Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение полимеразной цепной реакции для молекулярной диагностики гемоглобинопатий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Применение полимеразной цепной реакции для молекулярной диагностики гемоглобинопатий"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК .ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. а.ЛЭНГЕЛЬГА1'ДТЛ

На ■правах, рукописи УЖ 616.155.16

ПОКЕДИМСКАЯ ДИАНА ДМИТРИЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛ1ШЕРЛЗНОП ЦЕННОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИЛП ЮСТ11К11 ГЕМОГЛОБ1 Н10ПАТ1ИI

Специальность — 03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ла соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа- выполнена в Международном Центре по д; агностике гемоглобинопгтш (Medical College of Georgia, Augusta, GA, USA, лаборатория профессора ТХ&Хайамапа) и в Институте молекулярной биологии им. ВАЭнгсльгардта РАН

Научный руководителе

Кандидат биологических наук, сн-с. ТЛМолчанова

Официальные оппонента:

Профессор, доктор химических наук СЛКочетков Кандидат биологических шук 1ШМалсева

Ведущая организация

Центр медикобиологичсжих и экологических проблем РАЕН

Зашита состоится 02., 1993 года в часов на заседании

специализированного совета Д 002 79.01 в Иьслггугс молекулярной биологии им. ВА-Эпгельгарлта РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. ВАЭнгсльгардта FAH

Автореферат разослан "ЪО, Of,

Ученый секретарь специализированного со кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ahmyti.ib>irx:r,ii /тботы. ГеиоплеСжнопатии — аномальные гечоглобшш (Ilns) и талаосемнчсасие синдромы — являются гетерогенной фуплой наследственных-гаю.'итпеских анемий человека, обуслсплашых нарушениями сиитеза i-емоглобина и результате различных мутаций в о2, al, 8, Gy, Ay, 5 глобнновых генах. Они широко распрост)£№1и во воеч мире, поэтому болыное практическое значение имеет поиск простях. экспрессивных и относительно недорогах метолов для молекулярной диагностики этих заболеваний. В осте этого, применение и оптимизация современного и щопхххнвиоги метола полимеразной цепной реакции (ПОР) представляется крайне актуальной научной задачей для усовершенствования и ускорения идентификации аномальных Hbs и таласоемических мутаций. При этом специфическая амплификация каяаего в отдельности ran требует своей индивидуальной сгратепш и нащввлешгаго поиска' конкретных экспериментальных условий ÍIUP. Актуальность настоящей работы заключается в rev., что она является составной частью системных исследований и разработки методологии диагностики гемоглобинопатии в рамках Международного Петра по диапюсгике гемоглобинопатии (Medical Collsge of Georgia [MCG],USA. п|яфеогор ТТЛХгйсмэн) и лзбцитории молекулярной организации хромосом (ИМИ РАН. академик АДМирзэбексв1

¡'елью настоящей работы является совершенствование нетола ПНР и его практическое применение дли молекулярной диапюстики наслелсгаегашх гемоглобмнопатин человека, вызванных различного рола мутациями в шести глобшювих генах. Для достижения этой цели били поставлены следующие задачи: L Унификация сцитегии и оптимизация экспериментальных условий П11Р. 2 Выяснение возможностей и преимущества использования ПЦР в молекулярной диагностике аномальных Hbs, идентификация которых затруднена или недоступна традиционными методами белковой химии. 3. Использование ПЦР в качестве эффе:стизного и нерадиоактивного метода" идентификации лелеционных мутаций в а и (3 глобииовых генах.

Научная новизна. В диссертационной работе (¡заработана стратегия и оптимизированы, аксперимагтальиые условия ПЦР для специфической амплификации фрагментов шести глобиковых генов — о2, al, /3, Gy, Ay, S. Дифференц^хжшы мутации R дуплицированиих a гегах, которые принципиально невозможно установить методами белковой химии. Впервые экспериментально подтверждай более высокая частста нуклеотидиых мутаций по сравнению с аминокислотными заменами, т.к. показано, что одна и та же аминокислотная замена в а цепи 11в!' может быть вызвана разными нуклеотилными мутациями в а2 или а! дуплшшрооаниых генах. Оптимизированы условия

f

ПЦР и выбраны праймероп для специфической амплификации гибридных генов, образующихся при лелешюшшх мутациях и о и ß глобиновых генах.

Научная и практическая значимость. Идентификацией боли: 100 точечных мутационных замен, m них 10 новых аномальных Hbs, а также более 20 случаен деленионных мутациий в а н ß глобиновых генах, продемонстрировано, что использование ПЦР глобиновых генов в сочетании с прямым сиквенированием значительно повысило эффективность диагностики гемоглобинопатии по сравнению с методами белковой химии за счет унификации и оптимизации процесса, сокращения временных и материальных затрат. С помощью ПЦР расширен спектр диагностики аномальных Hbs. идентификация которых затруднена или недосгуши классическими методами белковой химии. Решена новая научная и практическая задача в области совершенствования и интенсификации диагностики гемоглобинопатии с применением современных методов молекулярной биологии, что имеет значение для прикладной молекулярной биологии и в особенности для молекулярной медицины.

Лпробаиия работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах в MCG и ИМБ (1994-1

Нуб.шктши работы. По материалам диссертационной работы опубликовано Ь печатных работ в журналах "Hemoglobin", "Am.J.of Hemat.", "Br.J.of Hemat.". Готовится к печати монография: "A Laboratory Manual for recombinant DNA identification of human abnormal hemoglobins " Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1S94, 150 pages (T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, Yu.V.Postnikov, T.H.J.Huisman).

Объем и структура работы.. Диссертационная работа, изложена .-на 153 страниц машинописного текста, включающего 22 таблиц. 29 рисунков, список литературы из 125 наименований и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методики эксперимента, изложения результатов исследования, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ-

В ходе выполнения диссертационной работы был выработан унифицированный подход для молекулярной диагностики гемоглобинопатия. включающий три стадии: выделение Д111С, амплификация фрагментов глобиновых генов методом ПНР и сиквенирования амнлифицированных фрагментов (Рис.11

Вылсление геномном ДНК m ленкошгтп *

/Нотификация фрагмента г.то5;шозого гена метолом ПНР *

Анализ специфичности проекта ПНР или амплифинирогашюго Ф|шмсита

на агарозном геле *

Выделение продукта НИР Ф

Сикпенс Ф

Электрофорез емкпеинроганиых реакций п деиатурируюшем ПААГ Ф

Апгоралиографии и чтение сиквенса Ф

Идентификация мугаиии-Рис.1. Схема молекулярной диагностики гемоглобинопатии

Су/иилпечным 'ivimnt' в выработанной • подходе такты ■ оптимизация эксягримеита.'мщх условий ПНР для специфической амплификации фрапиеитов шести глобиноьых ютов. Специфичность 111 IP была достигнута путем оптимизации температуры отжига П1йймеров для каждого из шести глобижтах генов. п то время как остальные параметры (температура, и время денатурации и удлинения, число циклоп), а также компонент ПЦР (реакционный буфер. концентрзшш ионов магния. леюксипу(слоог|!лтриф«чато?^ праймероа) оставались иракпгкжки одинаковыми. Дополнительное впеденме ко-распюрителей (Твнна, формамила) истолковали п случае трулчогмглифицируимых. тугоплавких матриц-ЛПК с целью повышения эффективности и специфичности ПНР. Разработанная в настоящей работе стратегия ПЦР фрагментов шести глобтювых грнов заключается . в одноступенчатой (ааыметркчной! ПЦР ко|хггких ф[вгмягшв íoOO-lDOO п.ч.) с использованием геномной ДНК в качестае матрицы и на двухступенчатой ¡симме. ¡дачной и асимметричной) ПШ' длинных фрагментов (1400-2000 ¡uü. Выделение специфичных ПНР продуктов (одпонегочечних фрагментов ДНК). а\ш.чи<3 «¡»'¡¡«"лунных при оптимизированных уи-ювиях, било «зелено к. П[«СТОМ унипгргалиЫ (цюцелуре. есно'аккпей осаждение ДНК" сшвлеч ib ¡истъора анегат аммония, т: прюктая к зд'якмким «смолам с даголюоиняем кенпвщатороп Centíicon-

30 или вырезании к выделению фрагментов ПНР из ага|хвпого геля Йепд й а1., 1992; Уигед1г й а1., 1992). П|х*кд>ра сиквенса также была унифииироиана для всех глобиновых генов, за исключением разных сиквенируюших примеров к температур отжига с. амшшфютронаниой матрицей-ЛНК. -который ">ыли иолпбрапм лля каждою в отдельности Таски образом. разработандая универсальная стратегия и оптимизация условий ПИР фрагаиггоп шести глобиновых генов паигаити провести молекулярную диагностику гемогаобинопатнй и на основании более ](Ю идентифишцюванных случаев гемоглобинопатии саелать заключения, которые можно геложить следующим образом:

бежовот_струкадвс1саАнал11за

11. Целеспобразгюсть применения ПЦР для идентификации Gy, и о вариантов

В норме у взрослого человека минорные белки НвАз linfa) и HbF (¿<272) составляют 2. 5%+0.3% и соответственно окцло 1%. Особенностью 7 и 6 глобиновых вчриартов является также их низкое цхдагпюе содержание в периферической крови (1-2%), что затрудняет идеитнфикашш таких белков. Так, процентное содержание 6 глобинопых вариантов в i-стерози готах очень «ало (1-15%) и немного выше (2-3%) в гетерозиготах с носителютюч /3—таласссиии. Поэтому выделение достаточного количества этого минорного белка лля рутинного белкового анализа требует большого количества крови (190-250 мл! Эта трудность, а также звачительные усилия (затраты времени, многостадийносп>1 необходимые для выделения аномальной ¿цепи и характеристики ее триптических пептидов—.главные причины того, почему структурные изучения 5 глобиновых вариантов редки. В случае у глобиновых вариантов белковый анализ возможен только при условии, если пациент является новорожденным с процентным содержанием фатального HbF 70-76% и аномальной цепи 20-30%. Такое содержание аномального Нв достаточно для выделения у цепи и аминокислотного анализа протеолитических фрагментов. Однако у взрослых пациентов идентификация у вариантов затруднена из-за очень низкого процентного содержания HbF и у цепи (0.3-1%), что требует по-ярежнему большого количества крови для белкового ¡шалив (100-250 мл1

Нами было установлено, что ПНР и сиквенс амллнфшшрованных фрагментов позволяют быстро в течение вескольких дней идентифицировать у и ó глобиновые варианты, используя лишь 1-2 шi крови для выделения ДНК, тл в 50-Ю раз меньше по сравнению с рутинным белковым анализом. Применение ПИР и сикгенирования позволило идентифицировать два новых варианта — Нв F-Sacromonte IG7 59 (ЕЗ) Lys->G!n] у новорожденного из Испании и Нв A2-Liangcheng [5 117 (G19) Asn->Asp] у 14-летней китайской девочки. Амплификацию фрагментоз G7, Ау и о генов проводили с использованием двухступенчатой (симметричной 11 асимметричной) ПНР. Были оптимизированы условия ПНР для каждого га трех глобшюсых генов. Ау и 6 п:ни

трех глобшювых гсноп. А-у и 5 гены амалифшшрензли целиком («алI л ¡им фрагмогтом, включающим пое три 'лсзспга (1963 пл. и шй в то г^емя. как Су ген

ауплнфшшрокали двумя ф|йгменташ. одни из которых пклктал пер®" и второй экзоны (1279 шй а ттцюй — третий зкзоп (760 пл.1 Гмло показана что онттншцюванные условия ПНР (высокие температур отжига — 60-66°С и низкая концентрации (ЗЫТРз! давали './¡»фектнпный пиход выоокоспеинфичного ПЦР фрагмента, пплашруюший аналш которого показывает хорошие результаты (Рис21 11а рис2 представлен ф|игмеит ткте.'нруюшсго геля, включающий нуклеотидную последовательность вторых экзонов ву и А-р [еков, который идытифицировал мутацию Л на С в кодонс 59 67 гена и наличие полиморфного А-/Г гага С7л АТА-К1АА; 1уэ->С1п) у пашюгга и его матер». Оптимизированные нами условия и стратегия НИР 5 гена значтельно отличаются от условий, прицеленных в литературе, когда амплификацию 5 гена просолили с помощью двух или дажр четырех коротких фрагментов или продукт зкеграпфовали путем добавления хлороформа после симметричной и асимметричной стадий ПИР (и е1 а!., 19Э0; ТгШШзеО!.; 1993).

Лиапюстик'а у вариантов основана исключительно на трудоемком белковом анализе. Использопание оптимизированных условий ПНР и прямого сиквснса амнлифшшровакиых фрагментов имеет большее значение для простой и эффективной идентификации как 3 ,

Су ^

,-— -ч , \

ACGT ACGT ACGT ACGT ACGT »CGT

Mother' Fatfter Son Father Mother Зол

Рнс2 Фрагасот еджжируюшего геля амплифиш^юнаиных фрагментов G7 и А-/ глобинопых геноа

так и 7 глобииовых га [кантон. Применение ПЦР и сиквенса оказывается нсобхоличю для идентификации мутаций в 5 гене в случае дюнного игтерозиготного носительства St таласосмпи: при котором щхмюнтное содержание НвЛг снижеио или в норма тх использование щхжеттюго содержания ИоЛ2 в качестве елипственнои) критерия лл) скрининга /3 талаосемии не всегда позволяет. выявить наниентов с носитатьетпои L талаосемии. Поэтому характе|)истика двойных гетерозигот по 6/3 таласосмпи, оообеннс пренатальная диагностика, должна улучшить генетические консультации населения в те> областях, где расиростраши & таласоемия. Применение ПЦР и сикьенса также имеет большое значение для пренатальиой диагностики f варщнтон, поскольку носитсдьствс нестабильных у вариантов может приводить к преждевременной гибели плода. 'Гакш образом, использование методов ПЦР и прямого сиквенса амплифицированных фрагменте! позволяет усоведокнствогать и повысить эффективность продления диагностики 6 и •) вариантов.

1.2. Использование ПЦР в диагностике нестаОильных и тамсселитеских глобиноеих вариантов

Нестабильные lies являются результатом таких молекулярных дефектов, как точечные мутации, делеции. вставки или мутации сдвига рамки. Мутации, вызывающие нестабильность молекулы Нв. могут приводить к преципитации аномального белка п форме телец Гейниа в циркулирующих эритроцитах и. слсдоютельцо, являться причииоГ несфероцитарных наследственных гемолитических анемий. В настоящее цямя существует два основных поххола лля идентификации мутаций в нестабильных вариантах структурные 'исследования аномального бедка, выделенного из гемолизата эритроцитои. i анализ нуклеотидной нослеловательноти ДНК глобинового гена, несущего муташне (Williamson, 1993). Определение ДНК последовательности является елипственнс приемлемым подходом в случае гипернесщбильных или талассемических Hbs, которые вообще не обнаруживаются в периферической крови или составляют не более 1% от общего содержания Нв в эритроцитах и наследование которых приводит к фенотипу талассемии' с характерными чертами 'гипохромии, микроцитоза, анемии, ретикулоцитоза спленокегалии. дисэритрапоэза.

В ходе выпатнения настоящей работы было показано ¡¡¡«имущество использования ПЦР и сиквенса амплифициросанных фрагментов а и /3 глобиновых генов хпя идентификации несгабилы]ых и' таласоемичоских вариантов, невыявляемых с помощью 'классически* методов белковой химии. Была выбрана стратегия и оптишзированы условия ПЦР лл; амплификации /3 гаа с помощью двух коротких фрагментоа охватывающих два первых экзона (1098 пл.) и третий экзон (706 пл.), или с помощью одного большого фрапиеита (1611 пл1 включающего все три экзона Д гена (РисД ПНР коротких фрагментов была проведена с помощью одной (асимметричной) стадии, в то время, как ПНР большого фрагмента — с номошмо двух стадий (симметричной и асимметричной! Параметры ПНР, используемые как при амплификации коротких фрагментов, так и большого фрагмента.

\

прэктмчеп.'и сходны между собой, за исключением температура отжига праймероп, значенин которой были нише для ПНР фрагмента |шме))Ом 1611 ил, поскольку иаголдавалась пара тугоплавких прайперов. С помощью двухступенчатой ПНР сиешмнгхкого фрлгменга /3 гаи (1611 пл.) и последующего сикпенга идентифицировали новый 0 глобиновый вариант Ив Алеша с мутацией СТС->АТС или заменой валмноюго остатка на метидачжя.'й в колоне 67. Валнн в 67-ом положении 0—глобиновой пени предсп'вляет собпй !1-ый остаток Е спирали, которая является частью неполярного кармагд, чдаржащего гемовую группу, непос(>едсп пенно с которой ваши формирует контакт.

Внедрение метионшювогс остатка в 67-ом положении приводит к сильной дестабилизации молекулы Пв и к образованию шлыюнсстаСилького Нв Алеша с тяжелыми клиническими проявлениями (тяжелая гемолитическая анемия — Нв 80-90 г/я. гипохрочия. сплекомегалия1 Все попытки идентифицировать аночалышй вариант с помощью белкового структурного анализа ни к чему не щмведи. В данной работе с помощью ПНР и ашюннрования фрагмента /3 глобшюмго гена удалось идентифицировать несбычшй 3 таласкемнческнй вариант у армянской депочки, яа-тлощийся результатом пеганки экст1Ш|х11а',|>ового остатка между 123 и 126 аминокислотными осгатками.

706 mi ю98 il4

,--11--

fa0.2) fa(3) ra(3)

ЕХ1 ЕХ2 ЕХЗ

шиш ЕС

ivs1 ivs2

si si S3

fa(1à3) ra[12?)

1511 пк

РисЗ. Ст]иития ПИР Ф(игментов 0 глобинового гена: FA(1,2), FA(3), FA(1,2,3) -амплификанионные forward праймеры для ПНР экзонов ¡Л: 3 и трех экзонов /3 lena. RA - амплификашгакный reversa праймер. SI, S2, S3 - сикшнируюшио праймеры для экзонов 12Л.

который не удалось вылвить ни одним из рутинных методов белковой химии. Новый Д глобиновый галаосемичсосин вариант Russian является нестабильным и вызывает у ребенка фенотип гетерозиготной /3 талассемии со следующими клиническими проявлениями: доюлыю тяже;ия анемия (Нв 70-90 г/л1 гипохрегси^ сплаюмегалия.

клинические пречелепия. показал, что они. как правила являются гле.-.яг:ем муташш (вставок или делений), возникающих в третьем экзоне 0 глобинового гена. Поэтому с полью поиска мутации амплифицировали фрагмигт длиной 1098 пл. включающий экзон Я GiKBeir. этого фрагмента установил вставку кодогл CCA (Pro). Спедует отметить. что невозможно точио локализовать положение вставки, тж. в последовательности ACC.CCACCA.GTG.CAG (кодоны 123—127) имеется два 'поло;« ССА, поэтому вставка может происходть между кодонами 125 и 126 или межу колонами 124 н 125. приводя к одной и той же иуклеогидной последовательности: ACC.CCACCA.CCA.GTG.CAG.

Оптимизиронааше условия ПЦР и последующий сиквенса фрагаентов а глобиновых генов позволили идентифицировать нестабильный а вариант таласоемическога типа — Нв Taybe с деление« треонинового остатка в 38 или 39 положении а\ глобшювей цепи у пациента из Израиля и его дочери двух лет (Рис4).

G Т

-Ф

« А///Т

" fit р« ТА/Д

ж

Нк»Рп) - Ч •*/// с

——Sft

®ГО « Fpî « С 7/г

Ж

П*.Ту( ч Т'//А

— ш

« «Же

TTW.Ly» « Ç

т.ч. » Щ

•nit.

№•4» Я С/ с.

_iL«

ь га

liTvf

4

patient o1 gene

PATIENT o2gsna

A

Рис.4. Сиквоэг амялифиакпопанных фрагментов «2 и идентифицировавший-у пашюпа Нз Taybe.

al глобиновых генов.

Ранее lin Taybe Пил детеящюпан Girodon et al. (1992) с птюшыо структурного анализа иодированной аномальной a mi. а также амплпфикаинсн и сиквеиоом al глобинопото гена н гткшготгам состоянии у молодой арабской женщины с тяжелой гемолитической анемией. > .

Потеря трешшююго (Thr) остатка в II» ТауЬе может Сыть результатом делении одного ш трех триплетов (ССА, АСС, САС). которая во всех трех случаях приводит к-одной и тон же нуклеотидной последовательности: TTC.CCC.ACC.AAG (колоны 34-401 Эта нуклалидн-чя последоиатсиыюсп. включает в себя палиндром ССАСС и три погггора: два АСС- -рм ССА ¡; два САС. Наличие в ланной последовательности палиндрома делает этот сегмент ДНК ■" путчей точкой " для ккютюпения делений и пегаяок.

Как было показано сиквеноом фрагментов «1 и а2 глооинобьк • генов, пациент :сте[хз:,'И| отек по Ни ТауЬе (»1 геи) и но иеделеиионной а—талассемической мутации в polyA а2 гена, которые локализуются на противоположных хромосомах, т.е. в транс-положении: аа(-САС)/ a(AATAAA->AATAAG)a, поскольку двое старших детей нацией га (сын — 4 года H дочь — 3 гола) ("етерознготни по мутации в polyA. Встает вопрос почему зти две мутации вызывают такую тяжелую клиническую картину у пациента (гемолитическая анемия, аномалии в морфологии эритроцитов! в то время как младшая дочь пациента (2 годз). которая яатястся простой iwepronrcrrofi по Нв ТауЬе, имеет легкую форму анемии. Ранее Higgs et al. (1983) предположили, что гексанук.'юстидигя последовательность ААТААА, которая расположена в 31-иекоднруемой области на расстоянии Ю-'Ю пл. от polyA сайта, является местом узиакшия ферментов, участвующих в термипации транскрипции н полиаденнлировэнии мРНЬГ. Whitelaw et al. -(1985), исследовавшие терминацню траиасрнлшш а глобкновых генов, показали, что при наличии мутации ААТААА на AATAAG в polyA о2 гена. транскрштг а2 удлиняется на Î5 тли. с 3' -некодируемую область с формиролаииеч нового polyA сайта между «2 и aî генамц, который является в 4 Р3® менее эффективным ло сравнению с нормальным сайтом, что приалдит к пониженному уровню а2 mPHIC Tnein et aL (1988), изучавшие рассматриваемую нами неделешадшую к-талассемичеосую мутацию среди пациентов из Саудовской Драбин, предположили, что удлиненный аномальккн а2 транасрипт значительно уменьшает экспрессию «1 гена путем транскрипционного взаимодействия между ей и а1 генами. Исходя из анализа литературных данных, возможно следующее обмокшие .наблюдаемой нами тяжелой клиники у пациента и .четкой клинической картины у простои гетероздготы по Нв ТауЬе. .Мутация в polyA ей гена приводит к значительному снижению экспрессии а2 гена, а также к уменьшению экспрессии а1 гена вследствин транскрипционного взаимодействия. В то же время, экспрессия а1 гена с лелашей 38/39 треонина приводит к образованию силыюнестабишлой а цепи. Таким образом, при возникающем недостатке о цепи, /3 иепь объединяется лаже с нестабильной а це»1.ю и аномальный irpnairr выявляется и периферической кров». В случае п|>осгой гстерозигога по Нв ТауЬе экспрессия а генов находится в норме, а нестабильная а цепь

быстро подвергаете* иротеолитичеасой деградации, поэтому аномальный Ив не выявляете! в периферической крови ■пялиииопными методами белковой химии. 2 Ца1еахюраа«ш^ц-аффеыивцоса1 ППР и 01етд.!са_фратешх)вл'.'юбт(дмхита1ш -ш

человека

В холе 8ынол«еяия диссертанионпой [иботы были установлены-следующие особенности использоьания он-пюизированных параметров ПНР и сиквспса глобиковых генов по Зйепению с методаш белковой химии для идаггификации мутаций в аномальных Низ:

— сокращение ымичеспн стадий и. как следстше. временных ч материальных затрат для установления мутаций:

— дифференщваня лотацин в дуплицировашшх генах (а2, al), которые принипиально невозможно установить методами белковой химии:

— высокая частота нуклеотидных мутаций по сравнению с аминокислотными заменами, т.к. одна и та же аминокислотная за.меда в а цепи !'а может быть вьввана разними нулеогиднмии мутациями в а2 или al луплииированных генах.

Перечисленные преимущества позволили эффективно провести идентификацию ноюго гемоглобинового варианта — Нв Сара (al 94(G1)Asp->GIy). Белковый структурный анализ выявил с помощью метода обращенпо-фазовой ВЭ/КХ наличие аномального пептида: аХТ-11. Последующий аминокислотный анализ пептида ;ie давал однозначного ответа о точной локализации замены, поскольку заменяемый амшокислитный остаток несколько раз повторялся в разных положениях пептидной последовательности. Так, аминокислотный анализ пептида аХТ-11 предкмшал замену Asp->Gly либо в положена} 94. либо 97 a-глобиновой пени. Для того чтобы решить вопрос. о локализации мутации, было необходимо провести сик;«нс аномальных пептидов. Поскольку этот метод является трудоемким и многостадийным, то проблема локализации мутации была эффективно решегй-с помощью ПЦР и анегюнеа амплифидароваиных фрагментов а генов. В случае а глобинового варианта мутация теоретически может локализоваться как в а], так и в з2 гаях. Было показа!», что al и а2 глобичовые гены по-разному зкспрессируются в нормальных ретикулздпах, т.е. соотношение мРНКаЗ : мРНКа1 равно 28 (Liebhaber et al., 1986) или 26 (Molchanova, Pobedimskaya et al., 1994). Поэтому аномальные Ibs с мзташншн и a2 и al генах характеризуются разным процаггным содержанием в периферической кроае а] в среднем 19.9% и а2 в среднем 235%, что было показано нами ка большом статистическом материале по идентификации 21 разных а глобшгашх вариантов (Molchanova, Pobedimskaya etai, 1994). Однако меньшее отличие в 1-1.7 раза количественного отношения продуктов трансляции а2 и al мРНК не отражает сильного различия в 26-2.8 раза уровня экщгхам а2 и а! генов. Наблюдаемое выравнивание или нивелирование процентного содержания а2 и al г.¡шиповых вариантов в периферической крови можно объяснить на основе двух известных наблюдений: большей эффективностью трансляции al мРНК по qxwiicmuo с а2 (Liebhat er et al., 1982) и образованием в норме

несгабитчото удлиненного да 40% но сравнению с al мРНЬС транасринта al мРИК (Owczarek et a!., 1S92). Причиной разного у|»вня транскрипции а2 и «1 мРНЬС могут Сыть (яынчия и нуклеотщной последовательности обоих генов в З'-кгашевсй области, посколыс;.' она ш]юет гажьую ран, в синтезе mPHIC: терминами» транскрипции и ii|*!uemin«: (Manley et al., 1994).

Прожитое содержание нового а варианта, идентифшшроваиного нами и названного Пв. Сара, отставило 16% по данным разделения На методом катвднообмешюй ЮЖХ. Исходя из такого низкого н|юпемта. «поюлили ПЦР фрапиента al гена. Сиквеноом второго экзона амплифжшрезакьото фрагмента (795 iut! была идентифицирована мутация А на G в колоне 94-, которая приводит к замене аспарагиновой кислоты на глицин.

Идентификация аномального 11с Manitoba (a102(G3)3er->Arg) у. двух разных пациентов позволила ¡¡[»демонстрировать следующие преимущества П1 IP и сикоенса фрагментов глобмновых генов: дифференциация мута1шй в дупли;шроганных (aZ а!) генах: идентификация не только замены аминокислоты, но и различных муклеотндиых мутаций в al и оЗ. генах, результируюшихся в одной и той же аминокислотной замена Пациенты, носители Пв Manitoba, происходили из разных популяций: Ш. — из Америки (пациент белой расы), П. — из Южной Африки (пациент негроилной расы1 И в том, и в другом глутзе был проведен белшздй анализ. Аномальный Нв и цепь анализировали методами катионообменной и ОФ ВЭ/КХ, причем процентное содержание НвХ и аХ цепи в обоих случаях было разным: ф.—17%,П.—23.9%; Ф.—19%,П. —22%.Аминокислотный анализ установил замену оерина* на арпжм в 102 положении мутантной <*Х цепи. Исходя их данных по Л5юиент!юму содержанию аномального Из и/или аномальной ucnvi. можно было предположить, что у пациентов мутация вероятнее всего локализована в а2 гене. Сиквенс т]хпъйт> эюопа амнлифиннроюнного фрагаента а2 гена (783 п.н.1 пациента Ф. показал наличие мутации А на С в первом положении ¡02 колона (AGC->CGC) ,что соответствует замене Ser->Arg. В тоже время, у пациента П. была идентифицирована мутация С иа A (AGC->AGA) в третьем положении 102 кодона амплифицироаанного al гена (795 щи), что ссоттспггаэвало той же аминокислотной замена Мутация у пациента П. была найдена в гомозиготном состоянии, что может объяснить довольно высокое процентное содержание аномального Нв (23.9%1 Таким образом, были обнаружены две независимые, разные олнонуклеотшшые мутации в а2 и al генах, приводящие к одному и точу же белковому продукту — На Manitoba. Обнаруженный факт указывает на то, что частота возникновения нуклеотидных мутаций в глобиновых генах выше, чем их фснатапнчеасое проявление. т.е. один и тот же вариант может кодироваться разными нуклеотндными мутациями как в ouL так и в al генах. Кроме Ня Manitoba мы идентифицировали еще пять аномальных lies с мутациями в о2 и el генах у пациентов да разных популяций! Наиболее интересным среди этих случаев для ■ обсуждения представляет Пи G-Philade!phia (a€8(E17)Lys->Asn), которая является енеиь распространенным а вариантом. Rucknagel et al. (1981), изучившие более 70 случаев

rerreixBiiror 1« Нв G-Philadelphia, показали, что существует три основных распределения 11с 6 у гстерознгт: 25%, 35%, 45%. Гетергеигиггы с 35% и 45% процентным шдержаниеч Нв G щх^иются у П|х;дсгашггелей heipo'Mi.en раш и характертуются мнкрошгпцмюй и пшохромной анемией н л-^шинточ биосинтеза а испей. Ранее с помощью гибридизации Саузерн блота было пока-ано, что im G наследуется с а-талаоое.\шей-2 (деления 3.7 tjui) в иис-ноложепии ( fSaarrsia et a!., 1S34). Различие между, двумя гетерозиготными коаггеяьспимн с 35% и 45% Нв G зависит от отсутствия или присутствия второй делеиионной хромосома в т;;лнс-г,оложении. т.е. с/Ц-ЗЛ/аа или Q^(-3.7)/ct(-,'i7l Таким образом, гегерашготы с 33% Нв G имеют три а гена, в то время, как гетерозиготы с 45% Нв G — ли а гена. С другой сторошл били найдены случаи простого гетерозиготного носительсти !1п G (25-26%) цредн итальянских семей, которые характеризуются наличием четырех а [ензв (аc^icy или а^а/аа). Поскольку генотип aaGlaa или cfiaiaa был найден только у пристав ¡телей белой расы, a cfi{-?i.7)lcici ила c/^/dTl/cf-H?) среди П]йлстаъителей негроидной расы, то Sciarraia et al. (1984) предположили существование двух не.ыр,ишмых организации гетерозиготного носительства Нв G, специфичных для определенной расовой или этнической группы. Мы разрешили эту долге обсуждаемую в литературе (с 1981 г) проблему, идентифицировав две незазиашые однонуклеотиднь» мутации в а2ч al генах, которые приводят к одной и ток же аминокислотной замене аспарагина на лизин в кодоне 68 (Molchanova et al., 19S4). С помошью ПНР и смквенса фрагмента а-2 гена било показано, что гетерешгагаый носитель но Ha G с ¡5% распределением имеет мутацию С и Л в а2 гене IcGa/aa). Эта млтания была обшружеда у пациента и ребенка италмнекого ' \ * происхождения. В то' же время мутация С на - G в ui гене была найдена у пациента негрегянжой расы, носитель 33% Нв G и агталассемии-2. тл. IMaa. Мутация ЛЛС на AAG cneui)6i!4iia для а2а\ гибршногт) гена, который являйся результатом делении размером '3.7 tjul между а2 и al ганаш. Таким образам, различное процентное содержание HbG в гетерозиготах у представителей |йзных расовых групп можно объяснить существованием двух независимых одненуклеотшшых мутаций n а2 al и а2 гепах. ведущих к одной и той же аминокислотной замена Содержание HbG в количестве 25-26% отражает преимущественную экспрессию в2 гена. В то же время наличие 33-35% Нв G характеризует приотствие трех а генов, что ямяется резз'льтагом сгталагш1Ии-2.

Таким образом. ПИР и сиквеис ачпли«)« широва иных фрагаеитов позволяет идентифицировать муташш в о2 и al генах, что недоступкэ с помощью белкового структурноп) анализа. Анализ новейшей литературы показывает, что всего с использованием смквенса амплифиниросанного а гена идентифицировано лишь 15-20 а вариантов, в то время как вое остальные (145-150) выявлены с помощью белкового структурного анализг. который является многостадийным. трудоемким и не позволяет установить, в каком из а генов локализована.мупншя. Преимущественное использование в настоящее время методов белковой химии для идентификации о вариантов объясняется

тем, что а гены трудно амнлифнннрукггся. поскольку характеризуются необычно пысокнм содержанием GC-nap (7(Ш/^). GC-богатые области характершуются тф1юсгаб||Льностьх> и тенденцией к реассошгашш с образованием вторичных структур, тем самым щхжптстпуя oranii.v п|ийме|хш с матрицей и (какшт полимеризации. Ьыл предложен ряд метаю» определения структуры « глобинопого локуса. которые в основном включали изоли]Х)ГО1ше а- пммв с помощью молекулярного клонирования (Liebhaberetal., 1S81; Michelscn et al., 1983) или гибридселективной трансляцией а2 и al мРИК (Liebhaber et al., 1PS6). lla.vi щх-мстакляется. что альтернативным подходом является селективная амплификация ф|игментов al и ol генов с помощью ПНР. Поскольку основные трудности, связанные с указанным подходом «oiyr быть отнесены к большей степени гамолопгпюсти и большему подержанию GC пар, то для амплификации а генов в основном ислоль-вдялись трудоемкие методы, включаюшие многоступенчатую ПНР или многосталийное выделение ПНР продукта. Так, Zeng et al. (1992) предложили метол амплификации фрагментов а генов, включающий три стадии ПЦР, сопровождающиеся выделением специфического двухнепочечното фрагмента ПНР. из низкоплавяшейся агаролы с последующим сикяежом. Theinetai. (1991) .-подложили использовать биотпимрованшй праймер для ПШ' а генов и получать одиоцепочечиую матрицу путем се иммобилизации на магнитных гранулах (Dynabesds М-280 Streptavidin). '. Yuregir et al. (1992) использовали две стадии ПНР, сопровождающиеся выделением ГЩР фрагмента после каждой стадии с помощью Centricon-ЗО. В противоположность этим трудоемким методам мы разработали простую и эффективную методику амплификации фрагментов а2 и al генов методом асимметричной l ¡IIP» используя шсюконлавкие примеры с температурами пламенна между 72 и 7-КС и высокую температуру отжига (Molchanova, Pcbedimskaya et al., 1994j (Рис.5) . Некоторые авторы для того, чтобы увеличить специфичность ПНР для GC-бигатах последовательностей, используют такие органические растворители, как глицерин или диче-гилсульфошн (ЛМСО) (Sarkaretal., 1990). Другие

а2 «1

, 785 bp i , 795 bp t

FAoc2,1 ЯАо<1 FAa2,1 RAcd

Ex2 ЕхЗ Ex1 Ex2 Ex3*~

■{тиса_си-//-in r.-i n>

n/S-1 IVS-2 V/S-1 IVS-2

-»• ■* . -*■ -

S1 S2 S3 S1 S2 S3

PurJi. Стратегия ГШР-<*2 и or! глобиновых генов FAa2,1 - общий амплификашюниьш forward праймер al и al геноа RAo2, RA«1 - reverse праймеры a2 и ol генов. S1.S2.S3- сиквенируюшис таймеры экзоков 12Л

добивались специфичности 1110' путем предварительно/! дашурашш ЛЧКЧотрины и 0.1 \! МаОН и 0.4 мМ ЭДТА (Адзгу/а! е! а!., 1993). М,.: использовали фордау.ид (75%) с. тем. чтобы увеличить эффективность отжига щйтееро«. Поскольку, нредлашшая ками асимметричная ПНР включает в себя 35 циклон и идет при высоких. темне|Х1турах (денатурация: СЛ°—отжш: 68°—удлинение 72°1 то для стабилизации активности ТачДНК полимеразы нагальэопали Твин-20 (06%1 Таким ображм. использование высокой температуры отжига (68оС| и добавление формами.» (75°/?! позголили амилифиикровать Быоокоспеиифстные ПЦР продукты а2 и а\ генов.

Разработанный гати простой и эффективный метод амплификации Фрагментов а2 и а! генов и последующий сию;»к амплифииирилмних фр? ;.хнто'' позволил успешно кдектифшшрошть 24- различных а глобииовых варцаннщ у 62 пациентов ¡,з ¡0 стран (Мо1сЬапоуа^РоЬесИт5кауае1а1., 1994).

Возникновение и развитие метода ПЦР привело к быстрому ni)on**cy и развитии наших знаний и понимания различных а и Д таласэемических синдромов на молекулярное уровне. а-Талассемия ямяется широкораспространенпым генетическим заболеванием, обусловленным снижением синтеза g- глобииовых цепей г. результате различных делешкшых или недслециочных мутаций в с.-глобиновом кластере (Higgs, 1933 ). Большинство а-тглагамических синдромов возникает ъ результате делении одного или двух а генов. Делетш размером в 3.7 tjul. является одной и-1 самых распрос!ранепных в мире оталдсоемических мутаний, приводящей к лелецим 3.7 тли. между а2 и а 1 генами и образованию одного а2' al габридиого гена на лелецйонной храмооэма Стратегия скрининга 3.7 tjui. делении в целом основывалась иа реетрикционноя анализе и использовании ралиоактивномечешюй а пробы лля определения специфических а фрагментов (Muglia et al., 1993), также на определении соотношения а2 : al мРПК (Liebhâber et al., 1986) или нерадиоактинным методом количественного определения соотношений alfi и Ра мРНК. с-помощью окрашивания сермром ПЦР продуктов (Lin et al., 1994). Появление ПЦР открыло широкие возможности лля эффективного, нерадиоактивного детекти|»вания огталасоемических муптй. Bowden et al. (1992) предложили быстрое и эффективное определение с помощью П11Р нескольких делециониых егталаосемических мутаций, распространенных в Юго-Восточной Азии (-SEA) и с Средиземноморье (-WIED) и а(-205), используя две пары прайиеров, одна из которых амплифииирует JIHfC с нормальной хромосомы и локализуется внутри делении, а сгорая амплнфиикрует ДНК с аномальной делегированной хромосомы и фланкирует лелетиошше точки разрыва. Для каждого образна проводят две параллельные ПЦР в двух реакционных трубочках. Также особенностью этого метода является использование авторами буфера, содержащего бычий cuw, даяний г.льбумин (100 мтчд)' и Э-меркатоэтанол (10 мМ). а также добавление в реакционную смссь до ¡0% ДМОО. Мы опттн пировали I1L1P условия

Г/

для быстрого и специфичного скрининга делении 3.7 тлл. Г1[*)педсние ПНР с помощью лраймцюп. специфичных для «2а1 гибридного гена (or2 forward лраммер и al reverse праймер!. позволило Obi.'T¡¡o идентифицировать наличие делении 37 тли Поскольку п ¡хзультате такой делении образуется . alai гибридный ген. го а\;плифпШ1рован)шй Фрагмент ПЦГ размером 1773 iul служит доказательством наличия делении 37 тлл. С напио выяснения гомозиготного или гетсрозштотного носительства делении » тех же условиях ПНР (температура отжига 61°С реакционный буфер содержит 100 мкг\мл бычьего сывороточного ал|5ум:та и 10 мМ /3-меркаптоэтанола, 75% ДМСО) Проводили две ПНР с парами праймеров. одна из которых специфична для а2 гена, а другая — для а! гена. В случае ютчхвдготы по делеции амнлифииируются два специфичных а2 и al фрагменты, в то время, как в случае гомозиготы амплификация двух специфичных Фрагмагтов отсутствует. поскольку на двух делецио::ных хромосомах присутствуют только a2al гибридные гены. Нами были подобраны и оптимизированы углопия ПНР для идентификации клинически важного гибридного На Lepore, который вызывает фенотип /3 талассемии. Хотя носительстЕО На Lepore фенотипически и клишпески выражается как

0 талаетемия. однако присутствие 10-15% электрофо])етичег.ки медленно лм-аюшегося Нв позволяет отличить носительсгю аномального Нв и в талассемии. Нв Lepore представляет собой мутантиый гибридный Нв, обязующийся в результате неравного (иегомологачного) чххеимговера между 5'-концом 5 гена и 3'-концом 0 гена, что приводит к образованию гибридного S/3 гена и делешш размером Г тлл. Поскольку межгенный кроссинговер может происходить в различных участках 5 ¡un ¡3 геноз, то в зависимости от точки кроосинговера образуются три основных тала Нв lepore. Наиболее известен Нв Lepore Boston-Washington (£87-/3116), распространенный яшн жителей Средиземноморья. lice три типа Нв Lepore были идентифицированы с помощью рсстрикциошгого анализа и гибридизации с меченными олигонуклеотидными 5 ив пробами (Landos et al., 1937). Метод ПНР имеет преимущества над существующим стандартным генетическим анализом в смысле быстроты и надежности результатов и не используя радиоизотопы. Рядом авторов (Lindeman et al., 1939; Camescfcella et al., 1990; Craig et al., 1994) был предложен уетод определения Нв Lepore BostonWashington (SS7-/¡1!6) с тгочошыо ПНР, используя праймеры для . S/3 области кроосииговера. Данный метол был применен авто|»ми для пренатальной диагностики, шголыуя в качестве матрицы ДНК вороты хориона. ПНР проводили с лсмошью двух праймероз, позволяющих амплифииировать ДНК фрагмет между нуклеопиом 31 нитрона

1 и нуклеотидом ООннтрона 2 в 3 и 5Д генах. Ранее было показано, что Ь0 гибридный ген в Нв Lepore Boston-Washington включает интрон 2 целиком полученный от 0 гена ¡Landos et at., 1937). поэтому используя в П11Р reverse прзймер специфичный для utrrpoira 2 S гена и forward праймер специфичный для Ь гена, можно специфично амплифищршть гибридный Щ ген.

Мы предложили и апробировали быстрый, эффективный» иералиоакпшый м.тод детектирования Lepore 8f¡ гибридного гена. Этот метод пелшышется на амплификации двух дслешяянккпенифичиы.х ПИР продуктов. жэкшзуя три праймера: forward прайму специфичный длп 5'-коти 5 rcin.il дна reverse upaíw jú. один ил которж спашфнчег: для 3' -конца 0 гена, а другой — для цитрою 2 0 rem Ьранмер локализован между нуклеопдами 45 н 71 шггрона 21 Использование с одной ПИР всех трех праймеров приводит к тому, что с первой парой примеров змплифииирушея фрагмент S0 гена размером 1618 ши а от второй парой праймеров — фрагмент í¡3 гена размерю.! 620 пл. Landos et al. (1997) показал, '.то точка крооаовера в Ik Lepore Boston-Washington находится между кодоном 87 S гема и 5'-концом шпрота 2 jS гена в области гомологии размером в 58 ml Поэтому образование второго короткого фрагмента (620 пли) указьшает на та что действительно гибридный ген включзэт интрон 2 от /5 гена и что точка кроооовера наход!ггся на »'-конце интрона 2 /3,lena. Поскольку, нами были оптимизированы простые условия ПНР, не включающие.. никаких дополпительнич корастсюров, то этот метод может быть использован для простого скрининга Нв Lepore путем ПЦР и проверки специфичных П1ДР ф[)агу,с!ггов с помошью электрофореза на агарозноч геле.

ВЫВОДЫ

L Впервые для молекулярной диагностики аномальных гемоглобинов человека предложен уьихрхдльная стратегия и опти-.мфованы экспериментальные условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) для икдщфической амплификации фрагментов шести глобинешх генов - cZ al. ft Gy, Ay, &■

2. Применение огггимизированных выпокоспенифичных уемшй ПИР глшиновых генов в сочетании с сиквенсоч позволило расширить спектр и ускорить диагностику гемоглобинопатий, что, особенно эффективно в случае носительства аномальных iiss, илентефката которых затруднена или недоступна традиционными методами белковой химии:

молекулярная дигкостжа аномальных Hbs с, низким (2-3%) содержанием в периферической крови;

молекулярная л:;.пюсппя высоконестабиль.чь/х и\:ии талаосемического типа a «

вариантов. ноентельство которых вызмтет симптомы гемолитической анемии.

3. Установлена что опттг.сировашше параметры ПНР и последующий сикеснс глобкновых генов дают значительные преимущества по сравнению с методами белковой химии для идентификации мутаций в аномальных Hbs:

• сокращено количество кроен (в 50-80 раз! необходимое ,гля диагностики аномальных Hbs с низким содержанием;

• сокращены количество стадий и, как следствие, временные и материальные затраты лл.1 устанонлення .мутаций:

• лчффечмнкцюпанм мутании п лунлшшрованнык генах (е2 aR которые принципиально невозможно установить метолами белкопой химии:

впервые .чкепериментально подтверждена более высокая частота нуклеотилных мутаций но яишешда с аминокислотными заменами. Показано, что олна и та же-аминокислотная замена в а нспи Нв может быть вызвана разными нуклеотилными муташшми в а2 или al дуплииировамиом гене.

4. Экспериментально устакоплеиа эффективность применения ПНР лля идентификации делеционных мутаций в глобиновых генах, обуславливающих носительстш талаосемий.

а Применение ПНР и сиквенса фрагментов глобиновых генов позволило в максимально короткий срок гола) диагносшровагь около 100 случаев носитспьства аномальных Hbs (из них 10 новых. 10 нестабильных и 2 пьюоконестабильных а и 0 вариантов), более 20 случаен а и (5 талаахмических мутаций. 10 случаев сочетаний ноштельства аномальных Hbs и таласссмичеосих мутаций у пациентов из 13 стран лшра: Россия. США. Турция. Испания. Израиль. Пор-р/галия. Германия. Китай. Гон-Конг. Италия. Голландия. Южная Африка, Австралия.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. T.P.Molchanova, Yu.V.Postnikov, D.D.Pobedimskaya, N.S.Smetanina, AAMoschan, E.G.Kazanetz, Yu.N.Tokarev and T.H.J.Huisman (1993). Hb Alesha or alpha2beta2 67 (£11) Val->Met A new unstable hemoglobin variant identified through sequencing, of amplified DNA. Hemoglobin, 17(3): 217-227.

2. D.D.Pobedimskaya, T.P.Molchanova, L-H.Gu, M.A.Molina, J.M.de Pablos and T.H.J.Huisman (1993). Hb F-Sacromcnte or alpha2gamma2 59(E3) Lys->Gln observed in Spanish newborn and his mother. Hemoglobin, 17(3):269-275.

3. W-B.Qin, T-LJu, X-L.Yue, X-L.Yan, L-Y.Qin, T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, T.H.J.Huisman (1993). Hb Аг-Liangheng delta 117(G19) Asn->Asp (AAC->GAC): a new delta chain variant detected by gene analysis in Chinese family. Hemoglobin, 17(5); 463-466.

4. G.Dincol, D.D.Pobedimskaya, T.P.Molchanova, Z.Ye, B.B.Webbsr, J.B.Wilsori, T.H.J.Huisman (1994). Hb Capa or a mildly unstable variant with an A->G (GAC->GGC) mutation in codon 94 of the alphal globin gene. Hemoglobin, 18(1): 57-61.

5. T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, Z.Ye, and T.H.J.Huisman (1994). Two different mutations in codon 68 are observed in Hb G-Philade!phia heterozygotes. Am.J.of Hemat, 45: 345-346.

6. T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, Yu.V.Postnikov (1994). A simplified procedure for sequencing amplified DNA containing the a!pha2 or alphal globin gene. Hemoglobin, 18(3): 251-255.

7. D.D.Pobedimskaya, T.P.Molchanova, S.Striechman, and T.H.J.Huisman (1994). Conpound heterozygosity for two a-globin gene defects, Hb Taybe (al; 38 or 39 minus Thr) and a PolyA mutation (a2; AATAAA->AATAAG), results in a severe hemolytic anemia. AnU. of Hemat, 47:198-203.

8. T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, T.H.J.Huisman (1994). The differences in quantities of «2- and al-globin gene variants in heterozygotes. Er.J. of Hemat, E8: 300-306.

Подписано к печзги О.тпечатано яг ротапринте в Оориат (дойти 30x42/4 Производственной конЗинате 05ьем 3 п. л Литературного фояла гак. (р Ткр- ЮО