа литературных данных был составлен математической алгоритм оцетда диагностической эффективности препаратов н была оптимизирована система обсчета показателей ее характеризующих.

Используя в качестве референо метода прямую электронную микроскопию, были раечитанн показатели диагностической эффективности испытуемых тест-систем (таблица 2).

Анализ данных, представленных в таблице 2 показывает, что наибольшей чувствительностью (03.1В X), специфичностью (94.10 X). а также наиболее высоким суммарным показателем совпадения результатов с референтным' методом (94.85 I) обладает иммунофер-ментная тест-система, разработанная на основе моноклональных антител "РОТА-АНАЛИЗ", о чем свидетельствует также средний квадрат сопряженности - 0.787 и "сильная" степень связи.

Показано, что различия в показателях диагностической эффективности иммуноферментвой тест-системы, разработанной «а основе поликлональных антител "РОГА-АНТИГЕН" с двумя субстрат-индикаторными растворами (5 АСК и (ЯД) статистически не достоверны (р>0.05), таким образом, замена б АСК на ОХ>Д не повлияла на качество диагностической эффективности тест-системы 'ТОТА-АНТИГЕН".

Диагностическая эффективность кммуноферментных тест-систем и ТРКОА достоверно визе (р<0.05) соответствующих показателей эритроцитарных диагностикумов.

Таблица 2

ПОКАЗАТЕЛИ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РОТАВИРУСНСМ ИНФЕКЦИИ СРАВНИТЕЛЬНО С РЕЗУЛЬТАТА),« ПРЯМОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ.

Тест-системы ЧУВСТ-БИТЕЛЬ НОСТЬ X СПш ЛИЧНОСТЬ Z ПОК А УСТА): ПОПОЖ. Z ЗАТКЛИ ОВЛЕНИЯ Ро№г X СОВПАДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИАГ-Н0СТИЮ1 z СРЕДНИЙ КВАДРАТ СОПРЯЖЕН* НОСТИ phi' СТЕПЕНЬ СВЯГ:.И С ПЭЫ

< ш РОТА-АНАЛИЗ 96.15 94.19 82.29 97.99 94.85 0.787 ешь нал

РОТА- AÍITUT'Eü Í5-ACK) 73.45 95.55 yo.íri 6В.61 87.36 0.527 существенная

РОТА- АНТИГЕН (ОВД) 71.79 92.90 С3.53 86.75 .65.64 0.466 существенная

ТРКОА 68.14 96.55 91.66 34.18 еа.со 0.409 существенная

ь=С т ш- НОДИА-ГНОСТИ КУМ 52. &Ö 83.07 62.12 77.04 73.39 0.170 умеренная

РОТА- ТЕСТ сухой 53.10 97.10 90. Ю V8.00 60.60 0.349 Г/меренная

РОТА- ТЕСТ жидкий 34.62 91.60 67.59 73.58 72.53 0.108 легкая

3Í в ПААГе 79.31 92.39 76.67 93.41 69.26 0.502 существенная

Показатели диагностической эффективности двух эритроцитар-ных диагностикумов "РОТА-ТЕСТ" И "ИММУНОДИАГНОСТИКУ»*'' (лиофили-вированные формы) статистически ке различимы (р>0.05). Отмечена весьма низкая чувствительность (04.62 X) жидкой формы "РОТА-ТЕСТа" и статистически достоверная (р<0.05) разница между отдельными показателями эффективности "жидкой" и "сухой" формами этого препарата, что можно связать с низкий качеством "жидкой" формы "РОТА-ТЕСТа" к.повидимому.его технологической недоработкой.

Учитывая! что метод ГШ позволяет обнаруживать нирионы различных серогрупп ротавирусов, а все испытуемые тест-системы направлены на индикацию антигена ротавирусов группы А. нами был

проведен второй дополнительный вариант анализа полученных результатов, где в качестве референс-препарата использовалась наиболее чувствительная и эффективная иммуноферментная тест-система "РОТА-АНАЛИЗ", разработанная на основе моноклональных антител (таблица 3).

Таблица 3

ПОКАЗАТЕЛИ ЛИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПЫТУЕМЫХ ПРЕПАРАТОВ ОТНОСИТЕЛЬНО ИШУНОХ'ЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМУ "РОТА-АНАЛИЗ"

Тест-системы ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ X СПЕЦИФИЧНОСТЬ X ПОКАЗАТЕЛИ УСТАНОВЛЕНИЯ ДИАГНОЗА ПОЛОЛ. ОТРИЦ. X X СОВПАДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИАГНОСТИКИ X СРЕДНИЙ КВАДРАТ СОПРЯЖЕННОСТИ рМ' СТЕПЕНЬ СВЯЗИ С ИФА

Рота-Антиген 91.04 ее. 14 72.62 95.97 87.55 5.530 существенная

Иммуно- диагноо- тикум 59.70 94.34 60,61 83.63 77.25 0.193 умеренная

Рота- тест сухой 59.00 98.60 96.00 79.60 83.60 0.240 умеренная

Рота- тест жидкий 35.82 90.36 60.00 77.72 74.68 0.099 легкая

Данные, представленные в таблице 3, выявили те же закономерности, которые были прослежены при определении показателей диагностической эффективности испытуемых препаратов относительно ТОМ. Таким образом было показано что, зритроцитарные препараты обладают более низкими показателями .диагностической эффективности по сравнению с ПЭМ и ИФА и, вследсгвии этого, не могут быть применены' как самостоятельные лабораторные тесты для индивидуальной диагностики ротавирусной инфекции у больных.

Апробированная в ходе наших исследований высокочувствительная иммуноферментнач тест-систеыа "РОТА-АНАЛИЗ" может заменить дорогостоящий и трудоемкий метод ПЭМ в качестве референтного при исследовании новых препаратов в рамках Государственных испытаний.

- 12 -

На основании результатов наших исследований высоко эффективные кшуноферменткые тест-системы Сьш рекомендованы в практику здраьоохраяения для диагностики ротавируеных гзстроэнтери- .. тов у больных, а лиофилигированные формы эритроцитарных диатнос-тикумов - для идентификации ротавирусной инфекции при вспышках в очагах.

В ряде случаев для подтверждения диагноза ротагирусного гастроэнтерита, а так же для получения дополнительной информации о циркулирующих штаммах в том или ином очаге наряду с выделением антигена из фекальных экстрактов, нами проводился Э1> ротавирусной РЖ а ПААГе. Мы исследовали 121 образец фекальных экстрактов иэ 3-х вышеописанных групп больных и вдоровых детей. ' '.

Анализ полученных нами 29 электрофореграм показал значи- . тельный полиморфизм в миграции сегментов РЖ ротавирусов. Все изоляты имели характерную для ротавирусов группы А картину распределения РНК сегментов и были классифицированы с использованием модифицированной системы Lourenco И.Н. на б вариантов. Ив них S вариантов (26 образцов) обладали "длинным" профилем миграции (89.66 х) и 1 вариант (3 образца) "коротким" (10.34 X). Ротави-рус с "длинным" электрофоретипом 1Ь ПЬ mj IVc обнаруживался наиболее часто (Б5.17 X) и выделялся, в течение всего эпидсе8она 1992 года в клиниках Москвы. Таким образом, с помощью метода ЭФ можно проследить га циркуляцией определенных штаммов ротавирусов в эпидсезон, что представляет дополнительную информацию эпидемиологического плана. Эффективность метода Эф ротавирусной РШ в ПААГе относительно 1Ш представлена в таблице 2. Довольно высокие показатели чувствительности (79.31 X), специфичности (92.39 2) и "существенная" степень связи с методом ГШ' свидетельствует о том, что Э& может быть применен как дополнительный, подтверждез-ций тест при диагностике ротавирусной инфекции.

В ходе наших исследований было отмечено, что выявляемость антигена апробируемыми тест-системами находится в прямой взаимосвязи с концентрацией вирусных частиц в пробах по данным ПЭМ. Таблица 4.

Таблица 4.

ВЫЯВЛЯЕМОСТЬ АНТИГЕНА РОТАВИРУСОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ ПО ДАННЫМ эм

Число Число ЧИСЛО ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

вирусных частиц исслед. образцов ИФА абс. 2 ТРКОА абс. 7. РНГА абс. 7.

10"" 29 25 06.2*6.4 23 79.3+7.5 20 68.9*8.6

10' 44 29 65.9*7.1 £6 59.11-7.4 20 45.51-7.5

10» 69 33 47.8|6.1 26 37.715.8 £0 28.9*5.5

Анализ данных, представленных в таблице 4 показывает, что максимальная Еыявляемость антигена всеми тест-системами набдюда-

УЮ

егся при концентрации вируса 10 в.ч./мл, с уменьшением концентрации вирусных частиц по данным ПЭМ выявляемость антигена тест-системами достоверно снижается (р<0.001). Показана достоверная разница (р<0.05) между процентом выявления антигена ротави-русов группы А в иммунофэрментной реакции и в РНГА при концентрации 10*и ю'в.ч./мл. Это еще раз свидетельствует о более высокой диагностической эффективности иммуноферментных препаратов.

- Разработанные эритроцитарные диагностикумы направлены не только на индикацию антигена рогавирусов группы А, но также способны выявлять антитела у больных и реконвалесцентов в РТНГА, что может служить тестом, подтверждающим рогавирусную инфекшю по наличию сероконверсии. а так же использоваться для изучения иммуноструктуры населения. С этой целью нами было исследовано 105 сывороток, из них 29 парных от детей больных ротавирусным

гастроэнтеритом, а также 91 сыворотка от контрольной группы -детей, больных другими кишечными инфекциями, диагноз которых был подтвержден бактериологически, а также отсутствием специфических антител к ротавирусам референтным методом - ИЗN.

Пользуясь методом альтернативной корреляции были определены показатели диагностической эффективности тест-систем "ИМйУ-НОДИАГНОСТИКУМА" и "РОТА-ТЕСТа" "сухой" и "жидкой" формы по отношению к референтному методу ИЭМ (таблица 5).

.' Таблица 5

ПОКАЗАТЕЛИ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТШИХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕ1МЯ РОТАВИРУСНЫХ АНТИТЕЛ В РТН'А . . СРАВНИТЕЛЬНО С МЕТОДОМ И5М.

Эритро- цитар- ные диагнос тикумы ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ X ' СПЕЦИФИЧНОСТЬ X ',.'. - ПОКАЗАТЕЛИ УСТЛНОВШМЯ ДИАГНООЛ ПОЛСЖ. ОТРИЦ. х г СОВПАДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИЛГ-- ностики ■ X СРЕДНИЙ КВАДРАТ С0ПГЯШ1 НОСТИ рМ СТЕПЕНЬ СВЯЗИ ,

"Иммуно диагнос тикум" 81.80 80.00 78.95 63.16 73. ба 0.173 умеренная .

"Рота- тест" сухой бв.60 94.40 73.90 ' 75.00 74.10 0.170 умеренная

"Рота- тест" жидкий 59.40 46. £0 73.10 31.60 55.60 0.116 легкая

Из данных таблицы видно, что показатели диагностической

эффективности лиофилизированных форм эритроцитарных диагности-кумов при выявлении антител в РТНГА достоверно не различимы.Однако, прослеживается достоверная разница между этими показателями у лиофилизированных и жидкой формы препаратов. Так показатели специфичности "жидкой" и "сухой" форм у "РОТА-ТЕСТа" варьируют от 46.21 до 94.Л7, соответстЕенно. Средний квадрат сопря-

хеииости указывают ка "умеренную" степень связи с ИЭЫ - для лио-филиаироваиных форм я "легкую" - для жидкой форм! препарата "РОТА-ТЕСТ". Исследованные эритроцитаряые диагностккуш ввиду относительно нивких показателей диагностической эффективности нэ целесообразно применять в РТНГА как самостоятельные тесты для диагностики ротавирусной инфекции. Они рекомендованы как дополнительные для выявления анамнестических антител при изучении икму-ноструктуры населения, а тага» для научных целей.

В ходе исследований был апробирован предложенный нами унифицированный алгоритм математической оценки диагностической эффективности препаратов. Однако обработка огромного массива данных, подученных при испытании ряда диагностических тест-систем, представляет значительную сложность и является трудоемким процессом, занимающим длительное время. В связи с этим в ГИСК им.Л.А.Тарасевича в лаборатории биофизических методов исследования (руководитель д.б.н. В.Г.Петухов) на основе полученных нами экспериментальных данных я предложенного алгоритма была разработана компьютерная программа "ДИАТЕСТ", которая позволяет быстро обсчитать показатели диагностической эффективности: чувствительность, специфичность, вероятность установления положительного и

отрицательного диагнозов, суммарный показатель совпадения ре*

аультато» диагностики испытуемого препарата о референтным методом. коэффициентыаС исохранить введенные данные по геем методам в памяти для возможно последующего дополнения как новых Дания. так к новых методов; сравнить отдельные показатели диагностической эффективности испытуемых тест-систем с выбранным референтным методом и (км) между собой;определить значение"^ off" при котором все составлялпие показатели диагностической эффективности будут оптимальны, сравнить с авторскими данными и, в случае целесообразности, предложить соответствующие коррективы.

Таким образом, разработанный и апробированный на материалах наших исследований математический алгоритм оценки диагностической эфективности и составленная на его основе компьютерная программа "ДИАТЕСТ" позволяют унифицированной быстро и эффективно проводить статистический обсчет результатов и дать оценку эффективности препаратов для диагностики не только ротавирусных гастроэнтеритов, но и любых других инфекций.

Для стандартизации, улучшения качества, повышения диагностической эффективности как вновь разрабатываемых, так и коммерческих препаратов для диагностики ротазирусной инфекции необходимы адекватные методы юс контроля. В связи с этим, сдним из разделов нашей работы явилась разработка и аттестация е соответствии с требованиями ВОВ и ГОСТ в.315-91 первых национальных, отраслевых стандартных образцов ротавирусного антигена группы А и соответствующей ротазирусной сыворотки для стандартизации ротавирусных диагностических препаратов в различных серологических реакциях.

ООО ротавирусной сыворотки представляет собой сыворотку кроликов, иммунизированных рот&ьирусом обезьян (штамм БА 11) трехкратно, с интервалом 2-3 недели. инакткРирОЕанную прогреванием при тепературе /Ъ?ч\/'С в течение часа, приготовленную согласно технологии производственного процесса "Иммунодиагкос-тикума эритроцитарного ротавирусного сухого для РИГА и РТНГА" (ЭПР 348-92).

Для приготовления 0С0 антигена ротавкрусов группы А стоим РМ ротавируса телят концентрирован с помощью у ль траш атрибутирования и инактивировали формалином. Антиген был изготовлен согласно технологии производственного процесса изготовления антигенов ротавирусов группа А для иммуноферментной тест-системы "РОТА-АНТИГЕН" (ЭПР 202-89).

Отраслевые стандартные образцы представляют собой одну из экспериментально-производственных серий.

ФИ8ИК0-химические свойства ООО изучали в соответствии с методами, изложенными в сборнике инструкций, утвержденном приказом Минздрава СССР N 31 от 13.01.83 г.. по следующим показателям: внешнему виду, точности розлива (массе вещества в ампулах). растворимости, остаточной влажности.

Показатель остаточной влажности 0С0 ротавирусной сыворотки составил 2.52 X. ООО антигена - 2.40 Г, что гарантирует стабильность свойств при длительном хранении препарата. Высокая степень точности розлива (коэффициент вариации 4.07 и 0.62 XX для ОСО сыворотки и антигена, соответственно) свидетельствует о стандартности веса сухого остатка и стандартности концентрации препаратов.

Подлинность ОСО ротавирусной сыворотки была определена в РТНГЛ с помощью "ИШУНОДИАГНОСТИКУМА" при использовании в качестве антигена эталонного штамма SA И ротавируса группы А. Подлинность ОСО антигена ротавирусов группы А была подтверждена положительным результатом РИГА с аттестованным ранее ОСО ротавирусной сыворотки. При использовании в качестве контроля гете-рологнчных вирусов (полиомиелита. Коксаки. адено) и сывороток к ним для аттестации ОСО ротавирусных сыворотки и антигена были получены отрицательные результаты.

Активность ОСО антигена ротавирусов группы А была определена для всех испытуемых иммуноферыентяых и эритроцитарных тест-систем. ОСО ротавирусной сыворотки - для РТНГА с помощью "ИШУНСЛИАГНОСТИКУЫА" (таблица 6).

Таблица б

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ШЕЩШЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОСО АНТИГЕНА РОТАВИРУСОВ ГРУ1ШЫ А И ОСО РОТАВИРУСНОЙ СЫВОРОТКИ

Показатели активности ОСО ОСО АНТИГЕНА РОТАШ'УСОВ ГРУППЫ А ОСО РОТАВИРУСНОЙ СЫВОРОТКИ

ИШУНОКРМЕНТНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Г'РИТРОЦИТАГЧШЕ ДИАТНОСТИКУШ ИКМУНО- ДИАГНОС- ТИКУЫ

РОТЛ-АНАЛЮ РОТА-АНТИГЕН РОТА-ТЕСТ ИШУНО- тгност.

СРЕДНЕ ГКО-МЕТРИЧЕСКИЙ ТИТР 1:39 1:50 | 1:13 > 1:21 1:1200

СРЕДНИЙ ТИТР в 10^ (М) -5.400 -5.650 -3.740 -4.420 -10.25

ОШИБКА СРЕДНЕЙ 1«) 0.003 0.002 о.ооа 0.005 0.0001

СРЕДНЕЕ КВАДРАТИЧНОЕ ОШСЙЕНИЬ (<г) 0.0098 0". 0073 0.0260 0.0160 0.0003

КОЭФФИЦИЕНТ ВАРИАЦИИ ПО АКТИВНОСТИ (у) 9.74 в.зг 11.7 11.7 ■ 4.69

Специфическая активность ОСО Еырзжена в средне геометрических титрах и в Ьоел в соответсгвудешх тес г-системах. Ее иду отсутствия международных отраслевих стандартных образцов в еос еы-разить активность аттестованных ОСО в НЕ не представлялось возможным. Как видно их таблицы, показатели и», <Г, V , расчитшшые по данным повторных -титровании,' свидетельствуют о высокой воспроизводимости результатов.

Стабильность ОСО била изучена в' тесте ускоренной деградации

» «

при различных режимах повышенной температуры (65 и 80 С). Стабильность определяется периодом, в течение которого сохраняется уровень его исходной активности яри хранении при температуре 4*С (Jerne Н.К., 1956, СапрЬеП Р..!., 1974).

На основании данных снижения титров ООО антигена и ОСО ротавирусной сыворотки по сравнений с исходными показателями били вычислены константы термостабильносги и установлен срок сохранения 95 X исходной активности отраслевых стандартных образцов, которые составили для ОСО сыворотки - 10 лет,ОСО антигена 5 лет.

А А А

Таким образок, результаты проведенных лабораторных и полевых (натурных) исследований позволили аттестовать и внедрить в систему практического здравоохранения впервые разработанные в нашей стране препараты для диагностики ротавирусной инфекции. Предложенный в ходе наших исследований математический алгоритм унифицирует и способствует стандартизации оценки показателей диагностической эффективности вновь разрабатываемых препаратов. Приготовленные и аттестованные нами ОСО антигена ротавирусов группы А и ОСО ротавирусной сыворотки применяются при создании и коммерческом выпуске препаратов для диагностики ротавирусных гастроэнтеритов, что позволяет проводить сравнительную оценку препаратов, выпускаемых различными предприятиями и спссобство-вует повышении их качества и стандартности в соответствии с международными требованиями; Это в свою очередь будет влиять на эффективность диагностики и правильного проведения комплекса лечебно-профилактических и противоэпидемических мероприятий в борьбе с ротавирусной инфекцией.

ВЫВОДЫ

1). В лабораторных тестах и натурных условиях в рамках Государственных испытаний сравнительно изучена и оценена эффективность впервые разработанных в нашей стране препаратов для диагностики ротавирусной инфекции.

2). Установлено, что показатели диагностической эффективности (чувствительность, специфичность, вероятность установления положительного и отрицательного диагнозов, суммарный показатель совпадения результатов диагностики с референтным методом и коэффициент сопряженности "phi*") иммуноферментных препаратов и ТРКОА существенно выше этих показателей у зритроиитарных диагностикумов.

3). Иммуноферменшая тест-система, изготовленная на основе мо-ноклональных антител - "РОТА-АНАЛИЗ", по показателям диагностической эффективности превосходит препарат того же класса, изготовленный на основе полнююнальшн антител "РОТА-АНТИГЕН" и как наиболее чувствительная, может служить референтным методом при испытании эффективности вновь разрабатываемых препаратов для диагностики ротавирусной инфекции.

4). Показана способность зритроцитарных ротавярусных диагностикумов выявлять специфические антитела в РТНГА и возможность применения их для серологического надзора, а также в научных целях.

5). На основании результатов нашх исследований иммунсфермент-ные тест-системы, ТРКОА и эритроцитарные диагностикумы рекомендованы в практику здравоохранения.

6). Впервые для контроля и стандартизации ротавирусных диагностических препаратов разработаны и внедрены в практику отраслевые стандартные образцы активности антигена ротавнрусов группы А и ротавирусной сыворотки. Утверждены "Свидетельства" и "Инструкции по применению ОСО". (0С0 42-28-195-92 и 0С0 42-28-196-92).

7). Предложен и апробирован математический алгоритм для стандартизации оценки эффективности диагностических препаратов, который лег в основу разработанной в ГИСК компьютерной программы "ДИАТЕСТ" для ускоренного обсчета большого массива данных, получаемых при натурных испытаниях различных диагностических препаратов.

- 21 -

Список опубликованных по теме диссертации работ:

1. Изучение диагностической эффективности "Диагностикума рота-вирусного иммуноглобулинового сухого для РИГА и РТ11ГА" /совместно с Евреиновой Е.Э., Калашниковой Т.В., Хаустовым В.И.. Фекли-совой Д.В., Карпович Л.Г.// Энтеровируеы. Общетеоретические и медицинские аспекты. Тезисы докл. Всесоюзной конференции.- Киев, 1991.-С.57-68.

2. Оценка эффективности впервые разработанных в СССР тест-систем для диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Карпович Л.Г., Калашниковой Т.В., Евреиновой Е.Э., Хаустовым В.И., Эару-бинским В.Я., Никиткж Н.Ы., Феклисовой Л. В., Салминым Л.В.// У1 Всероссийский съезд микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. Тезисы докл. - Н.Новгород, 1991.- С.67-88.

3. Оценка диагностической эффективности новых препаратов для диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Карпович Л.Г., Евреиновой Е.Э., Калашниковой Т.В., ХаустоЕым В.И., Никиткж Н.М., Феклисовой Л.В., Тарасовым И.Г.// Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии. Тезисы докл. П Всероссийского симпозиума.- Самарканд, 1991.- С.86.

4. Сравнительная оценка эффективности препараов для диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Карпович Л.Г., Калашшковой Т.В., Евреиновой Е.Э., Хаустовым В.И., Зарубинским В.Я., Никитюк Н.Ы;//МР1. 1991, N.4-6, публ.1417.

5. Сравнительное изучение эффективности оригинальных отечественных тест-систем для диагностики ротавирусной инфекцин. /совместно с Евреиновой Е.Э., Калашниковой Т.В., Карпович Л.Г.// Актуальные вопросы эпидемиологии иинфекционньх болезней. Сборник трудов молодых ученых. Москва, 1992,- С.51-52.

6. Оценка эффективности впервые разработанных иммуноферментных тест-систем для диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Карпович Л.Г..Евреиновой Е.Э..Калашниковой Т.В..Феклисовой Л.В. Мсскиной Е.Р.//Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Сборник научных трудов. Екатеринбург. 1992.- С.102-106.

7. Разработка и аттестация отраслевого стандартного образца ан-тиротавирусной сыворотки группы А. /совместно с Евреиновой Е.Э., Сбигневой H.H., Карпович Л.Г., Закировой С.Ф.// Эпидемиология, клиника и профилактика вирусных инфекций. Сборник научных трудов. Екатеринбург, 1992.- С.106-109.

8. Определение диагностической эффективности новых препаратов для экспресс-диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Евреиновой Е.Э., Карпович Л.Г., Калашниковой Т.В., Рыжиковой Е.В. //Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии. Тезисы конф. Махачкала, 1992. С. .146-147.

9. Совершенствование методов стандартизации и контроля препаратов для ускоренной диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Евреиновой Е.Э.,' - Сби.тневой H.H., Карпович Л.Г. //Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии. Тезисы конф. Махачкала, 1992.- С. 144-145.

10. Стандартизация препаратов для диагностики ротавирусной инфекции, /совместно с Евреиновой Е.Э..Карпович Л.Г..Горбачевым E.H. Артюховым А.И., Вербовым ВЛ1.//Актуальные проблемы инфекционной патологии. Тезисы конф. Санкт-Петербург, 1993.- Ч.З.-С.67.

11. Сравнение иммуноферментных тест-систем для диагностики ро-тавирусного гастроэнтерита при помощи новой компьютерной программы "ДИАТЕСГ"./совместно с Евреиновой Е.Э., Карпович Л.Г., Пе-туховым В.Г. //Актуальные проблемы инфекционной патологии. Тезисы конф. Санкт-Петербург. 1993.-Ч.З.-С.76.

12. Разработка математического подхода и компьютерной программы для оценки эффективности препаратов для диагностики ротавирусной и других инфекций./совместно с Карпович Л.Г..Петуховым В.Г. .Евреиновой Е.Э..Калашниковой Т.В.//Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики. Материалы докл. Всероссийской научно-практической конф., Пермь. 1993, С.54-55.