Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль канонических и неканонических инициаторных факторов в механизме кэп-зависимой и внутренней инициации трансляции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Пестова, Татьяна Васильевна

сканирующая модель, в соответствии с которой 40S рибосомная субчастица связывается с кзпированньм 5'-концевым районом мРНК, после чего сканирует 5'-нетранслируемую область (5-НТО) до встречи с первым AUG кодоном, находящимся в благоприятном нуклеотидном окружении. Однако абсолютно, неясно, благодаря чему осуществляется движение рибосомной субчастицы вдоль мРНК, какие белковые факторы задействованы в этом процессе и как происходит выбор инициаторного кодона. Ещё менее изученным является механизм ассоциации рибосомных субчастиц, приводящий к образованию непосредственно синтезирующей белок 80S рибосомы.

Инициация трансляции очень небольшого количества клеточных и вирусных мРНК (среди которых есть очень серьёзные патогены) происходит не по сканирующему механизму, а по механизму внутренней посадки рибосомы. В этом случае 40S рибосомная субчастица первоначально связывается не с 5'-концом 5-НТО матрицы, а непосредственно с её внутренним участком, IRES-элементом (internal ribosomal entry site). IRES-элементы обычно включают несколько сот нуклеотидов, обладают очень развитой вторичной структурой и содержат многочисленные AUG триплеты, не узнаваемые рибосомной субчастицей в качестве инициаторных. В настоящее время совершенно неизвестно, благодаря чему обеспечивается кэп-независимая внутренняя посадка 40S рибосомной субчастицы: только лишь благодаря специфическим свойствам самих IRES-элементов, способных каким-то пока не выясненным образом взаимодействовать с тем же набором клеточных факторов, что и кэпированные клеточные мРНК, или же в процесс инициации на IRES-элементах вовлечены специфические клеточные белки.

Цель и задачи исс.легсонания. Целью данной работы являлось изучение молекулярного механизма кэп-зависимой и внутренней инициации трансляции и характеристика индивидуальной роли икициторных факторов на различных этапах этого процесса. Для её достижения необходимо было разработать методы сборки in vitro щиаторных комплексов с использованием индивидуальных высокоочищенных реляционных компонентов и последующей локализации точного места связывания >сомной субчастицы с матрицей.

Научная новизна и практическая неннпсть работы. Все научные результаты, денные в работе, являются оригинальными. В частности, в результате проведённого ;ния механизма кэп-зависимой инициации трансляии на эукариотических мРНК первые выявлена роль иницаторных факторов elFl и elFIA в процессе рибосомного сканирования и роль elFl в распознавании и диссоциации аберрантных рибосомных комплексов. Обнаружен и идентифицирован новый иницйаторный фактор eIF5B, необходимый для ассоциации рибосомных субчастйц и являющийся гомологом прокариотического инициаторного фактора IF2. Показано, что eIF5B обладает рибосом-зависимой ГТФазной активностью, необходимой для его функционирования. Таким образом, впервые продемонстрировано, что в процессе эукариотической инициации трансляции принимает участие не одна, как предполагалось ранее, а две молекулы ГТФ: одна молекула связывается и гидролизуется фактором eIF2, а вторая - фактором eIF5B.

Во второй части работы проведено исследование молекулярного механизма внутренней инициации трансляции РНК вирусов энцефаломиокардита, Тейлера и ящура (семейство пикорнавирусов), вирусов гепатита С и классической лихорадки свиней (семейство флавивирусов) и вируса паралича сверчка (семейство пикорна-like вирусов насекомых). Показано, что все три группы вирусов используют различные механизмы внутренней инициации. Механизм инициации трансляции пикорнавирусных РНК включает специфическое взаимодействие участка 5'-нетранслируемой области вирусных РНК с инициаторным фактором eIF4G, в то время как механизм инициации трансляции РНК вирусов гепатита С, классической лихорадки свиней и паралича сверчка основан на специфическом взаимодействии их 5'-нетранслируемых областей с 40S рибосомной субчастицей, при этом инициация трансляции на РНК вируса паралича сверчка вообще не требует участия каких-либо инициаторных факторов.

Результаты работы имеют фундаментальное значение для изучения механизма бежового синтеза в клетках эукариот, а данные исследования механизма внутренней иницации трансляции РНК вируса гепатита С в настоящее время используются несколькими фармацевтическими компаниями (в сотрудничестве с автором данной работы) для разработки новых антивирусных препаратов.

Апробаиия работы. Материалы диссертации были доложены автором на следующих симпозиумах и конференциях: Симпозиумы "Translational Control" (Cold Spring Harbor, 1996, 1998, 2000, 2002), Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology (Cold Spring Harbor, 2001), Конференция Jacques Monod "New Insights into the mechanism of mRNA translation: flie significance of RNA structure" (Aussois, France, 1999), VIII Международный Симпозиум по вирусному гепатиту (Мадрид, Испания, 1998), V Международная Конференция по вирусному гепатиту и родственным вирусам (Венеция, Италия, 1998), Xlth Meeting of the European Study Group on Molecular Biology of Picornaviruses (Маттината, Италия, 2000), Семинар Европейских Молекулярно-Биологических Лабораторий (Гейдельберг, Германи, 2001), Gordon Research Conference: Nucleic Acids (Ньюпорт, США, 2000) и на заседании открытого совместного семинара отдела взаимодействия вируса с клеткой Научно-исследовательского Института Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ и лаборатории биохимии вирусов Института Полиомиелита и Вирусных Энцефалитов РАМН, Москва, 2001.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 статей и более 20 тезисов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Механизм образования 48S инициаторных комплексов в процессе 5'-концевой инициации трансляции на эукариотических мРНК.

В настоящее время для описания механизма инициации трансляции эукариотических кэпированных матричных РНК (мРНК) используется сканирующая модель, предложенная М.Козак (Kozak, 1978). В соответствии с этой моделью (Рис. 1), в процессе инициации трансляции принимает участие не целая 80S рибосома, а её малая 40S субчастица. На первой стадии гетеротримерный эукариотический инициаторный фактор eIF2 (состоящий из а, (3 и у субъединиц с молекулярным весом 36, 39 и 52 кД, соответственно) связывает ГТФ и инициаторную метионил-тРНК (Met-tRNAi), образуя тройственный комплекс eIF2-r№-Met-tRNAi, который в свою очередь вместе с мультисубъединичным инициаторным фактором eIF3 (11 субъединиц с молекулярным весом от 28 до 170 кД) взаимодействует с 40S рибосомной субчастицей, образуя 43S преинициаторный комплекс. Далее 43S преинициаторный комплекс связывается с 5'-концевым участком мРНК, вторичная структура которого предварительно расплавляется при участии факторов инициации eIF4A, eIF4B и eIF4F. eIF4F - гетеротриметный фактор, состоящий из eIF4E, eIF4A и eIF4G субъединиц. eIF4E (24 кД) имеет специфическое сродство к кэп-структуре (т7-метилгуанозин, связанный с 5'-концевым нуклеотидом 5'-5'-трифосфатной связью), расположенной на 5'-конце мРНК. eIF4G (171 кД) связывает две другие субъединицы eIF4F, а также мультисубъединичный eIF3 и, таким образом, играет центральную координирующую роль. eIF4A (46 кД) - DEAD box РНК-хеликаза и РНК-зависимая АТФаза, существующая в клетке в двух формах: в свободном виде и в составе eIF4F. Хеликазная активность свободной формы усиливается в присутствии eIF4B (69 кД). Три инициаторных фактора (eIF4A, eIF4B и eIF4F) кооперативно связываются с 5'-концевым участком мРНК и осуществляют локальное расплетание её вторичной структуры, позволяющее 43S комплексу связаться с этим районом мРНК, вероятнее всего, посредством взаимодействия eIF3, входящего в состав 43S комплекса, с e№4G субъединицей eEF4F. Сканирующая модель постулирует, что после связывания с 5'-концевым участком мРНК 43S преинициаторный комплекс начинает АТФ-зависимое движение вдоль мРНК до встречи с AUG кодоном, находящимся в благоприятном нуклеотидном окружении и обычно расположенном на расстоянии 50-150 нуклеотидов от 5'-конца матрицы. В результате анализа первичной структуры эукариотических мРНК был выведен оптимальный контекст AUG кодона: GCCGCCACCAUGQ, при этом наиболее важным является присутствие А в -3 и G в + положениях (Kozak, 1986,1987). Считается также, что наличие шпильки на расстоянии около 14 нуклеотидов к З'-концу от AUG кодона усиливает узнавание его как инициаторного (Kozak, 1990). Оптимальный контекст имеют далеко не все клеточные мРНК, и таким образом, эти различия могут являться одним из механизмов регуляции эффективности белкового синтеза в клетках эукариот. До сих пор остаётся неясным, благодаря чему осуществляется движение рибосомной субчастицы вдоль мРНК: благодаря свойствам самой рибосомной субчастицы или в результате работы инициаторных факторов (eIF4A, eIF4B и eIF4F). Инициаторный кодон мРНК непосредственно узнается антикодоном инициаторном Met-tRNAi (Cigan et al., 1988). В результате такого сложного многофакторного процесса образуется инициаторный 48S комплекс, в котором сформировано устойчивое кодон-антикодоновое взаимодейсивие.

1.1 Образование 48S инициаторного комплекса на природной кэпированной (J-глобиновой мРНК: роль инициаторных факторов elFl и elFlA.

Для более детального исследования различных стадий эукариотической инициации трансляции и роли индивидуальных факторов на каждой из этих стадий в данной работе была осуществлена сборка in vitro инициаторного 48S комплекса на природной кэпированной |3-глобиновой мРНК с использованием индивидуальных высокоочтценных трансляционных компонентов. Инициаторные факторы eIF2, eIF3, eIF4F и 40S рибосомные субчастицы были выделенны из кроличьего ретикулоцитного лизата, а рекомбинантные факторы eIF4A и eIF4B - экспрессированы в клетках Escherichia coli (.E.coli).

Центрифугирование через сахарозный градиент, используемое ранее для изучения образования 48S инициаторных комплексов, позволяло исследовать только ассоциацию 40S рибосомной субчастицы с мРНК, но не давало возможности определить её точное место связявания с матрицей. Для определения места посадки рибосомной субчастицы в данной работе использовался метод ингибирования реакции обратной транскрипции (toe-printing) (Рис. 2), ранее очень успешно применённый для картирования рибосомных комплексов на прокариотических мРНК. Этот метод заключается в удлинении при помощи обратной транскриптазы олигодезоксирибонуклеотидного праймера, комплиментарного участку мРНК, связанной с рибосомной субчастицей. 40S рибосомная субчасгица в эукариотических 48S инициаторных комплексах останавливает обратную транскрйптазу в позициях +15,16 и 17 к З'-концу от А в инициаторном AUG кодоне, на котором образован 48S комплекс. После разделения в геле фрагментов ДНК, образующихся в результате реакции обратной транскрипции, на радиограмме появляются характерные стоп-сигналы. Идентифицировать точное место стопов на мРНК можно путём сравнения продуктов реакции обратной транскрипции с сгосвенсом, проведенным с использованием того же праймера.

Применение описанного метода к исследованию образования 48S комплексов на природной кэпированной Р-глобиновой мРНК в in vitro реконструированной из индивидуальных компонентов системе показало, что вопреки ожиданиям, присутствие инициаторных факторов eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F было недостаточным для образования 48S комплексов на инициаторном кодоне этой матрицы (Рис. 3). Вместо ожидаемых стоп-сигналов, соответствующих позициям +15, 16 и 17 к З'-концу от А в инициаторном AUG кодоне, на радиограмме потаился сильный стоп-сигнал на расстоянии +21-24 нуклеотидов от 5'-конца (5-глобиновой мРНК. Такое близкое к 5'-концу положение этого рибосомного комплекса (который мы назвали комплексом I) свидетельствовало о том, что скорее всего в присутствии этих пяти инициаторных факторов 40S субчастица даже не начала сканирование матрицы.

В работе было проведено выделение из кроличьего ретикулоцитного лизата недостающих факторов, необходимых для сборки 48S комплекса на инициаторном кодоне (3-глобиновой мРНК. В результате этой процедуры были выделены два гомогенных белка с молекулярными массами 13,5 и 19 кД, добавление которых к описанной реконструированной in vitro системе было необходимым и достаточным для появления стоп-сигналов в позициях +15,16 и 17 к З'-концу от А в инициаторном AUG кодоне [5-глобиновой мРНК (комплекс II), (Рис. 3). Появление этих стоп-сигналов зависело от присутствия в реакционной смеси 40S рибосомной субчастицы, АТФ, Met-tRNAi, eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F. Таким образом, положение комплеска П на (3-глобиновой мРНК и потребность для его образования в 40S рибосомной субчастице, АТФ, Met-tRNAi и всех инициаторных факторах сввдетельствовало о том, что комплекс И является полноценным 48S инициаторным комплексом. Непосредственное секвенирование выделенных белков идентифицировало их как описанные ранее в литературе инициаторные факторы elFl и elFlA. Рекомбинантные elFl й elFIA были полностью способны заменить нативные белки в реконструированной системе. Хотя elFl и elFIA были известны сравнительно давно, их конкретная функция в инициации трансляции до сих пор оставалась неизвестной, вследствие чего им приписывалась общая стимулирующая активность. Добавление в систему только elFIA приводило исключительно к увеличению образования комплекса I, в то время как добавление только elFl приводило к уменьшению образования комплекса I и появлению небольшого количества 48S комплекса (комплекса П), при этом комплекс II давал только два характерных стоп-сигнала - в позициях +16 и +17 (Рис.3). Последующее добавление elFl и elFIA к уже сформированному комплексу I приводило к образованию исключительно комплекса II, как если бы elFl и elFIA присутствовали с самого начала реакции (Рис.3). Следовательно, комплекс I не являлся стабильным конечным продуктом. Таким образом, elFl и elFIA не требовались для первоначального связывания 43S преинициаторного комплекса с 5'-концевым районом мРНК, но являлись абсолютно необходимыми для достижения им инициаторного кодона.

В отличие от комплекса П, комплекс I эффективно образовывался при высоких концентрациях ионов магния (до 10 мМ), был нестабилен и диссоциировал при центрифугировании через сахарозный градиент (данные не показаны). Комплекс I также подвергался циклам спонтанной диссоциации и реассоциации. Так, в отличие от комплекса II, добавление избытка конкурентной РНК к предобразованному комплексу I приводило к его исчезновению. Добавление факторов elFl и elFIA к предобразованному при высокой концентрации ионов магния комплексу I приводило к исчезновению этого комплекса без одновременного образования комплекса II (данные не показаны). Эти результаты свидетельствовали о том, что либо elFl и elFIA были способны дестабилизировать комплекс I, либо комплекс I, будучи сам по себе нестабильным, диссоциировал спонтанно, a elFl и elFIA при высоких концентрациях ионов магния удерживали освободившийся 43S преинициаторный комплекс от повторного связывания с мРНК. При низких концентрациях ионов магния добавление elFl и elFIA к предобразованному . комплексу I могло приводить либо к миграции этого комплекса к инициаторному кодону (в этом случае комплекс I являлся бы непосредственным предшественником 48S инициаторного комплекса), либо к диссоциации рибосомного комплекса с мРНК с последующим связыванием 43S преинициаторного комплекса в уже продуктивном раунде инициации с участием elFl и elFIA (Рис. 4А). Чтобы сделать выбор между этими возможными сценариями, инициаторные комплексы, образованные на 32Р-меченой (3-глобиновой мРНК были исследованы при помощи центрифугирования через сахарозный градиент. Если elFl и elFIA приводят к миграции комплекса I к инициаторному кодону, то добавление этих факторов одновременно с избытком конкурентной РНК к образованному на 32рмеченой fi-глобиновой мРНК комплексу I должно приводить к образованию стабильного в сахарозном градиенте 48S комплекса на меченой fi-глобиновой мРНК, Как видно из Рис. 4Б, этого не произошло, из чего можно сделать вывод, что комплекс I не является прямым предшествейником 48S инициаторного комплекса и должен либо спонтанно, либо при помощи elFl и elFIA диссоциировать, чтобы вновь образованный 43S преинициаторный комплекс мог принять участие в новом продуктивном раунде инициации.

1.2 Третичная структура elFl и его взаимодействие с другими компонентами трансляционного аппарата.

В сотрудничестве с лабораторией профессора Г. Вагнера в Гарвардском Университете (США) при помощи ядерного магнитного резонанса (ЯМР) были определены пространственные структуры инициаторных факторов elFl и elFIA. Человеческий elFl содержит 113 аминокислот, и его последовательность на 62% идентична последовательности дрожжевого elFl. Гомологи elFl найдены также в других эукариотах, археобактериях и некоторых бактериях. Аминокислотные остатки 29-116 инициаторного фактора elFl образуют плотно свёрнутый домен с двумя а-спиралями по одну сторону от Р-слоя, образованного пятью параллельными и антипараллельными |3-цепями (Рис. 5А). Первые 28 аминикислот белка неструктурированы. Ни один из известных белков не обладает в точности такой же организацией, хотя подобные структуры, представляющие собой р-слой с а-спиралями по одну из его сторон, найдены в трёх классах небольших белковых доменов: в рибосомном белке S6 и RNP PHK-связывакяцих доменах, рибосомном белке S3 и КН РНК-связывающих доменах, а также в двуспиральных РНК-связывающих доменах, гомологичных по структуре рибосомному белку S5. elFl отличается ото всех этих структур по количеству элементов вторичной структуры, а также по расположению цепей в Р-слое. Единственной общей чертой является рарр сегмент, образованный второй, третьей, четвёртой р-цепями и первой а-спиралыо elFl. Из литературных данных известно, что мутации аминокислотных остатков D88, Q89 и G112 в дрожжевом elFl допускают прохождение инициации на отличных от AUG триплетах (например, UUG) (Castilho Valavicius et al., 1990, Yoon and Donahue, 1992). В структуре человеческого elFl эти аминокислотные остатки расположены в непосредственной близости друг от друга (Рие. 6А). Этот район содержит также другие очень консервативные аминокислоты: С69, Q86, G87 и R90. Вероятно предположить, что эта область поверхности elFl непосредственно отвечает за способность белка участвовать в селекции инициаторного кодона и является сайтом связывания другого компонента трансляционного аппарата. 23 заряженных аминокислотных остатка на поверхности структурированного домена elFl объединены в кластеры: три кластера положительно и два кластера отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Один из этих кластеров, расположенный на поверхности первой а-спирали, содержит 7 остатков лизина и является ещё одним, удалённым на некоторое расстояние от района, ответственного за выбор инициаторного кодона, положительно заряженным потенциальным сайтом связывания elFl с другим компонентом трансляционной системы. Ранее при помощи метода двухгибридной системы было показано, что дрожжевой elFl взаимодействует с инициаторным фактором eIF5, принимающим участие в ассоциации рибосомных субчастиц. Однако нам не удалось при помощи метода ЯМР детектировать непосредственное взаимодействие между человеческими elFl и eIF5. Не исключено, что взаимодействие между elFl и eIF5 происходит только в контексте полного трансляционного рибосомного комплекса или не является консервативным между дрожжами и высшими эукариотами. Сходство структуры elFl с РНК-связывающими доменами других белков и присутствие положительно заряженных кластеров на его поверхности свидетельсововали о возможности связывания elFl с РНК. Однако при помощи метода ЯМР нам также не удалось обнаружить прямого взаимодействия elFl с олигорибонуклеотидом с последовательностью cGCCACAAHfiGCA, представляющей собой практически оптимальный эукариотический инициаторный сайт. Опять же, такое взаимодействие может требовать присутствия других компонентов трансляциооного аппарата, или же elFl может предпочитать другую последовательность РНК, хотя если бы elFl обладал ярко выраженными РНК-связывающими свойствами, то нам, вероятнее всего, удалось бы при помощи ЯМР обнаружить хотя бы неспецифическое связывание фактора с использованным олигорибонуклеотидом. Описанное в литературе взаимодействие дрожжевого elFl с Niplp субъединицей дрожжевого инициаторного фактора eIF3 (Asano et al., 1998, Phan et al., 1998) предполагало возможность аналогичного взаимодействия человеческого elFl с pi 10 субъединицей фактора eIF3 высших эукариот, являющейся гомологом Nipl субъединицы дрожжевого фактора. Для проверки такой возможности р110 субъединица фактора eIF3 была экспрессирована в клетках E.coli в виде fusion-белка GST-pllO. GST-pllO зависимое связывание elFl с глутатион-агарозой подтвердило взаимодействие человеческого elFl с р110 субъединицей фактора eIF

11", i ' t 9 ' ' 'I;, -- t данные не показаны). Взаимодействие elFl с eIF3 потенциально может стимулировать связывание eDFl с 40S рибосомной субъединицей.

1.3 Мутационный анализ инициаторного фактора elFl.

Для выяснения роли различных участков elFl в функционировании этого фактора был произведён мутационный анализ. Во-первых, были мутированы аминокислотные остатки в районе, ответственном за выбор инициаторного кодона (€69, Q86, G87, D88, Q89, R90, G112) (Рис. 6А). Во-вторых, были введены множественные аминокислотные замены в положительно заряженную область первой а-спирали и в экспонированную петлю между первой и второй (5-цепями (К61,б4,65,66 и R38/R41/K42, соответственно). Все мутантные белки первой группы были способны дестабилизировать комплекс I, образованный вблизи 5'-конца р-глобиновой мРНК и способствовать образованию 48S комплекса на инициаторном кодоне матрицы (Рис. 6Б). Эти мутанты также обладали ожидаемой способностью стимулировать образование стабильных 48S комплексов на (3-глобиновой мРНК, в которой инициаторный кодон был заменён на UUG (Рис. 6В). Однако последующее добавление elFl дикого типа к таким 48 S комплексам, образованным на UUG кодонах в присутствии мутантных elFl белков, приводило к полной диссоциации этих комплексов (Рис. 6В). Это свидетельствовало о том, что мутантные белки elFl не ассоциированы стабильно с рибосомными 48S комплексами и могут замещаться белком дикого типа. Более того, стабильность в отсутствии elFl дикого типа 48S комплексов, образованных на UUG кодоне, свидетельствовала о том, что elFl активно диссоциирует аберантные рибосомные комплексы. Дестабилизирующая активность мутантов со множественными заменами в положительно заряженной области первой а-спирали и в экспонированной петле между первой и второй (З-цепями бьиа значительно, снижена, хотя оба мутанта обладали некоторой способностью стимулировать образование 48S комплексов на Р-глобиновой мРНК. Эти мутанты обладали также пониженной способностью связывать eIF3.

1.4 Третичная структура инициаторного фактора eEFlA.

Человеческий elFIA содержит 144 аминокислотных остатка и является наиболее консервативным инициаторкым фактором. elFIA - сильно заряженный белок, 46% которого составляют аргинин, лизин и аспарагиновая и глютаминовая кислоты. Аминокислотная последовательность центральной части elFIA . гомологична последовательности более короткого прокариотического инициаторного фактора IF1. Известно, что структура прокариотического IF1 образует, так называемый, ОВ (oUgonucleotide/oligosaccharide-binding) домен (Sette et al., 1997) (Рис.7Б). ЯМР анализ показал, что в своей центральной части elFIA тоже содержит (3-бочечную структуру, характерную для ОВ доменов, и тем самым подтвердил структурную гомологию эукариотического elFIA и прокариотического IF1. ОВ домен фактора elFIA сформирован пятью (31-Р5 цепями, имеет эллиптическую форму и может быть разделён на две поверхности: одну сторону домена образуют ftt-рЗ цепи, а другую - р4 и $5 цепи (Рис. 7 А). Цепи и [54 соединены наиболее вариабельной частью ОВ домена, содержащей а-спираль. Кроме ОВ домена (аминокислоты с 33 по 94) elFIA содержит небольшой С-концевой домен с двумя а-спиралями и два длинных сильно заряженных неструктурированных N- и С-конца. В отличие от многих других ОВ домен-содержащих белков, elFIA не содержит RNP-1 последовательность в (52 или (Й цепях. Исследование с помощью ЯМР РНК-связЫвающих свойств elFIA показало, что белок связывал одиоцепочечную РНК с константой диссоциации Kd около 15 цМ и не обладал избирательностью по отношению к нуклеотидной последовательности одноцепочечных РНК: аналогичные изменения химических сдвигов наблюдались при использовании олигорибонуклеотида GCCACAAU£lGCA, содержавшего AUG в "хорошем" контексте, и при использовании олигорибонуклеотида GGACUUCG. Большое число изменений химических сдвигов при связывании elFI A одноцепочечной РНК приходилось на ОВ домен (Рис. 7В). Дополнительные изменения химических сдвигов наблюдались также в al, La4, La5 петлях, на N-конце второй a-спирали и на большей части неструктурированного С-концевого участка (Рис, 7В). Определённая при помощи ЯМР потенциальная РНК-связывающая поверхность elFIA является слишком большой для установления непосредственных контактов с 8-12 нуклеотидными РНК. Наиболее вероятно, только часть из наблюдаемых изменений химических сдвигов вызвана прямым РНК-белковым взаимодействием, в то время как остальные обусловлены конформационными перестройками elFIA, вызванными связыванием с РНК. Поверхность elFIA очень сильно и довольно асимметрично заряжена: около потенциального РНК-связывающего сайта ОВ домена, как и ожидалось, располагается большая положительно заряженная поверхность, в то время как на противоположной его стороне вблизи от a-спирального домена находится большая отрицательно заряженная область (данные не показаны).

1.5 Мутационный анализ инициаторного фактора elFIA.

Чтобы иметь возможность рассуждать о механизме действия elFIA, необходимо остановиться на работе по локализации при помощи кристаллографии места связывания прокариотического IF1 на 305Г рибосомной субчастице, проведённой в лаборатоии профессора В. Рамакришнана в Организации Медицинских Исследований в Кембридже (Великобритания) (Carter et al., 2001). IFi связывается в участке 30S рибосомной субчастицы, образованном рибосомным белком S12, спиралью h44 и петлёй L530 16S рибосомной РНК (Рис. 8). Расположение IF1 на 30S рибосомной субчастице таково, что белок стерически блокирует возможность связывания тРНК с рибосомным А сайтом, однако IF1 только покрывает, но не блокирует канал в основании А сайта, через который может проходить мРНК.

Для выяснения . роли различных районов и аминокислотных остатков в функционировании elFIA был проведён мутационный анализ белка. При введении мутаций учитывалась локализация аминокислоты на РНК связывающей поверхности < elFIA (определённой При помощи ЯМР), тип аминокислоты и её консервативность. Работа по мутагенезу проводилась до публикации описанных выше результатов, полученных в лаборатории В. Рамакришнана, однако оказалось, что мутированы были именно те аминокислотные остатки, которые в случае IF1 принимают участие во взаимодействии с 30S рибосомной субчастицей. Мутированные аминокислотные остатки H59D, R65D и K67D располагались в районе, который в прокариотическом IF1 взаимодействует с петлёй L530, R45D и W69A - в районе, взаимодействующем со спиралью h44, a Y83A был гомологичен тирозину 60 белка IF1, образующему водородную связь с рибосомным белком S12 (Рис. 9А). Поскольку elFIA и IF1 являются очень близкими структурными гомологами в их центральных частях, с осторожностью можно предположить, что эквивалентные участки elFIA вовлечены в аналогичные взаимодействия с 40S рибосомной субчастицей.

Качествено, все мутантные elFIA белки обладали одинаковым фенотипом. Их присутствие в in vitro реконструированной системе, как и присутствие elFIA дикого типа, приводило к полной диссоциации комплекса I, образованного вблизи 5'-конца р-глобинбвой мРНК (Рис. 9). Тем не менее, образование 48S комплекса на инициаторном кодоне (5-глобиновой мРНК (комплекс П) было менее эффективным, чем в случае немутированного фактора, а стоп-сигнал в позиции +15 - менее выраженным. Более того, в присутствии мутантных белков образовывался новый рибосомный комплекс (комплекс Щ), характеризовавшийся появлением стоп-сигналов в позициях +8 и +9 от инициаторного кодона (Рис. 9Б). Последующее добавление elFIA дикого типа к реакционной смеси, содержавшей комплекс Ш, образованный в присутствии мутантного elFIA, приводило к образованию исключительно 48S комплекса на инициаторном кодоне (5-глобиновой мРНК (комплекс II) (Рис. 9В). Это означает, что мутантный elFIA не является стабильным компонентом рибосомного комплекса Ш и может быть заменён белком дикого типа. В настоящий момент природа комплекса HI неизвестна, хотя очевидно, что его появление является результатом дефекта рибосомного сканирования. Однозначно трудно сказать, является ли немутированный elFIA стабильным компонентом сканирующего рибосомного комплекса, однако позиция прокариотического IF1 на 30S рибосомной субчастице предполагает, что elFIA может принимать участие в создании канала на 40S рибосомной субчастице, через который проходит мРНК во время сканирования. Нельзя также исключить менее прямой роли elFIA в процессе рибосомного сканирования: связывание этого фактора могло бы вызывать информационные изменения в рибосомной 18S РНК и в относительном расположении доменов 40S субчастицы, аналогичные тем, которые вызывает связывание IF1 в 30S субчастице (Carter et al., 2001), и которые в свою очередь могли бы влиять на сканирующую способность рибосом. Блокирование рибосомного А сайта связыванным elFIA могло бы также способствовать более направленному связыванию инициаторной тРНК с рибосомным Р сайтом.

1.6 Первоначальная посадка и последующее сканирование 43S преиннциаторным комплексом неструктурированных 5'-НТО мРНК.

Определение минимального набора инициаторных факторов, необходимых для первоначального связывания и последующего сканирования 43S преиннциаторным комплексом 5-НТО р-глобиновой мРНК, позволило адресовать более частные вопросы, касающиеся процесса эукариотической инициации трансляции. Рибосомное сканирование никогда непосредственно не наблюдалось в не исследовалось, и механизм его совершенно неизвестен. Так, не ясно, способна ли сама по себе рибосомная 40S субчастица двигаться вдоль мРНК посредством механизмов линейной диффузии или переменной диссоциации-реассоциации, или же её движение вдоль матрицы осуществляется посредством хеликазной транслокации. В случае последнего механизма, также встаёт вопрос, какие инициаторные факторы могут быть задействованы в этом процессе: eIF4A, eIF4B и eIF4F или же только eIF4A и eIF4B, a eEF4F участвует исключительно в первоначальном связывании 43S комплекса с 5'-концом мРНК.

Чтобы попытаться ответить на эти вопросы и, по возможности, разделить процессы первоначального связывания 43S преинициаторного комплекса с 5'-концевым районом мРНК и последующего сканирования в работе использовался набор мРНК либо с полностью неструктурированными 5'-нетранслируемыми областями, либо с такими же лидерами, но содержащими в определенных участках стабильные шпилечные структуры. Модельная мРНК (CAA-GUS мРНК) содержала глюкуронидазу (GUS) в качестве репортерного гена и неструктурированную 5-НТО, состоявшую из 20 САА и одного GAA триплета (Рис. 10). Такая 5-НТО была не только неструктурированной, но также содержала только САА, ААС и АСА триплеты, которые никогда не описывались в литературе как возможные инициаторные кодоны эукариот. Трансляция CAA-GUS мРНК ш vitro в кроличьем ретикулоцитном лизате была частично устойчива к ингибированию отрицательным Гг«и«-доминантным R362Q мутантом фактора eIF4A (Рис. 10), дефектным в АТФ и РНК связывании, но способным стабильно связывать eIF4G и, тем самым, инактивировать eIF4F (Pause et al., 1994). Даже при очень высоких концентрациях R362Q eIF4A мутанта, полностью ингибирующих кэп-зависимую трансляцию Р-глобиновой мРНК (данные не показаны), CAA-GUS мРНК сохраняла до 30% активности. Этот результат свидетельствовал о том, что инициация трансляции на CAA-GUS мРНК не зависела абсолютно от фактора eIF4F, но не отвечал на вопрос о потребности в АТФ и eIF4A, поскольку даже в присутствии R362Q eIF4A мутанта, CAA-GUS мРНК могла использовать активный эндогенный eIF4A ретикуяоцитного лизата. Для исследования АТФ и фактор-зависимости инциации трансляции на CAA-GUS мРНК в работе было изучено образование 48S инициаторных комплексов в in vitro реконструированной системе с использованием toe-printing анализа. На определенной стадии исследований было замечено, что суммарная тРНК фирмы Novagene, использованная в данной работе, содержит большое количество примесной РНК различного молекулярного веса, которая могла связывать инициаторные факторы eIF4F, eIF4B, eIF3 или сам 43S комплекс и тем самым оказывать ингибирующее действие иа образование 48S комплексов на CAAGUS мРНК. Для избежания этой проблемы из пула суммарной тРНК была выделена индивидуальная инициаторная тРНК. Метод выделения иншщаторной тРНК основывался на способности инициаторной тРНК образовывать стабильный тройственный комплекс с ГТФ и eIF2. При использовании суммарной тРНК исключение из, реакционной смеси инициаторных факторов eIF4A, eIF4B и eIF4F, таже как и исключение из неё АТФ, снижало в 3 раза эффективность образования 48S инициаторного комплекса на CAA-GUS мРНК (Рис. 11), но не ингибировало полностью образование этого комплекса, как в случае р-глобиновой мРНК (данные не показаны). При использовании индивидуальной инициаторной Met-tRNAi отсутствие в реакционной смеси eIF4A, eIF4B, eIF4F и АТФ не приводило к снижению эффективности образования 48S инициаторного комплекса на CAA-GUS мРНК (Рис. И). Исключение elFIA не оказывало влияния на образование 48S комплекса. Исключение elFl приводило к небольшому уменьшению эффективности образования 48S комплекса, а исключение из реакционной смеси обоих elFl и elFI A г к дальнейшему её снижению. Интересно, что одновременное отсутствие eIF4A, eIF4B, eIF4F и elFIA очень сильно снижало выход 48S комплекса, а одновременное отсутствие eIF4A, eIF4B, eIF4F и elFl почти полностью ингибировало его образование (Рис. 11). В отсутствии eIF4A, eIF4B, eEF4F, elFl и elFIA 48S комплекс вообще не образовывался. Таким образом, в присутствии eIF4A, eIF4B и eIF4F образование 48S комплекса на CAA-GUS мРНК с неструктурированной 5'-НТО, и не содержащей потенциальных инициаторных кодонов, может происходить в отсутствии инициаторных факторов elFl и elFIA, хотя эти факторы значительно увеличивают процессивность 43S комплексов. Оно также может происходить в отсутствии АТФ и факторов, ассоциированных с АТФ-гидролизом, однако в этом случае присутствие elFl и elFIA в реакционной смеси становится необходимым; Таким образом, elFl, elFIA, eIF4A, eIF4B, и eIF4F - все вносят вклад в увеличение процессивности сканирования, хотя наиболее вероятно, посредством различных механизмов. В то время как eIF4A, eIF4B, и eIF4F, наиболее вероятно, расплавляют вторичную структуру мРНК, elFl и elFIA могут вносить необходимые изменения в структуру мРНК-связывающего центра 40S субчастицы и/или позиции инициаторной тРНК в 43S комплексах.

Образование 48S инициаторного комплекса на CAA-GUS мРНК в отсутствии eIF4A, eIF4B, eIF4F и АТФ зависело от 5'-конца мРНК, а не являлось результатом посадки 40S рибосомной субчастицы на внутренний участок 5'-НТО. Так, введение стабильной шпилечной структуры с энергией -13,6 кКал на 5'-конец этой мРНК полностью ингибировало трансляцию матрицы в кроличьем ретикулоцитном лизате и образование на ней 48S инициаторного комплекса в in vitro реконструированной системе (данные не показаны). Это означало, что в присутствии elFl 43S преинициаторный комплекс способен узнавать 5-коиец мРНК с неструктурированной 5-НТО, связываться с ним и двигаться вдоль этой 5'-НТО к инициаторному кодону не зависимо от присутствия АТФ и факторов, ассоциированных с АТФ гидролизом.

1.7 Сканирование 43S преииициаториым комплексом структурированных 5'-нетранслируемых областей мРНК.

Тот факт, что связывание 43S преинициаторного комплекса с 5'-концевым участком неструктурированной 5'-НТО CAA-GUS мРНК может происходить в отвутствии eIF4A, eIF4B, eIF4F й АТФ, позволил нам исследовать роль этих инициаторных факторов в процессе сканирования независимо от процесса первоначального связывания 43S преинициаторного комплекса с 5'-концевым участком мРНК. Для этого были синтезированы производные CAA-GUS мРНК, в которых стабильные пншлечные структуры различной энергии й состава были введены в центральную часть 5-НТО CAA-GUS мРНК после 43 неструктурированных 5'-концевых нуклеотидов. Предполагалось, что такая длина 5'-концевой неструктурированной области должна быть достаточной для АТФ-независимой посадки преинициаторных комплексов на мРНК. Если бы образование 48S комплексов на таких производных требовало присутствия АТФ и всех или часта факторов, ассоциированных с АТФ гидролизом, можно было бы сделать вывод о том, что такие факторы принимают участие в рибосомном сканировании на структурированных 5'-НТО. В отличие от CAA-GUS мРНК, в отсутствии eIF4A, eIF4B, eIF4F и АТФ 48S инициаторные комплексы практически не образовывались даже на производной мРНК, содержавшей наименее стабильную (с энергией всего -6,6 кКал) AU-богатую шпильку (Рис. 12). Исключение из реакционной смеси одного eIF4F оказывало такой же ингибирукяций эффект, как и исключение всех трёх факторов (eIF4A, eIF4B и eIF4F), ассоциированных с АТФ гидролизом. Таким образом, хотя рибосомные 43S комплексы способны двигаться вдоль неструктурированной 5-НТО мРНК посредством механизмов линейной диффузии или переменной даюсоциации-реассоциации, в нормальных условиях их движение вдоль структурированных 5-НТО опосредовано хеликазной активностью eIF4A, eIF4B и eIF4F. Более того, в отсутствии eIF4F инициаторные факторы eIF4A и eIF4B, скорее всего, не обладают самостоятельной ролью и не обеспечивают рибосомного сканирования.

1.8 Образование 48S инициаторных комплексов на отличных от AUG триплетах в отсутствии elFl.

Введение описанной выше шпильки в 5-НТО CAA-GUS мРНК не просто изменило вторичную структуру 5-НТО мРНК, но и увеличило, по сравнению с CAA-GUS мРНК, количество потенциальных non-AUG триплетов, некоторые из которых в определённых ситуациях могли служить инициаторными кодонами эукариот. Исключение из реакционной смеси elFl привело к появлению интенсивных стоп-сигналов, соответствовавших позициям +15,16 и 17 к З'-концу от А в AUU триплете, находящемся в начале шпилечной структуры (Рис. 12). Это означало, что в отсутствии elFl 43S преинициаторныйкомплекс может сканировать даже структурированную 5-НТО мРНК, но не способен распознавать и отвергать неполноценные кодон-антякодоновые взаимодействия между триплетами 5'-НТО мРНК и инициаторной тРНК.

1.9 Роль elFl в узнавании 43S преинициаторными комплексами иуклеотидного контекста инициаторного кодона.

Для ответа на вопрос, какие инициаторные факторы отвстствены за узнавание нуклеотидного контекста инициаторного кодона, в 5'-НТО CAA-GUS мРНК были введены. дополнительные AUG триплеты в "хорошем" или "плохом" козаковском контекстах и исследовано образование на них 48S комплексов в in vitro реконструированной системе^ (Рис. 13А)- В случае мРНК с дополнительным AUG триплетом в "хорошем" контексте, в присутствии всех инициаторных факторов (eIF2, eIF3, eIF4A, еПЦВ, eIF4F, elFl и elFIA) около 60% рибосомных субчастиц останавливалось на этом первом иншдааторном кодоне (Рис. 13Б). В случае мРНК с дополнительным AUG триплетом в "плохом" контексте, в аналогичной ситуации 90% рибосомных субчастиц игнорировало первый кодон и сканировало 5'-НТО до инициаторного кодона репортерного гена GUS (Рис. 13В). Следовательно, присутствие инициаторных факторов eIF2, eIF3, eIF4A, еШ4В, eIF4F, elFl и elFIA было достаточным для узнавания контекста инциаторного кодона 43S преинициаторньш комплексом. Исключение из реакционной смеси elFIA или eIF4A, eIF4B и eIF4F снижало процессивность 43S комплексов. Так, в этом случае значительно меньше комплексов образовывалось на втором инициаторном кодоне в конструкции с дополнительным AUG триплетом в "хорошем" контексте. Последовательное снижение температуры реакционной смеси с 37°С до 15°С также снижало процессивность 43S комплексов: и в этом случае меньше рибосомных субчастиц достигало второго инициаторного кодона в конструкции с дополнительным AUG триплетом в "хорошем" контексте (данные не показаны). Этот эффект аналогичен описанному ранее (Kozak, 1990) эффекту введения шпилечной структуры после инициаторного кодона. Вероятнее всего, снижение скорости движения рибосомной субчастицы (посредством исключения некоторых инициаторных факторов, снижения температуры или введения вторичной структуры) увеличивает шансы на образование стабильного кодон-аигикодонового взаимодействия и снижает "протекаемость" сканирования. Однако исключение из реакционной смеси elFIA или еПЧА, 4В и 4F не повлияло на способность 43S комплекса различать "хороший" и "плохой" нуклеотидаые контексты инициаторного кодона. Исключение этих факторов не увеличило эффективность образования 48S комплекса на первом AUG кодоне в "плохом" контексте и не сильно повлияло на соотношение 48S комплексов, образованных на первом и втором AUG кодонах в конструкции с дополнительным AUG триплетом в "плохом" контексте (Рис. 13 В).

Исключение же из реакционной смеси инициаторного фактора elFl очень сильно увеличило образование 48S комплекса на первом AUG кодоне в "плохом" контексте (Рис. 13В). Тем не менее, последующее добавление elFl к 48S комплексу, образованному на AUG триплете в "плохом" контексте в отсутствии elFl, привело к распаду этого комплекса (Рис. 13Г). Этот результат свидетельствует о способности elFl не только помогать 43S преинициаторному комплексу узнавать и отвергать неполноценные кодонантикодоновые взаимодействия, но также о решающей роли этого фактора в узнавании рибосомной субчастицей нуклеотидного контекста инициаторного кодона. 1.10 Роль elFl в дискриминации 48S комплексов, образованных на AUG кодонах, расположенных очень близко от 5'-конца мРНК

Подавляющее большинство эукариотических мРНК содержат 5'-нетранслируемые области длиной от 50 до 150 нуклеотидов, и известно лишь несколько примеров матриц с экстримально короткими лидерными последовательностями. Экспериментально показано, что укорачивание 5-НТО с 32 до 3 нуклеотидов в мРНК, содержащей два AUG кодона, последовательно снижало инициацию трансляции на первом AUG кодоне и увеличивало её на втором (Kozak, 1991). Однако причина, почему AUG кодоны, расположенные на очень близком расстоянии от 5'-конца, используются так неэффективно, неизвестна. С одной стороны, - можно предположить, что при первоначальном связываний 5'-концевые нуклеотиды мРНК располагаются в РНК-связывающем центре 40S рибосомной субчастицы таким образом, что они просто не могут быть инспектированы антикодоновой петлёй икициаторной тРНК. С другой стороны, возможно также, что 43S преинициаторный комплекс инспектирует мРНК с самого первого нуклеотада, однако образующееся кодон-антикодоновое взаимодействие является нестабильным, если в РНК связывающем центре рибосомной субчастицы находится недостаточное количество нуклеотидов с 5'-конца от AUG кодона. Для изучения этого вопроса в работе исследовалась трансляция в кроличьем ретикулоцитном лизате и образование 48S иншщаторноых комплексом в in vitro реконструированной системе на производных CAA-GUS мРНК с дополнительными AUG триплетами, расположенными очень близко от 5'-конца матрицы и находящимися в той же рамке считывания, что и AUG кодон GUS белка. Дополнительные кодоны находились на расстоянии 1,2,4 или 8 нуклеотидов от 5'-конца (Рис. 14А). Трансляция с AUG кодонов, расположенных в 1 или 2 нуклеотидах от 5'-конца, была очень неэффективной (Рис. 14Б). Увеличение длины 5-НТО с 2 до 4 нуклеотидов увеличило трансляцию с 5'-концевых AUG кодонов. В этом случае мРНК с AUG кодоном в "хорошем" контексте транслировалась лучше, чем мРНК с AUG кодоном в "плохом " контексте (Рис. 14Б). Это означало, что 43S преинициаторный комплекс способен различать нуклеотидный контекст инициаторных кодонов, удаленных от 5'-конца мРНК всего на 4 нуклеотида. Увеличение длины 5'-НТО с 4 до 8 нуклеотидов ещё больше увеличивало эффективность трансляции с 5'-концевого AUG кодона (Рис. 14Б).

Исследование образования 48S комплекса в in vitro реконструированной системе при помощи toe-printing анализа показало, что в присутствии всех инициаторных факторов (eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4B, eIF4F, elFl и elFIA) 48S комплекс образовывался только на AUG кодоне GUS (Рис. 14В). Однако в отсутствии инициаторного фактора elFl наблюдалось очень эффективное образование 48S комплекса на AUG кодонах, расположенных на расстоянии 1 или 2 нуклеотидов от 5'-конца, и полное отсутствие комплекса на AUG кодоне GUS (Рис. 14В). 48S комплексы на 5'-концевых AUG кодонах образовывались даже в присутствии только eIF2 и еЕРЗ. Последующее добавление инициаторного фактора elFl к 48S комплексам, образованным на 5'-концевых AUG кодонах в отсутствии elFl, привело к полной диссоциации этих комплексов и образованию 48S комплекса исключительно на AUG кодоне GUS (Рис. 14В). В случае мРНК с 5'-концевыми AUG кодонами, находящимися на расстоянии 4 нуклеотидов от 5'-конца, 48S комплексы эффективно образовывались на этих кодонах в отсутствии elFl, и очень небольшое количество 48S комплекса образовывалось в присутствии elFl на мРНК с AUG кодоном в "хорошем" нуклеотидном контексте (Рис. 14В). 48S комплексы эффективно образовывались на AUG кодонах, находящихся на расстоянии 8 нуклеотидов от 5'-конца как в отсутствии elFl, так и в его присутствии (Рис. 14В). 48S комплексы, образованные на 5'-концевых AUG кодонах, были устойчивы к последующему добавлению избытка конкурентной РНК и стабильны в условиях центрифугирования через сахарозный градиент (данные не показаны), а также были способны эффективно образовывать 80S рибосомные комплексы при добавлении в реакционную смесь 60S рибосомных субчастиц и инициаторнных факторов eIF5 и eIF5B (смотри раздел 2).

Полученные результаты свидетельствовали о том, что антикодоновая петля инициаторной тРНК в 43S преинициаторных комплексах способна инспектировать самые первые нуклеотиды мРНК и образовывать кодон-антикодоновое взаимодействие с AUG триплетом, расположенным в 1 нуклеотиде от 5'-конца. Однако вероятно, что в этом случае мРНК недостаточно правильно и стабильно фиксирована в РНК-связывакмцем центре 40S рибосомной субчастицы, и присутствие elFl дестабилизирует такой 48S комплекс. 8 5-концевых нуклеотидов являются достаточными для правильной фиксации района AUG кодона в РНК-связывающем центре рибосомной субчастицы и обеспечивают устойчивость 48S комплексов к дестабилизирующему действию еД?1. 1.11 Связывание с 40S рибосомной субчастицей и возможный механизм действия elFl.

Функциональные войства elFl очень сходны со свойствами прокариотического инициаторного фактора IF3 (а точнее, его функционального С-концевого домена): оба фактора диссоциируют псевдо-инициаторные комплексы, образованные на отличных от AUG триплетах, а также комплексы, образованные на мРНК с очень короткими лидерными последовательностями, тем самым обеспечивая точность выбора инициаторного кодона. Гомология первичной структуры у этих факторов отсутствует, хотя наблюдается некоторое сходство на уровне третичной структуры (Рис.5, стр.11). Как и elFl, IF3 образован двумя а-спиралями, располагающимися по одну сторону от слоя, который в этом случае образован четырьмя (3-целями. Выполнять свою контрольную функцию elFl мог бы либо непосредственно инспектируя область инициаторного кодона мРНК и кодон-антикодоновое взаимодействие (прямой механизм), либо соответствующим образом изменяя конформацию 40S рибосомной субчастицы (опосредованный механизм).

Для выбора между этими механизмами необходимо определить место связывания elFl с 40S рибосомной субчастицей. Для этого в работе был использован метод направленного расщепления гидроксильными радикалами. Он основан на расщеплении 18S рРНК гидроксильными радикалами, образованными в области атомов железа Fe(II), специфически связаных при помощи бромоацетамидобензил-EDTA с уникальными остатками цистеина на поверхности молекулы elFl. Гидроксильные радикалы образуются в результате обработки 40S/eIFl комплексов аскорбиновой кислотой и перекисью водорода. Нукпеотидные позиции щцроксил радикального расщепления в 18S рРНК определялись при помощи реакции обратной транскрипции. Сравнительно небольшой радиус действия гидроксильных радикалов позволяет довольно точно определить местоположение белка на рибосомной субчастице. elFl содержит два остатка цистеина: Cys69 и Cys94. На основе функционально активного бесцистеинового мутанта нам удалось сконструировать 12 других активных мутантов elFl, содержавших по одному уникальному цистеину в разных участках поверхности белка (Рис. 15А, стр.57). Гидроксильные радикалы, образованные атомами железа Fe(II), связанными с семью из двенадцати мутантов, вызывали расщепление 18S рРНК в спиралях 23Ь, 24а и 44 (наименование спиралей 18S рРНК соответствует наименованию аналогичных спиралей в прокариотической 16S рРНК) (Рис. 15Б). Наиболее интенсивное расщепление наблюдалось в петле 1060 (аналог петли 790 в 16S рРНК) в верхней части спирали 24а (нуклеотиды 1048-1054). Гидроксильные радикалы, образованные атомами железа Fe(II), связанными с Cys38, Cys42 (петля между первой и второй (З-цепями), Cys57, Cys61 (первая ос-спираль) и Cys75 (третья |3-цепь), расщепляли этот район рРНК с различной интенсивностью (Рис. 15В). Гидроксильные радикалы, образованные атомами железа Fe(If), связанными с Cys75, расщепляли также 18S рРНК в верхней части спирали 23Ь в районе нукдеотидов 960-962 (аналог петли 690 в 16S рРНК) (данные не показаны). Гидроксильные радикалы, образованные атомами железа Fe(II), связанными с Cys38 и Cys42, также расщепляли 18S рРНК в позициях 1695-1696, а образованные атомами железа Fe(II), связанными с Cys38, Cys61, Cys66 (первая а-спираль) и Cys91 (вторая а-спираль), вызывали слабое расщепление в позициях нукдеотидов 1810-1825 (44 спираль) (данные не показаны). Гидроксильные радикалы, образованные атомами железа Fe(II), связанными с Cys38 и Cys42, были также способны расщеплять инициаторную тРНК в преинициаторных 43S комплексах в позициях 23-25 и 11-12 (дигядроуридиновый стебель), а гидроксильные радикалы, образованные атомами железа Ре(П), связанными с Cys75, вызывали слабое расщепление тРНК в позиции 5-го нуклеотида (акцепторнный стебель) (Рис. 15Г). Пространственная структура эукариотической 40S рибосомной субчастицы неизвестна. Однако высокая степень гомологии 18S и 16S рРНК позволила нам с известной степенью осторожности воспользоваться недавно определённой пространственной струкрурой прокариотической рибосомы (Yusupov et al., 2001) для моделирования 40S/eIFl взаимодействия. Принимая во внимание места и интенсивность расщепления рРНК и инциаторной тРНК, вызванного гидроксильными радикалами, образованными атомами железа Fe(II), связанными с различными участками elFl, можно заключить, что elFl связывается с 40S рибосомной субчастицей в районе межсубъединичной поверхности платформы вблизи рибосомного Р сайта (Рис. 16А, стр.58). Такое близкое к Р сайту нахождение elFl на 40S рибосомной субчастице, кроме того смоделированное на основании структуры 30S рибосомной субчастицы, не позволяет нам в данный момент с полной уверенностью сделать выбор между прямым и опосредованным механизмами действия elFl. Однако очень важно отметить, что проведенное также с использованием метода направленного расщепления гидроксильными радикалами исследование связывания IF3 с 30S субчастицей (Dallas А. and Noller Н., 2001) показало, что С-концевой домен IF3 также связывается с районом межсубъединичной поверхности платформы вблизи рибосомного Р сайта (Рис. 16Б). Более того, места расщепления 18S и 16S рРНК в спиралях 23Ь и 24а абсолютно идентичны. Более точное, чем это возможно в случае взаимодействия elFl и 40S субчастицы, моделирование связывания С-концевого домена IF3 с 30S субчастицей, по мнению авторов, свидетельствует в пользу опосредованного механизма действия IF3 в процессе поддержания точности выбора инициаторной тРНК и инициаторного кодона в прокариотической трансляции. Известно также, что связывание IF3 действительно вызывает конформационные перестройки в декодирующем центре рибосомы и изменение положения мРНК на 30S субчастице (La Teana et al., 1995, Shapkina et al., 2000, Petrelly et al., 2001). Хотя в настоящее время данные о потенциальных конформационных изменениях 40S субчастицы, вызванных связыванием с-eIFl, отсутствуют, сходство функций elFl и IF3, а также поразительное сходство их взаимодействия с рибосомными субчастицами заставляет нас также склоняться к опосредованому механизму действия elFl. Более того, нам не удалось обнаружить расщепления мРНК в 48S комплексах, что также может свидетельствовать об отсутствии прямого контакта elFl с матрицей. Согласно нашей модели опосредованного механизмами действия elFl, 43S преинициаторный комплекс может существовать в двух конформациях: "закрытой" (в отсутствии elFl) и в "открытой" (в присутствии elFl). Потенциальные конформационные изменения, вызванные elFl,могут приводить к изменению позиции мРНК, инициаторной тРНК или их обеих на рибосомной субчастице. В "закрытой", не приспособленной для сканирования, конформации 43S комплекса антикодоновая петля инициаторной тРНК способна легко образовывать частичное взаимодействие с триплетами, отличными от AUG. В "открытой", предназначенной для сканирования конформации 43S комплекса антикодоновая петля способна образовывать устойчивое взаимодействие исключительно с AUG триплетами, находящимися только в благоприятном нуклеотидном окружении^ Эта модель предполагает, что основания нуклеотидного контекста инициаторного кодона могут непосредственно взаимодействовать с рРНК или рибосомными белками, гарантируя правильную фиксацию мРНК в мРНК связывающем центре рибосомы, способствующую образованию кодон-антикодонового взаимодействия.

2. Ассоциация рибосомных субчастиц и образование 80S инициаторного комплекса.

Ассоциация рибосомных субчастиц с образованием 80S комплекса является последним этапом инициации. 40S рибосомная субчастица в 48S комплексе связана с инициаторными факторами eIF2, eIF3, elFl и elFIA и, следовательно, не готова к ассоциации с 60S субъединицей. До недавнего времени считалось, что единственным фактором, принимающим участие в ассоциации рибосомных субчастиц, является eIF5 (49 кД). eIF5 связывается с р-субъединицей инициаторного фактора eIF2. Связывание еБ 5 с elF"1., в свою очередь связанным с 40S рибосомной субчастицей, стимулирует ГТФ-азную активность 7-субъединицы eIF2. е1Р2-ГДФ теряет способность связывать инициаторную тРНК. Таким образом, предполагалось, что гидролиз связанной с eIF2 молекулы ГТФ приводит к диссоциации е1Р2-ГДФ и других инициаторных факторов с 40S субчастицы, обеспечивая подготовку 48S комплекса к ассоциации (Рис. 17).

2.1 Образование 80S инициаторного комплекса на Р-глобиновой мРНК: роль нового инициаторного фактора eIF5B, аналога прокариотического фактора IF2.

Однако добавление 60S субъединиц и eIF5 к 48S комплексу, образованному на fS-глобиновой мРНК в in vitro реконструированной системе, не привело к образованию 80S рибосом (Рис. 18А). В работе бьшо проведено выделение из клеток асцитной карциномы мышей Кребс-2 недостающих факторов, необходимых для образования 80S рибосомного комплекса на Р-глобиновой мРНК. В результате очистки были выделены два белка, обеспечивающих ассоциацию рибосомных субчастиц на этой матрице (Рис. 18А). Один из белков оказался инициаторным фактором eIF5. Определённая в работе N-концевая последовательность второго белка идентифицировала его как мышиный гомолог прокариотического инициаторного фактора IF2. Пршшмая во внимание функцию этого белка в ассоциации рибосомных субчастиц, он был назван инициаторным фактором eIF5B. Укороченный с 5'-конца рекомбинантный человеческий eIF5B (аминокислоты 587-1220) полностью заменял нативный полноразмерный белок в реакции ассоциации рибосомных субчастиц.

Аминокислотная последовательность IF2 и eIF5B может быть разделена на три района. Тогда как первый N-концевой участок вариабелен, два других района обладают очень высокой консервативностью среда бактерий, археобактерий и эукариот (Рис. 18Б). Наиболее консервативный центральный район содержит последовательности, характерные для ГТФ-связывающих белков. Прокариотический IF2 принимает участие в двух этапах инициации. Во-первых, он стимулирует связывание инициаторной тРНК с Р-сайтом 30S рибосомной субчастицы и, во-вторых, стимулирует ассоциацию рибосомных субъединиц. Проверка возможной роли eIF5B в образовании 48S комплекса на Р-глобиновой мРНК показала, что eIF5B был не способен заместить инициаторный фактор eIF2, а в присутствии eIF2 не оказывал никакого влияния на образование 48S комплекса данные не показаны). Таким образом, несмотря на гомологию и общую роль в ассоциации рибосомных субчастиц, eIF5B отличается от своего прокариотического аналога тем, что не стимулирует связывание инициаторной тРНК с 40S рибосомной субчастицей. В эукариотах эту функцию исполняет инициаторный фактор eIF2, не имеющий прокариотического аналога.

2.2 Зависимость потребности eIF5 и e!F5B для образования 80S рибосом от присутствия в реакционной смеси elFl и eIF3.

Тогда как в предыдущих работах eIF5 был достаточным для образования 80S рибосом (Chakrabarty et al., 1991, Das et al„ 1993), в нашем случае присутствие обоих факторов eIF5B и eIF5 было необходимым для ассоциации рибосомных субчастиц на (3-глобиновой мРНК. Проведённые ранее анализы были выполнены с использованием 48S комплексов, образованных не на нативных матричных РНК, а на AUG триплетах в присутствии неполного набора ишщиаторных факторов. Образование 48S комплексов на AUG триплетах очень эффективно и не требует присутствия всех йнициаторных факторов. Так, 48S комплексы на AUG триплетах способны образовываться в присутствии одного лишь eIF2. Хотя elFl, elFIA и eIF3 не являются абсолютно необходимьши для образования таких рибосомных комплексов, в нормальных условиях они ассоциированы с 40S рибоеомными субчастицами в 48S комплексах, образованных на мРНК, и могут непосредственно влиять на процесс ассоциации рибосомных субчастиц. Таким образом, исследование ассоциации рибосомных еубчастш на 48S комплексах, образованных на AUG триплетах в присутствии различных комбинаций иншщаторных факторов, позволило изучить влияние elFl, elFIA и eIF3 на этот процесс в уникальных условиях, когда эти факторы не являлись абсолютно необходимыми для образования 48S юшциаторных комплексов. Ассоциация рибосомных субчастиц исследовалась при помощи реакции синтеза метионил-пуромицина, имитирующей образование первой пептидной связи. Структура пуромицина настолько сходна со структурой З'-концевого участка аминоацилированной тРНК, что он способен связываться с рибосомным А-сайтом и реагировать с метионил-тРНК, находящейся в Р-сайте, с образованием метионил-пуромицина. Метионил-пуромицин не связывается прочно с рибосомой и может быть экстрагирован. Если: инициаторная тРНК аминоацшшрована при помощи З^-меченого метионина, то образованный метионил-пуромицин тоже радиоактивен и может быть детектирован при помощи сцинтилляционного счётчика. Индивидуально eIF5 и elFSB одинаково стимулировали синтез пуромицина в системе, содержавшей только eIF2 и elFIA (Рис. 19). elFl слегка стимулировал активность eIF5 и не влиял на активность elFSB, Включение в реакционную смесь eIF3 немного увеличивало активность eIF5B и сильно снижало активность eIF5. Одновременное включение в реакционную смесь eIF3 и elFl сильно снижало ассоциативную активность eIF5B и полностью ингибировало активность eIF5. Вместе eIF5 и eIF5B обладали сильным синергичным действием в присутствии полного набора инициаторных факторов (elFl, elFIA, eIF2 и eIF3). Таким образом, в присутствии полного набора иницаторных факторов, который необходим для образования 48S инициаторного комплекса на природной мРНК, ассоциация рибосомных субчастиц абсолютно зависит от обоих инициаторных факторов eIF5 и eIF5B. eIF5B обладал способностью действовать каталитически, за 30 минут стимулируя в среднем три цикла ассоциации рибосомных субчастиц (данные не показаны),

2.3 Роль eIF5 и eIF5B в стимуляции гидролиза связанной с e!F2 молекулы ГТФ. Поскольку ассоциирующая активность eIF5 и eIF5B ^зависит от набора инициаторных факторов, использованных для образования 48S комплекса, а гидролиз связанной с eIF2 молекулы ГТФ является необходимым условием ассоциации рибосомных субчастиц, в работе было проведено сравнение способности eIF5 и eIF5B стимулировать этот процесс в присутствии различных комбинаций инициаторных факторов (Рис. 20). 48S инициаторные комплексы были образованы на AUG триплетах в присутствии 32р. меченого ГТФ и различных комбинаций инициаторных факторов. eIF5 и eIF5B одинаково стимулировали гидролиз е1Р2-связанного ГТФ, когда 48S инициаторные комплексы содержали только eIF2 и elFIA. Одновременное присутствие в реакционной Смеси elFl и eEF3 сильно снижало стимулирующую активность eIF5B, но не влияло на активность eIF5. Принимая во внимание данные результаты и описанные выше результаты анализа синтеза метионил-пуромицина, можно сделать вывод, что в присутствии полного набора инициаторных факторов (elFl, elFIA, eIF2 и eIF3) гидролиз еГБ2-связанного ГТФ индуцируется инциаторным фактором eIF5, а не eIF5B, но этой активности eIF5 не достаточно для образования 80S рибосомного комплекса, и требуется присутствие eIF5B. В минимальной системе, содержащей инициаторные факторы eIF2 и elFIA, гидролиз е1Р2-связанного ГТФ может быть в равной степени стимулирован как eIF5, так и eIF5B, и этого достаточно, чтобы подготовить 48S инициаторный комплекс к ассоциации с 60S субчастицей.

2.4 Диссоциация инициаторных факторов с 48S комплекса в процессе ассоциации рибосомных субчастиц.

Одним из объяснений потребности в инициаторном факторе eIF5B для ассоциации рибосомных субчастиц может являться тот факт, что стимулируемый eIF5 гидролиз е1Р2-связанного ГТФ не достаточен для удаления с 48S комплекса всех инициаторных факторов. Для проверки этой гипотезы была исследована диссоциация инициаторных факторов с 48S комплексов, образованных на AUG триплетах с использованием различных комбинаций факторов, после инкубации их с eIF5. При использовании полного набора факторов гидролиз е]Р2-связанного ГТФ приводил к удалению только eIF2 из 48S комплексов, в то время как elFl и eIF3 оставались ассоциированными с 40S субчастицей (Рис, 21). Этот результат объясняет недостаточность eIF5 для ассоциации рибосомных субчастиц в присутствии полного набора факторов. Включение в реакционную смесь eIF5B не привело к изменениям в диссоциации факторов, и elFl и e!F3 оставались связанными с 40S субчастицей. Этот результат показывает, что eIF5B не играет подготовительную роль не зависимо от 60S субчастицы, a elFl и eIF3 удаляются самой 60S субчастицей непосредственно в процессе ассоциации, стимулируемом elFSB.

2.5 ГТФ-азиая активность eIF5B. 4 Центральная часть eIF5B содержит последовательности, характерные для ГТФ-связываюших бежов. Использование метода ультрафиолетового сшивания позволило показать, что eIF5B способен непосредственно связываться с ГТФ, не зависимо от рибосомных субчастиц и факторов инициации (Рис. 22А). 32р-Меченый ГТФ не очень стабильно связывался с eIF5B и легко обменивался на нерадиоактивный ГДФ, его негвдролизуемый аналог и ГДФ. eIF5B сам по себе не обладал ГТФ-азной активностью (Рис. 22Б). ГТФ-азная активность eIF5B стимулировалась одновременным присутствием в реакционной смеси 40S и 60S рибосомных субчастиц, значительно слабее -присутствием только 60S субчастиц и совсем не стимулировалась индивидуальными 40S субчастицами. Стимуляция ГТФ-азной активности eIF5B наиболее просто могла бы объясняться непосредственным связыванием фактора с рибосомными субчастицами. Такое взаимодействие фактора с 40S и 60S субчастицами было продемонстрировано при помощи метода быстрого центрифугирования через сахарозную подушку: в обоих случаях eIF5B обнаруживался в осадке рибосомных субчастиц (данные не показаны).

2.6 Зависимость активности eIF5B от связывания и гидролиза молекулы ГТФ. Для выяснения роли связывания ГТФ в функциональной активности eIF5B 48S инициаторные комплексы, образованные на AUG триплетах в присутствии ГТФ, были отделены от не включившегося в комплекс трифосфата при помощи гель-фильтрации и проинкубированы с eIF5, eIF5B и 60S в присутствии ГТФ, его негидролизуемого аналога ГМФФ№ или в их отсутствии. Полученные рибосомные комплексы были проанализированы центрифугированием через сахарозный традиент. Активность рекомбинантного AeIF5B587-!220 полностью зависела от присутствия в реакционной смеси ГТФ (Рис. 23А), в то время как полноразмерный нативный eEF5B сохранял небольшую активность в отсутствии ГТФ, которая тем не менее стимулировалась в три раза при связывании фактора с трифосфатом. 80S рибосомные комплексы также образовывались и в присутствии ГМФФ№. Однако в этом случае eIF5B был не способен работать каталитически. При использовании высоких концентраций фактора одинаковые количества 80S рибосом образовывались в присутствии ГТФ или ГМФФИФ (Рис. 23Б), тогда как при низких концентрациях eIF5B количество 80S рибосом* образованных в присутствии ГТФ, значительно превышало количество рибосом, образованных в присутствии ГМФФИФ. Таким образом, связывание ГТФ инициаторным фактором eIF5B требуется для принятия им активной конформации, в то время как гидролиз ГТФ не является необходимым для ассоциации рибосомных субчаствд, хотя невозможность гидролизовать ГТФ лишает eIF5B способности работать каталитически.

Исследование способности 80S рибосом, образованных в присутствии ГТФ или ГМФФКФ, реагировать с пуромицином показало, что более 60% "ГТФ" рибосом были способны синтезировать метионил-пуромицин, тогда как только 8% " ГМФФКФ " использование этого мутанта наглядно продемонстрировало, что в процессе эукариотической инициации трансляции принимает участие не одна, как предполагалось ранее, а две молекулы GTP: одна молекула связывается и гидролизуется инициаторным фактором eEF2, а другая - фактором eIF5B.

3. Механизм внутренней инициации трансляции.

Сканирующая модель инициации трансляции накладывает определённые ограничения на структуру эукариотических мРНК. В частности, подавляющее большинство эукариотических матриц моноцистронны, кэпированы, содержат относительно короткие 5-НТО, лишенные высокостабильных шпилечных структур, а инициация происходит, как правило, на первом от 5'-конца AUG кодоне. Трансляция очень небольшого количества вирусных и клеточных мРНК происходит не по сканирующему механизму, а по механизму внутренней посадки рибосом. В этом случае 40S рибосомная субчастица связывается не с 5'-концом 5-НТО матрицы, а с её внутренним участком, IRES-элементом (internal ribosomal entry site). IRES-элементы способны направлять трансляцию второго цистрона в бицистронных конструкциях в условиях, когда трансляция первого цистрона блокирована .введением в его 5'-НТО стабильной шпилечной структуры. IRES-элементы обычно включают несколько сот нуклеотидов и обладают очень развитой вторичной структурой. Трансляционная активность IRES-элементов зависит от их структурной целостности, и даже небольшие точечные мутации могут вызвать общую или тканеспцифическую потерю их активности. Характерной чертой IRES-элементов является также присутствие в них многочисленных AUG триплетов, не узнаваемых рибосомной субчастицей в качестве инициаторных. Такие отличия в структурах 5'-нетранслируемых областей большинства цитоплазматических мРНК и IRES-элементов свидетельствуют о том, что механизмы кэп-зависимой и внутренней инциации трансляции должны отличаться коренным образом.

3.1 Образование 48S комплекса на IRES-элементе РНК вируса энцефаломиокардита: специфическое взаимодействие IRES-элемента с фактором eIF4F.

Существование механизма внутренней ишциации трансляции впервые было показано для пикорнавирусных РНК (Pelletier and Sonenberg, 1988). Пикорнавирусы представляют собой мелкие икосаэдрические лишенные внешней оболочки вирусы с одноцепочечной РНК положительной полярности. Семейство включает 4 рода: энтеро- (полиовирусы, коксакивирусы, эховирусы й др.), рино- (вирусы насморка), кардио- (вирус энцефаломиокардита мьппей, менговирус, вирус Тейлера), афтовирусы (вирус ящура) и отдельно гепатовирус, претендующий на статус пятого рода. Размер 5'-НТО этих вирусов колеблется от 610-628 нуклеотидов (риновирусы) до 1167-1194 нуклеотидов вирус ящура). 5-конец пикорнавирусных РНК не содержит кэп-структуры, вместо этого с 5'-концом вирионных РНК связан небольшой вирус-специфический белок VPg, удаляемый в цитоплазме зараженных клеток. Большое сходство во вторичных структурах наблюдается между энтеро- и риновирусами, с одной стороны, и между кардио- и афтовирусами, с другой. Поскольку механизм инициации пикорнавирусных РНК значительно отличается от механизма инициации на котированных матрицах, возникает вопрос, благодаря чему обеспечивается кэп-независимая внутренняя посадка 40S рибосомной субчастицы на 5-НТО пикорнавирусных РНК: только ли благодаря специфическим, свойствам самих пикорнавирусных РНК, способных определённым образом взаимодействовать с тем же набором клеточных факторов, что и кэпированные клеточные мРНК, или же в процесс инициации пикорнавирусных матриц вовлечены специфические клеточные белковые факторы, одним из которых может являться полипиромидинтракт-связывающий белок (РТВ), специфически взаимодействующий с 5'-НТО вируса энцефаломиокардита (Borovjagin et al., 1990) и другими IRES-элементами. Потребность в канонических инициаторных факторах для инициации трансляции на пикорнавирусных и клеточных мРНК тоже может существенным образом различаться. Так, известно, что в клетках, зараженных энтеро-, рино- и афтовирусами, eIF4G подвергается протеолвтическому расщеплению в положении R641/G642, при котором N-концевой домен, связывающий eIF4E, отделяется от С-концевого домена, связывающего eIF3 и eIF4A, в результате чего трансляционный аппарат клетки перестаёт быть способным осуществлять синтез на кэпированных клеточных матрицах и полностью переключается на трансляцию вирусных РНК (Etchison et al., 1982).

Для ответа на эти вопросы в данной работе была проведена сборка 48S инициаторного комплекса на,РНК вируса энцефаломиокардита мыши в in vitro реконструированной системе. 5'-НТО энцефаломиокардитной РНК использованного в работе штамма имеет длину 833 нуклеотида и содержит 10 AUG триплетов. IRES-элемент высоко структурирован (Pilipenko et al., 1989), содержит около 450 яуклеотидов и расположен непосредственно к 5'-концу от инициаторного AUG834, являющегося одиннадцатым AUG триплетом (Рис. 25А). Образование 48S комплекса на IRES-элементе энцефаломиокардитной РНК было АТФ-зависимым и эффективно происходило в присутствии канонических инициаторных факторов eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F (Рис. 25В). Исключение из реакционной смеси eIF4B немного снижало образование 48S комплекса, но не иншбировало его полностью, в то время как нициаторные факторы еШ2, eIF3, eIF4A и e]F4F были абсолютно необходимы. Включение в реакционную смесь РТВ повышало образование 48S комплекса в полтора-два раза, но не являлось абсолютно необходимым для этого процесса. В отличие от образования 48S комплекса на (3 глобиновой мРНК, образование 48S комплекса на IRES-элементе энцефаломиокардитной РНК нетребовало присутствия инициаторных факторов elFl и elFIA. Это полностью согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что процесс инициации трансляции на энцефаломиокардитной мРНК не включает стадию сканирования

Kaminsky et al., 1990) и обеспечивается непосредственным связыванием 43S комплекса с инициаторным кодоном. Однако в присутствии только инициаторных факторов eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F большой процент рибосомных комплексов (около 40%) образовывался на десятом AUG826 триплете 5-НТО энцефаломиокардитной РНК, предшествующем инициаторному AUG834 (Рис. 25Б,В). Это очень сильно превышало относительную частоту инициации на AUG826 триплете при трансляции этой РНК in vitro и in vivo. Присутствие в смеси инициаторного фактора elFl с самого начала реакции или его добавление к уже предобразованным рибосомным комплексам сильно снижало образование инициаторного комплекса на AUG826 и соответствующим образом повышало его образование на AUG834 (Рис. 25Г). В настоящий момент неизвестно, какой структурный дефект комплекса, образованного на AUG826, является причиной его дестабилизации инициаторным фактором elFl. Однако очевидно, что elFl способен выполнять свою корректирующую функцию не только на матрицах, транслируемых по классическому сканирующему механизму, но и на мРНК, инициация которых происходит по механизму внутренней посадки рибосом. Включение в реакционную смесь инициаторного фактора elFIA повышало в полтора раза эффективность образования 48S комплекса на IRES-элементе энцефаломиокардитной РНК и увеличивало относительную интенсивность стоп-сигнала в положении +15, однако не влияло на соотношение комплексов, образованных на AUG826 и AUG834. Наряду со стоп-сигналами, соответствовавшими инициаторным рибосомным комплексам, на радиоавтограммах появлялся также интенсивный стоп-сигнал в положении С786 в Ji спирали, расположенной в основании J-K домена (Рис. 25В). Последовательное исключение из реакционной смеси различных компонентов показало, что появление стоп-сигнала в положении С786 было обусловлено специфическим взаимодействием IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК с инициаторным фактором eIF4F (Рис. 25Д). Это взаимодействие являлось АТФ-независимым и происходило как в отсутствии АТФ, так и при замене его на негидролизуемый аналог (данные не показаны). Для исследования специфичности и функциональной роли взаимодействия eIF4F с J-K доменом в работе были использованы D1 и D2 мутанты IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК. В мутанте D1 были удалены две трети верхей части J-K домена (нуклеотиды 701-763), но как было показано ранее (Evstafieva et al., 1982), эта делеция не нарушала целостность Ji и }2 шпилек в основании этого домена (Рис. 25Б). В мутанте D2 нуклеотидные остатки UAAAAA796-774 были заменены на AU (Рис. 25Б). Оба мутанта обладали очень низкой способностью образовывать 48S комплекс (данные не показаны). Инкубирование мутантов D1 и D2 с инициаторным фактором eIF4F не приводило к появлению стоп-сигнала в положении С786 (Рис. 25Д), что свидетельствовало о необходимости структурной целостности J-K домена для активности IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК и его взаимодействия с eIF4F.

3.2 IRES-элемент РНК вируса энцефаломиокардита взаимодействует с eIF4G субъединицей eEF4F.

Происходящее в зараженных энгеро-, рино- и афтовирусами клетках протеолитинеское расщепление eIF4G в положении R641/G642, отделюящее домен eIF4G, взаимодействующий с eIF4E, от домена, взаимодействующего с еШЗ и eIF4A (Рис. 26А), и таким образом, разобщающее кэп-связывающую и хеликазную/рибосом-связывающую функции eIF4F, не влияет на трансляционную активность IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК, хотя как было показано выше, eIF4F является необходимым для образования 48S комплекса. В клетках млекопитающих eIF4G существует в двух функциональных юоформах: eIF4GI и eIF4GII. Для определения роли различных субъединиц eIF4F в образовании 48S комплекса на энцефаломиокардитной РНК в настоящей работе были использованы экспресеированные в клетках E.coli рекомбинантные eIF4A и специфические домены eEF4GI. Образование 48S комплекса абсолютно зависело от присутствия инициаторного фактора elF4A и центральной части eIF4Gl6t3-l090, ответственной за взаимодействие eIF4G с eIF3 и eIF4A (Рис. 26Б), и не требовало N-концевого домена eIF4G и кэп-связывакицего фактора eIF4E. Центральный домен eIF4Gl6i 3-1090 был способен связываться с J-K доменом IRES-элемента энцефаломиокардитной РЖ в отсутствии АТФ и инициаторного фактора eIF4A (Рис. 26В) с той же специфичностью, что и нативный eIF4F. С-концевой фрагмент eIF4GIi078-1560 не обладал способностью специфически взаимодействовать с J-K доменом и поддерживать образование 48S комплекса на IRES-элементе энцефаломиокардитной РНК (Рис. 2бБ,В), Центральный домен eIF4Gl6i3-i090 в отсутствии АТФ и других инициаторных факторов ультрафиолетово сшивался с IRES-элементом и был способен сильно стимулировать ультрафиолетовое сшивание с IRES-элементом инициаторного фактора eIF4A (данные не показаны). Представленные выше результаты свидетельствуют о том, что механизм внутренней инициации трансляции на IRES-элементе энцефаломиокардитной РНК может быть обеспечен исключительно каноническими факторами инициации, при этом принципиальная разница между потребностью в факторах для инициации трансляции на энцефаломиокардитной РНК и кэп-зависимой инициации заключается в том, что инициация на IRES-элементе не требует присутствия кэп-связывакяцего фактора eIF4E и взаимодействующей с ним N-концевой области eIF4G, а также факторов elFl и elFIA. eIF4F взаимодействует с IRES-элементом энцефаломиокардитной РНК принципиально иным способом, основанным не на связывании eIF4E с 5'-концевой кэп-структурой РНК, а на специфическом взаимодействии центрального домена eIF4G с внутренним участком IRES-элемента. Такое взаимодействие eIF4G с IRES-элементом может играть роль, аналогичную роли взаимодействия eIF4E с концевой кэп-структурой, то есть обеспечивать связывание рибосомного 43S преинициаторного комплекса с определенным районом мРНК.

3.3 Определение сайта связывания eIF4G на IRES-элементе РНК вируса энцефаломиокардита.

Для картирования сайта связывания eIF4GI с IRES-элементом в работе использовался метод защиты от химических и энзиматических модификаций (foot-printing). Энцефаломиокардитная РНК и комплексы eIF4Gl6i3-l560 с IRES-элементом обрабатывались РНКазой VI, расщепляющей двуспиральные и другие спаренные или находящиеся в стэкинге участки РНК, диметилсульфатом (DMS), специфически модифицирующим неспаренные адениновые и в меньшей степени цитидиновые остатки, и 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимидом (СМСТ), модифицирующим неспаренные урвдиновые и гуанидиновые остатки РНК. Сайты расщепления или модификации определялись при помощи реакции обратной транскрипции. Полученные результаты суммированы на Рис. 27. Наиболее сильные защиты наблюдались в олиго(А) петле, соединяющей J и К домены (нуклеотиды ААААА770-774), а также в трёх прилегающих к ней спиралях (J1-J2, Ki и й). Такие структурные элементы, состоящие из олиго(А) петли, расположенной на стыке трёх спиралей, обнаруживаются в аналогичных позициях IRES-элементов многих других пикорнавирусов, включая все кардио- и афтовирусы. eIF4Gl6i3-i560 не образовывал специфических контактов с другими участками ЖЕЗ-элемеета энцефаломиокардитной РНК: так, никаких защит от химических или энзиматических модификаций не было обнаружено в Н, I или L доменах. Более того, делеция нуклеоидов 485-647 в верхней части Домена I, приводящая к трансляционной инактивации энцефаломиокардитной РНК, не повлияла на связывание eIF4G с IRES-элементом (данные не показаны). Это свидетельствовало о том, что специфическое взаимодействие eIF4G с РНК вируса энцефалоимиокардита обусловлено взаимодействием фактора только с районом J-K домена и является необходимым, но не достаточным условием функционирования IRES-элемента.

3.4 eIF4A стимулирует связывание eIF4G и IRES-элемента РНК вируса энцефаломиокардита.

Фрагмента eIF4Gl6l3-i560 и его производные специфически связывались с IRES-элементом с довольно низкой аффинностью: константа диссоциации Kd для индивидуальных фрагментов eIF4GI различной длины, определённая при помощи титрования на фильтрах, составляла 120-800 пМ (Табл. 1А) и лишь незначительно отличалась от константы диссоциации для неСпицифического связывания тех же фрагментов eIF4GI с некэпированной (5-глобиновой мРНК (данные не показаны). Очевидно, что такое довольно низкое сродство eLF4G РНК вируса энцефаломиокардита к eIF4G, не могло объяснить, как энцефаломиокардитная РНК могла успешно конкурировать с другими клеточными мРНК за инициаторный фактор eEF4F. Оказалось, что включение в реакционную смесь инициаторного фактора eIF4A увеличивало сродство eIF4G к IRES-элементу на два порядка (Табл. 1А). Такой стимулирующий эффект eIF4A не зависел от АТФ-связывакяцей и АТФ-гидролизующей активностей eIF4A, поскольку IRES/eIF4G/eIF4A комплекс образовывался с одинаковой специфичностью и аффинностью как в присутствии, так и в отсутствии АТФ, а также eIF4A дикого типа мог быть заменён отрицательным транс-доминантным мутантом R362Q, не способным связывать АТФ, РНК и не обладающим хеликазной активностью (данные не показаны). eIF4A не стимулировал неспецифическое связывание eIF4GIc некэпированной 0-глобиновой мРНК (данные не показаны). Таким образом, взаимодействие IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК с eIF4G/eIF4A комплексом, а не с индивидуальным eIF4G обеспечивает конкурентноспособность этой РНК с клеточными матрицами за связывание с инициаторным фактором eIF4F. eIF4A может, таким образом, обеспечивать дополнительный сайт контакта с IRES-элементом и/или изменять структуру eIF4G, повышая его аффинность к РНК вируса энцефаломиокардита. Если минимальный фрагмент eIF4GI, способный специфически взаимодействовать с IRES-элементом, содержал около 200 аминокислот, при этом его N-концевая граница располагалась между 746 и 772 аминокислотами, а С-кояцевая - между 941 и 949 аминокислотами, то для связывания eIF4G с eIF4A и образования тройного комплекса eIF4G/eIF4A/IRES дополнительно требовались 24 N-концевых аминокислоты (722-746) (Табл. 1А,Б). Определённые мутации в eIF4G (L729A/L734A/F737A и R935A/F938A) специфически ингибировали способность фактора взаимодействовать с eIF4A, не влияя на его способность связываться с IRES-элементом, в то время как другие мутации (L857A/I860A и I749T/R754I), наоборот, ингибировали связывание eIF4G с IRES-элементом, не оказывая влияния на связывание с eIF4A (Табл.1Б и данные не показаны). Таким образом, связывание eIF4A и IRES-элемента предъявляет различные требования к структурной целостности eIF4G. Мутации в eIF4G, нарушающие его способность связывать eIF4A, делали фактор не способным стимулировать образование 48S инициаторного комплекса, даже если он сохранял способность специфически взаимодействовать с IRES-элементом (Табл. 1Б). Наиболее простым объяснением этому может служить потребность в локальном расплетании вторичной структуры определённого участка IRES-элемента вблизи инициаторного кодона, необходимая для прямой посадки на него 43S преинициаторного комплекса без предварительного сканирования. В этом случае связывание eIF4G с J-K доменом нацелило бы хеликазную активность eIF4A на определённый участок IRES-элемента. В соответствии со сканирующей моделью, первичное связывание 43S комплекса с 5'-концевым участком кэпированной мРНК обеспечивается взаимодействием eIF3, входящим в состав 43S комплекса, с eIF4G субъединицей eIF4F. В наших экспериментах фрагмент eIF4Gl697-969, не содержавший аминокислоты с 967 по 1076, необходимые для связывания eIF4G с eIF3, стимулировал образование 48S комплекса на РНК вируса энцефаломиокардита (Табл. 1Б). Таким образом, приямое взаимодействие eIF4G с eIF3 не является необходимым условием инициации трансляции на этой матрице. Это не исключает возможности взаимодействия eIF3 с eIF4G через промежуточные белок-белковые взаимодействия, например, eIF4B способен связываться с eIF3 и 40S субчастицей и функционально взаимодействовать с eIF4F и eIF4A. С другой стороны, нельзя исключить возможности существования пока не обнаруженных взаимодействий IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК с другими компонентами 43S комплекса.

Таблица 1. Константы связвания мутантов eIF4G с IRES-элементом РНК вируса энцефаломиокардита в присутствии и отсутствии eIF4A (А). Функциональная активность мутантов eIF4G (Б).

Kj (BM)

JF4GI иутаяты -dF4A + .IF4A dF4Gl(643-i076) eIF4GI(697-1076) eIF4Gl<722.1076) eIF4GI(734-1076) eIF4GI(746-1076) 1,400 1, eIF4GI(772-1076) >6,000 >6, tIF4GI(697-%9) dF4GI(697-949) 2, eIF4GI(697-94t) 3,000 3, tIF4GI(697-869) >8,000 >8,

3.5 Третичная структура центрального домена eIF4G.

В сотрудничестве с лабораторией профессора С. Бёрли в Рокфеллеровском Университете (США) была определена кристаллическая структура центрального домена eIF4GII (аминокислоты с 745 по 1003) с разрешением в 2,4А. Этот фрагмент соостветствует фрагменту с 712 по 970 аминокислоты другой изоформы eIF4GI. Идентичность аминокислот в этих фрагментах различных изоформ eIF4G составляет 88%. Фрагмент eIF4GIi745-l003 был функционально активен и способен специфически взаимодействовать с IRES-элементом энцефаломиокардитной РНК, с инициаторным фактором е№4А и стимулировать образование 48S инициаторного комплекса на РНК вируса энцефаломиокардита (данные не показаны). Фрагмент eIF4GIl745-ioo3 состоит из 10 а-спиралей, образующих правосторонний полукруглый соленоид с суперспиральной осью, перпендикулярной цилиндрическим осям а-спиралей (Рис. 28А, стр.58). Структура организована пятью находящимися одна над другой парами антипараллельных а-спиралей (каждая пара образует один, так называемый, повтор). 10 а-спиралей организованы в порядке la-lb-2a-21j-3a-3b-4a-4h-5a-5h. Это приводит к появлению двух слоёв а-спиралей с двумя поверхностями, образованными, соответственно, г и h а-спиралями. Петли между а-спиралями внутри повторов и петли между а-спйралями различных повторов расположены на противоположных сторонах молекулы. Находящиеся рядом повторы стабилизированы солевыми мостиками и Ван-дер-Ваальсовыми связями на протяжении всей полипептидной цепи, что приводит к появлению протяжённой гидрофобной сердцевины молекулы, а-спирали внутри повторов 1-2 и 3-5 организованы в параллельные слои с углом поворота между соседними повторами менее 25° вокруг оси соленоида. Закрут соленоида образуется за счёт 50° правого поворота повтора 3 относительно повтора 2. Структуру петель между спиралями 2h-3a и За-ЗЬ определить не удалось, поскольку эти районы не обладали чёткой электронной плотностью. Структурная организация фрагмента eIF4GIl745-ioo3 позволила отнести его к семейству белков с, так называемой, структурой HEAT повторов (Andrade and Bork, 1995). Эти белки участвуют в очень разнообразных клеточных процессах, требующих образования больших мультибелковых комплексов. Как правило, белки этой группы не содержат консервативных аминокислот. НЕАТ-повторы состоят из двух антипараллельных а-спиралей различной длины (цепи а и Ь) и организованы в структуры по 3-22 повтора (в среднем, по 14 повторов на молекулу). Наличие пролинов в а а-спиралях приводит к их изгибу. Многие из Ь а-спиралей также изогнуты. Наибольшее отличие eIF4GIl745-ioo3 от других членов семейства состоит в том, что а-спирали eIF4GH не изогнутые, а прямые, поскольку не содержат пролинов. Для определения участков связывания IRES-элемента энцефаломиокардитной РНК и инициаторного фактора eIF4A был проведён направленный мутагенез аминокислотных остатков, находящихся на поверхности eIF4GIl745-ioo3. Аминокислотные замены

Arg814Asp/Lys820Asp и Arg834Asp/Lys835Asp приводили к потере способности eIF4GIl745-l003 связываться с IRES-элементом, замены Arg756Asp/Arg759Asp/Lys764Asp и Lys798Ala частично снижали IRES-связывающую активность eIF4GIl745-ioo3, а замены Arg814Asp/Lys820Asp и Arg756Asp/Arg759Asp/Lys764Asp очень сильно снижали способность eIF4GIl745-i003 взаимодействовать с eIF4A (данные не показаны). Данные мутагенеза eIF4GIl745-l003, описанные выше данные мутагенеза eIF4GI и опубликованные ранее в литературе данные по мутагенезу дрожжевого eIF4G и человеческого eIF4GI

Iraataka and Sonetiberg, 1997; Neff and Sachs, 1999; Morrno et al.,2000) позволили нам идентифицировать две различные поверхности eIF4G, вовлеченные во взаимодействие с IRES-элементом энцефаломиокардитной РНК и инициаторным фактором. Вся поверхность, образованная петлями между повторами, вовлечена во взаимодействие с eIF4A (Рис. 28Б, чёрный цвет). Область, ответственная за связывание с IRES-элементом, располагается на поверхности, образованной Внутренними петлями повторов 1,2 и 3 (Рис. 28Б, голубой цвет). Поверхность петли, соединяющей а-спирали 2jj и За, важна для взаимодействия eIF4G как с IRES-элементом, так и с eIF4A. Позиция этой неструктурированной петли показана чёрными точками. Сайты связывания IRES-элемента и eIF4A перекрываются в районе Arg814/Lys820. Поверхность связывания IRES-элемента положительно заряжена или гидрофобна. е1Р4А-связывающая поверхность высоко полярна, что свидетельствует о том, что белок-белковое взаимодействие может включать образование водородных связей и солевых мостиков. 3.6 Образование 48S комплекса на IRES-элементе РНК вируса Тейлера: роль трансдействующего фактора РТВ.

В последние годы в литературе накопились данные, свидетельствующие о том, что в инициации трансляции пикорнавирусных РНК помимо канонических факторов задействованы и особые клеточные транс-действующие факторы (ITAF - IRES transacting factors). На ранних стадиях изучения транс-действующих факторов нами и другими иследователями был обнаружен полипиримидин-тракт-связывакяций белок (РТВ), специфически взаимодействующий со всеми пикорнавирусными РНК. РТВ содержит четыре потенциальных РНК-связывающих домена, лишенных канонических RNP1 и RNP2 последовательностей, характерных для RRM мотива, однако наблюдается строгая консервация отдельных аминокислотных остатков, характерных для этого типа

РНК-связывающих доменов (Kenan et al., 1991). Добавление РТВ в реконструированную in vitro систему всего в полтора раза увеличивало образование 48S инициаторного комплекса на РНК вируса энцефаломиокардита дикого типа. Однако зависимость инициации трансляции энцефаломиокардитной РНК от РТВ очень сильно: повышалась при введении вставки из одного нуклеотида в е1Р40-связывающий сайт IRES-элемента (Kaminsky and Jackson, 1998). Foot-printing анализ показал, что РТВ связывается с несколькими довольно удалёнными по первичной структуре сайтами на IRES-элементе РЖ вируса энцефаломиокардита (Kolupaeva et al., 1996). Таким образом, можно предположить, что РТВ оптимизирует конформацию IRES-элемента, необходимую для связывания с eIF4F и/или 43S комплексом.

Первичная последовательность и вторичная структура IRES-элементов вирусов Тендера и энцефаломиокардита очень гомологичны, что позволяет отнести их к одному типу пикорнавирусных IRES-элементов, типу II (Pilipenko et al., 1989). Для идентификации факторов, необходимых для образования 48S инициаторного комплекса на IRES-элементе вируса Тейлера (штамм GDVII) в работе также была использована in vitro реконструированная система с последующим применением toe-printing анализа. В присутствии инициаторных факторов eIF2, eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F эффективность образования 48S инициаторного комплекса на инициаторном AUGi06s-70 кодоне IRES-элемента вируса Тейлера штамма GDVn бьша довольно низкой (Рис. 29А). Если включение в реакционную смесь РТВ оказывало лишь незначительный стимулирующий эффект на образование 48S комплекса на РНК вируса энцефаломиокардита, то РТВ в среднем в пять раз повышал образование 48S комплекса на близкородственном IRES-элементе вируса Тейлера (Рис. 29А). Присутствие elFl и elFIA не требовалось для сборки 48S комплекса на РНК вируса Тейлера, что соответствовало литературным данным, согласно которым инициация трансляции на этой матрице не включает стадии сканирования (Pilipenko et al., 1994). Помимо стоп-сигналов, характерных для образования 48S инициаторного комплекса, на радиограмме обнаруживались интенсивные сигналы, соответствовавшие позициям UUCCC1019-23, и более слабые стоп-сигналы в позициях СЮ72 и С1075 (Рис. 29). Последовательное исключение из реакционной смеси различных компонентов показало, что появление стоп-сигналов в положении UUCCC1019-23 в основании J-K домена было обусловлено специфическим взаимодействием IRES-элемента РНК вируса Тейлера с инициаторным фатором eIF4F (Рис. 29Б). Как и в случае РНК вируса энцефаломиокардита, центральный домен eIF4Gl6i3-i090 был способен связываться с J-K доменом IRES-элемента РНК вируса Тейлера в отсутствии АТФ и инициаторного фактора eIF4A и приводить к появлению стоп-сигналов в положении UUCCC1019-23 (данные не показаны). Стоп-сигналы в положениях С1072 и С1075 были обусловлены взаимодействием IRES-элемента с комплексом eIF4G/eIF4A, присутствие в реакционной системе индивидуальных eIF4G или eIF4A не приводило к появлению этих стоп-сигналов (данные не показаны). Стоп-сигналы в положениях С1072 и Сю75 усиливались в присутствии РТВ (Рис. 29). Следовательно, РТВ повышал эффективность образования eIF4F/IRES комплекса на РНК вируса Тейлера. Таким образом, процесс инициации на структурно сходных IRES-элементах РНК вирусов энцефаломиокардита и Тейлера хотя и различается по потребности в РТВ, в остальном происходит по сходному механизму, включающему специфическое связывание eIF4F с аналогичными участками IRES-элементов. 3.7 Образование 48S комплекса на IRES-элементе РНК вируса ящура: роль трансдействующих факторов РТВ и ITAF45.

Вирусы Тейлера и ящура являются, соответственно, нейротропным и эпителиотропным пикорнавирусами. Первичная последовательность их IRES-элементов идентична на 40%.

Однако замена IRES-элемента вируса Тейлера на IRES-элемент вируса ящура привела к получению аттенуированного вируса, не способного реплицироваться в центральной нервной системе, при этом такая замена IRES-элемента не повлияла на репликацию химерного вируса в клетках ВНК-21 и трансляционную активность его РНК в кроличьем ретикулоцитном лизате (данные не показаны). В отличие от РНК вирусов энцефаломиокардита и Тейлера, ииициаторные факторы eEF2, eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F были не достаточны для образования 48S комплекса на РНК вируса ящура в in vitro реконструированной системе (Рис. ЗОА). Включение в реакционную смесь РТВ также не привело к образованию 48S комплекса на этой РНК, хотя из литературных данных известно, что РТВ специфически связывается с IRES-элементом вируса ящура (Kolupaeva et al., 1996) и стимулирует трансляцию вирусной матрицы in vitro. В работе было проведено выделение из ретикулоцитов кролика недостающих факторов, необходимых для сборки 48S комплекса на РНК вируса ящура. В результате были очищены два белка, добавление которых было необходимым и достаточным для появления стоп-сигналов, соответствовавших 48S комплексу, образованному на инициаторном кодоне РНК вируса ящура (Рис. ЗОА). Одним из факторов оказался полшгаримидин-тракт-связывакяций белок РТВ. Молекулярный вес второго белка составил 45 кД. В соответствии с его функцией и молекулярным весом, он был назван ITAF45. Секвенирование триптических пептидов ITAF45 идентифицировало его как кроличий гомолог мышиного ассоциированного с пролиферацией белка Mppl (Nakagawa et al., 1997) или его человеческого аналога PAG24 (Lamartine et al., 1997). ITAF45 обладает значительной гомологией с аминопептидазами типа II археобактерий и эукариот. Гомология распространяется на всю последовательность белков и включает четыре из пяти консенсусных аминокислот, координирующих два атома кобальта в этих металло-ферментах (Tahirov et al., 1998). Эта группа ферментов включает метиониновую аминопептидазу р67, задействованную в регуляции трансляции и взаимодействующую с у-субъединицей eIF2 и ингибирующуто фосфорилирование его асубъединицы (Ray et al., 1993). ITAF45 - пролиферация-зависимый белок, не обнаруживающийся в непролифёрирующих дифференцированных клетках, таких как мышиные клетки мозга (Radomsky and Jost, 1995). ITAF45 не стимулировал образование 48S комплексов на РНК вирусов Тейлера и энцефаломиокардита и не был способен заменить РТВ при сборке 48S комплекса на РНК вируса Тейлера, хотя специфически связывался с этими IRES-элементами (данные не показаны). Различная потребность в ITAF45 IRES-элементов РНК вирусов Тейлера и ящура может объяснить тот факт, что замена IRES-элемента вируса Тейлера на IRES-элемент вируса ящура привела к получению аттенуированного вируса, не способного реплицироваться в центральной нервной системе. Как и в случае РНК вирусов Тейлера и энцефаломиокардита, eIF4F специфически взаимодействовал с J-K доменом РНК вируса ящура. Это приводило к появлению стоп-сигналов в положении UG664-5 (Рис. ЗОА). Более детальный анализ показал, что центральный домен eIF4G607-i076 в отсутствии eIF4A связывался с J-K доменом РНК вируса ящура специфически, но слабо, давая только один стоп-сигяал в положении G665, а включение в реакционную смесь eIF4A усиливало этот стоп-сигнал и приводило также к появлению стоп-сигнала в положении U664 (Рис. ЗОБ). Присутствие в реакционной смеси РТВ и ITAF45 усиливало стоп-сигналы UG664-5. Присутствие в реакционной смеси РТВ также приводило с появлению стоп-сигналов в положениях GCCG681-4 и UUU690-2, не зависимо от присутствия других инициаторных факторов. Как было показано ранее, нуклеотидные остатки UUU690-2 непосредственно задействованы во взаимодействии IRES-элемента РНК вируса ящура с РТВ (Kolupaeva et al., 1996). Стоп-сигналы в позициях GU671-2 появлялись только при одновременном присутствии eEF4G, РТВ и ITAF45. Таким образом, РТВ и 1TAF45 усиливали связывание eIF4G/eIF4A с РНК вируса ящура, что в свою очередь могло способствовать связыванию 43S комплекса и образованию 48S инициаторного комплекса на этой РНК. Для картирования сайтов связывания eIF4G, eIF4A, РТВ и ITAF45 с IRES-элементом вируса ящура в работе использовался foot-printing анализ. РНК-белковые комплексы обрабатывались РНКазой Т1, расщепляющей РЖ после неспаренных G нуклеотидов, и СМСТ, модифицирующим неспаренные уридиновые и гуанидиновые остатки. Результаты суммированы на Рис. ЗОВ. 1TAF45 связывался в основании домена I, РТВ образовывал множественные контакты с доменами Н, К и к З'-концу от домена L, a eIF4G/eIF4A комплекс взаимодействовал с J-K доменом. РТВ и ITAF45 также повышали доступность некоторых участков IRES-элемента РНК вируса ящура для модификации использованными реагентами, что свидетельствовало о конформационных изменениях IRES-элемента.

Таким образом, инициация трансляции на близкородственных IRES-элементах РНК вирусов энцефаломиокардита, Тейлера и ящура требует одинакового набора канонических факторов и включает специфическое взаимодействие eIF4G/eIF4A с аналогичными участками их IRES-элементов, однако значительно различается по потребности в неканонических транс-действующих факторах: инициация на РНК вируса энцефаломиокардита лишь незначительно зависит от присутствия РТВ, инициация на РНК вируса Тейлера сильно зависит от присутствия РТВ, а инициация на РНК вируса ящура нуждается в присутствия РТВ и ITAF45. Интересно, что все три IRES-элемента были способны связывать как РТВ, так и ITAF45. Наиболее вероятно, неканонические транс-действующие факторы исполняют роль шаперонов, которые взаимодействуют с IRES-элементами и помогают им принимать и поддерживать активную конформацию, необходимую для эффективного взаимодействия с eIF4G/eIF4A, а также, возможно, и с другими компонентами 43S преинициаторного комплекса. Различная потребность в транс-действующих факторах, вероятно, отражает небольшие структурные различия в IRES-элементах РНК вирусов энцефаломиокардита, Тейлера и ящура и может быть ответственной за тканевую специфичность вирусов.

3.8 Образование 48S комплекса на IRES-элементах РНК вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи: специфическое взаимодействие IRES-элементов с 40S рибосомной субчастицей й инициаторным фактором eIF3.

РНК вирусов гепатита С и пестивирусов (вирус классической лихорадки свиньи), относящихся1 к семейству флавивирусов, содержат родственные IRES-элементы, абсолютно отличные от IRES-элементов пикорнавирусных РНК. Эти IRES-элементы составляют примерно 330 нуклеотидов и включают около 30 нуклеотидов прилегающей к инициаторному кодону кодирующей последовательности. 5'-НТО вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи состоят из четырёх основных структурных доменов I-IV, три из которых (II-IV) составляют IRES-элемент. Домен IV включает инициаторный кодон. Между доменами П, Ш и IV находится функционально важная псевдоузельная структура (Рис. 31А,Б). Для идентификации инициаторных факторов, необходимых для образования 48S комплексов на IRES-элементах вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи в работе была использована in vitro реконструированная система. Рибосомные комплексы анализировались при помощи toe-printing анализа и центрифугирования в сахарозном градиенте. Оба IRES-элемента обладали беспрецедентной способностью специфически связываться с 40S субчастицами в отсутствии инициаторных факторов. Бинарные 40S/IRES комплексы были настолько стабильны, что выдерживали условия сахарозного градиента (данные не показаны). При использовании toe-printing анализа образование бинарных комплексов 40S рибосомных субчастиц с IRES-элементом вируса гепатита С приводило к появлению на радиограммах стоп-сигналов, соответствовавших позициям G318 и G320 в районе псевдоузла, а также позициям нуклеотидов CU355-6, находящихся на расстоянии +14-15 нуклеотидов к 3'-концу от инициаторного кодона AUG342-344 (Рис. 31В). Бинарные комплексы 40S рибосомных субчастиц с IRES-элементом вируса классической лихорадки свиньи характеризовались стоп-сигналами в позициях Сзз4 и G345 в районах псевдоузла, а также в позициях нуклеотидов UUU387-9, находящихся на расстоянии +15-17 нуклеотидов от инициаторного кодона AUG373-5 (Рис. 31Г). Таким образом, 40S рибосомные субчастицы связываются с этими IRES-элемеитами в районе псевдоузлов, при этом позиции стоп-сигналов в положениях +14-15 нуклеотидов от инициаторного кодона вируса гепатита С и в положениях +15-17 нуклеотидов от инициаторного кодона вируса классической лихорадки свиньи свидетельствуют о том, что при таком связывании прилегающая к инициаторному кодону нуклеотвдная последовательность стабильно фиксирована в РНК-связывающем центре рибосомной субчастицы, а сам инициаторный кодон находится в рибосомном Р сайте. Добавление в реакционную смесь инициаторной тРНК и инициаторного фактора eIF2 привело к исчезновению стоп-сигналов в позшщях CU355-6 и ослаблению стоп-сигналов в позициях G31S й G320, а также к появлению новых интенсивных сигналов в позициях ААА357-9 (+16-18 нуклеотидов к З'-концу от инициатоного кодона) на РНК вируса гепатита С (Рис. 31В). Появление стоп-сигналов в позициях ААА357-9 абсолютно зависело от присутствия в реакционной смеси 40S субчастиц, eEF2 и инициаторной тРНК и, таким образом, отражало образование стабильного кодон-антикодонового взаимодействия, что свидетельствовало о том, что это этот рибосомный комплекс является полноценным 48S инициаторным комплексом. Введение в реакционную смесь инициаторных факторов eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F не привело к дальнейшим изменениям в стоп-сигналах G318, G320 и ААА357-9 (Рис. 31В). Таким образом, инициаторные факторы eIF3, eIF4A, eIF4B и eIF4F не влияли на взаимодействие 40S рибосомной субчастицы с IRES-элементом вируса гепатита С. Интересно, что присутствие в реакционной смеси инициаторного фактора eIF3 (индивидуально или в комбинации с рибосомными субчастицами и другими факторами инициации) приводило к появлению стоп-сигналов в положениях АА243-4 в основании домена III (Рис. 31В). Таким образом, IRES-элемент вируса гепатита С обладал способностью специфически взаимодействовать не только с 40S рибосомными субчастицами, но и с инициаторным фактором eIF3. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с использованием IRES-элемента вируса классической лихорадки свиньи. Добавление в реакционную смесь аминоацилированной Met-tRNAi и инициаторного фактора eIF2 привело к ослаблению стоп-сигаалов в позициях Сзз4, G345 и UUU387-9, характерных для бинарного комплекса с 40S субчастицей, а также к появлению новых интенсивных сигналов в позициях UGA390-2 (+18-20 нуклеотидов к 3'-концу от инициаторного кодона AUG373-5) (Рис. 31Г). Введение в реакционную смесь инициаторных факторов eIF4A, eIF4B и eIF4F не повлияло на интенсивность стоп-сигналов С334, G345, UUU387-9 и UGA390-2, а добавление инициаторного фактора eIF3 ещё более усилило интенсивность сигналов UGA390-2, характерных для связывания 43S комплекса, и снизило интенсивность сигналов С334, G345 и UUU387-9, характерных для бинарного комплекса с 40S субчастицей (Рис. 31Г). Как и в случае РНК вируса гепатита С, IRES-элемент вируса классической лихорадки свиньи специфически взаимодействовал с инициаторным фактором eIF3, что приводило к появлению стоп-сигналов в положениях АС250-1 также в основании домена Ш (Рис. 31Г). Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что 43 S комплекс в отсутствии eIF4A, eIF4B и eIF4F способен специфически и стабильно связываться непосредственно с инициаторными кодонами IRES-элементов вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи, образуя инициаторный 48S комплекс. Это взаимодействие обеспечивается способностью самой 40S рибосомной субчастицы в отсутствии инициаторных факторов специфически взаимодействовать с IRES-элементами РНК данных вирусов. Инициаторный фактор eIF3, также способный специфически связываться с IRES-элементами, может усиливать образование 48S комплексов, но ле является необходимым для этого процесса. 3.9 Характеристика сайтов свзывания 40S субчастиц и инициаторного фактора eIF3 на IRES-элементах вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи. Для характеристики сайтов связывания 40S субчастиц и еЩЗ на IRES-элементах вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи использовался foot-printing анализ. РНК-белковые комплексы IRES/eIF3 обрабатывались СМСТ, модифицирующим неспаренные уридиновые и гуанвдиновые остатки, РНКазой VI, расщепляющей двуспиральные и другие спаренные или находящиеся в стэкинге участки РНК, DMS, специфически модифицирующим неспаренные адениновые и в меньшей степени цигидиновые остатки, и РНКазой One, расщепляющей одноцепочечные участки РНК. Полученные результаты суммированы на Рис. 32А,Б. В обоих случаях elF3 связывался с верхней частью домена Ш, обладающей структурой клеверного листа, образованного центральной спиралью домена и шпильками Ilia, IHb и Шс. Непосредственный сайт связывания включал субдомен 1ПЬ и участок стыка ШаЪс. Различия в нуклеотидных последовательностях еШЗ-связывающих сайтов IRES-элементов вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи свидетельствуют о важности третичной структуры для взаимодействия этих IRES-элементов с фактором. eIF3 млекопитающих состоит из И субъединиц с молекулярным весом от 28 до 170 кД. Использование метода ультра-фиолетового сшивания показало, что четыре субъединицы eIF3 (р170, р116, рбб и р47) непосредственно контактируют с IRES-элементами (данные не показаны). Неспецифическое взаимодействие |3-глобиновой мРНК с eIF3 включало контакт РНК только с р116 и рбб субъединицами, содержащими RRM мотив в их аминокислотной последовательности. Таким образом, IRES-элементы вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи образуют более обширные контакты с eIF3.

Бинарные 40S/IRES комплексы обрабатывались РНКазой VI, расщепляющей двуспиральные и другие спаренные или находящиеся в стэкинге участки РНК, и РНКазой Т1, расщепляющей РНК специфически после несларенных G нуклеотидов. Полученные результаты суммированы на Рис. 32В,Г. Аналогичные участки взаимодействия с 40S рибосомной субчастицей были обнаружены на обоих IRES-элементах. Эти районы IRES-элементов отличаются высокой степенью консервативности и включают верхнюю часть субдомена ПИ IRES-элемента вируса гепатита С и эквивалентный ему субдомен ffldl IRES-элемента вируса классической лихорадки свиньи, дсевдоузел и нуклеотиды, фланкирующие инициаторньш кодон. Количество нуклеотидов, защищаемое 40S рибосомной субчастицей в районе AUG кодона, примерно соответствует протяжённости РНК-связывакяцего центра 40S рибосомной субчастицы, что свидетельствует о том, что по всей вероятности, в дополнительных контактах 40S рибосомной субчастицы с субдоменами 1Ш и ПИ1, а также с псевдоузлом задействованы участки 40S субчастицы снаружи от РНК-связывакяцего центра. Таким образом, 40S рибосомная субчастица образует множественные, разделенные в пространстве, контакты с IRES-элементами вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи; при этом данные foot-printing анализа указывают на то, что сайты связывания 40S рибосомной субчастицы и инициаторного фактора eIF3 с IRES-элементами не перекрываются. 3.10 Образование 48S комплекса яа IRES-элементе РНК вируса паралича сверчка: специфическое взаимодействие IRES-элемента с 40S рибосомной субчастицей. Проведённый недавно анализ последовательностей РНК пикорна-like вирусов насекомых включая вирус паралича сверчка) выявил их двуцистронную природу (Johnson and Christian, 1998): 5' -концевая открытая рамка считывания, кодирующая неструктурные с.15 (А) Повитая аминокислот, замена которых на Cys проиводнла к получени мутантов elrl, способных расщеплять 18S рРНК. (Б) Позиции гидроксил-радикального расщепления 18S рРНК. (В) Гидрокснл-радикальное расщепление спирали 24а loS рРНК различными мутантами elFl.

Г) Моделирование относительного расположения elFl (жёлтый) и инициаториой тРНК (синяя)в 43S компелексе на основе данных гидроксил-радикального расщепления тРНК мутантами R38C, К42С и Е белки, отделена от З'-концевой открытой рамки считывания, кодирующей структурные белки, межцистронным районом (IGR - intergenic region), представляющим собой IRESэлемент (Wilson et al., 2000). IGR-IRES-элемент вируса паралича сверчка составляет всего около 200 нуклеотидов, обладает высоко развитой вторичной структурой, включающей сложный псевдоузел (Рис. 33А), и не содержит AUG, CUG или GUG триплетов, которые могли бы быть использованы в качестве инициаторных. N-концевое секвенирование продуктов трансляции, направляемой IGR-IRES-элементом, показало, что инициаторным кодоном является соответствующий аланину триплет GCU6217-6219, непосредственно прилегающий к псевдоузельной структуре, включающей 42 нуклеотида (Рис. ЗЗА). Структурная целостность псевдоузла является абсолютно критической для трансляционной активности GR-IRES-элемента. Для определения минимального набора инициаторных факторов, необходимых для инициации трансляции на IGR-lRES-элементе вируса паралича сверчка, была проведена сборка 48S инициаторного комплекса in vitro в реконструированной системе. Как и в случае IRES-элементов вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи, IGR-IRES-элемент вируса паралича сверчка специфически связывался с 40S рибосомными субчастицами в отсутствии инициаторных факторов. Бинарные 40SflGR-IRES комплексы были очень стабильны и выдерживали центрифугирование в сахарозном градиенте (данные не показаны). При использовании toe-printing анализа образование 40S/IGR-IRES бинарных комплексов приводило к появлению на радиограммах стоп-сигналов, соответствовавших позициям нуклеотидов AG«228-6229, находящихся на расстоянии +12-13 нуклеотидов от инициаторного кодона GCU6217-6219 и на расстоянии +15-+16 нуклеотидов от предшествующего ему триплета CCU6214-6216 (Рис. ЗЗБ). Такое положение стоп-сигналов свидетельствовало о том, что в 40SflGR-IRES бинарных комплексах в рибосомном Р сайте находится не инициаторный кодон GCU6217-6219, а предшествующий ему триплет CCU6214-6216, задействованный в образовании вторичной структуры псевдоузла. Инициаторный же кодон GCU6217-6219 находится в рибосомном А сайте. CCU триплет может быть заменён на любой другой кодон без ущерба для трансляционной активности IRES-элемента, если при этом соответствующие замены будут введены в нуклеотиды, AGG6189-6191 для сохранения вторичной структуры псевдоузла (Wilson et at, 2000). Добавление в реакционную смесь аминоацилированной Met-tRNAi и инициаторных факторов eIF2, eIF3, eIF4A, eDF4B, eIF4F, elFl и elFIA не приводило к появлению дополнительных стоп-сигналов, как это было в случае IRES-элементов вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи, а лишь ослабляло интенсивность стоп-сигналов в позициях СА6226-6227, характерных для бинарного комплекса с 40S субчастицей (данные не показаны), что свидетельствовало о снижении эффективности его образования. Центрифугирование в сахарозном градиенте показало, что развитая вторичная структура IGR-IRES-элемента не препятствует прямому связыванию 60S рибосомных субчастиц с бинарным комплексом 40S/IGR-IRES и образованию рибосомных комплексов 80S/IGR-IRES (данные не показаны). Как и ожидалось, образование 80S рибосомного комплекса на IGR-IRES не приводило к изменению стоп-сигналов, характерных для 40S/IGR-1RES бинарных комплексов. Для дальнейшего исследования механизма инициации трансляции на IGR-IRES-элементе вируса паралича сверчка было изучено влияние инициаторных факторов на активность IGR-IRES-элемента in vitro в кроличьем ретикулоцитном лизате. Добавление eIF2 не оказывало влияния на 5'-концевук> трансляцию первого цистрона бицистронной мРНК, в то время как трансляция второго цистрона, направляемая IGR-IRES-элементом вируса паралича сверчка, практически полностью ингибировалась в присутствии экзогенного eIF2 (Рис. 33В). Природа инициаторного кодона (GCU), результаты toe-printing анализа и снижение эффективности трансляции IGR-IRES-содержащей мРНК в кроличьем ретикулоцитном лизате в присутствии экзогенного eIF2 свидетельствовали в пользу беспрецидентного механизма инициации трансляции, не требующего участия ключевого инициаторного фактора eIF2. Для подтверждения этого предположения было исследовано влияние снижения концентрации активного eIF2 в клетках Cos7 (вследствие обработки их тапсигаршном) на трансляцию IGR-IRES-содержащей мРНК. Обработка клеток тапсигаргином вызывает накопление, в эндоплазматическом ретикуломе неправильно свёрнутых белков, что в свою очередь, приводит к активациии PERK киназы, фосфорилирующей а-субъединицу eIF2. Фосфорилированный eIF2 теряет способность обменивать ГДФ на ГТФ и, следовательно, образовывать eIF2-n4>-Met-tRNAi тройственный комплекс. В согласии с выдвинутой гипотезой, обработка клеток тапсигаргином приводила к снижению на 50-60% 5'-концевой трансляции первого цистрона бицистронной мРНК и к двукратному повышению трансляции второго цистрона, направляемой IGR-IRES-элементом вируса паралича сверчка (данные не показаны). Для окончательного доказательства фактор-независимого механизма инициации на IGR-IRES-элементе вируса паралича сверчка была проведена реконструкция in vitro процесса элонгации на этой матрице. Элонгационные факторы eEFlА и eEF2 были выделены из ретикулоцитного лизата, а индивидуальная аланиновая tRNA была клонирована, транскрибирована ш vitro и аминоацилирована при помощи аминоацил-ЙША-синтетаз, выделенных из ретикулоцитов кролика. Включение в реакционную смесь, содержавшую IGR-IRES мРНК, 40S и 60S рибосомные субчастицы, элонгационных факторов eEFl А и eEF2 и аминоацилированиой аланиновой tRNA приводило к появлению новых стоп-сигналов иААб231-й233 в положениях +15-+17 нуклеотидов от соответствующего аланину инициаторного триплета GCU6217-6219. Это свидетельствовало о прохождении первого шага элонгации и перемещения триплета GCU6217-6219 из рибосомного А сайга в Р сайт. При этом очевидно, что транслокация на этой стадии проходила без предшествующего ей в нормальных условиях образования пептидной связи. Этот эксперимент позволил доказать беспрецедентный механизм инициации трансляции на IGR-IRES-элементе вируса паралича сверчка, не требующий участия инициаторных факторов и инициаторной tRNA, в рзультате которого образуется 80S рибосомный комплексов котором Р сайт занимает не инициаторная tRNA, а сложная псевдоузельная структура IGR-IRES-элемента, имитирующая структуру tRNA и кодон-антикодоновое взаимодействие (Рис.ЗЗВ). выводы

Образование 48S комплексов в процессе 5'-концевой инициации трансляции.

1.В присутствии eIF4A, eIF4B и eIF4F 43S преинициаторные комплексы способны связываться с 5'-коицевым участком кэпированной 0-глобиновой мРНК, но для достижения ими инициаторного кодона необходимы инициаторные факторы elFl и elFlA.

2.eIFlA гомологичен более короткому прокариотическому инициаторяому фактору IF1. ЯМР анализ показал, что центральная часть elFIA содержит ОВ структуру, очень сходную с ОВ структурой фактора EF1.

3. По данным ЯМР анализа, elFl образует плотно свёрнутый домен с двумя ос-спиралями по одну сторону от Р-слоя, образованного пятью параллельными и антипараллельными ^-цепями.

4.43S преинициаторные комплексы способны узнавать 5'-конец мРНК с полностью неструктурированной 5'-нетранслируемой областью, связываться с ним и в присутствии elFl двигаться вдоль этой 5'-нетранслируемой области к инициаторному кодону в отсутствии АТФ и факторов, ассоциированных с АТФ гидролизом (eIF4A, eIF4B и eIF4F).

5. Сканирование 43S преинициаторными комплексами 5'-нетранслируемых областей, содержащих даже слабые шпилечные структуры, нуждается в присутствии АТФ и хеликазной активности eIF4A, eIF4B и eIF4F. В отсутствии eIF4F, инициаторные факторы eIF4A и eIF4B недостаточны для поддержания рибосомного сканирования.

6. Инициаторному фактору elFl принадлежит решающая роль в обеспечении правильности выбора инициаторного кодона: elFl отвечает за узнавание нуклеотидного контекста инициаторного кодона 43S комплексом, а также диссоциирует аберрантные рибосомные комплексы, образованные иа отличных от AUG триплетах и на мРНК с короткими лидерными последовательностями менее 8 нуклеотидов. Эти свойства elFl очень сходны со свойствами прокариотического инициаторного фактора IF3.

7. elFl связывается с 40S рибосомиой субчастицей в районе межсубъединичной поверхности платформы вблизи рибосомного Р сайта. Сайт связывания elFl на 40S субчастице аналогичен сайту связывания IF3 на прокариотической 30S субчастице. Позиция elFl на 40S субчастице свидетельствует скорее в пользу опосредованного механизма действия фактора, чем прямого инспектирования им области инициаторного кодона мРНК.

Ассоциация рибосомных субчастиц

1. Стимулируемый инициаторным фактором eIF5 гидролиз связанной с eIF2 молекулы ГТФ не приводит к диссоциации с 48S комплекса всех связанных с ним инициаторных факторов и, следовательно, не обеспечивает подготовку комплекса к ассоциации с 60S рибосомной субчастицей.

2.Для связывания рибосомных субчастиц необходимо участие ещё одного инициаторного фактора, eIF5B, являющегося гомологом прокариотического инициаторного фактора IF2.

3. eIF5B является ГТФазой, активность которой индуцируется рибосомными субчастицами.

4. Связывание ГТФ с eIF5B необходимо для принятия фактором активной конформации.

5. Гидролиз связанной с elFSB молекулы ГТФ не требуется для диссоциации инициаторных факторов с 48S комплекса и для связывания рибосомных субчастиц, но является необходимым для диссоциации самого eIF5B с образованных 80S рибосом.

Таким образом, процесс рибосомной ассоциации обеспечивается не одним, как предполагалось ранее, а двумя инициаторными факторами, и включает гидролиз не одной, а двух молекул ГТФ: одна молекула связывается и гадролизуется инициаторным фактором eIF2, а вторая - фактором eIF5B.

Внутренняя инициация трансляции

1 Образование 48S комплекса на IR Е S-элементе РНК вируса энцефаломиокардита (семейство пикорнавирусов) нуждается только в канонических инициаторных факторах (eIF2, eIF3, elF4A и ценртальном домене eIF4G) и включает специфическое взаимодействие J-K домена IRES-элемента с фактором eIF4G.

2. Образование 48S комплексов на IRES-элементах РНК вирусов Тейлера и ящура, гомологичных IRES-элементу РНК вируса энцефаломиокардита, требует того же набора канонических факторов (eIF2, eIF3, eIF4A и центрального домена eIF4G) и включает специфическое взаимодействие eIF4G с аналогичными участками их IRES-элементов, но значительно различается по потребности в неканонических транс-действующих факторах. Инициация на РНК вируса энцефаломиокардита лишь незначительно зависит от пиримидин-тракт связывающего белка РТВ, инициация на РНК вируса Тейлера сильно зависит от РТВ, а инициация на РНК вируса ящура нуждается в присутствия РТВ и пролиферационно-зависимого белка ITAF45, не обнаруживающегося в непролифнрирующих дифференцированных клетках.

3. Образование 48S комплексов на IRES-элементах РНК вирусов гепатита С и классической лихорадки свиньи (семейство флавивирусов) требовало присутствия только инициаторного фактора eIF2 и основывалось на специфическом взаимодействии участка IRES-элемента с 40S субчастицами.

4. Беспрецедентный мезанизм иницации трансляции на IRES-элементе вируса паралича сверчка (семейство ликориа-like вирусов насекомых) не требовал участия инициаторных факторов и основывался на специфическом взаимодействии IRES-элемента с 40S субчастицами, при котором рибосомный Р сайт занимает сложная псевдоузельная структура IRES-элемента, имитирующая инициаторную тРНК и кодон-антикодоновое взаимодействие.