Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение полимеразной пенной реакции для молекулярной диагностики гемоглобинопатий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Применение полимеразной пенной реакции для молекулярной диагностики гемоглобинопатий"

^ л'

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. П.О№1ЬГАРЛТЛ

На правах рукописи

УЖ 616.155.16

П0ШШЖ2САЯ ДИАНА ДМИТРИЕВНА

ПРИМЕНЕНИЕ НШШМЕРАЗИОП 11ЕПНОП РЕАКЦИИ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАНЮСТИЮI ГШОГЛОЫИЮПАТ!П!

Специальность — 03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ лиосерташи да соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва ]Ш

Работа- выполнена в Международном Центре по диагностике гемоглобиногрпш (Medical College of Georgia, Augusta, GA, USA, лаборатория профессора ТХЕХайсмана) и в Институте молекулярной биалоош им. ВАЗнгельгардта РАН

Научный руководителе

Кандидат биологических наук, chjc ТДМолчано®

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор химических наук СШСочетков Кандидат биологических наук НЕМалсева

Ведущая организация:

Центр медикобиологичсских и экологических проблем РАЕН

Зашита состоится - & 1995 года в часов на заседании

специализированного совета Д 002 79.01 в Институте молекулярной биологии им. {ШЭнгельгарлта РАН

С диссертацией можно ознакомься в библиотеке Института капекулкрной биологии им. ВАЭнппъгардта J АН

ОБШЛЯ X Л РА KTIP ! I СП !Г\Л РЛКОТЫ

/чппуа.и.шк;.!!. работы. Гемоглобинопатии — аномальные гемоглобина (Uns) и тг.тидемичсаше ашлромы — являются гетеро гешда группой нагледстюшмх-и:мол»тичеа;!-;\ анемий человека, обусловленных нарушениями синтеза гемоглобина п |хззухтатс |излнчнцх мутаций в а2, al, 3, Gy, А7. о глобиншмх генах. Они широки ¡испросцжнени ос вы;« маре, поэтому большое практическое значимо имеет поиск яиозгчх. экспрессивных 1: относительно недорогих методов для »«пекулярной диагностики этих заболеваний. Í3 свете этою, применение и оптимизация юопремепного и п; ор.ххгиг-нош могола ¡юличеразной ценной реакции (ПНР) нредсгаатлется крайне актуально!! научной задачей для усовершенствования и ускорения идентификации аномальных Iíbs и талзсземических мутаций. При зти.м специфическая амплификация каждого Е стлелыкхтп; tua требует своей индивидуальной стратегии и накопленного поиска конфетных экспериментальных условий ÍILÍP. Актуальность настоящей работы заключается в тем. что они ¡шляется составной частью системных исследований и разработки методологи:! диагностики гемоглобинопатия в рамках Международного Пенгра по лиапгасгике гемоглобинопатии (Medical College of Georgia [MCGJ.USA. цхзфеяжр ТПЯХайсман! и лабо^йтории молекулярной организации хрочполг (ИМИ РАН. академик АЛМпрззбеков!

1'клыо настоящей работы яачяется совершенствование мспш ПЦР и его практическое применение ллд молекулярной диагностики наследственных гемоглобинопатии человека, созванных [наличного рола мутациями в шести глоокновах генах. Для достижения этой иели были постаплекц следующие задачи: 1 Укифиишия спатегии н оптимизации экспериментальных усповий ГШР. 2. Выяснение возможностей и преимущества использования ПЦР в молекулярной диагностике аномальных Hes. идентификация которых затруднена или недоступна традиционными методами белковой химий. 3. Использование ПНР p. качестве зффеггигчого и нерадиоактивного метола идентификации делешюнных мутаций в а и В гаобиновых генах.

Иаучнаг иоочзиг.. .4 диссертационной ¡afore вдмботава стратегия и оптимизированы экспергшеитальные условия ПНР для спещ!фггасгой амплификации фрагментов шгеги глоииновых reí®» — cû, cl. (3, G-,, Ay. S. Лчдфереицирэсаим .чутаиии v. луплшшрогешшх «V генах, которые лрикцитплыю неюзчожно установить методами е-.гжтаой химии. Вчерпые ^ксперименталпно подтверждена Полое «.ыпокая часпла цуклалшккч M-\TEitu(i по апютаияе с ачаиокиаклпнчи заденат т.к. показано. что олна у, "я же ааджкислопия за>«;% í a цепи i!» может бш>. дошпа разными нуклосгтчии.т гугаи-игп' ; --7- •:.'„■■. я". тггх. 0""И';'-"!">• кип.' у. к-етк

«

nUP и выбраны праткроп для специфической амплификации гибридных гекоо. образующихся при делсшюнных мутациях в а и 0 глобииоиых генах.

Научная и практическая значимость. Идентификацией более 100 точечных мутационных замен, из них Ю iiooux аномальных Mos. а также более 20 случаен лслсиионных мутаииий в а и ß глобпноеых генах. продемонстрировано, что использование ПЦР глобиновых гаюв в сочетании с прямым акоенированием зшчителыю повысило эффективность диагностики гемоглобинопатии по сравнению с методами белковой химии за счет унификации и оптимизации процесса, сокращения временных и материальных затрат. С помощью ПНР расширен спектр диагностики аномальных IIbs. идентификация которых затруднена или недоступна классическими методами белковой химии Ранена новая научная и практическая задача в области совершенствования и интенсификации длапюсгики гемоглобшюпатий с применением современных методов молекулярной биологии, что имеет значение для прикладной молекулярной биологии и в особенности для молекулярной медицины.

Лпробаичя работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах в MCG и ИМБ (19941

Пуб.шктша работы. По материалам диссертационной работы оп>бликовано 8 печатных работ в журналах "Hemoglobin", "AmJ.of Hemat.", "Br.J.of Hemat.". Готовится к печати монография: "A Laboratory Manual for recombinant DNA identification of human abnormal hemoglobins " Marcel Dekker, Inc., N.Y.. 1994, 150 pages (TP.Molch anova, D.D.Pobedimskaya, Yu.V.Postnikov, T.H.J.Huisman).

.Объем а структура работы.. Диссертациошия работа, изложена .-»а 153 страниц машиногожного текста, включающего 22 таблиц. 29 рисунков, список литературы из 125 наименований и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методики эксперимента, изложения результатов исследования, их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В ходе выполнения диссертационной работы был выработан унифицированный подход для молекулярной диагностики гемоглобинопатии. включающий три стадии: выделение ДНК. амплификация фрагментов глобиновых генов методом ПНР и сиквенирования ачнлифишрованных фрагментов (Рис.11

Пылслсние гаюмнон ДНК из лейкотпта *

Амплификация фрагмента глоПмиозого гаи метолом ПИР *

Анализ специфичности проекта ПНР или ачллифмнироишюго фрагмента на агарозном геле Ф

Выделение продукта HHP Ф

Сикпенс Ф

Э.чсктрофо[хз ажвенироганных реакций в денатурирующем ПДАГ

4в-

Аиторалиографин и чтение ансвенса

Ф

Идентификация mjташш-Рис.1 Схема молекулярной диагностики гемоглооинопатин

Суиклпе'нгым -¡таном' и выработанном • подходе является • оптимизация экспериментальных устовий IJIIP для специфической амплификации фрагментов шести глобиноьых генов. Специфичность НИР была достигнута путем оптимизации температуры отжига поаймеров для каждого из шести глобиновах генов, г. то Еремя как остальные паргметры (температуря и время денатурации и удлинения, чисто циклов), а также компоненты HUP (реакционный буфер. концентрации ионов магния. дедаксинуклсютидтр'.Цкхфатов, праймеров) оставались практически одинаковыми. .Допашктсяыюе пледешге котасгворителей Пк«и, фпршмила) использовали в случае трулноачГиифмцирусмых. тугоплавких матриц-ЛПК с целью повышения эффективности и специфичности ПИР. Разрботанная в настоящей работе стратегия ГИР фрагментов шести глсСинивмх генов заключается в одноступенчатой (геиммярячтй! ПЦР коротких ф[ягмгаггов i'riOO-lOOO iul) с истюльзосанием геномной ЛИК в качестве матрицы и на двухступенчатой {си vMtn ¡дачной и асимметричной) ПНР длинных фрагментов (М00-2000 pjii Вилсление специфичных ПНР продуктов (олнонеяочечних фрагментов ДНК), ачплифкчйропаннмх при оптимизированных условиях, oi.no сделен» к. щюстой уннпергалык/й «[юцелуре. сключаюн.'ей осажлешк .'IHK CMHinvv. m ¡мстюра анстат аммония, не прибегая к тпуд-ем^лг методам с ¡гаюлкюшшем ксвнкпращюп Certricnn-

30 или вырезанию к выделению фрагментов ПНР из агарозного геля (2епд е( а1., 199?; Уигед1г е( а1., 1332). Пртюдура сиквенса также была унифицирована для всех глобиновых генов, за исключением разных сиквсиирукншх примеров и температур отжига г. амплифипиропашюй матрицей-ДНК. кончил- были нолоб]ипы для каждого в отдельности. Таким образом. разраГхггамия унивсрсалыая стратегия и оптимизация условий ПЦР фрапюгтоп шести глобшювых генов позволили провести молекулярную диапюстику гемоглобинопатии и на основании более К)0 идентифтшрованкых случаев гемоглобинонатий саелатъ заключения, которые можно изложить следующим образом:

брлк-QRfim rrpvt.-T\f«inm анятга

U. Целеспобразность применения ПЦР для идентификииии Gy. Ау a ó ва ршттов

(5 норме у взрослого человека минорные белки НвАг (аз&г) и HbF (0272) составляют 2. 5%+0Л% и соответственно окдло 1%. Особенностью 7 и 5 глобиновых триактов является также их низкое цюце.тпюе содержание в периферичеесой крови (12%!, что затрудняет идентификацию таких белков. Так, процентное содержание 8 глобицовых вариантой в гетерозиготах очень «ало (1-15%) и немного выше (2-3%) в гетерозиготах с носителистЕоч /3-талассемии Поэтому выделение достаточного количества этого минорного белка для рутинного белкового анализа требует большого количества крови {500-250 мл). Эта трудность, а также звачительные усилия (затраты времени, многосгадийкосгь), необходимые для выделения аномальной J цепи и характеристики ее трмптичесхих шгтидор—.главные причины того. почему структурные изучения 5 глобиновых вариантов редки. П случае у глобшювых варианта белковый анализ возможен только при усювии, если пациент является новорожденным с процентным содержанием фетального HsF 70-76% и аномальной цепи 20-30%. Такое содержание аномального Нв достаточно для выделения у цепи и аминокислотного анализа протеодитическг.х фрагментов. Однако у взрослых пациентов идентификация у вариантов затруднена из-за очень низкого процентного содержания HbF и у цепи (0.3-1%), что требует по^режнему большого количества крови для белкового анализа (100-250 мл1

Нами было устаноьтено, что IlliP и сиквенс амплифинированных фрагментов позволяют быстро в течение иесхолькнх дней идентифицировать у и д глобиновые ва1»тнты. иаюльзуя лишь 1-2 ш крови для выделения ДНК, т.е. в 5G-S0 раз меньше по сравнению с рутинным белковым анализом. Применение ПЦР и сиквенирования позволило идентифицировать два новых варианта — Нв F-Sacromonte [G7 59 (ЕЗ) Lys->6ln] у новорожденного из Испании и Нв Аг-Uangcheng [5 117 (G19) Asn->Asp] у 14-летней китайской девочки. Амплификацию фрагментов G7, Ау и о генов проводили с использовании! двухступенчатой (симметричной и асимметричной) ПЦР. Были оптимизированы у схим П11Р для каждого из тре? глобиновых ге:;ов. Ау и 5 ими

трех глобинсвых гсиоп. А7 и 5 гены амплмфшшрепали целиком (Лаяыиим фрагментом, включающим иге три экзени (1963 mi. и 1665 mil в то щжмя. как Gy raí амнлифшшровалп двумя ф(агмснтамн, один из которых пключал перявй и второй экзоны (1.7Г9 iuü. a imipoii — Tjiemff экяпн (760 mil Ьылп показано, что пгстичизиропаииые условия ПЦР (высоте температуры отжига — б0-66"С и низкая концентрация dNTPs) давали э|>фекти!йый шлеи высокослешфичного ПНР фрагмента, агаенируюший анализ которого показывает хорошие результаты (Рпа21 На рис2 представлен фрагмент сикомшруюшего геля, включающий нуклеотидную последовательность вторых экзонсв G7 и Ау генов; который идентифицировал мутацию А на С в кодокс 59 Gy гена и наличие полиморфного АуТ гага (75 АТА->САА; Lys->Gln) у пациента и ' его матери. Оптимизированные нами условия и стратегия HUP S пена значительно отличаются от условий, приведенных в литературе, когда ачплифишшю 5 гена позволили с помощью двух или лаже четырех коротких фрагментов или продукт экстрагировали путем добашгепия хлщ»форма посте симметричной и асимметричной стадий ПЦР (Li et al., 19Э0; Trifillis etal.; 1993).

Диагностика у париантги основана исключительно на трудоемкое белковом анализе. Использование гагппшзиронанцых условий ПЦР и прямого сикиенса амплифицировакных фрагментов имеет большее значение для простой к эффективной идентификации как 5 ,

Чу Ат

Mother ' Fsfter Son fatter Mother Sen

Pnc2 Фратогнт сикнснируюшею 16ля амплифиш^вйанных фрагментов Gy и A-, глобинпвых генов.

к

так и у глобшювых га [кантов. Применение ПЦР и сиквеиса оказывается необходимым для идентификашш мутаций в Ъ гене в случае дшпиого ютерозиготного посительстпа о/З талаожмии. при mrqxiM ii|»>n€imioc содержание НвДг снижено или в норме, т.п. иаыдыокшие щшатюги содержания I1üV¿ u качестве единственного критерия для скрининга 0 талаоташи не всегда позволяет . выявить пациентов с носительствоч 0 талассемии. Поэтому характеристика двойных гетерозигот по 6/3 таласадши, особенно пренатальиая диагностика, должна улучшить генетические консультации населения в тех областях, где распространена 0 талаосемия. Применение ПЦР и сикьенса также имеет большое значение для прснаталыюй диагностики у вариантов, поскольку носнтельстю нестабильных у вариантов может приводить к преждевременной гибели плода. Таким образом, использование методов ПНР и прямого сиквенса амплифииированных фрагментов позволяет усовершенствовать и повысить эффективность проведения диапюстики 5 и у вариантов.

12. Использовате ПЦР в диагностике нестабильных и пныассемических глобиноеых вариантов

Нестабильные lies являются результатом таких молекулярных дефектов, как точечные муташш. делеции. вставки или мутации едшта рамки. Мутации. вызывающие нестабильность молекулы Нв. moot приводить к преципитации аномального бачка в форме телец Гейниа в циркулирующих эритроцитах и, следовательно, являться причиной несфероцитарных наследственных гемолитических анемий. В настоящее цлчя существует два основных подхода для идентификашш мутаций в нестабильных вариантах; структурные' исследования аномального белка, выделенного из гемолиза га. эритроцитон. и анализ нуклеотидной последовательности ДНК глобинового гена, несущего мутацию (Williamson, 1993). Определение ЛИК последовательности является единственно приемлемым подходом в случае гипернесгцбильных или таласоемических Hbs, которые вообще не обнаруживаются 8 периферической крови или составляют не более 1% от общего содержания Нв в эрэтроштах и наследование которых приводит к фенотипу таласоемии' с характерными чертами "гипохрочии, микроиитгси, анемии. ретикуяиштоза, спленомегалии. дисэритропоэза.

В холе выполнения настоящей работы было показано преимущество использования ППР и сиквенса амплифииированных фрагментов а и /3 глобиновых генов для идентификации нестабильных и таласоемичоских вариантов. невиявляемых с помощью классических методов белковой химии- Была выбрана стратегия и онтюнадронаны условия П11Р для амплификации /3 reía с помощью двух коротких фрагментов, охватывающих два первых экзона (1098 iut) и третий эюот (706 пл.), или с помощью одного большого фрагаента (1611 п.а). включающего юе три экзона (3 геиа (РисЗ! ПИР коротких фрагментов была проведена с помощью одной (асимметричной) стадии, в то время, как ППР большого фрагмента — с помощью двух стадий (симметричной и асимметричной). Параметры ПНР, используемые как при амплификации коротких Фрагментов. т?к и большого фрагмента.

шиктичсс::н сходны между собой, за исключением температуры отжига прайме[»п, значении которой были нише для ГШ!' фрагмента [кзмчюч F6II ruu поскольку использовалась пара тугоплавких праймеров. С помощью двухступенчатой ПНР снешкиггхэсого фрчгмемта /? гена (¡611 lui.) и последующего сикпсиса идентифицировали новый 0 глобиновый вариант Ив Алеша с мутацией GTG->ATG ила заменой валинового остатка па мстаокшкдай в колоне 67. Валин в 67-ом положении /?-глобипоиой нспн г.редстлвляет собой 11-ый остаток Е спирали, которая является частью неполярного кармаит, оуг-ржамего гемовую фуппу. непоседа пенно с которой валин фондирует контакт.

Внедрение метионинового остатка в 67-ом положении приводит к сильной дестабилизации молекулы Нв и к образованию слшюнссгабндькото Пв .Алеша с тяжелыми клиническими проявлениями (тяжелая гемолитическая анемия — Нв 80-90 г/л. гипохромия, сшекомегалия). Все попытки идентифицировать аномальный вариант с помощью белкового структурного анализа ни к чему не умнели. В данной работе с помощью ПНР и емкпенирошния фрагмента 0 глобшюього гена удалось идентифицировать необычный /3 талассечнческий вариант у армянской девочки, явдзюшийся результатом гстагоси экстраприлиновото остатка между 123 и 126 аминокислотными остатками.

FA(l,2) RA(1i) FA(3) RA(3)

EX1 EX2 ЕХЗ

Ч ЕЯ TSB8 ЕТТ—

st s; S3

ГА(1ДЗ) RA(1.2,3)

un /ш.

РисЗ. Ст]итегия ПЦР фдегментов /3 глобиноюло гена; FA(1,2), FA(3), FA(1,2,3) -амплификаииоиные forward праймеры для ПЦР экзонов 12: 3 и трех экзонов ¡3 гена. RA - амгглификакионкый reverse праймер. S1, S2, S3 - сиквенируюшие праймеры для экзонов 12Л.

который не удалось выявить ни одним из рутинных методов белковой химии. Новый р глобиновый галасве,\шческий вариант Russian является нестабильным и вызывает у ребенка фенотип гетерозиготной /3 таласоемии со следующими клиническими проявлениями: лоиолшо тяжелая анемия (Нв 70-90 г/л1 гипохромия^ сплспомегзлия.

клинические продления. показал, что они. как правила являются гле;стЕ:ем мупший (вставок или деавдш), возникающих в третьем экзонс 0 глобинового гена. Поэточу с целью поиска мутапии амплифиинровали фрагмент длиной 1098 пл. гослючающш экзон Я Qiraeir. этого фрагмента установил вставку колота СС\ (Pro). Следует отметить. что невозможно тоге) локализовать положение встапки. т.к. в последовательности ACC.CCA.CCAGTG.CAG (кодоны 123—127) имеется два 'повтора ССА, поэтому вставка может происходоть между колонами 125 и 126 или между колонами 124- и 125. привои к одной и той же нуклеотинон последовательности: ACC.CCA.CCA.CCA.GTG.CAG.

Оптичизироваяиые условия ПЦР и последующий сиквенса фршмецтов а глобиновых генов нозполили идентифицировать нестабильный о вариант таласоемическоро типа — Ив ТауЬе с л ела шей треонинового остатка в 38 или 39 положении <*1 глобиновей цепи у пациента из Израиля и его дочери двух лет (Рис.41

А О G Т

А С G Т

-ОЧ 1

SM.LM « fi/l \

щ

VM»*Mi « ЛИ А

Ii

г»

I

«I Vflk

Ж " ж

w.Ln m

It

4

icuh»>mhm

PATIENT al gene

- s * "

PATIENT " a2gene

AA COOM I

Рис.4. Сикнзс амилифииирозанных фрагментов al и al глобиновых генов, идентифицировавший-у пациента На ТауЬе.

Ранга I Id Taybe nun лсгасщюнан Girodon et al. (1992) с вэапшью структурного анализа гзанцювашюй аномальной а непи. а также амплифмкашкй »• акцентам al глобшююго гена н гтвквнготно.м состоянии у молодой арабской жокшшы с тяжелой пгчаитпмжпй анемией. ' .

Потеря треонинового (Thr) остатка в Пв ТауЬе можег Сыть результатом делении одного из трех триплетов ÎCCA, АСС, САС). которая по всех трех стулаях приводит к • одной и той же нуклеоталной последовательности: TTC.CCC.ACC.AAG (колоны 31-401. Эта н>кл«ггиднчя последовательность включает в себя палиндром ССАСС и три повтора; лва АСС- три ССА и лва САС. Наличие в ланной последовательности палиндрома делает этот сегмент ДНК " горячей точкой " для возникновения делений и вставок.

Как било показано сиквеноом фрагментов a1 и ог2 глобиновых -генов, пациент гетерозиготен го Ив Та/be (сИ ген) и по неделеиионной а—талаооеяической мутации в poiyA a2 гена, которые локализуются на проппюположных хромооомах. т.е. в транс-положении: оо(-САС)/ a(AATAAA->AATAAG)a, поскольку лвое старших детей пациент (сын — А года и лочь — 3 гола) гетерозиготны но мутации в polyA. Встает вопрос, почему зти две мутации вызывают такую тяжелую клишлескую картину у пациента ¡гемолитическая анемия. аномалии в морфологии эритроцитов), в то время как младшая дочь пациента (2 гола), которая яаляется простой гетерозиготой по ! ! г. ТауЬе, имеет легкую форму анемии. Ранее Higgs et al. (1983) предположили, что гексануклестилная последовательность ААТААА, которая расположи» в 3'-некодируемой области на расстоянии 10-30 пл от polyA сайта, является местом узнаюния ферментов, участвующих в терминации транскрипции и полиаленилиропэнии мРНК. Whitelaw et al. -(1986), исслелоившис терминаииго траиасрипнии а глобиновых генов. показали, что при наличии мутации AVTAAA на AATAAG в polyA а2 гена, транскриот а2 удлиняется на 15 т.гиь с 3 ' -некшируеуую область с формированием нового polyA сайта между «2 и ai генами, который является в 4 Г033 менее эффективным по сравнению с нормальным сайто;.:, что яршшит к пониженному уровню о2 «РНК. Thein et al (1988), изучавшие рассматриваемую намп нелелециош1ую а-талаосеиическую мугаиию среди пациентов из Саудовской Арабии, предположили, что удлиненный аномадькый а2 транскрипт значительно уменьшает экспрессию ог1 гена путем транскрипционного взаимодействия между сЗ. и а1 генами. Исходя из анализа литературных данных, возможно следующее объяснение наблюдаемой нами ^яжелой клиники у нациента и легкой клинической картины у простои гстерозипоты го Нв ТауЬе. М^тгиия в polyA с2 гена приводит к значительному снижению экспрессии о2 гена, а также к уменьшению экспрессии <*1 гена вследсгвии транскрипт юнноге вззтшсйсгаия. В то же время, экспрессия а1 гена с лелепией 38/39 треонина приводит к образованию силыюнесгабилитй а цепи. Таким образом, при возникающем недостатке а пели, 0 цепь объединяется лаже с нестабильной а пенью и ажжальиый ' вариант выявляется в периферической крови. В случае щясгой гетсрознготы по Ив ТауЬе экспрессия а генов находится в норме, а нестабильная а цепь

быстро подвергаете* нротгагнггической деградашпц поэтому аномальный Нв ис выявляется в периферической кропи TjjaiiimtoiiiiHMH .методами белковой .химии.

аиовека

В ходе выгюл»ения диссертационной |яботы были установлены- ыедуюшие особенности иагальзоьаиия оттмизированшх параметров ПНР и шквенса глобиновых генов по Чявнению г. методами батковой химии для идентификации мутаций в аномальных Uns:

— сокращение количества стадий и, как следствие, временных и материальных затрат для установления мутаиий:

— дифференциация мутаций в дуплитшровмных генах (а2, о]), которые приниинально невозможно усганояпъ методами белковой химии:

— высокая частота нуклеотидных мутаций по сравнении с аминокислотными заменами, т.к. одна и та же аминокислотная замена в а цепи Ив может быть вы.шна разными нулеотидныии мутацндии в а2 или al дупллцированных генах.

Перечисленные цхимущества позволили эффективно провести идентификацию нового гемоглобинового варианта — Нв Сара (al 94(G1)Asp->Giy). Белковый структурный анализ выявил с помощью метода обращенно-фазовой ВЭ/КХ наличие аномального пептида: aXT-lL Последующий аминокислотный анализ петте» не давал однозначного ответа о точной докализаиий замены, 1Юсколысу заменяемый аминокиоютный остаток несколько раз повторялся в разных положениях пептидной последовательности. Так, аминокислотный анализ пептида ciXT-Il преднолат-ал замену Asp->Gly либо в иоложениу 94. либо 97 а—глобиновой имя Дзд того чтобы решить вопрос о локализации мутации, было необходимо провести сиквенс аномальных пептидов. Поскольку этот метод является трудоемким и многостадийным, то проблема локализации мутации была эффективно peiueiÄ- с помощью ПЦР и сиквенса амплифиаированных фрагментов а генов. В случае а глобиновопо варианта мутация теоретически может локализоваться как в al, так и в з2 генах. Было ноказаиа что al и о2 глобиновые гены показному экспрессируются в нормальных ретикулошггах, те. соотношение мРНКа2 : мРНКа! равно 28 (Liebhaber et al., 1986) или 26 {Molchanova, Pobedimskaya et al., 1994). Потгому аномальные Uns с мутациями e o2 к ol генах характеризуются разным процентным содержанием в периферической крови: al а среднем 19.9% и а2 в среднем 235%, что было показано нами ка большом сшисгк-юском материале по идентификации 2А- разных а глобиковых вариантов (Molchanova, Pobedimskaya et al, 1994). Однако меньшее отличие в 1-I.7 раза кш1ичественного отношения продуктов трансляции а2 и al мРНК не отражает сильного различия в 26-23 раза уровня .экспрессии а2 и а! генов. Наблюдаемое выравнивание или нивелирование процентного содержания а2 и al глобиногых вариантов в периферической крови можно объяснить на оаюое двух известных наблюдений: большей эффективностью трансляции al мРПК по цхх&нтш> с a2 (Liebhaber et al., 19S2) и образованием и тор\-,<.;

нестабильного удлиненного на 40% по сравнению с al мРНК транскрипта о2 мРПК (Owczarek et a;., 1S92). Причиной разного у|х>пня транскрипции «2 и al мРНЬС могут Сыть различия в нуклтгилиой постелоштелы.'ости обоих генов в З'-коннеиой области, посколысу ода штиет гажьую ран, в синтезе мРНК: тсрминации "пинскрншши и проиеаэшге (Manley et al., 1994).

Пролентное подержание нового а варианта, идентифицированного нами и названного По. Сара, составило 16% но данным разделения Ни метод™ катнонообменной ГОЖХ. Исходя из такого низкого мдонента, проводили ПЦР фрагаента al гена. Сиквенаом второго экзона амплифицирснанного фрагмента (795 ilil) была идентифшшрована мутация А на G в кодоне 94, которая приводит к замене аспарагиновой кислоты на глицин.

Идентификация аномального Не Manitoba (a102(G9)Ser->Arg) у, двух разных пациентов иозиолила продемонстрировать следующие преимущества ППР и сикпенса фрагментов глобиновых генов: дифференциация мутаций в дуплгешропанных (a2. al) генах; идентификация не только замены аминокислоты, но и различных нуклеотидных мутаций в al и а2 генах, результируюшихся в одной и тон же аминокислотной замена Пациенты, носители Нв Manitoba, происходили из разных популяшпе Ф- — из Америки (пациент белой расы). П. — из Южной Африки (пациент негроидной расы1 И в том, и в другом случае был проведен белковый анализ. Аномальный Нв и цепь анализировали методами катионообменнон и ОФ ВЭЖХ, причем процентное содержание НвХ и аХ цепи в обоих случаях было разным: ф.—17%,П.—23.9%; Ф.—19%,П. —22%.Аминокислотный анализ установил замену оерина* на аргинин в 102 положении мутантной аХ цепи. Исходя их данных по процентному содержанию аномального Нз и/или_ аномальной цепи, можно было предположить, что у пациентов мутация вероятнее всего локализована в а2 гене. Сиквенс Tjxrncro экзона амнлифшшроиашюго фра!мента а2 гена (783 п.н.) пациента Ф. показал наличие мутации А на С в первом положении ¡02 кодона (AGC->CGC), что соответствует замене Ser->Arg. В тоже время, у пациента П. была идентифицирована мутация С на A (AGC->AGA) в третьем положении 102 кодона амплифяцированного al гена (795 mi.), что соотпетствовало той же аминокислотной имена М\таиия у пациента П. была найдена в гомозиготном состоянии, что может объяснить довольно высокое проиенпюе содержание аномального Нв (23.9%1 Таким образом, были обнаружены две независимые, разные олнонуклеогилные мутапии в «2 и al генах, приводящие к одному и тому же бачковому продукту — На Manitoba. Обнаруженный факт указывает на то, что частота возникновения нуклеотидных мутаций в глобиновых генах выше, чем их фенотипнческое проявлений т.е. один и тот же вариант может кодироваться разными нуклеотидными мутациями как в о2. так и в al генах. Кроме На Manitoba мы идентифицировали еще пять аномальных Hbs с мутациями в а2 и al генах у пациентов да разных популяций Наиболее интересным среди этих случаев для обсуждения представляет Нв G-Philadelphia (a6B(E17)Lys->Asn), которая является очень расп(ххл1ииеннь!ч а вариантом. Rucknagel et al. (1981), изучившие более 70 случаев

гете)яэитот по Ив С-РМаййрМа, показали, что существует Т])и оакиишх распределения Не в у гетерезнтп 25%, 35%, 45%. Гсггерашготы с 35% и 45% мроцагтным содержанием !1п С вчхчаюгея у п()едсташ1телей иярочдик"! расы и харктфда^шся М1!К]х5ш1та)Л1Сй1 и пшохромнон анемией н дефицитом биосинтеза а пепси. Ранее с помощью гибрнд1шшш Саузсрн Слота было пока-ано, что Ив С настедуется с сгтал1соемиег<-2 (делеция 3.7 тлии) в шкмюложении ( -с0) (Заа.тг!а е( а1„ 1 £84)-Различнс между двумя гетерозиготными «оапелытпвмн с 35% и 4ГУЛ Нв С зависит от отсутствия или присутствия второй делеционной у[к»юсомы в ^шк-положении. т.е. сМ-3.7Уаа или »2{-3.7)/'а(-371 Таким образом, гетеглиготы с 35% Нв в имеют три а гена, в то время, как гетерозигош с -15% Нй 6 — аса о той. С другой сторопи. били найдены случаи простого гетерозиготного носительсгва Ни й (25-26%; среди итальянских семей, которые характеризуются наличием четырех а генов (ас^/с-у или а$и/аа). Поскольку генотип аа^1аа или аеи/аа был найден только у представителей бе;*»: расы, а а^-ЗЛИоа иш: аОД.7)/о<-3.7) среди п/Ачставителей негроидной расы, то Баагга1а е( а!. (1984) предположили существование двух независимых организации гетершлготаопо носительсгва Нв в, специфичных для определенной расовой ют этнической группы. Ми разрешили эту долго обсуждаемую в л.гтературе (с 1981 г) проблему, илаптфчшровав две незазиа!мые олионуклеагилные мутации в о2 и а! га ¡ах. которое приводят к одной и той же аминокислотной замше аспарагина на лизиь ь кодоне 68 (Мо1с1тапоуа е1 а!., 1994). С помошыо ПНР и сиквенса фрагмента а2 гена било показано, что гетерозиготный носитель по Нв в с 25% распределением имеет мутацию С на А в ей гене (а^а/аа). Эта мутация была обнаружена у пациента и ребенка итальянского ' \ • происхождения. В то же время мутация С на - С в «1 гене была найдена у пациента ¡юретянской расы. носитель 33% Нз в и огтзласаемии-2. т.е. аЬ(-3.71/аа. Мутация А АС на АД С специфична для <х2а\ гибридного гена, который является результатом делении размером 37 тли. между о2 и а1 гсиаш. Таким об|1азом, различное процентное содержание НвС в пзтерозиготах у представителей |изных расовых групп можно объяснить существованием двух независимых одненуклеотидцых мутаций п а2 а! и а2 генах, ведущих к одной и той же аминокислотной замене. Содержание Нав в количестве 25-26% отражает (¡[«имущественную экспрессию а2 гена. В то же п|хз«я наличие 3335% Нв в характеризует присутствие трех а генов, что является результатом огталагхЕмии-2.

Таким образом, ПИР и сиквеис • ампдифитрованиых фрагментов позволяет идентифицировать мутации в о2 и а1 генах, что недоступно с помощью белкового структурного анализа. Анализ новейшей литературы показывает, что всего с использованием сикненса модифицированного а гена идентифицировано лишь 15-20 а вариантов, в то время как все остальные (145-150) выявлены с. помощью белкового структурного анализа. который яаляется мпогалалишплг. трудоемким и не падоляет установить, в каком из а генов локалиэогсна мутация. Преимущественное использование в настоящее время методов белковой химии для идентификации о вариантов объясняется

тем. что а гемм трудно амилнфиинруются. поскольку характеризуются необычно высоким содержанием GC-imp (7(ШГ.и). GC-богатие области характеризуются итйюстабилыюстью и тенденцией к ргашмвиции с образованием вторичных структур тем самым »[хянтггвуя шж'ту щийщюн с мацпшей и ¡ххнатн полимеризации. Утл предложен ряд методов оцхиг-лении структуры а глобинопого локуса. которые в оаювпом включали изолщювание а им юн с помсяпью молекулярного клонирования (Liebhaber et al., 1S81; Michelscn et al., 1983) или гибридселективной трансляцией a2 и al мРНК (Liebhaber et al., 1956). Нам надставляется, что альтернативным подходом является селективная амплификация ф[Х1гмснтов <х2 и al генов с помощью ПИР. Поскольку основные трудности. связанные с указанным подходом мотут быть отнесены к большей степени гомолопгшости и большему подержанию GC пар, то для амплификации а генов в основном идамьзовались трудоемкие методы, включающие мной »ступенчатую ПНР или многостадийное выделение ПНР продукта. Так. Zeng et al. (1992) предложили метод амплификации фрагментов а генов, включаюший три стадии ПЦР, сопрооождзюшиеся выделением специфического двухцепочечного фрагмента ППР. из нгакоплавяшейся агарозы с последу¡оши.4 сикве,!сон Thein et al. (1991) .щхуложилн иа1Ш1Ьзоватъ биотинили|юванный праймер для ПНР а геноп и получать олноцепочечную матрицу путем ее иммобилизации на магнитных гранулах (Dynabsads М-280 Streptavidin).'. Yuregir et al. (1992) использовали две стадии НИР. сгироиождакшшеся выделением ПНР фрагмента после каждой стадии с помощью Centri.con-ЗО. В противоположность этим трудоемким методам мы разработали простую и эффективную методику амплификации фрагментов а2 и а! генов методом асимметричной НИР. используя выгокоплавкие примеры с температурами плавления между 72 и 710C и высокую температуру отжига (Molchanova. Pcbedimskaya et al., 1994) (Рис.5) . Некоторые авторы для того, чтобы увеличить специфичность ПН!' для GC-богатых последовательностей, используют такие органические растворители. как глицерин или димстилсульфоксид (Д.МСО) (Sarkaretal., 1990). Другие

сх2

I 785 bp |

FAa2,1 ЯАа2

Ех1 Ех2 ЕхЗ*

5'-1 т Г--1 Fггу

IVS-1 IVS-2

S1 S2 S3

Рис."). Стратегия ППРа2 и а1 глтиновых генок FAa2,1 - общий ачплификашюнный forward праймер а.2 и аI тагов. RAo2, RAa1 - reverse праимеры а2 и al генов. S1,S2,S3- сиквеиируюшие и|иймеры экзоков 12,1

4h

I-

FAa2,1

"*Ех1

-спи

а1

795 Ьр Ех2

-1

RAa1

ЕхЗ

' !ч~Э П

S1

IVS-1 S2

IVS-2 S3

3

добивались специфичности ШЦ' путем предвар1.¡тельной денатурации Л'(^-матрицы п 0.1 М ЫаОН и 0.4 мМ ЗЛТА (Адагу/а! е1 а1., 1983). М-: использовали фориамил (75%) г. тем. чтобы упеличитъ эффективность отжига Поскольку, предло.;сенная нами

аашметричная ПНР пключасг в себя 35 циклов и идет при высоких. темг^итурах (денатурация: 91°—отжш: 68"—удлинение: 72°; то для стабилизации активности ТачДНК полимеразы использовали Твин-20 ЮЬ%1 Таким обозом. использование высокой температуры отжига (68°С) и добавление формамила (75%) позголили амнлифщировать выоокоспецифкчные ПЦР продукты а2 и «1 генов.

Разработанный нами простой и эффективный мегод ампди.фикаиш фрагмагтов а2 и и1 генов и последующий сиквенс амллифщироьаннцх фр!~.:а1тс,< позволил успешно идентифшмровзть 24 различных а глобнповых гаризнкщ }• 62 иашентог ;.з 10 стран (Мо1сЬзпсуа, РоЬей]гпзкауа е! а!.. 1994).

Возникновение и развитие метода НИР привете к быстрому щюгреосу в развитии наших знаний и понимания различных аи ß талассемических синдромов на молекулярное уровне. а-Талаооемия яаляется широкораспространенным генетическим заболеванием, обусловленным снижением синтеза о- глобиповых цепей п результате различных делешонных или неделениочних мутаций в ii-глобиновсм кластере (Higgs, 19ЭЗ ). Большинстве егталаажмических синдромов воэнмгаст в результате делении одного или двух а геноЕ. Деления размером в 37 tjui. является одной и1 самих распространенных в мире сгталаоаемичсских мутаций, приводящей к делении 3.7 тли. между о2 и al генами и образованию одного cil' ai гибридного гена на лелецйонкой хромосома Стратепт скрининга 3-7 tjul делеции в целом основывалась на рестрикшюнном анализе и использовании ралиоактивно.чеченной а пробы для определения специфических q Фрагментов (Muglia ei a!., 19S3), также на определении соотношения а2 : al мРИК (Liebhaber et al., 1986) или нералиогктивным методом количественного определения соотношений а!8 и fla мРНК. с. помощью окрашивания серебром ПЦР продуктов (Lin et al., 1994). Появление ПШ' открыло широкие возможности для эффективного, нерадиоактивного детектирования сгталассемических мутаций. Bowden et al. (1992) предложили быстрое и эффективное определение с помощью ПШ' нескольких делешонных огталассемичеасих мутаций, распространенных в Юго-Босточной Азии (-SEA) и с Средиземноморье (-MED) и d-2051 используя две пары праймеров, . одна m которых амплифииирует ДНК с нормальной хромосомы и локализуется внутри лелаши, а вторая амшшфицкрует ДНК с аномальной делегированной хромосомы и фланкирует делениоиные точки разрыва. Для каждого образна проводят две параллельные ITLJLP и двух реакционных трубочках. Также особенностью атого метода является использование авторами буфера, содержащего бычий сывороточный слшумип (100 мкг\мл) и ß меркантоэтанол (К) мМ). а также добавление в реакционную смесь ло 10% ДМСО. Мы оптимизировали НИР условия

n

для быстрого специфичного скрининга делении 3.7 tjul П/жпеление 11111' с помощью прайме)*». специфтных для alai гибридного reirá (al forward прайме)) и al reverse прайме])), позволило быст]х> идентифицировать наличие делении .17 tjul Поскольку п ¡хуультле такой делении образуется .. a2al гибридный гон. то амплифнниропанный Фрагмент ПНР размером 1773 пл. служит доказательством наличия делении 37 тлн. С целью выяснения гомозиготного или гетерозиготного носнтельстпа делении п тех же успониях ПНР (температура отжига (VI°С (хзакционный буфер содержит 100 мкг\мл бычьего шпороточиого альбумина и 10 мМ /З-меркаптоэтанола. 75% ЛМСО) Проводили две ПИР с парами праймероа одна из которых специфична для а2 гена, а другая — для al гена. В случае ¡ечерозиготы но делеции амплифинируются два специфичных а2 и al фрагменты, в то время, как в случае гомозиготы амплификация двух специфичных Фрагментов отсутствует, поскольку на двух делецио::ных хромосомах присутствуют только a2al -гибридные гены. Нами были подобраны и оптимизированы условия ПНР для идентификации клинически важного- гибридного Нв Lepare, который вызывает фенотип 0 талаосемии. Хотя носительсгво Нв Lepore фенотипическн и клинически выражается как ¡3 талассемия. однако присутствие 10-15% электрофизически медленно двигающегося Нв позволяет отличить мосительслто аномального Нп и 9 талаосемии. Ив Lepore яредстаиляет собой мутантшй гибридный Нв, о0(шую[;иися в результате неравного (негомологичного) кроосимговера между 5'-концом 5 гена и 3'-концом /3 гена, что приютит к образованию гибридною 6/3 гена и делеиии размером 7 tjui. Поскольку межгенпый кроссинговер может происходить в различных участках 5 или v геноз, то я зависимости от точки кроссинговера образуются три основных типа Нв Lepore. Наиболее известен Нв Lepore Boston-Washington (¿87-/3116), paaipocrpaneniibirt qxyn жителей Средиземноморья. 13се три типа Нв Lepore были идентифицированы с помощью рестрикшюшюго анализа и гибридизации с меченными олигонуклеотидными 5 и 0 пробами (Landos et al., 1987).- Метод ПЦР имеет преимущества над существующим стандартным генетическим анализом в смысле быстроты и надежности результатов и не используя радиоизотопы. Рядом авторов ÍLindeman et al., 1939; Cameschella et al., 1990; Craig et al., "1994) был предложен метол определения Нв Lepore BostonWashington (¿37-/3116) с помощью ПНР. используя праймеры для. 5/3 области кроссинговера. Данный метод был применен анто|)а\1и для пренатзльной диагностики, используя в качестве матрицы ДНК ворсины хориона. ПНР проводили с помощью двух праймероа. позволяющих амплифицировать ДНК фрагмент между нуклеотидом 31 интрона 1 и нуклеотидом 90штрона 2 в S и 50 генах. Ранее было показано, что 6/3 гибридный ген в Нв Lepore Boston-Washington включает интрон 2 целиком полученный от 0 гена (Landos et al., 1987), поэтому используя п ПНР reverse праймер специфичный для интрош 2 0 гена и forward праймер специфичный для 5 гена, можно специфично амплифишчюпать гибридный ген.

Мы предложили и апробировали быстрый, чффективиыл, нерадиоактивный м.-'тол детектирования Lepore ¡0 гибридного mía. Этот метол основывается на амплификации двух лелеционшкленифичных ПИР продуктов. паю. иду я т|)и прайчера: forward прайм.у специфичный дли 5'-коша 5 raw. и .ни reverse прайму«!, один ил которих спотфичо: для 3'-конца 0 гена, а другой — .ил интрона 2 0 гега ¡npañvtep локализован между нуклеотшами 45 и 71 нитрона 21 Использование с елной ПНР всех трех праймёров приводит к tow, что с первий парой праймёров змшшфицирустся фрагмент ¡0 гена размером 1618 mu a on вгопой парой праймёров — фрагмент • ¿0 гена размере?.! 620 пл. Landos et al. (1987) показал, что точка кросоовсра в Ив Lepore Boston-Washinglon находита иежду кодоном 87 5 гена и 5' -конном нитрона 2 (5 гсщ. в облает гомологии размером в 58 пл. Поэтому образование второго короткого фрагмента (620 пл.) указывает на то, что действительно гибридный гел включает интрон 2 от б гена и что точка крооооьера находится на 5'-конце нитрона 2 /5*; гена. Поскольку. нами были оптимизированы простые условия ППР. не включающие.. никаких деполпитсльнич ко^астворов, то этот метод может быть использован для простого скрининга Нв Lepore путем ПЦР и проверки специфичных ПЦР фрагментов с" помощью электрофореза на ara розном геле.

ВЫВОДЫ

1 Впервые для молекулярной диагностики аномалы1ах гемоглобинов челогека предложена универсальная стратегия и онти\; «преданы, экспериментальные условия полимеразной цепкой реакции (ПЦР) для специфической амплификации фрагментов шести глобинешх генов - о2, ul, f¡, G7, А7, 6.

2 Применение оптимИзированнмх пилжоспешфших условий ПИР глобиновых генш в сочетании с сиквенсом позволило расширю ь спектр и ускорить диагьостику гемоглобинопатии, что. особенно эффективно в случае носитедьсгга аномальных ¡íbs, идентификация шгорых затруднена или недоступна традиционными методами белковой химии:

• молагулярная диагностика аномальных Hbs с. низким (2-3%) содержанием в периферической кроши

• молекулярная диагностика высоконестабилшых и'умли талассемичсского типа а и °

вариантов. носительство которых вызывает симптомы гемалитичеосой анемии.

3. Установлена что оптимизированные параметры ППР и последующий сиквснс глобиновых геноо дают значительные преимущества по сравнению с методами белковой химии для идентификации мутаний в аиочалшых Hbs:

• сокращено количество крови (в 50-80 раз!, необходимое для диагностики аномальных Hbs с йизкич тлержа1г>»еч;

• сокращены количество стали» и, как следствие. временные и материальные защиты iii установления мутации:

лмффцмшнрппапм мутации н дуилишцюванпых генах (а2 all. которые нринкишплыю наизможно установить метолами белковой химии:

• впервые гжелериментально подтверждена более высокая частота нуклеотидных мутаций по «шннамю с аминокислотными заменами. Показано, что одна и та же-аминокислотная замена в а непи Нв может быть вызвана разными нуклеотидными мутлшлчи в а2 или al дуплииированном гене.

4. Экспериментально установлена эффективность применения ППР для идентификации лелеционных мутаций в глобиношх генах, обуславливающих носительство талаосемий.

5. Применение ППР и сиквенса фрагментов глобиновых генов позволило в максимально короткий срок (15 гола) диагноашровать около 100 случаев носительства аномальных Hns (из них 10 нозых. 10 нестабильных и 2 выажонесгабилшых а и 0 вариантов), более 20 счучаев а и 0 талаосемических мутаний, 10 стучаев сочетаний носительства аномальных !Ibs и талассемических мутаций у пациентов из 13 стран мира: Россия. США, Турция, Испания. Израиль. Португалия. Германия. Китай. Гон-Конг. Италия. Голландия. Южная Африка, Австралия.

Оаюниыо результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. T.P.Molchanova, Yu.V.Postnikov, D.D.Pobedimskaya, N.S.Smetanina, AAMoscnan, E.G.Kazanetz, Yu.N.Tokarev and T.H.J.Huisman (1993). Hb Alesha or a!pha2beta2 67 (E11) Val->Met A new unstable hemoglobin variant identified through sequencing, of amplified DNA. Hemoglobin, 17(3): 217-227.

2. D.D.Pobedimskaya, T.P.Molchanova, L-H.Gu, M.A.Molina, J.M.de Pablos and T.H.J.Huisman (1993). Hb F-Sacromcnte or alpha2gamma2 59(E3) Lys->Gln observed in Spanish newborn and his mother. Hemoglobin, 17(3):269-275.

3. W-B.Qin, T-LJu, X-L.Yue, X-L.Yan, L-Y.Qin, T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, T.H.J.Huisman (1993). Hb Аг-Liangheng delta 117(G19) Asn->Asp (AAC->GAC): a new delta chain variant detected by gene analysis in Chinese family. Hemoglobin, 17(5); 463-466. ,

4. G.Dincol, D.D.Pobedimskaya, T.P.Molchanova, Z.Ye, B.B.Webber, J.B.Wilson, T.H.J.Huisman (1994). Hb Capa or a mildly unstable variant with an A->G (GAC->GGC) mutation in codon 94 of the alphal globin gene. Hemoglobin, 18(1): 57-61.

5. T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, Z.Ye, and T.H.J.Huisman (1994). Two different mutations in codon 63 are observed in Hb G-Phi/ade!phia heterozygotes. AmJ.af Hemat, 45: 345-346.

6. T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, Yu.V.Postnikov (1994). A simplified procedure for sequencing amplified DNA containing the a!pha2 or aiphal globin gene. Hemoglobin, 18(3): 251-255.

7. D.D.Pobedimskaya, T.P.Molchanova, S.Striechman, and T.H.J.Huisman (1994). Conpound heterozygosity for two a-globin gene defects, Hb Taybs (ol; 38 or 39 minus Thr) and a PolyA mutation (<*2; AATAAA->AATAAG), results in a severe hemolytic anemia. Am.J. of HemaL, 47:198-203.

8. T.P.Molchanova, D.D.Pobedimskaya, T.H.J.Huisman (1994). The differences in quantities of a2- and crl -globin gene variants in heterozygotes. Br.J. of Hemai., 68: 300-306.