Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хромосомы домашней курицы и японского перепела (Phasianidae, Galliformes)

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Хромосомы домашней курицы и японского перепела (Phasianidae, Galliformes)"

005060199

ЗЛОТИНА Анна Михайловна

ХРОМОСОМЫ ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ И ЯПОНСКОГО ПЕРЕПЕЛА (РНАБ1АМОАЕ, САШРОЯМЕБ): СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО -ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург - 2013

3 о МАЙ 2013

005060199

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете в лаборатории структуры и функции хромосом кафедры цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гагинская Елена Романовна ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный университет

доктор биологических наук, доцент Кузнецова Татьяна Владимировна ведущий научный сотрудник ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук Трифонов Владимир Александрович

заведующий лабораторией сравнительной геномики ФГБУН Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск

Ведущее учреждение:

ФГБУН Ботанический институт

им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится «¿0» ссЮИ^2013 г. в -/¿г *?йасов на заседании Диссертационного совета Д.212.232.12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук и кандидата биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « ^ » _£ 2013 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.212.232.12, доктор биологических наук

Мамон Людмила Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Организация и эволюция кариотииов принадлежат к широко исследуемым проблемам современной биологии, при этом хромосомные перестройки и их потенциальная роль в процессе видообразования и генезисе генетически-обусловленных заболеваний вызывают особый интерес. Среди позвоночных животных к настоящему моменту в наибольшей степени изучены кариотипы млекопитающих (например: Graphodatsky et al., 2002; 2011; Murphy et al., 2005; Ferguson-Smith, Trifonov, 2007; Kemkemer et al., 2009; Romanenko et al., 2012; Trifonov et al., 2012). В то же время, исследования кариотипов других животных, в частности представителей класса Птицы, расширяют представления о закономерностях эволюции хромосом и о механизмах формирования хромосомных перестроек (Родионов, 1997; Burt et al., 1999; Griffin et al., 2007; Ellegren, 2010; Skinner, Griffin, 2012). Важность анализа хромосом представителей отряда Курообразные (Galliformes) также обусловлена большой хозяйственной ценностью ряда видов, актуальностью исследований в области их генетики, селекции и разведения, а кроме того, использованием птиц в качестве модельных объектов в разных областях биологии и биомедицины (De Groef et al., 2008; Huss et al., 2008; Datar, Bhonde, 2011).

Птицы характеризуются сложно устроенными кариотипами: типичный диплоидный набор представлен высоким числом хромосом, среди которых большая часть - крошечные морфологически сходные микрохромосомы (Tegelstrom, Ryttman, 1981; Родионов, 1996; 1997; Burt, 2002; Griffin et al., 2007).

Кариотипы домашней курицы (Gallas gallas domesticus) и японского перепела (Coturnix coturnix japónica), двух представителей Курообразных, на первый взгляд очень сходны. Оба кариотипа содержат одинаковое число хромосом (2п=78); в литературе описана высокая степень консерватизма ортологичных хромосом (Schmid et al., 2000; 2005; Shibusawa et al., 2001; Guttenbach et al., 2003; Galkina et al., 2006; Kayang et al., 2006; Sasazaki et al., 2006). Тем не менее, морфология (в первую очередь, положение центромеры) большинства ортологичных хромосом курицы и японского перепела заметно различается. Для исследования природы этих различий требуется детальный сравнительный цитогенетический анализ двух кариотипов. Ввиду небольшого физического размера митотических метафазных хромосом птиц, их стандартный цитогенетический анализ является крайне затруднительным. Для исследований хромосомных перестроек у птиц оказывается полезным использовать удлиненные хромосомы, а именно гигантские транскригщионно-активные хромосомы стадии ламповых щеток (ЛЩ) из растущих ооцитов.

Хромосомы-ламповые щетки - это сильно деконденсированные хромосомы диплотенной стадии профазы мейоза I, имеющие характерную хромомерно-петлевую организацию (обзоры: Callan, 1986; Morgan, 2002; Gaginskaya et al., 2009). На стадии ламповых щеток гомологичные хромосомы входят в состав бивалентов и объединены между собой в районах хиазм. Хромосомы-ЛЩ птиц в 20-30 раз превышают по размеру соответствующие метафазные хромосомы, кроме того, они обогащены цитологическими маркерами (Кропотова, Гагинская, 1984; Челышева и др., 1990; Solovei et al., 1992; Родионов, 2001; Gaginskaya et al., 2009). Благодаря своим исключительным свойствам хромосомы-ЛЩ птиц оказываются удобным инструментом для физического картирования как уникальных последовательностей ДНК, клонированных в искусственных бактериальных хромосомах (ВАС-клоны) (Galkina et al., 2006; Krasikova et al., 2006; Solinhac et al., 2010), так и повторяющихся последовательностей (Solovei et al., 1994; 1996; 1998; Saifitdinova et al., 2003; Krasikova et al., 2006; Deryusheva et al., 2007; Ogawa et al., 2007), с высоким уровнем разрешения.

Данные, полученные в ходе выполнения международного проекта по секвенированию генома курицы (ICGSC, 2004; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/lll), подробное описание кариотипа домашней курицы (Masabanda et al., 2004), а также наличие молекулярных зондов к индивидуальным хромосомам этого вида (Zoorob et al., 1996; Griffin et al., 1999; Crooijmans et al., 2000; Masabanda et al., 2004) служат необходимой базой для сравнительных молекулярно-цитогенетических исследований кариотипов птиц, в том числе представителей Курообразных.

Целью настоящей работы было исследование природы различий в морфологии (в частности, в положении центромер) ортологичных хромосом домашней курицы и японского перепела для выявления закономерностей кариотипических изменений в ходе эволюции птиц отряда Курообразные.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Локализовать центромер-специфичные последовательности макрохромосом 1, 2, 3, 5 и микрохромосом 11, 27 курицы на хромосомах типа ламповых щеток этого вида. Провести поиск последовательностей, гомологичных центромерным последовательностям этих хромосом курицы, на хромосомах японского перепела.

2. Провести поиск внутрихромосомных перестроек, различающих ортологичные макрохромосомы 1, 2, 3 домашней курицы и японского перепела. Для выявленных перестроек картировать с высоким уровнем разрешения точки разрывов/слияний.

3. Провести поиск внутрихромосомных перестроек, характеризующих наиболее крупные микрохромосомы домашней курицы (хромосомы 11 - 15) и их ортологи в кариотипе японского перепела. С высоким уровнем разрешения определить границы выявленных перестроек.

4. Охарактеризовать последовательности ДНК из районов разрывов/слияний на хромосомах, затронутых перестройками.

5. Провести сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ околоцентромерных районов макрохромосом 1, 2, 3 и микрохромосом 11-15 курицы и ортологичных хромосом японского перепела. Проанализировать, чем обусловлены различия в положении центромер на ортологичных хромосомах у двух видов.

Научная новизна работы. В настоящей работе выявлен ряд новых внутрихромосомных перестроек, различающих ортологичные хромосомы домашней курицы и японского перепела. Для этих перестроек, а также для некоторых ранее описанных инверсий с высоким цитогенетическим разрешением определены границы. Впервые идентифицированы и детально охарактеризованы наиболее крупные микробиваленты курицы и ортологичные микробиваленты японского перепела. Полученные данные служат важным заделом для детальной характеристики микрохромосом в кариотипах обоих видов.

С использованием хромосом-ЛЩ показано, что в геноме японского перепела отсутствуют последовательности, гомологичные центромерным сателлитным повторам хромосом 1, 2, 3 и 11 курицы, тогда как уникальные центромерные последовательности хромосом 5 и 27 курицы присутствуют в центромерных районах ортологичных хромосом у японского перепела.

Впервые проведен детальный сравнительный анализ положения фрагментов ДНК курицы, содержащихся в ВАС-клонах, относительно центромер на некоторых ортологичных хромосомах домашней курицы и японского перепела. Установлено, что дивергенции кариотипов двух видов сопутствовали не только инверсии, но и нередкие случаи формирования «эволюционно новых центромер».

Практическая ценность работы. Объекты исследования обладают большой сельскохозяйственной значимостью, что определяет практическую ценность настоящей работы. Результаты сравнительного картирования последовательностей ДНК на хромосомах-ЛЩ позволяют эффективно переносить информацию о хорошо изученных геноме и кариотипе курицы на значительно менее изученный кариотип японского перепела. С практической точки зрения особенно полезными оказываются результаты высокоразрешающего цитогенетического анализа микрохромосом, которые обогащены генами, в том числе генами, имеющими большую значимость для селекции. Кроме того, результаты физического картирования уникальных и повторяющихся последовательностей на ЛЩ курицы позволяют усовершенствовать карты упорядоченных секвенированных последовательностей хромосом этого вида. Так, в настоящей работе были уточнены и дополнены текущие версии карт макрохромосомы 3 и крупных микрохромосом курицы.

Результаты диссертации могут быть использованы в курсах лекций и практических занятий по клеточной биологии, цитогенетике, организации хромосом и эволюции кариотипов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 18-м (Бухарест, Румыния, 2008) и 19-м (Краков, Польша, 2010) Международных коллоквиумах по цитогенетике животных и картированию генов, на Международном научно-методическом семинаре «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем» (Санкт-Петербург, 2008), на 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2008), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009), на Международной конференции «Современные методы микроскопии в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2009), на 8-й Европейской конференции по цитогенетике (Порту, Португалия, 2011), на 18-й Международной конференции по хромосомам (Манчестер, Великобритания, 2011), на 6-й Международной конференции по курице (Эдинбург, Шотландия, 2011), на Ш-й конференции молодых ученых института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 5 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит I таблицу и 21 рисунок. Работа включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы и список цитированной литературы, состоящий из 272 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом исследования служили хромосомы типа ламповых щеток, изолированные из растущих ооцитов домашней курицы (Gallus g. domesticus, GGA) и японского перепела (Coturnix с. japónica, ССО).

Для получения препаратов хромосом был использован метод микрохирургического выделения хромосом-ЛЩ из ооцитов амфибий, адаптированный для выделения ЛЩ птиц (Кропотова, Гагинская, 1984; Solovei et al., 1993;

http://projects.exeter.ac.uk/lampbrush/downloads/bird.doc).

Метод непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания использовали для выявления когезин-обогащенных центромерных гранул на хромосомах стадии ЛЩ обоих видов. Препараты окрашивали с помощью антител (AT) против белков комплекса когезин по стандартной методике (Krasikova et al., 2005; 2006). В качестве первых AT использовали поликлональные AT К828 и К854 кролика против белков STAG2 и Rad21 человека,

соответственно (Prieto et al., 2004). После иммуноокрашивания препараты использовали для гибридизации in situ.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Для сравнительного картирования последовательностей ДНК на хромосомах двух видов в качестве зондов для FISH использовали 65 ВАС-клонов, содержащих фрагменты геномной ДНК курицы. Клоны из ВАС-библиотеки университета г. Вагенинген, Нидерланды (Crooijmans et al., 2000) были любезно предоставлены Р. Круймансом и М. Гроененом. Информация о положениях молекулярных маркеров или концевых последовательностей ВАС-клонов доступна в текущей версии сборки секвенированных последовательностей генома курицы (GalIus_gallus-4.0, версия 3.1, http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/genome/l 11). Для идентификации микробивалентов курицы и их ортологов у перепела дополнительно использовали цельнохромосомные зонды (англ. «chromosome paints») микрохромосом курицы (Griffin et al., 1999; Masabanda et al., 2004). ДНК ВАС-клонов выделяли по стандартной методике щелочного лизиса (Маниатис и др., 1984) с небольшими модификациями, амплифицировали с помощью DOP-PCR с вырожденными праймерами 6MW (Telenius et al., 1992), после чего метили гаптенами (биотином или дигоксигенином) с помощью ПЦР с теми же праймерами.

Центромерные сателлитные повторы хромосом 1, 2, 3 и 11 курицы амплифицировали из геномной ДНК и метили биотином с помощью ПЦР со специфичными праймерами (Krasikova et al., 2012), подобранными согласно первичным последовательностям соответствующих повторов (Shang et al., 2010). Для картирования центромер-специфичных уникальных последовательностей хромосом 5 и 27 курицы использовали ВАС-клоны, содержащие CENP-A-связывающую центромерную ДНК этих хромосом (Shang et al., 2010). В работе также были использованы однонитевые олигонуклеотидные зонды к коротким 41-п.н. тандемным CNM- и BglII- повторам курицы и японского перепела, соответственно (Matzke et al., 1990; Tanaka et al., 2000; Krasikova et al., 2006; Derjusheva et al., 2007).

FISH на хромосомах-ЛЩ курицы проводили по стандартному протоколу ДНК/(ДНК+РНК-транскрипт)-гибридизации (Galkina et al., 2006). Гетерологичную гибридизацию на хромосомах японского перепела осуществляли при температуре 32-37°С. Гибридизацию с короткими зондами проводили при комнатной температуре в течение 3-5 часов или в течение ночи. Зонды, модифицированные дигоксигенином или биотином, детектировали с помощью антител против дигоксигенина, конъюгированных с флуорохромом СуЗ (Jackson ImmunoResearch Laboratories), и с помощью авидина, конъюгированного с флуорохромом Alexa 488 (Molecular Probes Inc.), соответственно. Для колокализации последовательностей ВАС-клонов и коротких повторов на одной и той же хромосоме, два набора различно меченых зондов гибридизовали на одном и том же препарате последовательно.

Двумерная флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия. Анализ препаратов осуществляли с помощью универсального флуоресцентного микроскопа DM4000B (Leica Wetzlar GmbH). Для получения изображения использовали программное обеспечение CW 4000 FISH (Leica Cambridge Ltd.).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Высокоразрешающее картирование центромерных последовательностей курицы на хромосомах типа ламповых щеток

С целью как можно точнее картировать центромерные районы взятых в анализ макрохромосом 1, 2, 3, 5 и микрохромосом 11 и 27 курицы мы локализовали центромерные

последовательности этих хромосом на хромосомах типа ЛЩ того же вида (Krasikova et al., 2012). Стоит подчеркнуть, что центромеры хромосом 1, 2, 3 и 11 курицы содержат хромосомо-специфичные сателлитные повторы, тогда как центромеры хромосом 5 и 27 организованы необычно и представлены уникальными последовательностями, обогащенными интерсперсными повторами (Shang et al., 2010).

Центромерные сателлиты хромосом 1, 2, 3 и 11 локализовались в сильно конденсированных, обычно беспетлевых районах соответствующих хромосом-ЛЩ, называемых также «центромерными валиками» (Красикова, Гагинская, 2010; Macgregor, 2012). Как и ранее картированные центромерные повторы курицы (обзор: Красикова, Гагинская, 2010), локализованные в настоящей работе повторы приурочены к одной паре компактных хромомеров, фланкирующих центромерную когезин-обогащенную гранулу.

Центромерные последовательности большинства хромосом курицы были расшифрованы недавно, и до того момента на картах упорядоченных секвенированных фрагментов хромосом (версия 2.1, www.ncbi.nlm.nih.gov) центромерные районы были представлены пропусками длиной 1,5 млн.п.н. и 0,5 млн.п.н. для макро- и микрохромосом, соответственно. Ранее было показано, что центромера на хромосоме 3 курицы (GGA3) не может соответствовать отведенному ей пропуску в положении 11,6-13,1 млн.п.н. (Krasikova et al., 2006). В настоящей работе было проведено детальное физическое картирование района 0-23 млн.п.н. ЛЩЗ курицы методом FISH с 23 ВАС-клонами, содержащими фрагменты геномной ДНК курицы (Zlotina et al., 2010). Совместное использование иммуноцитохимического выявления центромеры и многоцветной FISH на ЛЩ показало, что центромера на карте GGA3 соответствует пропуску между соседними контигами в положении 2,4 млн.п.н. (рисунок 2 а, б). Кроме того, мы получили доказательство того, что пропуски между контигами в положениях 5,6 млн.п.н. и 11,6 млн.п.н. соответствуют положению двух крупных нецентромерных блоков тандемного повтора CNM (рисунок 2 а, б), о существовании (но не о точной локализации) которых на этой хромосоме было известно ранее (Krasikova et al., 2006).

Последовательности, гомологичные хромосомо-специфичным центромерным сателлитам курицы, не удалось обнаружить в кариотипе японского перепела. На ЛЩ перепела они не были выявлены методом гетерологичной FISH, а также не были амплифицированы из тотальной геномной ДНК перепела методом ПЦР с праймерами, специфичными к центромерным сателлитам курицы. На основании полученных данных можно предположить, что в ходе дивергенции двух кариотипов центромер-специфичные тандемные последовательности эволюционировали независимо.

Уникальные центромерные последовательности хромосом 5 и 27 курицы также были успешно локализованы на соответствующих хромосомах-ЛЩ вблизи центромерных гранул. В отличие от сателлитных центромерных повторов курицы, которые, по всей видимости, являются видоспецифичными, эти последовательности обнаруживаются методом FISH и на хромосомах японского перепела. Более того, в настоящей работе было показано, что положение этих последовательностей в двух кариотипах консервативно.

Организация центромерного района микрохромосомы 27 оказалась наиболее сложной и необычной. Так, согласно полученным в работе данным, помимо уникальных CENP-A-связывающих последовательностей, содержащих рассеянные повторы, в центромерном районе GGA27 локализуется кластер тандемного повтора CNM. Ранее, путем секвенирования иммунопреципитированной фракции хроматина была выявлена способность последовательностей CNM связывать гистон CENP-A, что подразумевает участие CNM в формировании центромер на микрохромосомах (Shang et al., 2010). Таким образом, вероятно, что тандемно организованные последовательности CNM наряду с

уникальными последовательностями на определенных этапах клеточного цикла могут участвовать в сборке кинетохора хромосомы 27. Альтернативно, по крайней мере, в случае данной микрохромосомы, кластер повтора СИМ может выполнять функцию прицентромерной ДНК. Интересно подчеркнуть, что центромерный район ортологичной микрохромосомы в кариотипе японского перепела (СС027) также содержит последовательности разной природы, а именно уникальные последовательности, гомологичные центромерным последовательностям ООА27, и кластер видоспецифичного тандемного £¿'/11-повтора.

Исследуемые центромерные последовательности были нанесены на цитологические карты соответствующих хромосом стадии ЛЩ (рисунки 1, 2 и 3). Данные по детальному картированию центромерных последовательностей курицы на ЛЩ могут быть в дальнейшем использованы для высокоразрешающего цитогенетического анализа хромосом курицы, а так же могут быть полезны при сравнительных исследованиях кариотипов птиц, в частности, для анализа перестроек, захватывающих центромерные районы хромосом.

Сравнительный анализ перестроек хромосом в кариотипах домашней курицы и японского перепела с использованием хромосом типа ламповых щеток

При исследовании внутрихромосомных перестроек, различающих кариотипы курицы и японского перепела, маркером положения центромер на хромосомах-ЛЩ служили центромер-специфичные последовательности и/или когезин-обогащенные центромерные гранулы. Ранее полученные данные подтверждают универсальность и надежность использования таких белковых структур в качестве маркеров центромеры на хромосомах типа ЛЩ птиц (8о1оуе1 е1 а1., 1996; 8а1ГПс1тоуа е1 а1., 2003; Кга81коуа е1 а1., 2006; 2012).

Макрохромосомы:

Хромосома 1. Семь ВАС-клонов, покрывающих район 53,2 - 80,6 млн.п.н. на карте упорядоченных секвенированных последовательностей хромосомы 1 курицы (СОА1), успешно гибридизовались на хромосомах-ЛЩ обоих видов (21о1ша е1 а1., 2012). Все используемые в анализе маркеры демонстрировали одинаковый порядок на ООА1 и ортологичной хромосоме 1 японского перепела (СС01) (рисунок 1 а). Таким образом, разница в положении центромер на ООА1 и СССИ не вызвана наличием перицентрической инверсии, предполагаемой ранее на основании цитогенетического анализа митотических хромосом у двух видов (8ЫЬи5а\уа й а1., 2001; Kayang й а1., 2006). Полученные нами результаты показали, что центромерные районы ООА1 и СС01 находятся в окружении различного генетического материала (рисунок 1 а).

Хромосома 2. Сравнительное картирование ВАС-клонов, содержащих фрагменты хромосомы 2 курицы (ООА2), на хромосомах-ЛЩ двух видов подтвердило наличие ранее предполагаемой крупной перицентрической инверсии, различающей СвА2 и СС02 (¿ЫЬиваша й а1., 2001; Кауаг^ й а1., 2006; Заяагак! е1 а1., 2006), и позволило уточнить её границы (рисунок 1 б). Так, одна граница локализуется в районе 38,5 млн.п.н. (\VAG26B13) - 47,9 млн.п.н (\VAG12M4), а другая - в положении между 85,2 млн.п.н (\VAG29F23) и 97,0 млн.п.н (маркер в гене 8р1г-1, ранее картированном Завагак! й а1., 2006) на хромосоме 2 курицы. Внимательный анализ рисунка гибридизации картированных ВАС-клонов (в частности, клонов \VAG12M4, \VAG21J8 и \VAG18L21, выделенных малиновым цветом на рисунке 1 б) на ЛЩ2 обоих видов позволил выявить наличие ещё одной структурной перестройки (инверсии) между ООА2 и СС02, захватывающей центромеру.

СЕЫ

- \ЛГАС31В10 . . УУАС13Е20 ■ . WAG69C11 , < WAG43G6 . . X \«А043М"11 •

>— тАС53Е23 ' 5— WAG25G16 '

2р

\«АС26В13 -?

тС12М4 WAG21J8 \Л/АС181_21 УУАС18С1 WAG21J10

WAG14J6 WAG40C1Э

\№«329Р23 —

•СЕМ-.

\CENJf-

2Я

\Л/АС26В13 ■ №АС29Р23

\Л/АС40С19 \NAG14J6

WAG12M4 WAG21J8 WAG18L21

5- \Л/А041С2

WAG41C2

2Р

2<7

ССА1

СС01

0СА2

СС02

Рисунок 1. Цитологические карты хромосомы-ЛЩ1 (а) и хромосомы-ЛЩ2 (б) курицы (ОСА) и японского перепела (ССО) с нанесенными на них ВАС-клонами. Показаны центромерные гранулы (красный), яркие ОАР1-позитивные хромомеры (черные осевые кружки), хромомеры, содержащие центромерные сателлиты (зеленый), границы крупной перицентрической инверсии (пунктир). РВЫ 1, ТВЬ, ЬЬ, 8М - маркерные структуры.

Хромосома 3. Сравнительный анализ генетических карт генома курицы и японского перепела позволил предположить наличие инверсии, различающей хромосому 3 этих видов (Базагак! е1 а!., 2006); в то же время традиционными цитогенетическими методами какие-либо перестройки между хромосомой 3 курицы (ООАЗ) и перепела (ССОЗ) не выявлены. Сравнительное картирование ВАС-клонов на хромосомах-ЛЩ показало наличие инверсии в терминальном районе ССОЗ по сравнению с вСАЗ, а также позволило точно определить границы перестройки (г1ойпа е1 а1., 2012). Одна из границ располагается в районе 0 - 380 тыс.п.н. (\VAG23F21), а вторая - в районе 5,4 млн.п.н. ("\yAG44P17) -5,8 млн.п.н. (\VAG13D11) на хромосоме курицы (рисунок 2 б, в, г). Совокупность данных по локализации центромерной гранулы и картированию повтора СепЗ относительно ВАС-клонов на ЛЩ свидетельствует о том, что центромеры на вСАЗ и ССОЗ находятся в

1М 2М ЗМ 4М 5М 6М 7М 8М 9М ЮМ 11М 12М 13М 14М

TBL. WAG23F214-WAG29L12 WAG35013

ШЩ

CNM WAG13D11 л WAG21122 / WAG40J15 О-

CNM WAG32A13 '

~i®CEN '

CNM ICEN в

■ Gellus jgallus-2.1)

. .WAG44P17 Л/, WAG54M22 ..-•' CEN^^J WAG35013 - WAG29L12 „ ■ WAG23F21 3— WAG13D11 ^ WAG21I22 3 WAG40J15 ■ WAG32A13

В

»;

п » ' * > ч

J

GGA3 • WAG44P17 WAG 13D* 1

GGA3

GGA3

ССОЗ

♦

¿jf 4 ССОЗ

/ WAG44P17

__WAG 40 Ч

Рисунок 2. Цитогенетический анализ хромосомы 3 курицы (GGA3) и японского перепела (ССОЗ). а - схема контигов из района 0-14 млн.п.н. на GGA3 (версия 2,1; www.ncbi.nlm.nih.gov). На схеме обозначены пропуски, соответствующие центромере (CEN) и кластерам повтора CNM. б - Цитологические карты хромосомы-ЛЩЗ курицы и японского перепела с нанесенными ВАС-клонами. Обозначения как на рисунке 1. в, г -двуцветная FISH с ВАС WAG44P17 и WAG 13D 11 на хромосоме-ЛЩЗ курицы и перепела.

разном генетическом окружении. Таким образом, различие в положении центромер на хромосоме 3 курицы и перепела не может быть объяснено только наличием выявленной инверсии.

Важно отметить, что на хромосоме курицы одна из границ выявленной инверсии соответствует массивному кластеру тандемного повтора CNM (проксимальный кластер в положении 5,6 млн.п.н.) (рисунок 2 а, б). Интересным оказался тот факт, что в этом же положении была картирована точка разрыва/слияния инверсии, различающей GGA3 и ортологичную ей хромосому MGA2 в кариотипе индейки (Dalloul et al., 2010; Zhang et al., 2011). Вторая граница инверсии между GGA3 и MGA2 локализуется в положении 11,6 млн.п.н. на GGA3 (Dalloul et al., 2010; Zhang et al., 2011), где, как мы показали, располагается дистальный кластер повтора CNM (рисунок 2 а), и таким образом данная перестройка оказывается фланкированной двумя кластерами повтора.

Несмотря на то, что последовательности из точек разрывов/слияний хромосом у птиц остаются мало изученными, существующие данные, а также результаты настоящей работы свидетельствуют об участии повторяющихся последовательностей в эволюции кариотипов и геномов птиц. Так, недавно при тотальном выравнивании секвенированных геномов курицы, индейки (Meleagris gallopavo) и зебровой амадины (Taeniopygia guttata) в точках разрывов/слияний эволюционных перестроек было выявлено значительное обогащение различными классами повторов (Skinner, Griffin, 2012). Обнаружение повторов на границах хромосомных перестроек у птиц хорошо согласуется с данными о локализации повторяющихся последовательностей различной природы в точках разрывов хромосом других позвоночных (Slamovits, Rossi, 2002; Bailay et al., 2004; Armengol et al., 2005; Ruiz-Herrera et al., 2006, Kehrer-Sawatzki, Cooper, 2007; 2008; Adega et al., 2009).

Молекулярные механизмы, лежащие в основе реструктуризации геномов позвоночных, в частности птиц, также мало понятны. В недавних работах британских исследователей у птиц была выявлена взаимосвязь между наличием структурных геномных перестроек и повышенным уровнем рекомбинации (Völker et al., 2010; Skinner, Griffin, 2012). Авторы полагают, что опосредовать формирование хромосомных перестроек в ходе эволюции могли механизмы неаллельной гомологичной рекомбинации. В связи с этим, интересным оказался тот факт, что оба кластера повтора CNM на хромосоме 3 курицы, обнаруживаемых нами на границах хромосомных перестроек у представителей Курообразных, являются горячими точками рекомбинации. Так, анализ распределения хиазм на хромосомах-ЛЩ позволяет оценить частоту рекомбинации в любом районе хромосомы вплоть до хромомера (Родионов и др., 1992; Родионов, 2001; Родионов, Чечик, 2002; Galkina et al., 2005). Результаты проведенного в настоящей работе анализа распределения хиазм внутри района 0-23 млн.п.н. на ЛЩЗ курицы демонстрируют, что в районах обоих кластеров CNM частота формирования хиазм повышена. Таким образом, полученные данные поддерживают гипотезу о повышенной рекомбинационной активности как механизме реорганизации геномов птиц.

Микрохромосомы. В настоящей работе были идентифицированы и подробно охарактеризованы наиболее крупные микробиваленты 11-15 курицы и их ортологи в кариотипе японского перепела (Zlotina et al., 2012). Ранее было показано, что микрохромосомы перепела обычно значительно длиннее, чем микрохромосомы курицы ввиду аккумуляции на их коротких плечах вариабельных по длине блоков гетерохроматина (Krasikova et al., 2009). Это затрудняет нумерацию микрохромосом перепела на основании их относительного размера. Принимая во внимание то, что два кариотипа содержат одинаковое число хромосом и межхромосомные перестройки, по-видимому, не были характерными событиями в ходе дивергенции двух кариотипов, мы условились нумеровать микрохромосомы перепела так же, как ортологичные им микрохромосомы курицы.

Хромосома 11. Цельнохромосомный зонд и ВАС-клоны, содержащие фрагменты хромосомы 11 курицы (GGA11), гибридизовались с одним относительно крупным микробивалентом в обоих кариотипах (рисунок 3 а, б). Сравнительное исследование локализации центромеры относительно молекулярных маркеров позволило выявить структурные различия между двумя ортологичными хромосомами. Так, ВАС-клоны WAG35F15 и WAG12F3 были картированы на коротком плече GGA11 (рисунок 3 в, г). Напротив, на ортологичной хромосоме японского перепела (ССОП) все используемые клоны локализовались на длинном плече (рисунок 3 в, д, е); короткое же плечо ССОП сформировано частично деконденсированным гетерохроматином. Интересно, что хромосома-ЛЩ11 перепела оказалась полиморфной в отношении длины короткого плеча.

СС011

PA! NT WAG52K20

• :} * '»

Ж

Рисунок 3. Сравнение микрохромосомы 11 курицы и ортологичной микрохромосомы японского перепела на стадии ламповых щеток. Идентификация хромосомы-ЛЩ11 курицы (а) и перепела (б), б' - FISH с центромерным Bgl/7- повтором (желтый) на хромосоме перепела, в - цитологические карты ЛЩ11 обоих видов. Картирование ВАС-клонов курицы относительно центромеры на ЛЩ11 курицы (г) и перепела (д, е) методом FISH.

я CNM=^fccEN CEN«j>Sg/H-nOBTOp CNM^:|>CEN CEN ti > Bg/Il- ПОВТОр Я

WAG7E23 — Q .. . 8 55 Г •• .• Я

WAG40H21 — § Ч / 8 WAG59J23 j \ g—WAG40H4

8 / \ § — WAG40H21 „J •• '•• 8"—WAG7E23 WAG40H4—S TGL TGL—^ 0 — WAG59J23

^эВд/И-повтор

—WAG12F3 —WAG35F15 ~-~WAG52K20

GGA11 CC011

В

GGA12

CC012

GGA13

CCQ13

CNM -WAG42M3 — ? WAG19G22

WAG32F10 — j TGL«

ICEN CENЧ -=8дЛ1- повтор CNM*=

5 — WAG32F10 WAG21C7-; ^ WAG114F13

i — WAG19G22 WAG6D21 — $

»ßg/ll- повтор > —WAG21C7

GGA14

CC014

GGA15

CC015

Рисунок 4. Цитологические карты микрохромосом-ЛЩ12 (а), ЛЩ13 (б), ЛЩ14 (в) и ЛЩ15 (г) курицы (ввА) и ортологичных микрохромосом-ЛЩ японского перепела (ССО) с картированными на них ВАС-клонами. Пунктирные линии указывают на инвертированный порядок генов на хромосомах перепела по сравнению с ортологичными хромосомами курицы.

Ранее было показано, что в некоторых оошггах японского перепела встречаются ассиметричные биваленты, в которых более длинный гомолог - субметацентрик, а более короткий - акроцентрик, лишенный гетерохроматинового плеча и центромерного кластера Bg/П-повтора (Deryusheva et al., 2007; Krasikova et al., 2009). В настоящей работе показано, что микробивалент 11 может быть одним из таких ассиметричных бивалентов (рисунок 3, б'). Альтернативно, в некоторых проанализированных ооцитах микробивалент 11 был образован двумя одинаковыми акроценгрическими гомологами.

Различный рисунок гибридизации ВАС-клонов WAG35F15, WAG12F3 и WAG52K20 на GGA11 и ССОП свидетельствует о наличии перицентрической инверсии, захватывающей генетический материал всею короткого плеча GGA11, с точкой разрыва/слияния в районе центромеры, где содержится кластер сателлитного повтора Cení 1. Интересно заметить, что инверсия этого же района была показана между GGA11 и её ортологом в кариотиие индейки (MGA13) (Dalloul et al., 2010; Zhang et al., 2011).

Хромосома 12. В АС-клоны, содержащие фрагменты хромосомы 12 курицы (GGA12), выявили в наборах хромосом-ЛЩ обоих видов крупный микробивалент. ВАС-клоны WAG7E23 и WAG40H21 локализовались в непосредственной близости от терминальных DAPI-позитивных центромерных хромомеров на GGA12 (рисунок 4 а). В то же время, на ортологичной хромосоме японского перепела (СС012) эти клоны были картированы в дистальном районе длинного плеча и в обратном порядке (рисунок 4 а). Таким образом, на GGA12 и СС012 картированные ВАС-клоны демонстрируют обратный порядок относительно центромеры; центромеры на двух хромосомах находятся в разном генетическом окружении. При этом стоит подчеркнуть, что выявленная внутрихромосомная перестройка не может объяснить несовпадение центромерных индексов у GGA12 и СС012.

Хромосома 13. В текущей версии карты упорядоченных секвенированных последовательностей хромосомы 13 курицы (GGA13) положение центромеры остается неоднозначным. Использование иммуноцитохимнческой детекции центромеры и картирования ВАС-клонов и повтора CNM на одном препарате хромосом-ЛЩ позволили нам однозначно локализовать нентромерный район микрохромосомы 13 относительно молекулярных маркеров (рисунок 4 б).

Как и в случае микрохромосомы 12, картина гибридизации ВАС-клонов, содержащих последовательности GGA13, на ортологичной хромосоме японского перепела (СС013) была неожиданной. Так, ВАС WAG59J23, маркирующий околоцентромерный район GGA13, на СС013 локализовался в самом терминальном хромомере длинного плеча, тогда как ВАС WAG40H4, маркирующий q-терминальный конец GGA13, был картирован в проксимальном районе длинного плача СС013, на расстоянии нескольких хромомеров от центромеры (рисунок 4 б). Результаты свидетельствуют о том, что центромеры на GGA13 и СС013 фланкированы разными последовательностями ДНК.

Хромосома 14 на стадии ЛЩ у курицы (GGA14) была идентифицирована ранее (Дакс и др., 2009). В настоящей работе, с помощью гегерологичной FISH с несколькими ВАС-клонами был идентифицирован и охарактеризован ортологичный микробивалент японского перепела (СС014). Как и в случае хромосомы 13, положение центромеры относительно молекулярных маркеров в текущей версии карты упорядоченных секвенированных фрагментов GGA14 неоднозначно. В связи с этим, для детального сравнительного анализа локализации центромер на GGA14 и СС014 на ЛЩ двух видов были картированы ВАС-клоны, маркирующие оба конца этой хромосомы у курицы. ВАС-клоны WAG19G22 (положение 12,8 млн.п.н.) и WAG42M3 (13,8 млн.п.н.) локализуются на хромосоме курицы в непосредственной близости к CNM-позитивному хромомеру,

прилежащему к центромерной грануле, то есть маркирующему район центромеры (рисунок 4 с). Напротив, ВАС WAG32F10, содержащий последовательности из противоположного конца GGA14 (3,7 млн.п.н.), картирован в дистальном районе ¡/-плеча ЛЩ курицы (рисунок 4 с). Такой гибридизационный рисунок, а также ранее полученные данные по картированию маркеров на ЛЩ14 курицы (Дакс и др., 2009), указывают на то, что реальный порядок генов относительно центромеры на GGA14 противоположен порядку, аннотированному в текущей версии карты GGA14.

На хромосоме-ЛЩ14 японского перепела оба ВАС-клона - WAG19G22 и WAG32F10 - также локализуются на длинном плече хромосомы, но в обратном порядке по сравнению с их расположением на хромосоме курицы (рисунок 4 с). При этом, как и в случае микрохромосом 12 и 13, центромеры на GGA14 и СС014 оказываются фланкированными разными молекулярными маркерами.

Хромосома 15. На микрохромосоме 15 курицы (GGA15) ВАС-клон WAG21C7 (положение 11,8 млн.п.н.) прилежит крупному CNM-иозитивному центромнрному хромомеру, тогда как ВАС WAG6D21 (положение 0,7 млн.п.н.) картирован в q -терминальном районе (рисунок 4 д). Полученные результаты свидетельствуют о том, что, как и в случае хромосомы 14, в текущей версии сборки генома курицы на GGA15 неправильно аннотирован порядок генов относительно положения центромеры, и, таким образом, карты упорядоченных расшифрованных контигов хромосом 14 и 15 следует перевернуть. Важно, что эти результаты полностью согласуются с имеющимися данными о положении центромер на картах радиационных гибридов GGA14 и GGA15 (Morrison et al., 2007; д-р А. Вигнал, личное сообщение).

На ортологичной микрохромосоме перепела (СС015) ВАС WAG21C7 локализован также на длинном плече, близко к центромере, а именно в хромомере, прилежащем к крупному центромерному кластеру Bg/II-повтора (рисунок 4 д). Таким образом, центромеры на GGA15 и СС015 фланкированы гомологичными последовательностями.

Природа различий в морфологии хромосом домашней курицы и японского перепела: формирование центромер de novo или перицентрические инверсии?

Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что перицентрические инверсии не были главным механизмом изменения морфологии ортологичных хромосом при формировании кариотипов курицы и японского перепела. Так, по всей видимости, центромеры макрохромосом 1 (рисунок 1), 3 (рисунок 2) и 4 (Galkina et al., 2006), по крайней мере, у одного вида были сформированы de novo в ходе дивергенции двух кариотипов. Сходный пример формирования «эволюционно новых центромер» (ЭНЦ, англ. «evolutionary new centromere») у Курообразных был выявлен при сравнении кариотипов курицы и красноногой куропатки (Alecloris iiifa, семейство Фазановые) (Kasai et al., 2003): на хромосоме 4 курицы и ортологичной хромосоме куропатки сохранился идентичный порядок генов, тогда как положение центромеры на них различно.

Феномен «перемещения центромеры» (англ. «centromere repositioning»), когда в ходе эволюции центромера возникает в новом локусе хромосомы без какого-либо изменения порядка генов на ней, был ранее описан в разных таксономических группах (например: Montefalcone et al., 1999; Nagaki et al., 2004; O'Neill et al., 2004; Kobayashi et al., 200B; Stanyon et al., 2008; Han et al., 2009; Piras et al., 2010; Rocchi et al., 2012; Trifonov et al., 2012). Считается, что именно перемещение центромеры могло представлять потенциально мощную эволюционную силу для репродуктивной изоляции и видообразования (Amor et al., 2004; Marshall et al., 2008). Стоит отметить, что механизмы, лежащие в основе данного явления, пока остаются не до конца понятными. Согласно одной из гипотез, описывающих

механизмы перемещения центромеры в ходе эволюции, данный процесс представляется в виде совокупности событий инактивации функциональной центромеры, содержащей сателлитную ДНК, и формирования неоцентромеры в другом районе хромосомы с последующей фиксацией события в популяции (Amor et al., 2004; Marshall et al., 2008; Piras et al., 2010). При этом старая, инактивированная центромера со временем теряла сателлитные повторы, тогда как вновь сформировавшаяся центромера должна была приобрести сателлитную ДНК, преобразуясь, таким образом, в обычную «зрелую» центромеру и элиминируя свидетельства своей неоцентромерной природы.

Можно ли согласно этой модели обнаружить свидетельства этапов формирования ЭНЦ в ходе эволюции Курообразных? В контексте данных, полученных в настоящей работе при сравнении кариотипов домашней курицы и японского перепела, можно было ожидать обнаружения различий в организации центромерных районов между хромосомами, на которых центромера сохраняла свое положение в ходе дивергенции двух кариотипов (хромосома 2), и хромосомами, на которых центромеры «перемещались» в новый локус (хромосомы 1, 3 и 4). Мы не знаем, как организованы центромерные районы этих хромосом у перепела, но, но крайней мере, в кариотипе курицы все они имеют сходную организацию и представлены тандсмнымн повторами, очевидно произошедшими от общей анцестральной последовательности (Shang et al., 2010). Принимая во внимание время дивергенции курицы и японского перепела, а именно более 30 млн. лет назад (van Tuinen, Dyke, 2004), разумно предположить, что в ходе эволюции кариотипа курицы сформировавшиеся de novo центромеры могли со временем аккумулировать сателлитные повторы и, таким образом, преобразоваться в зрелые центромеры. В связи с этим, стоит подчеркнуть, что практически все обнаруженные к настоящему моменту ЭНЦ содержат в своем составе протяженные блоки сателлитных повторов и потому уже неотличимы по организации от обычных центромер (Rocchi et al., 2012). Альтернативно, центромеры на хромосомах 1, 3 и 4 в кариотипе курицы могли сохранить анцестральное положение, тогда как случаи формирования ЭНЦ сопровождали эволюцию кариотипа японского перепела, однако, без широкого сравнительного анализа ортологичных хромосом птиц, принадлежащих разным таксонам, эволюционная направленность случаев формирования ЭНЦ остается неопределенной.

Хромосомой, чья центромера была сформирована недавно в ходе эволюции, может являться хромосома 5 курицы. Так, центромера на GGA5 лишена сателлитных повторов, типичных для центромерных районов хромосом, и содержит уникальные последовательности и интерсперсные повторы (Shang et al., 2010). Именно такой тип организации, по всей видимости, может соответствовать начальным этапам формирования центромеры в ходе эволюции. В то же время, выявленная в настоящей работе консервативность локализации и состава центромерного района GGA5 и СС05 свидетельствуют о том, что центромера сформировалась в этом локусе хромосомы ещё до момента дивергенции двух кариотипов от их общего предкового кариотипа. Интересно, что сходная организация центромер недавно была обнаружена в геноме картофеля {Solatium tuberosum) (Gong et al., 2012). В составе центромер пяти хромосом S. tuberosum были выявлены уникальные/низкокопийные последовательности ДНК, но не сателлитные повторы. Авторы предполагают, что центромеры, сформировавшиеся de novo, могли длительное время оставаться лишенными сателлитных повторов и медленно эволюционировать путем аккумуляции мугаций и встраивания транспозабельных элементов (Gong et al., 2012).

Как уже упоминалось ранее, центромерные районы микрохромосом домашней курицы и японского перепела маркированы консервативными центромерными повторами с

повторяющейся единицей длиной 41 п.н. - CNM и Дд/П-повтором, соответственно, которые, по всей видимости, произошли от общей анцестральной последовательности (Matzke et al., 1990; Tanaka et al., 2000; Krasikova et al., 2006; Derjusheva et al., 2007). Означает ли это, что случаи «перемещения центромеры» затрагивали только макрохромосомы? На основании данных, полученных в настоящей работе, можно полагать, что, по крайней мере, на некоторых микрохромосомах центромера могла сформироваться de novo в ходе дивергенции двух видов. Так, результаты высокоразрешающего сравнительного анализа микрохромосом 12, 13 и 14 курицы и ортологичных хромосом японского перепела (рисунок 4) позволяют заключить, что на этих хромосомах при формировании одного из кариотипов могли происходить события перемещения центромеры или крупномасштабные парацентричекие инверсии. Интересным является тот факт, что некоторые микрохромосомы в кариотипе курицы помимо центромерного кластера CNM содержат дополнительный кластер этого повтора в ^-терминальном районе (Krasikova et al., 2006). Суммируя полученные результаты и данные литературы, мы можем предположить, что в ходе формирования современного кариотипа курицы могли происходить следующие события: (1) повтор CNM изначально маркировал оба конца хромосомы, при этом фиксация положения центромеры на одном из концов происходила стохастически, (2) «перемещение центромеры» происходило через удвоение CNM, и q-терминальный кластер представляет собой остаточный (следовой) массив сателлитной ДНК в старой инактнвированной центромере, (3) парацентрические инверсии, вовлекающие материал целого плеча хромосомы, с точками разрывов/слияний в районах кластеров повтора сопутствовали дивергенции кариотипов двух видов.

Обсуждая природу различий в морфологии (в первую очередь, различия центромерного индекса) микрохромосом домашней курицы и японского перепела, следует отметить, что по сравнению с акроцснтрнчсскими микрохромосомами 11-15 курицы, ортологичные микрохромосомы перепела, по всей видимости, стали двуплечими в процессе аккумуляции гетерохроматина. Такой гстсрохроматин, как показано, формирует материал коротких плеч микрохромосом перепела (Krasikova et al., 2009). При этом особый случай представляет микрохромосома 11, где помимо формирования гетерохроматинового блока в ходе дивергенции двух кариотипов произошла перицентрическая инверсия района, соответствующего длинному плечу хромосомы курицы.

В заключение хочется подчеркнугь, что высокоразрешающее сравнительное картирование на гигантских хромосомах стадии ламповых щеток является удобным инструментом для изучения хромосомных перестроек, сопутствовавших эволюции кариотипов представителей Курообразные. Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество внутрихромосомных изменений, сопровождавших эволюцию на первый взгляд очень консервативных кариотипов представителей отряда Курообразные, значительно больше, чем позволяют оценить методы стандартной цитогенетики с использованием митотических метафазных хромосом. В настоящей работе были выявлены ранее не описанные инверсии, различающие оргологочные хромосомы двух видов, а также с высоким разрешением картированы их точки разрывов/слияний. На границах выявленных инверсий были обнаружены тандемно повторяющиеся последовательности, характеризующиеся повышенной рскомбинационной активностью. Типы внутрихромосомных перестроек, различающих два кариотипа, но всей видимости, более разнообразны, чем считалось ранее. Так, выбранный методический подход позволил пересмотреть устоявшиеся представления о существовании множественных перицентрических инверсий, различающих хромосомы этих птиц. Помимо пара- и

перицентрических инверсий эволюцию карнотипов представителей Курообразных сопровождали события перемещения центромеры путем формирования центромер de novo.

ВЫВОДЫ

1. Последовательности, гомологичные центромерным сателлитным повторам хромосом 1,

2, 3 и 11 курицы, отсутствуют в геноме японского перепела. Уникальные последовательности из цснтромерных районов хромосом 5 и 27 курицы присутствуют в геноме японского перепела и локализуются в нентромерных районах соответствующих ортологичных хромосом.

2. Центромерные районы микрохромосомы 27 курицы и ортологичной микрохромосомы японского перепела организованы сходным образом и представлены уникальными последовательностями и кластерами тандемного повтора с длиной повторяющейся единицы 41 п.н.

3. В кариотипах домашней курицы и японского перепела отсутствует ранее предполагаемая инверсия перицентрического района хромосомы 1. Разница в положении центромеры на хромосоме 1 курицы и японского перепела обусловлена формированием центромеры de novo в ходе дивергенции двух кариотипов.

4. Ортологичные макрохромосомы 2 в кариотипе домашней курицы и японского перепела различают две инверсии, захватывающие цснтромерный район. Границы крупномасштабной инверсии располагаются в районах 38,5^17,9 млн.п.н. и 85,297,0 млн.п.н.

5. Хромосому 3 курицы и японского перепела различает инверсия, захватывающая терминальный район хромосомы. Границы инверсии располагаются в районах 0380 тыс.п.н и 5,4-5,8 млн.п.н. на хромосоме 3 курицы, при этом «нижняя точка разрыва» соответствует кластеру тандемного повтора CNM. Разница в положении центромер на хромосоме 3 курицы и перепела обусловлена формированием центромеры de novo в ходе дивергенции двух кариотипов.

6. Кластеры повтора CNM в точках разрывов/слияний инверсий, различающих хромосому 3 курицы и её ортологов в кариотипах японского перепела и индейки, являются горячими точками рекомбинации.

7. Разница в положении центромеры на микрохромосоме 11 курицы и ортологичной хромосоме японского перепела обусловлена наличием перицентрической инверсии, при этом точка разрыва/слияния располагается в центромерном районе.

8. Центромеры ортологичных микрохромосом 12, 13, 14, но не микрохромосомы 15, курицы и японского перепела находятся в разном генетическом окружении. Различия в положении центромер относительно молекулярных маркеров на хромосомах 12, 13 и 14 у двух видов могут быть обусловлены либо формированием центромер de novo, либо наличием крупных парацентрических инверсии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Zlotina A., Galkina S., Krasikova A., Crooijmans R., Groenen M., Gaginskaya E., Deryusheva S. Centromere positions in chicken and Japanese quail chromosomes: de novo centromere formation versus pericentric inversions// Chromosome research. 2012. V. 20. №8. P. 1017-1032.

2. Krasikova A., Fukagawa Т., Zlotina A. High-resolution mapping and transcriptional activity analysis of chicken centromere sequences on giant lampbrush chromosomes // Chromosome research. 2012. V. 20. №8. P. 995-1008.

3. Zlotina A., Galkina S.? Krasikova A., Crooijmans R., Grocncn M., Gaginskaya E., Deryusheva S. Precise centromere positioning on chicken chromosome 3 // Cytogenetics and Genome Research. 2010. V.129. №4. P. 310-313.

4. Дакс A.A., Дерюшева C.E., Красикова А.В., Злотииа A.M., Гагинская Е.Р., Галкина С.А. Хромосомы-ламповые щетки японского перепела Cotumix coturnix japónica: новая версия цитогенетических карт// Генетика. 2010. Т.46. № 10. С. 1335-1338.

5. Krasikova A., Daks A., Zlotina A., Gaginskaya Е. Polymorphic heterochromatic segments in Japanese quail microchromosomes // Cytogenetics and Genome Research. 2009. V. 126. № 1-2. P.148-155.

Тезисы:

6. Красикова A.B., Маслова А.В., Василевская Е.В., Злотииа A.M. Пространственная организация и транскрипционная активность сателлитной ДНК в клетках линии MDCC -MSB1 домашней курицы // Цитология. 2012. Т. 54. № 4. С. 345.

7. Zlotina A., Krasikova A., Deryusheva S., Crooijmans R., Groenen M., Gaginskaya E., Galkina S. Comparative cytogenetic analysis of centromere positions in chicken and Japanese quail karyotypes using giant lampbrush chromosomes // Chromosome Research. 2011. V. 19. №1 (Supplement). P. 190-191.

8. Krasikova A., Fukagawa Т., Zlotina A. High- resolution mapping and analysis of transcriptional activity of chicken CENP-A- associated sequences on giant lampbrush chromosomes // Abstract book of the 18-th International chromosome conference. 2011. P.4.

9. Galkina S., Zlotina A. Comparative cytogenetic analysis of chicken and quail: high precision chromosome mapping // Abstract book of the 6-th International chick meeting. 2011. P. 36.

10. Galkina S., Zlotina A., Daks A. High-resolution cytogenetic analysis of chicken microchromosomes // Abstract book of the 18-th International chromosome conference. 2011.P.87.

11.Zlotina A., Galkina S., Crooijmans R„ Groenen M., Gaginskaya E., Deryusheva S. Intrachromosomal rearrangements in chicken and Japanese quail karyotypes: inversions and neocentromere formation // Chromosome Research. 2010. V. 18. № 6. P. 728-729.

12. Злотииа A.M., Галкина С.А., Гагинская E.P. Цитогенетический и компьютерный анализ точек разрывов в хромосоме 3 у курицы и японского перепела // Материалы международной конференции «Хромосома 2009». 2009. С. 128-129.

13. Zlotina A, Galkina S., Dcrysheva S., Krasikova A., Gaginskaya E. Intrachromosomal rearrangements in chicken and Japanese quail karyotypes: in situ and in silico analysis // Abstracts of the international conference «Modem microscopy techniques in biology and medicine». 2009. P.33.

14. Zlotina A., Daks A., Galkina S., Deryusheva S., Krasikova A., Crooijmans R., Groenen M., Gaginskaya E. High-resolution comparative FISH mapping on chicken and Japanese quail lampbrush chromosomes // Chromosome Research. 2008. V. 16. № 7. P. 1048.

15. Злотииа А., Галкина С., Красикова А., Дерюшева С., Гагинская Е. Центромерный район хромосомы 3 курицы (Callus gallas domeslictis): детальный цитогенетический анализ // Сборник тезисов 12-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». 2008. С. 26-27.

16. Злотииа A.M. Галкина С.А. Красикова А.В. Дерюшева С.Е. Гагинская Е.Р. Детальное физическое картирование и распределение хиазм в центромерном районе хромосомы-ламповой щетки 3 курицы // Материалы международного научно-методического семинара «Современные методы микроскопии в исследовании живых систем». 2008. С. 19.

Подписано в печать 06.05.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10618b.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Злотина, Анна Михайловна, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ЗЛОТИНА Анна Михайловна

ХРОМОСОМЫ ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ И ЯПОНСКОГО ПЕРЕПЕЛА

(РНА81А1ЧГОАЕ, САЫЛРОГШЕЗ): СРАВНИТЕЛЬНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

На правах рукописи

04201358880

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор биологических наук, профессор Е.Р. Гагинская

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 6

1. Обзор литературы 13

1.1. Класс Птицы (Aves). Краткие сведения о классификации, происхождении и эволюции 13

1.2. Особенности кариотипов птиц 15

1.2.1. Число хромосом в кариотипах 15

1.2.2. Структура кариотипов 16

1.2.3. Консервативность кариотипов 19

1.2.4. Происхождение микрохромосом 21

1.3. Исследование кариотипа и генома курицы - основа

для сравнительной цитогенетики и геномики птиц 22

1.3.1. Генетические карты 23

1.3.2. Кариотип и физические карты 25

1.3.3. Организация генома курицы 30 1.3.3.1. Центромерные районы хромосом курицы 32

1.3.4. Методы, используемые в сравнительной геномике птиц 35

1.4. Хромосомные перестройки, сопутствовавшие эволюции

кариотипов представителей отряда Курообразные (Galliformes) 38

1.4.1. Кариотипы домашней курицы {Gallus g. domesticas) и

японского перепела (Coturnix с. japónica) 41

1.5. Анализ кариотипов птиц с использованием гигантских хромосом из растущих ооцитов 43

1.5.1. Организация хромосом на стадии ламповых щеток птиц 43

1.5.2. Высокоразрешающее цитогенетическое картирование с использованием преимуществ хромосом-ламповых щеток 49

2. Материалы и методы 52

2.1. Объекты и материал исследования 52

2.2. Приготовление препаратов хромосом-ламповых щеток 52

2.3. Скрининг баз данных, содержащих информацию о

расшифрованных последовательностях генома курицы 53

2.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание 56

2.5. Подготовка ДНК-зондов, используемых для флуоресцентной гибридизации in situ 57

2.5.1. Выделение ДНК ВАС-клонов 58

2.5.2. Мечение ДНК ВАС-клонов и цельнохромосомных зондов 58

2.5.3. Подготовка зондов к центромерным последовательностям курицы 60

2.5.4. Оценка эффективности мечения ДНК зондов 61

2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) 62

2.6.1. FISH на хромосомах-ламповых щетках курицы 62

2.6.2. Гетерологичная FISH на хромосомах-ламповых щетках

японского перепела 63

2.6.3. Повторная FISH на хромосомах-ламповых щетках 64

Г

2.7. Двумерная флуоресцентная и фазово-контрастная микроскопия и обработка изображений 64

3. Результаты 65

3.1. Высокоразрешающее картирование центромерных последовательностей курицы на хромосомах-ламповых щетках 65

3.1.1. Локализация хромосомо-специфичных центромерных сателлитных повторов на хромосомах-ламповых щетках курицы 65

3.1.2. Детальный цитогенетический анализ района 0-23 млн.п.н. хромосомы 3 курицы: локализация центромеры и двух нецентромерных кластеров повтора CNM относительно молекулярных маркеров 68

3.1.3. Локализация нетандемно повторяющихся центромерных последовательностей на хромосомах-ламповых щетках 5 и 27 курицы 71

3.1.4. Поиск последовательностей ДНК, гомологичных центромерным последовательностям домашней курицы,

в кариотипе японского перепела 75

3.2. Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ хромосом домашней курицы и японского перепела с использованием ламповых щеток 79

3.2.1. Внутрихромосомные перестройки, различающие ортологичные макрохромосомы курицы и японского перепела 80

3.2.1.1. Хромосома 1 80

3.2.1.2. Хромосома 2 83

3.2.1.3. Хромосома 3 87

3.2.1.4. Хромосома 5 89

3.2.2. Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ микрохромосом курицы и их ортологов в кариотипе японского перепела 91

3.2.2.1. Хромосома 11 92

3.2.2.2. Хромосомы 12 и 13 95

3.2.2.3. Хромосома 14 98

3.2.2.4. Хромосома 15 100

4. Обсуждение 102

4.1. Высокоразрешающий цитогенетический анализ центромерных районов хромосом-ламповых щеток домашней курицы и японского перепела 103

4.2. Природа различий в морфологии хромосом домашней курицы и японского перепела: формирование центромер de novo или перицентрические инверсии? 106

4.3. Свойства последовательностей, локализующихся на границах инверсий, различающих хромосомы курицы и японского перепела 115

4.4. Высокоразрешающий цитогенетический анализ хромосом и коррекция баз данных по расшифрованным последовательностям генома курицы с использованием ламповых щеток 118

Выводы 122

Список литературы 125

і

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT - антитела

дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ - дезоксиаденозин-, дезоксигуанозин-, дезоксицитозин-дезокситимидинтрифосфат

ЛЩ - хромосомы типа ламповых щеток

млн. п.н. - миллион пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

тыс.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ЭНЦ - эволюционно новая центромера

AFLP (amplified fragment length polymorphism) - полиморфизм длины амплифицированных фрагментов

ВАС (bacterial artificial chromosome) - бактериальная искусственная хромосома

ССО (Coturnix coturnix japonica) - японский перепел (при обозначении хромосом)

CGH (comparative genome hybridization) - сравнительная геномная гибридизация

ChIP (chromatin immunoprecipitation) - иммунопреципитация хроматина

CM A (chromomycin A3) - хромомицин A3

CNM - chicken erythrocyte nuclear membrane associated repeat

CNV (copy number variation) - вариация числа копий сегментов ДНК

CR1 - chicken repeat 1

DABCO (l,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) - 1,4- диазобицикло[2.2.2]октан) DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) - 4'-6-диамидин-2-фенилиндол DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction FISH (fluorescence in situ hybridization) - флуоресцентная гибридизация in situ GGA (Gallus gallus domesticus) - домашняя курица (при обозначении хромосом) HSA (Homo sapiens) - человек разумный (при обозначении хромосом) ICGSC - International Chicken Genome Sequencing Consortium LINE - (long interspersed nuclear element) - длинный интерсперсный элемент LTR - (long terminal repeat) - длинные концевые повторы PBS (phosphate buffered saline) - фосфатный буферный раствор QTL (quantitative trait loci)- локусы количественных признаков

SINE (short interspersed nuclear element) - короткий интерсперсный элемент SNP (single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм SSC (saline-sodium citrate) - стандартный натрий-цитратный буфер TBL (telomeric bow-like loop) - теломерные петли-бантики TGL (terminal giant loop) - терминальная гигантская петля

ВВЕДЕНИЕ

Организация и эволюция кариотипов принадлежат к широко исследуемым проблемам современной биологии, при этом хромосомные перестройки и их потенциальная роль в процессе видообразования и в генезисе генетически-обусловленных заболеваний вызывают особый интерес. К основным структурным внутрихромосомным перестройкам, сопровождавшим эволюцию кариотипов, можно отнести инверсии (парацентрические и перицентрические, при этом последние захватывают район центромеры), делеции и дупликации. Наиболее распространенными примерами межхромосомных эволюционных аберраций могут служить транслокации, центрические слияния хромосом (так называемые робертсоновские транслокации), а также центрические разделения (Коряков, Жимулев, 2009).

Среди позвоночных к настоящему моменту в наибольшей степени изучены кариотипы млекопитающих (например: Graphodatsky et al., 2002; 2011; Murphy et al., 2005; Ferguson-Smith, Trifonov, 2007; Perelman et al., 2012; Romanenko et al., 2012; Trifonov et al., 2012). Так, на основании целого комплекса методических подходов классической цитогенетики, а также современных методов сравнительной молекулярной цитогенетики и геномики был сконструирован предполагаемый анцестральный (предковый) кариотип млекопитающих (Graphodatsky, 2007; Kemkemer et al., 2009; Graphodatsky et al., 2011; Ruiz-Herrera et al., 2012), построены подробные схемы филогенетических взаимоотношений их основных таксономических групп (Graphodatsky, 2007; Hallstrom, Janke, 2010; Graphodatsky et al., 2011; Trifonov et al., 2012), выявлены некоторые свойства нуклеотидных последовательностей из хромосомных точек разрывов/слияний (Slamovits, Rossi, 2002; Ruiz-Herrera et al., 2006; Kehrer-Sawatzki, Cooper, 2008; Adega et al., 2009; Kemkemer et al., 2009), сформулированы возможные механизмы формирования эволюционных перестроек (Pevzner, Tesler 2003; Kemkemer et al., 2009; Kehrer-Sawatzki, Cooper, 2008; Adega et al., 2009), сопровождавших дивергенцию кариотипов млекопитающих. Тем не менее, исследование кариотипов других животных, в частности, кариотипов представителей класса Птицы, необходимо для расширения представлений о закономерностях эволюции

хромосом и о механизмах формирования хромосомных перестроек у позвоночных. За последнее десятилетие был сделан значительный прогресс в области сравнительной геномики птиц, вследствие чего были выявлены интересные тенденции в эволюции их кариотипов (Burt et al., 1999; Burt, 2002; Griffin et al., 2007; Ellegren, 2010; Völker et al., 2010; Skinner, Griffin, 2012).

Представители класса Птицы характеризуются сложно устроенными кариотипами. Так, их типичный диплоидный набор представлен высоким числом хромосом, несколько пар из которых - относительно крупные макрохромосомы, а остальное множество - крошечные морфологически похожие друг на друга микрохромосомы (Tegelström, Ryttman, 1981; Родионов, 1996; 1997; Burt, 2002; Masabanda et al., 2004; Griffin et al., 2007). С помощью различных методических подходов была показана удивительно высокая консервативность синтенных блоков, а также эволюционная стабильность кариотипов птиц в целом (Shibusawa et al., 2001; Guttenbach et al., 2003; Derjusheva et al., 2004; Kayang et al., 2006; Griffin et al., 2007; Backström et al., 2008; Nanda et al., 2008; 2011). Главным образом, такая консервативность обусловлена малым числом межхромосомных перестроек, сопутствовавших дивергенции кариотипов птиц, что связывают с относительно низким содержанием повторяющихся последовательностей в их геномах (Burt et al., 1999; Burt, 2002; ICGSC, 2004; Wicker et al., 2005). Тем не менее, частота внутрихромосомных изменений, по всей видимости, является недооцененной (Shibusawa et al., 2001; 2004 a,b; Völker et al., 2010; Skinner, Griffin, 2012).

Кариотипы представителей отряда Курообразные (Galliformes) (куры, перепела, индейки, павлины, куропатки, фазаны) - одни из наиболее подробно изученных кариотипов птиц; в первую очередь такой интерес объясняется важностью этих видов с экономической точки зрения. Кроме того, некоторые представители отряда, такие как домашняя курица (Gallus gallus domesticus) и японский перепел (Coturnix coturnix japonica) широко используются в качестве модельных объектов исследований в области биологии развития, генетики, нейробиологии, эндокринологии, иммунологии и в биомедицине (например: De Groef et al., 2008; Huss et al., 2008; Datar, Bhonde, 2011).

Данные, полученные в ходе выполнения международного проекта по секвенпрованию генома курицы (ICGSC, 2004), а также детальное описание кариотипа этого вида (Masabanda et al., 2004) являются базой для сравнительных молекулярно-цитогенетических исследований кариотипов птиц, в том числе представителей Курообразных. Так, стало возможным «переносить» данные о хорошо охарактеризованных геноме и кариотипе курицы на менее изученные кариотипы других видов птиц. Получение цельнохромосомных зондов (англ. chromosome paints) для хромосом курицы (Griffin et al., 1999; Guillier-Gencik et al., 1999; Masabanda et al., 2004), ВАС (bacterial artificial chromosome) - библиотек клонированных последовательностей генома курицы (Zoorob et al., 1996; Crooijmans et al., 2000; Lee et al., 2003) и использование их в качестве молекулярных зондов для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) позволяет проводить более детальный, по сравнению со стандартными методами цитогенетики, анализ хромосом птиц.

Ряд внутрихромосомных перестроек, крупных инверсий, отличающих ортологичные хромосомы у представителей отряда Galliformes, был охарактеризован с помощью картирования молекулярных маркеров на митотических метафазных хромосомах (Shibusawa et al., 2001; 2002; 2004 a,b; Kasai et al., 2003; Griffin et al., 2008). Однако использование таких хромосом не дает удовлетворительного разрешения при сравнительном картировании, и поэтому точно определить границы инверсий и охарактеризовать последовательности из точек разрывов/слияний оказывается невозможным.

К внутрихромосомным перестройкам, сопутствующим эволюции кариотипов при дивергенции видов, также можно отнести недавно описанное в литературе явление «перемещения центромеры» (англ. centromere repositioning) (Montefalcone et al., 1999). При этом в ходе эволюции центромера возникает в новом локусе хромосомы без какого-либо изменения порядка генов на ней. Считается, что перемещение центромеры могло представлять потенциально мощную эволюционную силу для репродуктивной изоляции и видообразования (Amor et al., 2004; Marshall et al., 2008). Наиболее подробно этот феномен исследован на примере кариотипов приматов (например: Montefalcone et al, 1999; Ventura et al.,

2007, Stanyon et al., 2008), но также был выявлен у других млекопитающих (O'Neill et al., 2004; Murphy et al., 2005; Carbone et al., 2006; Kobayashi et al., 2008; Piras et al., 2010; Rocchi et al., 2012; Trifonov et al., 2010; 2012) и растений (Nagaki et al., 2004; Han et al., 2009). У птиц, в частности у представителей отряда Курообразные, сходный случай формирования центромеры de novo был описан при сравнении хромосомы 4 в кариотипах курицы и красноногой куропатки (Alectoris rufa) (Kasai et al., 2003) из семейства Фазановых, а также ортологичной хромосомы японского перепела (Galkina et al., 2006). Являются ли эти случаи единичными, или же феномен «перемещения центромеры» был характерным для эволюции кариотипов птиц остается не известным. Ответ на этот вопрос можно получить, проводя детальное сравнительное картирование последовательностей ДНК из околоцентромерных районов на хромосомах разных видов птиц. Кроме того, сравнительный анализ последовательностей, входящих в состав самих центромер хромосом близкородственных видов птиц, позволил бы расширить представления о механизмах формирования и эволюции центромер.

На протяжении долгих лет лишь немногие центромерные последовательности курицы были известны (Matzke et al., 1990; Solovei et al., 1998; Wang et al., 2002; Krasikova et al., 2006; Li, Leung, 2006). Однако недавно удалось расшифровать и охарактеризовать CENP-A-связывающие центромерные последовательности большинства хромосом курицы, в результате чего были выявлены различия в организации её центромер на разных хромосомах (Shang et al., 2010). В отличие от большинства центромер, содержащих блоки сателлитных повторов, центромеры хромосом 5, 27 и Z курицы представлены уникальными последовательностями, обогащенными ретротранспозонами, и, таким образом, внроятно, являются эволюционно новыми, недавно сформировавшимися центромерами (Shang et al., 2010). Присутствуют ли последовательности, гомологичные центромерным последовательностям хромосом курицы, в геноме других видов птиц и, если да, то выполняют ли они там функцию центромерных последовательностей, остается не исследованным.

Два эволюционно близких вида, домашняя курица и японский перепел, как и большинство представителей отряда Курообразные, обладают на первый взгляд очень сходными кариотипами. Оба кариотипа содержат одинаковое число

хромосом (2п=78). Кроме того, результаты сравнительного цитогенетического картирования (Shibusawa et al., 2001; Schmid et al., 2005; Galkina et al., 2006; Kayang et al., 2006), хромосомного пэйнтинга (Schmid et al., 2000; Guttenbach et al., 2003), a также генетического картирования (Kayang et al., 2006; Sasazaki et al., 2006) свидетельствуют о высокой степени консервативности хромосом курицы и японского перепела. Тем не менее, морфология (в частности, положение центромер) большинства ортологичных хромосом в двух кариотипах заметно отличается. Так, практические все микрохромосомы домашней курицы акроцентричны, в то время как микрохромосомы японского перепела преимущественно субметацентрики (Kaelbling, Fechheimer, 1983; Calderón, Pigozzi, 2006; Krasikova et al., 2006; 2009). Показано, что короткие плечи микрохромосом японского перепела сформированы вариабельными по размеру блоками гетерохроматина (Krasikova et al., 2009). Выявить другие эволюционные события, которые могли сопровождать дивергенцию микрохромосомной части двух кариотипов, возможно лишь с помощью детального цитогенетического анализа микрохромосом, в частности, методом сравнительного картирования молекулярных маркеров с высоким цитогенетическим разрешением.

Различия в положении центромеры характеризуют также некоторые ортологичные макрохромосомы курицы и перепела. Так, сравнительный анализ рисунка дифференциальной исчерченности метафазных хромосом у двух видов позволил обнаружить несовпадение ряда сегментов ортологичных макрохромосом 1, 2, 4, 6 и Z, что было объяснено наличием перицентрических инверсий (Ryttman, Tegelstróm, 1981; Sasaki, 1981; Stock, Bunch, 1982). Позже, часть из этих предполагаемых инверсий была подтверждена с помощью картирования клонированных последовательностей курицы на метафазных хромосомах обоих видов (Shibusawa et al., 2001; Schmid et al., 2005; Kayang et al., 2006). Тем не менее, имея в виду небольшой физический размер митотических хромосом птиц, для сравнительного картирования близкорасположенных последовательностей ДНК оказывается важным использовать удлиненные хромосомы, в частности, хромосомы стадии ламповых щеток (ЛЩ).

Ламповые щетки представляют собой сильно деконденсированные танскрипционно-активные хромосомы диплотенной стадии профазы мейоза I, имеющие характерную хромомерно-петлевую организацию (обзоры: Callan, 1986; Morgan, 2002; Gaginskaya et al., 2009). На стадии ламповых щеток гомологичные хромосомы входят в состав бивалентов и объединены между собой в районах хиазм. Хромосомы-ШЦ птиц в 20-30 раз превышают по размеру соответствующие метафазные хромосомы, кроме того, они обогащены цитологическими маркерами (Кропотова, Гагинская, 1984; Челышева и др., 1990; Solovei et al., 1992; Родионов, 2001; Gaginskaya et al., 2009). Благодаря своим исключительным свойствам хромосомы-ЛЩ птиц оказываю�