Применение новых молекулярно-биологических технологий для выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью

Скотникова, Ольга Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение новых молекулярно-биологических технологий для выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Применение новых молекулярно-биологических технологий для выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью"

На правах рукописи

Скотникова Ольга Ивановна

ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Mycobacterium tuberculosis С МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

V J

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы

Научные консультанты:

академик РАМН, профессор Виталий Ильич Литвинов доктор медицинских наук, профессор Аркадий Максович Мороз

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пашков Евгений Петрович доктор медицинских наук, профессор Червинец Вячеслав Михайлович доктор биологических наук Сафонова Светлана Григорьевна

Ведущая организация: Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова» РАМН, г.Москва

Защита состоится «¿л.// » ¿Л? 2006 г. в -у 7. часов на заседании диссертационного совета Д 208 040.08 при ГОУ ВПО Московской медицинской академий им. И.М.Сеченова Росздрава (119992, г.Москва, ул.Трубецкая, д.8, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской академии им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан « ¿¿3 » 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук , ; " о

профессор Миронов Андрей Юрьевич

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Одной из основных причин повышения заболеваемости туберкулезом является увеличение числа лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, которые определяются как МБТ, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия или отсутствия устойчивости к другим препаратам [Iseman М., Madsen D., 1989; Shinder Dl et al., 1991; Kochi A. et al., 1993; Espinal M. et al., 2001; Gillespie S., 2002].

У больных с впервые выявленным туберкулезом легких уровень Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью колеблется от 1,7% в Барселоне [Tudo G. et al., 2004], 5,0 - 7,0% в Москве [Литвинов В.И. и др., 2004, 2005], до 10,0% в ряде других стран Европы [Nutini S., et al., 1998; van Deun A. et al., 1999; Gonzavez N. et al., 1999], хотя имеются публикации и о более высоком проценте 21,8% в Эстонии [Kruuner A. et al., 1998; Leimane V., Leimans J., 1998],. до 40,0% в отдельных регионах Украины [Чернушенко Е.Ф., Клименко М.Ю., 1999], до 57,7% в Казахстане [Ильина Т.Я. и др., 2003]. По данным А.Г.Хоменко, В.И.Чуканова (1999), А.К.Стрелис и со-авт. (2001), Б.И. Вишневского, Е.Б. Вишневской (2003) в разных регионах.России множественная лекарственная устойчивость Mycobacterium tuberculosis в 2001 году зафиксирована от 8,0% до 61,0% у впервые выявленных больных.

В Москве у больных с хроническим течением туберкулеза легких, обнаруживают Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в пределах 13,0 - 15,0% [Сельцовский П.П. и др., 2005]. Эффективность лечения больных с множественно-лекарственно устойчивыми Mycobacterium tuberculosis составляет не более 50,0% [Coninx R. et al., 1999; Dye С. et al., 2002].

той стандарт»), хотя известно, что Mycobacterium tuberculosis вырастают на них не раньше, чем через 4-6 недель. Применение автоматизированных систем с использованием жидких сред [МВ/ВасТ или Bact/Alert 3D (BioMerieux) и Bactec " MGIT 960 (Becton Dickinson)] сокращает время выделения возбудителя до 2 - 3 недель [Rohner Р. et al., 1997; Brunello F., Fontana R., 2000; Somoskovi A. et al., 2001].

Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, в зависимости от применяемого метода, удлиняет время анализа еще на 1 - 3 недели и, как правило, больным назначают противотуберкулезные препараты независимо от того каким штаммом они заражены, хотя подбор схемы лечения, учитывающей характер чувствительности Mycobacterium tuberculosis у больного, в значительной степени определяет ее эффективность [Егоров A.M. и др., 2000; Соколова Г.Б. и др., 2000; Мишин В.Ю., 2001, 2005]. Кроме того, известно, что 6,0 - 7,0% пациентов, у которых выявляли Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, умирают от лекарственной непереносимости и более чем у 16,0% из них развивается почечная недостаточность [Мишин В.Ю. и др., 2005; Olle-Goig I.etaL, 1999].

Таким образом, вопрос разработки и внедрения экспресс-методов детекции и определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis, остается одной из самых актуальных проблем фтизиатрии.

В последние годы, в связи с внедрением в практику фтизиатрии методов молекулярной биологии, которые отличаются быстротой анализа, высокой чувствительностью и специфичностью, выявление микобактерий и определение их генотипических характеристик значительно облегчает постановку диагноза и назначение больному адекватного лечения. На данный период времени расшифрован геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv, который имеет длину 4411529 пар нуклеотидов и включает в себя примерно 4000 генов [Cole S. et al., 1998]. Для ряда генов известны мутации, ответственные за изменение феноти-пических свойств микобактерий, связанных с возникновением резистентности к

противотуберкулезным препаратам. Установлено, что Mycobacterium tuberculosis с различными типами мутаций требуют для предотвращения размножения разные дозы лекарственных препаратов [Williams D. et al., 1998; Stepanshina V. et al., 1999; Van Soolingen D. et al., 2000].

В настоящее время известно, что резистентность к изониазиду определяется мутациями в 4 основных генах: katG, inhA, ahpC/oxyR, kasA и еще некоторых других, менее изученных: fur A, ndh [Rouse D. et al., 1995; Musser J., 1995; Blanchard J., 1996; Rapiti E. et al., 1998; Riska P. et al., 2000; Zhang Y. et al., 2005].

Более 95% случаев резистентности к рифампицину у больных туберкулезом обусловлено мутациями в коротком фрагменте (81 пара нуклеотидов) гена гроВ, кодирующего /?-субъединицу РНК-полимеразы Mycobacterium tuberculosis [Генерозов Э.В. и др., 2003; Telenti A. et al., 1993; Kapur V. et al., 1994; Ramaswamy S., Musser J., 1998; Chaves F. et al., 2000].

Для выявления мутаций в молекулярной биологии применяют, как правило, сочетание нескольких методов. Прежде всего, это стадия полимеразной цепной реакции, с помощью которой происходит клонирование исследуемой части ДНК, и далее анализ полученных ампликонов с помощью рестриктаз, методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов или различньмй видами гибридизации с соответствующими олигонуклеотидами. В большинстве случаев с помощью этих методов мутации в исследуемой области ДНК только выявляются. Для определения типа мутаций вводятся дополнительные стадии, что делает анализ более длительным [Патрушев Л.И., 2000] или используют дорогостоящие методы секвенирования, не имеющие в настоящее время практической перспективы.

В Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН под руководством академика А.Д.Мирзабекова была разработана технология биологических микрочипов, кардинально изменившая возможности молекулярно-диагностического анализа Mycobacterium tuberculosis [Mikhailovich V. et al., 2001]. С помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» можно определить чувствительность

к рифампицину, а «ТБ-БИОЧИП» предоставляет возможность одномоментного выявления чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изо-ниазнду с определением 29 типов мутаций к первому препарату по гену гроВ и 19 типов мутаций ко второму препарату по генам katG, oxyR, inhA. Этот метод в 2004 году получил регистрационное удостоверение Федеральной службы РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Принципиальным преимуществом этих тест-систем являются сроки получения результатов (48 часов) при сохранении 95% чувствительности и специфичности при выявлении Mycobacterium tuberculosis и определении ее лекарственной устойчивости.

В то же время, с помощью используемых молекулярно-генетических методов выявляется не весь спектр мутаций в целом ряде генов Mycobacterium tuberculosis, ответственных за множественную лекарственную устойчивость, нет единого технологического протокола всех этапов выполнения молекулярных исследовании, позволяющих определить множественную лекарстве1шую устойчивость, и совершенно нет данных о возможности их применения в кли-нико-лабораторной практике фтизиатрических учреждений.

Цель исследования

В связи с вышесказанным, целью данного диссертационного исследования являлась разработка и внедрение в практику единого протокола использования в клинике молекулярно-биологических экспресс тест-систем, позволяющих выявлять Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью у больных туберкулезом, и доказательство их принципиальных преимуществ перед общепринятыми микробиологическими методами.

Задачи работы

1. Разработать технологию забора и обработки проб диагностического материала для выделения ДНК Mycobacterium tuberculosis для эффективного определения их чувствительности и/или резистентности к изониазиду и рифампицину.

2. Адаптировать метод гетеродуплексного анализа для выявления резистентных к рифампицину Mycobacterium tuberculosis путем определения мутаций в гене гроВ.

3. Оценить возможность применения в клинико-лабораторной практике метода биологических микрочипов для выявления резистентных к рифампицину Mycobacterium tuberculosis на чипах «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)».

4. Разработать собственную тест-систему для выявления устойчивых к изониазиду Mycobacterium tuberculosis в генах katG, inhA, oxyR/ahpC, kasA с наиболее распространенными мутациями, на основе полимеразной цепной реакции и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов Single Strengh Conformation Polymorfism (SSCP).

5. Адаптировать для клинико-лабораторного применения тест-систему «ТБ-БИОЧИП», основанную на определении в Mycobacterium tuberculosis типа мутаций, ответственных за множественную лекарственную устойчивость.

6. Изучить , молекулярно-генетические особенности Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, характерных для жителей Московского региона, Астрахани, Нижнего Новгорода, Саратова, Республики Молдова (Кишинев) и Казахстан (Алматы).

Научная новизна работы

Разработана и практически апробирована технологическая цепочка забора, обработки различных биологических образцов и выделения из них ДНК Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом, как основополагающий этап для, эффективного определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам (патент № 2231790 от 27 июня 2004 г. «Способ обработки цельной крови для выявления ДНК микобактерий туберкулеза методом ПЦР»; патент № 2163022 от 28 мая 2001 г. «»Способ диагностики туберкулеза»).

Посредством подбора условий пробоподготовки расширены возможности использования других биологических секретов, кроме мокроты, для выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в различном биологическом материале.

Впервые для определения резистентности к изониазиду применен метод SSCP по определению мутаций сразу в 4-х генах (патент № 2200323 от 29 августа 2001г. «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к изониазиду с помощью ПЦР и конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов»).

Впервые для определения чувствительности jL-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину применен метод «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» (патент № 2263149 от 27 октября 2005г. «Способ определения лекарственной чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину»)

Впервые использована система множественного генетического зондирования различных биологических образцов для выявления чувствительности к рифампицину и изониазиду в бактериальной и ¿-формах Mycobacterium tuberculosis методами гетеродуплексного анализа, конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов и биологических микрочипов.

Впервые в одном штамме Mycobacterium tuberculosis удалось одновременно определить мутации по пяти генам, ответственным за резистентность к рифампицину и изониазиду.

Впервые с помощью технологии биологических чипов проведено моле-кулярно-генетическое паспортирование штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, характерных для Московского региона, Астрахани, Саратова, Нижнего Новгорода, Республики Молдова (Кишинев) и Республики Казахстан (Алматы).

Практическая значимость работы Практическая значимость работы заключается в разработке технологической цепочки забора и обработки разных биологических образцов и выделения из них ДНК Mycobacterium tuberculosis.

Используется в клинико-лабораторной практике собственная тест-система «Нестед-ПЦР» для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса у больных туберкулезом, которая пригодна для любого биологического

материала и отличается от коммерческих низкой себестоимостью и более высокой чувствительностью.

Разработана и апробирована для практического применения собственная тест-система выявления устойчивых к изониазиду Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом методом конформационного полиморфизма одноцепо-чечных фрагментов по генам katG, inhA, oxyR/ahpC, kasA.

Адаптирован метод гетеродуплексного анализа для определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину по гену гроВ.

Адаптированы для клинико-лабораторной практики биологические микрочипы для выявления устойчивых к рифампицину Mycobacterium tuberculosis с помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» и выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, устойчивых одновременно к изониазиду и рифампицину, с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП».

Определены молекулярно-генетические характеристики Mycobacterium tuberculosis, выявляемые у жителей Московского региона, Астрахани, Саратова, Нижнего Новгорода, Республики Молдова (Кишинев) и Республики Казахстан (Алматы).

Положения, которые выносятся на защиту

1. Доказана важность дифференцированного подхода при выборе метода, применяемого для обработки биологических образцов и выделения ДНК

Mycobacterium tuberculosis, в зависимости от целей исследования.

: • . t «'

2. Определена возможность выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в образцах, взятых от больных с разными формами туберкулеза в динамике лечения.

3. Показана эффективность использования метода гетеродуплексного анализа для определения устойчивых к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis.

4. Осуществлена адаптация метода биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» для выявления устойчивых к рифампицину Mycobacterium tuberculosis.

5. Установлена возможность применения метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов для выявления мутаций в генах katG, inhA, oxyR, has А, ответственных за резистентность к изониазиду.

6. Разработана клинико-диагностическая цепочка, состоящая из этапов обработки диагностических образцов и выделения ДНК для наиболее эффективного применения тест-системы «ТБ-БИОЧИП», определяющей Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

7. Осуществлено молекулярно-генетическое паспортирование резистентных к рифампицину и изониазиду штаммов Mycobacterium tuberculosis из различных регионов Российской Федерации и ряда стран СНГ.

Внедрение в практику

Результаты диссертации используются в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы и в Институте молекулярной генетики РАН для выявления Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР в различном диагностическом материале от больных разными формами туберкулеза на разных стадиях лечения. Адаптированный метод гетеродуплексного анализа применяется для определения штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов применяется для характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к изониазиду по четырем генам (katG, inhA, oxyR, kasA) в МНПЦБТ. Для одномоментного выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, применяются биологические микрочипы «ТБ-БИОЧИП». С их помощью также производится молекулярно-генетическое паспортирование штаммов Mycobacterium tuberculosis, то есть в МНПЦБТ создается банк штаммов Mycobacterium tuberculosis с определенными типами мутаций по исследуемым генам.

Материалы диссертации использованы при составлении методических рекомендаций «Выявление ДНК микобактерий туберкулезного комплекса методом «Нестед-ПЦР» в различных биологических пробах», М. (2001).

Апробация работы Материалы диссертации доложены на IV съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров, Йошкар-Ола (1999); 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва (2000); конференции памяти профессора М.М.Авербаха «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы», Москва, (2000); Первой Российской научно-практической конференции с международным участием «Нозокомиальная туберкулезная инфекция», Москва (2001); конференции к 75-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы (2001); Международной конференции «Туберкулез - старая проблема в новом тысячелетии», Новосибирск

(2002); Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва (2002); 12 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва (2002); VI ¡Российском съезде фтизиатров, Москва ( 2003); 13th Annual Congress of European Respiratory Society, Vienna

(2003); 11 International Congress on Infectious Diseases, Mexico (2004); 15 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания и 1-й Учредительном конгрессе Евроазиатского Респираторного общества, Москва (2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 монографии, получено 4 патента.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения, выводов. В тексте содержится 31 таблица и 18 рисунков. Библиография включает 298 источников литературы, из них 66 на русском и 232 на иностранных языках.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Были обследованы 2320 больных, находившихся на лечении в МНПЦБТ, туберкулезной клинической болыщце № 3 и противотуберкулезных диспансерах Москвы и Московской области с диагнозом туберкулез легких и 340 больных с другими диагнозами.

В качестве материала для исследования были взяты клинические культуры Mycobacterium tuberculosis (МВТ), выделенные из различного биологического материала, взятого от больных туберкулезом. Всего было проанализировано 2856 штаммов МВТ, выращенных на плотной среде Левенштейна-Йенсена и/или на жидкой среде 7Н9 с помощью автоматизированных систем МВ/ВасТ и Bactec MGIT 960. Также было исследовано 1500 различных биологических секретов (мокрота, плевральная жидкость, бронхоальвеолярные смывы, спинномозговая жидкость, кровь и т.д.).

Диагностический материал с МВТ перед посевом на плотные и жидкие среды подвергали обработке для концентрирования МВТ и деконтаминации образца согласно требованиям, предъявляемым фирмой-изготовителем.

Выделение ДНК для проведения ПЦР на «Cobas Amplicor» проводили по инструкции фирмы Hoffman La Roche.

Выделение ДНК для «Нестед-ПЦР» осуществляли в собственной модификации [Скотникова О.И. и др.,1999].

Подбор праймеров для тест-систем осуществляли с помощью программы OLIGO ver.4.0.

Амплификацию на «Cobas Amplicor» проводили по инструкции фирмы Hoffman La Roche.

Двухэтапную «Нестед-ПЦР» (Н-ПЦР) проводили в соответствии с ранее описанным методом [Скотникова О.И. и др. 2001].

Специфичность «Н-ПЦР» проверяли на коллекционных штаммах мико-бактерий туберкулезного комплекса (M.tuberculosis, M.bovis, M.bovis BCG, M. microti), нетуберкулезных микобактерий (М. fortuitum, М. kansasii, М. terrae, М.

avium, M.gordonae) и других микроорганизмах, являющихся частью нормальной или патогенной флоры дыхательных путей. Штаммы были получены в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

Выявление мутаций в гене гроВ МВТ методом гетеродуплексного анализа проводили в собственной модификации [Исаева E.JI. и др., 2001].

Определение мутаций в генах, ответственных за резистентность к изо-ниазиду: katG, oxyR/ahpC, inhA, kasA проводили методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.

Для синтеза нужных фрагментов ДНК МВТ различных генов использовали следующие праймеры:

Для гена katG - 1 -й 5 ' ССС CGA АСС CGA GGC TGC Т 3 ', 2-й 5' CCA GCA TCG TCG GGG AGC G 3'. Для гена ahpC - 1-я 5' ТСТ ССТ CAT CAT САА AGC GG 3',

2-й 5' CTG CTG AAC CAC TGC TTT GC 3 Для гена inhA - 1-й 5'CGT AAC ССС AGT GCG AAA G 3',

2-й 5'ACT GAA CGG GAT ACG AAT GG 3\ Для гена kasA - 1-Й 5' GGC GAC GCG GAT GGC GTT 3',

2-й 5' TCG AGA CGG AGG AGC ACG CCA A3'. Режим амплификации: 1-й этап: 95°C - 5 мин., 60°C - 2 мин.; 2-й этап: 72°С - 1 мин., 95°С - 40 сек., 60°С - 1 мин. (35 циклов); 3-й этап: 72°С - 10 мин. Для денатурации 3 мкл образца смешивали с 3 мкл денатурирующего раствора и прогревали при температуре 95°С 10 мин. Разделение денатурированных ам-пликонов проводили с помощью вертикального электрофореза, в 8% полиакри-ламидном геле с 5% глицерином, при температуре 8°С, напряжении 450 вольт, 5 час., в ТВЕ-буфере, pH 8,0. Окраску проводили 0,1% AgN03 (100мл) в присутствии 100 мкл формальдегида. Проявляли 0,28М Na2C03 в присутствии 100 мкл формальдегида при комнатной температуре. Окраску красителем SYBR GREEN проводили в ТЕ-буфере, pH 7,8, 80 мин при комнатной температуре. Наличие мутации фиксировали в том случае, если расстояние между двумя ни-

тями денатурированной ДНК исследуемого штамма МБТ отлично от расстояния между двумя нитями денатурированной ДНК МБТ чувствительного типа.

При применении красителя SYBR GREEN электрофореграмму помещали под ультрафиолетовый трансиллюминатор, длина волны - 254 нм. Окрашенные денатурированные ампликопы представляли собой две белые полоски. В случае окраски Ag2N03 результаты интерпретировали в видимом свете.

Определение чувствительности МБТ к рифампицину и с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) проводили с помощью биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» и «ТБ-БИОЧИП» соответственно, согласно требованиям фирмы изготовителя («ООО Биочип-ИМБ»).

Чувствительность МБТ к рифампицину и изониазиду определяли методом абсолютных концентраций (приказ Минздрава от 21 марта 2003 г. № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий»).

Чувствительность к рифампицину ¿-форм МБТ определяли по описанной ранее методике [Бадлеева М.И. и др., 2005].

Секвенирование проводили с использованием «Dye Deoxy Sequencing Kit with Amplitaq Polymerase FS» (Perkin Elmer) на автоматическом секвенаторе ABl 373А фирмы «Applied Biosystems».

Для оценки статистической значимости различий между сопоставляемыми величинами (количество исследуемых вариантов) использовали критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при р < 0,01, высоко достоверными при р ~ 0,001 и недостоверными при р > 0,05 (программа Matlab, версия 6,5). Если разница между двумя величинами составляла не более 2,0%, то она считается достоверной.

Кроме того, для каждого из методов просчитывали чувствительность, специфичность, эффективность, прогностическую значимость по резистентности, прогностическую значимость по чувствительности.

Основные результаты и их обсуждение Влияние подготовки образцов ДНК и характера туберкулезного процесса на определение множественной лекарственной устойчивости Mycóbacterium tuberculosis

' "Применение молекулярно-биологических технологий для определения чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП), позволяет за короткий срок провести лабораторную диагностику с высокой чувствительностью и специфичностью.

Чувствительность тест-систем тем выше, чем чаще встречаются в геноме МБТ последовательности, которые берутся в качестве мишени. Кроме того, характер биологического образца (мокрота, лаваж, кровь, спинномозговая жидкость и т.д.), качество и время его забора, способ обработки образца, наличие ингибиторов амплификации и другие факторы, достаточно сильно влияют на полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и могут изменить показатели любой тест-системы. Кроме того, выявляемость ДНК МБТ и возможность определения ее МЛУ, во многом зависит от формы туберкулеза и эффективности проводимого лечения. 5 1

Для выделения МБТ использовали NaLC с NaOH с последующим центрифугированием и 2-кратным отмыванием осадка буфером Трис HCL, с 1% тритоном, рН 8,0 с дальнейшим его прогреванием при 95°С - 20 мин, в том же буфере при рН 8,8, что явилось достаточным для применения выделенной ДНК в ПЦР. Метод очень эффективен для лабораторных исследований [патент № 2002125199 от 23 сентября 2002 г.].

Метод выделения ДНК сказывается и на эффективности определения мутаций, ответственных за резистентность к рифампицину и изониазиду в ДНК МБТ. По крайней мере, обработка образцов разными методами показала, что при выделении ДНК МБТ с сорбентом могут теряться штаммы МБТ с определенным типом мутаций, ответственных за резистентность к ПТП. Подобный факт важен для больных инфицированных несколькими штаммами МБТ, которые отличаются по чувствительности к ПТП. В таблице 1 представлены варй-

анты «потерь» на сорбенте штаммов МБТ, имеющих те или иные мутации, ответственные за резистентность как к рифампицину, так и к изониазиду.

Таблица 1

Влияние метода выделения ДНК из Mycobacterium tuberculosis для определения мутаций в генах, ответственных за резистентность к рифампицину и изониазиду, с помощью биологических микрочипов

№ Гены Метод выделения

без сорбента с сорбентом

1 RpoB 533Рго 531 Leu

KatG 315Thr 315Thr

AhpC Ч Ч

KatG 315Thr -

2 RpoB 531Leu 531Leu

3 RpoB 531 Leu Ч

Кровь - биологический образец, который кажется универсальным диагностическим материалом для анализа на содержание любого инфекта, но известно, что гемоглобин мешает процессу амплификации. Собственные исследования показали, что если выделять ДНК МБТ из цельной крови, а не из лимфоци-тарной фракции, например, с цитратом натрия, или в кровь добавлять №11С с ИаОН в соотношении 5:1с последующей отмывкой в ТЕ-буфер рН 7,6, затем в ТЕ-буфере с рН 8,0, затем в буфере рН 8,0 с 1% тритоном, то процент выяв-ляемости повышается на 25%. По нашим данным вполне достаточно. 3 - 5 мл крови для определения ДНК МБТ у больных с генерализованным процессом.

Ранее для выявления ДНК МБТ использовали, как правило, одноэтапные методы. С целью повышения чувствительности и специфичности применяемых методов, в настоящее время в лабораторной практике чаще используют двух-этапные подходы. Для выявления микобактерий туберкулезного комплекса, на данный период времени существуют зарубежные тест-системы, выпускаемые

фирмами «Hoffmann La Roche», «Gen-Probe Inc» и др. и ряд отечественных тест-систем.

Нами создана двухэтапная тест-система, основанная на выявлении последовательностей /£6110. Анализ занимает до 4 часов. Два этапа амплификации нивелируют недостаточную очистку ДНК, допущенную при обработке клеток, увеличивая эффективность выявления МБТ на 30,0%. По чувствительности эта тест-система эффективнее «Cobas Amplycor», и при этом гораздо дешевле.

Фактором, влияющим на выявляемость ДНК МБТ, может быть неудачный забор образца. Нами было показано, что двухкратный забор образца ДНК МБТ увеличивает выявляемость на 17,0%, трехкратный - еще на 5,0%. Объединение неоднократно забранных образцов от одного больного может увеличить вероятность выявления ДНК и определения ее лекарственной чувствительности.

Большое значение для выявления МБТ имеет форма туберкулеза. Именно поэтому у больных фиброзно-кавернозным и инфильтративным туберкулезом процент выявляемости гораздо выше, чем в случаях очагового процесса или туберкулемы. Но даже у больных с активным процессом выявляемость зависит от стадии лечения -

Эффективность выявления ДНК МБТ методом ПЦР на всех этапах лечения всегда выше, чем методами бактериоскопии и абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена.

Определение чувствительности к рифампицину и изониазиду одного штамма МБТ ранее проводили, как правило, для генов гроВ и katG и по кодо-нам, в которых мутации встречаются чаще - это 531 и 315, соответственно.

Молекулярная биология предлагает целый ряд методов для определения типа мутаций в генах [Патрушев Л.И., 2000; Скотникова О. И. и др., 2002; Мельников H.H. и др., 2005; Скотникова О. И. и др. 2005; NachamkinT. et al., 1997; Watterson S. et al., 1998; Gonzalez N. et al., 1999; Shi R. et al., 2005].

Изучение чувствительности к рифампицину в МБТ методом гетеродуплексного анализа и методом абсолютных концентраций на плотных средах по-

казало 97,0% совпадений полученных результатов. В то же время, важнейшим преимуществом метода гетеродуплексного анализа является то, что для получения результата требуется всего 1-2 дня, в то время как методом абсолютных концентраций - несколько месяцев.

Было установлено, что количество штаммов МБТ, определенных как резистентные и чувствительные к рифампицину, почти одинаковое как для культур, выделенных от больных, так и для МБТ, выделенных из диагностического материала. Методами гетеродуплексного анализа можно определить чувствительность к рифампицину в тех штаммах МБТ» которые впоследствии могут не вырасти на плотных средах.

Исходя из описанных данных, были установлены основные характеристики, обосновывающие возможности использования гетеродуплексного анализа (в качестве сравнительного стандарта был взят культуральный метод абсолютных концентраций): чувствительность - 98,2%; специфичность - 82,3%; эффективность - 94,0%; прогностическая значимость по устойчивости - 88,9%; прогностическая значимость по чувствительности - 90,3%.

С помощью гетеродуплексного анализа нами было получено 16 типов мутаций в гене гроВ штаммов МБТ, характерных для больных проживающих в Московском регионе [Скотникова О.И. и др., 2000, 2001, 2002]. Для 70,0% изучаемых штаммов МБТ наиболее характерными были мутации в 531 ко доне, в 15,3% - в 526 и 7,0 % - в 516. В других кодонах мутации были представлены единичными случаями.

В то же время, этот метод имеет определенные недостатки, прежде всего, могут возникнуть трудности связанные с выращиванием плазмиды, являющейся универсальным гетеродуплексным генератором. Возникали сложности для разделения некоторых мутаций, особенно встречающихся в одном кодоне (His526>Asp и His526>Tyr), которые имели близкую подвижность на электро-фореграмме и для их разделения было необходимо изменение условий электрофореза. При использовании гетеродуплексного анализа не всегда удавалось выявить ряд мутаций: 516Gly, 533Leu, 511 Arg. Для их определения также бы-

ло необходимо изменение процентного содержания акриламида в геле. Кроме того,! для определения типа мутации надо иметь набор ДНК МБТ, имеющих в исследуемом кодоне аналогичные мутации, или, лучше, проводить секвениро-вание каждого образца.

Принципиально новым подходом для решения проблемы определения штаммов МБТ устойчивых к рифампицину явился биологический микрочип «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)», созданный в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН и определяющий наиболее встречающиеся мутации в гене гроВ МБТ (исследовались 10 кодонов с 28 типами мутаций). Микрочип представляет собой матрицу, состоящую из ячеек полиакриламидного геля, нанесенных на предметное стекло и содержащих олигонуклеотидные зонды [Михайлович В.М. и др., 2000; М1к1ш1ктс11 V. а а1., 2001].

При адаптации биочипов было проанализировано 330 образцов ДНК, выделенных из биологических проб и культур МБТ, полученных от больных с разными формами туберкулеза. Наблюдался высокий процент совпадения (93,0%) в определении чувствительности рифампицина с помощью посева на среде Левенштейна-Йенсена и биочипов для одних и тех же штаммов МБТ. Секвенирование подтвердило полученные данные.

Сравнение методов гетеродуплексного анализа и «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» показало, что результаты определения чувствительности к рифампицину как в ДНК МБТ культур выделенных от больных, так и из биологических образцов были почти одинаковы, но не всегда методом гетеродуплексного анализа можно определить тип мутации. Например, на электрофореграмме, демонстрирующей разделение гетеродуплексов, была зафиксирована мутация, но по типу расхождения гетеродуплексов не было понятно какая (табл. 2), биочип выявил двойную мугацию Ьеи511>Рго Н1$526>А5р, секвенирование подтвердило ее наличие. Такая же ситуация наблюдалась и для мутации другого типа (№з526>А8р).

Таблица 2

Варианты мутаций, ответственных за резистентность к рифампицину, определенных в одних и тех же биологических пробах методом гетеродуп-лексного анализа и на «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» в Mycobacterium tuberculosis

№ варианта Определение мутаций в гене гроВ

на «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» методом гетеродуплексного анализа

1 Ser531>Leu Ser531>Leu

2 Чувствительный Чувствительный

3 Leu511>Pro His526>Asp Мутация

4 His526>Asp Мутация

Таким образом, метод гибридизации на микрочипах обладает более высокой чувствительностью, что обусловлено особенностями процедуры подготовки образца к анализу, включающей получение одноцепочечной флюоресцентно меченой ДНК путем 2-стадийной асимметричной ПЦР, а также использованием для регистрации гибридизационной картины высокочувствительной оптической системы на базе флюоресцентного широкополыюго микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой.

Кроме того, с помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» была выявлена новая двойная мутация, которая с помощью гетеродуплексного анализа не определялась в МБТ, резистентных к рифампицину: Ьеи511-Рго, Азр516-С1у, то есть тест-система позволяет идентифицировать двойные мутации в МБТ. В МБТ, выявленных только с помощью ПЦР (на культуральных средах они не выросли), с помощью гетеродуплексного анализа лекарственная чувствительность была определена в 32,8% случаях, а на чипах - в 95,3% .

Характер распределения мутаций в гене гроВ, установленных с помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)», был такой же как и характер распределения мутаций, полученных с помощью гетеродуплексного анализа, то есть наибольшее количество штаммов МБТ имели мутации в 531, 526, 516 кодонах, но варианты этих мутаций отличались большим разнообразием.

Эффективность выявления устойчивых к рифампицину штаммов методом гибридизации на микрочипах <<ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» для культур, выделенных от больных, составила 100,0%, а выявляемость методом гетеродуплексного анализа - 98,2%; прогностическая значимость в отношении наличия мутаций составила 88,9 % и 88,2 % соответственно. Важным моментом является возможность использования этих методов для детекции резистентности к рифампицину непосредственно в первичном материале, то есть методы пригодны для скрининговых исследований.

Преимущество использования чипов, по сравнению с методом гетеродуплексного анализа, состоит в том, что метод обладает более высокой чувствительностью, выполняется быстрее, в результате анализа определяется тип и локализация мутации, причем исследуется широкий спектр мутаций в разных кодонах, и нет необходимости иметь контрольные штаммы для- ежедневных анализов. Определение типа мутаций важно с клинических позиций, так как имеются данные о корреляции между типом мутации и степенью устойчивости МБТ к рифампицину [Taniguchi Н. et al., 1996; Moghazeh S. et al., 1996].

Изониазид является препаратом первого ряда специфическим для лечения туберкулеза. Первичная устойчивость к данному препарату МБТ различная в разных странах. По данным G. I.Mokrousov и соавт. (2002), мутации в гене katG были выявлены в 93,6% резистентных к изониазиду штаммах МБТ.

Среди молекулярно-биологических методов определения мутаций в различных генах чаще всего применяется метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов - SSCP [Yap Е., McGee J., 1992].

Адаптация этого метода для определения чувствительности ДНК МБТ к изониазиду заключалась в том, что мы отработали условия для одновременного

(по одной программе амплификации) определения мутаций в четырех основных генах: katG, inliA, oxyR, has А, ответственных за резистентность к изониазиду.

Праймеры подобраны для выявления мутаций, присутствующих в наибольшем количестве штаммов МБТ, резистентных к изониазиду. Изучали следующие фрагменты генов МБТ, резистентных к изониазиду: для гена katG 315335 кодоны, для гена irihA - его промоторная и структурная области, для гена oxyR/ahpC - межгенная область. Для гена KasA — область нуклеотидных последовательностей 31032-31426, то есть для определения мутаций в 269 и 312 ко-донах (патент № 2200323 от 29 августа 2001 г.).

Метод является достаточно доступным (ПЦР и электрофоретическое разделение денатурированной ДНК применяются сейчас во многих молекуляр-но-диагностических лабораториях), , специфичным (работа проводится с исследуемыми генами).

По нашим данным, выявление мутаций в ДНК МБТ, выделенных от больных туберкулезом Москвы и Московской области (п=350), резистентных к изониазиду, составляет для генов: katG - 85,1%; inhA - 30,3%; oxyR - 16,6%; kasA - 10,6%. Процентное совпадение с результатами секвенирования составило для katG - 85,0%; inhA - 77,6%; oxyR - 75,0%; kasA - 71,4%. Чувствительность по выявляемое™ мутаций в исследуемых генах падала katG>inhA>oxyR>kasA.

Было установлено, что в образцах ДНК, выделенной из МБТ, выросших на среде Левенштейна-Йенсена, процент определения мутаций несколько вы-

S '

ше, чем в образцах ДНК, выделенной из мокроты (по всей вероятности из-за потери МБТ при обработке мокроты), но, и в том, и другом случаях, в целом, процентное соотношение мутаций сохранялось. Самый большой процент совпадения в определении чувствительности к изониазиду с микробиологическими методами был для гена katG в кодоне 315Thr. По всей вероятности, это связано с тем, что данная мутация присутствует почти во всех МЛУ МБТ.

Для гена inhA мы также наблюдали высокий процент совпадений. Однако, данные литературы по определению мутаций в этом гене довольно разноречивы: X.Wu и соавт. (1989) - 8,8%; M.Torres и соавт. (1997) - 4,3%; A.Telenti и

соавт. (1997) - 36,8%; R.Cardoso и соавт. (2004) - 25,0%; G.Tudo и соавт. (2004) -80,5% и С.Lavender и соавт. (2005) - 25,0%.

По гену oxyR полученные результаты совпали с литературными данными. По данным R. Cardoso и соавт. (2004) мутации в этом гене составляли 10,3%.

Мутации, ответственные за резистентность к изониазиду, по гену has А изучали исключительно методом SSCP. Вопрос о роли мутаций в этом гене остается спорным, поскольку в штаммах, чувствительных к изониазиду также выявлялись мутации в этом гене [Larsen М. et al., 2002; Kremer L. et al., 2003]. В гене kasА нами были получены мутации в 269 кодоне. Мутации в этом гене в 1,5% случаев присутствовали в МЛУ МВТ, имеющих мутации в четырех генах и в 0,9% случаев - в штаммах МБТ, имеющих мутации в двух генах. Кроме того, в 2,2% случаях встречались штаммы МБТ резистентные к изониазиду, имеющие мутации только в этом гене.

Таким образом, применение метода SSCP оправдано для определения наличия или отсутствия мутации в исследуемых генах. Но точно определить тип мутации можно только секвенированием. < v

Определение МЛУ в штаммах МБТ ■"с помощью молекулярно-генетических методов делается крайне редко и до ноября 2004 г. вообще не было тестов, официально зарегистрированных в России, для проведения подобных исследований в клинико-диагностических лабораториях фтизиатрических учреждений.

Метод биологических микрочипов (тест-система «ТБ-БИОЧИП»), определяющий резистентность сразу к рифампицину и изониазиду, был создан в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН под руководством академика А.Д.Мирзабекова и прошел клиническое испытание в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы. С помощью «ТБ-БИОЧИП» можно идентифицировать в МБТ 28 типов мутаций по гену гроВ (всевозможные варианты двойных мутаций просчитываются отдельно), 9 типов мутаций по гену katG (двойные - отдельно), 5 - по гену inhA и 5 - по гену ahpC.

Совпадение результатов определения резистентности МБТ к рифампици-ну и изониазиду с помощью метода абсолютных концентраций и биологических микрочипов, для выделенных культур МБТ, составило - 98,5%, для разнообразного диагностического материала - 88,8%.

Тот факт, что определение чувствительности и/или резистентности разными методами составляет не 100,0%, может быть связано с особенностями роста МБТ на жидких и плотных средах, наличием не одного штамма МБТ у больного и наличием в штаммах МБТ мутаций в неизучаемых нами фрагментах генов.

Впервые нами был произведен анализ МЛУ МБТ по наличию мутаций в разных генах. Штаммы, имеющие мутации в четырех генах, составляли 1,5% , а в трех и двух - 20,4% и 78,1% соответственно. Штаммы МБТ, резистентные

только к изониазиду отмечены в 12,0%, а только к рифампицину - в 2,8%.

Самое большое количество штаммов МБТ было выявлено с мутациями в двух генах гроВ и katG, но были штаммы, у которых резистентность к изониазиду определялась мутациями только в гене has А - 2,2% и oxyR - 3,3%, то есть из полученных данных видно, как важно определение типа мутаций в генах, которые, как правило, раньше не исследовали. Мутации в 511 и 533 кодонах гена гроВ ранее тоже мало исследовали, но, по нашим данным, они составили 13,9%, а редкие варианты мутаций 531 кодона - 4,3%.

В МЛУ МБТ мутации были определены, в основном, в 315 кодоне гена katG одновременно с мутациями в разных кодонах гена гроВ {табл. 3).

Таким образом, с помощью «ТБ-БИОЧИП» нам удалось оценить роль ряда кодонов в МЛУ МБТ, которые раньше исследовали крайне редко, а эти данные могут, изменить представления о важности изучения широкого спектра типов мутаций в МЛУ МБТ. '

У больных с впервые выявленным туберкулезом, у которых определили МЛУ МБТ, разнообразие мутаций очень скудное, как правило, в 315'кодоне гена katG и 531 кодоне гена гроВ.

Таблица 3

Сочетание мутаций в штаммах Mycobacterium tuberculosisi выявленных с помощью «ТБ-БИОЧИП» в 315 кодоне гена katG и разных кодонах гена

rpoli (п=208)

Варианты Резистентность к рифампнцину Резистентность к изониазиду %

кодоны кодон

1 531 315 66,2

2 526 315 14,9

3 516 315 7,7

4 511 315 3,8

5 522 315 0,96

При анализе типов мутаций, встречающихся в штаммах МБТ, полученных от больных с хроническим течением туберкулеза, для рифампицина характерны мутации в кодонах 531, 526,516,533 гена гроВ, а для изониазида - в 315 кодоне гена katG, в кодонах гена inhA и гена oxyR.

В настоящее время установлено, что основная часть штаммов МБТ имеют мутацию в 315 кодоне гена hat G и встречается у 60,0 - 99,0% штаммов МБТ, устойчивых к изониазиду [Nachamkin I. et. al., 1997; Marttila H. et al., 1998; Rinder H. et al., 1999; Mokrousov J. et al., 2002; Cardoso R. et al., 2004]. Ho если авторами изучалась, в основном, мутация Ser315>Thr, то с помощью биочипов можно определить мутацию на Asn, lie, Arg, Gly. Нами было показано, что для МЛУ МБТ в 4,6% штаммах встречаются мутации в 315 кодоне Ser не на Thr, а на Не, Arg, Gly. Есть штаммы резистентные к изониазиду только по мутации Ser316>Asn - 3,36%.

Таким образом, мутации, которые изучались исследователями крайне редко, но определяются с помощью «ТБ-БИОЧИП», составляют более 18,0%, по гену гроВ и более 13,0% по генам, ответственным за резистентность к изо-

ниазиду, что может существенно сказаться на показателях анализируемой чувствительности МБТ.

С помощью «ТБ-БИОЧИП» открывается возможность определения МЛУ у /,-форм МБТ. Нами были получены мутации в 531 кодоне гена гроВу 315 ко-доне гена ЪиС и в Т(15) позиции гена ткЛ.

Поскольку определение чувствительности к рифампицину в ДНК МЛУ МБТ проводили с помощью двух типов чипов, представляло интерес сопоставление данных по выявлению мутаций, ответственных за резистентность к рифампицину в одних и тех же образцах. Оказалось, что с помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» и «ТБ-БИОЧИП» в одних и тех же образцах были выявлены одни и те же мутации, ответственные за резистентность к рифампицину.

Таким образом, используя одну и ту же технологическую цепочку обработки образцов, выделения ДНК и определения чувствительности к изониазиду и рифапицину было получено, что метод «ТБ-БИОЧИП» является наиболее эффективным для определения как МЛУ МБТ, так и чувствительности к одному из этих препаратов по множеству параметров (табл. 4).

Таблица 4

Сравнение эффективности применяемых методов определения чувствительности М.ШЬегси1о$1$ к рифампицину и изониазиду

Показатели Методы

ГДА ББСР «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» «ТБ -БИОЧИП»

Время анализа (часы) 48 48 48 48

Кол-во препаратов, которые можно исследовать на чувствительность по одной программе 1 1 1 2

Количество исследуемых генов 1 4 1 ' 4' •

Количество мутаций, которые можно определить, используя одну программу без секвенирования нет нет 28 46

Изучение типов мутаций в ДНК МВТ по четырем исследуемым генам от одного и того же больного, полученного со среды Левенштейна-Йенсепа, Ле-венштейна-Йенсена с рифампицином, Левенштейна-Йенсена с изониазидом показало, что для 94,0% штаммов они одинаковы. Это говорит о том, что определить спектр мутаций, ответственных за резистентность к рифампицину и изо-ниазиду, можно на любом из этих образцов, что увеличивает возможность детектирования лекарственной чувствительности.

Применяя общепринятые дозы для определения бактериологической чувствительности к ПТП, не всегда можно определить все мутации исследуемых штаммов, имеющихся у одного больного. Наблюдались случаи, когда выявленные мутации в ДНК МВТ, выделенной из мокроты, отличны от мутаций, определенных в ДНК МБТ культур МБТ, выросших на средах с разными дозами ПТП.

Имеются два варианта таких различий.

Первый - когда определенный тип мутаций выявляется в ДНК МБТ, выделенной из мокроты, и не выявляется в ДНК МБТ культур, выросших на среде Левенштейна-Йенсена с разными дозами соответствующего лекарственного препарата. По всей вероятности это может быть связано с подавлением роста штаммов МБТ на плотных средах с ПТП, мутации которой определялись на средах без ПТП;

Второй - когда в ДНК МБТ, выросшей из биологических образцов без ПТП, наблюдается мутаций меньше, чем в МБТ, выросших на среде Левенштейна-Йенсена в присутствии ПТП. Это можно объяснить тем, что химиопре-парат может ингибировать рост МБТ, из-за присутствия которого нельзя было выявить штамм с другой мутацией.

Например, в одном из исследованных штаммов МБТ, выросшем при концентрации рифампицина 80 мкг/мл, была выявлена делеция в 507 кодоне гена гроВ, которая отличается особенной агрессивностью [Rouse D. et al., 1995]. На средах с меньшими концентрациями рифампицина никакие мутации выявлены не были. Возможно, что это связано как с подавлением препаратом роста МБТ

с другими мутациями, так и с тем, что некоторые штаммы не растут без ПТП [Danelishvili L. et al., 1999]. Кроме того, на плотных средах вырастают'не все МБТ.

Например, при помощи гибридизации на «ТБ-БИОЧИП» в мокроте чаще всего выявляется штамм с мутацией Ser531-Leu в гене гроВ, ответственном за резистентность к рифампицину. При последующем культивироваййй образца на жидкой или плотной средах с рифампицином, микобактерии с этой Мутацией погибают, возможно из-за пониженной жизнеспособности, и выявляются МБТ с другой мутацией.

Известно, что разные типы мутаций требуют для инактивации разные дозы лекарственных препаратов [Неуш В. et al., 1995; Rouse D. et al., 1995; Gillespie S. et al., 1998] Их определение, возможно, может повлиять на тактику лечения. Вместе с тем, мутации в 315 кодоне гена katG по одним данным имеют максимальную ингибирующую концентрацию 2 мкг/мл, а по другим - 16 мкг/мл [van Soolingen D. et al., 2000; Abate G. et al., 2001], что скорее всего связано с наличием невыявленных мутаций в неисследованных генах или кодонах этого гена. По данным B.Heum и соавт. (1995) наличие мутаций сразу в двух генах (katG и inhA) приводит к снижению максимально ингибирующей концентрации. Надо иметь в виду, что некоторые больные инфицированы МБТ с разной чувствительностью к ПТП и их соотношение у больного, индивидуально. Нами было показано, что для некоторых штаммов, растущих на среде Левен-штейна-Йенсена, применение доз рифампицина (50 — 80 мкг/мл) и изониазида (10-25 мкг/мл) создало возможность выявить мутации, которые не определялись в мокроте, то есть, скорее всего, это случаи с присутствием смеси разных по чувствительности штаммов МБТ у одного больного.

В последние годы активно развиваются исследования, связанные с вопросами молекулярной эпидемиологии туберкулеза [Шемякин И Г. и др. 2000; Нарвская О.В., 2003; Mokrousov J. et al., 2002; Daley С., Kawamura L., 2003].

В нашей стране в этом плане наиболее изучен генотип МБ'Г северо-запада России, который для 65,4% больных туберкулезом составляет семейство Beijing [Mokrousov I. et al., 2003].

Представляло интерес выяснить, могут ли иметь значение для изучения эпидемиологии туберкулеза данные по мутациям в исследуемых генах и кодо-нах этих генов с помощью «ТБ-БИОЧИП». При изучении разнообразия мутаций в исследуемых генах штаммов МЛУ МБТ, полученных от больных из разных регионов, было зафиксировано 52 типа сочетания (табл. 5).

Таблица 5

Сочетания типов мутаций в генах гро В, kat G,inh А, оху R, kas А, ответственных за резистентность Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду (п=208)

Ген гро В, ответственный за резистентность к рифампицину Гены, ответственные за резистентность к изониазиду Количество (%)

katG inhA oxyR kas A

1 511Рго 315Thr 4 4 4 0,48

2 511Рго 315Arg 4 4 4 0,48

3 511Рго 315Thr T(15) 4 4 0,96

4 511Рго 315Thr A(8) 4 4 0,48

5 511Рго 315Arg T(15) 4 4 0,48

6 511Leu 315Thr T(15), T(8) 4 4 0,48

7 511Arg 315Thr T(15) 4 4 0,48

8 516Val 315Thr 4 4 4 2,90

9 516Yal 315Thr T(15) 4 4 1,45

10 516Val 315Gly T(15) 4 4 0,48

11 516Val 315Thr A(8) 4 4 0,48

12 516Tyr 315Thr A(8) 4 4 0,48

13 516Tyr 315Thr 1 T(15) 4 4 0,48

14 516Gly 315Arg 4 4 269Arg 0,96

15 516Gly 315Arg 4 4 4 0,48

16 522Leu 315Thr 4 4 4 0,48

17 522Leu 315Thr A(8) 4 4 0,48

18 526Arg 315Thr 4 4 4 2,41

19 526Leu 315Thr 4. 4 4 0,48

20 526Leu 315Thr T(15) 4 269Arg 1,45

21 526Leu 315Thr T(15) 4 4 0,48

22 526Leu ' 315Thr A(8) 4 4 0,48

23 526Asp 315Thr. 4 Л:.-:.i 0,48

24 526Asn 315Thr' T(I5)' •" ч : 4 : 2,41

25 526Asn Pro533 T(10) 4 4 . 0,48 a i ; ; .

26 526Pro 531Leu 315Thr 4 4 4 0,48

27 526Tyr 315Thr 4 4 4 3,38

28 526Tyr- 315Thr T(15) 4 4 0,48

29 526Tyr Д.т. 4 : > T(10):! 4 0,48

30 526Tyr Д.т. ч A(9) . • j * 4 0,48

31 526Tyr 31511e ч 4 4 0,48

32 531Leu 315Thr 1 ! ч 4 4 50,7

33 531Leu 3l5Thr T(15) 4 4 6,3

34 531 Leu 315Thr 335Val 4 4 4 0,48

35 531Leu 3l5Thr 335Val T(15) 4 ч 0,48

36 531 Leu 315Thr A(8) 4 4 0,48

37 531Leu 315Thr 4 T(12) 4 0,48

38 531Ьеи 0е1507 315ТЬг Ч Ч ч 0,48

39 531Ьеи Ч Ч Т(12) ч 0,48

40 531Ьеи Ч Ч А(6) ч 0,48

41 531Ьеи Ч Ч Т(10) ч 0,48

42 531Ьеи 315С1у Т(15) ч ч 0,48

43 531Ьеи 315А^ Ч ч ч 0,48

44 531Ьеи 315ау Ч ч ч 0,48

45 531Ьеи 335Уа1 ч ч ч 0,48

46 531Ьеи Ч С(16) ч ч 0,48

47 531Ьеи 315ТЬ- С(16) ч ч 0,48

48 531Ьеи 315ТЬг 335Уа1 ч ч ч 4,43

49 533Ьеи 315С1у Т(15) ч ч 0,48

50 533Рго 315ТЬг Ч ч ч 3,38

51 533Рго 315Т11Г Т(15) ч ч 1,9

52 531Ьеи Ч в!6 ч ч 0,48

Для штаммов МБТ, исследованных в Российской Федерации, на данный период времени, известно, что для МЛУ МБТ, обнаруженных у больных туберкулезом в Тульской области, характерны мутации в гене гроВ 531 (68,6%), 516 (17,5%), 526 (12,4%) и гене каЮ 315 (около100,0%) [Липин М.Ю., 2004]. По нашим данным, у штаммов МБТ с признаками МЛУ, обнаруженных у больных туберкулезом в Москве распределение мутаций по кодонам в гене гроВ было почти аналогичным: 531 (65,0%), 526 (16,8%), 516 (16,8%). Наибольшее разнообразие мутаций для гена гроВ характерно для штаммов МБТ, выделенных у больных туберкулезом в Москве и Саратове. Характерными признаками для мутаций, встречающихся в штаммах МБТ, выделенных от больных других

городов, можно отметить Asp516>Gly (в Алматы), Asp516>Arg (в Москве), His526>Pro (в Кишиневе), His 526>Arg (в Саратове).

Для штаммов МБТ резистентных к изониазиду основная часть мутаций, обнаруженных у больных туберкулезом во всех обследованных городах, находится в 315 кодоне гена katG (от 100,0% в Саратове и Кишиневе до 47,4% Алматы). Ser315> Cys встречались только в штаммах МБТ у больных туберкулезом в Москве, a Ser315>Arg в Алматы. Редко выявляемая мутация Ser315>Asn обнаружена только в четырех штаммах МБТ, резистентных к изониазиду, причем в трех - резистентность обусловливалась мутацией только в, этом кодоне, а в одном штамме еще и в гене inhA (3 случая - в Москве и 1- в Кишиневе).

Мутации в гене inhA содержались в 46,7%. штаммах МБТ больных туберкулезом в Кишиневе и в 38,8% штаммах больных из Московского региона, чуть более 20,0% - в Саратове и Нижнем Новгороде, 10,0% - в Астрахани и 5,3% - в Алматы.

Мутации в гене ahpC встречались довольно редко, за исключением Астрахани, где они были выявлены в 40% штаммов МЛУ МБТ. . . -

Хотя изучение разнообразия сочетаний мутаций в МЛУ МБТ, полученных с помощью биологических микрочипов по четырем генам, показало 52 варианта сочетаний мутаций, но этого не достаточно для точного определения варианта генотипа характерного для МБТ в изучаемых регионах. Количество изученных мутаций, определяющих резистентность к рифампицину и изониа-зиду, все увеличивается. По данным М.Ю.Липина (2004), в Тульской области мутации в кодонах гена rpoB: 513(Pro), 516(Phe), 522(Gln), 524(Ser), 525(Thr), 527(Gln), 531(Phe) содержатся в 5,2% штаммов МЛУ МБТ. Кроме того, у жителей этого региона были выявлены мутации в 479, 565, 566, и 580 кодонах гена гроВ МБТ, которые, как правило, не изучаются. D.Agdamag и соавт. (2004), изучая на Филиппинах мутации в гене гроВ в штаммах МБТ, получили, что в основном выявляются мутации в 531 (61,0%) и 510 (15,0%) кодонах. По данным S. Ramaswamy и соавт. (2004) у 41,7% МЛУ МБТ выявлялись мутации в 450 кодоне, кроме того, идентифицировали мутации в ДНК МБТ, резистентных к

изониазиду не только в генах katG, inhA, ndh, oxyR, ahpC, но и в fabE24, Rv1592с, Rvllll, i?v0340, ini [Ramaswamy S. et al., 2003].

L. Varma-Basil и соавт. (2004) выявили мутации в 511 - 514 кодонах. В совокупности, для штаммов, резистентных к изониазиду, обнаружено более 60 мутаций, разбросанных только по гену katG, для гена гроВ - около 40. Таким образом, для молекулярно-эпидемиологического анализа туберкулеза необходима паспортизация штаммов МБТ по максимальному количеству признаков (определение мутаций в максимальном количестве разных кодонов различных генов).

Представленные результаты наглядно демонстрируют, что для определения чувствительности к ПТП в исследуемых генах оправдано использование всех вышеупомянутых молекулярно-генетических методов, но наиболее перспективным является метод «ТБ-БИОЧИП».

Метод может иметь большое значение и для скрининговых исследований, когда важно за короткое время выявить резистентность к рифампицину и изониазиду МБТ основного контингента больных. Для его успешного применения необходимо соблюдение рекомендаций, предлагаемых в данной работе.

Для генетической паспортизации штаммов желательно использование, помимо чипов, других молекулярных методов, поскольку имеющиеся в нашем распоряжении чипы пока не позволяют выявить весь спектр мутаций в изучаемом штамме МБТ.

Таким образом, мы можем констатировать, что для этиологической диагностики туберкулеза наступает молекулярно-генетический период, который, с нашей точки зрения, имеет огромные перспективы.

Выводы

Разработан собственный метод выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в цельной крови, заключающийся в обработке крови JV-асетил L- цистеином (NALC) с NaOH (5:1) с последующим отмыванием осадка буфером 10 мМ Трис HCl и 1мМ ЭДТА (pH 7,6 далее 8,0 и 8,8) с 1% тритоном.

2. Создана собственная двухэтапная тест-система полимеразной цепной реакции, которая позволяет повысить эффективность выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в различных биологических образцах в среднем на 30%, по сравнению с одноэтапной полимеразной цепной реакцией.

3. Определена эффективность использования методов гетеродуплекс-ного анализа (чувствительность - 98,2%, специфичность - 82,3%) и метода «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» (чувствительность - 93,8%, специфичность - 100,0%) для выявления мутаций, ответственных за резистентность Mycobacterium tuberculosis

к рифампицину в гене гроВ.

4. Разработана собственная тест-система для выявления мутаций в генах katG, inhA, oxyR, kasA, ответственных за устойчивость к изониазиду, основанная на методе койформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов, отличающаяся тем, что все этапы полимеразной цепной реакции и SSCP осуществляются по единой программе для всех исследуемых генов.

5. Показано,что наиболее эффективным методом определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis й /.-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду является лицензированный метод «ТБ-БИОЧИП», заключающийся в том:, что всего за 18 часов можно определить множественную лекарственную устойчивость микобактерий в любом биологическом образце посредством определения мутаций (всего 52 типа) в генах katG, inhA, охуА и гроВ, связанных с резистентностью к исследуемым препаратам (чувствительность тест-системы 93,0%, специфичность - 100,0%).

ками множественной лекарственной устойчивости. Особенностями генотипов Mycobacterium tuberculosis из разных регионов были мутации в 533 ко доне гена гроВ, характерные для Mycobacterium tuberculosis, полученных только от больных Московского региона и Саратова; в гене inliA наблюдались мутации у 46,7% Mycobacterium tuberculosis больных туберкулезом, проживающих в Кишиневе, в штаммах микобактерий, полученных от больных из Астрахани в гене ahpC мутации встречались в 40%.

7. В результате исследований впервые выявлены мутации в гене inhA в -9 положении, в гене гроВ двойная мутация Asp516>Val Ser531>Leun двойная мутация в гене katG Ile335>Val и Ser 315 > Thr.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Иртуганова O.A., Владимирский М.А., Скотпикова О.И., Мороз A.M. и др. Современные возможности клинической бактериологии туберкулеза легких. // Материалы симпозиума «Иммунодиагностика, иммунореабилит. при лепре, туб. и других хронич. заболеваний». Астрахань. - 1998. - с.39-41.

2. Скотникова О.И., Демкин В.В., Николаева Н.П., Мороз А.М.Применение полимеразной цепной реакции для выявления МБТ в различных клинических образцах// Тезисы IV съезда научн.-медиц. ассоц. фтиз. - Йошкар-Ола. - 1999. - с.208.

3. Скотникова О.И., Демкин В.В., Николаева Н.П., Соболев Ä.IO. и др. Мо-лекулярно-генетические исследования при туберкулезе. Современные возможности и;ближайшие перспективы // Тезисы IV Съезда иаучно-медиц. ассоц. фтиз. - Йошкар-Ола. — 1999. - с.233.

4. Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Демкин В.В., Николаева Н.П. и др. Использование метода «Nested-PCR» в диагностики туберкулеза// БЭБиМ. -2000. - №6.-с.717-720.

5. Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Исаева Е.Л., Носова Е.Ю. и др. Выявление M.tuberculosis в клинических образцах методом ПЦР и изучение ал-лельных вариантов гроВ гена, ответственного за устойчивость к рифампи-цину».// Тезисы III Веер, научно-практич. конф. «Генодиагностика в совр. медицине». - 2000. - с. 284-285.

6. Демкин В.В., Скотникова О.И., Николаева Н.П., Корнева И.Н. и др. Эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса тест-системой, основанной на использовании принципа «Нестед-ПЦР» //П Всероссийская научно-практич. конф. «Генодиагностика, в совр. медицине». -2000.-с.268-271.

7. Носова Е.Ю., Скотникова О.И., Исаева Е.Л., Мороз A.M. Выявление M.tuberculosis в респираторных и не респираторных клинических образцах с помощью ПЦР //Московский медицинский журнал. - 1999. - № 4. - с.21-23.

8. Михайлович В.М., Лапа С.А., Грядунов Д.А., Стрижов Б.Н., Соболев А.Ю., Скотникова О.И., Иртуганова O.A. и др. Использование методов гибридизации на специализированном ТБ-микрочипе для обнаружения рифампи-цин-резистентных, штаммов M.tuberculosis» И БЭБиМ. - 2001. - № 1. -с.112-117.

9. Скотникова О.И., Носова Е.Ю., Исаева Е.Л., Мороз A.M. Выявление ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (M.tuberculosis М.bovis) методом ПЦР (Н-ПЦР) в различных биологических пробах // Методические рекомендации МНПЦБТ. - Москва. - 2001. - с. 15.

' • •• - / : .:

10. Mikhailovich V., Lapa S., Giyadunov D., Sobolev A., Strizhkov В., Chernyn N., Skotnikova O. et al. Identification of Rifampin-Resistant M.tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase detection reaction on oligonucleotide microchips».// J.Clin. Microb. - 2001. - V.39. - p.2531-2540. Соавт.:

11. Скотникова О.И., Мороз A.M., Литвинов В.И. Идентификация мутаций в rpoB-гене M.tuberculosis, ответственных за резистентность к рифампицину с помощью биологических микрочипов, ТБ-Биочип (РИФ) //Тез. междуна-

родной конференции «Туберкулез - старая проблема в новом тысячелетии». - Новосибирск. - 2002. - с. 154.

12. Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Михайлович В.М., Грядунов Д.А. и др. Молекулярно-генетические методы выявления рифампицин-резистентных штаммов М.tuberculosis».// Вестник РАМН. - М.: Медицина. - 2002. - №2. -с.36-39.

13. Скотникова О.И., Литвинов В.И., Носова ЕЮ., Мороз A.M. Типироваиие лекарственно-устойчивых штаммов M.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом легких, путем определения мутаций в генах rpoB, katG, oxyR/ ahpC, kasA различными молекулярно-биологическими методами». // Сб. тез. 4-ой Всероссийской научно-практич. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - 2002. - с. 124-125.

14. Скотникова О.И., Корнева И.Н., Мороз A.M., Демкин В.В. Индикация и идентификация микобактерий туберкулезного комплекса на основе ам-плификаци области SENX3-REGX3». //Сб. тез. 4-ой Всероссийской научно-практич. конф. «Генодиагностика инфекционных заболеваний» - 2002. -с. 118-119.

15. Скотникова О.И., Рыбакова H.H., Литвинов В.И., Мороз A.M. Выявление штаммов микобактерий, резистентных к химиопрепаратам // Тр. 12. Национального конгресса по болезням органов дыхания. - Москва -2002. -с.309-310.

16. Скотникова О.И., Носова Е.Ю. Использование метода ПЦР в диагностике туберкулеза // Труды 12 Национального конгресса по болезням органов дыхания. Москва. — 2002. - с.301.

17. Скотникова О.И., Носова Е.Ю., Маркова О.В., Мороз A.M. Типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампиципу и изо-ниазиду, с помощью молекулярно-биологических методов // БЭБиМ. -2003. -№9. - с.312-314.

18. Бадлеева М.В. Борисов С.Е., Купавцева Е.А., Скотникова О.И. и др. Экспресс-диагностика состава и свойств микобактериальной популяции у

больных с впервые выявленным туберкулезом //Тезисы 13th Annual Congress European Respiratory Society. Vienna, Austria. - 2003. - c.47. Соавт.:

19. Skotnikova O., Nosova E., Badleeva M.,Galkina K. et al.Use new technology (biochips) for simultaneously detection of Mycobacterium tuberculosis sensitivity to rifampicin and isoniazid.// II nternational Congress on infections Diseases.

- Mexico, March 4-7. - 2004. - p. 305.

20. Скотникова О.И., Михайлович B.M. Применение биологических микрочипов для определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis // Лаборатория. - 2004. - №2. - с. 18-19.

21. Скотникова О.И., Михайлович В.М., Носова Е.Ю., Лапа С.А. и др. Новые технологии в определении лекарственной чувствительности // Пробл. туб.

— 2004. - №6. - с.37-40. . ч,-• • - :" •

22. Носова Е.Ю., Скотникова О.И. Определение устойчивости M.tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrA методом ПЦР-SSCP.// Сб. трудов 5-ой Всероссийски научно-практич. конф. «Генодиагностика инфекционных болезней». - 2004. - Т. 1. - с.211-213.

23. Краснова М.А., Скотникова О.И., Кондратенко И.В., Кадникова О.Н. и др. Клиническое применение тест-системы для идентификации микобактерий M.tuberculosis, M.bovis, M.bovis BCG.H Сб. трудов 5-ой Всероссийск. науч-но-практич. конф! «Генодиагностика инфекционных болезней». - 2004. - Т 1.-с. 209-211.

24. Скотникова О.И. Молекулярно-биологические методы во фтизиатрии //Пробл. туб. - 2005. - №8. - с.5-10.

25. Скотникова О.И, Галкина К.Ю., Носова Е.Ю., Краснова М.А. и др.Характеристика чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифам-пицину и изониазйду посредством определения мутаций в генах гроВ, katG, inhA, охуА, kasA различными молекулярно-биологическими метода-ми.//Пробл. туб. - 2005. - № 8. - с.39-42.

26. Giyadunov D., Mikhailovich V., Lapa S., Roudinskii N., Donnikov M., Pankov S., Chupeeva V., Kuzmin A., Chemousova L., Skotnikova O., Moroz A., Zase-

datelev A., Mirzabekov A. Evaluation of hubridisation on oligonucleotide mi-croarraus for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis.// Clin Mi-crobiol Infect. - 2005. - v. 11. -p.531-539.

27. Научные труды (к 75-летию вед. противотуб. учрежден. Москвы). В.И.Литвинов, А.М. Мороз (титул.ред.). Раздел III. Лабораторная диагностика. Молекулярно-биологические исследования. - М.:Медицина и жизнь. -2001.

Носова Е.Ю., Скотиикова О.И. Эффективность метода ПЦР в диагностике туберкулеза. - с. 237-239.

Исаева Е.Л., Скотникова О.И., Соболев А.Ю. Идентификация мутаций в гене гроВ МБТ, отвечающего за резистентность к рифампицину у больных туберкулезом с помощью ПЦР-гетеродуплексного анализа - с.241 - 242. Скотникова О.И., Исаева Е.Л., Соболев А.Ю., Михайлович В.М., Грядунов Д.А., Лапа С.А., Иртуганова О.А. Совершенствование методов генодиагностики для выявления мутаций, ответственных за резистентность к рифампицину и изониазиду. - с.247-248.

28. Лабораторная диагностика туберкулеза. В.И.Литвинов, А.М.Мороз (титул.ред.). Часть II. Молекулярпо-генетические исследования. -М.:Медицина и жизнь. - 2001.

Скотникова О.И., Демкин В.В., Корнева И.Н., Николаева Н.П. Использование молекулярно-генетических методов для выявления М. tuberculosis. Сущность применяемых методов. - с.67-76.

Скотникова О.И., Носова Е.Ю.Результаты сравнительного анализа ПЦР с микробиологическими методами выявления. - с.76-79. Скотникова О.И., Носова Е.Ю., Мороз А.М. Эффективность выявления ДНК МБТ у больных разными формами туберкулеза с помощью вариантов метода ПЦР. - с.79-82.

Скотникова О.И., Носова Е.Ю., Мороз А.М. Результаты выявления МБТ с помощью ПЦР у пациентов в случае дифференциальной диагностики заболевания легких. - с.82-84.

Скотникова О.И., Носова Е.Ю. Результаты применения ПЦР-диашостики для контроля за эффективностью проводимого лечения. - с.84-87. Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Исаева E.JI. Определение чувствительности M.tuberculosis к лекарственным препаратам с помощью молекулярно-генетических методов. - с.87-91.

Скотникова О.И., Заседателев A.C., Михайлович В.М., Соболев А.Ю., Исаева Е.Л., Грядунов Д.А., Лапа С.А. Методы выявления мутаций и результаты их использования, -с.91-112.

29. Скотникова О.И., Литвинов В.И., Мороз А.М., Соболев А.Ю. и др/ Способ диагностики туберкулеза // Патент Ks 2163022 от 4 июля 2001г.

30. Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Мороз Á.M., Литвинов В.И. Способ диагностики чувствительности штаммов M.tuberculosis с помощью ПЦР-конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов // Патент № 2200323 от 10 марта 2003г.

31. Литвинов В.И., Мороз A.M., Скотникова О.И., Носова Е.Ю. Способ обработки цельной крови для выявления ДНК микобактерий методом ПЦР //Патент № 2231790 от 27 июня 2004 г.

32. Бадлеева М.И., Носова Е.Ю., Скотникова О.Й., Дорожкова И.Р. и др. Способ определения лекарственной чувствительности L-форм микобактерий туберкулеза к рифампицину. Патент № 2263149 от 27 октября 2005 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Скотникова, Ольга Ивановна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1.Введени е.

1.2.Молекулярно-генетические основы резистентности Mycobacterium tuberculosis к изониазиду.

1.3.Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину.

1.4.Генотипирование штаммов Mycobacterium tuberculosis по ДНК.

1.5.Культуральные и молекулярные методы диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.

1.5.1.Фенотипические методы диагностики.

1.5.1.1 .Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на плотных сре

1.5.1.2.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких сре

1.5.1.3. Анализ чувствительности Mycobacterium tuberculosis к 39 противотуберкулезным препаратам с помощью бактерио-фагов(?/га В-анализ).

1.5.2.Молекулярно-генетические методы определения чув-t ствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.

1.5.2.1.Методы пробоподготовки биологических образцов и выделения ДНК Mycobacterium tuberculosis.

1.5.2.2.Методы детекции мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1.Обследованные пациенты.

2.2.Культуры Mycobacterium tuberculosis, выделенные от больных туберкулезом.

2.3.Методы исследования.

2.3.1.Определение лекарственной чувствительности

Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду бактериологическими методами.

2.3.2.Обработка клинического материала для молекулярных исследований.

2.3.3.Выделение ДНК Mycobacterium tuberculosis из диагностического материала.

2.3.4.Подбор праймеров.

2.3.5.Определение ДНК Mycobacterium tuberculosis.

2.3.5.1.Реакция амплификации.

2.3.5.2.Регистрация и анализ продуктов амплификации.

2.3.6. Проверка специфичности полимеразной цепной реакции

2.3.7. Выявление мутаций в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis методом гетеродуплексного анализа.

2.3.7.1 .Получение универсального гетеродуплексного генератора

2.3.8. Прямое секвенирование ПЦР-фрагментов.

2.3.9.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину с помощью биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)».

2.3.10.Метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP).

2.3.10.1.Определение мутаций в генах, ответственных за резистентность к изониазиду katG, oxyR/ahpC, inhA, kasA.

2.3.11. Выявление микобактерий резистентных к рифампицину и изониазиду с помощью биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП».

2.3.12.Статистическая обработка.

Глава 3. Собственные исследования.

3.1. Методические подходы применяемые для повышения эффективности выделения ДНК Mycobacterium tuberculosis и определения ее лекарственной чувствительности.

3.1.1 .Забор образцов.

3.1.2.Пробоподготовка.

3.1.3 .Выделение ДНК.

3.1.4.Определение Mycobacterium tuberculosis в зависимости от формы туберкулеза и стадии туберкулезного процес

3.2.Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину методом гетеродуплексного анализа.

3.3.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину с помощью биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)».

3.4.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к изониазиду методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов.

3.5.Определение лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду методом биологических микрочипов «ТБ-БИОЧИП».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение новых молекулярно-биологических технологий для выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью"

Актуальность работы. Одной из основных причин повышения заболеваемости туберкулезом является увеличение числа лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, которые определяются как Mycobacterium tuberculosis, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину, независимо от наличия или отсутствия устойчивости к другим препаратам [Iseman М., Madsen D., 1989; Shinder D. et al., 1991; Kochi A. et al., 1993; Espinal M. et al., 2001; Gillespie S., 2002].

У больных с впервые выявленным туберкулезом легких уровень Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью колеблется от 1,7% в Барселоне [Tudo G. et al., 2004], 5,0 - 7,0% в Москве [Литвинов В.И. и др., 2004, 2005], до 10,0% в ряде других стран Европы [Nutini S., et al., 1998; van Deun A. et al., 1999; Gonzavez N. et al., 1999], хотя имеются публикации и о более высоком проценте 21,8% в Эстонии [Kruuner A. et al., 1998; Leimane V., Leimans J., 1998], до 40,0% в отдельных регионах Украины [Чернушенко Е.Ф., Клименко М.Ю., 1999], до 51,1% в Казахстане [Ильина Т.Я. и др., 2003]. По данным А.Г.Хоменко, В.И.Чуканова (1999), А.К.Стрелис и соавт.(2001), Б.И. Вишневского, Е.Б. Вишневской (2003) в разных регионах России множественная лекарственная устойчивость Mycobacterium tuberculosis в 2001 году зафиксирована от 8,0% до 61,0%о у впервые выявленных больных.

В Москве у больных с хроническим течением туберкулеза легких, обнаруживают Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в пределах 13,0-15,0%) [Сельцовский П.П. и др., 2005]. Эффективность лечения больных с множественно-лекарственно устойчивыми Mycobacterium tuberculosis составляет не более 50,0% [Coninx R. et al., 1999; Dye С. et al., 2002].

Во фтизиатрической практике до последнего времени туберкулез диагностируют на основании данных клинико-рентгенологических исследований с подтверждением роста Mycobacterium tuberculosis на плотных средах золотой стандарт»), хотя известно, что Mycobacterium tuberculosis вырастают на них не раньше, чем через 4-6 недель. Применение автоматизированных систем с использованием жидких сред [МВ/ВасТ или Bact/Alert 3D (BioMerieux) и Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson)] сокращает время выделения возбудителя до 2 - 3 недель [Rohner P. et al., 1997; Brunello F., Fontana R., 2000; Somoskovi A. et al, 2001].

Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, в зависимости от применяемого метода, удлиняет время анализа еще на 1 - 3 недели и, как правило, больным назначают противотуберкулезные препараты, независимо от того, каким штаммом они заражены, хотя подбор схемы лечения, учитывающей характер чувствительности Mycobacterium tuberculosis у больного, в значительной степени определяет ее эффективность [Егоров A.M. и др., 2000; Соколова Г.Б. и др., 2000; Мишин В.Ю, 2001, 2005]. Кроме того, известно, что 6,0 - 7,0% пациентов, у которых выявляли Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, умирают от лекарственной непереносимости и более чем у 16,0% из них развивается почечная недостаточность [Мишин В.Ю. и др., 2005; Olle-Goig I. et al., 1999].

Таким образом, вопрос разработки и внедрения экспресс-методов де-* текции и определения лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis, остается одной из самых актуальных проблем фтизиатрии.

В последние годы, в связи с внедрением в практику фтизиатрии методов молекулярной биологии, которые отличаются быстротой анализа, высокой чувствительностью и специфичностью, выявление микобактерий и определение их генотипических характеристик значительно облегчает постановку диагноза и назначение больному адекватного лечения. На данный период времени расшифрован геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv, который t имеет длину 4411529 пар нуклеотидов и включает в себя примерно 4000 генов [Cole S. et al, 1998]. Для ряда генов известны мутации, ответственные за изменение фенотипических свойств микобактерий, связанных с возникновением резистентности к противотуберкулезным препаратам. Установлено, что Mycobacterium tuberculosis с различными типами мутаций требуют для предотвращения размножения разные дозы лекарственных препаратов [Williams D. et al., 1998; Stepanshina V. et al., 1999; Van Soolingen D. et al., 2000].

Для выявления мутаций в молекулярной биологии применяют, как правило, сочетание нескольких методов. Прежде всего, это стадия полимеразной цепной реакции, с помощью которой происходит клонирование исследуемой части ДНК, и далее анализ полученных ампликонов с помощью рестриктаз, методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ' или различными видами гибридизации с соответствующими олигонуклеотидами. В большинстве случаев с помощью этих методов мутации в исследуемой области ДНК только выявляются. Для определения типа мутаций вводятся дополнительные стадии, что делает анализ более длительным [Патрушев Л.И., 2000] или используют дорогостоящие методы секвенирования, не имеющие в настоящее время практической перспективы.

В Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН под руководством академика А.Д.Мирзабекова была разработана технология ► биологических микрочипов, кардинально изменившая возможности молекулярно-диагностического анализа Mycobacterium tuberculosis [Mikhailovich V. et al., 2001]. С помощью «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» можно определить чувствительность к рифампицину, а «ТБ-БИОЧИП», предоставляет возможность одномоментного выявления чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду с определением 29 типов мутаций к первому препарату по гену гроВ и 19 типов мутаций ко второму препарату по генам katG, oxyR, inhA. Этот метод в 2004 году получил регистрационное удостоверение Федеральной службы РФ по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. Принципиальным преимуществом этих тест-систем являются сроки получения результатов (48 часов) при сохранении 95% чувствительности и специфичности определения при выявлении Mycobacterium tuberculosis и определении ее лекарственной устойчивости.

В то же время, с помощью используемых молекулярно-генетических методов выявляется не весь спектр мутаций в целом ряде генов Mycobacterium tuberculosis, ответственных за множественную лекарственную устойчивость, нет единого технологического протокола всех этапов выполнения молекулярных исследований, позволяющих определить множественную лекарственную устойчивость, и совершенно нет данных о возможности их применения в клинико-лабораторной практике фтизиатрических учреждений.

Цель исследования. В связи с вышесказанным, целью данного диссертационного исследования являлась разработка и внедрение в практику единого протокола использования в клинике молекулярно-биологических экспресс тест-систем, позволяющих выявлять Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью у больных туберкулезом, и доказательство их принципиальных преимуществ перед общепринятыми микробиологическими методами.

Задачи исследования

6. Изучить молекулярно-генетические особенности Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, характерных для жителей Московского региона, Астрахани, Нижнего Новгорода, Саратова, Республики Молдова (Кишинев) и Казахстан (Алматы).

Научная новизна. Разработана и практически апробирована технологическая цепочка забора, обработки различных биологических образцов и выделения из них ДНК Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом, как основополагающий этап для эффективного определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам (патент № 2231790 от 27 июня 2004 г. «Способ обработки цельной крови для выявления ДНК микобактерий туберкулеза методом ПЦР»; патент № 2163022 от 28 мая 2001 г. «»Способ диагностики туберкулеза»).

Впервые для определения чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину применен метод «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» (патент № 2263149 от 27 октября 2005г. «Способ определения лекарственной чувствительности L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину»)

Впервые использована система множественного генетического зондирования различных биологических образцов для выявления чувствительности к рифампицину и изониазиду в бактериальной и L-формах Mycobacterium tuberculosis методами гетеродуплексного анализа, конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов и биологических микрочипов.

Впервые с помощью технологии биологических чипов проведено мо-лекулярно-генетическое паспортирование штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, характерных для Московского региона, Астрахани, Саратова, Нижнего Новгорода, Республики Молдова (Кишинев) и Республики Казахстан (Алматы).

Практическая значимость работы заключается в разработке технологической цепочки забора и обработки разных биологических образцов и выделения из них ДНК Mycobacterium tuberculosis.

Используется в клинико-лабораторнтм практике собственная тест-система «Нестед-ПЦР» для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса у больных туберкулезом, которая пригодна для любого биологического материала и отличается от коммерческих низкой себестоимостью и более высокой чувствительностью.

Разработана и апробирована для практического применения собственная тест-система выявления устойчивых к изониазиду Mycobacterium tuberculosis у больных туберкулезом методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов по генам katG, inhA, oxyR/ahpC, kasA.

Определены молекулярно-генетические характеристики Mycobacterium ,tuberculosis, выявляемые у жителей Московского региона, Астрахани, Саратова, Нижнего Новгорода, Республики Молдова (Кишинев) и Республики Казахстан (Алматы).

Положения, которые выносятся на защиту:

1. Доказана важность дифференцированного подхода при выборе метода, применяемого для обработки биологических образцов и выделения ДНК Mycobacterium tuberculosis, в зависимости от целей исследования.

3. Показана эффективность использования метода гетеродуплексно-го анализа для определения устойчивых к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis.

5. Установлена возможность применения метода конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов для выявления мутаций в генах katG, inhA, oxyR, kasA, ответственных за резистентность к изониазиду.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертации используются в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы и в Институте молекулярной генетики РАН для выявления Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР в различном диагностическом материале от больных разными формами туберкулеза на разных стадиях лечения. Адаптированный метод гетеродуплексного анализа применяется для определения штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и метод конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов применяется для характеристики штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к изониазиду по четырем генам (katG, inhA, oxyR, kasA) в МНПЦБТ. Для одномоментного выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, резистентных к рифампицину и изониазиду, применяются биологические микрочипы «ТБ

БИОЧИП». С их помощью также производится молекулярно-генетическое паспортирование штаммов Mycobacterium tuberculosis, то есть в МНПЦБТ создается банк штаммов Mycobacterium tuberculosis с определенными типами мутаций по исследуемым генам.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 печатные работы, в том числе 2 монографии, получено 4 патента.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV съезде научно-медицинской ассоциации фтизиатров, Йошкар-Ола (1999); 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине», Москва (2000); конференции памяти профессора М.М.Авербаха «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы», Москва,

2000); Первой Российской научно-практической конференции с международным участием «Нозокомиальная туберкулезная инфекция», Москва

2001); конференции к 75-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы (2001); Международной конференции «Туберкулез - старая проблема в новом тысячелетии», Новосибирск (2002); Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва (2002); 12 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва (2002); VI Российском съезде фтизиатров, Москва ( 2003); 13th Annual Congress of European Respiratory Society, Vienna (2003); 11 International Congress on Infectious Diseases, Mexico (2004); 15 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания и 1-й Учредительном конгрессе Евроазиатского Респираторного общества, Москва (2005).

Содержание работы. Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения, выводов. В тексте содержится 31 таблица и 18 рисунков. Библиография включает 298 источников литературы, из них 66 на русском и 232 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Скотникова, Ольга Ивановна

Выводы

1. Создана технологическая цепочка обработки различных биологических образцов, полученных у больных туберкулезом легких, выделения из них Mycobacterium tuberculosis и ДНК, позволяющая сохранить штаммы микобактерий, имеющие различную чувствительность к рифампицину и изониазиду. Разработан собственный метод выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в цельной крови, заключающийся в обработке крови iV-асетил L-цистеином (NALC) с NaOH (5:1) с последующим отмыванием осадка буфером 10 мМ Трис НС1 и 1мМ ЭДТА (рН 7,6 далее 8,0 и 8,8) с 1% тритоном.

2. Создана собственная двухэтапная тест-система ПЦР, которая позволяет повысить эффективность выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis в различных биологических образцах в среднем на 30%, по сравнению с одноэтапной ПЦР.

3. Определена эффективность использования методов гетеродуплексного анализа (чувствительность 98,2%, специфичность 82,3%) и метода «ТБ-БИОЧИП-(РИФ)» (чувствительность 93,8%>, специфичность 100%) для выявления мутаций, ответственных за резистентность Mycobacterium tuberculosis к рифампицину в гене гроВ.

4. Разработана собственная тест-система для выявления мутаций в генах katG, inhA, oxyR, kasA, ответственных за устойчивость к изониазиду, основанная на методе конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP), отличающаяся тем, что все этапы полимеразной цепной реакции и SSCP осуществляются по единой программе для всех исследуемых генов.

5. Показано, что наиболее эффективным методом определения чувствительности Mycobacterium tuberculosis и L-форм Mycobacterium tuberculosis к рифампицину и изониазиду является лицензированный метод «ТБ-БИОЧИП», заключающийся в том, что всего за 18 часов можно определить множественную лекарственную устойчивость микобактерий в любом биологическом образце, посредством определения мутаций (всего 52 типа) в генах katG, inhA, охуА и гроВ, связанных с резистентностью к исследуемым препаратам (чувствительность тест-системы 93,0%, специфичность 100,0%).

6. При изучении штаммов Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных туберкулезом, проживающих в Московском регионе, Астрахани, Саратове, Нижнем Новгороде, Кишиневе (республика Молдова), Алматы (республика Казахстан) определено 52 варианта генотипов микобактерий с признаками множественной лекарственной устойчивости. Особенностями генотипов Mycobacterium tuberculosis из разных регионов были мутации в 533 кодоне гена гроВ, характерные для Mycobacterium tuberculosis, полученных только от больных Московского региона и Саратова; в гене inhA наблюдались мутации у 46,7% Mycobacterium tuberculosis больных туберкулезом, проживающих в Кишиневе, в штаммах микобактерий, полученных от больных из Астрахани в гене ahpC мутации встречались в 40%.

7. В результате исследований впервые выявлены мутации в гене inhA в -9 положении, в гроВ гене двойная мутация Asp516>Val Ser531>Leu и двойная мутация в гене katG Ile335>Val и Ser 315 > Thr.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Скотникова, Ольга Ивановна, Москва

1. Альварес Фигероа М.В, Леви Д.Т, Рухамина М.Л. и др. Результаты государственных испытаний ПЦР тест-системы «АМПЛИСЕНС МБТ» для выявления ДНК Mycobacterium tuberculosis complex. // В сб.: Генодиагностика инфекционных болезней 2004. - т.1. - с.159-167.

2. Альтшулер М.Л, Генерозов Э.В, Черноусова Л.Н, Говорун В.М. Детекция и характеристика мутаций в гроВ гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. // Бюлл. экспер. биол. мед.- 1999.-№11.-с. 555-558.

3. Бобченок А.П, Стеклова Л.Н, Вишневская Е.Б. и др. Частота выявления и клинико-диагностическое значение L -форм возбудителя у больных туберкулезом органов дыхания и внелегочной локализации. // Пробл. туб,-2002.-№4.-с.19-21.

4. Богадельникова И.В, Перельман М.И. Туберкулез на пороге третьего тысячелетия.// Врач. 1997. - № 7. - с. 2-6.

5. Бондаренко В.М, Мавзютов А.Р. Ингибиторы полимеразной цепной реакции.// В сб.: Генодиагностика инфекционных заболеваний. Тез. 4 Веер, научно-практической конф. -2002.- Москва. с.399-402.

6. Валиев Р.Ш, Фаизов Т.Х, Зайнуллин Л.И, Валиев Н.Р. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза.// Пробл. туб. 2005. - №.3. -с.25-27.

7. Вишневский Б.И, Вишневская Е.Б. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза на северо-западе России. // Пробл. туб. 2003. - №5. -с.42-43.

8. Владимирский М.А, Шипина Л.К, Левченко М.В. Эффективность обнаружения микобактерий туберкулеза методом ПЦР (результаты рандомизированного исследования).// Пробл. туб. 2003. - №12. - с.28-30.

9. Голанов В.С, Бухарин О.В, Усвяцов Б.Я. Прогностическое значение выделения L -форм микобактерий туберкулеза.// Пробл. туб. 2002. - №12. -с. 44-46.

10. Ю.Генерозов Э.В, Альтшулер M.JL, Говорун В.М. и др. Детекция и характеристика мутаций в гроВ гене резистентных к рифампицину изолятов M.tuberculosis в образцах мокроты.// Пробл.туб. 1999. - №2. - с.39-42.

11. П.Генерезов Э.В, Акопиан Т.А, Владимирский М.А. и др. Прямой генетический анализ резистентности к рифампицину изолятов M.tuberculosis в образцах мокроты.//Пробл. туб. 2003. - №4. - с.49-52.

12. Голышевская В.И. Роль ультрамелких форм микобактерий в патоморфозе туберкулеза.// Пробл. туб. 2003. - №3. - с.26-30.

13. Горбунова В.Н, Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. С-Пб. - 1997. - с. 286.

14. Н.Егоров A.M., Сазыкин Ю.О. Некоторые проблемы химиотерапии туберкулеза с учетом новых данных о его возбудителе. // Антибиот. и химиотер. -2000.-№3. с.3-5.

15. Дорожкова И.Р, Земскова З.С, Шмелева Н.А. Персистирование возбудителя туберкулеза в организме в виде L-форм и их повреждающее дейст-вие.//Вестник АМН СССР. 1976. - т. XX. - с. 161-163.

16. Дорожкова И.Р, Кочемасова З.Н, Дыхно М.М. I-формы микобактерий туберкулеза.//В кн.: Иммунологические аспекты легочной патологии. М.:Медицина. 1980.- 175 с.

17. Дорожкова И.Р, Земскова З.С, Круду В.Н. L-трансформация микобактерий в свете современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в мире.//Вестн. РАМН. 1995. - №7. - с.30-33.

18. Дорожкова И.Р, Бадлеева М.В, Скотникова О.И. и др. Состав и лекарственная чувствительность микобактериальной популяции у больных с подозрением на туберкулез.// Пробл. туб. 2005. - №.8. - с.36-39.

19. Ильина Т.Я, Жангиреев А.А, Сидоренко О.А. Резистентность микобактерий туберкулеза у впервые выявленных больных туберкулезом и при рецидивах заболевания.// Пробл. туб. -2003. №5. - с. 19-21.

20. Исакова Ж.Т, Пак О.А, Юсупова Э.У. и др. Применение биологических микрочипов в определении лекарственной устойчивости M.tuberculosis к рифампицину.// Пробл. туб. 2005. - №8. - с.50-53.

21. Киншт В.Н, Воронина Е.Н, Филипенко М.Л. Методы выделения ДНК M.tuberculosis из клинических образцов для использования в ПЦР: сравнение и оценка. // Клинич. лаб. диагн. 2005. - №.3. - с.23-24.

22. Клинчева С.А, Николаева Н.П, Гнедой С.Н. и др. Множественное ДНК зондирование, новый подход к лабораторной диагностике туберкулеза. // В сб.: Тезисы 4 Российского национального конгресса «Человек и лекарство» М. - 1997,- 191 с.

23. Липин М.Ю, Генетические механизмы устойчивости M.tuberculosis. Ав-тореф. дис. канд. мед. наук. 2004.

24. Литвинов В.И. Проблемы туберкулеза в мегаполисе. //Пробл. туб. 2005. -№ 8. - с.3-5.

25. Литвинов В.И, Сельцовский П.П. Туберкулез: проблемы и перспективы.// В сб.: Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы. М. 2000. - с. 172173.

26. Майерс Р, Шеффилд В, Кокс Д. // В кн.: Анализ генома Методы. - М.: Мир. - 1999.-с.123-175.

27. Мельникова Н.Н, Мокроусов И.В. Применение молекулярно-генетических методов для изучения устойчивости к рифампицину L-форм микобактерий.// В сб.: Научн. труды Всероссийской научно-практич. конф. С-Пб. - 2005. - 259 с.

28. Михайлович В.М, Лапа С А, Грядунов Д. А. и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микрочипе для обнаружения рифампицин-резистентных штаммов М. tuberculosis. // Бюлл. экспер. биол. и мед. -2001. ~№ 131.-е. 112-117.

29. Мишин В.Ю. Лекарственно-устойчивый туберкулез легких: диагностика и лечение.//Пульмонология 2001. - №4. - с.40-46.

30. Мишин В.Ю. Лекарственно-устойчивый туберкулез. М. - 2005. - 142 с.

31. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм M.tuberculosis и его значение в эпидемическом процессе. Автореф. дис. докт. мед. наук. С-Пб. - 2003.

32. Нарвская О.В, Мокроусов И.В. Лимегценко Е.В. и др. Молекулярная эпидемиология туберкулеза.//Большой целевой журнал о туберкулезе 2000. -№7 - 8. - с.4-6.

33. Нарвская О.В, Мокроусов И.В, Лимегценко Е.В. и др. Молекулярно-генетическая характеристика микобактерий туберкулеза, выделенных в северо-западном регионе России.// В сб.: Туберкулез сегодня, проблемы и перспективы. М. - 2000. - с.210-211.

34. Николаева Г.М. Цитология туберкулеза и других грануломатозов легких. -М. 2004. - 161с.

35. Норкина О.В, Филипенко М.Л, Никонова А.А. и др. Молекулярно-генетическая характеристика устойчивых к рифампицину изолятов M.tuberculosis, выделенных в Новосибирске.// Пробл. туб. 2003. - №12. -с.22-25.

36. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука. 2000. - 527с.

37. Пухлик Б.М. Проблема химиорезистентного туберкулеза и возможности ее решения. // Украинский химиотерапевтический журнал. 1999. - №2. -с.37-41.

38. Сапожникова Н.В, Скворцова Л.А, Павлова М.В. и др. Туберкулез легких, вызванный M.tuberculosis различных генотипов.// Пробл. туб. 2003. -№10. - с.13-15.

39. Сельцовский П.П, Литвинов В.И. Социальные аспекты эпидемиологической ситуации по туберкулезу. М. 2004. - 222 с.

40. Сельцовский П.П, Кочеткова Е.Я, Сон И.М. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Москве в конце XX начале XXI века.// Пробл. туб. - 2005. - № 8. - с.10-14.

41. Скотникова О.И Соболев А.Ю, Михайлович В.М. и др. Молекулярно-генетические методы выявления рифампицин-резистентных штаммов М.tuberculosis. //Вестн. РАМН. -2002. №2. - с. 36-39.

42. Скотникова О.И, Михайлович В.М, Носова Е.Ю. и др. Новые технологии определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis.//Проб.туб. -2004. №.6. - с.37-40.

43. Соколова Г.Б, Куничан А.Д, Можокина Г.М. Новые технологии химиотерапии туберкулезной инфекциии.// Антибиот. и химиотер. 2000. - т.45. - с.30-37.

44. Степаншина В.Н, Иванов И.Ю, Липин М.Ю. и др. Сполиготипы клинических штаммов M.tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом Центрального региона России.// В сб.: Туберкулез сегодня. Материалы VI1 Российского съезда фтизиатров. М. - 2003. - с. 115.

45. Стрелис А.К. Туберкулез с множественной лекарственной устойчиво-стью-угроза населению России.// Профилактика заболевания и укрепления здоровья. 2001. - №2. - с.29-30.

46. Тунгусова О.С, Марьяндышев А.О. Молекулярная генетика туберкулеза.// Пробл. туб. 2003. - №11. - с.39-42.

47. Тунгусова О.С, Марьяндышев А.О, Каугант Д.А. и др. Влияние лекарственной устойчивости на фитнес микобактерий туберкулеза генотипа W-Beijing.// Пробл. туб. 2005. - № 8. - с.46-50.

48. Хейфец Л.Б. Микробиологические аспекты выявления больных туберкулезом с лекарственной устойчивостью.//Пробл. туб. 2004. - №5. - с.3-5.

49. Херрингтон С, Маги Д. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.:Мир. - 1999. - с.305-306.

50. Хоменко А.Г. Современная химиотерапия туберкулеза.// Клин, фармакол. и терапия 1998. - №.7. с. 16-20.

51. Хоменко А.Г, Голышевская В.И, Корнеев М.А. и др. Распространенность и микробиологическая характеристика штаммов M.tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.//В сб.: Туберкулез. 1999. - с. 1-6.

52. Хоменко А.Г, Чуканов В.И. Туберкулез возвращается.// Медицина и жизнь. 1999.-№1.-с.14-21.

53. Шемякин И.Г, Степаншина В.Н, Коробова О.В. и др. Генетическое типи-рование штаммов M.tuberculosis методом сполиготипирования и геномной дактилоскопии.// Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2000. -№6. - с.30-35.

54. Шемякин И.Г, Степаншина В.Н, Манзенюк Щ.Ю. и др. Использование молекулярно-биологических методов для индивидуальной характеристики штаммов M.tuberculosis JI Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунол. -2000. №6. - с.30-35.

55. Шемякин И.Г, Степаншина В.Н, Иванов И.Ю. и др. Характеристика клинических штаммов M.tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов.// Молек. генетика, микроб, и вирусол. 2003. -№1. - с.32-40.

56. Abate G, Hoffner S, Thomsen V, Miorner H. Characterization of isoniazid-resistant strains of M.tuberculosis on the basis of phenotypic properties and mutations in katG. II Eur. J. Clin. Microb. Infect.Dis. 2001. - v. 20,- p. 329-33.

57. Abed Y, Davin-Regli.A, Bollet C. et al. Efficient discrimination of M.tuberculosis strains by 16S-23S spacer region-based random amplified polymorphic DNA analysis. //J. Clinyc. Microbiol. 1995. - v.33. - p. 1418-1420.

58. Agasino C, Ponce de Leon A, Jasmer R. Epidemiology of M.tuberculosis strains in San Franciaco that do not contain IS6\ 10.//Int. J. Tuberc. Lung Disease. 1998. - v.2. - p.518-520.

59. Agerton T, Valway S, Blinkhorn R. Spread of strain W, a highly drug=resistant strain of M.tuberculosis, across the Unated States.// Clin. Infect. Dis. -1999. v.29.-p.85-92.

60. Ahmad S, Mokaddas E. Contribution of AGC to ACC and other mutation at codon 315 of the katG gene in isoniazid-resistant M.tuberculosis isolates from the Middle East.// Int. J. Antimicrob. Agents. 2004. - v.23. - p.473-479.

61. Albert H, Stupple M, Wilson S. et al. Rifampicin susceptibility results of M.tuberculosis cultures in 48 hours using FAST Plaque TB=RIF . II Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v.3. - p.130-131.

62. Alexander R, Domenech O, Honore N. et al. Regulation of catalase-peroxidase (katG) expression, isoniazid sensitivity and virulence by furA of M.tuberculosis.!I Mol. Microbiol. -2001. v.40. - p.879-889.

63. Aquado J, Rebollo M, Palengue E. et al. Blood-based PCR assay to detect pulmonary tuberculosis.//Lancet. 1996. - v.3. - p.1836-1837.

64. Arenkov P, Kukhtin A, Gemmel A. et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzimatic reactions.// Anal, biochem. 2000. - v.278. - p. 123-131.

65. Bakayev V, Bahrmand A, Samar G. CMC analysis of heteroduplex of ri-fampin-resistant M. tuberculosis. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v.3. -p.123.

66. Ball P, Tillotson G. Tolerability of fluoroquinolone antibiotics: past, present, and future.// Drug Safety-1995.-v.l3.-p.343-358.

67. Balazs D, Cojocaru R, Damian H. Molecular characterization of M.bovis BCG: Romanian substrain.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v.3. - p. 13-16.

68. Banerjee A, Dubnau E, Quemard A. et al. InhA, a gene encoding a target for isoniazid and ethionamide in M.tuberculosis. //Science. 1994. - v.263. - p.227-230.

69. Bardou F, Raynaud C, Ramos C. et al. Mechanism of isoniazid uptake in M.tuberculosis./Microbiology. 1998. - №.9. - p.2539-2544.

70. Basso L, Zheng R, Musser J. et al. Mechanisms of isoniazid resistance in M.tuberculosis: enzymatic characterization of enoyl reductase mutants identified in isoniazid-resistant clinical isolates.// J. Infect. Dis. 1998. - v.178. - 769775.

71. Bahrmand A. Bakayev V. Polymerase chain reaction of bacterial genomes with single universal primer: application to distinguishing mycobacteria species.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. - v.2. - p.34-37.

72. Bjorkman J, Andersson J. The cost of antibiotic resistance from a bacterial perspective.// Drug resistance updates. 2000. - v.3. - p.237-245.

73. Bergmann J, Woods G. Evaluation of the ESP culture system II for testing susceptibilities of M. tuberculosis isolates to four primary antituberculous drugs.//J. Clin. Microb. 1998. - v.36. - p.2940-2943.

74. Behr M, Small P. Molecular fingerprinting of M.tuberculosis-. how can it help the clinical.// Clin. Infect. Dis. 1997. - v.25. - p.806-810.

75. Blanchard J. Molecular mechanisms of drug resistance in M. tuberculosis. // Ann. Rev. Biochem. -1996. v.65. -p.215-39.

76. Bloch A, Cauthen G, Onorato I. et al. Nationwide survey of drug-resistant tuberculosis in the United States // JAMA. 1994. - v.271. - p.665-671.

77. Bonora S, Gutierres C, Perri G. et al. Comparative evaluation of ligation-mediated PCR and spoligotyping as screening methods for genotyping of M.tuberculosis strains.// J. Clin. Microbiol. 1999. - v.37. - p.3118-3123.

78. Bozeman I, Mazurek G, Brim S. et al. The freguency of low-level isoniazid-resistant M.tuberculosis in Florida and Texas.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1999. v.3. - p.165-166.

79. Brunello F, Favari F, Fontana R. Comparison of the MB/BacT and BACTEC 460 ТВ systems for recovery of mycobacteria from various clinical specimens. // J. Clin. Microbiol. 1999. - v.37. - p. 1206-1209.

80. Brunello F, Fontana R. Reliability of the MB/BacT system for testing susceptibility of M.tuberculosis complex isolates to antituberculosis drugs. // J. Clin. Microbiol. 2000. - v. 38. - p. 872-873.

81. Buchmeier N, Blanc-Potard A, Piddington D. et al.// mgtC is reguired for growth of M.tuberculosis in human macrophages, in vivo in mice and in low magnesium medium.// Tubercle Lung Dis. 2000. - v.81. - p.88-89.

82. Canetti G, Fox W, Khomenko A. et al. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity and the use of the sensitivity test in tuberculosis control programs. // Bull. World Health Org. 1969. - v. 41 - p. 21-43.

83. Cangelosi G, Brabant W, Britschgi T, Wallis C. Detection of rifampin-and ciprofloxacin-resistant M.tuberculosis by using species-specific assays for precursor rRNA// Antimicrob. Agents Chemother. -1996. v.40. - p. 1790-1795.

84. Cardoso R, Cooksey R, Morlock G. et al. Screening and characterization of mutations in isoniazid-resistant M. tuberculosis isolates obtained in Brazil.// Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - v.48. - p.3373-3381.

85. Caugant D, Sandven P, Eng J. et al. Detection of rifampin resistance among isolates of M.tuberculosis from Mozambique.// Microbial Drug Resist. 1995. -v.l.-p. 321-326.

86. Chaves F, Alonso-Sanz M, Rebollo M. et al. RpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin-resistant M.tuberculosis.II Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2000. -v.4. -p.765-770.

87. Chakrabarti P. Drug targets and drug resistance in mycobacteria. // Proc. Nat. Acad. Sci. (India, B). 1997. - v.67. - p. 169-179.

88. Chen X, Wang, Jin Y. Detection of DNA extracted from Mycobacterium tuberculosis by Taq Man-PCR technique and its clinical application.// Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2000. - v.23. - p.284-288.

89. Churchyard G, Corbett E, Kleinschmidt I. et al. Drug-resistant tuberculosis in South African gold miners: incidence and associated factors.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2000. v.4. - p.433-440.

90. Cole S, Brosch R, Parkhill J. et al. Deciphering the biology of M.tuberculosis from the complete genome sequence. // Nature. 1998. - v.393. - p.537-544.

91. Coninx R, Mathieu C, Debacker M. et al. First line tuberculosis therapy and drug-resistant M. tuberculosis in prisons.// Lancet. 1999. - v.353. - p.969-973.

92. Cooksey R, Morlock G, Glickman S, Crawford J. Evalution of a line probe assay kit for characterization of rpoB mutation in rifampin-resistant M.tuberculosis isolates from New York City.// J. Clin. Microbiol. 1997. -v.35. -p.1281-1283.

93. Cousins D, Williams S, Liebana E. et al. Evaluation of four DNA typing techniques in epidemiological investigations of bovine tuberculosis.// J. Clin. Microbiol. 1998.- v.36.-p.168-178.

94. Daley C, Kawamura L. The role of molecular epidemiology in contact investigations^ US perspective.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2003. - v.7. -p.1104-1108.

95. Danelishvili L, Khechinashvili G, Shubladze N, Mskhiladse 1. Emergence of drug dependant M.tuberculosis strains among patients with pulmonary tuberculosis.// Изв.АН Грузии (серия биол.). 1999. - v.25. - p. 49-53.

96. Deepa P, Therese K, Mahadevan H. Detection and characterization of mutations in rifampicin resistant M.tuberculosis isolates by DNA sequencing.// Indian J. Tuberc. 2005. - v.52. - p. 132-136.

97. Deretic V, Pagan-Ramos E, Zhang Y, et al.// The extreme sensitivity of M.tuberculosis to the front-line antituberculosis drug isoniazid. Nat. Biothech-nol.-1996.-v.14.-p. 1557-1561.

98. De Wit D, Wootton M, Dhillon J, Mitchison D. The bacterial DNA content of mouse organs in the Cornell model of dormant tuberculosis.// Tubercle Lung Dis. 1995.-v.76.-p.555-562.

99. De Viedma G, Infantes D, Lasala F. et al. New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutation and high-level isoniazid resistance mutations in M.tuberculosis.// J. Clin. Microbiol. 2002. - v.40. - p.988-995.

100. Diaz-Infantes M, Ruiz-Serrano M, Martinez-Sanchez L. et al. Evaluation of the MB/BacT mycobacteium detection system for susceptibility testing of M.tuberculosis. //J. Clin. Microbiol. -2000. v.38. - p. 1988-1989.

101. Dobner P, Rusch-Gerdes S, Bretzel et al. Usefulness of M.tuberculosis genomic mutations in the genes katG and inhA for the prediction of isoniazid resistance.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1997. v. 1(4). - p. 365-369.

102. Domenech P, Honore N, HeymB, Cole S. Role of oxyR of M.tuberculosis in oxidative stress: overexpression confers increased sensitivity to organ hydroperoxides. // Microb. Infect. 2001. - v.3. - p. 713-721.

103. Dorronsoro J, Catmen M, Cabodedevilla B. Influencia del numero de mus-tras estudiadas en el diagnostico de la tuberculosis.// Enferm. Infect. Microbiol. Clin. -2000. v.18.-p.215-218.

104. Douglas J, Qian L, Gou W. et al. Tracing DNA spoliogotypes of M.tuberculosis across the pacific. /Tubercle Lung Dis. 2000. - v.80. - p.98.

105. Dussurget 0, Smith I. Interdependence of mycobacterial iron regulation, oxidative-stress response and isoniazid resistance.// Trends Microbiol. 1998. - v.6. - p.354-358.

106. Dussurget O, Rodriguez M, Smith J. Interdependence of mycobacterial iron regulation, oxidative-stress response and isoniazid resistance.// Tubercle Lung Dis. 1998.- v.79.-p.99-106.

107. Dye C, Williams B, Espinal M. Raviglione M. Erasing the worlds slow strain: strategies to beat multidrug-resistant tuberculosis.// Science. 2002. -v.295. - p.2042-2046.

108. Dziadek J, Sajduda A, Borun M. et al. IS 1606 and IS990,single-copy insertion sequence-related elements as the useful tools for diagnosis of M.tuberculosis complex infection.// J.Infect. Dis. 1999. - v.3. - p. 854-867.

109. Dziadek J, Wolinska I, Sajdula A. et al. /£1617, a single-copy insertion se-guence-related element of the M.tuberculosis complex.// Int. J. Tuberc. Lung Dis.-2000. v.4. - p.1078-1081.

110. Elia-Pasquet S, Tessier-Maugein J, Meynerard J. et al. Epidemiological survey on tuberculosis transmission based on RFLP analysis and contact investigation. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v3. - p.14-15.

111. Escalante P, Ramaswamy S, Sanabria Y. et al. Genotypic characterization of drug-resistant M.tuberculosis isolates from Peru.// Tubercle Lung Dis. -1998. v.79. - p.111-118.

112. Espinal M, Laszlo A, Simonsen L. et al. Global trends in resistance to antituberculosis drugs.//New Engl. J. Med. 2001. - v.344. - p.1294-1303.

113. Folgueira L, Delgado R, Palenque E. et al. Rapid diagnosis of M.tuberculosis bacteremia by PCR.// J. Clin. Microbiol. 1996. - v.34. -p.512-515.

114. Gale E, Cundliffe E, Reynolds P. et al. The molecular basis of antibiotic action, (ed. John Wiley). New York. - 1981- p. 131-142.

115. Gali N, Dominguez J, Mc Nerney R. et al. Rapid detection of drug resistance in M. tuberculosis clinical isolates using micobacteriophage D29. Preliminary study.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v.3. - p.129.

116. Gamboa F, Manterola J, Lonca J. et al. Rapid detection of M.tuberculosis in respiratory specimens, blood and other non-respiratory specimens by amplification of rRNA.// Int J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - v.l. - p.542-555.

117. Gillespie S, Newport L, Mc Hugh T. Ftoroquinolones: A new treatment for tuberculosis? // J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.853-854.

118. Gillespie S. Evolution of drug resistance in M. tuberculosis: clinical and molecular perspective. // Antimicrob. Agents and Chemother. 2002. - v.46. -p.267-274.

119. Gingeras T, Ghandour G, Wang E. et al. Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of generic Mycobacterium DNA arrays.// Genome Research. 1998. - v. 8. - p. 435-448.

120. Glavac D, Dean M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. // Hum. Mutat.-1993. v.2. - p.404-414.

121. Glynn J, Whiteley M, Bifani P. et al. Wordwide occurence of W-Beijing strains of M.tuberculosis:A systematic review.// Emerg. Infect. Dis. 2000. -v.8. - p.843-849.

122. Go M, Kapur V, Graham D, Musser J. Population genetic analysis of Helicobacter pylori by multilocus enzyme electrophoresis: extensive allelic diversity and recombinational population structure.//! Bacteriol. 1996. - v.178. -p.3934-3938.

123. Goble M. Drug-resistant tuberculosis.//Semin Respir. Infect.-1986.-v.l.-p.220-229.

124. Gold B, Rodriguez G, Marras S. et al. The M.tuberculosis ide R is a dual functional regulator that controls transcription of genes involved in iron acquisition, iron storage and survival in macrophages.// Mol. Microbiol. 2001. - v.42. - p.851-865.

125. Gonzalez N, Torres M, Aznar J, Palomares J. Molecular analysis of rifampin and isoniazid resistance of M.tuberculosis clinical isolates in Seville, Span.// Tubercle Lung Dis. 1999. - v.80. - p. 187-190.

126. Grompe M. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids. // Nature Genet. 1993. - v.5. - p. 111 -116.

127. Guerrero M, van Soolingen D, RibonW, Leon C. Rifoligotyping for the early detection of multiresistant M.tuberculosis strains.// Int.J. Tuberc. Lung Dis.-1999. v.3. - №9. - p.129.

128. Gutierrez C, Vincent V, Aubert D. et al. Molecular fingerprinting of M.tuberculosis and risk factors for tuberculosis transmission in Paris, France, and Surrounding Area. // J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.486-492.

129. Hauer B, Serke M, Loddenkemper R. et al. Various polyresistant strains of M.tuberculosis in one patient (case report).//Int. J. Tuberc. Lung dis. 1999. -v.3. -p.122-124.

130. Hawkins J, Wallace R, Brown B. Antibacterial susceptibility tests: mycobacteria. // In.: Manual of clinical microbiology, (ed. A.Balows et al.). -Washington, -1991.-p. 1138-1152.

131. Hazbon M, Orozco S, Labrada L. et al. Evaluation of is-test for susceptibility testing of multidrug-resistant isolates of M.tuberculosis.// J. Clin. Microbiol.- 2000. v.38.- p. 4599-4603.

132. Heifets L. Antituberculosis drugs: antimicrobial activity in vitro. In L.B. Heifets (ed.), Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections, 1st ed. CRC Press, Boca Raton, Fla. 1991. - p. 14-57.

133. Heifets L, binder T, Sanchez T. et al. Two liquid medium systems, Mycobacterium Growth Indicator Tube and MB Redox Tube, for M.tuberculosis isolation from sputum specimens. // J.Clin. Microbiol. 2000. - v.38. - p. 12271230.

134. Heym B, Honore N, Truffot-Pernot C. et al. Implications of multidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis: a molecular study.// Lancet. 1994. - v.344. - p.293-298.

135. Heym B, Alzari P, Honore N, Cole S. Missens mutations in the catalase-peroxidase gene, katG, are associated with isoniazid resistance in M. tuberculosis. II Mol. Microbiol. 1995. - v.15. - p.235-245.

136. Hewish M, Meikle A, Hunter S. et al. Quantifying phagocytosis of M.avium complex by human monocytes in whole blood.// Immunol. Cell Biol.-1996. v.74. - p.306-312.

137. Huang G, Lin T, M.tuberculosis L-forms.// Microb. Ecol. Health Dis.1998. v.10. - p.129-133.

138. Hunt J, Roberts G, Stockman L. et al. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens.// Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - v.18. - p.219-227.

139. Iademarco M, Salfinger M, Zuber P. Evalution of laboratory methods used to examine sputum specimens for M.tuberculosis JI Int. J. Tuberc. Lung Dis.1999.-v.3.-p.482-485.

140. Imwidthaya P, Mieskes K, Rienthong S. Evaluation of katG codon 315 mutations among isoniazid sensitive and resistant M.tuberculosis isolates from Thailand. //Med. Thai 2001. - v.84. - p.864.

141. Iseman M. Evolution of drug-resistant tuberculosis: a tale of two species.// Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1994. - v.91. - p.2428-2429.

142. Iseman M, Madsen D. Drug-resistant tuberculosiss. // Clin. Chest. Med. -1989.-v.10.-p. 341-353.

143. Jaber M. A simple method of DNA extraction from M.tuberculosis./1 Tubercle Lung Dis. 1995. - v.76. - p.578-581.

144. Jacobs R. Multiple drug-resistant tuberculosis.// Clin. Infect. Dis 1994. -v.19. -p.1-8.

145. Jenks P. Sequencing microbial genomes-what will it do for microbiology?// J. Med. Microbiol. 1998. - v.47. - p.375-382.

146. Jin D, Gross C. Mapping and sequencing of mutations in the E.coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance.//J. Mol. Biol. 1998. - v.202. - p.45-54.

147. Kam K, Yip C. Surveillance of M.tuberculosis drug resistance in Hong Kong, 1986-1999, after the implementation of directly observed treatment.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2001. - v.5. - p. 815-23.

148. Kam K, Yip C, Tse L. et al. Utility of mycobacterial interspersed repetetive unit typing for differentiating multidrug-resistant M.tuberculosis isolates of the Beijing family.//J. Clin. Microbiol. 2005. - v.43. - p.306-313.

149. Kamerbeek J, Schouls L., Коlk A. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of M. tuberculosis for diagnosis and epidemiology.// J Clin. Microbiol. 1997. - v.35. - p.907-914.

150. Kent P, Kubica G. Public health Mycobacteriology a guide for the Levee 3 laboratory.// U.S. Departament of Health and human services. Centers for Dis. Contr.Atlantia,Georgia 30333.

151. Khisimuzi M, Slayden R, Ya qi Zhu. Inhibition of a M.tuberculosis /?-ketoacil ACP synthase by isoniazid. // Science. 1998. - v.280. - p. 1607-1610.

152. Kim T, Khanh H, Minh L. et al. Molecular fingerprinting of M.tuberculosis strains isolated in Vietnam using IS6110 as probe.//Tubercle Lung Dis. 2000. -v.81. -p.75-83.

153. Kochi A, Vareldris B, Styblo K. Multidrug -resistant tuberculosis and its control.//Res. Microbiol. 1993. - v.144. - p.104-106.

154. Kremer K, van Soolingen D, Putova I, Kubin M. Use of/£6110 DNA fingerprinting in tracing man-to-man transmission of M.tuberculosis in the Czech Republic.//Center Eur J Publ. 1996. - №.4. - p.3-6.

155. Kremer K, Dover L, Morbidoni H. et al. Inhibition of inhA activity, but not kasA activity, induces formation of a fosw^-containing complex in Mycobacteria.,// J. Biol. Chem. 2003. - v.278. - p.20547-20554.

156. Kruuner A, Sillastu H, Danilovitsh M. et al. Drug resistant tuberculosis in Estonia. //Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1998. v.2. - p.130-133.

157. Kubica T, Rusch-Gerdes S, Niemann S. The Beijing genotype is emerging among multidrug-resistant M.tuberculosis strains from Germany. // Int. J. Tub. Lung Dis. 2004. - v.8. - p. 1107-1113.

158. Kwiatkowska S, Marczak I, Lieba M, Nowa K. Clinical utility of a commercial ligase chain reaction kit for the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis.// Tubercle Lung Dis. 1993. - v.74. - p.421-425.

159. Larsen M, Vilcheze C, Kremer L. et al. Over expression of inhA, but not kas A, confers resistance to isoniazid and ethionamide in M.smegmatis, M.bovis and M.tuberculosis.// Mol. Microbiol. 2002. - v.46. - p.453-466.

160. Lavender C, Globan M, Sievers A. et al. Molecular Characterization of isoniazid-resistant M.tuberculosis isolates collected in Australia.// Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - v.49. - p.4068-4074.

161. Lee A, Tang L, Lim I. et al. Lac of clinical significance for the common Arginine-to-leucine substitution at codon 463 of the katG gene in isoniazid-resistant M.tuberculosis in Singapore.//JID. 1997. - v.176. - p.l 125-1126.

162. Lee A, Teo A, Wong S. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant M. tuberculosis isolates.// Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - v.45. - p.2157-2159

163. Lee G, Andrey S. et al. Novel mutations in ndh in isoniazid-resistant M.tuberculosis isolates.// Antimicrob. Agents and Chemotherapy.—2001. -v.45. p.2157-2159.

164. Lee H, Cho S, Bang H. et al. Exlusive mutations related to isoniazid and ethionamide resistance among M.tuberculosis isolates from Korea.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v.4. - p.441-447.

165. Lee W.R. Drug-resistant tuberculosis.// Clinic Infect. Dis.-1993.-v.17.-p.442-446.

166. Leimane V, Leimans J. Surveillance of multi-drug resistant tuberculosis in Latvia. //Int J Tuberc. Lung Dis. 1998. - v.2. - p.297-301.

167. Levin M, Hatfull G. Mycobacterium smegmatis RNA polymerase: DNA su-percoiling, action of rifampicin and mechanism of rifampicin resistance.// Mol Microbiol. - 1993. - v.8. - p.277-285.

168. Levine R.Steatorrhea induced by para-aminosalicilic acid.// Ann Intern Med -1968.-v.68.-p. 1265-1270.

169. Lukacs J, Sor E, Bohacs A. et al. Tuberculosis due to multidrug resistant M.tuberculosis Beijing genotype indentified by DNA fingerprinting: the first case indentified in Hungary.// Orv. Hetil. 2005. - v. 146. - p. 1833-1837.

170. Magdalena L, Vachnee A., Supplu P. et al. Identification of a new DNA region specific for members of M.tuberculosis complex.// J. Clin. Microb. 1998. -v.36. -p.2471-2476.

171. Manca C, Paul C, Barry C. et al. M.tuberculosis catalase and peroxidase activities and resistance to oxidative killing in human monocytes in vitro.// Infect, and Immunol. 1999. - v.67. - p.74-79.

172. Master S, Zahrt T, Song J, Deretic V. Mapping of M.tuberculosis katG promoters and their differential expression in infected macrophages. //Bacteriology. 2001. - v. 183. - p.254-263.

173. Matsiota-Bernard P, Vrioni G, Marinis E. Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical M.tuberculosis isolates from Greece.// J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.20-23.

174. McClure W, Cech C. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. // J. Biol. Chem. -1978. v.253. - p. 8949-8956.

175. Mc Hugh T, Newport L, Gillespie S. // 7S6110 homologies are present in multiple copies in mycobacteria other than tuberculosis-causing mycobacteria. /Л Clin Microbiol. 1998. - v.35. - p.273-277.

176. Mdluli К, Slauden R, Zhu Y,et al.// Inhibition of M.tuberculosis beta-ketoacyl ACP synthase by isoniszid. Science-1998.-v.280.-p.1607-1610.

177. Mikhailovich V, Lapa S, Gryadunov D. et al. Identification of rifampin-resistant M.tuberculosis strains by hybridization, PCR, and Ligase detection reaction on oligonucleotide microchips. // J. Clin. Microbiol. 2001. - v.39. -p.2531-2540.

178. Mokrousov I, Narvskaya O, Otten T. High prevalence of katG Ser315Thr substitution among isoniazid resistant M.tuberculosis clinical isolates from Northwestern Russia, 1996 to 2001.// Antimicrob. Agents Chemother. 2002. -v.46. - p.1417-1424.

179. Mokrousov I, Otten T, Filipenko M. Detection of isoniazid-resistant M.tuberculosis strains by a multyplex allele-specific PCR assay targeting katG codon 315 variation.// J. Clin. Microbiol. 2002. - v.40. - p.2509-2512.

180. Mokrousov I, Otten T, Vyazovaya A. et al. PCR-based methodology for detecting multidrug-resistant strains of M.tuberculosis Beijing family circulating in Russia.// Eur. J.Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - v.22. - p.342-348.

181. Mokrousov I, Otten T, Vyshnevskiy B, Narvskaya O. Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant M.tuberculosis in sputum smears.//Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - v.47. - p.2231-2235.

182. Musser J. Antimicrobial agents resistance in mucobacteria:molecular genetic insights.// Clin. Microbiol. Rev. 1995. - v.8. - p. 496-514.

183. Nachamkin I, Kang C, Weinstein M. Detection of resistance to isoniazid, rifampin and streptomycin in clinical isolates of M. tuberculosis by molecular methods. // Clin. Infect. Dis. 1997. - v.24. - p.894-900.

184. Narvskaya 0, Mokrousov I, Limeschenko E. et al. Molecular characterization of M. tuberculosis strains from north-west region of Russia.// Epi. North. -2000. v.2. - p.22-24.

185. Narvskaya O, Otten T, Limeschenko E. et al. Nosocomial outbreak of mul-tidrug-resistfnt tuberculosis caused by a strain of M.tuberculosis W-Beijing family in St.Petersburg,Russia.// Eur. J. Clin. Microb. Infect. Dis. 2002. - v.21. - p.596-602.

186. Nieman S, Rusch-Gerdes S, Richter E. Fingerprinting of drug-resistant M.tuberculosis strains isolated in Germany during 1995.//J.Clin.Microbiol. -1997,- v.35. p.3015-3020.

187. Niyaz A, Monanty A, Mukhopadhyay U. PCR- based rapid detection of M. tuberculosis in blood from immunocompetent patients with pulmonary tuberculosis.// J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.394-395.

188. Nutini S, Tortoli E, Corrado A. Multidrug-resistant tuberculosis in the Fluorence province from 1992 to 1995.//Int. J. Tub. Lung Dis. 1998. - v.2. -p.484-489

189. Ohno H, Koga H, Kohno S. et al. Relationship between rifampin MICs and rpoB mutations of M.tuberculosis strains isolated in Japan.// Antimicrob. Agents Chemother. 1996. - v.40. - p.1053-1056.

190. Olle-Goig I. Culliyy J, Vargas R. A survey of prescribing patterns for tuberculosis treatment amongst doctors in a Bolivian city.// Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1999.-v.3.-p.54-57.

191. Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Sekya Т. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - v.86. - p.2766-2770.

192. Pagan -Ramos E, Song I, Mc Falone M. et al. Oxidative stress response and characterization of the oxyR-ahpC and furA-katG loci in M. tuberculosis J I J. Bacterid. 1998. - v.180. - p.4856-4864.

193. Patel R, Kvach J, Mounts P. Isolation and restriction endonuclease analysis of mycobacterial DNA.// J. Gen. Microbiol. 1986. - v.132. - p.541-555.

194. Ping C, Ruiz R, Li Q. The M.tuberculosis alternate sigma factor SigF, controls late-stage bacterial virulence.// Tubercle Lung Dis. 2000. - v.81. - p.87.

195. Pretorius G, Van Helden P, Sirgel F. et al. Mutation in katG gene se-guences in isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis are Rare.// Antimicrob. Agents and Chemother.-1995.-v.39.-p.2276-2281.

196. Ramaswamy S, Musser J. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in M. tuberculosis\l998 update.// Tubercle Lung Dis. 1998. - v.79. -p.3-29.

197. Ramaswamy S, Reich R, Dou S. et al. Single nucleotide polymorphisms in genes associated with isoniazid resistance in M.tuberculosis./! Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - v.47. - p.1241-1250.

198. Ramaswamy S, Reich R, Dou S. et al. Genotypic analysis of multidrug-resistant M.tuberculosis isolates from Monterrey, Mexico.// J. Bacteriol. 2004.- v.186. -p.104-106.

199. Rapiti E, Fano V, Forastiere F. et al. Determinants of tuberculosis in an immigrant population in Rome: A case-control study.// Int. J. Tuberc. Lung Dis.- 1998. v.2. - p.479-483.

200. Ratledge C. Iron, mycobacteria and tuberculosis.// Tubercul.-2004.-v.84.-p.110-130.

201. Rattan A, Awdhesh K, Nishat A. Multidrug-resistant M.tuberculosis: molecular perspectives. // Emerg. Infect. Dis. 1998. - v.4. - p.195-209.

202. Reddy M, Luna-Herrera J, Daneluzzi D, Gangadharum P. Chemotherapeu-tic activity of benzoxazinorifamycin, KRM-1648, against M.tuberculosis in C57BL/6 mice.// Tubercle Lung Dis. 1996. - v.77. - p. 154-159.

203. Rhee J, Tanaka M, Behr M. et al. Use multiple marcers in population-based moiecular epidemiologic studies of tuberculosis.// Tubercle Lung Dis. 2000. -v.80. - p.103-104.

204. Rinder H, Thomschke A, Rusch-Gerdes S. et al. Significance of ahpC promoter mutations for the prediction of isoniazid resistance in M. tuberculosis.// Eur. J. Clin Microbiol. Infect. Dis. 1998. - v.17. - p.508-511

205. Rindi L, Nicletta L, Garzelli C. et al. Search for genes potentialy involved in M.tuberculosis virulence by mRNA differential displey.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - v.25. - p.94-101.

206. Riska P, Jakobs W, Alland D. Molecular determinants of drug resistance in tuberculosis.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v.4. - №2. - p.4-10.

207. Rodrigues C. DNA amplification of /£6110 in rapid detection of M.tuberculosis.//Indian J. Med. Microbiol. 1997. - v. 15. - p. 167-171.

208. Rohner P, Ninet B, Metral C. et al. Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens.// J. Clin. Microb. 1997. - v.35. - p.3127-3131.

209. Rouse D, Zhongming 1, Bai G. et al. Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of M. tuberculosis.// Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - v.39. - №11. - p.2472-2477.'

210. Rubina A, Dementieva A, Stomakhin A. et al. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications.// Biotechniques. 2003. -v.34. - p.1008-1022.

211. Riisch-Gerdes S, Domehl C, Nardi G. et al. Multicenter evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for testing susceptibility of M. tuberculosis to first-line drugs. // J. Clin. Microb. 1999. - v.37. - p.45-48.

212. Rys P, Felmlee T. // PCR protocols for emerging infectious Diseases. In.: A supplement to diagnostic molecular microbiology: principles and applications. D.H. Persing (ed.). 1996. - p.l06-111.

213. Sajduda A, Dziadek J, Dela A. et al. DNA fingerprinting as an indicator of active transmission multidrug-resistant tuberculosis in Poland.// Int. J. Infec. Dis. 1998.-№1.-р.12017-12018.

214. Saint-Joanis В., Souchon H, Wilming M. et al. Use of site-directed mutagenesis to probe the structure, function and isoniazid activation on the catalase/peroxidase, katG, from M.tuberculosis//Biochem. J.-1999.-v.338.-p.753-760.

215. Sampson S, Lukey P, Warren R. et al. Expression, characterization and subcellular localization of the M.tuberculosis PPE gene Rvl917.// Tuberculosis.- 2001. v.81. - p.3056-317.

216. Sechi L, Zanetti S, Dupre I. et al. Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences as molecular targets for typing of M.tuberculosis strains.// J. Clin. Microb. 1998. - v. 36. - p. 128-132.

217. Sechi L, Zanetti S, Sanguinetti M. Molecular basis of rifampin and isoniazid resistance in M.bovis strains isolated in Sardinia, Italy.// Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - v. 45(6). - p. 1645-1647.

218. Sharma S, Mohan A. Multidrug-resistant tuberculosis.// Indian J. Med. Res.- 2004. v.120. - p.354-376.

219. Shi R, Otomo K, Yamada H. et al. Temperature-mediated heteroduplex analysis for the detection of drug-resistant gene mutations in clinical isolates of M.tuberculosis by denaturing HPLC, SURVEYOR nuclease.// Microb. Infect. -2005. v.21. - p.32-41.

220. Shinder D, Cauthen G, Farer L. et al. Drug-resistant tuberculosis.// Amer.Rev.Resp.Dis. 1991. - v.141. - p.732-732.

221. Shinnik T. Molecular approach to the diagnosis of tuberculosis.// In.: Tuberculosis: pathogenesis, protection and control. (Ed. Bloom В.). Washington. -1994.-v.30.-p. 517-530.

222. Singh R, Wiseman B, Deemagarn T. et al. Catalase-peroxidases (kat G) exibit NADH oxidase activity.// J. Biol. Chem. 2004. - v.279. - p.43098-43106.

223. Slayden R, Lee R, Barry C. Isoniazid affects multiple components of the type 11 fatty acid-syntetase system of M. tuberculosis JIMo\. Microbiol. 2000. -v.38(3).-p 514-525.

224. Soini H, Pan X, Amol A. et al. Characterization of M.tuberculosis isolates from patients in Houston, Texas, by Spoligotyping. // J. Clin. Microbiol. 2000. -v.38. - p.669-676.

225. Sola C, Horgen L, Maiseff I. et al. Spoligotyping followed by double-repetitive PCR as rapid alternative to /£6110 fingerprinting for epidemiological studies of tuberculosis.//J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.l 122-1124.

226. Sola C, Filliol I, Gutierrez C. et al. Spoligotype database of M.tuberculosis: biogeografhic distribution of shared types and epidemiologic and phylogenetic perspectives.// Emerg. Infect. Dis. 2001. - v.7. - p.390-396.

227. Somoskovi A, Kodmon C, Lantos A. et al. Comparison using recoveries of Mycobacterium tuberculosis using the automated BACTEC MGIT 960 system, the BACTEC 460 ТВ system, and Lowenstein-Jensen medium. // Respir. Res. -2001. -v.2. -p.164-168.

228. Sperhacke R, Mello F., Zaha A. et al. Detection of M.tuberculosis by a polymerase chain reaction colorometric dot-blot assay.//Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2004. v.8. - p.267-270.

229. Stauffer F, Haber H, Rilger A. Genus level identification of mycobacteria from clinical specimens by using an Easy-To-Handle mycobacterium-specific PCR assay// J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.614-617.

230. Streicher E, Warren R, Kewley C. et al. Genotypic and phenotypic characterization of drug-resistant M.tuberculosis isolates from rural districts of the Western Cape province of South Africa.// J. Clin. Microbiol. 2004. - v.42. -p.891-894.

231. Sue W, Kiran G, Jonjoe M. et al. Context-sensitive transposition of IS6110 in mycobacteria.//Microbiology. 1999.-v.145. - p.3169-3176.

232. Tan Y, Zhang Y. Quantitative detection of M.tuberculosis DNA in peripheral blood from patients with pulmonary tuberculosis by AmpliSensor-PCR technique.// Zhonghua lie He He Hu Xi Za Zhi. 1999. - v.22. - p.481-483.

233. Taniguchi H, Aramaki H, Nikaido Y. et al. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in M. tuberculosis.//FEMS Microbiol. Letters. 1996. -v.144. - p.103-108.

234. Telenty A, Imboden P, Marchesi F. et al. Detection of rifampicin-resistant mutations inM tuberculosis.//Lancet. 1993. - v.341. - p.647-50.

235. Telenty A., Imboden P, Schmidheini F. et al. Direct, automated detection of rifampin M.tuberculosis by PCR and SSCP. //Antimicrob. Agents Chemother. 1993. - v.37. - p.2054-8.

236. Telenty A, Honore N, Bernasconi C. et al. Genotypinc assessment of isoniazid and rifampin resistance in M.tuberculosis: a blind study at reference laboratory level.// J. Clin. Microbiol. 1997. - №3. - p.719-723.

237. Telles M, Ferrazoli L, Waldman E. et al. A population-based study of drug resistance and transmission of tuberculosis in an urban community.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2005. - v.9. - p.970-976.

238. Therry D, Chavarot P, Marchal G. et al. M.tuberculosis strains unidentified using the IS6110 probe can be detected by oigonucleotides derived from the Mt 308 sequence.//Res. Microbiol. 1995. - v.146. -p.325-328.

239. Torres M, Criado A, Palomares I, Aznar J. Use of real-time PCR and fluorometry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in M. tuberculosis J/ J. Clin. Microbiol. 2000. - v.38. - p.3194-3199.

240. Torres M, Criado A., Gonzalez N. et al. Rifampin and isoniazid resistance associated mutation in M.tuberculosis clinical isolates in Seville, Spain// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2002. - v.6. - p. 160-163.

241. Tracevska T, Jonsone I, Baumanis V. et al. Prevalence of Beijing genotype in Latvian multidrug-resistant M.tuberculosis isolates.// J. Clin. Microbiol. -2004. v.42. - p.5528-5536.

242. Troesch A, Ngueyen H, Miyada C. et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe assays.// J. Clin. Microbiol. 1999. - v.37. - p.49-55.

243. Van Deun A, Aung K, Chowdhury S. et al. Drug susceptibility of M.tuberculosis in a rural area of Bangladesh and its relevance to the national treatment regimens// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v.3. - №2. - p. 143-148.

244. Van Deun A, Salim A, Dam P. et al. Drug resistance monitoring:combined rates may be the best indicator of programme performance. // Int. J.Tuberc Lung Dis. 2003. - v.7. - p.501-509.

245. Van Deutekom H.,Gerritsen J, van Soolingen D. et al. A molecular epidemiological approach to studying the transmission of tuberculosis in Amsterdam.// Clin. Infec. Dis. 1997. - №5. - p. 1071-1077

246. Van Duin J, Pijneburg J, van Ryswoud C. et al. Investigation of cross contamination in a M.tuberculosis laboratory using /£6110 DNA fingerprinting. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. - v.2. - p.425-429.

247. Van Soolingen D, Hoogenboezem T, de Baas P. et al. A novel pathogenic taxon of the M.tuberculosis complex, canettii characterization of an exceptional isolate from Africa.// Int. J. Syst. Bacteriol. 1997- v.47. - p.1236-1245.

248. Varma-Basil M, El-Hajj H, Colangeli R. et al. Rapid detection of rifampin resistance in M.tuberculosis isolates from India and Mexico by a molecular beacon assay. //Corresponding author. E-mail:allandda @umdnj.edu. 2004.

249. Victor T, Jordan A, van Rie A. et al. Detection of mutations in drug resistance genes of M.tuberculosis by a dot-blot hibridization strategy.// Tub. Lung Dis.- 1999. v.80.-p.343-348.

250. Viedma G, del Sol Diaz I, Lasala F. et al. New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in M.tuberculosis!I J. Clin. Microbiol. 2002. - v.40. -p.988-995.

251. Watterson S, Wilson S, Yates M, Drobniewski F. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in M. tuberculosis. II J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.1969-1973.

252. Wengenack N, Uhl J, Amand A. et al Evidence for differential binding of isoniazid by M.tuberculosis kat G and the isoniazid-resistant mutant katG (S315T).// Biochemistry. 1998. - v.37. - p.15825-15834.

253. Whelen A, Felmlee T, Hunt J. et al. Direct genotypic detection of M.tuberculosis rifampin resistance in clinical specimens by using single-tube heminested.// J. Clin. Microbiol. 1995. - v.33. - p. 556-561.

254. Williams D, Waguerpack C, Eisenach K. et al. Characterization of ri-fampin-resistance in pathogenic mycobacteria. // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - v.38. -p.2380-2386.

255. Williams D, Limbers C, Spring L. et al. PCR-heteroduplecx detection of rifampin-resistant M.tuberculosis. II In: PCR protocols for emerging infectious diseases. D.Persing (ed.) 1996. - p. 122-129.

256. Williams D, Spring L, Collins L. et al. Contribution of rpoB mutations to development of rifamicin cross-resistance in M.tuberculosis. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - v.42. - p. 1853-1857.

257. Williams D, Spring L, Gillis T. et al. Contribution of rpoB mutations to development of rifamycin cross-resistance in M.tuberculosis J7 Clin. Infect. Dis. -1998. v.26. - p.446-450.

258. Wilson S, Al-Suwaidi Z, McNerney R. et al. Evaluation of a new rapid bac-teriophage-based method for the drug susceptibility testing of M.tuberculosis.// Nat. Med. 1997. - v.3. - p.465-468.

259. Winder F. // In.: The biology of the mycobacteria (ed. C.Ratledge and J.Stanford). -Academic Press. London. - 1982. - v.l. - p.353-438.

260. Wobeser W, Broukhanski G, Hoeppner V. et al. Application of a commercial DNA typing kit (Isogen) for analysis of M.tuberculosis isolates from remote Northern Canadian communities.// Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000. - v.4. -p.1105.

261. Wu X, Zhang J, Zhuang X. et al. Molecular mechanisms of drug resistance in M.tuberculosis clinical isolates //Chin. Med. J. 1999. - v.l 12. - p. 524-528.

262. Yang Z, Barnes P, Chaves F. et al. Diversity of DNA fingerprints of M.tuberculosis isolates in the United States.// J. Clin. Microbiol. 1998. - v.36. - p.1003-1007.

263. Yew W, Tong S, Lui K. et al. Comparison of MB/BacT system and agar proportion method in drug susceptibility testing of M. tuberculosis.II Diagn. Microb. Infect. Dis. 2001. - v. 39. - p. 229-232.

264. Van Doom H, Kuijper E., van der Ende A. et al. The susceptibility of M.tuberculosis to isoniazid and the Arg-Leu mutation at codon 463 of katG are not associated.// J. Clin. Microb. 2001. - v.39. - p.1591-1594.

265. Villegas M, Labtada L, Sazvia V. Evaluation of polymerasa chain reaction, adenosindeaminase and interferon-gammain pleural fluid for differential diagnosis of pleural tuberculosis // Chest. 2000. - v.l 18. - p.1355-1364.

266. Zahrt T, Song I, Siple J. et al. Mycobacterial FurA is a negative regulator of catalase-peroxidase gene katG. II J. Mol. Microbiol. 2001. - v.39(5). -p.1174-1185.

267. Zhang Y, Heym B, Allen B. et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mtuberculosis.il Nature. 1992. - v.358. - p.591-593.

268. Zhang Y, Vilcheze C, Jacobs W. Mechanism of drug resistance in M.tuberculosis. II In.: Tuberculosis and the tubercle bacillus (Ed. T. Stewart et al.).-Washington. -2005.

269. Zhang Z, Ishaque M. Evaluation of methods for isolation of DNA from slowly and rapidly growing mycobacteria.// Int J Leprosy. 1997. - v.65. -p.469-476.

270. Zhu M, Xia P, Zhang. Y. Detecting mycobacteria and their L-forms in peripheral blood from pulmonary tuberculosis patients by cultivation with hemo-lyzed-centrifugated blood in liguid medium.// Zhonghua Jie He He Hu Xi Zhi. -2000.-v.23.-p.556-8.

271. Zwolska Z, Augustynowicz-Kopec E, Klatt M. Drug resistance, primary and acquired, among M.tuberculosis strains isolated from patients in Poland in the years 1996-1997. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. - v.3. - p. 112-115.

Информация о работе

Скотникова, Ольга Ивановна
доктора биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Применение новых молекулярно-биологических технологий для выявления Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы