Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пост-трансляционная модификация жирными кислотами а-субъединиц гетеротримерных ГТФ-связывающих белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пост-трансляционная модификация жирными кислотами а-субъединиц гетеротримерных ГТФ-связывающих белков"

Р ^ ^ >^КОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _ ^ ^дЭД им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.155.2

ДЕГТЯРЁВ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ Пост-трансляционная модификация жирными кислотами а субъединиц гетеротримерных ГТФ-свяэывающих белков

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова в сотрудничестве с Национальным Институтом Здоровья. Бетезда, Мэриленд, США.

Научный руководитель - ведущий научный сотрудник.

доктор биологических наук А.А.Колесников Официальные оппоненты - ТКАЧУК Всеволод Арсеньевич

доктор биологических наук ВОЕЙКОВ Владимир Леонидович кандидат биологических наук

Ведущая организация - Институт Биоорганической химии РАН

им. М.М.Шемякина

Защита диссертации состоится __1995 г.

в __/^2час. на заседании специализированного Совета Д.053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу; 119899, Москва. МГУ. биологический факультет.

Автореферат разослан " 1995 г.

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук

, ВЛ.Каграманов

Актуальность проблемы: Нобелевская Премия по медицине и физиологии за 1994 год была присуждена Альфреду Гилману и ДОартинУ -Родбеллу (Alfred Gilman, Martin Rodbell). двум американским учёным-первооткрывателям роли гетеротримерных регуляторных ГТФ - связывающих белков (G-белков) в процессе передачи сигнала через мембрану. Такое внимание международной научной общественности к их работе обусловлено центральной ролью открытых ими белков в этом процессе.

Прикрепление G-белков к специфическим участкам клеточных мембран является, критическим для всего процесса передачи сигнала сквозь мембрану, который включает в себя взаимодействие G-белков со связанными с мембранами рецепторами и эффекторами. Общий механизм прикрепления G-белков к мембране являлся предметом пристального изучения в последние годы, и было предположено, что главную роль в этом процессе может играть пост-трансляционная модификация этих белков. Гетеротримерные регуляторные ГТф-связывающие белки состоят из трёх субъединиц разного размера и происхождения : а. Р и у. Известно, что некоторые а субъединицы G-белков подвергаются пост-трансляционной модификации жирной кислотой - миристоилированию. Однако, было предположено,, что одного миристоилирования недостаточно для прочного взаимодействия с мембраной, что также подтверждается фактом, что немиристоилированные a субъединицы взаимодействуют с мембраной без помощи этой модификации.

Другим фокусом исследований являлся вопрос, какие домены а субъединиц вовлечены в связывание с мембраной. Так, было предположено, что некоторые домены as субъединицы,

активирующей аденилатциклазу. возможно, важны для мембранного взаимодействия.

Цель и задачи исследования: Основной целью настоящей работы являлось изучение пост-трансляционной модификации а субъединиц как части механизма прикрепления К мембране. Для этого планировалось изучить возможную роль в этом процессе различных факторов : ру субъединиц, отдельных доменов а субъединиц, а также - пост-трансляционной модификации а субъединиц. Основное внимание предполагалось уделить изучению модификации а субъединиц пальмитиновой кислотой. В связи с ЭТИМ ставились следу ощие экспериментальные задачи: . 1 =

1. Создать химерные белки и анализировать их свойства для выяснения роли отдельных доменов а субъединиц в ассоциации с мембраной.

¿. Провести метаболическое мечение [Зщпальмитиновой кислотой клеточных линий COS и S49 и провести анализ субклеточных фракций с помощью иммунохимических методов на предмет включения радиоактивной метки в а субъединицы G-белков.

3. Охарактеризовать свойства пальмитоилирования а субъединиц : химический анализ, сайт модификации, обратимость, возможность регулирования, отношение к миристоилированию. взаимодействию а субъединиц с рту субъединицами и мембраной.

Научная новизна и практическая ценность работы: В настоящей работе впервые была показана и охарактеризована новая пост-трансляционная модификация а субъединиц гетеротримерных ГТф-связывающих белков жирной кислотой - пальмитоилирование. Определены сайты данной модификации на молекулах а субъединиц. На основе полученных данных предложена модель

функционирования О-белкоз с учйтом процесса пальмитоилирования как обратимого и регулируемого механизма прикрепления а субъеднниц к мембране.

Апробация работы: Представленные в диссертации результаты докладывались на Симпозиуме ТТФ-связывающие белки и проведение сигнала" на 650м Ежегодном Конгрессе Американского Общества Биохимии и Молекулярной Биологии 21-25 мая 1994 года. Вашингтон. Дистрикт Колумбия. США.

Материалы и методы: Использованные в работе мутантные а субъеднницы были получены с помощью полимеразной цепной реакции. кДНК в составе соответствующих векторов были трансфецированы в COS клетки. Либо трансфецированные, либо интактные COS и S49 клетки метились {Зщмиристиновой или l^H)пальмитиновой кислотой. Клеточные фракции иммунопрсципитировалнсь с использованием специфических к различным а субъединицам антител.

Результаты н их обсуждение:

1 Роль отдельных доменов а5 субъеднниц в ассоциации с мембраной.

Мы исследовали возможную роль в этом процессе некоторых доменов as субъеднницы. а именно: TENIR последовательность в карбокси-концсвой части молекулы и последовательностей, вовлечённых во взаимодействие с аденилатциклазой.

Оказалось, что ни TF.NIR последовательность, ни участки взаимодействия с аденилатциклазой. не оказались важными для прикрепления as субъединицы к мембране.

2 Метаболическое мечение rcs.

COS клетки были трансфецированы либо вектором, либо кДНК для длинной формы asl и были мечены [35з]метионином и [3Н]пальмитиновой кислотой. После этого клетки были фракционированы на мембранную и цитозольную фракции центрифугированием. После иммунопреципитации [35з]метионин-меченных клеток с RM антителами и разделения на SDS-ПААГ, обе эндогенные формы as (длинная и короткая), являющиеся продуктами альтернативного сплайсинга одного гена, видны как полосы примерно 44 и 48 кДа в мембранных фракциях (Рис.1А:3). Неспецифичный IgG не преципитировал а5(Рис.1 А: О. В клетках, трансфецнрованных asl кДНК, увеличенное количество белка было обнаружено в составе 48 кДа полосы в мембранной фракции и небольшое количество в цитозольной фракции (Рис.1 А: 5 и 6). что соответствует экспрессии asl белка. Иммунопреципитация COS клеточных фракций после инкубации с [Зн]пальмитиновой кислотой показала включение радиоактивной метки в эндогенные и экспрессированные после трансфекции os белки в мембранных фракциях (Рис. 1 Б; 3 и 5).

3 Характеризация и идентификация включения радиоактивной метки после мечения клеток (Зн]пальмитиновой кислотой.

COS клетки, трансфецированные as. были обработаны средой в присутствии или отсутствии циклогексимида, а затем инкубированы с 135в]метионином и [Зн]пальмитиновой кислотой, разделены на субклеточные фракции и иммунопреципитированы. Циклогексимид предотвратил включение [3551метионина в as, что отражает остановку белкового синтеза, но значительно не изменил включение (Зщпальмитиновой кислоты, то есть этот процесс

4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

А

З53 _ СЭ «*»• с» >8,л «да ^ ^

СЭ г?» -

Зн

СГ» «Я» «г» <2Т>

фракция МЦ МЦМЦ МЦМЦМЦ трансфекция в в св| СЗА аз! СЗА

J | «в!_аэ! |

антитела • |дС ЯМ ЯМ

Рис.1 Субклеточное распределение и метаболическое мочение ав белка и его мутантов. Условные обозначения'- В -вектор, М - мембранная и Ц - цитозольная фракции, 35э -[358]метионин, Зн - [Зн]пальмитнновая кислота.

является пост-трансляционным. Чтобы исследовать тип химической связи остатка {Зщпальмитиновой кислоты с «5. полосы БОБ-ПААГ после разделения иммунопреципитированных образцов из мембранных фракций СОБ клеток, меченных [Зщпальмитиновой кислотой, были обработаны при рН 7,5 гидроксиламином или Тп$-НС1. Интенсивность мечения ав полос после обработки гидроксиламином почти полностью исчезла, что отражает тиоэфирный характер связи. Обработка основанием и в гораздо меньшей степени обработка кислотой экстрагировали продукты, эмигрирующие со стандартом [Зщпальмитиновой кислоты на пластинках тонкослойной хроматографии.

4 Экспрессия СЗАа$ мутантов.

Мы проверили гипотезу, что Цис-3. третий остаток от амино-конца. может служить сайтом пальмитоилнрования. Для ответа на поставленный вопрос мы мутировали Цис-3 на аланин в диком типе а8 и в конститутивно активированном мутанте а*$ (СЗАав и СЗАа^. соответственно). Рис.!А демонстрирует экспрессию каждого из трансфецированных в СОБ клетках ав белков в виде увеличенной интенсивности -48 кДа полосы в мембранных фракциях поело иммунопреципитацин 1358)метионин-меченых клеток. Флюорограмма иммунопреципитированных фракций клеток, меченных (Зщпальмитиновой кислотой, демонстрирует включение метки в эндогенные белки, а также в экспрессированные белки дикого типа и активированного а* белков <Рис.1Б: 3. 5 и 9). Иммунопреципитацин обоих СЗА мутантов оказались абсолютно идентичными вектор-трансфецированным клеткам с включением тритиевой метки только в эндогенные белки (Рис.)Б: ср. 7 и 11 с 3).

6

Было замечено, что включение остатка [Зщпальмитиновой кислоты было пропорционально количеству экспрессированного белка, кроме С ЗА мутантов, которые не показали увеличения включения тритиевой метки сверх уровня эндогенных белков, несмотря на то что мутанты при этом были экспрессированы з количестве, несколько раз большем, чем эндогенные белки. Таким образом, Цис-3. вероятно, является сайтом пальмитоилирования.

5 Обратимость пальмитоилирования.

Мы исследовали регуляцию пальмитоилирования и оборот остатка пальмитиновой кислоты, включённого в состав а$ субъединнцы. на нативных клетках без сверхэкспрессин белков. Пульс-чейз эксперименты были проделаны на СОБ клетках, метаболически меченных либо [35$]метионнном. либо [Зщпальмитиновой кислотой. Оборот остатка пальмитиновой кислоты на обеих формах аз субъединицы (длинной и короткой) был примерно одинаковым с ц/г = 50 минут. Этот, оборот был значительно быстрее оборота белка, показавшего ц/2 = 840 минут для короткой формы и ц/2 = 380 минут для длинной формы.

6 Стимуляция изопротеренолом.

СОБ клетки обрабатывались р-адренергическим агонистом изопротеренолом в присутствии радиоактивной [Зщпальмитиновой кислоты. Иммунопрсципитация а» белков показала быстрое увеличение мечения [Зщпальмитиновой кислотой в присутствии изопротеренола в сравнении с контрольными клетками (Рис.2). Обработка изопротеренолом нэ изменила локализации а8 субъединиц в мембранной фракции или количества иммунопреципитированных

6 10 1520 25 30 35 115120 время (мин.)

+ISO

■45

-ISO

45

2 5 15 30 120 время (мин.)

Рис.2 Мочение а» субъединицы [Зщпальмнтниовой кислотой в присутствии изопротеренола. Условные обозначения: ISO - изопротеренол. пустые символы - инкубация без изопротеренола. заполненные символы - инкубация с 10 мкМ изопротеренола. круги - длинная форма о,, квадраты - короткая форма 4S - позиция 45 кДа маркёра.

8

<х$ белков, как было определено иммуноблоттингом. Так как общее количество а4 белков оказалось неизменным, увеличенное включение тритиевой метки представляет большую фракцию подвергшуюся пальмитоилированию. Интересно отметить, что длинная форма аз продемонстрировала большее по отношению к короткой форме пальмитоилирование после стимуляции агонистом, особенно на ранней стадии. Различия о базальном пальмитоилировании отражают большее количество короткой формы PJ в этих клетках.

Ряд экспериментов был проведён для определения, вызван ли наблюдаемый эффект регуляции пальмитоилирования агонистом специфической стимуляцией рецепторов. Так например, пальмитоилирование а$ показало концентрационную зависимость от изопротеренола. Обработка пропранололом, р-адренергическнм антагонистом, не изменила базального уровня пальмитоилирования . но затупила кривую пальмитоилирования а5 в присутствии изопротеренола, если пропранолол был добавлен на 2 минуты позже изопротеренола. Ни дибутирил-цАМФ, стабильный аналог цАМФ. ни совместная обработка форсколином и 1ВМХ, прямым активатором аденилатциклазы и ингибитором цАМФ 'фосфодиэстеразы, соответственно, не изменили степень пальмитоилирования а8. Следовательно, стимулированное пальмитоилирование не является следствием повышенного внутриклеточного уровня цАМФ после активации р-адренергического рецептора.

Неспецифическое увеличение пальмитоилирования других мембранных белков нзопротеренолом не было замечено, как не было отмечено изменения в пальмитоилировании оц субъединицы, которая не взаимодействует с (5-адренергическим рецептором.

7 Uncoupled и H21a мутанты а$в549 лимфомных клетках.

Клетки дикого типа S49 лимфомы продемонстрировали такое же увеличение мечения а8 [ЗН]пальмитиновой кислотой при стимуляции изопротеренолом, как и COS клетки, с той лишь разницей, что ответ был гораздо более быстрым с достижением максимального уровня мечения к 2-5 минутам. as субъединицы в unc (uncoupled) мутанте S49 клеток не способны взаимодействовать с p-адренергическим рецептором. Н21а мутант as в S49 лимфомных клетках способен связываться с p-адренергическнм рецептором и обменивать гуаниловые нуклеотиды. но специфическая мутация в этом белке не позволяет ему формировать активную конформацию и диссоциировать от Ру субъединиц. Оба мутанта показали схожий с диким типом S49 клеток уровень пальмитоилирования. но ни один из них не продемонстрировал стимулированное изопротеренолом пальмитоилирование as. Результат с unc мутантом указывает на то. что стимулированное пальмитоилирование as не является результатом активации p-адренергического рецептора как такового.

a

Результаты с Н21а as мутантом подсказывают очень важный вывод, что агонист-индуцированное пальмитоилирование не является следствием прямого взаимодействия с рецептором, а происходит после принятия а субъедииицей активной конформации и диссоциации от Ду субъединиц.

8 Обработка Холерным токсином.

Холерный токсин вызывает активацию а$ субъединицы путём её АДФ-рибознлировання. Прединкубацня COS клеток с холерным

10

токсином с последующей обработкой [Зщпальмитиновой кислотой вызвали увеличенное пальмитонлнровэние сц.

9 Депальмитоилирование а® субъедиииц.

Так как пальмнтоилирование - это обратимый процесс, то описанные нами результаты по увеличенному включению метки после инкубации с [Зщпальмитиновой кислотой и стимуляции р-адренергического рецептора агонистом изопротеренолом могут, на самом деле, быть объяснены двумя причинами. Первое, то что при этом происходит пальмнтоилнрование немоднфицированной а3 субъединнцы, второе, что происходит депальмитоилирование а$ с последующим палшитоилированием.

Чтобы проверить вторую гипотезу, мы провели пульс-чейз эксперимент, в котором 549 клетки дикого типа были помечены а течение короткого промежутка времени [Зщпальмитиновой кислотой, а затем проинкубированы в среде с сывороткой без радиоизотопа в присутствии или отсутствии изопротеренола. Инкубация в среде с изопротеренолом привела к гораздо более быстрой потере остатка (Зщпальмитиновой кислоты а$ белком. Из этого можно заключить, что при стимуляции рецептора и активации в5 субъединицы происходит быстрая потеря остатка пальмитиновой кислоты (депальмитоилирование).

10 Пальмитоилированне миристоилированных а субъединнц.

С08 клетки были трансфецированы плазмидами, содержащими кДНК дикого типа ал субъеднницы и её мутантной формы с замещённым цистеииом-3 на аланнн (СЗАсп). Иммунопреципитация показала включение метки в обеих мембранной и цитозольной

II

фракциях. Мечение клеток [Эщпальмитиновой кислотой показало, что дикий тип ан белка подвергается пальмитоилированию. а СЗАап мутант - нет. То есть сайтом данной модификации, как и в случае субъединицы, скорее всего, служит остаток цистеина в позиции 3.

11 Внутриклеточная локализация СЗАац белка.

Чтобы определить роль пальмитоилирования в мембранной ассоциации, мы сравнили субклеточное распределение ац белков дикого типа, непальмитоилированного СЗА мутанта и немиристоилированного ОА мутанта с заменой глицина-2 на аланин. Белок дикого типа располагался практически целиком в мембранной фракции, а вА мутант - практически целиком в цитозольной фракции (Рис.3). Распределение СЗА мутанта было промежуточным: приблизительно 2/3 экспрессированного белка было обнаружено з цитозольной фракции (Рис.3).

12 Свойства непальмитоилированного СЗАап мутанта.

Мы исследовали способность непальмитоилированного СЗАап мутанта формировать гетеротример с ру субъединицами с помощью реакции АДФ-рибозилирования. катализируемого коклюшным токсином. а субъединица может служить субстратом АДФ-рибоэнлировання только тогда, когда она связана с р? субъединицей в составе гетеротримера. Клетки, экспрессирующие непальмитоилированный СЗАап мутант, показали сравнимую с контрольными клетками (вектор-трансфецированными) степень АДФ-рибозилирования. Так как довольно.значительное количество СЗА белка находится в мембранной фракции (Рис.3), из последнего

12 .

1 2 3 4 5 6 7 8

45— ,

«етг».....- ■ют^'ОЖ^ .........

фракция ,м ЦПМ Ц|(М Цмм Ц, трансфекция в ДТ СЗА GA

Рис.3 Субклеточное распределение ail белка и его мутантов после экспрессии в COS клетках, условные обозначения: В - вектор. ДТ - дикий тип. М - мембранная и Ц - цнтозольная фракции. 45 - позиция 45 кДа бал косого маркёра.

13

результата можно сделать предположение, что большинство С ЗА белка в этой фракции не способно взаимодействовать с Ру субъединицами и служить субстратом для коклюшного токсина. Что касается цитозольной фракции, то СЗА белок в цитозольной фракции являлся функционально активным, то есть был способен связываться с ру субъединицам с высоким сродством, как и белок дикого типа.

Для проверки конформации непальмнтоилированного СЗА балка в мембранных фракциях были проделаны эксперименты по гидролизу трипсином в присутствии и отсутствии ГТФуЗ. Нелальмитоилированный СЗА мутант в мембранной фракции полностью деградировался трипсином с присутствии ГТфуЗ. Нз этого можно предположить, что данный белок не способен связывать гуаниловые нуклеотиды. и поэтому не является устойчивым к протеолиэу трипсином. Цитозольный аналог СЗА мyтaнfa при этом был полностью активным.

Мы также исследовали солюбилизационные свойства СЗА мутанта в мембранной фракции. В то время, как большинство эндогенных белков и ал дикого типа были солюбилиэированы детергентом Тритон Х-100. СЗА мутант был практически несолюбилизируемым. Эти результаты указывают на возможную агрегацию СЗА мутанта после его экспрессии на мембране.

13 Коэкспрессия ру субъединиа

Так как. трансфекция а субъединиц приводит к экспрессии а субъединиц в молярном избытка по отношению к субъединицам. мы решили проверить, еоз?ложно ли предотвратить агрегирование непальмнтоилированного СЗАсец мутанта на мембране путём его

экспрессии совместно с Ру субъединицами (коэкспрессия). После котрансфекции в COS клетках с pi и у2 субъединицами, приблизительно 2/3 СЗА белка теперь было ассоциировано с мембраной. При АДФ -рнбоэилировании мембранной фракции клеток, экспрессирующих СЗА мутант вместе с Ру субъединицами, было замечено существенное увеличение сигнала по сравнению с клетками, экспрессирующими только СЗА белок. Это увеличение было редуцировано на 75JS. если мембранные фракции перед реакцией АДФ -рибозилирования были прединкубированы с ГТфу5. Это говорит о том. что после экспрессии с Ру субъединицами СЗА мутант находится на мембране с составе функционального гетеритримера и способен связывать гуаниловые нуклеотйды. Суммируя полученные результаты, можно сделать важное заключение, что непальмнтоилированный СЗАац мутант может формировать функциональный гетеротример с Ру субъеднницами на мембране.

14 Пальмитоилирование немиристоилированного GAocn белка.

Так как миристоилирование происходит котрансляционно в цитозоле, а пальмитоилирование - пост-трансляционно на мембране, вчжно ответить на вопрос, является ли миристоилирование необходимой предпосылкой пальмитоилирования? Очевидно, для немирнстонлированных белков, к которым относится а$. этот вопрос неактуален. Исходя из факта, что немиристоилироваиный GAaii белок оказывается практически целиком в цитозоле. может сложиться впечатление, что на поставленный вопрос можно ответить положительно. Однако, пониженное сродство этого белка к ру субъединицам не должно упускаться из виду. В связи с этим, мы решили компенсировать низкое сродство этого белка к ру

субъединицам увеличением их внутриклеточной концентрации путём их коэкспрессии. Так, экспрессия GAan в COS клетках вместе с Ру субъединицами привела к небольшому количеству GAaii белка, локализованного на мембране (Рнс.4: В). Иммунопреципитация мембранных фракций COS клеток, экспрессирующих GAaii белок совместно с Ру субъединицами и меченных [Зщпальмитиновой кислотой, продемонстрировала пальмитоилирование GAaii белка (Рис.4: а). Пальмитоилирование и мембранная локализация GAaji субъединицы зависели от количества трансфецированных р и у плазмид (Рис.4: Б и в). Пальмитоилирование GAaji белка не наблюдалось, когда он был экспрессирован сам по себе, с р и у плазмидами по отдельности, или с нормальной р и мутантной у субъединицей, которая не подвергается изопренилированию и мембранной локализации. Мембранные фракции клеток, экспрессирующих GAaii белок совместно с ру субъединицами, показали очень незначительное увеличение АДф-рибозилирования по сравнению с клетками, экспрессирующими только вектор или GAaii белок. Из этого можно предположить, что несмотря на то, что GAaii белок ассоциирован с мембраной и был. вероятно, доставлен к мембране с помощью и через взаимодействие с ру субъединицами, он находится в состоянии, свободном от ру субъединиц, и прикреплён к мембране исключительно через остаток пальмитиновой кислоты. Следовательно, миристоилирование не является необходимой предпосылкой для пальмитоилирования. а служит необходимым элементом третичной структуры а субъединиц миристоилированной подгруппы, обеспечивая.высокое сродство к Ру субъединицам, играющим важную роль прикрепления а субъединиц к мембране до того, как они подвергаются лальмитоилированию.

А 45-

■ -- - ee

ру коэкспрессия ,— -f-fl— +,,— + трансфекция в ДТ GA

Б 45 —

сгэ '

В 45 —

—- «»*- иве

ру коэкспрессия 0 5 -jg ^ (мкг кДНК)

Рис. 4 Мембранная згоиоянзация и пальмитоилнрованне дикого типа и немиристоилированиого GA мутанта ац бэлкз после их коэкспрессии с 0у субъединицами о COS клетках. Условные обозначения: В - вектор, ДТ - дикий тип, 45 - позиция 45 кДа белкового маркёра. А. Б - мечение [3Н]пальмитиновой кислотой. В - иммуноблоттинг мембранных фракций. Б и В - трансфекция GA мутанта оц с различными концентрациями кДНК ру субъединиц.

17

IS Обратимость пальмитоилирования ~ присутствии ру субъединиц.

Для определения скорости оборота пальмитоилирования мы провели пульс-чейз эксперименты с [Зщпальмитиновой кислотой на COS клетках, трансфецироьанных с GAaii + Py. диким типом «п*Ру и диким типом отдельно. GAaii белок продемонстрировал очень быстрый оборот с ti/2 = 13 мин. по сравнению с 11 /2 = 41 мин. для дикого типа ail и ц/2 = 52 мин. для дикого типа ац+ру.

Оборот пальмитоилирования также определялся путём мочения клеток [Зщпальмитиновой кислотой в зависимости от времени как обмен нерадиоактивного материала на радиоактивный. Например, для 20 минут инкубации величина мечения для дикого типа aii + Py была 73%+/-8% от величины пальмитоилирования дикого типа ail без Ру.

Меньшая скорость оборота пальмитоилирования в случае an белка дикого типа, экспрессированного вместе с Ру субъединицами, может означать предохранение a субъединиц ру субъединицами от депальмитоилирования. В подтверждение к этому, следует отметить очень быстрый оборот пальмитоилирования немиристоилированного GAaii белка, обладающего низким сродством к ру субъединицам.

Выводы:

I. Было показано, что ни TENIR последовательность (остатки 369-373), ни участки взаимодействия as субъединицы с аденилатциклазой, не оказались важными для прикрепления as субъединицы к мембране.

2. Показана и охарактеризована новая пост-трансляционная модификация а субъединиц - пальмитоилирование. о^ и оц субъединицы, эндогенные и экслрессированные в эукариотических клетках, подвергались радиоактивному меченига при инкубации клеток с [Зн]пальмитиновой кислотой. Химический анализ иммунопреципитированных образцов показал включение в состав бёлков остатка пальмитиновой кислоты.

3. Пальмитоилирование а субъединиц происходит только на мембранах, является обратимым и пост-трансляционным, то есть не зависит от процесса синтеза белка. Присоединение остатка пальмитиновой кислоты осуществляется через тиоэфирную связь с аминокислотным остатком цистеина-3 для осе и с^ субъединиц.

4. Как обратимый процесс, пальмитоилирование подвергается регулированию. Нами было показано, что активация субъединиц рецептором при стимуляции агонистом приводит к увеличению скорости обратимости пальмитоилирования. Анализ этого процесса показал, что при этом происходит депальмитоилирование а8 субъединиц (активированных ГТф-связанных и свободных от субъединиц) с их последующим быстрым пальмитоилированием.

5. Для а! субъединицы была показана двойная липидная модификация - миристоилирование и пальмитоилирование, происходящие на соседних аминокислотных остатках: глицине-2 и цистеине-3, соответственно. Эти две модификации являются независимыми друг от друга. Пальмитоилирование оказалось необходимым и достаточным условием для прикрепления 0| субъединиц к мембране в функциональном состоянии. Одного миристоилирования для этого недостаточно. Большая часть непальмитоилированного, но миристоилированного мутанта

находится в цитоэоле. а остальная часть агрегирует на мембране в нефункциональном состоянии. Немиристоилированный мутант может быть ассоциирован с мембраной и пальмитоилирован только при совместной экспрессии с Ру субъединицами. Была также показана возможность формирования функционального гетеротримера с Ру субъединицами на мембране для непальмитоилированного мутанта. Таким образом, миристоилирование является частью структуры ai субъединицы, ' благоприятствующей взаимодействию с ру субъединицей, которое позволяет доставлять ai субъединицы на мембрану, где пальмитоилирование играет роль "якоря" при поддержании на мембране ai субъединицы, свободной от Ру.

6. Ру субъединицы обладают способностью предотвращать или замедлять депальмитоилирование a субъединиц, поддерживая их в гетеротримерном состоянии, вероятно, неблагоприятном для фермента протеин-пальмитоил эстеразы.

7. На основании полученных результатов предложена модель функционирования G-белков с учётом новой пост-трансляционной модификации обратимого и регулируемого пальмитоилирования a субъединиц.

Список работ по материалам диссертации:

h Degtyarev, M.Y., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. The G protein as subunit incorporates [^HJpalmitic acid and mutation of cysteine-3 prevents this modification. Biochemistry 32, 8057-8061, 1993

2. Degtyarev, M.Y., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. Increased palmitoylation of the Gs protein a subunit after activation by the p-

adrenergic receptor or cholera toxin. J. Biol. Chem. 268, 23769-23772, 1993

3. Degtyarev, М.У., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. The membrane localization of the G protein as subunit is not dependent on its TENIR

'sequence or effector domain. Cellular Signalling 6 (1), 25-33, 1994

4. Degtyarev, M.Y., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. Palmitoylation of a G protein ai subunit requires membrane localization not myristoylation. J. Biol. Chem., 1994, .

5. Degtyarev, M.Y., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. Rapid increase in palmitoylation of the G protein as subunit after ^-adrenergic receptor activation. Mol. Biol. Cell Abstr. (приложение) 4:237a, 1993, # 1374. ЗЗЙ Ежегодный Конгресс Американского Общества Клеточной Биологии, 11-15 декабря 1993 года, Нью Орлеан, штат Луизиана. США.

6. Degtyarev, M.Y., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. Increased palmitoylation of the G protein as subunit after (l-adrenergic receptor activation. J. Cell. Biochem. Abstr. (приложение) 18B.215, 1994, # 1116.

7. Degtyarev, M.Y., Spiegel, A.M., and Jones, T.L.Z. py subunits are required for membrane attachment of a mutant, nonpalmitoylated G protein aj subunit. The FASEB J. 8(7):A1431, 1994, abstr. tf 1001. Симпозиум "ГТф-свяэывающие белки и проведение сигнала" на 8S0M Ежегодном Конгрессе Американского Общества Биохимии и Молекулярной Биологии 21-25 мая 1994 года. Вашингтон. Дистрикт Колумбия. США.