Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Превращение формиата и его влияние на метаболические процессы в рубце

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Превращение формиата и его влияние на метаболические процессы в рубце"

од

украшська аклдешя аграриях наук институт фззюлогп i biqximii тварин

На правах рукопису yjf 576.8;577.15.07/g8;57?.151

Войт»« Ояеясандр Аркад1йавич

ЛЕРЕТВОРВШЯ ФОРША ТУ I ЙОП) ШМВ ЯА ОКРШ ИЕТАБОЛ1ЧН1 ПРОЩМ В РУБЦ1

03.00.04 - öioxiMl«

Автореферат

дисертащ I ва здобуггя ваукового ступени канладата б!олог1чних наук

ЛЪВШ - lSKtó

Робота виконана в лабораторП обкину речовин 1нституту ф!з1 -одогИ 1 61ох1мП тварин У.4ра1Нсъко1 академП аграрии* наук.

Ваухавкй кер!вник - доктор б1олог!чних наук, 11рофесор

КАЛАЧЮОК ГРИГ0Р1Й 1ВАН08ИЧ Науксший консультант - кандидат 61олог1чних наук,

РОМАНИШШ ЛЮДМИЛА МИХАИЛ 1ВНА

0ф1ц1йн1 опонеити - доктор 61олог1чних наук, професор

1.1. Р03Г0Н1 - доктор б1адог1чних наук, прок-сор 3.1. СОЛОГУБ

Пров {дна установа - 1нститут 01ох1мП 1м. О.В.Паллад1на НАНУ

Захист дисертацЛ вШудеться "/Р" л 995 року

год на зас5данн1 спемо ал \ йовансн ради при I нет и тут! ф1а1алогИ 1 £Пох1мП тварин У крадись ко! академП аграриях наук.

Адреса ^статуту: 34, м. Лынв-34,

3 дисертад1ею можна ознайомитися в бЮдЮтеШ 1нституту ф1-а1аяогп 1 б1ох1м1* тварин УААН.

вул. В.Стуса, ЗЯ

Автореферат роэ1слаяий

Вчений секретар спец1ая1зовано1 вчеко! рг доктор е.- г. наук

ЯЛ. КИРШИ 8

Загальна характеристика робота

¿КТУАЛЬН1СТЬ ТЕМИ. Питания« 1нтэрмед1ариого иетабол1аму мак-рооргая1зму-господаря та метабол1эму у м1кроб1аяьн1и екосистеШ передшгунк!в тварин присвячено чюшо роб1т. Однак, щ недос-татньо уваги було нрид1лено вивченгао впливу тих чи 1ших 1нтермв-д!атхв бродання на метабал1вм ы1кроорган!ам1в рубця жуйних.

До одних 1э важливих 1ятермед1ат1в, що утворооться i перет-воряються в pyöitf належить мурашина кислота. Мапчи особ диву структуру, аокрема наявнАстъ ааьдвг1дно! 1 карбокснльно! групи при одному aTOMi вуглец», ця сполука надзвкчайио активно вступав в 6ioxiMl4Hi реакцП (Масу J.M. et al., 1S86). Перетвореккя фер-Шату TicHHM чином пав'яааие ie oOmîkqu аШнокислот, нуклеотид1в, 1н1ц1ац1ею б!дкового синтезу. Так, б1л2>ш1сть бактер!йних кд1тин при розцеавенн! п1рувату до ацетилЗ-КсА, г якого синте>аувтьоя АТФ, утворвлтъ у сервдовищ! фори1ат (Allais J.J. et al., 1983). В анаеробних умовах при дксим1ляц1иному в!дновленн1 HiTpariB до HlTpHTiB форшат служить донором електроШв (Kondratjeva E.N., 1979). Мурашина кислота кр!и його окисних перетворень вкшчавться в piaHi ыетабол!чн1 шляхи, швалентно эв'язуючись ia тетраг1дро-фсшевою кислотою, яка приймае участь у белковому синтез! (Гулий ПЛ., Мелмшчук Д.О., 1973). Разом 13 аппаратîhobob кислотоп, глутам1ном, гл!циком i СОг форм1ат приймаз участь у формуванн! пуркнового К1льця (Mohu W.W., Tiedje J.M., 1990). I взагал1 трудно назвати процес, у якому б не приймав у част ï фортат. Поряд а цим BiflOMi м1кроорган1зми, hkî використовують одновуглецвв1 спо-луки, здатн! будувати вех кемпонекти кл1тини 1з них i отримувати необх!дну еяерНи аз рахунок ïx окисления (Krumholz L.R., Bryant M.P., 1586).

Вгдомо, mp основну роль у рубцевому метабол!"Mi Б1дхгр;гит1 бактерП. В передалунках жуйних розвкваються, в основному, анае-робн! OaKTspiï. Mi* Bciiia вцдами ьйкроорггигмв 1снув екмбхоткч-31й зв'язок. Так, наприклад м1ж лактатпродукувчкии 1 дактатуткл!-зуечкки вида«!. Лктквшм розвиток одних вид1з коле стидалювати або прига1чуЕати picï 1 розвиток 1кших. Кр1м тего яри збршуваши бактвр1ями проотих цукр1в, в hkootï кхнцевкх продуктов з'являшь-ся молочна, оцтова ,проп!онова киалоти та irai речовкки- i нгерме-д!ати, як! сяужать субстратами для 1т®их вид1в рубцевкх бактер1й (Stewart O.S. and Bryant M.P., 1SS9).

Судя'ги з цього актуальность досуЦдяеггь рал! формаату у мета-бол!зм1 рубцевих бактер1й не викликге сумн!ву, оск!лькн посук i вивчення б1олог1чно активнж речозюг, цо здатн! зкконувзти плас-тичн!, енергетичн1 i регулятора! функцП, в одн1еи 1з ва«лив!ос

- г -

проблей сучасно! Cioxlull.

МЕТА ТА ЗАВДАННч ДОСЛЩЕНЬ. Виходячи 1э вгаугсказаяого, метав роботи було досл!дити иетабаШзм сумарно! фракцИ рубцевих бактер!й та И Еайхарактерн!ших предс/авнигс1в п1д вшгивом форм!а-ту. ДЛя досягнення мети вир1шувались. так! аавдання:

- дсчйдити д!ю р!зних концентрац!й ыурашино! кислота та П метабол!чного попередникз - форыаяьдег1ду (СНгО) на иета-бол1чн! характеристики 8м1шано1 допуляцП бактер!й рубця та чистих штам1в - лактатпродукуючого S. bovis А024/85 i лакгатутил!зуючого И. elsdenii LC8;

- встановити 1нтенсивн1сть включения Е14СЗ-фо>.м1ату та [14С]-формальдег1ду у внутр1шньокл1тинв1 б!опол1мари чистих штам!в та зм1шано! популяцП рубцевих бактер!й;

- э'ясувати дхп пеол1ту на 1нг!буоч1 властивост! форм!ату та р1вевь ам!акоутворення рубцевими бактбр!ями;

- вивчити д!п курашино! кислоте ва ективнЮть деяких дег1д-рогеназ зм!шано1 пояуляцП та чистих штш1в бактер!й рубця;

- ввд1лити 1з М. elsdenii LC8, очиотити та охарактеризувати ензим, щр безпопвредньо приймаа участь у розщешшнн! мурашино! кислотк - НАД-запишу форм1атдег!дрогеназу (ФДР).

НАУК08А НОВИЗНА РОБОТИ. Вперше вотановлен! меж! ф!з!олог!чно-го оптимуму для форм1ату у бактер1йн!м комплекс! t у чистих шта-м1в, як! складгтгь 1-9 Ш.З'яоовано вшшв зроставчих концентрац!й мурашино! кислоти на метабол!чн! характеристики ги1шано1 популя-ц!1 бактер!й рубця 1 вакливих предотавник!в род1в Streptococcus та Meyasphaera. Показаний вшшв CHgOz на процеси метабол1зму ам1-шанЛ популяцП бактер!й рубця в приоутност! цеол1ту. Досл!джена д!я форм1ату на активн!отъ дег!дрогенаг чистих штам!в та зм!шано! популяцП Оактер!й рубця. Встановлеио особливосИ включения С14С5-форм!ату I С14С]- формальдег!ду у Енутр!шньокл!тинн1 6!опо-л!мери Streptococcus bovis А024/65 i Megrasphasrs elsdenii LC3 та загг-ьного комплексу рубцевих 6atcrepiü. Запропововано метод вид1-лекня i очистки ОДГ ia лактатуиШа,счого штам" М.elsdenii LC8. Показано, щр Ки ФДГ для форм!ату скяадае 23,5 мМ, а для НАД* -0,21 Ш при оптимум! рЯ 7,0-8,0 i Т0пт " 35-40°С.

ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕНИЯ РОВОТИ. Виконана робота хае зкогу розши-рити энашш го 6ioxiMiI бактер!й рубця жуйних. Дано конкретну в!дпов!дь «рдо мед! ф!8!олог!чно-оптшальких концеитрац!й. мурашино! к злоти. Це дав емогу передбачати х!д брод1иня у рубц1 при зэстооуванн! форм!ату для консервувают псскивних речовия та при 1нии\ уиова;;. 3 китою п!двищенкя ефеетиьлост! асим!ляц11 амон!й-

яого азоту i форьаату м!крорган1змами рубця рекомендуется вико-ристання цеал1т1в.

OCHGBHI ПОЛОЖЕНИЯ, ДО ГЧНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСГ.

1. Рубцевi бактерП використовують мурашину кислоту у концентрат! до 9 мМ, як одне з простих i найдоступн1ипк дкерел eneprii та вугдецо. Однак, починаючи i3 концгнтращ'i 22 ¡AI, фор-м1ат виступас iHriöiTopoM метабол1чних процесгв у py6«i. Формальдегид у ес1х досл1дхуван]1х концентрациях поенЮтю блокув метабо-л1зм бачтер!й.

2. 1э всього С14С]--фзрм1ату, що вюгачився е щптини 74,7 -38,0% попадав у нуклешовх кислотл досшддувзних шкроб1альш1х об'вкт1в.

3.Ыурслзпгй уп'гпо-га у кспцгптрацП 11 »AI проявляв неспецк-ф1чний валив на актианз-оть скромнх дегчдрогепзз ; riдрага» сумар-но1 фракдП i чистих штатв рубцевих бактер!й з р1эним тшоы брс-Д1ння: лактатпродукуючих (S.bovis А024/85) i лактатутшЦзуючих (M.elscäenli LC8).

4. Форм1ат у pyöyi розщешюеться до СОо i Нг НАД-залежною $орм1атдег1дрогеназою, щр niora вид!лення, очистки 1 вивчеиня властивостей вкявилась гомодкмером э молекулярной масою оубоди-нгап, 62 кДа. Ii Км для НАД* скдадав 0,21 мМ, а для форм1ату -23,0 ыЧ при рНап-г 7,0-5,0 1 ТСпг " 35-40й:.

АПРСБАД1Я РОВОГй ТА ПУБЛ1КАЦП. Матер1али роОоти представлялись ка VI УкраЗноькому бЮк1н1чноиу з'Ззд! (Ки'1в, 1992), из кон-ферекци молодик зчених (Льв1в, 193£), науюто-риробничлй конфе-ренцп (.IbBiB -Оброишга, 19S2), на 3csyitpaiHci>Kiü копф^ре:':;!! s ф1г!ологП i 6ioxif.nI марин (Льзгв, 1S35) i на вдпчиих 'зггах лабораторН обм!ну речозян (Льв!в, 1991-1934). По текц дисе-ртащЛ опуСлжовано 5 статей, 5 тез 1 методичк! рекомекдг"и а науко-во-практичнкм обгрунтуванкям.

СТРУКТУРА ТА ОБ'бМ РОБОШ. Дисертацая складасться 1з вступу, огляду лхтератури, опису матер1ал1з i метод1в, викладу реаултз-т1в доолхдж'зкь тд Ix обговорення, BiicHonr.lB 1 списку ци;оэано'1' лХтератури ( 252даврела). Робота вгаозденз ;:а 121 отсрг -ц друко-взного тексту, i 1дюстрована 29 рисунками та 10 тзблиця». и.

ДЕКЛАРАЦШ 3 ОСОБИСТОГО ВНЕСКУ ДЙСЕРТАНТА У Р03Р0БКУ НАУКО-ВИХ РЕЗУЛЬТАТ 18.

Bei експериментадып досл1да9Ння по TeMi дисертацП дроведе-Hi автором особ!-.сто.

Матер1али i «зтодо

05'бктами досл1Джень правили зм!шана популкц1я бактерхй pyö-ця велико"! рогато! кудобп та два штамя рубцевих бактерШ лак-

татпродукуючий - Streptococcus bovis АО 24/85 1 лактатутил!зуючий - Megasphaera elsdenll LC8.

Зм1шану популяц!» бактер!й рубця отримували ьа Ченгом (Cheng E.W., et al., 1955) i вис!ваяи на уи1версадьне середовище М-10. Ростове середоваде для вирощування 6актер1й рубця виготовлялось 1з дотримрчняи yclx вимог' анаеробЮзу. Чист! штами Streptococcus ' bovis i Megaspoaera elsdenll люб'язно булк надан! нам колегами 1а 1нс,титуту ф!з!алогП тварин Словацько! АН (Kosice. Slovakia), 1нституту ф1з1олог11 1 генетики Чымсько! АН (Praha-Uiirineves, feechia) та Роветеького науково-досл!дного Тнституту (Aberdeen, United Kingdoa). Вказан! штами вирошувались таксск н.. ун!версаль-ному середовияЦ М-10. Але субстратами у дакому випадку служили 0,ß% глюкоза (Rearial) для Streptococcus bovis, i 0,8% лактат Na (Reanal) та 0,32 т!огл!колева кислота (Reanal) для Megasphaera elsdenll.

В першiи серП дсюидхень середовище для росту зм!шано1 по-пуляШЗ бактер1й рубця. розд)лилось на 5 вариант!в: г - контроль-не (середовнще без добавок формiату); 2, 3, 4, 1 5 - досл^дн!, в ростове серядовище яких додавали Формат у концентрациях 4,4 Ш; 11 Ш; 22 Ш; 44 Ш вшюендно. öm Ивана популяцгя бактерЫ рубця вироцувалась в термостат! в анаероОних умовах при ЗУ°С. На старт! та через 4, 6, 8, .10, та 12 годин визначали концентрацт к!нцевих метаболiriв / культуральному середовищ! кожно! груни, Лосл^джували вплив форм!ату на класичну криву росту (спектрофотометрично при 540нм), загальну концентрад!ю ЛЖК - пгговою дистиляц!ею (в аларат! Маркгама), концентрац1ю форм!ату - х!м!чним методом (Sleet R., Mah R., 1984), концентрац!ю ам1аку - спектрофотокет-рич! 1 ia вигаристанням реактиву Нес л ера (Калачкюк Г. И., и др., 1981), концентрацию дадочно! кислоти - енэиматично (Hohorst М., 1959) 1 вм!ст б!лк1в (при 260нм). На старт! 1 через 14, 18. 22, 20 i 30 годин в культуральному середовищ! чистих штатв визначали т! х метаАшичн! пскаакики.що i для ьм!шано! популяц!I бактерий рубця за методами, що зазиачен! вшце.

У другой cepi'i досл!джень вивчали включения С14С}"форм!ату у внутрхшньоюНтинт бюпол^мери зм1шажн популяц!I бактер'й рубця i чистих штам1В 3.bovis А024/85 та M.elsdenli LC8. Культури виро-всували на В1дпои1дних середовищах з попередн!м внесениям i 14С!-Форм i ату (40 МБк; С.-Петербург, Рос ¡я) у во! культури по Г/мкКи/100мл ростового середовища. Культури росли до середини ек^пон^шиально!" фази в гнаеробних умовах при Зу^'С. КЛтини кож-.(о. i? культур ьбираяи ц---нтрифугуранням i дб!Ч1 щомиваля 20 мМ ,!м буфером pH 7,5, отрт.п/ючи таким чином в!дмилну

Фракц1ю. 1з з!браних кл1тия видШли низькомолекулярнi речовини,

Hyrjif'inoBi кислоти, б!лки та лШди (Roberts R., et al., 1955; Kenrvjll I).. 1967).В одержат ix 61олол!мерах, на р!дьлному сцинти-ляц] иному л1чильнику Rackbeta -1219 (LKB, Sweden ) визначали ра-л1очктир.тсть в 1мпульсах га чьилину.

У трет1й cepii досдАдхень ь? бактер1й змшано! популяцП i чистил штам!в S.bovis АО 24/85 та M.elsdenlJ LC8 з допрмого» ме-xaHiUHoro руйнування i диференщ иного центрифугування одрржували 0"окл5тинний екстрякт, попео>дньо роздиивш ередовищр кожноЧ 1з культур на два варкчнти: 1 - контроль (без ферм!ату) 1 ?, - досл1д С у сер^лоьищн вносили долатково мурашку кислоту у конц*нтрац1 i 11 мМ'>. Куль тури росли ь анаеробних умовач при 39°с до середилп "К'ч1'и4^нци1льноТ (Uw-fcuiO • 5 г>дер».».иому безкл!тинному екстракт t ьимплоьали активнють <;кгпм1в у scix трьох ir/л*турях, «о ьи(<яцувались. Визначали актиьюсть лактатдеПдрогекази <.ЛДГ;КФ 1. i. J .У'). форьпатдеИдроген.чзи (ФЛГ;КФ I.?.). малатдепдроге-на*и <МДГ:КФ i.i.l.oV), jаоцитратдеплрогенази (КФ 1.1.1.42), ма-.'¡iK-енэиму (КФ 1.1.1.40), акон1тайи (КФ 4.2.1.3) i фумарази (КФ 4.2.1.2). Активнасть перших п'яти ф*<рментАв визначали спектрофо-тометрично при 340 нм i виражали у кМ НД."Н АНАДФН) за t хв на 1 mi 6i„".Ka (Norris J.R. and Ribbons. 1971). Фумаразу при 300 нм по •»м-нда-ниг! Kiлькоот 1 йумарату у с^реяони1:><, г акон!тазу - при 240 т ПО УГеОреННГ' b •-»р*(ДОШй<. иЖ--АКОН1Т?>?У I Хэнио И. и цр. , ¡■j.':-:'• 1 вкрачаяи в нМ Owapary - цис-акон1тату, в1дпов1дно. за ! -л. на 1 мг б1лку. В!лок рдакчч&ки no Lowrv O.N. (tdst;.

O-.mvw КАД-зая?лкоТ форч1атд*пдрог*»на»и t? М. els^-Mi; i лре-nv;irf/:H на к-.'локт C-J х 7см) 1з ЛЕДР,-ц^лллозом (Rf-ai.al). ' о.-онка vp I b40ba*.vwvw;h трьома ов'<--мэди 80 мМ Na-фосфчтного fivwv, эдэ

0,Of. м TiotviiiKojii-bo') кислоти, 0,01 М форм!чту Na. 1 мМ f;.7A. ¿мМ сош Мора. 5Z гдтерину. Наносили 2,5 мл неочикекого *кс1 ракту 1 v рол! елюента ьикористовували Ма-фоо(«тний 6v<H> рн .',о in Г11.чл1ент<!М 50 - 200 мМ.

Фраки; i nia>w ¡окск/Мнно! х.роматогр:>4>Н з найри^ло актив-н!стю ФДГ об'едиуьалк 1 наносили на колонку (? х ??! : С-Фадексом 6-200 'Pharmacia, Sweden). Колонка epi внойачу baia^i и мМ Na-фос-(!-«т:ним буфером рН 7,0, що Mic-тив 2. мМ ЕДТА t 1 мМ т!огл!колеьо! киглс-ти. Екстракт у к!лькост! 1 'мл наносили на колонку. В!лки ел>*-нАяись ти» жч оу^ктм, по рикористо?у?аРся для кал!брування. 4iwruU'i 1? 'Ki-aKTiitHio™ об'еднували i лгатк-^увапи протягом доби нроти 5 мМ Na-фосфатного буферу рН 7,0, використоьуочи ?

порами 3-0 кЛа (S«i va. FRG). мля<»кулярну часу ФЯР вязнаовли за допомогою каяхерувааьяого яабору о;лк1б (Phanrncia, Swe-ieru.

Електрофоретичне досл!дження хроматограф1чних фракц!й, отри-маних п!д час очистк. препарату ФДГ 1з M.elsdenil LC8, проводили на пластинах пол1акрилам!дного гелю (ПААГ) у присутност! додецил-сульфату натр1ю (ДДС-Na) зг1дно методики, запропововано! Laemmli U.K. (1970). Ал1квоти тестованих фракц1й (50 шел) лЮф1льно вису-шували, розчиняли у буфер1 для проб (Laeimül U.K., 1970). Елект-рофоретичне р^зд1лення зд1Йснювали на пластинах ПААГ з град!ентои концентратï акрилам1ду в1д 10 до 18 X. Б1лков1 фракцП виявляли шляхом 1х фарбування Кумасс! яск^аво-блакитним R-250 (Serva, FRQ) зг1дно Zehr B.D. (1989). Надлишок води з гелевих пластинок вида-ляли пом1щаючи 1х у концентрований розчин пол!вШ. п1рол1дону (Ferak, FRQ). П1сля цього г ел i висушували при кШнатн1й темпера-т. pi протягом доби 1 фотографували на пл!вц1 М1крат-300 (Свема, Укра1на). Молекулярну масу б1лк1в визначали за допомогою кал!бру-валыюго набору б1лк1в (Pharmacia, Sweden).

Для визначення уявних Км проводили сер!» вим1рювань початко-во'1 швидкост! реакцП в стандартних умовах, зм1юсючи концентрацию одного 1з субстрат1в при насичуючгй коицентрац11 1ншого. Експери-ментальн1 дан! обрсбляли, використовуючи л!неаризоване р1вняння за Лайну1вером 1 Берном (Lineweaver H., Burk D.J., 1934): 1/V - Km/Ymax ' VS + 1/Vmax. Де V - початкова швидк!сть; S - концеь.рац!я субстрату.

Граф1к будували в подв1йних обернених координатах, як описано В.И.Крупянко (1990). При визначенн! д11 Т°С, чи pH на активн!сть ФДГ використовували температуру у межах 10 -50°С 1 фосфатний буфер з межами pH б -10.

Bei дг-гл1ди проводили не менше 5 раз!в, з 2-3 паралелями у кожному BapiñHT.. Кожна точка гpaфiкiв, наведених на рисунках, В1дпов1дае середньому значению М, розрахованому за результатами 5 вим1рю»ань в одному а дек1лькох однотипних експеримент!В. С"редки похибку m отримаиого результату вира/овували за величиною се-редньоК квадратично! похибки б, i пор!вняння двох м!нливих величин проводили на основ! показника в1рог1дност! р!зниц! t (критерий От'юдентя), як описано (CopiH 1.Ф., Виноградова Р.П., 1975). Ейдмйипсть Mix величинами вважали достоЫрною, коли iMOBipKicTb Р1эниц1 Р була меншою 0.05.

Результат« досл!джень та ïx обговорення

1. МотоболÍ3M s-niuiH'iOï rtonyjixniï óaoniepifi рубця i ангиш'в 'S. bovis ALIH4/S5 да M.elsdôni i I.C8 за дИ' iiopuisiny.

Лолавг ня му ..ашино! .кислоти у к1лькост1 ZL впливае на pH,

. - 7 -

приппчуя розмноження м!кроорган1зм!в в рубц1 1 створюе умови для актнви^яцП протеаз, гхдролаз та 1ниих фермент1в у травному трак-т1. 8 той же час, встаковлено (Гулый М.Ф., Силонова ri. В., 1987; ксг.тикорский в.А., Тараканов- в.в., 1989), що форм1ат е звичалним 1 духе лктивним метабол1том рубцево'1 флори, а також тканинного метабол(зму. Ироте, нами не виявлено л1тературних даних по впливу pir-.них концентрзшй СН^О^ на метабол!зм рубцевих бактер1й.

При досл^дх^нн} рН 1 динамши росту зм!шано! популяцП бак-тер1й рубця (Рис. 1А 1 1В), встачовлено, що lac-Фаза для дано! популяцп тягнеться на протяз) перших 6 годин, а Iog-фаза продов-жуеться В1Д 6-oï до 10-o'i (Рис.1А). Муралшиа кислота, внесена у ростове середовище в концентраци 4,4 мМ не викликала достов1рн! р!зниц1 у рост! бактерш. Ка И ii' Форм!ат! lag-фаза дешо затягу-еться. А при культивуванш ïx 1s 22 ш i 44 мМ СНгОг pler бакт»-pift достов1рно !нПбуеться.

На рисунку 1Б показано, що в ход1 росту бактер1й початкове рН у середовищ! протягом всього росту знижуеться з 7,0-7,2 до 5,5-5,0. SMiHa р!вня рН у середовищах 1з 4,4 мМ 1 И мМ форм1атом мало в!др1зняеться в1д динам1ки рН у контроль А у середовищах 1з 22 мМ i 44 мМ форм1атом достов!рно в1др1зняеться в1д контрольного варианту.

Динам!ка утворення ШК, ач^аку, форм!ату 1 л акт ату при рост!

змшано!' популяц!"i бактер1й рубця на середовищ! 13 форм!атом показана на Рис.1В-Е. lli дан1 св!дчать, що максимальний р!вень продукт'! ам^аку i лактату припадав на 10-12 години i складае 38-40 urZ aniaKy i 29-31 мкмоль/мл молочно! кислоти. Ргвень утрорення а-л1аку на середовиа1 i3 4,4 мМ i 11 мМ СН2О2 достоверно -5- вгд-р1знявться niд piвкя v контроль Максимум утворення ЛЖК припадая на 10-12 години i складае ?8-40 мкмоль/мл, а максимум утворення мурашино'1' кислоти у контрол! приходиться на 8-10 години i складае 6-8 мкмоль/мл (Рис. 1Д), 1псля чого ревень 4орм1ату у середовкШ .чещо палас. Встановлений факт Еказуе на те, що мурашина кислота, як К1нц»?вий продукт гнймае важливе wicue v py6ni. Ане його висока р^акШйна здатн1сть та ¡нтенсквне перетворення не завжгн дае змо-гу зафхксувати справжн!й його р!вень у рубщ. На середс^шй з 4,4 мМ i И мМ форм^атом те спостер!гаеться зб1льшення р!вня ЛЖК у середовипц, але менше, нхж у контрол! (36 ! 37 мкмоль/мл в1дпо-в i дно ). А при рост! бактерий на середовщ! 13 22 мМ 1 44 мМ СН^Ог зОыыпення piBHH ЛЖК не спсютер1гачось зовс!м.

Отае, муратина кислота у концентрацП 4,4 i 11 мМ суттеяо не ьнливзе на sci досл1джуванз мета6ол}чн! показники при культиву-

1 1 <> «v*

Рис.1. Динам1ка росту pH (В) та утворення к!нцевих продукте метабол!зму (В-Е) у бактер1альн1м комплекс! за д11 р1зних концентрацгй фортату. BaHHi aMitiaHo'i популяцм б актер in рубця. Вищ1 И концентрацП (22 i 44 мМ) достов1рно 1нПбують метабол1чн! процеси. Разом з тим, нами встановлено, шр 1нПбуюча д1я форм!ату на метаболизм змша-но! популяци рубцевих бактерий, а також р^векь акиакоутворення енижуеться в npiicyTHOCTi цеол1ту.

Ключове значения у рубцевому брод!нн1 вШгргють групи лак-татпродукуючих i лактатутил!зуючих бактер!й (Russell J.В., et al., 1981). Особливо нажливу роль вони в1д1грають при утриманн1 тварин на ^пецяф!чн1й д!ет! або при певних зм!нах у рубцевому середовгаЦ (Maiouriek М.. et al., 1989; Russell J.B., 1991). Оск!.чъки яскра-вими представниками цих труп в Streptococcus bovis i Megasphaera elsdenll. то метою наступного стал у ня/ra'i роботи було досл1дити ппли;? мурашино'! кислоти вищевизначених концентращй на чисп штамп цлх 1.:ид1в 6актер!й.

!з даних f .сунку 2 i 3 видно, що форм1ат ; нижчих концентра-ц1ях (4,4 мМ I и мм) б1льшч впливае на picT M.elsdenii i S.bovis, Hix на picT змшачо! популяцп бактер!й рубця. хоча у вищих концентроц}ях (22 1 44 мМ) достоз1рно припичуе р!ст обох штам!в, як 1 0лктер1£ змшачо1 популяцП (Рис.2А,ЗА). Ц1 дан! не протирЬ v теку, l;o вплив мурашино! кислоти на р1ст i вих!д б!омаси до-ситъ , i г.нитъея, для окрених вид1в бактер1й (Smogrovicova D., Au-yustih J.. 1937).

ite-w, пиказачо 61льший вклкв beix досл!джуваних концентраЩй

иппим ГЖ*Атц(

г-----япЧнЛ

' <1Л ~~I—

Рис.2. Динам 1ка росту (А), б!осинтезу б1лкових комлонент1в

(Б) та утворення к1нцевих продукт1в метабол1эму (В-Е)

v 5.Ьоу1я Л024/85 за дн р'яних концентрац!й_СН20;1._

я

НиНХоЛО/п V»: . <иР5СШ6Ы колоти,

Л 30 «".-Ч *

и »•"•"»

КиМ,

СНА. й

к«

Гч СНр.

» "_Г " „ 'Л

* —О-О—21 о — « —

"210 5..Д---Л-- 44,0

--зт**.'«

Рис.й. Дииам!ка росту (А), бюсинтезу болкових компонентов (Б) та утворення юнцевих продукт!в метабол!эму- (В-Е) у М.е]5с!етд ЬС8 за ди р1зних концентраций СН2О2.

форм1ату на синтез б1лку у S.bovis, в1ж у M.elsdenil (Рис.25,ЗБ Хоча показано (Russell J.B., 1991), що 1нша кислота - ацетат, майже не впливае на твидк1сть рос?у 1 синтез б1лку S.bovis. Biso мо (Marounek M., et al.. 1989), що M.elsdenil утил1зуе лактат швидше, н!ж глюкозу. Д1йсио, мурашина кислота менш 1нтенсивно впливае на утворення лактату М. elsdenll, н!ж на утворення цього ж метабол!ту у S.bovis (Рис.2Е,ЗЕ). Це» очевидно, пов'яэане з тим, до лактат не е характерним продуктом брод1ння для M.elsdenil, i утворюеться його в 10-15 раз1в менше, н1ж при бро-д!нн1 S. bovis. Форкйат у високих концентрац!ях (22 1 44мМ) також значно менше впливав на утворення в середовищ! амг^ку M.elsdenil, Hi« на утворення цього Лицевого продукту S.bovis (Рис.2Г,ЗГ). Очевидно, на фермента! процеси. що ведуть до утворення NH3 у M.elsdenil форм!ат мае мекший вплив, н1ж на т1 ж ензими у S.bovis. Вплив форм!ату на решту метабол!чних показник!в обох штам1в був однаковим (Рис.2,3).

Сл1д BlmiTKUK, що формальдег!д у вс!х досл!джуваких кон-центрац!ях повн1стю iHriöye метабол1чн1 процеси у зм1шан!й попу-ляцП бактер!й рубца.

Z. Вкптеиня [1<1С]-форм1ату в кп1тни бактерЫ зШпаио]' ло-пумяцИ 1 рубцевих штам1в S.bovis A0Z4/85 i M.elsdenii W8.

Paul nie було показано (Силонова H.B., и др., 1979; Boss J.R., 1982), що м!тка 1з С14С1-форм1ату 1нтенсивно включаетъся в б1лко-ву 1 л1Шдку Фракц! i печ1нки щур!в, в пурини на шляху 1х синтезу de novo в нормальних л!мфобластах. людини.

Нами встановлено (Рис.4 1 5; Табл.1 1 2), що б!лыпа частика Рсцдоактивност1 при рост1 змшано! популяцП оактер!й рубця на С14СЗ-форм1ат1 спостер!гаеться у внутр1шньокл1тинн1й фракцИ (Рис.4). що пов'язано, очевидно, 1з наявн1стю у рубщ бактерий с!мейства Enterobacterlacae, пк1 зд1йснюють мурашинокисле брод'н-ня. Под1бн1 дан! були отриман1 при хнкубацП иетилотрофних др!жд-ж!р (Augustin J., Dercova К., 1987).

1з даних таблиц! ! видно, що найвиша рад!оактквн!сть знайде-на у фракцП нукле'1кових кислот при включение Г14СЗ-форм1ату (40 505,3 !мп/хв-мг). Б iKiui фракцП öionaniMeplB Г14С]-форм1ат вклю-чаоться менш !нтенсивно, н!ж у нукле'!нов1 кислоти. Так, радюак-TviBHiuTh у пул! ниэькомолекулярних речоьин при включенн! С14СЗ-Форм1ату с?ашвигь 67"/,3 iv.n/хв-мг, у лШди i б!лки 160,9 i

44,£r* lMU/XB'Mr, Bl *ЮВ1.ДНО.

- и -

л

[С]НД ¡тШъ)

45

JC\ <5

iOiV

45

ТЩсздй

тт-

№

А Л

Рис. 4 Рис. 5

Рис.4, Включений [14С)-форм1ату у кдхтини 2м1е?:!01 популяцП бактер1й рубця: 1- загальна; 2- вкутр1кл1тинна i 3-позакл1ткнна рад1оактивн1сть.

Рис.5. Включения [14СЗ-форм1ату у кл!тину S.bovis(jJjJ) i М. elsdenii (Q) : 1- загальна; 2- внутр!юйтинна i 3-гюза>а1тинна рад1оактивн!сть.

Таблиця 1. Включения 114СЬ форм! ату у внутр1шньокл1тинн! 61-опол1мери бактер1ального комплексу Омп/хв-мг;

М ± m; п - 5).

Б1опол]мери кл1тин Р а д i о а к.т и в н i с т ь (С14СЬформ1ат)

Пул низъкомолекулярннх речовин Високомолс-кулярн i сполуки: Л1п1ди Б1лки Нуклеинов! кислоти 677,3 ± 1,02 , 160,95 ± 0,25 44,25 ± 0.1 40505.3 t 183,4

1з даних рисунку 5 видно що рлд1оачтивн1сть в зна* но шодэю У

позагайтинних фракциях S.bovis 1 M.eisdenii. Це узгоджуетъся з дан ими J.Augustih, D.Smogricova (1083), де показано, що в др!жд-жов1 клiтини включаеться .лише 17. вуглеш i3 С^СЬформзату. Можна В1дм]тити значно вишу рад1оактивн1сть у внутр1нньокл1тшш1й фрак-uii M.eisdenii, ни у S.bovis (Рис.5). Це можна пояснити здатн'.с-тю M.eisdenii використовувати деякч органiчнi кислоти у якост: субстрата в (Russell J.B., et al., 1081). Шкаво, üb найб!льп7 pa-. д1оактивн!сть нами виявлено у ФракцП нукле! нович кислот обо у.

штам!в (Тзбл 2). 1ншими авторами (Uchida К., et al., 1982) вста новлено, що рад1оактивний вуглець включаеться у 4-те положения п!рим!дину при рост1 Saccharomyces cerevislae у присутност1 [14Ш -форм¿ату. Шсля нукле!нових кислот, найвища рад1оактивн!сть спостер!гаеться у Фракц!1 низькомолекулярних речовин (Табл 2). На жаль, намк не було энайдено л1тературних даних по включению 14С 1а одновугдецевих джерел у кл1тини рубцевих бактер!й.

Таблиця 2. Включения [14СЬформ1ату у низько- 1 високомс-лекулярн1 сполуки рубцевих штам1в S.bovis АО 24/85 i М.elsdenii LC8 (M m; п-5).

ФракцП Рад1оактивн1сть (1мп/хв-мг)

S. bovis А024/85 М. elsdenii LC8

Пуд низькомолекулярних сполук Високомолекулярн1 сполуки: Нукле1НОВ1 кислоти Бхлки Л1п1ди 3 833,0 ± 30,5 12 215,95±119,3 283,1 ± 2,1 7,86 ± 0,05 6 220,36 ± 60,4 45 536,6 ± 432,7 553,4 ± 1,9 46,85 ± 0,3

3. Актвн1сть деяких дег!дрогеназ 1 г1дратаз рубцевих бакте-р!й за дИ форьИату. Для з'ясування впливу мурашино! кислоти (у встановлен1й ра-

н1ше концентрац! 1) на процес брод1ння у рубц! нами було досл!дже-

но активн1сть окремих дег1дрогеназ цитозольно! Фракц!! зм1шано!

популяцП бактерий рубця 1 рубцевих штам1в з р1зними типами бро-д^ння. Результати наших досл1джень подан1 у таблиц! 3 1 4. Як

видно 13 представлеиих даник, мураншча кислота у концентрат 1

(ИмМ) достов!рно !нг^буе лактатдег!дрогеназну активн!сть (89,0

прот 164,0 нмоль/хв-мг), а отже, 1нг1буе процес розцеплення субстрату до молочно! кислоти в гмшанш популяцГ рубцевих бакте-

рий. Разом з тим, така к концентрат я СН?Ог суттево но впливала

на акивн!сть таких енз!!м1в, як малатдег!дрогеназа (92,4 проти 95.6 нмоль/хв-мг) ! мал!к-ензиму (28,0 проти 20,:: нмоль/хв-мг). Активност! !зоцитратлег!дрогенази ! форм!атдег!дрогенази досто-

ь!рно п!дБ!адвались при рост! рубцевих бактер1й на середовииц з

11 мМ лураашно! кислоти ! в1дпов1дко складапи 101,9 проти 82,5

кадль/хь-мг ! 8$,7 проти 72,й ньюль/хв-мг. Мураиина кислота ьис-а, очевидно, у даному' випадку Шдуктором.- Шкапе, що актив-

н1сть фумарази i акон1таэи, як1 в високоспециф1чними ензимами наш не вдэлося виявити, як при pocTi бактерий без форм!ату, так i з додаванням кого. Веявши до уваги отриманi дан! можна передбачити, шо формга? у досл1длуван1й концентрацН пригн1чуе рЮт у змша-н1й популяцП бактер1й рубця лзчтатпродукуючих видгв i не вилизае на разьиток бачтер1й 13 змшаним типом брод1ння, ючцеЕИмк про-Таблиця 3. Активность деяких дег1дрогеказ при poc?i зм1шаяо1 популяцП бактерий рубця на середовки! 1з форм1-атом (n-5; Mim).

Е Н 3 и м и (одиниц1 активности Ростове середо-вищч без мураши-tro'i кислоти ^остове середо-вище + llvM М7-рашино!' кислоти

Лактатдеггдрогеназа (нмоль НАДН/хв-мг) Малатдег iдрогеназа (нмоль НАЛН/хв-мг) Iзоцитратдег!дрогеназа (нмоль НАДФН/хв-мг) Форм1атдег1дрогеназа (кмоль НАДН/хв-мг) Мадат-фермент (нмоль НАДФН/хв-мг) Фумараза Акон1таза 16-i,0 ± Т3,2 95,6 ± 12,2 82,5 * 9,4 72,3 ± 10,4 20,2 ± 5,4 не знайдено не знайдено SS.0 ± 9,4 92,4 ± 14,1 101,9 ± 4.7 89,7 ± 5,4 28,0 ± 5,4 не знайдено не знайдено

дуктами якого е сукцикат, ацетат, етанол, СОг 1 На.

Активн1сть 5 ключових депдрогеназ чистих штам1з рубцевих бактертй - лактатпродукуючого (S. bovis А024/85) 1 лактатутил1зу-»чого (М. elsdenii LC8) представлена у таблиШ 4. 1з дач их табли-ui видно, ¡до aKTHRHicTb деяких ензим1в цих штам!в суттево pi3-няться. Внесения у ростове середовище 11 мМ форм1ату достов!рно Шдвишуе активн1сть ЛДГ у S. bovis (Табл.4), що потребув додатко-вого вивчення. Можна передбачати, що проходить обернена реакц1я е!д лактату до nip'/вату, яку каталieye також ЛДГ. Мурашина киелсг-та v досл1джуван1й концентрапП (11 мМ) виступала у якост! iHrl-6iTopa для ФДГ у S. bovis i пивишувача активншть цього енаиму у М. elsdenii (Табд.4). Цей факт може бути причиною того, що форьиат у вшцезгадан1й концентрацП найб!льш пригнгчував р!ст якраз S. bovis. Достов1рне зниження активностг акон1тгзи, малатдег!дроге-нази 1 незначче ШЛГ вкаяуе. на 1нг1бування форм1атом окремих дЬ jwhok циклу Kijffjca, що ведуть до утворення оксалоацетату. Нато-м1сть оностер1гаеться актизування oöxiдних реакщй, що катал1зу-ш'ься Фумаразою (активность яка')' достов1рно пгдвищуеться) та ма-лж-ензимом i приводить також до оксалоацетату мере? Шруват. А оксагоацетат1 у свою чергу мае змогу включатися в анабол.^.чн! реак-

Таблица 4. Активн1сть цитоплазматичних ен8им1в рубцевих штам1в 5. Ьоу1з 1 М. е1&1еп11 за дП форм1ату (М±т; п-5).

Е Н 8 И И И (одиниц1 активвост1) г. Ьоу1Б А024/85 М. е^епП 1С8

Ростове середо вще (контроль) Ростове середо вище+11мМСН£0г Ростове середо виде(контроль) Ростове середо БИще+ИыМСНгОг

Лактатдег1дрогеназа (нмоль НАДН /хв-иг б1лку) Форм1атдег1дрогеназа (нмоль НАДН/хв-мг б!лку ) Акон1таза (нмоль дас-акон1тату/хв-мг) Iзоцитратдег1дрогеназа (нмоль НАДФН/хв-мг б!лку) Фумараза (нмоль фумарату/хв-мг б1лку) Ь-малатдег1дрогеназа (нмоль НАДН/хв-мг 01лку) Мал1к-ензям (нмоль НАДФН/хв-мг С1лку) 789.3 ± 35.482.4 ± 7,5 28.0 ± 5.2 67.3 ± 15.4 647,7 ± 71.2 1433.0 ± 43,9 4.6 ± 0.5 2037,4 ± 208,0* 37,5 ± 4,2 * 12.1 ±2,0 * 66.5 ± 12.1 940,4 ± 102,0 * 1031.0 ± 94.1 л 5.7 ± 1.0 1068.0 ± 141.0 61.5 ± 12.0 4.6 ± 0.8 74.2 ± 10.5 469.9 ± 50.1 494.7 ± 50.1 17.5 1 5.8 630,9 ± 105,4* 75,9 ± 15,2 3.6 ± 0.5 81.4 ± 12.2 383.8 ± 39,2 434.2 4 42,4 24.0 ± 4.2

Прим1тка: -V - р!гниця достсв!рна.

ЦП. Форм1ат у введен1й концентрацП пригн1чуе активн!сть ЛЯГ i

утворения у М.elsdenii лактату, шр'може вказувати на 1нг!бування реакц!й шляху Ембд € • н a-Meкергофа- Парнаса. Недостов1рне змег.иення активност! решти досл!джуваних фермент1в (кр!м 1ЦДГ i мал! к-ензиму) сыдчить про незкачне itii'iivBaHHM процеогв, що ведуть до ут-ворення продуктов. як1 використовуватимуться у анабэл!чних шляхах.

D.A.Keys, L.MoAlister (1990) показали, що при рост] др!ждж!в у р i ни их умоьах вмк т та активн1сть 1ПДГ 1 МДГ духе добре корелю-ють. Однак нами не Суло знайдено тако! кореляцП Mix цими ферментами ЦТК. Активность МДГ п!д впливом додаткового (11мМ) форм!гту знитр/валась в схю* штамах.що, можливо, пов'язано 1з накопиченням у середовищ оксалоацетату i знихенням pH еередовида (Teixido F., et al., 1985). Активн1сть же ЩДГ п!д впливом форм1ату майже не змонювалась у S. bovis 1 М. elsdenii. Цьому Mir би сирияти п!дви-кений р!вень ацетату. Адже при наявност! у середавишд надм1рно! к!лькост1 ацетату проходять регулятор^ механ!зми фосфорилювання i дефосфорилювання 1ЦДГ мжробного походженкя (Nimmo H.G. , 1984).

Отриман! дан! дають право стверджувати, що форм1ат у досл!д-xyeapiü концентрацП неспециф1чно впливае на ензими м1кроог>гак!з-м1в з рглшм тиши брод!ння. А саме: у S.bovis п!д д1ею форм1ату Бодбуваетьсь п!пбува!шя окремих дыянок ш^клу Кребса i незначне зктивування обхлдних реакц1й. У М.elsdenii ж 1нг1буються д1лякки шляху ЕМП i незначно 1нг1буються процеси анабол i зму.

4. Вадглення, очистка i Ф1зшю-Х2м1чн1 характеристики НАД-залежноГ ФДГ 1з рубцевого шламу Megasphaera elsdenii LC8.

. Шдвия^ння активност! ФДГ (хоч i недостов1рне) у М.elsdenii п!д д1ею 11 мМ формiату вказуе про 1ндукування форматом у даного орган! зму ензиму з недоелiдженими властивостями. tow К1нцевим етапом наш! роботи було вид!лити, очистити i доа>пдити ф!вико-xini4Hi характеристики ФДГ 1з М.elsdenii, як ензиму. до безпосе-редньо приймае участь у перетворенн! форм!ату. Кр!м того, ФДГ е вручною моделлю для вивчення механ1зму дег!дрогеназних реакц1й I широко досл1джуеться, але не для рубцевнх бактер1й.

PaHioie зверталась увага на Gioxiмiю i генетику ФДГ анаероб-них та аеробних оргак!змп. (Алешин А. Е., и др., 1987). Було показано, up формлат для багатьох анаеробних архебактер!й i еубакте-pjü е ростподтримуючим субстратом, додатковим врнозником.

Результата очистки ФДГ la M.elsdenil LC8 поданi у таблиц! 5 1 на рисунку 6.

Таблиця 5. Етапи очистки ФДГ 1з M.elsdenil LC8 (од. -нмоль/хв; M ± m; п - 3).

Етапи Об'ем, мл Б!юк, мг Par.акт ФДГ, ОД/Ш1 Спец. ак тив.ФДГ од/мг ВИХ1Д б1лкуД Очист. (раз)

Екстракт 5,0t 0,13 12.4i 0.5 160.9Î 5,0 65,0 t 2,0 100,0 i 6, я 1,0 t

1онообм1Ниа хроматограф)я на ДЕнЕ-целюло-3i 13,0 t 0.4 9.1 i 0,4 128,6t 3,9 183.8 t 5,4 73,4 i 3,0 2,8 t 0.1

Гель-ф!дьтрац1я (сефад. Q-200) 7,8 ± 0,2 2.73 t 0.1 ' 155,01 4,6 442,5 i 15.4 22,0 i 0,8 6,8 t 0.2

Äiasia 7,0 ± 0,3 1.7 i 0,05 217,5± 6,4 810,5 t 25.6 13,7 t 0,5 12.5 t 0,5

Форм1атдег!дрогеназа елмовалась з колонки 113,75 мМ буфером, да використовувавея для зр!вновадувалня колонки (Рис.6). Б1лок було очищено в 12,5 раз з виходом 13,7%(Табл.5).Визначення приб-лиано! молекулярно! мае и нативно! ФДГ показано на рисунку 7. Б к-кодячи !з кал16рувально'1 прямо!, видно, що приблизна молекулярна маса нативно"! ФДГ склада?. 134,0t7,2 кДа. Визначення молекулярно! мяси субодикиць ФДГ la M.elsdenil LC8 показано на рисунках 8 i 9. Як видно га даних pucyi ку В, залежн!оть електрофорзтичио! рухли-вост) ряду маркерних б!лк!ь в!д log молекулярно! маси в д;апааон! 14.4 - 94.0 кДа представляв собою пряму. Величина молекулярно! мае и субодинкць ФДГ !з M.elsdenil. що була визначена на ocuobî Uis'i залехност!, складае 62,0 t 3,0 кДа. Враковуачи дан! гель-ф1 ль град! 1 ! електрофэрезу в ПААГ ДОН (Рис.9), мохя.ч вва-жати. що ФДГ is M.elsdeni i е гомодимером з молекулярной масою субодиниць 62кДа. Судячи з л!тературних даних. молекулярна маса ФДГ 1з M. elsdemi най6Ш.а наближае.ться до молекулярно! маси ФДГ 1з Pichia pastoris (Allais J.J., et al., 1983).

Встановивгаи структуру i молекулярку масу доелдауваного ен-зиму, ми поставили за мету дскшдити деяк! його фззико-х!м!чнх влзстивост!. Нами знайдено, щр температуркий оптимум для доавд-жуваного ферменту знаходиться в межах 35 - 40°С (Рис.10). Це ниж-че, Hi* для метилотрофних др!ждж!в Pichia pastoris (47°С; Allais J.J., 1983). рНоптимум (Рис.И) е близький до такого, як у метилотрофних др!ждж!в (Allais J.J., et al., 1983; Izumi V., et al.,

- б!лок (Ez8o): - о — активн1сть ФДГ (нмоль/хв-мд).

Рис. 7 Рис. 8

Рис.7. Визначення молекуляяко! маси нативно! ФДГ на сефадек-c.i G-200: 1-хпгатрипсин (25 кДа); 2-овакбутн (43 кДа); 3-сир.альбум1к бичий (G7 кДа); 4-досл1джу-ваний бглок (134 кДа); 5-альдолаза (154 кДа).

Рис.8. Визначення мс/екулярноТ маси субодиниць ФДГ : 1-фос-(¡юрилаза b (П4 гДп); 2-апьбум1н (67 кДа); 3-овальбу-MiH (43 кДа); 4-карбоанг1драза (30 кДа); 5-inri6lTop трипсину (ЯО,' кДсЧ); б- в-ляктальбум1н (14,4 кДа); 7-молекулярна .часа субодиниць ФДГ la M.eisdenii LC8.

20-

»

14--

-

1 2 3

Рис.9. ЕЛектрофорез в ПААГ очищено! ФДГ 1з M.elsdenli LC8: 1- маркери; 2- неочищений екстракт i3 M.elsdenli 1X8; 3- препарат пгсля 3-го етапу очистки.

Рис.10. Темлературна д1я на активнЮть ФДГ 5з М. elsd?niiLC8.

1989) та метаяолзасвогочих бачтер1й (Ламэин B.C., Тишков В.И., 1&в5) i знаходитьоя в мехах 7.0 - 8,0. 0триман1 даю про рН i Топт е законом1рними , оекзльки це е ф1з1олопчно-оптимальн1 умо-ви для росту орган1зму. з якого вщплявся ензим. 0дн1ею is ос-

новних характеристик механизму проходхення реакцИ е значения ко ютлнти Mixae^ica. Метолом годв!йних обернених координат (за Ла1ну1вером-Бер!:ом') було визначено Км для ФДГ 1з M.elsdenii (Рис.12). Вона для форм1ату склад.яе 23,5 мМ 1 для НАД+ - 0,21 Ш. Ц1 величини К,л наближаються до Ч,п даних сподук метилотрофних

Рис.11. Дхя pH на активн!сть ФДГ 1з M.elsdenii LC8.

Рис.12. Визначення Кш для НАД+ 1 форм!ату в систем! обернених координат Лайну1вера-Берка. др1ждж!в (Allais J.J., et al.. 1983; Устинникова T.B., И др.,

1986). Представлен! результати юнетичних досл1джень дозволягстъ вгохати, що форм!ат волоц!?. виеокою спор1днен!стю до одерханого ензиму. Отриман i величини е характерами для односубстратних де-гирогеназних реакций.

Таким чином встчновлено, що при наярност! у ростовому сере-доьицЦ •topMiaxy у Ф1з1олог1чно-оптималь!пй концентрац1 i, рубцевим шламом M.elsdenii 1.08 синтезувться НАД-залежна форм1атде1^дроге-наг-'а ¡з ф!зико-;ам':чними властивостями близькими до таких для ок-ремих НАД-эадежних ФДГ i3 метилотрсфних др1лдж1в i метанолокислю-ючих бактер1й.

Еисновкм

1. ИзшлоНчнкн оптимум для форы ¡ату у зм1шан1й популяцП öaKTepin i у чистих штам!в (S.bovis А024/85 i M.elsdenii LC8) зиачодяться в межах 1-9 мМ.

2. ,М\,йши«а кислота, починаючи з концентрац! 1 22 мМ, достоверно inriOve пронеси бро/пння у зм1шан!й популяцП бактер1й рубля г:, v пубиерих «vraMiB S.oovis А024/35 i M.elsoenii LC8, tojü як иУ>рмаиьд*г1д у дозл1джуваних концентратах повн1стю блокуе мега-Сол\ь.\\ рубцйвих 6aKTepin.

3. 69,ОХ [14С]-форм1ату в1д bcIgI к!дькост1, цо вносилась у середовице, вкдючаеться в клхтини бактер!й вы1тачо1 популяц!I, аде т!лъки ИХ - у югётини S. bovis А024/85 i 33t у кл!тини M.elsdenli LC8.

4. Лише 31,41 С14С]-формальдег1ду в!д вс!е! к!лькост!, щр вносилась у середовище, вклшаеться в бактер!йн! кл1тини зм1тано! популяцП бактер!й рубца.

5. la Bciel рад1оактивност!, щр вклшклась в кл!тини, най-6iJD>me [14СЗ-фори1ату (74,7-98,ОХ) знайдено в нукле!нових гасло-тах досл!джуваних м1кроб1аяьних об'ектгв.

8. Перевакаоча к!льк1сть -фориадьдег!ду, щр вюпочився в кл!тини, попадаб в нукле!нов1 кислоти зм!шаяо! популяцП рубцевих бактер1й i M.elsdenli - 89,0 i 75,ОХ, в1дпов1дно, аде у пул ниэь-коыолекулярних сполук S.bovis - 50,5Х.

7. 1нпбуюча д1я форм1ату ва ыетабол1гы зм1шано! популяцП рубцевих 6актер1й, а таноа р1ввнь аи!акоутворення анижуеться в присугноот1 цеол!ту.

8. Мурашина кислота у концентрацП И мМ проявляв неспеци-фхчний вплив на активн!сть окремих дег1дрогенаэ i г!дратаз сумар-но1 фракц11 i чистих итам!в рубцевих бактер!й з р1эним типом бро-д!шш: лактатпродукуочих (S.bovis А024/85) i лактатутилiэугчих (M.elsdenii LC8).

9. Видiлена i очищена ФДГ is M.elsdenii LC8 е гомодимером 1з молекулярное иасос субодиниць 62 кДа, Km цього ензиму для форм1а-ту склад as 23,5 Ш i для НАД* - 0,21 шМ при оптимум! pH 7,0 - 8,0 та температурному оптю<ум! - 35 - 40°С,

Сгаоок poÖiT,опубликование по тон! дисертацй'

1. Калачимс ГЛ. та !н. (у сп!вавторств! Войтюк O.A.). Вико-ристаякя цеол!т!в при вирощуванн! 1 в1дгод1вл1 молодняка велико! рогато! худоби//Ме'.одкчн! рекомендацП а науково-практична обг-рунтуваиюш.-Лъв1в-1991, 29с.

2. Калачник Г.1., Войтек O.A., Савка О. Г. Метабол ism форига-ту за д11 лактатпродукуючих 1 лактатутил!зуючих бактер!й руб-ця//Укр.б!ох1м.иурн.-1994.-65, N4.-с. 43-51.

3. Калачник Г.И., Войтюк A.A., Савка О.Г. и др. Формиат-фор-мальдегидная ингибиция метаболизма бактерий рубца и включение [14СЗ-формиата во внутриклеточные биополимеры//Докдады Россельхо-э£кадемии.-1993.-Ш.-с. 15.

4. Калачюок Г.И., Войтюк A.A., Савка О.Г. и др. Формальдегидам таболический оптимум и вклвчение С14СЗ-формальдегида в руб-цовые внутрибактериальные биополимера/Доклады Россельхозакаде-

mm.-1934.-N2.-с. 31-23.

5. Войтюк О.А., КалачншГ.1. АктивШстъ форм!атдег1драгена-зи 1 лактатдеПдропнази рубцевих бактер!й эа р1аних умов дез1н-тегращ I//Наук.-тех. бюл. УЩП Ф1Б с-г тварин.-1991.-13(2).-с. 18.

6. Войтюк О.А., Калачник ГЛ. Динам1ка росту бактер1й i концентрата б1лка в рубцев!м середовищ! п1д впливом форм1ату//На-ук.-тех.бюл. УНД1 Ф!Б с-г твария.-1992.-14(2).-С. 35.

7. Войтюк О.А., Калдчшок ГЛ. Форы1атна д!я на метабол1чну здатн1сть рубцевнх бактер1й//У1 Украшсъкий б1ох!м1<ший з'1зд. Тези допов1дей.- Кии: УСТА, 1992.-е. 78

8. Войтюк О.А., Калачнюк Г. Г. Форм1ат-формадьдег1дна кодю$1-кац1я мзтабод1эму рубцев:к бглтер i й\\ Всеукра! не*ка конф. а Ф1а1-ол. i 6ioxiM. твзр:п1. Теся допов!дей.- Дьв1в (24-2бо1чия), 1995.-е. 30.

9. Войтюк О.А., Калачгаок ГЛ. Токсична д!я форы!ату i фор-мальдеПду ка метабал1зм бзктер1Й рубця//Республ1канська наук. -прак.конф. "Проблеми п!двкщення продуктивност! твирик та ефек-тивност1 IX д1кування".~ Дшпропетровськ (19-21кв1тня), 1994.-0.

10. Войтюк О.А., Калачгаок Г.I. Д1я р1зних доз форм1ату на pier рубцевих бактер1к\\Науково- виробнича конф. "Наукове забезпв-ченая агропрсмислоЕого комплексу зах1дного региону Укра\ни в умо-вах переходу до ринкових в!дкосин".- Льв1в-0бросяно.-1993,

с. 130-131.

11. Войтюк О.А., Кадачнюк ГЛ, Б1ох1м1Чна оценка деэгнтегра-Uil рубцевих м!кроб!в//Науково-виробничз кокф."Нзукове забезпз-чення агропроьгаслового комплексу зах1дного регЮну Укра1ни в уыо-вах переходу до ринковкх згдкосин",- Льв1з-0брошино.-1в93, с.144.

Voltyuk О.А.

Formate transformation and his influence on the metabolic processes of rumen bacteria.

Doctoral thesis on speciallisation 03.00.0-1-biochemistry'.

Institute of animal physiology and biochemistry of UAAS.

L'viv, 1995.

Summary

It has beeu shown that fonnate does not essentialy influence on the metabolism mixed population of rumen bacteria and individua] strains in the concentrations lower 9rr.M. Increase of the concentration to 22 and 44trM resulted in reliably activated inhibition of metc\bolio processes in the bacterial cell. Of the total amount cf 14C-fonnate Included in the ce.U, the highest

radii}-activity lias find in the fraction nucleic acids of the all Investigated microbial objects. The amonia form&tlon process and formate inhibition of ruminai bacteria Is decreases In presence of 2eolite. Formate non specifically influences on the dehydrogenase of the mixed ruznen bacteria population, S.bovis and M.elsdenil strains at the 11 Ш formate concentrâtionvtas. KAD-depended FDH isolate and purifícate from M.elsdenil has molecular weight 134 kDa (62x2). Km of enzyme is 23,5 irM for formate and 0,21 Ш for NAD+.

Войтт Александр Аркадьевич

Превратила формиата и его влияние на метаболические процессы в рубце.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических каук по специальности 03.00.04-биохишя, Институт физиологии и биохимик ккаогных УААН. Львов, 1895.

Резюме

Показано, что формиат в концентрации ниже 9мМ существенно не влияет ка метаболизм смешанной популяции бактерий рубца и отдельных птаазгоь. Увеличение его концентрации до 22 и 44 Ш достоверно усиливает Ркгибираванке метаболических процессов в бактериальной клыке. Из всего вклачквшегося в клетку С14С]-формиата, наиболь-шаз радиоактивность была найдена во фракции нуклеиновых кислот всех исследуемых цикробиальных объектов. В присутствии цеолита понижается процесс амкакообразованкя, а также кнгибирование метаболизма бактерий форииатоц.ООнарукеко, что формиат е концентрации 11мМ не специфически влияет на дегидрогеназы сметаной популяции Рубцовых бактерш, а также штаммов S.bovis и M.elsdenii. Выделенная иа M.elsdenii к очищенная НАД-эазискмая ФДГ кыеет молекулярный вес 134КДа (62x2). Константа Шхазлиса ФДГ для формата составляет 23,5кМ, а для НАД* - 0.21Ш.

K£Q40Bi слова: БактерП рубця, метабол1зм, йорм1ат, С14СЗ-форшат, дег1дрогеяази, форм1атдеПдрогецаза, S.bovis, M.elsdenil.

Зам.» 1*38. Шдписано до друку 14.07.1995 Формат 60x84 1/16.Ум.друк.арк.1,3. Тираж 120 пр.

Ротапринт JîbBiBCbKQÏ Наумова! б!бл1отеки iu. В.Стефаника HAH Укра1ни. JbBíB, вул.Лермонтова, 15