Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ МЕТАНИСПОЛЬЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ МЕТАНИСПОЛЬЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ОСР

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ИМ. Д. К. ЗАВОЛОТШГО ,

На правах рукописи

СОКОЛОВ Иван Георгиевич

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ ШАНИСГШЬЗУШХ БАКТЕРИЙ (03.00.07 -микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Киев - 1990

Работа выполнена в отделе биологии газоокислягащ микроорга-, низмов Института микробиологии и вирусологии им. Д. К Заболотного

АН УССР.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, заслуженный деятель науки УССР, профессор % Я. ЗАХАРОВА

доктор биологических наук С. С. БЕЛЯЕВ

доктор биологических наук Ю. В. ЦЫГАНКОВ

Ведущая органивация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР. г.Пуцино

Зашита состоится " " ■ • '__ 1990 г,

в 9 час 30 мин на заседании специализированного совета Д 016.06.01 при Институте микробиологии и вирусологии им Д. К. Заболотиого АН УССР по адресу:. 252627, Киев, ул. Заболотаого, 154.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д. К Заболотного АН УССР.

Автореферат разослан " " _■ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук э-А- Коваленко

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Me такие польз у щие бактерии - группа метилотрофных микроорганизмов, способных ассимилировать только метан (в ряде случаев метанол). Метаболизм метана, как и других одноуглеродных соединений, шсличает ряд уникальных биохимических процессов, которые определяют б потех но логический потенциал мети-лотрофов. Их предполагают использовать в качестве продуцентов белка и других веорств (полисахаридов, аминокислот, витаминов) на основе дешевого органического сырья - метана или метанола. Цатилотрофы являются источноком ряда уникальных ферментов, в связи с чем возмошю применение их каталитической активности для переработки трудноатакуемых субстратов.

Протекающие в метках метаниспользукщих бактерий реакции окисления метана до углекислоты и вовлечения углерода (на уровне формальдегида) в конструктивный метаболизм изучены в настоящее время достаточно полно. В то же время, данные об энергетическом метаболизме этих бактерий практически отсутствуют.

Механизмы генерации энергии у метаниспользумцих бактерий своеобразны и существенно отличаются от таковых, реализуемых при гетеротрофном типе питания. Трансформация энергии метана является тем звеном их метаболизма, которое определяет направленность остальных его этапов. Поэтому изучение энергетического метаболизма метаниспользущих бактерий актуально как в теоретическом, так и в прикладном аспектах.

Цель и задачи _ исследования. Цель диссертационной работы -изучить пути трансформации энергии метана у метаниспольэующих бактерий, выяснить роль метанмонооксигеназы в энергетическом метаболизме и определить этапы окисления метана, сопряженные с генерацией энергии.

Список сокращений: ГАОР - г пдроке илами нокс идо ре дуктаз а, НДГ -метанолдегидрогеназа, МНО - метанмоноокеигеназа, мШО - мембранная ШЮ, НАДСФ) - никотинамидадениндинуклеотид( фосфат), ТО -

терминальная оксидаза, Т$4 - тетрафенилфосфэниЯ, ФдДГ - |ор-мальдегкддегядрогеназа, ХтДГ - формиатдегидрогенаеа, ФП - Фла-вопротеид, ЭДТА - этилендиашнтет(>аацетат, ГССР - карбонилциа-нид - трифторметоке ифе н идг идраэ о н, С1ССР - карбонилцианид-w-хлорфенилгвдраэон, t HI - восстановительные эквиваленты, PQQ -пирролохинолинхинон, лрН и ¿.f - разница рН и электрического заряда, соответственно, относительно цитоплазматической мембраны.

ЦЕНТРАЛЬЙАЯ iЛУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА сэаьско^оз академии и !. К. Л.. Tut,ng^iesi _

- 2 -

В работе решались следующие задачи:

- определить восстановители, которые используются клетками в качестве доноров электронов для монооксигенирования метана;

- научить сопряжение этапов окисления метана с генерированием энергии в Форме трансмембранного градиента протонов;

- определить роль метанмонооксигеназы в качестве теминально-го акцептора основной части электронов метана;

- построить стехиометрические модели метаболизма и на их основе количественно оценить возможность функционирования постулируемых механизмов генерации энергии у метаниспользукдах бактерий.

Научная новизна. На защиту выносятся следующие новые положения.

При мэнооксигенировании субстрата в клетках метаниспользующих бактерий электроны могут поступать не только от НАДН (источник - реакции дегидрирования формальдегида, и формиата), но и от доноров*е более полжительным редокс-потенциалом - простетических групп метанолдегидрогеназы и гидроксиламинокси доредутстазы.

Генерация энергии в процессе окисления метана осуществляется за счет переноса электронов на кислород при функционировании не только цит о хромо кс и дазы, но и мембранной метанмонооксигеназы. Энергя в форме трансмембранного протонного градиента генерируется при переносе электронов через мембранные переносчики к мШЭ от НАДН либо от простетической группы метанолдегидрогенаэы. В последнем случае градиент рН создается за счет того, что протоны, освобождающиеся при окислении метанола, остается в перилдавне клеток, где локализована метанолдегидрогеназа, а электроны транспортируются к цитоплазматической стороне мембраны, где акцептируются кислородом с потреблением протонов цитоплазмы при монооксигенировании метана.

При фунционировании в клетках растворимой метанмонооксигеназы, которая прямо сопряжена с окислением НАДН, трансмембранный градиент протонов создается при переносе электронов от периплаз-матической метанолдегидрогеназы к цитохромоксидаэе.

Окисление метана клетками метаниспользуших бактерий зависит от разницы потенциалов на цитоплазматической мембране, что предполагает возможность активного транспорта метана при его поступлении в клетку.

При росте метаниепользующих бактерий на метаноле часть этого

субстрата окисляется метанмонооксигеназой, причем у некоторых видов монооксигенирование метанолз является основным стоком электронов на кислород. Если монооксигенирование метанола не протекает (например, в присутствии ингнбигора метанмонооксигена-вы - ацетилена), то рост воэ^.жен лишь тех видов, у которщ функционируют альтернативные экергогенерирующие электронтранс-портные системы.

Совместная ассимиляция метаниспользукмцими бактериями метанола и субстратного аналога метана (этана или СО) реализуется благодаря сопряжению реакций дегидрирования метанола с монооксиге-нированием второго субстрата. Данное явление представляет собой вариант кометаболизма, результатом которого является более интенсивный и эффективный рост клеток, что позволило определить его как синтабодиэм.

Анализ результатов экспериментальных и теоретических исследований позволил сформулировать концепцию, которая отражает основную особенность энергетического метаболизма метаниспользующих бактерий: метанмонооксигеназа участвует в акцептировании большей части электронов ассимилируемого субстрата, причем в случае функционирования мЫШ этот процесс сопряжен о генерацией энергии в форме трансмембранного протонного градиента. Данная концепция позволяет объяснить ряд свойств метаниспользующих бактерий, которыми отличается эта группа микроорганизмов не только от гетеротрофных, Но и метилотрофных форм, не использующих метан. Так, отсутствие способности всех изучавшихся нами метаниспользующих бактерий использовать в качестве источников углерода и энергии многоуглеродные субстраты, а также ингибирование ацетиленом (блокирует ЫНО) роста некоторых штаммов на метаноле обусловлено тем, что в этих условиях не функционирует метанмонооксигеназа.

Практическая ценность. Результаты работы позволят подойти к изучению принципов регуляции энергетического метаболизма метаниспользующих бактерий и его генетического контроля. Последний вопрос представляет большой интерес, поскольку метанмонооксигеназа является весьма перспективным ферментом для технологических целей (способна осуществлять реакции окисления и эпоксидирования трудноатакуемщ субстратов). Их реализация требует разработки способов клонирования метанмонооксигеназы и получения ее препарата.в больших масштабах.

Установленные вакономерности могут найти применение при

создании и отладке технологии культивирования метаниспользуюшх бактерий на природном газе. Применение принципа сиитаболизма позволяет избежать ингибирования роста при высоком содержании этана в природном газе, вызываемом соокислением метана и этана. Контроль процесса культивирования ацидотолерантных штаммов должен осуществляться с. учетом того факта, что окисление метана обеспечивает поддержание разницы рН между цитоплазмой и кислой средой. Поэтому в отсутствии метана или кислорода рН культураль-ной жидкости повышается за счет поступления протонов в клетки.

Представленные модели для расчета эффективности конструктивного и энергетического метаболизма построены в общем виде, в связи с чем они применимы для прогнозирования механизмов генерации энергии у любых аэробных хемоорганотрофных организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме "Образование и использование газов микроорганизмами" (ФРГ, Геттинген, 1975);,VI Международном коллоквиуме ло почвенной зоологии "Почвенные организме как компоненты экосистем" (Швеция, Стокгольм, 1977); Республиканских конференциях молодых исследователей (Киев, 1977, 1981, 1986); III, IV к V Украинском биохимическом съезде (Донецк, 1977, Киев, 1982, Йвано-йранковск, 1987); VII Международном симпозиуме по непрерывному культивированию микроорганизмов (ЧСФР, Прага, 1978); III Европейском конгрессе по биотехнологии (ФРГ, Мюнхен, 1984); Всесоюзном симпозиуме 'Тегуляция биохимических процессов у микроорганизмов" (Пушно, 1978); Всесоюзном симпозиуме "Микробиологические сообщества и их функционирование в почве" (Чернигов, 1979); V, Vi и VII съезде Украинского биохимического общества (Днепропетровск, 1980, Донецк, 1984, Черновцы, 1989); VI и VII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985); V и VI Международном симпозиуме по росту микроорганизмов на С1-соединениях (Нидерланды, Гронинген, 1986, ФРГ, Геттинген, 1989); II и III Симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (ГДР, Лейпциг, 1980, ЧСФР, Братислава, 1983);. III и VI Всесоюзной конференции "Теория и практика управляемого культивирования" (Киев, 198Í, Пущино, 1986); Всесоюзном совещании "Использование, проектирование и строительство систем сооружений метанового сбраживанйя навоза (Таллин, 1982); Международном симпозиуме ФЕМО "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Пушно, 1983); Всесоюзной конференции "Термо-

фильные микроорганизмы в природе и практшсе народного хозяйства" (Нэсква, 1933); Всесоюзной кс-'еренши "Новые направления в биотехнологии (Пущино, 1984); XVII Конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 1986); Всесоюзной конференции "Биохимия ti физиология метилотрофов" (Пущино, 1986); Международном симпозиуме в честь 100-летия открытия литоавтотрофин С, Е Виноградовы (ФРГ, Геттинген, 1987): Международном симпозиуме Интербиотех'89 (ЧСФР, Братислава, 1989); Международном кол-_ локвиуме по биохимии метмлотрофных бацилл (Нидерланды, Гроиин-ген, 1989); На общем соорании отделения биохимии, физиологии и теоретической медицшы АН УССР (Киев, 19Ö0).

Публикация результатов, исследований. Основные результаты исследований отрадны в 70 научных работах и двух авторских свидетельствах на изобретения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа наложена на 375 страницах (учетный текст - 225 страниц), включая 26 схем, 41 таблицу, 37 рисунков и библиографичекий указатель из 354 источников литературы (из них 297 на иностранных языках).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. МЕТАБОЛИЗМ МЕТАНА У МИКРООРГАНИЗМОВ

В главе изложены литературные сведения об энзимологии окисления метана, регуляции метаболизма у метилотрофов, сопоставлены механизмы окисления метана и аммиака у метаниспользущщ и нитрифицирующих бактерий.

Глава 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили культуры облигатных метание-пользующих бактерий, выделенные в отделе биологии газоокиелнювци микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотпого АН УССР В. А. Романовской, а также культуры, предоставленные Р. Виттенбери (Великобритания) и КХ Хайером (ГДР).

Основная часть исследований проведена с культурами Methylo-monas rubra i5m, Methyloinonas alba Ш8, Methjiococcus tharmoptü-iüs Uta, Methyl ococcus capsulotus 9H, Methyl ostnus trieftaspori-Ш1 ОШЬ, которые реализуют различные пути ассимиляция метала.

Методы культивирования. Для выращивания бактерий иопользона-

лн жидкую или агаризованную минеральную среду СМалашенко с со-авт., 19751. В качестве углеродного субстрата использовали метан. природный газ или метанол. Культивирование осуществляли в периодических условиях (в колбах на качалке), либо в режиме хе-мостата в ферментах типа АНКУМ-2 и АК-10 с лимитом по источнику азота ГГСинчук с соавт., 19873.

Концентрацию клеток бактерий в суспензии определяли нефело-метрически с последующим пересчетом на сухую массу клеток.

Бактереологическую частоту выраюеваемых культур контролировали методом посева на агаризованные среды с другими источниками углерода (г люкозо-картофельный и мясо-пептонный агар).

Определение концентрации газообразных , И водорастворимых субстратов и низкомолекулярных.продукутов метаболизма. Определение концентрации компонентов газовой фазы осуществляли газохро-матографичеки на хроматографе ЛХМ-8МД, используя катарометр. При определении концентрации растворенных в родной фазе газообразных углеводородов, нкзкомолекулярнх спиртов и альдегидов использовали ионизационно-пламенный детектор [Малашенко с соавт. ,1978].

Формальдегид определяли по реакции с ацетилацетоном [Hash, 1953]. Ацетат определяли при помощи ацетаткинаэы [ Криштаб и Соколов, 1985], формиат - при помощи формиатдегидрогенаэы [Соколов, 1988]. Концентрацию аммония определяли при помощи реактива Несслера, нитрита - при помощи реактива Грисса [Баславская и Трубецкова, 1964], гидроксиламина - по реакции с 8-оксихинолином tDalton, 1977].

Скорость окисления субстратов определяли по изменению концентрации молекулярного " кислорода полярографически при помощи электрода закрытого типа, либо по скорости поглощения соответствующего субстрата СМалашенко с соавт. ,1937].

Трансдотацию протонов при окислении субстратов клетками определяли по изменению pH среды после импульса кислорода (в виде раствора, насыщенного воздухом) в анаэробную суспензию клеток в растворе, содержащем 0.15М KCl, 0,15М КСЮ4> карбоангндразу и

окисляемой субстрат. Шкалу pH-метра калибровали путем внесения известного количества HCl [Соколов, 1936]. Отношение количества гранслоцированных протонов к количеству потребленного при этом

кислорода (->Н+/0) использовали как меру сопряженности окислительного процесса с аккумулированием энергии.

Получение и фракционирование бесклеточных ?катрактов. Клет-

ки, отмытые и ресуспендированные в 0.05М фосфатном буфере pH 7,0. разрушали ультрозвуком (22 кГц) на аппарате УЗДК-1. Полученный дэзинтеграт центрифугировали при 20000 g (4°С, 20 мин).

Надосадочную жидкость использ^;али в качестве грубого бесклеточного SKCTpaia. Для получения фракций растворимых белков и субклеточных частиц грубый экстракт подвергали центрифугированию при 144000 g.

Выделение и очистка МДГ, ГАОР и цктохромных компонентов. Ис-; пользовали процедуру, описанную раннее, которая включает фракционирование растворимых белков бесклеточного экстракта при помощи ионообменной хроматографии (ДЗА.Э-целлюлоза, КМ-сефадекс 0-50), гельфильтрацию на сефадекеах 6-150 и G-200, препаративный диск-электрофорез в ПААГ [Соколов с соавт., 1980; 19811, Оценку гомогенности полученных препаратов проводили при помощи диск-электрофоре за в ПААГ [Davts, 1964). Спектры поглощения записывали на спектрофотометре Specord UV VIS.

Знзиматические анализы. Активности ЫДГ и ГАОР определяли по-лярографически по метанол- шш гидроксиламинзависимому поглощению кислорода в присутствии феназинметосульфата, гидроксила-ыин: цитохром с оксидоредуктазы - спектрофотометрически по скорости восстановления цитохрома с , цитохрошксидазы - по скорости окисления предварительно восстановленного дитионигом ци-тохрош с (Соколов с соавт., 1980). Активность гекеулозофосфат-еинтавы в грубом бееклеточном экстракте определяли по зависимому от рибозо-6-фосфата потреблению формальдегида.

' Концентрацию белка а клетках и бесклеточных препаратах измеряли по Лоури [Lowry et al. , 19511.

Гидрофобные ингибиторы перед внесением в реакционные смеси растворяли в диметилформамиде.

Глава 3. ИСТОЧНИКИ ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ЭКВИВАЛЕНТОВ ДЛЯ . МЕТАНШНООКСИГЕКАЗЫ У МЕТАНИСЙОЛЬЗУЩКХ БАКТЕРИИ

Газообразные гомологи метана не ассимилируются метаннсполь-вующкми бактериями как единственные источники углерода и энергии. однако могут окисляться клетками в условиях кометаболизма (при наличии метана либо неростовых энергодавдих субстратов) благодаря неспецифичности ферментных систем - ММО и, в случае атана, КЦГ сиалаиенко с соавт. ,1976,19873.

В качестве источников восстановителя) для Ш) могут исполь-

зсваться продукты окисления метана (метанол, формальдегид, формиат) и этана (этанол, ацетальдегид). То, какая форма восстановителя используется при монооксигекировании субстрата в клетке, зависит от свойств ММО. Мембранная ММО может принимать электроны как от НДЯИ, так и от восстановителей с более низким редокс-по-тепциалом (например, от сукцината (Cornish et al., 1985]), растворимая ММО - только от НАДН. Дегидрирование спиртов, катализируемое МДГ. не обеспечивает клетку НАДН, поскольку электроны от простетической группы МДГ акцептируются цитохромными компонентами [ Топ^е et at., i975; Соколов с соавт., 19813. .Доказательства способности МДГ служить донором электронов для ММО, полученные in vitro CTonge et al., 1975], воспроизведены не были COalton а. Leak, 19851.

Вопрос о том, на каком уровне ШО получает электроны - НАДН или простетической группы МДГ - имеет принципиальное вначение, т.к. эффективность синтеза биомассы из метана во втором случае вдвое выше. В связи с этим изучена способность клеток метанис-польаующих бактерий использовать различные источники восстановительных эквивалентов (формиат, формальдегид, спирты, гидроксила-мин) в качестве косубстратов для обеспечения окисления субстратных аналогов метана.

3.1. Влияние формиата и метанола на кинетику окисления метана и его субстратных аналогов клетками метаннспользукшх бактерий. Если без косубстратов окисление метана в присутствии этана происходило с низкой скоростью, то при введении формата или метанола процесс окисления метана протекал достаточно активно.

Характер зависимости скорости потребления метана от «го концентрации при окислении смеси метана и этана клетками определялся вводимым косубстратом, В присутствии формиата (как и без него) данная зависимость в двойных обратных координатах была нелинейной, а в присутствии метанола она носила линейный характер (рис. 1). Очевидно, при низких концентрациях метана формиат не в полной мере обеспечивал восстановителем реакцию монсоксиге-нирования этана, в то время как метанол практически полностью снимал недостаток восстановителя,

3. Z. Сопряжение окисления субстратов метзнолдегидрогеназы (этанола и пропанола) с монооксигеназной реакцией. Изучена динамика потребления этана и накопления продуктов его окисления (этанол, адатальдегид, ацетат) интактныш кле"псаш мчтанкспользуюких бак-

Рис. I. Влияние формиата и метанола на зависимость скорости окисления клетками Кс. ttwrmophilus ilia смеси метан этан от концентрации метана, выраженную в двойных обратных координатах.

: терий Ит. rubra 15ш в присутствии этанола или пропало да, .окисление которых осуществляется только ИГ и не генерирует НАД!1 Для сравнения изучено влияние формиата и метанола. Этан без косубстратов окислялся с нивкой затухающей скоростью, Продукты окисления этана при этом не были обнаружены.

Окисление этана в присутствии формиата происходит значительно активнее. Процесс сопровождается накоплением продуктов окисления этана (этанола, ацетальдегида, ацетата) и формиата (углекислота) (рис. г, А).

В присутствии этанола окисление этана также происходило активно (по сравнению с окислением этана без кссубстрата). ша субстрата окислялись до ацетальдегида. После исчерпания этанола, введенного в реакционную смесь, накопившийся ацетальдегид окислялся до ацетата.

Установлено, что клетки Ия. rubra 13ш активно окисляют этан в присутствии пропанола (рис. 2, Б), В данном случае восстановительные эквиваленты для монооксигенирования метана могут поступать только от метанолдегидрогеназы, т. к. продукт дегидрирования зтим ферментом пропанола далее не окисляется и накапливается в инкубационной среде совместно с продуктами окисления этана -этанолом, ацеталъдегидом и ацетатом.

Скорости окисления этана (как без косубстрата, так и в присутствии различных доноров знерГШ) покоящимися клетками однпго

А

Б

Этанол, ацеталъдегид, ацетат. пропанол, пропаналь, углекислота.

Этак, ммоль/л

7.

20

им е

4

16

12

О

1

2 0 1 Время, ч'

, 2

Fhc. 2. Соокисление смесей этан + формиат (А) и этан + itpo-панол (Б) клетками Mm. rubra 15« и накопление окисленных продуктов в среде. 1 - этан, 2 - этанол, 3 - ацетальдегид, 4 - ацетат, 5 - углекислота, 6 - пропанол, 7 - пропаналь.

и того же штамма метан ис польз у ющх бактерий сильно варьируют (в экспериментах были использованы Mm. rubra 15ш, Не. themophilus lim и Ms. trichosporium ОВЗЬ). Как правило, метанол и формиат наиболее активно стимулировали окисление этана. Стимулирующее действие этанола и пропанола на окисление этана клетками было практически одинаковым и несколько меньше действия метанола.

Полученные данные позволяют в определенной степени судить о путях переноса электронов к MHO в клетках. Способность как фор-миата, так и спиртов (этанола и пропанола) генерировать восстановительные эквиваленты, используемые в шяоокекгеназкой реакции, согласуется с возможностью Функционирования в клетках метаниспользующих бактерий связанной с мембранами ВД), акцептирующей электроны как от КАДН, так и от МДГ. 3.3. Сопряжение,, окисления гидроксиламина с монооксигёназной реакцией у Wetftytococciis thermotfii tus iiln. Meтанис tic лъзуюше бактерии способна осуществлять нитрификацию аммония [романовская с соавт., 1977; Соколов соавт., 1977]:

Окисление аммиака осуществляется путем монооксигенирования благодаря неспецифичности метанмонооксигенаэы [Малашенгсо с со-чвт., 19781. Продукт этой реакции - гидрокеиламин - окисляется

NHg —> МН20Н —> HN02

- It

клетками метаниспольвувдих бактерия {за исключением видов рода Hethytomoms) до нитрита. У шташпв Не. ttwraophilus этот процесс катализирует ГАОР [Соколов с соавт., 1980, 19811.

Энергия, особовдаюшаяся при окислении гидроксиламина, используется для восстановления НАД за счет обратного энергозависимого траннспорта электронов, либо для синтева АГФ СМэлдаенко а соавт., 19791, С точки врения хемиосмотической теории, данные процессы должны быть опосредованы протондвижущей силой, создаваемой при окислении гидроксиламина [Hooper a. DiSpirito, 19851.

В свяви с этим изучена генерация трансмембранного градиента протонов при окислении гидроксиламина, проведен анализ возможной пространственной организации этого процесса, и возможность его сопряжения с монооксиг е ь и рование м субстрата ШЭ.

Цепь транспорта электронов от гидроксиламина у Не. ttwrmophi-Itts Hin. Раннее было показано, что у Не. thermophilus Hin электроны гидроксиламина переносятся на кислород через ГАОР (ге-мовые группы Ь- и с-типа), цитохром (или цитохром есо) и цитохром aag [Соколов с соавт., i960; 19811:

Гидроксиламйкокеидоредуктаза была выделена из клеток Не. thermophtltis litn и очищена до состояния, близкого к гомогенному [Соколов с соавт., 1981]. Степень очистки (в 25 раз) свидетельствует о том, что содержание данного бедка в клетках достаточно высоко - около 4 X от растворимых белков.

■ Локализация гидроксиламшоксидоредуктазы в клетках Не. thermofhitus Hin. В процессе ваморакивания-оттаивания суспензии клеток Не. tIwrmoptdlns Hin большая часть активности ГАОР обнаруживается во внеклеточной жидкости, в то время, как активность цитоплазматического фермента гексулоэо!осфатсинтазы в ней не обнаруживалась. Это свидетельствует о том, что у Не. tfiermophilus Hin ГАОР является периплазматическим белком, который солибили-вируетея при нарушении наружной мембраны в результате замораживания-оттаивания.

Генерация трансмембранного протонного градиента при окислении гидроксиламина у Не. tliermopfiilus tltn. Закис ленке инкубационной среды в ответ на ведение кислорода в анаэробную суспензии

■> ГАОР —> Цитохром Cqq —> Цитохром aa-j —>

(гемы Ь. с) Цитохром с^-.

-554

гололэеших клеток Мс. (Иегию/М I ид 111п происходило в присутствии гидроксиламина, что свидетельствует о генерации трансмембранного протонного градиента. Без гидроксиламина еакисление среда не наблюдалось. При проведении эксперимента с неголодавшимя клетками эндогенные субстраты, окисляясь, были способны генерировать дрН. Разобщитель С1ССР разрушал протонный градиент за счет быстрого поступления протонов в клетки. В том случае, когда субстратом служил гидроксиламин, зачисление среды происходило и в присутствии С1ССР, однако оно было не столь интенсивным, как без С1ССР. По-видимому, эакисление в присутствии С1ССР происходит за счет продукта окисления гидроксиламина - азотистой кислоты, но не за счет транслокации протонов.

Значение ->Н+/0, полученное при окислении гидроксиламина (с вычетом нечувствительного к С1ССР закисления) составляет 0,6 (табл. 1), что предполагает функционирование у Не. {ЬегторМ.Iиз Шп не более одного нротонтранслоцируадего сегмента электротранспорт ной цепи в данном случае.

Таблиид 1

Отношения при окислении гидроксиламина клетками

Мс. 1ЬегторМ,1из

Субстрат Концентрация, мм ->Й*7о, г-шнов н\ тракслоцированных при потреблении г-атома кислорода

Бза разобадаеля В присутствии С1ССР (5 мкМ)

Эндогенные Эндогенные* ынвои* 0,6 3,1 0 0,2 0 1.4 0.8

Примечание. *- эксперименты проведены с клетками, подвергнутыми голоданию в течении 24 ч.

Гидроксиламин как донор электронов для метанмонооксигевазы. Для демонстрации сопряжения окисления гидроксиламина с Функционированием ММЭ был использован этан, который окисляется штаммами Мс. (ЬегиюрМ I ия с очень низкой скоростью за счет энергии эндогенных субстратов, либо не окисляется вообще при их отсутс-вии. Гидроксиламин вносили небольшими порциями в связи с его токсичностью.

Покоящиеся клетки Ис. (1гегпорЫ I ия Н1п окисляли этан в присутствии гидроксиламина. Этот процесс сопровождался накоплением с ост ве тс г в ущих продуктов окисления этана (зтанола) и гидрокси-

ламина (нитрита). Без гидроксиламина в аналогичных условиях этан не окислялся.

Таким образом, у Не, therrao/Viííus lUn гидрокеилапин может служить физиологическим источников вое с т ановит ель н рых эквивалентов, вовлекаемых в реакцию шнооксигенирования углеводородного субстрата.

Клетки другого вида нетаниспользущих бактерий, Ms. iricha-sporiun OSJb, не использовали энергию, осБобовдающуюся при окислении гидроксиламина. для монооксигенирования этана.

Учитывая локализацию процесса окисления гидроксиламина в периплазме Me. tliermophlius lila, можно предположить, что сопряжение окисления гидроксиламина и этана осуществляется за счет переноса электронов от ГАОР посредством мембранных компонентов к Ш). Если ре доке-потенциал авдептора электронов от ГАОР (цитох-ром с) более положителен, чем у непосредственного донора электронов для МШ, то восстановление последнего молят быть осуществлено путем обратного переноса электронов за счет энергии электрохимического градиента, создаваемого при окислении гидроксиламина. .

Глава 4. СОПРЯЖЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ МЕТАНА И

МЕТАНОЛА С ГЕНЕРАЦИЕЙ ПРОТОШШЙЖУЩЕЙ СИЛЫ

Весь метан, метаболизируемый клетками метаниспольаующих бактерий, подвергается шноокаигенированив. Эасчет данного процесса переносится на кислород (т, е. энергетически обесценивается) как минимум половина Доступных электронов потребляемого метана: °2 HgO HgO

СН4 > СНдОН —j--> НСОН -> НСООН --j-> со2,

Zim 2ЕШ ЕСН1 2СШ

суммарная реакция: СН4 + Og —> COg + 4СЮ.

Однако, в процессе роста не весь углерод метана окисляется до COg: значительная часть его потока в виде формальдегида отвлекается на синтез биомассы. Б этом случае доля электронов, акцептированных кислородом при монооксигенирования метана, существенно выше и составляет 6Q-80X [Anthony, 19821.

Высокая интенсивность переноса электронов к ММЭ позволяет предположить, что этот процесс является энергодашш, т.е. cotí-

ряжен с синтезом макроэргических соединений. Подобное мнение высказано ранее рядом исследователей, обративших внимание на то, что низкий уровень накопления биомассы (либо вообще отсутствие роста) метаниспользуюцих бактерий на метаноле не согласуется с более выгодным (по сравнению с метаном) путем его окисления [HigfTjrcs a. Quayle, 1970; Ribbons et al., 19703:

н2о

CHgOH —J-> HOOH ^—> НСООН —J—> оо2.

ЙЕН] 2[Ш 21 HI

суммарная реакция: СН3ОН + HgO —> С02 + б[Ш.

Согласно хемиосмотическоЯ теории, сопряжение окисления субстрата с синтезом АТФ опосредовано протондвижущей силой, составными компонентами которой являются протонный градиент и электрический заряд относительно цитоплагматической мембраны [Jones, 1982]. Доказательство генерации трансмембранного электрохимического градиента при окислении субстрата является одновременно свидетельством участия этого процесса в синтезе АТФ. Для оценки возможности запасания энергии при транспорте электронов к мембранной ШО нами изучено образование протонного градиента при совместном окислении метана и формиата клетками метаниспользуюцих бактерий с инактивированной МДГ. Также изучен механизм генерации протондвижущей силы при окислении метанола. 4.1. Сопряжение процесса транспорта электронов к метанюнооксиге-назе с транслокацией протонов. - При изучении транслокации протонов, происходящей при окислении субстрата клетками микроорганизмов, в инкубационную среду вводят ионы К+ и проникающие анионы, увеличивающие протонный градиент за счет снижения разности потенциалов на мембране CBakker а. Mangerich, 1981 J. В связи с этим предстояло выяснить влияние веществ, изменяющих компоненты протондвижущей силы (протонофоров и проникающих ионов) на окисление метана клетками метаниспользуицих бактерий.

Чтобы исключить влияние ВДГ на формирование протондвижущэй силы при окислении метана клетками, необходимо было найти такой ингибитор этого фермента, который не влиял бы на активность МИО. В его присутствии монооксигенирование метана (или другого субстрата) должно быть обеспечено энергией НАДН (возможный источник - окисление формиата ФгДГ).

Зависимость способности клеток окислять метан от наличия заряда на мембране. Изучено влияипэ ряда проникаших ионов на окисление метана и продуктов его катаболизма (метанола и формиа-та) клеточными суспензиями №. alba 0GВ. Тиоцианат (наиболее часто применяемый проникающий анион) полностью ингиОиро-вал окисление метана и на В7% - окисление метанола. Иодид или перхлорат лишь частично подавляли окисление метана и метанола. Все испытанные проникающие анионы практически не влияли на окисление формиата. Аналогичные результаты были получены для клеточных суспензий Не. themophilus iiin, Ик. rubra 15ш и Ms. trtchosporiue ОВЗЬ.

Ингибирование проникающими анионами окисления метана клетками метаниспользущих бактерий не было отмечено ранее. Мы предположили, что окисление метана в данном случае прекращается (или снижается) за счет рассеивания л*-. Для проверки этого предположения было определено влияние на окисление метана проникающего катиона ТФФ+и протонофора FCCP.

Окиелени метана подавлялось ТФИ*" у всех испытанных штаммов метшие по льзущих бактерий (табл. 2). Протонофор FCCP полностью подавлял окисление метана у Ия. rubra 15т и №. (ЬегшорШия iiin. Клетки Мс. caAst/taius 9И были способны окислять метан в присутствии FCCP, причем эффект разобщителя зависел от условий культивирования: у выращенных при рН 5,6 клеток наблюдалась стимуляция окисления метана (табл. 2).

Более детально влияние FCCP на окисление метана изучено у Не, ther«ophllu5 llin. При изучении зависимости скорости окисления метана клетками от рН среды было обнаружено, что со снижением концентрации одновалентных к&тиоков оптимум рН даняого процесса смещается в щелочную сторону. При использовании буферного раствора, не содержащего ионов К+ и На+, окисление метана не подавлялось полностью FCCP при рй выше 8, а при рН 9,5 ингибирование не наблццалось. Это говорит о том, что ингибирующее действие FCCP связано с его нротонофорными свойствами (рассеивает электрохимический градиент на мембране), которые теряются в щелочной среде, а не с прямым мигрированием метанмонооксигенаэы. Проникающий катион Т$Ф+ ингибировал окисление метана при всех значениях рН. Это указывает на то, что окисление метана зависит от л*-, а его прекращение при рассеивании д^ можно объяснить остановкой

Табмша 2

Влияние FCCP и ТФФ+ на окисление метана клетками метаяиспольэующих бактерий

Вид, штамм Скорость окисления метана, нмоль/мик*мг клеток

Без добавок В прис FCCP, 5 мкы утствии: ТФФ+, 0,1 мМ

Mm, rubra 13m He. capsulatus 9M* Mc. capsulatus 9И Мс. t hermophtI us illn 98 327 92 85 0 379 61 0 оооо

Примечания: * - использовали клетки, выращенные при рН 5,6 в

кемостате с лимитом по кислороду, D-0,2 ч; в остальных экспериментах использовали клетки, выращенные в периодических условиях при начальном рН среды 6,9.

активного транспорта метана в клетки.

Поиск селективных ингибиторов метанолдегидрогеназы. - В качестве ингибиторов были испытаны карбонильные реагенты, связывающиеся в активном центре метанолдегидрогеназы (цианид, гидрокеи-ламин, метилгидразин, л-нитрофенилгидразин) СDutne a. Frank, 19811, атшеже иодацетат, фосфат, формамид и ацетамид.

Цианид и иодацетат не обладали избирательным действием и ин-гибировали как окисление промел!уточных продуктов катаболизма метана, так и самого метана, а метилгидразин не шгибировал окисление метанола покоящимися клетками. Остальные соединения инги-бировали окисление метана, метанола, но не ингибировали окисление метана в присутствии формиата.

При анализе динамики накопления в инкубационной среде продуктов окисления этана и формиата клетками Mm. rubra i5м в присутствии гидрокеиламкна, формамида или фосфата было обнаружено, что лишь формамид в концентрации 100 мМ полностью блокировал окисление этанола Гидроксиламин был эффективен в концентрации 1 -2 мМ в течение первого часа инкубации, после чего наблюдалось накопление ацетальдегида. Фосфат не оказывал полного подавления окисления этанола. Кинетика подавления активности ИНГ в бесклеточных экстрактах Ияи rubra 15ш и Мс. thernoptit 1 its liln свидетельствует о том, что формамид является неконкурентным (К(- 1,1 мы), а гидроксиламин - конкурентным (К,- 6 мкЮ ингибитором дан-

ного фермента.

Генерация лрН при переносе электронов от НАДН к нетанмоноок-сигенаэе. Учитывая высокое сродство ВДГ к гидроксилаиину, данный ингибитор был использован в даль^Яшх экспериментах для блокирования окисления метанола, а такле для блокирования цитохромок-сидаэы. В его присутствии метан мог окисляться лишь еопряшшо с дегидрированием формиата:

Проведенные эксперименты показали, что сопряженное окисление клетками Иш. alba ЮЭ. содержащими мММО, метана и формиата Е присутствии гидроксиламина сопровождается транслокацией протонов (рис. 3). Это свидетельствует о генерации п ротонд в илу силы, которая происходит на этапе транспорта электронов от формиата череа НАДН к мШО, поскольку другие электронт ране портные цепи ингибировакы гидроксиламином.

Данный процесс, судя по значениям ->Н+/0, сопряжен с функционированием одного протонтранслоцярущего сегмента. Однако нудно учесть, что поступление формиата в клетку снижает pH за счет переноса протона в клетку в составе нейтральной молекулы формиата либо за счет еишюрта НСОО" с протоном, поэтому полученные значения ->Н+/0 (1,7 для Иш. aiba BG8 и 0,8 для Hs. trichasporim Oß3b) могут Сыть еаниженными.

Представленные данные позволяют заключить, что метакокисляи-Ййе бактерии способны использовать энергии восстановителя, окисляемого при монооксигештрованки метана, для получения макрозрги-ческих соединений.

Очевидно, системы получения энергии у метанокисляющих бактерий отличается от функционирующих у прочих аэробных организмов энергогенерирующих систем. Обычно синтез макрозргических соеди-

1_Ф$ЛГ}

НСООК

-> со2

-> Я4/0 - 3,8

К о.

к ж о

щ

0

в §

1

и

1 мин

->Н+/0 - 1,7

Рис. 3. Изменение рН инкубационной среды в результате транслокации протонов при окислении эндогенных субстратов (а), метана или формиата в присутствии гидрокеиламина (б), смеси метан + формиат в присутствии гидрокеиламина (в) неголодавятми клетками Им. а1Ьа &08<

нений сопряжен с транспортом электронов от соответствующих доноров через ряд промежуточных переносчиков на кислород, являющийся конечным акцептором электронов в реакции, катализируемой,как правило, цитохромоксидазой. В отличие от этого, у метанокисляющих бактерий большая часть электронов субстрата транспортируется. на кислород не через обычную дыхательную цепь, а через специфические переносчики к мММО, осуществляющей первый этап окисления метана. Реакции монооксигенирования, протекающие за счет анергии восстановителя, обычно рассматривают как энергетически невыгодные. -Однако, учитывая полученные данные, систему монооксигенирования метана у метанокисляющх бактерий можно рассматривать как основную систему транспорта электронов данного субстрата на кислород, которая сопряжена с генерированием энергии. 4. z. Генерация трансмембранного протонного градиента при окислении спиртов клетками Ис. < ЬепиорШ цд 1Нп. С целью определения роди МИГ в генерации протондвижущей силы нами была определена способность генерировать дрН у голодавших клеток НсЛЬегяюгМХиз Шп при окислении ими субстрата ВДГ - пропанола. Поскольку образующийся при этом пропиловьй альдегид далее не трансформируется, участие других систем генераци энергии исключено. Для срав-

нения определена транс локация прогонов при окислении эндогенных субстратов, метанола и формиата (рис. 4. си. табл. 1). Метан не генерировал дрН, т.к. клетки в результате голодания теряли способность его окислять. Разобщитель С1ССР способствовал быстрому возвращению транслоцированных протонов по градиенту рН в клетки.

.а

Зля метаном! ->Н+/0 - 3,3 Шя пропаном —> Н+/0 - 3,2

«а

о т

№ §

г

1 мин

—> И*/О - 1,56

Рис, 3. Изменение рН инкубационной среды в результате транслокации протонов при окислении метанола или пропанола (а) и формиата (б) голодавшими клетками Не. ЬЬвгвюрПНиз Шп.

Значения ->Н^/0 для эндогенных субстратов, метанола и пропанола были выше 3, причем -при окислении пропанола исключено возможное завышение этого показателя для метанола, которое могло бы произойти в результате закисления среды формиатом, образующимся при окислении метанола. Это предполагает наличие двух протонт-ракслокирующих сегментов, функционирующих при переносе электронов от ВДГ субстратов на кислород.

• Значение ->Н+/0-1,56," полученное при окислении формиата, свидетельствует о том, что процесс транспорта электронов от ПАДН на кйслород сопряжен с функционированием одного протонтранелоци-руадего сегмента. Однако, если учесть, что ¿рН снижается за счет переноса в клетку протона в составе молекулы формиата, то два протонтранелокирующих сегмента должны функционировать при окислении НАДН у Не, Ihermoph.ilия Шп,

Окисление метана как энергодакдрй процесс для поддержания АрН при росте метаниспольэуювдх бактерий в кислой среде. При

культивировании ацидотолерантных ме т анис по ль э у ющнх бактерий на метане в кислой среде было обнаружено повышение рН культуральной жидкости после ее отбора из Ферментера. Поскольку рН является одним из основных факторов, по которым ведется управление про-сессом культивирования, необходимо было определить причены его изменения.

Показано, что клетки Ис. сарзи1сйиз, отобранные из ферментера (рН="5,6), отделенные от культуральной жидкости и ресуспенди-рованные в минеральной среде (рН-4,4), способствуют повышению рН до 6,0.. Этого не происходит при насыщении суспензии клеток в кислой среде смесью метана и кислорода, Таким образом, энергия, освобождающаяся при окислении метана, используется для. поддержания дрН между цитоплазмой и кислой внешней средой, а в отсутствии метана повышение рН является результатом поглощения протонов среды клетками (предел этой способности - 2,6 мкг-ионов Н+/г сухих клеток).

Цепь транспорта электронов от метанолдегидрогеназы на кислород г Не. I (югторМ. I из И1п. Из бесклеточного экстракта были выделены метанолдегидрогеназа и цитохром с, способный связываться с СО (цитохром его), и очищены до гомогенного состояния. Показано, что цитохром сС0 является естественным акцептором электронов от МДГ у Мс. {ЬегкорМIиг Шп. Спектры поглощения препарата МДГ свидетельствуй о наличии РОО в качестве простетической группы.

В мелйранной фракции бесклеточного экстракта Мс. 1 ИегторМ 1115 Шп идентифицирована одна терминальная оксидаза типа аад. Активность цитохромоксидазы также сосредоточена во фракции мембран бесклеточного экстракта Ис. 1 ЬегторМIия Шп. Метанол восстанавливал цитохрома типа с, ассоциированные с мембранами, и цитохром ЗЭд.

Полученные результаты указывай на то, что у Ис. *ЛегторМ1-ил Шп электроны от простетической группы метанолдегидрогеназы акцептируются цитохромом сго и переносятся посредством мембранной терминальной оксидазы типа азд на кислород.

Пространственная организация окисления метанола у'ИсЛЬегио-рЩц? Шп. Для определения локализации МДГ проведен анализ действия ЗДГА на трансформацию метанола. ЭДТА проникает в периплазму грамотрицательных бактерий и воздействует на внецитоплаз-матические белки, но не способен преодолеть цитоплазматическую

мембрану. Данное соединение в концентрации о.З мЫ не полнеет* подавляло окисление метана и метанола клетками метаишшьэушкх бактерий (табл. 3), хотя известно его ингибирукщее действие на окисление метанола клетками мет знолис по льзу ющих бактерий (ЭДТА не является ингибитором МДГ in vitro, но нарушает перенос электронов от простетической группы этого фермента к цитохрому с в клетках [Carver et al., 19841). Дополнительное внесение формиата как источника НАДН для монооксигенирования метана приводило к полному восстановлению скорости потребления метана клетками в присутствии ЭДТА, однако скорость потребления кислорода не восстанавливалась до исходной (табл. 3).

Табмща 3

Еаияние ЭДТА на окисление субстратов метанмоноокс игеназы и метанолдегидрогенаэы клетками Me. tttermophi¡ tis 11 In.

Субстрат Концентрация. МЫ Скорость потребления ,нмоль/мин*мг

Бев добавок В прш ЭДТА -утетвик ЭДТАКЗ^

°2 сн4 °2 сн4 С114

Метан Матанол Этанол Пропадал Формиат Метан+ формиат 0,1 1.0 1.0 1.0 10,0 0,1 + 10,0 228 116 282 108 112 33 23? ISO 43 42 ■ 144 21 £5 19 112 115 0 0 0 15 16 19 19 0

Примечание. "-" - метан отсутствовал.

Это свидетельствует о том, что ЭЯА ингибирует процесс окисления метана на уровне метанола, но не влияет на активность №0 и ЗтДГ. Неполное подавление ЭДТА окис лещи метанола является результатам способности ММО окислять этот субстрат С глава 5).

Ингибирование ЭДТА окислений спиртов, которые не являются субстратами Ж) (этанола, пропанола), было более сильным. Следовательно, инкубация клеток метаниспользущих бактерий с ЭДТА приводила к потере их способности окислять спирты эа счет нарушения транспорта электронов от МЭГ на кислород. Неполное восстановление способности клеток окислять метанол после удаления ЭДТА и добавления ионов двухвалентных металлов предполагает наличие по крайней мере одного переносчика электронов, легко диффундирующего из периплазмы при обработке ЭДТА.

Таким образом, можно заключить, что окисление метанола происходит Б периплазме клеток Не, 1ЛегторШиз Н1п. Протонный градиент создается за счет того, что освобождающиеся при дегидрировании метанола протоны остаются в периплазме, а электроны транспортируются цитохромными компонентами к терминальной оксидазе или МНО, локализованным на цитоплазматической стороне мембраны. Кроме того, высокие значения ->Н+/0 (3,2-3,3), полученные при окислении спиртов клетками, свидетельствуют о возможности транслокации протонов при функционировании терминальной оксидавы как протонного насоса. Эти механизмы приводят к формированию электрохимического градиента на мембране, обеспечивающего энергетические потребности клетки:

Периплазма

Цитоплазма

СН30Н

Глава 5. РЕАКЦИЯ МОНООЮГЕНИРОВАНИЯ КАК СТОК ЭЛЕКТРОНОВ МЕТАНОЛА У МЕТЛНИСПОЛЬЗУОДК БАКТЕРИЙ Несмотря на то, что метанол является первым промежуточным продуктом окисления метана и возможность более эффективного пути окисления, выход биомассы метаниспользующих бактерий на метаноле существенно ниже, чем на метане. Рост большинства видов на мета-поле подавляется формальдегидом, накапливающимся в культуральной жидкости.

Выявление причин неэффективного роста метаниеПользугаих бактерий на метаноле позволило определить роль метанмонооксиге-назной реакции как основного механизма переноса электронов субстрата на кислород.

1. Лимитирующий этап окисления метанола. Скорость окисления ннтермедяатов катаболизм метанола покоящимися клетками метанис-иользуших бактерий различна: окисление метанола происходит в 1гесдалько раз белее активно, чем формиата (табл. 4). В связи с том, что скорость окисления эндогенных субстратов в клетках ме-

Таблица 4

Стехиометрия окисления метанола покоящимися клетками метаниспользующих бактерий

Вид. птамм Условия культивирования Скорость, нмоль/минамг клеток

Потребления сн3он | Og Образования со2

Ня. rubra 13ш №. f hermophi t из Hin Периодические Периодические Хемостат 82,3 108 28,2 81,2 95,1 31.0 173 255 86,1

таниспользующих бактерий крайне низка, образующийся как при окислении метанола, так и формиата углекислый газ является продуктом дегидрирования формиата. При окислении метанола скорость образования углекислоты существенно ниже, чем скорость потребления метанола (табл. 4), что свидетельствует о накоплении продуктов неполного окисления метанола. Действительно, при внесении метанола (0,1 об. X) в ферментер с растущей на метане хемостатной культурой Мс. fhemophilus Hin в культуральной жидкости происходило накопление формиата (но не формальдегида).

При окислении смеси субстратов НССОН+СО клетками метаниспользующих бактерий скорость потребления кислорода бала вдвое выше, чем при окислении НСООН, а скорость образования углекислоты - в 4-5 раз (табл. 5). В отсутствии формиата окисление СО клетками практически не происходило. Стехиометрия реакции окисления смеси НСООН+СО свидетельствует о том, что половина образующейся углекислоты происходит из формиата. Увеличение скорости окисления формиата при функционировании дополнительного стока электронов НАДН - реакции монооксигенирования СО - свидетельствует о том, что окисления метанола до углекислоты у метаниспользующих бактерий лимитировано скоростью транспорта электронов от НАЛН на кислород.

5.2. Вдияние субстратов метанмонооксигеназы на асимиляцию метанола метаниспольаукицими бактериями. Рост Ия. rubra 15ш на метаноле как единственном источнике углерода и энергии характеризуется нивкой эффективностью и сопровождается накоплением формальдегида Это характерно и для других видов метаниспользующих бактерий. Ряд культур (например, Мс. thermopktlus Hin) не способны использовать метанол. Ib-видимому, причиной этого является создание в клетке избытка НАДН из-за*несбалансированности интенсив-

Таблиц а 5

Стехиометрия потребления кислорода и образования углекислоты при окислении ШООН+СО клетками метан использующих бактерий

Скорость, нмоль/минамг клеток

Рид, штамм Субстрат Потребления °2 Образования си.

ит. р-кЬга ^S«l. Эндогенные ЫСООН СО 1ЮООНЮО 5,1 20,5 7,3 45,5 3,2 22,1 6,1 96,2

Не. 1 ЬегторЫ) >15 И1п Эндогенные НСООН СО ШООНЮО 5.0 11.2 5.1 29,1 2.8 16,3 3,2 56,8

Иг, (йегвюцМ 1 шг Шп (хешетат) Эндогенные НСООН СО нсоон+со 19.7 33.8 23.7 81.8 15,9 32,3 23,8 159

гости дегидрирования метанола или интермедиатов его окисления и тпчстрта электронов на кислород НАЛН-оксидааной системой:

СН30Н

0„

ИЖОПЛОНШ

в среде

1 ЦДГ I—

■> гсш

то

->н2о

И„0

— ЯСОН —> Ассимиляция

НАЛН -^

Шутриклеточный пул

ФдДГ

°2

Н£0

нсоон I ФгДГ

-> Т1АДН

С02

Более эффею'ивное использование метанола вое можно при акцептировании его электронов кислородом, участвующем в монооксиге-И'!Г:НОЛ реаКЦПИ.

Рост на смеси метанолэтан. Не растущая на метаноле культу-;Мс. (ГюггюрШшг Шп способна расти на метаноле в присутствии ЭТ-1НЯ, Иит«ие;ш гость роста на метаноле других культур мета-!!11-*;п'.М1>ру!С'Р!{их бактерий сутестгеино повышалась при введении

- 25 -

этана, формальдегид не накапливался в этих случаях.

Эксперименты, проведенные с Mm. rubra 15м. показали, что эффективность использования метанола для синтеза биомассы максимальна при низких концентрациях метанола (до 0,05%), при этом основными продуктами окисления этана были ацетальдегид и ацетат, С увеличением концентрации метанола в среде выход биомассы снижался, увеличивалось образование углекислоты, основным продуктом окисления этана был этанол (табл. б). Интенсивность соокисления

Таблица 6

Стехиометрия потребления метанола и образования продуктов окисления этана в процессе роста Мм. rtibra îSm на этих субстратах.

Концентрация Трансфор- Продукт окисления

субстратов мированный , этана, мм

метанол,мМ

с2% СНдОИ Е био- До Сумма дан СН3СОИ СН3СООН Сумма

массу COg

5 0,01 2,5 0 2,5 0 1,7 0,5 2,2

0,05 8,7 4,8 13,5 0 3,1 1.0 4,1

0,1 10,8 14,2 26,0 1,9 2,7 0,2 4.8

0,13 8,3 20,9 29,2 6,2 0,4 0 6.6

0,18 7,5 3,8 11,4 1,5 0 0 1,5

10 0,01 2,5 0 2,5 0 1,6 0,7 2,3

0,03 6,3 1,2 7,5 0 3.3 1,0 4,3

0,05 7,1 5,4 12,5 0 4.8 1,7 6,5

0,1 13,7 9,6 23,3 4,0 4.0 0,4 8,4

0,15 10,4 20,9 31,3 8,1 0,2 6 8,3

0,18 9,2 7,5 16,7 5,4 0 0 6,4

20 0,01 2,5 0 2,5 0 3,1 1,1 4,2

0,05 8,3 5,2 13,5 1,5 5.0 2,5 9.0

0,1 12,0 12,6 24,6 6,7 3,3 1,0 11,0

0,15 10,4 22,9 33,3 8,3 1,9 0. 10,2

0,2 10,0 12,9 22,9 6,25 0 0 6,25

этана, судя по сумме концентраций накопившихся продуктов, увеличивалась с увеличением его концентрации при одной и той же концентрации метанола. При увеличении же концентрации метанола интенсивность соокисления этана снижалась. При низких концентрациях метанола (0,01-0,03%) этан соокислялся пропорционально потребленному метанолу в соотношении, близком 1:1. Поскольку практически весь метанол превращался в биомассу (углекислота практически не накапливалась), единственной реакцией, сопряжен-но1 с мошоке игенированнем этана, может быть дегидрирование метанола метшюллегидрогенааой:

СНдОН НДР

°2Нб

-> 21Ю

№0

->н«о

С2Н50Н

мят

-> 2СЮ

ТО

->н2о

«2°

С^Н^О -------

МДГ °2

-> гт

->н2о

СНдСООН

НСОН —>' Ассимиляция По-видимому, процесс окисления этана до ацетата является энергодаюшим, поскольку при низких концентрациях метанола наблюдался необычно высокий выход биомассы.

При более высоких концентрациях метанола (выше О,IX) продукт монооксигенироваиия этана - этанол - не окислялся далее и накапливался в культуральной жидкости. В этих случаях наблюдалось интенсивное окисление этанола до углекислоты при низкой эффективности синтеза биомассы. Соокисление этана оставалось пропорциональным (1:1) количеству метанола, превращенного в биомассу, Поскольку окисление этанола не происходило, в качестве энергодашего использовался процесс окисления метанола до углекислоты:

СН3ОН.

С2Н6

ВДГ

-> ЕШ —

КМО

°2

->н2о

С2Н50Н —

Накопление в среде

НСОН —> Ассимиляция Од

( ФдДГ | ТО Н^О -4—-> НАДН-> ЕЕ Н) —1-

нсоон

фтдг

-> налн-> гт

" I ТО

.-1->нго

При использовании этана как субстрата метанмонооксигенавы нельзя однозначно судить о влиянии процесса акцептирования электронов метанола в монооксигеназной реакции на ростовой процесс. Так, продукт монооксигенирования этана - этанол - моле? использоваться как дополнительный источник энергии и(или) углерода. Для демонстрации роли реакции монооксигенировання как стока электронов субстрата у мет анис пользуются бактерий был использован другой субстратный аналог метана - СЮ.

Рост на смеси метанол+СО. СО имеет высокое сродство к метанмонооксигеназе, а продукт его монооксигенировання - углекислота - нетоксичен и не может быть использован клетками как источник энергии. Внесение в газовую фазу колб СО при культивировании Мм. rubra 15а на метаноле приводит к увеличению выхода биомассы по метанолу. В этом случае формальдегид накапливался лишь при концентрации метанола выше 0,2 г. Культура Не, ttwraophilus Hin оказалась способной расти на метаноле в присутствии СО. 'При росте обеих культур на метаноле+СО происходит одновременное потребление этих субстратов. Стехиометрия ростового процесса зависит от концентрации метанола в среде (табл. 7).

Таблица 7

Зависимость стехиометрии процесса роста Мя. rubra 15« на метаноле + СО от концентрации метанола в среде.

Концентрация метанола, обД Потребление субстратов и продуктов , г углерода/г углерода метанола

СНдОН , СО Биомасса COg

0,05 0,15 0,20 1 1,25 1 1 1 . 0,89 0,82 1,43 0,71 1,29 0,61 1,20 '

Расчеты свидетельствуют о тем, что при высокой эффективности использования метанола в присутствии СО для соблюдения баланса по углероду все электроны, освобожденные при окислении метанола, должны быть акцептированы при монооксигенировании СО:

CHgOH

CO

ЫДГ

I-0.

J'->H2°

co2

HCOH —> Ассимиляция фдДГ

--> НАДН-> 21Ш

СО

н2о

ша

->н2о

НСООН

со2 со

ФтДГ

■> НАЛН -> 2СН1

шо

■>HgO

со2

Это свидетельствует о том, что транспорт электронов метанола к метанмонооксигеназе сопряжен с генерированием энергии.

3. Оинтаболизм. способность таниспользующих бактерий расти на смеси двух субстратов, каждый из которых в отдельности не является ростовым, расширяет наше представление о кометаболизме. Шд кометаболизмом понимают процесс трансформации субстратов, не способных поддерживать рост, в обязательном присутствии субстрата для роста или другого трансформируемого соединения С Daiton а. Stirling, 19821.

Обычно кометаболизм (соокисдение) приводит к торможению роста. Однако, у Не. t hsrmoptii I its ilin совместный метаболизм двух неростовых субстратов (метанол+CO или метанол+этан) обеспечивал прирост биомассы. Такой тип кометабслизма был назван нами спита-, болизмом tMalashenko a Sokolov, 1980. Синтаболизм - это сопряженная ассимиляция двух неростовых субстратов, обеспечивающая рост и размножение клеток.

Совместная ассыиляция источника восстановительных эквивалентов и углерода (метанола) и субстрата ММО (этана или СО) у всех испытанных штаммов метаняепольвукщих бактерий приводит к положительному результату: эффективность использования клетками метанола увеличивается. Бели при кометаболизме культурой Ига. rubra 15и смеси метан+этан (соокисдение) рост полностью ингибируется при концентрации этана выше 7 об. %, то при кометаболизме смеси

метанол+ этан (синтаболизм) рост возможен при концентрации этана 20 об. X. Показано, что введение метанола в среду дает возможность культивировать ме такие по ль в узощте бактерии на природном газе с высоким содержанием этана.

5.4. Роль метавмояооксиге наз ы при ассимиляции^ метанола метанис-пользующими бактериями. Одной из причин появления формальдегида при росте на среде с метанолом может оказаться способность ММО окислять метанол [Colby et al. , 1977; Cornish et al. . 19841. В связи с этим изучено влияние ингибитора ММО - ацетилена - на рост ряда штаммов на среде с метанолом, а также на окисление метанола покоящимися клетками.

Влияние.ацетилена на ассимиляцию метанола. Ацетилен подавлял роет Hs. tríchosporitun ОВЗЬ в жидкой среде с метанолом {рис. 5, А). В среде накапливался формальдегид, концентрация которого

А Б

Биомасса, г/л НОТН, мН

CgHg, об. %

Fhc, 5. Зависимость накопления биомассы (1) и формальдегида (2) в процессе роста Hs. trichosporiшп ОВЗЬ (А) и Mm. rubra 13ш СБ) от концентрации ацетилена в газовой фазе.

повышалась с увеличением концентрации ацетилена. Рост Ис. thermophilus iiin на среде с метанолом в присутствии ацетилена не наблюдался. Влияние ацетилена на ассимиляцию метанола культурами Mm. rubra 15ш (рис. 5,Б) и Мс. capsul at us 9И оказалось стимулирующим, формальдегид при этом не накапливался.

Влияние ацетилена на окисление метанола покоящимися клетками. Степень ингиСирования ацетиленом окисления метанола клетками коррелировала с их способностью окислять метан; чем скорость окгсления метана была выше, тем сильнее ацетилен подавлял окисление метанола (ингибирование достигало 702). Это согласуется с

предположением об участии ММО в окислении метанола.

При избытке ацетилена скорость окисления метанола практически не зависела от его концентрации в диапазоне 1-10 мЫ, однако степень ингибировання ацетиленом увеличивалась с увеличением концентрации метанола (табл. 8). Сохраняющееся после добавления

Таблица 8

Влияние ацетилена на окисление метанола клетками метаниспольвущих бактерий

Скорость окисления метанола, нмоль/мин*мг клеток

Вид, штамм Концентрация CHgOH, мМ Без добавок (V В присутствии 0,15 MU CgHg (V2) Разность VV2 (активность ШО)

Мя. rubra 15ш 1.0 2,5 5.0 10,0 134 153 174 190 42.7 41,3 44.8 50,1 91,3 117 129 140

Не. thermophilics Hin 0,15 1.0 6,0 77,2 114 197 68.4 75.5 79,1 8,3 38,6 IIS

ацетилена окисление метанола обусловлено функционированием ЦЦГ, устойчивой к этому ингибитору, а подавляемое ацетиленом окисление метанола обусловлено активностью UMO. Анализ зависимости этой активности (V^-Vg, табл. 8) от концентрации метанола позволяет дать предварительную оценку сродства метанмонооксигеназы к метанолу. Полученные значения Km для ММО в составе целых клеток М*. rubra и №. ttemophtlus iiin (0,63 и 2,5 мЫ, соответственно) свидетельствуют о низком сродстве этой ферментной системы к метанолу (для метана значения Km составляют 20 и 6,6 мкМ, соответственно). Концентрации метанола, применяемые для выращивания метанисяользующих бактерий, превышают найденные значения Km для метанола, что позволяет данному ферменту окислять метанол наряду с МЦГ.

Особенности терминального акцептирования электронов метанола при его ассимиляции метаниспользующими бактериями. Ингибирование ацетиленом роста its. tricbasporitm OfiJb на среде с метанолом свидетельствует о том, что реакция монооксигенирования необходима для стока электронов метанола на кислород:

СН3ОН СНдОН

неон

|>

ЯСОН —> Ассимиляция

Н2° фдДР '--> НАДН-> ЕС НЭ

СНдОН

I -

1->^0 С&.

Накопление >> в среде

НСООН ФгДР

НСОН СНдОН

-> НАДН-> 2Ш

НСОН

Видимо, при блокировании этой реакции остающиеся системы терминального акцептирования электронов кислородом недостаточно активны, либо недостаточно эффективно сопряжены с генерированием энергии. В обоих случаях скорость окисления метанола . превышает скорость удаления образующихся продуктов за счет окислительны* или конструктивных реакций, поскольку вначитель-ные концентрации формальдегида накапливались в среде с метанолом, инокулированной Мл ((-«АазрогЧш ОВЗЬ (рис. Б),

Стимуляция ацетиленом роста культур Им. тЬга 13а и Мс. сар£и1сйиз 9Н на метаноле предполагает наличие у них в этих'условиях активных систем переноса электронов как от ЬЩГЧ. так и от НАДН на кислород при неактивной ММО. Эффективность роста повышается за счет блокирования холостого стока электронов на кислород, участвующий в монооксигенировании метанола с образованием избытка формальдегида, и появления более активных энергогенери-руицда систем терминального акцептирования электронов, альтернативных ММО. Необходимость такой активации подтверждается тем, что Не все штаммы метаниспольэущих бактерий более активно растут на метаноле при добавлении ацетилена, а рост Ми. гыЬга 13« интенсифицировался в жидкой среде, но не на твердой агаризован-ной.

- зг -

Глава 6. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ЭФШСГИБНОСГИ

КОНСТРУКТИВНОГО МЕТАБОЛИЗМ И СОПРЯЖЕННОСТИ

ОКИСЛЕНИЯ МЕТАНА С СИНТЕЗОВ АТФ

Нами предпринята попытка унифицировать процесс прогнозирования эффективности использования субстрата микроорганизмами. Предлагаемая схема анализа метаболических превращений включает формальное их описание и позволяет: а) определить эффективность образования АТФ (Р/О) в энергетическом метаболизме при известном выходе биомассы, либо решить обратную задачу - провести прогнозирование эффективности использования субстрата при известных значениях Р/О; б) определить фактор, лимитирующий конструктивный метаболизм и метаболизм в целом; в) определить эффективность использования восстановительных эквивалентов при синтезе АТФ в энергетическом метаболизме; г) оценить правильность наших представлений об определенных этапах метаболизма или об определенных реакциях и прогнозировать их механизмы. Данный подход использован для оценки роли монооксигенирования метана в энергетическом метаболизме метание польз ухшх бактерий.

Условные обозначения: rs, гь> r^, ~ степень восстановлен-

ности субстрата, биомассы, центрального метаболита и продукта окисления субстрата с участием молекулярного кислорода, соответственное г-зкв. доступных злектронов/г-атом С); тс - экономический коэффициент образования биомассы по углероду (г С биомассы/г С субстрата); д(, д^, д^- баланс АТФ этапов: синтеза

биомассы из базисного метаболита, транспорта субстрата, образования центрального метаболита, образования базисного метаболита, окисления центрального метаболита до углекислоты, соответственно. моль АТФ/г-атом С субстрата (знак "+" - расход, "-" - образование) ; CHffi0j - формула субстрата, CH^Oj - продукта окисления

субстрата с участием мелекулярного кислорода, СН^О[ - центрального метаболита, CH-Oj- - базисного метаболита; а - метаболизиро-ванный субстрат, а^- часть, поступившая в конструктивный метаболизм, а^- в реакции перестройки, г-атом С; Э - доля COg, использованная при образовании базисного метаболита, г-моль COg/г-атом С субстрата; - доля СО-,, фиксированная гетеротрофно, г-моль COg/г-атом С биомассы; Ь - синтезированная биомасса, г-атом С. Опущены члену уравнений, не влияющие на стехиометрию: Н^О, Н+, NHg, АДФ, фосфат неорганический, окисленная форма переносчика электронов. НАЖФ)Н + Hh записан в виде НАДЕ,. ДЭ - доступные электроны.

6.1. Построение формул для расчета эффективности использования углерода и энергии субстрата. В основу построения уравнений синтеза биомассы положена теория баланса доступных электронов (№ш-кевич и Ерошин, 1976). В качестве конструктивного метаболизма рассматривается та часть обменных реакций, которая приводит к образованию биомассы при'полном сохранении энергии соответствующей части вовлекаемого в метаболизм субстрата. Эта доля субстрата (при постоянном элементном составе биомассы) зависит только от энергии, содержащейся в субстрате, но не от конкретных путей метаболизма. При отсутствии затрат энергии на обеспечение Сио-синтетических реакций Ус Судет лимитирован степенью восстанов-ленности углерода субстрата:

Этапы конструктивного метаболизма. Согласно определению, конструктивный метаболизм включает в себя окислительно-восстановительные реакции, которые приводят к уравниванию восстановленное™ углерода субстрата с восстановленностью углерода биомассы. Обычно такие же реакции окисления субстрат претерпевает в энергетическом метаболизме. Поэтому целесообразно ввделить метаболит, на уровне которого происходит разделение потока углерода субстрата ва окислительные и конструктивные реакции, т. е. центральный метаболит. Он должен характеризоваться степенью восста-новленности углерода не выше таковой биомассы.

Не всегда центральный метаболит шш быть использован непосредственно в реакциях синтеза клеточных компонентов: если число атомов углерода в его молекуле меньше трех, то собственно конструктивным реакциям должны предшествовать реакции.наращивания углеродной цепи, связанные с дополнительным выделением либо вовлечением углекислоты. Метаболит, пути синтеза клеточных компонентов от которого являются общими для всех организмов, пред-ложе ко называть базисным (Иванов, 1981). Наиболее удобно в качестве такого метаболита рассматривать фосфоглицериновую кислоту.

Этапы конструктивного метаболизма приведены на рис. 6, условные обозначения возможных переносчиков электронов и стехиоштри-ческие коэффициенты их участия в метаболизме - в табл. 9.

Образование центрального метаболита с вовлечение» кислорода. Если снижение восстановленное™ углерода субстрата осуществляется эа счет оксидаэного или оксигеназного механизма, то

- Э4 -

л,АТФ

02 (А-а^СН^ -х

^АТФ^Х, А^

а СН.0,

/ьАТФ УЧ

► (а-а^СН^

Д^АТФ

->(а-аг)С02

АТФ

■♦(ар-а^И^

ь сн

Сбиомасса)

Рис. 6. Метаболизм субстрата с указанием этапов потребления и генерации восстановительных эквивалентов (см. табл. 9) н АТФ.

электроны, акцептируемые кислородом, выбывают ив метаболизма:

СНжО( + -> ВД (2)

Баланс ' гя ~ - г^ СЗ)

Шэтому при участии кислорода в окислении субстрата экономические коэффициент его использования ограничен степенью восстанов-ленности продута окисления:

ТС

(4)

Потребности конспрукшшного метаболизма в Для составления балансовых уравнений была использована величина, обратная

УДТф - расход АТФ на синтез биомассы (д): д где

р, п. а - коэффициенты формулы СНрО^, отражащей состав биомасса Усредненный состав биомассы микроорганизмов определяется формулой (Д^Од 5н0 25 САпЬЬэпу, 19781, откуда следует, что на 1 г-атом С биомассы приходится 25,5 единиц молекулярного веса

соединения приведенного ваше состава. Приняв УдТФ-10,5, расход АТФ на синтез биомассы из базисного метаболита Оь АТФ) составляет 2.42 моль АТФ/г-атом С биомассы.

Таблиц! р

Акцепторы электронов, стехиометрические коэффициенты их участия в окислении субстрата или последующих метаболитов и количество АТФ, которое может быть синтезировано при окислении восстановленного акцептора

Акцептор электронов Стехиометрический коэффициент (2 экв. дэ/г-атом С субстрата) Количество геяери^емого АТФ

Условное обозначение Возможный физиологический

% ■ 4 0

РОС! с0 п0

НАД*, НАДФ+ 4 п0

Ы «а с, .

НАД НАД+, НАДФ+ п*

НАД НАД+, НАДФ+ 4 п*

Аг ш с2 "р

А* ФП ск ПЛ

6,2, Балансовые уравнения этапов конструктивного метаболизма. Гетеротрофная фиксация углекислоты. Иввестно, что часть клеточных компонентов как при гетеротрофном, так и при автотрофном росте микроорганизмов синтезируется путем вовлечения углекислоты ва счет реакций т, н. гетеротрофной фиксации. Поскольку почти каждая ив этих реакций протекает с использованием 1 шяь АТФ на моль углекислоты, на образование клеточных компонентов иэ углерода С02 расходуется (л^+1)АТФ. В этом случае балансовое уравнение синтеза биомассы имеет вид;

(Г СОг * с'НАДНз + £Г < V 1) АТФ —> . (5)

Образование биомассы из базисного метаболита: СЬ-(Г)СНаОу + (Ь-(Г)дь АТФ + сь НАШг —> СЬ-<Г)СНрОпН<1 (6)

Образование базисного метаболита из центрального: а1СН*°1 + ^^г * С^НАД^ + п^д^АТФ —> (Ь-(Г + (7)

+ в,^^

- 36 -

Образование центрального метаболита из субстрата;

а1сн,Л * а1со°г + —> с^н+

+ ^СН'О^ св)

Суммарное балансовое уравнениэ образования биомассы в конструктивном метаболизме:

а,СНйОг + а1с<(Р2 + (^а +$)С02 + (с-а^с^ЕУРи + ЬдАГФ —■>

—> ЬСНрОД + а^А^ + а^А^ (9)

Баланс.АТ& ЬдАТФ - а^АТФ + (Ьдь+й')АТФ + +д1)АТФ (10)

Баланс углерода: а^ + а^ 2 + <Г - Ь (11)

Баланс ДЭ: 2с - - а^г^ ' 2ск) (12)

Пределы значения экономического коэффициента. зависящие от путей конструктивного метаболизма.

Потребности в НАЦИ обеспечиваются на этапе образования центрального метаболита. При > г* возможно поступление НАДН в конструктивный метаболизм при окислении субстрата до центрального метаболита. При с < а^с^ не потребуется дополнительного окисления субстрата для генерации НАДН, обеспечивающего конструктивные реакции. В этом случае выход биомассы зависит лишь от вовлекаемой в метаболизм углекислоты:

. - - 1 + (13)

'с! (4 1 -

Поншив оптимума гетеротрофной фиксации у&леююмты. При использовании всего образующегося в конструктивном метаболизме

НАДН на фиксацию углекислоты значение Ус1 достигает предела:

При уровне, фиксации углекислоты ниже ^образующийся НАДН вынужден будет расходоваться вколостую, а при более высоком - потребуется дополнительный иисточник НАДЕ

Дополнительное окисление субстрата для генерации НАДН в

(Г Сп

раяках конструктивного детбомзма, при > : (аг-а()(СН1101 + —> (аг-а,)(С02 +■ + -

- (д^л^д^АТФ + (с-^с^НАДПо (15)

(^шлярное уравнение конструктивного метаболизма:

+ + ЬдАТФ ЬСНрО/д + (Ор-Ь)С0г + ОгС1А1НЙ +

+ + ~ (а2~а1 ^ ^ (16) Баланс ДЭ: ^) = Ьгь + га^с^-с^) (17)

Величина определяет эффективность конструктивного метабо-

гГ »

лиэма при ^ > -5е , обозначенную как Ус2:

При с^ > с^ Ус2 возрастает с увеличением р- до 1. Этот предел определяется уравнением; уЦЛ| - (19)

' гъ

Критерии для выбора формул расчета коэффициентов эффективности конструктивного метаболивма и их пределов. Определение

УС1 2 и должно состоять из следующих этапов!

1. Определение стехиометрических коэффициентов (табл. 9).

2. Сравнение сл и с^ при сл > с2~ формулы (18), (19);

при с^ < с?, ~ следующий пункт.

(¿* (С

3. Сравнение и 5е2; при < - формулы (13), (14);

„ <Г

при > - формулы (14), (28). 6.3. Энергетический метаболизм.

Генерация АТФ путем субстратного фосфорилированиядоноров электронов при окислении субстрата:

оСНл0|+ о<$)2+ ЬДАТФ —> ЬСНДЫ^ (а-Ь)С02+ ас^И^

н

+ (а-а1)(с?А£Нг - (л(+д(+др)АТФ) + (ас-а^с^тс^) - -р^НАШ^

Генерация АТФ в энергетическом метаболизме (коэффициенты согласно уравнения (25) указаны только перед АТФ):

А^Но + |о2 —> п^ск^АТФ

НАД^ + |о2 —> тЛас^-а^-с^) -

- 38 -

АгЛ2 + —> п^Со-а^с^АТФ

А*Н2 + 2°2 _> Субстратное

фосфораларование —> - д^д^+Лг,) АТФ

Бадане АТФ ЬдАТФ —> + +

+ + п^Сд. - {а-а1)(л(+л^й2)АТФ (21)

Прогнозирование эконоь-ических коэффициентов при известной эффективности фосфорилирования. Решив уравнение (21) относитель-

но получим значение Ус:

V п1с1 + * - < _™

с о, „ ^^ ^

4 + - (д{ ) + пп ^

Ддя конкретного пути метаболизма коэффициент дАТФ определяется из еледующзго уравнения:

дАТФ - дьАТФ + §- + ^ (д(+л1+йр)АТФ (23)

При помощи формулы (22) прогнозируется экономический коэффициент использования субстрата при известных значениях Р/О и ете-хнометртеских коэффициентов. Решение относительно п^ позволяет определить зффективность синтеза АТФ при окислении НАДН, если известен экономический коэффициент использования субстрата и эффективность синтеза АТФ при окислении прочих переносчиков электронов (п1). Аналогичным образом определяются коэффициенты Формула применима для случаев использования организмами органических субстратов в качестве источников углерода и энергии, кислорода в качестве конечного акцептора электронов, аммония в качестве источника азота, конечные продукты трансформации биомасса и улекислота.

6. 4. Анализ эффективности конструктивного и энергетического метаболизма метаниспольвущих бактерий. При монооксигенировании метана теряется половина доступных электронов этого субстрата, что

снижает значение в два раза (У^*- 0,94). Скорректированный относительно потери четырех доступных электронов молекулы метана энергетический выход (л) при росте метаниспользующих бактерий достигает 0,67-0,73, что превышает значения т? для 'такого "аффективного'1 субстрата, :сак глюкоза. Это позволяет предположить, что не вся энергия электронов, переносима на кислород при

монооксигенировании метана, окончательно теряется для клетки. Наиболее вероятный путь ее сохранения - превращение в электрохимический градиент при переносе электронов от А^^ к ШО.

Генерация трансмембранного протонного градиента при транспорте электронов от НАДН к мембранной ММО бала показана на клетках метаниспользукицих бактерий (см. главу 4). Другая возможность генерации энергии при монооксигенировании метана может реализоваться при сопряжении данной реакции с дегидрированием метанола, если метанолдегндрогенаэа и метанмонооксигеназа локализованы по разные стороны цитоплааматической мембраны. Вклад реакции моно-оксигенирования в энергетический метаболизм был продемонстрирован при выращивании метаниспользущих' бактерий на метаноле в присутствии субстратного аналога метана - этана или СО.

Эффективность гетеротрофной фиксации углекислоты. Рассчеты свидетельствуют, что' у метаниспользущих бактерий с гексулозо-фосфатным путем ассимиляции метана при >0 эффективность конструктивного метаболизма не зависит от уровня гетеротрофной фиксации углекислоты. Для бактерий с сериновым путем выгоднее фиксировать углекислоту, хотя эффективность конструктивного метаболизма повышается ва счет этого несущественно. Положительное влияние углекилоты на рост может объясняться снижением затрат энергии на поддержание заряда на мембране, рассеивающегося при выходе НСОд из клеток.

Моделирование процесса сопряжения окисления метана с генерацией энегии. Данных о механизме окисления метана недостаточно для определения эффективности его сопряжения с фосфорилированием АДФ. Поэтому правомочна обратная задача; используя данные об эффективности синтеза биомассы метаниспользущих бактерий определить механизм окисления метана.

Источник электронов для метанмоноокс11геназы. При НАДН-вави-•дазм окислении метана эффективность конструктивного метаболизма

(Ус) составляет 0,47. Более высокая эффективность роста может Сыть реализована только при сопряжении моноокеигенироваиия метана с дегидрированием метанола.

Реакции переноса электронов на кислород, сопряженные с синтезом АГФ. В литературе имеется достаточно много данных о том, что Ус при росте бактерий на метане достигает 0,63 и выше. Расчет показал, что генерируемого в этих случаях НАДН недостаточно для синтеза АТФ: если АТФ синтезируется только при окислении

НАДН, то значения Р/О должны составлять 3,1-3,5, что маловероятно. Наиболее реальным восстановителем, окисление которого должно быть сопряжено с синтезом АТФ, является простетическая группа ИНГ - Р0С*Н2 • Поскольку з рассматриваемых случаях Ус> 0,47, электроны от МНР должны участвовать в монооксигенировании метана и их перенос к ШО должен быть сопряжен с синтезом АТФ. Это может осуществляться путем создания трансмембранного градиента протонов при локализации ШО и ВДГ по разные стороны цитоплазматической мембраны;

Периплазма НСОН

2Н

Ыеыбрана

ВДГ —>2е —>

ШО

Цитоплазма

/Сн4 + 02

-2Н+

CHgOH

р--СНдОН

Если ММО получает электроны от НАДН, то при Yc около 0,47 не-оходим синтез 1,5 молекул АТФ при переносе пары электронов от ВДГ на кислород. Ддя этого терминальная оке ид аза должна функционировать как протонный насос. Если это невозможно, то тр&исмемб-ранный перенос протонов должен происхидить при при транспорте электронов от НАДН к мМШ,

ВЫВОДЫ

1.' Цэнооксигеназная реакция in vivo может обеспечиваться эиеигрокаыи как от НАДН (источник - форииат и формальдегид), так и от доноров с более положительным редоке-потенциалом, которыми являются прсстетическда группы метанолдегидрогенаэы и гидрокси-ламиноксидоредуктаэы.

2, Способность клеток окислять метан зависят от лаличия разницы потенциалов на цитоплазматической мембране, что предполагает протекание активного транспорта метана при его поступлении в клетку. При росте метаниспользуюцих бактерий в кислой среде Часть энергии метана тратится на поддержание равницы РН между цитоплазмой н внешней средой.

а В процессе окисления мотана протондвижущая сила генерируется при транспорте электронов от периплазматически расположенной метанолдегидрогенаэы к цитохромоксидазе (если метанмоноокси-геназа сопряжена с окислением НАШ, либо к мембранной

метанмонооксигенаэе. Транслокация протонов также происходит при транспорте электронов от НАИН через мембранные компоненты к мембранной метанмонооксигенаэе.

4. Совместная трансформация двух субстратов в процессе роста метаниспольэущих бактерий приводит к его подавлению (рост на метане + субстратный аналог), либо к его интенсификации (рост на метаноле + этан или СО). В последнем случае рост возможен благодаря сопряжению путей превращения двух субстратов, каждый из которых в отдельности не является ростовым (либо, в случае метанола, ассимилируется с низкой эффективностью). Данный тип кометаболиэма, отличительной чертой которого является более эффективное использование кометаболизируемых субстратов в энергетических и конструктивных процессах, назван синтаболизмом,

5. при ассимиляции метанола метанисполъзующими бактериями функционируют два механизма; монооксигеннрование неспецифичной метанмонооксигеназой и дегидрирование метанолдеги дроге назой. Блокирование метаимонооксигеназы ацетиленом может вызвать остановку роста из-за отсутствия альтернативных- мокооксигеназному механизму энергосопряженных систем переноса эжлекгронов на кислород (Methiiosinus trichasporium Ofîîb), либо стимуляцию роста в результате экспрессии таких систем ( Met hpl omanas rubra 15ut и Met hyl ococcus capsul at us 9Ю.

6. Определены уровни экономического коэффициента использования метана при синтезе биомассы, ограничивающее возможность сопряжения окисления метана с о|сислением НАДН (Ус - 0.4? для бактерий с рибулоэомонофосфатным путем ассимиляции метана и Yc - 0,41 - с сериновым). Более высокий экономический коэффициент указывает на сопряжение моноокисгеназной реакции с дегидрированием метанола метанолдегидрог е н азой. При экономическом коэффициенте Yc > 0,63 генерация необходимого для синтеза биомассы АТФ невозможна без сопряжения транспорта электронов к метанмонооксигеназе с синтезом АТФ. 1

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Малашенко И Р., Романовская К А., Соколов И. Г., Криштаб Т. п. О механизме соокислекия этана интакткыми клетками облигатных мети-лотрофов // Микробиология. - 1976. - 45, N6. - С. 1105-1107.

2. Roneriovskaya V. Д. , Ualashenko Yu. R, , Sokolov I. G. . Kryshtab T.P. the coirpetitive inhibition of the microbial oxidation of rretha-

гш by ethane // Microbial Production and Utilization of Gases / Eds. H. й Schlegel, G. Qottschalk, N. Pfennig. - G&ttingen, 1976. -P. 345-351 .

3. Romanovskaya V. A.. Malastienko Yu. R.. Lyalko V.I., Bogachenko V.N., Sokolov I.G. Involvment of ira thane-utilizing microorganisms In accumulation and recirculation of readily mobile carbon and nitrogen compounds in biosphere // Ecol. Bull. - 1977. - £5. - P. Б56-5&0.

4. Соколов I. Г.. Грищенко H. I., Щуроьа 3. E Трансформация минерального азоту обЛ1гатними метилотрофами // Ы1кроб1ол. журн. -1977. - 39, N4. - С. 473-479.

5. Налашенко tap., Соколов I.Г. Цро механ!зм сшвокислекня не-ростових субстрат! в у обл1гатних метилотроф^в // Ш Укр. б ¡ох 1м, 8'КЭД: Тез. доп. - Докецьк, 1977. - С. 130-131.

6. Ыааашенка К1 Р., Романовская В. А., Соколов И. Г. Вэ которые фи-виолого-биохимические особенности новых форм обдигатных метилотро-фов // Успехи микробиологии. - 1378. - 13. - С. 133-142.

7. Sokolov 1.0., Moutchnik F.V., Malashanko Yu.fi. Control mechanisns and siKwlattn of the process of bacterial oxidation of natural gas hydrocarbons // Abstr. 7th Intern. Synp. on Continuous Cultivation of Microorganisms, - Prague, 1978. - P. 93.

8. Romanovskaya V. A., Sokolov I.G. Characterization of hydroxyl-amine oxidase and methanol dehydrogenase from Methpiococcus therno-tMlus// Abstr. XII Congr. Microbiol. - Miinohen, 1978. - P. 125.

9. tfelashenko Yu. R., WDutchntk P. V., Sokolov I. Q. Regulatory mechanisms and simulation of the process of bacterial oxidation of natural gas hydrocarbons // Prepr. 1st Europ. Congr. Biotechnol. -Prankfurt/M, 1978. - Part 2. - P. 3/48.

10. Соколов Й. P., Малашенко Л P., Карпенко R К., Криштаб Т. П. Превращение субстратов, неиспользуемых для роста, иммобилизованными мет анокис ляодими бактериями // Укр. Оиохим. л<урн. - 1979. - 51, N4. - С. 383-399.

П. Мзладенко йР., Соколов И,Г., Романовская В.А., ИКурко Й.В. Элементы лктотрофного мегаболиама у обяигатного метидотрофа Meiftylo-COCCUS (ЛегиорШ us // Микробиология, - 1979.- 48, N4.- С. 592-598.

12. иадашенко Ю. Р., Романовская а А., Соколов К Г. Особенности метаболизма и управления ростом метанокислящкх бактерий // Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов, Штериалы симпозиума. - ПуВИНО, 1979. - а - £66-272.

13. Малашенко Ю. р., Романовская В. А., Соколов И. Г., Криштаб Т.И, Людвиченко Е. с. Ассимиляция углекислоту микроорганизмами при росте на различных субстратах. - Укр. биохим. журн. - 1990. - 52, N 2. - С. 159-163.

14. Криштаб Т.П., Соколов ИГ. ЬЬханизм иягибирования роста ме-танокислящих бактерий-// V съезд УЖ): Тез, докл. - Киев, 1980.- С. 44.

15. Соколов И. Г., Романовская R д., !14<урко Ю. Е , Малашенко Ю. Р. Сравнительная характеристика ферментных систем метаниепользующих бактерий,окисляющих NHgOH и СНдОН // Микробиология.- 1980.- 49. N2,-С. 202-209.

16. Соколов И. Г., Шсурко П R Особенности окислительного фосфо-рилирования у метаниспользукдах бактерий //VI с-ьезд ВМС* Тез. докл. - Рига, 1980. - Т. а - С. 87.

17. Романовская Е А. , Людвиченко Е. С., Соколов И Г., Малашенко Ю. Р. Фиксация молекулярного азота метано кисля шш ми бактериями. // Шкробиол. журн. - 1930. - 42, N б. - С. 683-683,

18. Романовская Е А., Людвиченко Е. С., .Криштаб Т.Е. Жуков Е Г., Соколов И. Г., Малашенко й Р. Роль экзогенной углекислоты в метаболизме метанокисляющих бактерий // Микробиология. - 1980, -49, N 5. - С. 687-694.

19. Sokolov 1. Q., Malashenko Yu, R. Peculiarities of electron transfer in nitrification of NH^ effected by methane-utilizing bacterium Met ftpf ecoccus t hermopht I us // Abstr. 3rd Intern. Symp. on Microbial Growth on C^ Compounds. - Sheffield, 1980, - P. 86-88.

20. Malashenko Yu. R., Sokolov I.G., Karpenko V.].. Romanovskaya V.A. Cometabolism of nongrowth substrates by free and immobilized cells of nwthane-oxidi2tng bacteria // Abstr. 3rd Intern. Symp. on Microbial Growth on Compounds. - Sheffield, 1980. - P. 92-95.

21. Sokolov 1. G., Moutchnik F. V., Malashenko Yu. R. Control mechanisms and simulation of the process of bacterial oxidation of natural gas hydrocarbons // Proc. 7th Intern. Symp. on Continuous Cultivation of Microorganisms. - Praha, 1980. - P. 527-534.

22. Соколов И. Г., Малашенко Ю. P., Романовская R А. Цепь транспорта электронов у термофильной метанокисляющей культуры Hethytococ-us thermophilus // Микробиология. - 1981. - 50, Н 1. - С. 13- 20.

23. Соколов И. Г., Романовская В. А. Роль углекислоты в конструктивном метаболизме микроорганизмов, растущих на углеродных субстратах различной степени восстановленноети //Теория и практика управляемого культивирования / Тез. III Всес. конф, - Киев, 1981. - Ч.

1. - С. 41.

£4. Мучник Ф. В., Малаше ¡¡ко ft Р., Соколов Я Г., Богачей го Е Н. Математическая модель трофических связей некоторых микробных ассоциаций // Микробные сообщества и их функционирование в почве / Ред. Е.И. Андреюк. - Киев: Наукова думка, 1981. - С. 69-75.

25. Романовська В.О., Соколов 1.Г., Малашенко Ю.Р, Pict метано-кислюючих бактер1й на с ум шах неростових субстрат! в // IV Укр. 6iOXiM. з* 1зд: Тез. доп. - Ки*в, 1962. - Ч 2. - С. - 163.

26. Соколов .Г. Г., Ледвиченко О. с. Вивчення деяких властивостей фермент1В катаболизму метану метанокислюючих OaKTepiit // IV Укр. 610Х1М. з'1зд: Тез. доп. - Кшв, 1982. -Ч 2. - С. - 185.

27. Ооколов I. Г., Романовська R0. Одержали я знергп метанокис-лшчими бактер!ями в процес! н1тр1фпсацп // IV Укр. OioxiM. з'1ад: Тез. доп. - Клав, 1982. Ч Z. - С. - IBS.

28. Шлашенко КХ Р,, Панцхава Е. с., Карпенко В. И., Романовская К А., Соколов И. р. Шкробиологические проблемы биотехнологии производства энергии и белка на основе целлюлозосодержащего сырья // Яс-ледование, проектирование и строительство систем сооружений метанового сбраживания навоза; Тез. докл. совещ, -Таллин, Шсква, 1932,- С. 37.

29. Gagarlna V. F. . Malashenko Yu. R.. Sokolov LG. Energy yeild variation during yeast growth on methanol with addition of NaHCO^ in nutrient madium// Abstr. XIII intern. Congr, Microbiol. - Boston, 1982. - P, 170.

30. Налашенко Id P., Хайер ft , Соколов И. Г., Боцелко С. ft., Романовская В. А. Метаболизм метанокисляюошх бактерий, выделенных из различных зкониш // Шкробиол. жури. - 1983. - 45, N 2. - С, 3-9.

31. SGkolov I.e., Qlkhovikova Е. L. Production of monooxygenase reaction products by methane-oxidizing bacteria'/ Abstr. . 3rd Symp. Soc. Countr. on Biotechnology. - Bratislava, 1983. - К A2-49.

32. G3garina V. A., Sokolov I.G., Pilyashenko A. I., Malashenko Yu. R. Growth thermodynamics of yeast Candida bertdinii on Single'and mixed carbon sources // Abstr. 3rd Symp. Soc. Oountr. on Biotechnology. - Bratislava, 1983. - N A4-21.

33. Соколов И. Г. Роль реакции мокоо кс иге н ирования в энергетическом метаболизме метанокислвщих бактерий // Микробиология и научно-технический прогресс: Тез. IV Респ. конф. молодых ученых., - Киев, 1983. - С. 138-139.

34. Пинчук Г. а , Соколов И. Г., Шатохина а С. Вопросы регуляции синтеза аминокислот аспарагинового ряда у Hethytococctts thermophil-

us // Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды: Тез. Мевдунар. сими. ФЕЮ. - Цущино, 1Э83. - С. 43-44.

35. Романовская Е А., Гринберг Т. А., Дурова 3. П., Еудкова Е, Н., Соколов И. Г. распространение и некоторые физиологические особенности термофильных метанокислящих бактерий // Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства: Tea. Всее. конф, -

- Москва, 1983. - С. 54.

36. Sokolov I. a Slgmficans of substrate roonooxygenation process m energy metabolism of methane-utilizing bacteria // Abstr. 4th Intern. Cortf. on Microbial Grorth on Cj Corpouns. - Minneapolis,

1983. - H 2-12.

37. Sokolov 1.6., Romarrovskaya V. A. HydroxyJamir» as a reducer source for hydrocarbon monooxygenation m Methylococcus themophilus // Abstr. 4th Intern. Oonf. on Microbial Growth on C^ Compounds. Minneapolis, 1983. - Session IX.

38. Malasbenko Yu. R., Pantskhava E. S., Karpenko 1 V, I., Romarrovskaya V. A., Sokolov I. a Microbial problems tn biotechnology and protein production on cellulose-containing row material // Abstr. 8th Intern. Spec. Synp. on Yeasts. - Borrbay, 1983. -,N A-201.

39. Mslashenko Yu. R., Chernyshenko D. V., Sokolov I. a Bacterial oxidation of methane, the cannel of atmospheric methane sink // Abstr. 3rd Intern. Synp. on Microbial ecology. - Michigan, 1983. -N A-3.

40. Соколов И. Г., Криштаб Т. П. Кометаболизм неростовых субстратов у метанокислящих бактерий // VI съезда УШ Тев. докл. - Киев: Наукова думка, 1984. - С. 88.

41. Romanovskaya V. А., Malashenko Yu.R., Grinberg Т. А., Sokolov I. Q. Use of mathemat i cal me thods dur 1 rvg the cult 1 vat i on of microorganisms // Proc, 3rd Eur. Congr. on Biotechnology. -mnchen, 1984. -Vol. 3. - P. 629-634.

42. Malashenko Yu. R., Sokolov I. a Syntabolism, the way of transformation of non-growth substrates up to blomass and secondary metabolites // Proc. 3rd Eur. Congr. on Biotechnology. - Milnchen,

1984. - Vol. a - P. 684-689.

43. Карпенко E И. , Соколов И. Г., Данько ЯН.,. Мохамед Э. -Е , Малашенко Ю. Р. Механизм регуляции получения метанола и этанола с использованием иммобилизованных метанокислящих клеток // Новые направления в биотехнологии: Тез. Всес. конф. - Пущино, 1984.- С. 120.

44. Соколов И. Г., Романовская Е А., Криштаб Т. П., Малатенко

Ю. Р. Управление процессом кометаболизма углеводородных субстратов у бактерий, усваиваюада метан //Микробиология, - 1934. - 53, N б. - С. 9D7-9ia

45. Криштаб Т. IL , Соколов И. Г. ЗнзиматическиА метод количественного определения уксусной кислоты в культуральной жидкости // ЫикроОиод. журнал. - 1985. - 47, N 1. - С. 86-88.

46. Романовская Е А., Соколов И. Г., Малашенко Ю. Р. сопряжение органотрофного и литотрофного метаболизма у метаниспользующих бактерий // Микробиология. - 1985. - 54. Ml. - С. 11-16.

47. Пинчук Г. Э,, Соколов И. Г., Щурова Э. П. Регуляция активности аспартаткиназы у метанокисляадей термофильной бактерии Het fiyl ococcus thermophtlus // VII съезда BMQ: Тез. докл. - Алма-Ата: Наука, J985. - Т. 2. - С. 117.

49. Sokolov I.a, Malashenko Yu.R, Sources of reducing equivalents for the monooxygenation reaction iri methane-oxidizing bacteria // Abstr. 5th Int. Symp. on Microbial Growth on C^ Compounds /Eds. J. A. Duine, H. B. van Verseveid. - Arreterdaim Free University , Press. 1986. - P. 179.

49. Sokolov i. G. The methane mmooxyienation reaction as the mechanism of electrons terminal acceptton coupled with energy generation // Abstr. 5th Int. Sytrp. on Microbial Growth on C^ Compounds / Eds. J. A.Duine, H.B.van Verseveid. - Amsterdam: Frse University Press, 1986. - P. 1E4.

50. Соколов И. Г. Сопряжение процесса транспорта электронов к метанмонооксигеназе с транслокацией протонов у метано кис ля шик бактерий // Микробиология. - 1986. - 55. N Б. - С. 715-722.

51. Соколов ЯГ., Пинчук Г.Э. Циклический механизм формирования протонного градиента у метанокисляющей бактерии Methytococctis ther-mofMlus // Проблемы современной биологии: Тр. 17 науч. конф. мол. ученых биол.фак. МГУ. ч. 1. - М., 1986. - С. 116-121. Дел. в ВИНИТИ 12.09.86, N 6642-В.

52. Пинчук Г. Э., Соколов И. Г, Регуляция синтеза аспартаткиназы При нерерывном культивировании облигатных метанокислящих бактерий Metfiyiococcus tternopfttlus // Управляемое культивирование микроорганизмов; Тезисы IV Всес. конф. - Пувдно, 1986. - С. 151.

53. Соколов И. Г. Кометаболизм и синтаболиэм неростовш субстратов у метано кислящих бактерий // Физиология, генетика и биохимия метилотрофных микроорганизмов: Тр. конф. мол. ученых Ин-та микробиологии и вирусологии АН УССР. - Киев: СОГО УССР, 1966. - С. 39-54.

54. Пинчук Г. Э., Соколов К. Г. Механизм ингибирования роста tfet-hllococcus thermophUus аминокислотами аспартатного семейства // Физиология, генетика и биохимия метилотрофных микроорганизмов: Тр. конф. мол. ученых Йн-та микробиологии и вирусологии АН УССР. - Киев: ООГЮ УССР, 1986. - С. 96-105.

55. Малашенко КХ Р., Соколов И. Г., Романовская В. А. Микробный метаболизм неростовых субстратов. - Киев: Наукова думка, 1987. - 192с.

56. Малашенко КХ Р., Соколов Я. Г., Криштаб Т. П. Источники восстановительных эквивалентов для монооксигенирования углеводородов в клетках метанокисляющих бактерий. - Микробиология, 1987. - 56, N 3.

- С. 374-380.

57. Малашенко Id Р., Пинчук Г. Э,, Соколов И. Г. Регуляция активности аспартаткиназы Methplococcus t hermophiI us аминокислотами ас-партатного семейства // Микробиология. - 1987. - 56, N5. - С. 740- 745.

58. Пинчук Г. Э., Щурова 3. п., Шатохина з. с., Можилевская JL П., Соколов И. Г., Малашенко d Р. Характеристика роста метанокийлявдих бактерий Msthylococcus thermophllus в присутствии аминокислот аспартатного семейства // Микробиология, - 1987.- 56, N4. - С. 621-625.

59. Соколов I.P. Проблеми енергетичного метабол1ему у метано-кислшчих бактер1Й // V Укр. 6ioxfм. э'тзд: Тез. доп. - кшв, 1987.

- Ч. 1. - С. 143.

60. Романовская Е А., Власов Д. С., Соколов Л Г.. Князева JL С. Поглощение протонов клетками Het hp£ ococcus coasuI at us при субстратном голодании // Ыикробиол. журн. - 1988. - 50, N 3. - С. 20-23.

61. Власов А. С., Чувалдина м, Е., Соколов И. Г., Кункцина 3. Т., Романозская ЕА. Трансформация неростовых субстратов клетками Methyl ococcus capsulatus // Микробиол, яурн.- 1988.- 50, К 4. - С. 8-12.

62. Соколов И. Г. Реакция моиоокисгенирования как сток электронов метанола у метанокисляших бактерий // Микробиология. - 1988. -57, К 5. - С. 716-72а

63. Пинчук Г. Э., Соколов И. Г., Мучник Ф. а , Малашенко КХ Р. Анализ регуляции синтеза ферментов у микроорганизмов при непрерывном культивировании // Редкол. "Микробиол. журн.- Киев, 1989. -7 с.-Деп. В ВИШИ 25.11.88, N 8338-В88.

64. Ptnchuk G. Е., Sotolov ]. й , Malashenko Yu. R. Merrbrane potential-dependent msthane uptake by Hethyiococcus thermophilic cell" ff Abstr. 6th intern. Syitp, on Microbial Growth on C^ Compounds. - Gottingen, 1989. - К P-440.

65. Sokolov I. a Prediction of етегКУ transduction in methane-

oxidizing microorganisms // Abstr. 6th Intern. Syrtp. on Microbial Growth on Cj Compounds. - Qottingen, 1989. - N P-450.

66. Соколов К. Г., Столяр С. М., Криштаб Т. П., Пинчук Г. Э. Роль метан моноокс иге наэ и при ассимиляции метанола метанокислающими бактериями // Никробиол. журн. - 1989. - 51, N 2. - С. 38-46.

67. Pinchuk й Е., Sokolov I. а . Muchnik f. У., Malashenko Y. R. The analysts of aspartate kinase synthesis regulation in Met ftjil ococcus t hermopht I us bacter i utn by mathemat i cal mode 1 ft Abstr. Intern. Synp. INTERBIOTECH'89. - Bratislava, 1989. - P. 122.

' 68. Соколов И. Г. Генерация энергии у метанокисляющих микроорганизмов // VII съезд УЮ: Тез. докл. - Киев, Черновцы, 1989. - Ч. 1. - С. 66-87.

69. Соколов И. Г., Столяр С. и.. Криштаб Т. а , Кушнир & Е Роль метанмонооксигеназы при росте метанокислящих бактерий на метаноле // VII съезд УМО:Тез.докл.- Киев, Черновцы, 1969.- Ч. 1.- С. 87-88.

70. Pinchuk G. Е., Sokolov I.G.. Muchntk Г. V.. Malashenko Y. R. The analysis of aspartate kinase synthesis regulation in Methiitococcus ihereophiltts bacterium by mathematical model // Progress in Biotechnology: Proc. Intern. Symp. INTERBIOTECH'89. -Netherlands: Elsevier, 1990. - Vol. 6. - 6 p.

$>opuatjii>' Ji^Бумаге fM глу.Г Уч.-нэд, л. ¿t- Тиражу»

Подл. к неч. i, it $О Печ. офс. Усл. Ибч. л / За к (>• iS^Sj. Бесплатно,

Киевская кннжная ih nor рафия научной книги. Киев, Репина, 4.