Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Преждевременное разделение центромер метафазных хромосом как перспективный диагностический и прогностический маркер при острой лимфобластной лейкемии у детей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Преждевременное разделение центромер метафазных хромосом как перспективный диагностический и прогностический маркер при острой лимфобластной лейкемии у детей"

?V6 oft

- i\ ОіП г&

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТШШОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Сіренко Артур Г еннадіііович

УДК 576.312.32.32/:38:616-006.446.2:612-076.5.

ПЕРЕДЧАСНЕ РОЗДІЛЕННЯ ЦЕНТРОМЕР МЕТАФАЗНИХ ХРОМОСОМ ЯК ПЕРСПЕКТИВНИЙ ДІАГНОСТИЧНИЙ І ПРОГНОСТИЧНИЙ МАРКЕР ПРИ ГОСТРІЙ ЛІМФОБЛАСТНІЙ

ЛЕЙКЕМІЇ У ДІТЕЙ

03.00.15. - генетика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському науково-дослідному інституті спадкової патології' (м. Львів, Україна), Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук Акопян Гаяне Рубенівна,

НДІ спадкової паголопі' МОЗ України, завідуюча відділенням генетики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Малюта Станіслав Станиславович,

Інстшуг молекулярної біології' та генетики НАН України, завідуючий відділом молекулярної генетики;

кандвдат біологічних наук, старший науковий співробітник . Глазко Тетяна Теодорівна,

Інститут агроекології та біотехнології УААН, завідуюча лабораторією генетики екологічних стресів.

Провідна установа: Український науковий гігієнічний центр МОЗ України, м. Київ, вул. Попудреика, 50.

Захист відбудеться: «^~ » 2{СО$>Мґі 2000 року о 10-00 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01. в Інституті клітинної біології і генетичної інженерії за адресою: м.Київ-143, вул. ак. Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії за адресою: м. Київ-143, вул. ак. Заболотного, 148

Автореферат розісланий" $ " С&і/І Я___________________2000 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради _______Тарасенко Л.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Ефективне лікування дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) передбачає наявність об'єктивної інформації як про тип (підтип) лейкемії, так і про масштаби генного дисбалансу геному клітин лімфоїдного ряду внаслідок змін у структурі та (або) кількості хромосом. В залежності від характеру вторинних змін хромосом можна передбачити деякі ознаки пухлинного процесу і, зокрема, важкість перебігу, стійкість до традиційних схем хіміотерапії, ймовірність досягнення стійкої ремісії та ризик нового рецидиву захворювання. Визначальними критеріями щодо вибору тактики лікування та оцінки прогнозу ГЛЛ у дітей вважають наявність структурних перебудов хромосом та зміни у плоїдності каріотипу клітин у лейкемічних клонах. В останні роки піднімається питання про діагностичну та прогностичну цінність інших цитогенетичних ознак, які здатні спричиняти геномний дизбаланс: явищам поліплоїдії, ендоредуплікації та змінам у порядку розділення метафазних хромосом. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом (ПРЦ) вважається однією з найбільш вірогідних причин виникнення анеуплоїдного каріотипу клітини. Оскільки виразні варіації у кількості хромосом набору є типовою ознакою клітинної трансформації, припускається вагома роль ПРЦ у патогенезі пухлинного процесу.

Актуальність теми. Незважаючи на значний прогрес у дослідженні молекулярно-генетичних механізмів виникнення гострої лімфобластної лейкемії (ГЛЛ), одного з найбільш поширених онкологічних захворювань дитячого віку, залишається відкритими питання патогенезу типових хромосомних трансформацій. Зміни плоїдності хромосомних наборів лейкемічних клітин вважаються однією з найбільш поширених клональних аномалій при ГЛЛ у дітей. Якщо утворення гіпердиплоїдішх клонів можна пояснити порушеннями у системі цитокінезу, то втрата або набуття поодиноких хромосом вимагає цілком іншого обірунтування. Виникнення анеуплоїдного каріотипу є наслідком порушень розділення хромосом в мітозі. На стадії метафази мітозу кожна хромосома візуалізується у вигляді двох ідентичних хроматид (сестринські хроматиди), кожна з яких містить ідентичну молекулу ДНТС. Сестринські хроматиди з'єднані у ділянці центромери і лише під час анафази відбувається їх розділення і міграція до полюсів клітини вже у якості самостійних хромосом. Передчасне розділення центромер, скорочено ПРЦ, має місце, коли на стадії метафази сестринські хроматиди вже є розділені у ділянці центромери. Переважно ПРЦ захоплює одну або декілка хромосом клітини, тоді як решта хромосом зберігають характерну метафазну структуру. Якщо центромери розійшлися в усіх хромосомах каріотипу, таку мітотичну клітину вважають С-анафазою або передчасною анафазою. Актуальність ПРЦ полягає в тому, що це явище вважається одним із провідних механізмів нерозходження

хромосом та виникнення анеуплоїдії каріотипу, тоді як функціональне значення С-анафази запишається невідомим.

На даний час передчасне розділення центромер не підлягає обов'язковій реєстрації при проведенні цитогенстичного дослідження. Попри це у авторитетному керівництві для цитогенетиків, виданому у Оксфорді у 1996-му році, даються рекомендації враховувати дане явище при аналізі метафазних хромосом. За даними літератури, існує широкий перелік захворювань, при яких ПРЦ та С-анафаза виявились невипадковими цитогенетичними ознаками клітини. Особливу увагу привертає значна поширеність ПРЦ при пухлинних захворюваннях. Під час каріотипування дітей, хворих на ГЛЛ та інші поширені гемобластози, ми часто реєстрували ПРЦ і С-анафази на препаратах хромосом клітин крові і кісткового мозку. Це природньо спричинило питання про інформативність урахування даного явища у цитогенетичній діагностиці гемобластозів. Для цього в даній роботі проводився порівняльний аналіз частоти клітин з передчасним розділенням центромер у здорових осіб та на різних етапах ГЛЛ у дітей, а також аналіз експресії даного явища в залежності від особливостей- перебігу захворювання та стану клініко-лабораторних показників. Оскільки перебіг будь-якого онкологічного процесу є тісно пов'язаний із здатністю організму контролювати та обмежувати ріст трансформованих клітин, актуальним аспектом даної роботи було дослідження явища апоптозу (фізіологічної загибелі клітин) у взаємозв'язку з експресією передчасного розділення центромер та перебігом ГЛЛ у дітей.

Предметом дослідження було явище передчасного розділення центромер метафазних хромосом у клітинах кісткового мозку та периферичної крові дітей, хворих на ГЛЛ, та здорових осіб.

Об’єкт дослідження складали хромосоми культивованих клітин кісткового мозку і периферичної крові дітей, хворих на ГЛЛ, та здорових осіб.

Метою роботи було дослідження інформативності

використання явища передчасного розділення центромер метафазних хромосом в якості діагностичного та прогностичного маркера перебігу гострої лімфобластної лейкемії у дітей. Цій меті були підпорядковані наступні завдання:

1. Дослідити частоту клітин з передчасним розділенням центромер на різних етапах перебігу ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей.

2. Дослідити взаємозв'язок явища ПРЦ з відомими кліиіко-лабораторними маркерами ГЛЛ у дітей.

3. Дослідити взаємозв'язок явища ПРЦ з виникненням анеуплоїдного стану каріотипу.

4. Дослідити взаємозв'язок між експресією ПРЦ та запрограмованою загибеллю клітин (рівнем апоптозу).

з

5. Дослідити інформативність ПРЦ у якості прогностичного критерію ГЛЛ у дітей.

Методи дослідження: культуральні, цитогенетичяі,

цитофлуориметричні, варіаційної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджено експресію передчасного розділення центромер метафазних хромосом у культивованих клітинах кісткового мозку і крові при гострій лімфобластній лейкемії у дітей. Встановлено типові ознаки експресії даного явища в мітотичних клітинах кісткового мозку і крові у дитячому віці в нормі та на різних стадіях перебігу ГЛЛ, зокрема, його відтворення у стані С-анафази (повного розділення центромер всіх хромосом клітини) або передчасного розділення центромер поодиноких хромосом (ПРЦ) із залученням різної кількості хромосом певних груп. Встановлено статистично вірогідну відмінність в експресії даного явища при ГЛЛ та інших поширених гемобластозах у дітей, порівняно з контролем. Статистично обгрунтовано закономірність змін в експресії передчасного розділення центромер у гострій фазі ГЛЛ та па стадії ремісії. Встановлено відмінність в експресії С-анафази та ПРЦ у випадках повної і неповної ремісії ГЛЛ у дітей. З'ясовано функціональну різнорідність явищ С-анафази і ПРЦ при ГЛЛ у дітей. Статистично доведено, що ПРЦ з високою ймовірністю відповідає бластним клітинам і є провідною причиною анеуплоїдизації їх каріотипу. Вперше встановлено, що С-анафаза с цитогенетичним маркером клітин, які гинуть шляхом апоптозу. Встановлено, що експресія С-анафази у гострій фазі ГЛЛ на рівні контрольних показників асоціюється з несприятливим прогнозом захворювання, тоді як її реєстрація на рівні 10% клітин і вище вказує на високу’ ймовіність досягнення стійкої ремісії, Продемонстровано кореляцію у визначенні прогнозу шляхом урахування експресії С-анафази та при застосуванні відомих клініко-лабораторних прогностичних критеріїв. .

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати вказують на перспективність урахування експресії передчасного розділення центромер метафазних хромосом у якості діагностичного та прогностичного критерію перебігу ГЛЛ у дітей. Визначено межі експресії та структуру передчасного розділення центромер в нормі, у гострій фазі ГЛЛ та на стадіях неповної і повної ремісії захворювання. Встановлено асоціацію ПРЦ з лейкемічними бластними клітинами, що дозволяє використовувати дане явище для моніторингу трансформованих клітин на препаратах хромосом. Встановлено асоціацію явища С-анафази з реалізацією програми апоптозу, що у перспективі може бути використаним для моніторингу апоптозу у культурі клітин. З'ясовано перспективність урахування експресії С-анафази для визначення перебігу ГЛЛ у дітей: асоціацію з несприятливим прогнозом при появі на рівні 0-1%

мітотичних клітин та високу ймовірність досягнення стійкої ремісії пр відтворенні на рівні 10% мітотичних клітин.

Реалізація результатів роботи. Результати дослідження феномен передчасного розділення центромер впроваджуються у Львівські Обласній Дитячій Спеціалізованій Клінічній Лікарні як додаткови діагностичний критерій.

Особистий внесок здобувача. Основні експериментальні дані бул одержані здобувачєм особисто: освоєно методи приготуванн

хромосомних препаратів кісткового мозку і периферичної крові хворих н ГЛЛ, освоєно методи роботи на проточному цитофлуориметрі, одержано проаналізовано хромосомні препарати периферичної крові та кістковог мозку дітей хворих на ГЛЛ та інші поширені гемобластози, та здорови: осіб, одержано результати цитофлуориметричного визначення частот: аиоптичних клітин. Здобувач особисто зробив пошук літератури і написа тект дисертації. У дисертацію включені лише ті наукові результати, як отримані дисертантом особисто. Автор безпосередньо брав участь : експериментальних і теоритичних дослідженнях. В опублікованих з співавторами наукових працях здобувану належить 70-80 °/

експериментальних та теоритичних даних.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаці доповідалися на ХУШ-му Міжнародному конгресі з аналітичної цитологі (м. Ріміні, Італія, 1996), XVI-му Європейському конгресі з гематології т імунології (м. Тессалоніки, Греція, 1997), ІІ-му Міжнародному медичном; конгресі молодих вчених і студентів (м. Тернопіль, Україна, 1998), ІІ-іі конференції Європейської дитогенетичної асоціації (м. Відень, Австрія 1999).

Публікації. Основні положення і результати досліджен; опубліковані у 9 роботах, з яких 6 статей та З тез до виступів ні міжнародних наукових конференціях та конгресах.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 16; сторінках машинопису і складається з вступу, огляду літератури, опис; об'єкту, об'єму, матеріалів та методів дослідження, розділу отриманий результатів дослідження, обговорення отриманих даних, висновків практичних рекомендацій, переліку посилань використаної літератури додатку. Перелік посилань містить 164 джерела. Демонстративниі матеріал представлений у вигляді 19 таблиць і 11 рисунків.

На захист виносяться наступні положення:

1. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом клітш крові і кісткового мозку є типовою ознакою гострої фази ГЛЛ та інши> поширених гемобластозів у дітей.

2. Метафазні клітини з передчасним розділенням центромер декількох хромосом (ПРЦ) з високою ймовірністю відповідають бластниг. клітинам.

3. Явище ПРЦ може бути причиною виникнення анеуплоїдного хромосомного набору клітини.

4. Метафазні клітини з передчасним розділенням центромер всіх хромосом (С-анафаза) з високою ймовірністю відповідають бластним клітинам, які знаходяться на стадії запрограмованої загибелі (апоптозу).

5. Частота С-анафаз у гострій фазі ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей демонструє вірогідну кореляцію з прогнозом захворювання.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ.

У першому розділі описано сучасні погляди на проблему онкогенезу та генетичні механізми гострого лімфобластного лейкозу у дітей, на механізм розділення центромер в нормальній клітині та охарактеризовано нинішній стан дослідження феномену передчасного розділення центромер метафазних хромосом, сучасні погляди на явище апоптозу.

На основі аналізу досліджень, що викладені в роботах Berger R., Sandberg A., Raimondi S., Melo J., Akao Y. та in.,узагальнені сучасні уявлення про механізм онкогенезу гострого лімфобластного лейкозу.

Згідно сучасних уявлень на онкогенез гострих лейкозів всі випадки ГЛЛ спричинені хромосомними мутаціями (транслокаціями, делеціями, інверсіями, дуплікаціями), що виникають у кістковому мозку (КМ). Коли локалізація цих хромосомних мутацій співпадає з локалізацією протоонкогенів, утворюються химерні гени, трансляція яких і обумовлює виникнення проліферуючого злоякісного клону. Різні хромосомні аномалії мають різне прогностичне значення. Наявність одних (таких як t (9; 14) є несприятливою ознакою з високою летальністю та високим ризиком рецидиву, інші (такі як гіпердиплоїдія) вказують на сприятливий прогноз і високу ймовірність довготривалої ремісії. Описано вже більше 70 різних хромосомних мутацій, які не випадкові при ГЛЛ і є причиною винекнення лейкозного клону.

На основі аналізу досліджень, що викладені в роботах Fitzgerald P., Mehes G., Mehes К., Buhler E., Vig B., Alberts В та ін.,узагальнені сучасні уявлення про механізм розділення центромер в нормі і при патології та сучасні погляди на феномен передчасного розділення центромер метафазних хромосом.

Феномен передчасного розділення центромер (ПРЦ) метафазних хромосом - явище недостатньо досліджене, його молекулярно-генетичні механізми невідомі.Відкрите ще у 70-ті роки XX століття, воно довгий час вважалося випадковим. Але пізніше було доведено зв’язок феномену ПРЦ з рядом захворювань: розсіяним слерозом, онкологічними захворюваннями та ін. Проте, як проявляється цей феномен при гострому лімфобластному лейкозі (ГЛЛ), яке його діагностичне та прогностичне значення при ГЛЛ

досі практично не досліджувалося. Яка роль феномену ПРЦ у процесі лейкемізації, у виникненні гіпоплоїдних клонів, яка його роль у виникненні і розвитку ГЛЛ - досі не встановлено. На сьогодні доведеним вважається лише те, що феномен ПРЦ є явищем невипадковим - він пов’язаний з рядом захворювань, зокрема з такими захворюваннями як синдром Альцгеймера, синдром Робертса, фолат-дефіцитними анеміями та рядом онкологічних захворювань, в тому числі з гостріш мієлобласпшм лейкозом (ГМЛ). Встановлено зв’язок феномену ПРЦ з процесом старіння клітин.Вважаєгься доведеним, що феномен ПРЦ пов’язаний з процесом утворення анеуплоїдних клонів, ендоредуплікантів, подіплоїдних клонів.Вважають, що механізм виникненя ПРЦ пов’язаний з процесом метилювання ДНК, доведено, що феномен ПРЦ пов’язаний з внутрішньоклітинним дефіцитом фолатів - донорів метилових радикалів в процесі метилювання.

Розрізняють дві різновидності ПРЦ - повне (або С-анафаза) та часткове (або PCD - далі ПРЦ). При частковому ПРЦ у феномен задіяні від

1 до 23 хромосом каріотипу (рис 7), а при повному ПРЦ задіяні від 50 до 100 % хромосом (рис. 6). Повне і часткове ПРЦ вважається принципово різними явищами з різними механізмами та різним функціональним значенням і розглядаються окремо. Явище повного ПРЦ в літературі називають С-анафазою.

У цьому розділі на основі праць Стойки Р.С., Фільченкова А.А., Gorman A., Nazareth L. та багатьох інших охарактеризоване явище апоптозу (запрограмованої смерті клітин), сучасні погляди на його механізми і зв'язок з іншими процесами в клітині, показано одночасну реєстрацію індукції апоптозу і різних клітинних аномалій, що пов’язані з феноменом ПРЦ. Описано випадки паралельної реєстрації індукції апоптозу і цитогенетичних варіантів клітинної конституції, що пов’язані з феноменом ПРЦ. В цілому ряді робіт, що з’явилися друком в останні 1-2 роки виявлено наявність факторів, що одночасно є індукторами апоптозу або безпесоредньо зв’язані з його індукцією і одночасно пов’язані з прцесом розділення центромер. Так в цих роботах доведено, що білки CTNP, які безпосередньо пов’язані з функціонуванням центромери, пов’зані з явищем апоптозу. Так доведено, що білок CENP-C пов’язаний з індукцією апоптозу - мишача клітинна лінія DT40 з мутантним геном білку CENP-C має підвищену здатність до аіюшозу (за певних умов) і апоптоз настає при метафаз-анафазному переході. Виявлено, що білок CENP-A пов’язаний з індукцією апоптозу і ця індукція відбувається на рівні цетромери. Доведено, що топоізомераза безпосередньо пов’язана з явищем апоптозу. Цей же фермент як було описано вище пов’язаний з процесом розділення центромер. Виявлено, що апоптозні клітини при медулобластомі мають рядцитогенетичних характеристик аналогічних до цитогенетичних характеристик ембріональних клітин для яких характерно

явище С-анафази зокрема. Доведено, що еруцилфосфохолін приводить до утворення і акомуляції тетраплоїдних клітин і одночасно до формування бінуклеарних і полінуклеарігах клітин і індукції апоптозу. Доведено, що процеси метилювання і фосфорилювання пов’язані з явищем апоптозу.

У другому розділі описано методи, якими було проведено дослідження, реактиви, обладнання, досліджуваний матеріал, наведено клінічну характеристику пацієнтів та статистичні методи обробки результатів.

Феномен ПРЦ досліджувався у периферійній крові та кістковому мозку. Для цього ставилась 48-годинна культура клітин на середовищі Ігла фірми "Life Technologies" та фірми "Sigma" з глютаміном та з ембріональною телячою сироваткою фірми "Biomark" при З7°С.Співвідношення сироватки до середовища Ігла бралося 1:6. Глютамін додавався ex tempore - 0,1 мл стерильного насиченого розчину L-глютаміну до 7 мл середовиша. Колхіцин використовувався фірми "J.T.Baker Inc."Розчин колхіцину додавався за Ігод.30 хв. до кінця 48-годинного клітинного циклу. Кістковий мозок культивувався 24 год. в середовищі Ігла або в середовищі RPMI 1640 фірми "Sigma".Гіпотонія проводилась 0,075 М розчином КС1, приготування хромосомних препаратів проводилось стандартно. Мітоген фітогемаглютинін (ФГА) використовувався фірми Difco для культивування периферійної крові. Паралельно периферійна кров лейкозних хворих культивувалася без мітогенів. Кістковий мозок культивувався без мітогенів. Для визначення ПРЦ фарбування препаратів проводилось рутинно фарбником Гімза та диферецційно з використанням трипсинового методу. Хромосомні препарати аналізувалися мікроскопом фірми Геійг.Визначепня рівня апоптозу проводилось за допомогою проточного цитофлуориметра FACScan фірми "Becton-Dickinson". Для цього досліджувані клітини виділялися з кісткового мозку або периферійної крові на фікол-верографіновому градієнті. Потім клітини відмиватись фізрозчшгом, фіксувались 70 % етанолом, після центрифугування розчинялися в 0,5 мл розчину пропідіум йодиду (200 мкг/мл) з 0,1 % NP-40, 0,9 % NaCl. До розчину додавалося на льоду 50 мкл РНКази А (50 мкг/мл) та інкубували 30 хв. при 4°С. .Після цього клітини тричі промивали в забуференому розчині (PBS) і аналізували на проточному цитофлуориметрі FACScan при довжині хвилі аргонового лазеру 488 нм. При апоптозі відбувається прогресуюча деградація ДНК в клітині, частина ДНК виходить з клітини, з'являються клітини з меншим ніж нормальний вмістом ДНК — з'являється додатковий пік на цитофлуорограмі - npe-Gl пік. По кількості цих клітин визначають рівень апоптозу (рис. 8).

У третьому розділі описано результати дослідження рівня феномену передчасного розділення центромер метафазних хромосом при гострому лімфобластному лейкозі у дітей в першому госрому періоді, в періоді

ремісії, в час роде диву. Описано прояв цього феномену у дітей хворих на гострий лімфобластний лейкоз групи високої летальності та у групі тривалої ремісії. Описано прояв цього феномену у батьків дітей хворих на гострий лімфобластний лейкоз та у контрольній групі здорових дітей, що проходиш обстеження у гематологічному відділі Львівської дитячої обласної спеціалізованої клінічної лікарні. Показано діагностичне та прогностичне значення досліджуваного феномену.

У якості контрольної групи аналізувались здорові діти, що проходили обстеження віком від 0 до 14 років і були після обстеження визнані здоровими. Досліджено рівень ПРЦ та С-анафази у 15 здорових дітей. Рівень ПРЦ в цій контрольній групі коливався від 0 до 6 % і становив в середньому 1,7 _+ 0,3 %. С-анафаза у контрольній групі не зустрічалося зовсім (0%). Було проведено дослідження рівня ПРЦ в кістковому мозку 3 здорових дітей (пункція була зроблена внаслідок помилки діапіозу, здійсненої у районній лікарні). Хоча вибірка в даному випадку є малою для остаточних висновків для кісткового мозку, але рівень ПРЦ та С-анафази був майже аналогічний до рівня у периферійній крові - рівень ПРЦ становив в середньому 3,6 _+ 0,3 %, а С-анафази 0 % (не зустрічався зовсім), що наводить на думку, що феномен ПРЦ не властивий нормальним проліферуючим клітинам, а властивий лише при патології.

Проведено комплексний цитогенетичний аналіз 60 хворих на ГЛЛ на різних стадіях розвитку хвороби: у першому гострому періоді, під час рецедивів, на стадії ремісії. У хворих на ГЛЛ, нелікованих, в першому гострому періоді у периферійній крові (ПК) рівень ПРЦ коливався від 8 до 100 % і становив в середньому 32,0 _+ 2,9 %.Це статистично достовірно відрізняється від контрольної групи (Р < 0,001). Рівень С-анафази в периферійній крові хворих на ГЛЛ в першому гострому періоді коливався від 0 до 40 % і становив в середньому 4,0 _+ 1,4 %.Це статистично достовірно відрізняється від контрольної групи (Р < 0,01). У кістковому мозку (КМ) у першому гострому періоді ГЛЛ рівень ПРЦ становив в середньому 37,0 _+ 6,5 %, а С-апафази відповідно 14,0 _+ 4,3 % (рис.1). Це статистично достовірно відрізняється від контрольної групи (Р < 0,001).

По ходу досліджень було здійснено комплексний цитогенетичний аналіз 20 хворих на ГЛЛ дітей в період тривалої ремісії після курсу лікування. Час, у якому хворі перебували в тривалій ремісії становив від З місяців до 5 років. За основний критерій ремісії брався рівень бластів у кістковому мозку після зазершення лікування, що не перевищував 2 %.

У період ремісії величини ПРЦ та С-анафази як у периферійній крові, так і у кістковому мозку достовірно знижувались і статистично достовірно не відрізнялися від контрольної групи (див.рис.1).

В кістковому мозку у дітей хворих на ГЛЛ в період ремісії рівень ПРЦ становив в середньому 3,4 _-+■ 0,3 %, а С-анафизи - 0 %. В

периферійній крові у дітей хворих на ГЛЛ в період ремісії рівень ПРЦ становив в середньму 3,5 _+ 0,4 %, а С-анафази -1,5 _+ 0,3 %.

Це дозволяє стверджувати, що зниження рівня ПРЦ може бути новим критерієм ремісії.

Проведено дослідження рівня ПРЦ та С-анафази у хворих на негодаскінську лімфому. У цих хворих в першому гострому періоді виявлено низькі рівні ПРЦ як в кістковому мозку так і в периферійній крові (близькі до контрольної групи) і високі рівні С-анафази як в кістковому мозку (в середньму 57,0 _+- 3,0 %) так і в периферійній крові (в середньому 52,5 _+ 7,7 %), що свідчить про те, що феномен С-анафази є новим додатковим діагностичним маркером негоджкінської лімфоми (див.рис.4).

Очевидно, такі високі рівні С-анафази є типовими для лімфом і можуть бути додатковим діагностичним критерієм. Рівень ПРЦ у хворих на лімфому при відсутності лейкемізації був низьким ( в периферійній крові в середньому 4,0 _+ 1,2 %, а в кістковому мозку (КМ) в середньому

8,0 _+ 3,6 %), що близьке до значення контрольної групи. Слід зазначити, що у 1 хворого на негоджкінську лімфому з лейкемізацією крім високого рівня С-анафази був відмічений і високий рівень ПРЦ, що корелював з рівнем бластів у периферійній крові. Очевидно, високий рівень ПРЦ є критерієм лейкемізації при лімфомах.

У 10 пацієнтів хворих на ГЛЛ проводилось паралельне визначення рівня ПРЦ, рівня С-анафази та рівня апоптозу в периферійній крові та кістковому мозку. Рівень апоптозу як в кістковому мозку так і в периферійній крові хворих на ГЛЛ дітей в першому гострому періоді коливався в досить широкому діапазоні - від 0 до 16,7 %. В період ремісії у хворих на ГЛЛ дітей в периферійній крові та кістковому мозку рівень апоптозу коливався від 0 до 3,01 %. В контрольній групі - у 20 здорових донорів та здорових дітей рівень апоптозу становив від 0 до 0,3 % ( в середньму 0,12 %). Паралельно із визначенням апоптозу в тій же пробі пунктату кісткового мозку або периферійної крові проводилось визначення рівня С-анафази. Виявлено позитивну кореляцію між рівнем С-анафази та рівнем апоптозу, що визначався на проточному цитофлуориметрі. Коефіцієнт кореляції між рівнем апоптозу і рівнем С-анафази становив р~0,9 (Р<0,01). Це свідчить про те, що феномен С-анафази високоімовірно є одним із проявів явища апоптозу, або одною із форм апоптозу чи його певною стадією (див.рис.5).

Виявлено позитивну кореляцію між рівнем бластів у периферійній крові та рівнем ПРЦ (рис.2). Для ПРЦ коефіцієнт кореляції становив р=0,75; (Р<0,01). У пацієнтів з тотальним бластозом у ПК (100% бластів) рівень ПРЦ досягав до 100%. Це дозволяє стверджувати, що феномен ПРЦ високоймовірно є характерною ознакою проліферуючих клітин, є однією з властивостей бластів при ГЛЛ.

Було проведено дослідженая прогностичного значення феномену С-анафази при ГЛЛ. Для цього аналізувались 3 групи хворих:

І-з високою летальністю, хворі,що померли не досягаючи ремісії;

2 - хворі, що померли внаслідок рецидиву після короткочасної ремісії;

3 - хворі, що досягай довготривалої ремісії.

Дослідивши феномен С-анафази у першому гострому періоді було встановлено, що у 1 та 2 групах рівень С-анафази був низьким, відповідно в середньому 2,7 _+ 0,3 % та 3,4 _+ 0,4 %, а у 3 групі був достовірно вищий (Р<0,01) і сладав в середньому 14,8 1,5 %, що свідчить про тс,що високі

рівні С-анафази у першому гострому періоді є позитивним прогностичним фактором (див.рис.З). Це дозволяє стверджувати, що високоймовірно С-анафаза виконує функцію елімінації мутантних клонів і її високий рівень свідчить про більшу опірність організму проліферації злоякісних клонів. Це свідчить про зв'язок між феноменом С-анафази і явищем апоптозу.

Рис. І.Частота реєстраціїПРЦ і С-анафази (в %) в гострому періоді та на стадії ремісії ГЛЛ у дітей КМ - культура клітин кісткового мозку.

ПК - культура клітин периферійної крові.

рівень бластів в периферійній ІфОВІ, (%)

Рис. 2.Графік залежності між частотою реєстрації клітин з передчасним розділенням центромер на препаратах хромосом та відносним рівнем бластів у периферійній крові хворих на ГЛЛ.

Рівень С-анаф.(%) 16-00 у гострій 14.00-фазі

Рис. 3. Аналіз перебігу ГЛЛ у дітей залежно від частоти реєстрації С-анафази у гострому періоді захворювання.

60%-

50%-

40%-

30%-

% 20%-

С-ан. 10%- 0%^

уї-\

* і * ч і-

контроль КМНГЛ ПКНГЛ КМ ГЛЛ ПКТЛЛ

Рис. 4. Феномен С- анафази при негоджкінських лімфомах (НГЛ) та лейкозах (ГЛЛ)

рівень аиоптозу (%)

Рис. 5.Графік залежності між частотою реєстрації С-анафази на препаратах хромосом та рівнем апоптичішх клітин у хворих на ГЛЛ.

- А

Рис. 6. Феномен С-анафази в культурі клітин кісткового мозку хворого на ГЛЛ.

«Чи*

ч.

О"

.)»* *'Г

/

> С

^ У^ т

£;Ч*Л''

Рис. 7. Феномен ПРЦ в культурі клітин кісткового мозку хворого Ні

глл.

400

400

Рис. 8. Розподіл ДНК в клітинах у різних фазах клітнппогс циклу (цитофлуориметричннй аналіз клітин кісткового мозку хворогс на гостру лімфобластну лейкемію).Прогресуюча втрата ДНК апоптичними клітинами призводить до утворення додаткового пре-С1 піку (показано стрілкою).

Висновки.

1. Передчасне розділення центромер (ПРЦ) метафазних хромосом не відноситься до конститутивних ознак каріотипу культивованих клітин крові і кісткового мозку здорових осіб. Показником нормального стану каріотипу слід вважати експресію С-анафази 1% мітотичних клітин та реєстрацію ПРЦ поодиноких хромосом (1-єї - 2-х хромосом, переважно приналежних до груп С і Е) в межах 4% клітин. Експресія передчасного розділення центромер метафазних хромосом є статистично вірогідною ознакою культивованих клітин крові і кісткового мозку у гострій фази перебігу ГЛЛ, ГМЛ і НГЛ. Зміни в експресії передчасного розділення центромер у гострій фазі гемобластозів, порівняно з контролем, проявляються у статистично вірогідному зростанні частоти С-анафази та клітин з ПРЦ та залученні у ПРЦ 3-20 хромосом каріотипу із значним питомим вмістом хромосом, для яких ПРЦ є нетиповою ознакою (хромосоми груп Б, Р, в). В ремісії ГЛЛ встановлено статистично вірогідне згортання експресії передчасного розділення центромер метафазних хромосом у культурі крові і кісткового мозку порівняно з гострою фазою захворювання, незначне персистування С-анафази та ПРЦ у випадках неповної ремісії та досягнення контрольних показників за усіма параметрами у випадках повної ремісії.

2. Статистично вірогідна кореляція між рівнем бластів у периферичній крові та частотою ПРЦ на препаратах хромосом вказує па високу ймовірність походження метафазних клітини з передчасним розділенням центромер декількох хромосом (ПРЦ) з трансформованих бластних клітин.

3. Статистично вірогідна кореляція між рівнем ПРЦ та частотою клітин з анеуплоїдним каріотипом вказує на ПРЦ як на вагому причину виникнення анеуплоїдного хромосомного набору клітини при ГЛЛ у дітей.

4. Статистично вірогідна кореляція між частотою С-анафази па препаратах хромосом та рівнем апоптичних клітин, визначених цитофлуориметричним методом, вказує на притаманність передчасного розділенням центромер для каріотипа бластних клітин, які гинуть шляхом апоптозу.

5. Експресія С-анафази у гострій фазі ГЛЛ на рівні показників здорових осіб (0-1% мітотичних кліти) асоціюється із несприятливим перебігом захворювання (летальним кінцем або швидким наступлениям рецидиву), тоді як її відтворення на рівні 10% мітотичних клітин вірогідно вказує на високу ймовірність досягнення стійкої ремісії. Частота С-анафази у гострій фазі ГЛЛ у дітей статистично вірогідно корелює з відомими клініко-лабораторними ознаками, які використовуються для визначення прогнозу захворювання. Статистично вірогідна динаміка в

експресії С-анафази і ПРЦ на різних стадіях перебігу ГЛЛ, її вірогідний зв'язок з патогенезом захворювання (асоціація з бластними клітинами, рівнем анеуплоїдії і апоптозу) та вірогідна кореляція з відомими клініко-лаборагорними прогностичними ознаками вказують на перспективність урахування передчасного розділення центромер в комплексі критеріїв діагностики гострої фази ГЛЛ, досягнення повної ремісії ГЛЛ та визначення прогнозу у гострій фазі захворювання.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Запропоновано критерії для визначення експресії явища передчасного розділення центромер метафазних хромосом в нормі та на різних етапах перебігу ГЛЛ та інших поширених гемобластозів у дітей при застосуванні несинхронізованої культури крові і кісткового мозку.

2. Рекомендовано вважати показником нормального стану каріотипу культивованих клітин крові і кісткового мозку експресію С-анафази 1% мітотичних клітин та реєстрацію ПРЦ поодиноких хромосом (1-еї - 2-х хромосом, переважно приналежних до груп С і Е) в межах 4% клітин.

3. Рекомендуємо вважати, що експресія С-анафази більше ніж 1% мітотичних клітин та наявність клітин з ПРЦ 3-х - 20-и хромосом набору із залученням хромосом груп О і в вказують на наявність хромосомного дизбалансу і можуть бути ознаками клітинної трансформації при гострій лімфобластній і гострій мієлоїдній лейкемії у дітей.

4. Рекомендуємо вважати, що експресія С-анафази на рівні 40-50% мітотичних клітин поряд знормальними параметрами ПРЦ можуть бути ознакою каріотипу клітин крові і кісткового мозку при негоджкінській лімфомі у дітей.

5. Рекомендуємо вважати, що відсутність експресії С-анафази та реєстрація ПРЦ поодиноких хромосом (1-єї - 2-х хромосом, переважно приналежних до груп С і Е) в межах 4% клітин вказують на досягнення повної ремісії гострої лімфобластної лейкемії у дітей.

6. Рекомендуємо вважати, що якщо у гострій фазі перебігу ГЛЛ і ГМЛ у дітей, до початку цитостатичної терапії за протоколом, частота С-анафази складає 0-1% мітотичних клітин крові і кісткового мозку, це вказує на високу ймовірність несприятливого перебігу захворювання: летальний кінець або швидке наступлення рецидиву.

7. Висока ймовірність позитивного прогнозу ГЛЛ та ГМЛ у дітей асоціюється з експресією С-анафази більше ніж 2-ма відсотками мітотичних клітин крові і кісткового мозку і є високовірогідною у випадках, коли частота С-анафази перевищує 10% клітин.

Список основних опублікованих автором праць за темою дисертації.

1.Акопян Г.Р., Сиренко А.Г., Гнатейко О.З., Петрух А.В., Стойка Р.С.

С-анафаза как цитогенетический маркер апоптоза клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей // Экспериментальная онкология. - 1999. -N21(2).-С. 127-132. -

2.Акопян Г.Р., Гнатейко О.З., Сіренко А.Г., Поліщук Р.С., Логінський

B.C., Новак B.JI. Передчасне розділення центромер метафазних хромосом при гострій лімфобластній лейкемії у дітей // Онкология. — 1999. - N4. -

C.283-289.

3.Сіренко А.Г., Акопян Г.Р. Передчасне розділення центромер як цитогенетичний маркер гострої лейкемії у дітей // Збірник наукових праць “Проблеми екології та медичної генетики і клінічної імунології / Вип.4(24).

- Київ-Луганськ. - 1999.-С. 122-133.

4.Кіцера Н.І., Козій Р.С., Поліщук Р.С., Сіренко А.Г. Цитогенетичний та клініко-генеалогічний аналіз хронічної мієло-моноцитарної лейкемії у дитини// Лікарська справа.- 1999. -N1(1043). -С. 129-131.

5.Сіренко А.Г. Феномен передчасного розділення центромер хромосом при гострому лімфобластному лейкозі // Бюлетень Всеукраїнського Наукового та Професійного Товариства їм. Миколи Міхновського: Медицина. Медична генетика. Екологія людини - 1998 -N7. -С. 4-11.

6.Сіренко А.Г.Передчасна анафаза як новий цитогенетичний маркер неходжкінської лімфоми // Бюлетень Всеукраїнського Наукового та Професійного Товариства ім. Миколи Міхновського: Медицина. Медична генетика. Екологія людини. - 1998. - N7. - С. 11-15.

7.Sirenko A., Akopian G. Premature centromere division of the chromosomes at the different stages of acute lymphoblastic leukemia in infants // Pediatric research. - 1997. - 41(5).- P. 774.

8,Sirenko A.G., Acopian G.R., Petrukh A.V. Premature centromere division of metaphase chromosome and blood cell differentiation // Cytometry. -1996.-N8.-P.99.

9,Передчаене розділення центромер метафазних хромосом та баланс гетерохроматину в геномі клітин із різним ступенем дифереціації. Г.Р. Акопян, А.Г.Сіренко, Н.Л. Гулеюк, А.В, Петрух, П. Мале. //Тези доп. 2 з'їзду мед. генетиків України. - Львів. -1995.- С. 6.

Анотація.

Сіренко А.Г.Передчасне розділення центромер метафазних хромосом як перспективний діагностичний і прогностичний маркер при гострій лімфобластній лейкемії у дітей. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидат біологічних наук за спеціальністю — 03.00.15 генетика. Львівській науково-дослідний інститут спадкової патології', Львів, Україна, 1999.

Дисертацією є рукопис, який містить теоретичні розробки Ті експериментальні дослідження в галузі онкогенетики та цитогенетик; гострих лейкозів з метою пошуку нових цитогенетичних маркері] діагностики та прогнозу гострого лімфобластного лейкозу (ГЛЛ) у дітей.! якості нового діагностичного і прогностичного маркеру досяіджувавс! феномен передчасного розділення центромер метафазних хромосом (ПРЦ та С-анафаза як варіант повного ПРЦ.Показано, що ПРЦ є характерним і більшій мірі бластним клітинам, аніж нормальним диференційовані» лімфоцитам. Пропонується новий критерій ремісії при ГЛЛ - зниженню рівня ПРЦ.Виявлено, що С-анафаза є прогностичним критерієм при ГЛЛ її високі рівні в першому гострому періоді є позитивним прогнозом свідчать про високу ймовірність входження в тривалу ремісію.Виявлено що С-анафаза є одним із проявів явища апоптозу.

Ключові слова: Передчасне розділення центромер, гостриі

лімфобластний лейкоз, хромосома, ген, метафаза, апоптоз.

Аннотация.

Сиренко А.ГЛреждевремениое раазделение центромер метафазных хромосом как перспективный диагностический и прогностический маркер при острой лимфобластной лейкемии у детей. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности — 03.00.15 генетика. — Львовский научно-исследовательский институт наследственной патологии, Львов, Украина, 1999.

Диссертацией является рукопись, содержащая теоретически разработки и экспериментальные исследования в области онкогенетики ] цитогенетики острых лейкозов с целью поиска новых цитогенетически: маркеров диагностики и прогноза острого лимфобластного лейкоза (ГЛЛ у детей. В качестве нового диагностического и прогностического маркер; исследовался феномен преждевременного разделения центромс] метафазных хромосом (ПРЦ) - феномен в котором задействованы от 1 д< 23 хромосом и С-анафаза как вариант полного ПРЦ - феномен в которое задействованы от 50 до 100 % хромосом кариотипа. Показано, что ] остром периоде ГЛЛ уровень ПРЦ значительно статистически достоверні превышает уровень ПРЦ в контрольной групе (в периферической крови ] остром периоде в среднем уровень ПРЦ 32,0 +_2,9 %, а в костном мозг

37,0 +_ 6,5 % припоказателях контрольной групы 1,7 +_ 0,3 % и 3,6 +_ 0,'. % соответственно, Р< 0,001). Показано, что ПРЦ в большей мер< характерен бластным клеткам, чем нормальным дифференцированы! лимфоцитам.Обнаружена позитивная кореляция между числом клеток ' ПРЦ и числом бластов в периферической крови детей больных на ПП (коэфициент кореляции р= 0,75). Обнаружено что при ГЛЛ в перио; ремисии уровень ПРЦ достоверно снижается и статистически н< отличается от уровня Г1РЦ в контрольной групе. Предлагается новы:

критерий ремисии при ГЛЛ - снижение уровня ПРЦ. С-анафаза не проявляет кореляции с уровнем бластов в периферической крови детей больных на ГЛЛ (р = 0,1). Предложено ПРЦ в качестве нового дополнительного диагностического критерия при ГЛЛ. Обнаружено, что С-анафаза - прогностический критерий при ГЛЛ и ее высокий уровень в первом остром периоде является позитивным прогнозом и свидетельствует о высокой вероятности вхождения в продолжительную ремиссию. Обнаружено позитивную кореляцию между уровнем С-анафазы и уровнем апоптоза в периферической крови и костном мозге детей больных на ГЛЛ в первом остром периоде. Показано, что С-анафаза является одним из проявлений апоптоза. Обнаружено, что при злокачественых неходжкинских лимфомах у больных в периферической крови и в костном мозге имеет место высокий уровень С-анафазы (в среднем 57,0 +__ 3,0 % в костном мозге и 52,5 +_ 7,7 % в периферической крови). Предложено определять уровень С-анафазы в качестве дополнительного диагностического маркера при неходжкинских лимфомах. Обнаружено позитивную кореляцию между уровнем ПРЦ и уровнем анеуплоидных клонов в периферической крови и костном мозге больных на ГЛЛ детей (р= 0,6), что свидетельствует о том что ПРЦ является одной из причин появления анеуплоидных клонов при ГЛЛ.

Ключевые слова: Преждевременное разделение центромер, острый лимфобластный лейкоз, хромосома, ген, метафаза, апсптоз.

Summary

Sirenko A.G. PHENOMENON PREMATURE CENTROMERE DIVISION IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA OF METAPHASE CHROMOSOME IN CHILDREN. - Manuscript.

The thesis for a candidate's degree of biological scienses on speciality -genetic-03.00.15.

Institute of Hereditary Pathology, Lviv, Ukraine. 1999.

The thesis is a manuscript wich contains theoretical developments and experimental reasearch in a field of genetic of acute lymphoblastic leukemia with the object new diagnostic and prognostic marker this disease. The evidence of premature centromere division of the metaphase chromosomes (PCD) and C-anaphase (PCD of 50-100 chromosomes) as a new prognostic cytogenetic marker of children's acute lymphoblastic leukemia (ALL) is suggested.PCD more typical for blast cell than normal differenciation lymphocits was showed. The lowering of level PCD is a new cryterial of remission by ALL was suggested. C-anafase is a new prognostic marker in ALL and high level C-anaphase in first acute period is positive prognosis and testify about high

probability of entrence in duration remision was showed. C-anaphase is a display of apoptosis in ALL was suggested.

KEY WORDS: premature centromere division, acute lymphoblastic leukemia, chromosome, gene, metaphase, apoptosis.

ПОДЯКИ.

Приношу глибоку подяку директору Львівського інституту спадкової патології професору> доктору медичних наук Гнатейку Олегу Зінов’євичу за надання можливості для виконання цієї наукової роботи, д.м.н. Новаку Василю Леонідовичу та д.б.н. Стойці Роману Степановичу за наукові консультації. Приношу глибоку подяку колективу Львівської обласної дитячої спеціалізованої лікарні (ЛОДСЛ) (головний лікар. -Миндюк Олександр Володимирович) і особливо колективу гематологичного відділення цієї лікарні (зав. відділом Поліщук Романа Степанівна) за допомогу в організації науковіх досліджень. Також приношу персональну глибоку подяку к.м.н. Петруху Андрію Васильовичу

- завідуючому клінічної лабораторії ЛОДСЛ та к.м.н. Поліщук Романі Степанівні - завідуючій гематологічним відділенням ЛОДСЛ за допомогу в організації цих наукових досліджень.