Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние функциональных элементов в лидерах прокариотических мРНК на эффективность инициации трансляции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние функциональных элементов в лидерах прокариотических мРНК на эффективность инициации трансляции"

Российская Академия Наук

Ордена трудового красного знамени Институт биоорганической химии им. М.1У1. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

Комарова Анастасия Васильевна

Влияние функциональных элементов в лидерах прокариотических мРНК на эффективность инициации трансляции

03.00.03 - Молекулярная биология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук И.В.Бони

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,* профессор Л.Ю. Фролова

доктор химических наук, профессор A.M. Копылов

Ведущая организация:

НИИ Физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского,

МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «/Г» 0ИЯЯ6Р2 2003г в /^'Засов на заседании Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « »_2003г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

В.А.Несмеянов

2с=оЗ-Д.

Акт\

Актуальность проблемы Эффективность белкового синтеза у прокариот зависит от эффективности инициации трансляции. Информация о том, как эффективно будет узнаваться мРНК малой субчастицей рибосомы, закодирована, главным образом, в структурно-функциональных элементах ее лидерных последовательностей. В соответствии с общепринятой моделью ведущую роль в образовании инициаторных комплексов при инициации трансляции отводят последовательности Шайна-Дальгарно (SD), пурин-богатому участку перед инициаторным кодоном, образующему комплементарный дуплекс с 3'-концевой последовательностью 16S рРНК. В то же время, многие прокариотические мРНК эффективно транслируются и в отсутствие SD-последовательности. Имеющаяся информация о так называемых энхансерных элементах в 5'-нетранслируемых областях (5'-НТО) мРНК пока не обобщена в виде модели, так как механизмы трансляционного усиления все еще дискутируются. Таким образом, фундаментальные исследования молекулярных механизмов белкового синтеза представляют несомненную актуальность, поскольку до сих пор невозможно создать алгоритм, позволяющий предсказать эффективность инициации трансляции, а, следовательно, и процесса в целом, исходя из первичной структуры мРНК. Цель и задачи работы. В узнавании мРНК рибосомой на этапе инициации трансляции принимают участие два компонента малой субчастицы рибосом - 3'-концевой участок 16S рРНК (aHraSD), связывающий SD-последовательность, и рибосомный белок S1. Согласно данным, ранее полученным в нашей группе (Boni et al. 1991; Tzareva et al. 1994; Артамонова и др. 1998), белок S1 взаимодействует с U- или A/U-богатыми участками в мРНК-лидерах, которые выполняют функцию трансляционных усилителей (энхансеров). Целью настоящей работы явилась оценка вклада РНК-РНК (SD-amnSD) и РНК-белковых (Sl-мРНК) взаимодействий в эффективность трансляции. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Оценить вклад сильных SD-взаимодействий в эффективность трансляции in vivo.

2. В экспериментах in vitro (тоупринт-анализ) исследовать зависимость образования инициаторных комплексов на мРНК с протяженными SD-последовательностями от присутствия рибосомного белка S1.

3. Изучить влияние A/U-богатых участков-мишеней для белка S1 на эффективность трансляции мРНК с протяженными SD-элементами in vivo и образование инициаторных комплексов in vitro.

4. Исследовать зависимость стабильности мРНК от строения 5'-нетранслируемой

ОблаСТИ (ОТ ПРИСУТСТВИЯ ПрОТЯЖеННЫХ SD-ЭЛеМ^нтпп и S1 -читенкйЧ .

Научная новизна и практическая ценность работы. Для выполнения поставленных в работе задач была использована совокупность экспериментов in vivo и in vitro, позволяющая соотнести наблюдаемые in vivo эффекты с определенными молекулярными взаимодействиями. С помощью такого подхода в работе получены новые данные о негативном влиянии SD-последовательности с избыточной комплементарностью к 3'- концевому участку 16S РНК на эффективность трансляции in vivo; впервые показаны строгая необходимость присутствия рибосомного белка S1 при инициации трансляции даже при наличии протяженного SD-домена и способность белка S1 модулировать SD взаимодействия; найдена прямая корреляция между аффинностью белка S1 к мРНК-лидерам и эффективностью трансляции и показана возможность повышения продуктивности белкового синтеза при встраивании A/U-богатых S1-мишеней в 5'-сторону от протяженного SD-домена; наконец, получены новые данные о том, что стабильность мРНК определяется, главным образом, эффективностью ее трансляции. Результаты работы позволили впервые представить экспериментально-обоснованную динамическую модель инициации трансляции, описывающую роль Sl-мРНК и SD-взаимодействий при образовании инициаторных комплексов in vivo. Полученные в работе данные об эффективности трансляции мРНК, содержащих сильный SD-домен, и о роли A/U-богатых элементов в лидерных последовательностях прокариотических мРНК могут быть использованы при оптимизации генно-инженерных конструкций для экспрессии гетерологичных генов в E.coli.

Публикация и апробация работы. По теме диссертационной работы опубликовано две статьи и одна статья готовится к печати. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме для студентов и аспирантов «Ломоносов-99», г. Москва, Россия, 1999 г.; на Международной школе "Advanced Bacteria] Genetics Course" (CSHL) Колд Спринг Харбор, США, 2001г.; на 7-ой Международной конференции Общества РНК (RNA Society) «RNA 2002», Висконсин-Мэдисон, США, 2002г.; на Международном симпозиуме «Нетранслируемая РНК: роль в трансляции и регуляции генов" г. Осуа, Франция, 2003г.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на /»? ^страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждения, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован ¿9 _рисунками и о таблицами. Библиографический указатель включает цитированных работ.

* * . г * „. •

Содержание работы

До сих пор остается открытым вопрос о том, коррелирует ли эффективность инициации трансляции с термодинамическими параметрами связывания рибосомы с мРНК, иными словами, правомерно ли утверждение, что трансляционная эффективность определяется числом пар в SD-дуплексе, образуемом между 3'-концевым участком 16S рРНК и SD последовательностью мРНК. Хотя многие исследователи придерживаются именно такой точки зрения (см. последний обзор R.Jackson, 2000), это утверждение не основано на надежных экспериментальных данных; более того, оно противоречит очевидным фактам о том, что в клетках Е coli и других грам-отрицательных бактерий, а также хлоропластах и митохондриях хорошо транслируемые мРНК не имеют протяженных SD элементов. Первыми экспериментальными данными, поставившими под сомнение ведущую роль SD взаимодействий в узнавании мРНК рибосомой, были результаты, полученные с помощью SELEX-подхода (Ringquist el al., 1995). В этой работе было показано, что в отборе высокоаффинных лигандов к 30S субчастице рибосомы могут принимать участие только два компонента - рибосомный белок S1 и 3'-концевая последовательность 16S рРНК. Однако протяженный SD-элемент как высокоаффинный лиганд отбирался 30S рибосомами только в отсуплвие SI (SD-aHTHSD взаимодействия), а полноценными, S1-содержащими субчастицами отбирались те же РНК-аптамеры, что и в случае свободного белка S1 (мРНК-белок S1 взаимодействия). Такие результаты позволяют предполагать, что и ш vivo первичное связывание мРНК-транскрипта рибосомами направляется не SD- взаимодействиями. Поэтому основной целью настоящей работы являлась оценка вклада РНК-РНК (SD-aSD) и РНК-белок (мРНК-Sl) взаимодействий в эффективность инициации трансляции in vivo. Также нами была поставлена задача, выяснить, как зависит стабильность мРНК, содержащих протяженную SD-последовательность, от присутствия Sl-мишеней в 5'-НТО.

1. Эффективность трансляции мРНК, содержащих сильный SD-домен

Для изучения эффективности протяженного SD-элемента в инициации трансляции in vivo был использован молекулярно-генетический подход, основанный на создании хромосомных конструкций для количественной оценки выхода белка с одной копии гена (хромосомного lacZ-гена).

AKSD10H

Нас *

г* &и|Щ__ gcttc tfwdffl

I A^TOTCACCGGATUCWTTTOGOTijCABBAAAAACATG A AGCTTS AGCTTC lac-оператор SDIO

NtfiSD

I II

и U G

A U U А

A U №

C-G м

A G A-U

A G С-0

U-A U-G и С

A-U ННвенныя С А

G-C SD-мемнт G-C

GC М G-U

AG',=-14,3 ккал/моль

5'AAUUGUGAGC AAAGGAGGUGAAAAAACAL G

В и

A u II

A " AC, =-2,7 ккал/моль

AG UG

AG u A"*-Tovnpwtr+16

U-A C-G

A-U G-C

G-C A-U

G-C SD-мемат +1 A-U 5'AAUUGUGAGC AAAGGAOOUGAAAAAAMUGAAACA GAG

РИСУНОК 1 Строение регуляторной /ас-области (А) и соответствующая вторичная структура lacZ чРИК (Б и В) в штаммах AKSD с искусственными RBS, содержащими GCU (Б) нлн AAA (В) триплеты в качестве вторых кодонов. SD-элемент подчеркнут или изображен на схеме в виде чёрного прямоугольника; указано положение участков узнавания рестриктаз Ват№ и Mil (курсив), стартовый кодон выделен жирным шрифтом, разбивка на триплета отвечает трансляционной рамке 1ас2-гена Указаны свободные энергии образования локальных вторичных структур (шпилька II), расчетанные по программе RNAfoId [http //www bioinfo rpi edu/applications/mfold/old/ma]

Таблица 1 Эффективность трансляции lacZ мРНК в штаммах AKSD.

Штаммы SD ß-галдаозндазная активность*

AKSD10H AAGGAGGUGA 3504200

AKSB10 AAGGAGGUGA 1250±200

AKSD8 AAGGAGGU 5200±300

AKSD6 AAGGAG 7200±400

• -активность р-галактозидазы во фракции растворимых клеточных белков выражена в количестве ОНРС (нмоль), гидролизуемого в 1 мин. в пересчете на 1 мг тотального клеточного белка (нмоль ОЫРО/мин/мг белка).

Для начала, учитывая данные метода SELEX о структуре SD-содержащего РНК-лиганда (Ringquist, et al,1995), сведения об оптимальном нуклеотидном составе и длине участка, разделяющего SD-элемент и инициаторный кодон, а также информацию о наиболее распространенном втором кодоне, на основе вектора pEMBLA46 были получены плазмидные конструкции, в которых синтез а-пептида ß-галактозидазы управляется на транскрипционном уровне промотором и оператором /ас-оперона, а на трансляционном - искусственными участками связывания рибосом (RBS), содержащими SD-элементы разной длины и соединенными с кодирующей частью lacZ-гена с сохранением рамки считывания (Рис.1.А). Далее, отобранные с помощью теста на а-комплементацию плазмиды использовались для трансформации штамма HfrG6A12 (Lac') Е. coli, в котором /ас-промотор и область инициации трансляции хромосомного гена lacZ делегированы (Dreyfus, 1988). В содержащих плазмиду клетках по механизму гомологичной рекомбинации между плазмидной и хромосомной /ас-областями искусственные RBS, содержащие протяженные SD-элементы - SD10 (10 нуклеотидных остатков, комплементарных 3'-концевому участку 16S РНК), SD8 и SD6 (8 и 6 н.о. соответственно) - из плазмид встраивались в хромосому и направляли синтез ß-галактозидазы, что приводило к фенотипу Lac+. Полученные в результате рекомбинантные штаммы, названые AKSD10H, AKSD10, AKSD8, AKSD6, характеризовали по эффективности синтеза ß-галактозидазы (Табл.1).

Было показано, что химерные lacZ мРНК с протяженной 10-звенной SD-последовагельностью, направляют наименее эффективную трансляцию. Хотя при замене второго инициаторного ко дона GCU (AKSD10H) на ААА (AKSD10) и удалось повысить экспрессию, наибольший трансляционный выход обеспечивал б-звенный SD, чья активность в 6 раз превышает активность 10-членного SD (см. Табл.1).

Компьютерного анализ показал, что низкий уровень белкового синтеза, направляемого RBS с протяженным SD-элементом, в случае хромосомной конструкции SD10H объясняется, вероятнее всего, вовлечением инициаторного кодона химерной lacZ мРНК в формирование стабильной вторичной структуры (Рис.1.Б). Во всех последующих искусственных RBS (SD10, SD8 и SD6) мы понизили вероятность образования стабильной шпилечной структуры в районе инициаторного кодона путем замены одного часто встречающегося второго кодона (GCU) на другой (ААА) (Рис.1.В). Однако, несмотря па единообразие полученных вторичных структур RBS, при котором инициаторный кодон одинаково доступен для связывания рибосомой, 10-звенный SD-элемент направлял наименее эффективную трансляцию (см. Табл.1).

Возможной причиной низкого уровня белкового синтеза, направляемого протяженным SD-элементом, может быть образование малопродуктивного комплекса рибосома-мРНК, когда даже при наличии SD-дуплекса вероятность попадания инициаторного кодона мРНК в рибосомный Р-участок низка. В качестве теста на образование истинного инициаторного комплекса in vitro мы использовали метод тоупринтинга (toeprinting). Как известно, 308-субчастица, связанная с мРНК в присутствии инициаторной тРНК, тормозит синтез кДНК обратной транскриптазой в положении +16 (если первое основание инициаторного кодона принять за +1) (Hartz et al.,1988). ДНК-матрицы для синтеза РНК in vitro были получены с помощью Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) с использованием хромосомной ДНК соответствующих штаммов. Т7 промотор был введен в прямой праймер, так что РНК для экспериментов in vitro полностью соответствовали структуре 5'-концевых областей мРНК in vivo. Образование тройного инициаторного комплекса in vitro на мРНК, содержащих RBS с 10 и 6-звенными SD-элементами, проводилось с использованием двух типов 308-субчастиц: содержащих и лишенных рибосомного белка S1 (Рис.2).

РИСУНОК 2 Образование ЗОБ инициаторного комплекса (тоупринт анализ) на мРНК-транскриптах, соответствующих 5'- областям 1ас2 мРНК в штаммах АКвБЮ (А) и АКЗДб (Б). Авторадиограмма 6% денатурирующего ПААГ. А, в, С, Т - результаты секвенирования плазмид рЗОЮ(А) и р806(Б) с того же праймера (081ас), что и в случае тоупринт-анализа. Компоненты инициаторного комплекса, присутствующие (+) или отсутствующие (-) в реакционной смеси, указаны в таблицах над авторадиограммами. Концентрации компонентов:0.04 цМ РНК, 0.4цМ 308, 0.4цМ 308-81, 2цМ тРНК"". Отмечено положение инициаторного кодона (зведочки) и ЭБ-последовательпоста (черная линия слева от авторадиограммы).

Тоупринт-анализ показал, что:

1. в обоих случаях (на мРНК с 10 (Рис.2.А) и 6 (Рис.2.Б) -звенными SD-элементами) формирование истинного тройного инициаторного комплекса происходит только в присутствии инициаторной тРНК и белка S1;

2. интенсивность классического (А+16) тоупринт сигнала для обеих матриц соизмерима, поэтому наблюдаемая разница трансляционного выхода in vivo (более чем в 6 раз) не может быть объяснена различием в эффективности образования тройного инициаторного комплекса;

3. 30S рибосомы, лишенные белка S1, не способны к образованию истинного тройного инициаторного комплекса в присутствии инициаторной тРНК;

4. в случае 10-звенной SD-последовательности (но не 6-звенной) 30S рибосомы, лишенные белка S1, образуют протяженный SD-дуплекс в бинарном комплексе, который настолько прочен, что останавливает синтез кДНК обратной транскриптазой (сигналы -8/-9);

5. в бинарном комплексе между интактной (Sí-содержащей) 30S субчастицей рибосомы и мРНК, несущей SD10, сигнал от протяженного SD-дуплекса не выявляется, следовательно, присутствие белка S1 модулирует SD-взаимодействия, препятствуя образованию 10-членного SD-дуплекса;

6. образование в процессе инициации трансляции протяженного РНК дуплекса между мРНК и 16S рРНК (для 30S субчастиц без белка S1) не является гарантией его перехода в истинный инициаторный комплекс, в котором AUG-кодон находится в Р-сайте рибосомы, где он связан с антикодоном тРНК.

Таким образом, в качестве возможных причин ипгибирующего влияния протяжеипого SD-дуплекса на трансляцию in vivo не могут быть предложены ни различия в эффективности образования тройного инициаторного комплекса in vitro, ни значительные изменения внутримолекулярной структуры 5'-концевой области мРНК при укорачивании SD. Поэтому мы полагаем, что наблюдаемые различия в уровне трансляции in vivo определяются стабильностью SD-дуплексов. В самом деле, как показывают термодинамические расчеты, величины свободной энергии формирования SD-aSD дуплексов составляют -15.2, -11.1 и -6.1 ккал/моль для 10, 8 и 6-звенного SD-элементов соответственно. Принимая во внимание, что в процессе трансляции на определенной стадии элонгации SD-дуплекс должен разрушаться, освобождая RBS для связывания следующей 30S субчастицы рибосом, можно предположить, что слишком сильное SD-взаимодействие негативно влияет на трансляцию, т.к. увеличивает время,

необходимое, чтобы рибосома покинула шшциаторный сайт. Такая ситуация теоретически может вызывать нарушение сопряжения транскрипции и трансляции, торможение процесса образования полисом и, как следствие, низкий выход белкового продукта. По теоретическим оценкам, время полужизни РНК-дуплекса длиной и 10 п.о. при 30°С составляет не менее 30 мин, а в случае G-/C-6oraToro РНК-дуплекса может возрастать до 100 лет (см. Herschlag, 1995). Очевидно, что это бы полностью запретило трансляцию мРНК с 10-звенной SD-последовательностью. Если же в нашем случае синтез р-галактозидазы, направляемый протяженным SD-элементом, все же идет, хотя и с невысоким выходом, это говорит о том, что 10-членный SD- дуплекс in vivo не образуется, т.к. белок S1 препятствует его образованию.

Эти результаты позволяют сделать выводы об ингибирующем влиянии удлиненной SD-последовательности на трансляцию in vivo и о строгой необходимости присутствия белка S1 для инициации трансляционного процесса даже при наличии сильного домена SD.

2. Влияние A/U-богатых участков, введенных в 5'-сгорону от протяженной SD-последовательности, на эффективность трансляции lacZ мРНК in vivo

Хотя белок S1 и способен модулировать SD-взаимодействие, снижая количество комплементарных пар оснований в SD-дуплексе, однако даже в этом случае, протяженный SD-элеменг оказывается менее эффективным, чем 6-звенная SD-последовательносгь. Как известно, трансляционный выход может быть существенно повышен введением в 5'-НТО трансляционных энхансеров. Опираясь на предложенную в нашей группе ранее гипотезу (Boni et al., 1991; Tzareva et al., 1994), о том, что трансляционные энхансеры являются мишенями для белка S1, мы решили продолжить исследования в этом направлении и выяснить, увеличится ли трансляционный выход, если перед протяженными SD-последовательностями ввести участки с высоким сродством к S1. Ранее в работе Mogridge & Greenblatt (1998) было показано, что in vitro SI способен специфически и с высокой аффинностью связывать Бокс А - 12-звенный A/U-богатый участок в лидерной области транскриптов оперонов рибосомных РНК (тг-оперонов), на котором происходит сборка антитерминационного комплекса. Поэтому интересно было проверить, сможет ли эют реальный Sl-лиганд служить трансляционным энхансером in vivo.

Р/яс

г> В1 НохА ББ

/жчтератор

истстттаасаа

?1ас

г* сотрВохА В1

lAArrOTOA^KQGATMCAAmGGGATCTOATAAAJZZI^AOTGG4ГСCAИl ЛААЛАСАТГ, ААА /ас-оператор

ТГОТТАААОАОС

В

Р 1ас

В1 тшВохА 80

¡ааттотоаосксатаасаатттсст^ТССАСТС^П^Т^тсаоагссаишааааасатс ААА . йммсриор 'Щес^м^

|лл

РисуНОК 3 Строение 5'-концевой /ос-области в штаммах ВАвИ (А), СотрБАвБ (Б) и МШВАББ (В). ББ-домен изображен на схеме в виде черного прямоугольника, указано положение и последовательность БоксА-, комп-БоксА, мут-БоксА-элементов (для мут-БоксА единичные замены в последовательности Бокса А обведены в круг), указано положение участков узнавания рестриктазы ВатШ (В1, курсив), стартовый кодон выделен жирным шрифтом.

Таблица 2 Эффективность трансляции Ш мРНК в штамма* ВА5Б, СошрВАвО, \1utBASD, йгА^нШиА-йиЯ.

Штаммы во р-галактозидазная

активность •

ВАвО 10 8400 + 450

СошрВАЗО 10 ААШАШЮА 970011100

МиШАЯО 10 2700 ±300

ВА808 113501 600

ААСЮАОШ

СотрВА808 11300 1 600

ВАвБб 1100011200

СотрВА80 6 ААСШ}

1260011400

САва) 13001100

ДШМ-кЯ 350150

-активность р-галакгозидазы см. подпись к Таблице 1.

Для решения поставленной задачи использовались хромосомные конструкции с SD-элементами разной протяженности (SD10, SD8 и SD6, см. выше) (Рис.3). Бокс А с его естественными флангами был встроен в 5'-нетранслируемые области перед SD-элементами (Рис.З.А). В качестве контроля, были созданы аналогичные конструкции с последовательностью, комплементарной Боксу А (Рис.3.Б) и мутированным Боксом А (Рис.З.В), с пониженной аффинностью к SI (Mogridge & Greenblatt, 1998).

Измерения ß-галактозидазной активности в полученных хромосомных конструкциях показали, что как Бокс А, так и комплементарная ему последовательность работают in vivo как эффективные трансляционные усилители (энхансеры) (Табл.2). Это позволяет утверждать, что функция Бокса А в усилении трансляции не связана с его способностью повышать скорость транскрипции за счет участия в сборке антитерминационного комплекса (увеличение скорости синтеза мРНК в сходной конструкции с Боксом А перед /acZ-геном были показаны ранее в работе Vogel & Jensen, 1995). Следовательно, необходимо рассматривать полученный энхансерный эффект только с точки зрения инициации трансляции.

-БошА +БокА4 1 2° 3 4* 5 * 1 2 Э 4 S

РИСУНОК 4 Тоупринт-анализ образования ЗОБ инициаторных комплексов на мРНК. А: Присутствие БоксА-элемента перед 10-нуклеотидной вО-последовательностью не увеличивает стабильность инициаторного комплекса, Сиквенс приведен для плазмиды с БоксА-последовагельностью. Концентрации компонентов реакции см. в Рис.2. Б: олиго(Ц)-последовательностъ в лидере ЛгА мРНК способствует образованию более прочного комплекса мРНК - ЗОв - тРНК,м*. Тоупринт-анализ с понижением концентрации (рМ) ЗОЯ субчасгиц в пробах: (1)0.8; (2)0.4; (3)0 2; (4)0.1 и (5)0.05. Концентрация тРНКги" во всех пробах 4 рМ, РНК - 0.05 цМ.

Для начала нужно было проверить, связаны ли в этот раз различия в эффективности трансляции in vivo, с эффективностью образования тройного инициаторного комплекса in vitro. Сравнение результатов тоупринт-анализа на мРНК, содержащей БоксА-последовательпость перед 10-звенным SD-элементом с результатами на мРНК с тем же лидером, но без Бокс А-э л смета, не показало видимых изменений в эффективности формирования тройного инициаторного комплекса (Рис.4. А). Таким образом, и в этом случае тоупринт-анализ не передает трансляционную картину, наблюдаемую in vivo (7-кратное увеличение). Следует заметить, что это не является общим правилом. Для других мРНК, например химерных IhrA-lacZ и AUthrA-lacZ, эффективность формирования тройного инициаторного комплекса in vitro напрямую зависит от присутствия мишени для связывания белка S1 в 5'-НТО (Рис. 4.Б). В этом случае удаление олигои-элемента, расположенного в 5'-сторону от SD-домена, не только в 4 раза снижало р-галактозидазную активность (Табл. 2), но и значительно уменьшало эффективность формирования тройного инициаторного комплекса in vitro (Рис.4.Б). По-видимому, взаимодействие олигои с белком S1 вносит значительный вклад в стабилизацию тройного инициаторного комплекса. В случае же A/U-богатого Бокса А различий в эффективности тоупринта не наблюдается (Рис.4.А), и это позволяет предполагать, что БоксА может служить промежуточным сайтом при связывании 30S рибосомных субчастиц с мРНК in vivo.

Таким образом, наблюдаемое усиление трансляции никак не связано с влиянием Бокса А на транскрипцию или с изменением термодинамических параметров образования тройного инициаторного комплекса. Мы можем также исключить мРНК-16S рРНК взаимодействия как механизм трансляционного усиления, так как комплементарные друг другу последовательности одинаково эффективно усиливают трансляцию. Наиболее вероятно, что, будучи по составу A/U-богатыми последовательностями, как БоксА, так и ком-БоксА являются мишенями для связывания белком S1 и поэтому работают как трансляционные энхансеры. Согласно предложенной ранее гипотезе (Boni et al., 1991) механизм трансляционного усиления U- или A/U-богатыми последовательностями в лидерах мРНК связан с преимущественным связыванием энхансеров с белком S1 в составе 30S рибосом. Как известно, взаимодействие S1 с одноцепочечными РНК не обладает строгой специфичностью к последовательности (Subramanian, 1983), поэтому БоксА и комп-БоксА-элементы и могут усиливать трансляцию одинаково эффективно. Однако отсутствие строгой специфичности к последовательности РНК не значит отсутствие

таковой вообще, так как введение с помощью сайт-направленного мутагенеза в БоксА-последовательность точечных мутаций (мут-БоксА см. Рис.З.В) значительно снижает усиливающий эффект на трансляцию in vivo, по сравнению с эффектом Бокса А и комп-БоксА (Табл.2).

РИСУНОК 5 Сродство белка S1 к мРНК лидерам, содержащим бокеА (А), ком-ioncA (Б), мут-боксА (В) и не несущим эншгсерные последовательности (Г). Метод торможения в геле. Меченные ["Р aUTP] РНК-фрагменты получали с помощью и vitro транскрипции соответствующих 5'-НТ0 химерных lacl мРНК BASD10 (А), CompBASDIO (Б), MulBASDIO (В),и AKSD10 (Г) штаммов. Протяженность РНК-фрагментов в случае (А, Б, В) составляла 86 н.о и 130 ео для (Г) Аналю комплексов S1-PHK проводили в неденатурирующих условиях (8% ПААГ) с последовательным понижением концентрации белка S1 в реакционной смеси (цМ) (1)1; (2) 0.5, (3) 0 25, (4) 0 125, (5) 006, (6) 0.03 и (7) в последней (контрольной) пробе белок S1 отсутствовал Концентрация РНК-фрагментов во всех побах составляла 4-5 нМ.

Таблица 3 Трансляционные энхансеры в лидерах прокариотических

мРНК.

ген последовательность литературный источник

atpEE.coli UUUUAACUGAAACAAA McCarthy et al„ 1985

Т7 ген10 UUUAACUUUAA Olins & Rangwalla, 1989

Т4 ген 32 UUAAAUUAAAA Hartz et al., 1991

rpsA E.coli UUAAAUAUAAA Boni et al., 2001

rplL E.coli UUAUCUUUUUA Артамонова и др., 1998

tufM.genitalium UUAACAACAUAAUUU Loechel et al., 1989

a изТМУ РНК ACAAUUAC-повторы Gallie & Kado, 1989

rrn BoxA E.coli CACTGCUCUUUAACAAUUUAUCA* данная работа

CompBoxA UGAUAAAUUGUUAAAGAGCAGUG данная работа

* Последовательность ггпВ бокс А выделена жирным шрифтом и приведена в таблице вместе со своими природными фланками.

Предположение о том, что механизм трансляционного усиления на мРНК, содержащих БоксА и комп-БоксА-элементы в 5'-НТО, являегся результатом преимущественного связывания белка S1 в составе 30S рибосомных субчвсгиц с этими последовательностями, было проверено in vitro при помощи метода торможения в геле (Рис.5). Было показано, что сродство S1 к мРНК-лидерам, содержащим БоксА (Рис.5.А) и хом-БоксА (Рис.5.Б), сравнимо и при этом выше, чем сродство к лидерам, несущим мут-БоксА (Рис.5.В) или не несущим встроенных элементов (Рис.5.Г). Таким образом, сродство S1 к лидерным последовательностям напрямую коррелирует с эффективностью трансляции соответствующих мРНК ш vivo. Это полностью соответствует результатам работы Ringquist et al.{ 1995), где с помощью метода SELEX было показано, что свободный белок S1 и Sl-содержащая 30S субчастица рибосом обладают одинаковой РНК-селективностью.

Знхансерный эффект БоксА-элемента и комплементарной ему последовательности вполне логично дополняет имеющуюся информацию о трансляционных усилителях. Оба эти элемента являются A/U-богатыми однотяжевыми участками РНК, и по этому признаку их можно поставить в ряд с известными трансляционными энхансерами гена 10 фага Т7, гена 32 фага Т4, генов rplL, atpE и rpsA Е. coli (Табл. 3).

Полученные нами данные о значительном усилении трансляции при введении S1-мишеней в лидеры мРНК, даже при наличии сильного сигнала Шайна-Дальгарно, позволяют по-новому взглянуть на последовательность событий при инициации трансляции in vivo. Учитывая, что у прокариот трансляция мРНК начинается задолго до окончания ее транскрипции и что эти два процесса сопряжены, мы полагаем, что первое взаимодействие между мРНК и рибосомой - это Sl-зависимое связывание лидеров мРНК, которые первыми становятся доступны рибосоме после начала транскрипции (Рис.6.А). Наличие высокоаффинных к белку S1 мишеней в лидерах дает кинетические преимущества несущим их мРНК перед другими в конкуренции за рибосому. Это первичное связывание увеличивает концентрацию SD-домена в районе З'-концевого участка 16S рРНК, а образование SD-дуплекса (Рис.б.Б), в свою очередь, повышает концентрацию инициаторного кодоиа в районе Р-сайта (Рис.6 В). Такая схема объясняет, как могут транслироваться мРНК, лидеры которых не имеют SD перед инициаторным кодоном (число примеров растет с каждым годом) - в этом случае Sl-мРНК взаимодействия сами способны направлять инициаторный кодон в Р-сайт. Наконец, эта схема объясняет, почему в E.coli, высокоэффективные мРНК

(напр., мРНК рибосомных белков) не содержат протяженных вО-сигналов, но всегда имеют протяженные лидеры, несущие потенциальные в 1-мишени.

РИСУНОК 6 Динамическая модель инициации трансляции, описывающая роль Sl-мРНК и SD-взаимодействий при образовании инициаторных комплексов i п vivo ( см. объяснения в тексте).

Таким образом, мы показали, что Бокс А узнается и связывается белком S1, и что это связывание, скорее всего, лежит в основе эффекта усиления трансляции при введении Бокса А в лидер мРНК. Что же касается предполагаемого ранее участия свободного S1 в узнавании Бокса А в составе оперонов рРНК (Mogridge & Greenblatt, 1998), у нас все еще нет достаточного количества экспериментальных данных, чтобы подтвердить или опровергнуть эту гипотезу. Тем не менее, есть веские основания полагать, что не свободный белок SI, a 30S субчастица рибосомы может быть вероятным кандидатом на предполагаемую роль модулятора антитерминации транскрипции оперонов рРНК, что, возможно, является одним из механизмов регуляции биогенеза рибосом по принципу обратной связи.

3. Зависимость стабильности мРНК от строения 5'-нетранслируемой области

Уровень синтеза белка зависит от количества соответствующей мРНК в клетке и от эффективности ее транслирования. Количество мРНК, в свою очередь, определяется скоростью ее накопления (силой соответствующего промотора) и распада (деградации). При одном и том же промоторе, как в случае наших конструкций, количество мРНК в определенный момент роста клеточной культуры будет зависеть, главным образом, от ее стабильности. Существует тесная взаимосвязь между эффективностью трансляции и стабильностью мРНК, то есть её функциональным временем полужизни в клетке. Однако этот вопрос до сих пор является предметом дискуссий, и по многим аспектам существуют значительные разногласия. Так, например, для lacZ мРНК показано, что, транслируя, рибосома защищает матрицу от РНКазыЕ, основного фермента деградации клеточных мРНК E.coli, поэтому слаботранслируемая мРНК в большей степени подвержена деградации (Yarchuk et al., 1992). Однако в других экспериментах с lacZ мРНК было найдено, что прочного связывания рибосомы с протяженным SD-элементом лидерной последовательности достаточно, чтобы защитить полноразмерный транскрипт от деградации (Wagner et ai, 1994).

Для внесения ясности в эту проблему мы воспользовались хромосомными конструкциями, созданными в рамках данного диссертационного исследования, с целью сравнить, как при одном и том же уровне транскрипции изменяется количество полноразмерной lacZ мРНК в фиксированный момент времени в зависимости от строения ее 5'-НТО, а именно: от присутствия вторичной структуры (сравнить SD10H и SD10); от протяженности SD-последовательности (SD10 и SD6); от степени

аффинности лидеров мРНК к белку S1, то есть, наличия трансляционных энхансеров (SD10, БоксА-SDlO, комп-БоксА-SDlO, мут-БоксА-SDlO). Таким образом, мы исследовали стабильность мРНК как функцию ее ТИР.

Стабильность lacZ мРНК изучалась с помощью классического «Нозерн-блот»-анализа, который позволяет определить количество исследуемой мРНК in vivo. Тотальная РНК выделялась из экспоненциально растущей при 37°С культуры клеток (СЮбоо= 0-5). Блотгинг-анализ по Нозерну показал для всех образцов присутствие одинакового набора дискретных полос, соответствующих полноразмерному транскрипту, а также двум «малым» 'фрагментам lacZ мРНК, приблизительно отвечающим первым 400 и 240 н.о. транскрипта (Рис. 7. А). При этом интенсивность сигналов сильно варьировала.

Для оценки количества полноразмерной lacZ мРНК мы использовали соотношение сигнала, полученного от lacZ-пробы, к сигналу от 23S рРНК в том же образце (см. Рис. 7. А). Сравнение этого соотношения с Р-галактозидазной активностью в тех же штаммах, показало прямую корреляцию между эффективностью трансляции и величиной lacZ/23S (Рис. 8. А и Б). Таким образом, для всех используемых в работе ТИР была найдена прямая зависимость между эффективностью трансляции и стабильностью мРНК in vivo. Следует подчеркнуть, что хотя по результатам тоупринтинга SD10 и SD6 мРНК, а также SD10 и BoxA-SDIO мРНК прочность связывания рибосом в тройном инициаторном комплексе была сравнима, стабильность мРНК in vivo оказалась различной. Это позволяет сделать вывод, что только транслирующая, а не связанная с RBS рибосома может стабилизировать мРНК.

Как уже было сказано ранее, кроме сигнала от полноразмерного lacZ транскрипта, с помощью 5'-lacZ-пробы нами были получены полосы, соответствующие двум «малым» фрагментам lacZ мРНК: 400 и 240 н.о. (Рис. 7. А). В случае слаботранслируемой SD10H lacZ мРНК этот сигнал был наиболее интенсивен, а в пробах с высокотранслируемыми BoxASD6 и CBoxASDó lacZ мРНК он ослабевал (Рис.7. А). Появление «малых» фрагментов lacZ мРНК может быть вызвано либо преждевременной остановкой транскрипции lacZ мРНК по причине нарушения сопряжения транскрипции и трансляции; либо рибонуклеолитической атакой РНКазой Е, которая опять же, в случае слабой трансляции, должна быть более эффективна из-за наличия протяженных участков «голой» РНК (Yarchuk et ai, 1992). Тот факт, что те же самые сигналы наблюдались в работе Joyce & Dreyfus (1998), в которой транскрипция lacZ транскрипта направлялась Т7-РНК-полимеразой, нечувствительной к эффекту полярности, говорит в пользу эндорибонуклеолитической атаки.

Варианты химерных lacZ мРНК

lacZ мРНК-

"Малые фрагменты" lacZ мРНК

23S рРНК-

SD10

SD6

SD10

SD6

Рисунок 7 Стабильность полноразмерной lacZ мРНК в зависимости от строения 5'-НТО ("Нозерн-блот,'-аналт) в штаммах гпе+ (А) и rnel (Б). Полноразмерный транскрипт выявляли с помощью ДНК-зонда, соответствующего 1.8 т.п.о. центральной части lacZ гена, для стандартизации количества lacZ мРНК относительно общего количества РНК в пробе использовался ДНК-зонд, комплементарный уникальной последовательности в 23S рРНК; для выявления "малых" фрагментов lacZ мРНК использовался олигонуклеотид, гибридизующийся с первыми 20 универсальными н о.

5 ' - Н Т О / а с Z мРНК

лидер IücZmFBK

РИСУНОК 8 ß-галактозидазная активность(А) и стабильность lacZ мРНК (Б) в штаммах £ coli гпе+, с различной структурой регуляторной области lacZ мРНК.

Для более подробного изучения природы деградации lacZ мРНК in vivo, с помощью Pl-трансдукции, мы перенесли в хромосому наших штаммов термочувствительную мутацию по гену те, кодирующему РНКазу Е (ams/rnel; ts). Для выделения РНК мутантные клетки сначала выращивали при 30°С до экспоненциальной фазы, а затем в течение 30 мин растили при 42°С, то есть, в условиях, при которых термочувствительная РНКаза Е инактивированна. «Нозерн-блот» анализ показал, что интенсивность сигнала от полноразмерного от lacZ транскрипта для всех конструкций заметно возрастает (Рис.7. Б). Это еще раз подтверждает, что РНКазаЕ является основным ферментом деградации lacZ мРНК.

Таким образом, мы показали, что для всех lacZ мРНК, в лидерах которых присутствуют A/U-богатые элементы (энхансеры), характерна высокая стабильность всего транскрипта. Другими словами, присутствие энхансеров в мРНК лидерах не только обеспечивает высокую эффективность трансляции, но и стабилизирует транслируемый РНК-транскрипт.

Выводы

1. Протяженная SD-последовательность негативно влияет на эффективность трансляции in vivo.

2. Присутствие рибосомного белка S1 в составе ЗОв-субчастиц рибосом E.coli строго необходимо для формирования иннциаторного комплекса на мРНК с протяженным SD-доменом.

3. Рибосомный белок S1 модулирует SD-взаимодействия, препятствуя образованию 10-звенного SD-дуплекса.

4. Сродство белка S1 к лидерными последовательностями прямо коррелирует с эффективностью трансляции мРНК in vivo.

5. Встраивание A/U- богатых мишеней для белка S1 в 5!-сторону от протяженного SD-домена приводит к повышению продуктивности белкового синтеза.

6. Sl-зависимое связывание лидеров мРНК является первым событием в инициации белкового синтеза, за которым следует образование SD-дуплекса (взаимодействие MPHK-16S рРНК) и попадание инициаторного кодона в Р-сайт рибосомы, где он связывается с инициаторной тРНК кодон-антикодоновыми взаимодействиями.

7. Сильного взаимодействия рибосом с инициаторной областью мРНК недостаточно для стабилизации lacZ мРНК E.coli; стабильность этой мРНК можем быть обеспечена только эффективной трансляцией.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Публикации в научных журналах

1. А.В. Комарова, Л.С. Чуфистова, Е.В. Супина, И.В. Бонн. (2001). Избыточная комплементарность области Шайна-Дальгарно и З'-концевого участка 16S рибосомной РНК неэффективна при трансляции in vivo. Биоорг. химия 27:282-290.; Russ. J. Bioorg Chem., v.27: 282-90.

2. A.V. Komarova, L.S. Tchufistova, E.V. Supina and I.V. Boni. (2002). Protein SI counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-Dalgarno sequence on translation. RNAv.8:1137-1147.

Тезисы докладов на российских и международных научных конференциях

3. А.В.Комарова, Е.В.Супина. Анализ, трансляционной эффективности in vivo искусственных рибосомсвязывающих участков с высокой аффинностью к рибосомам. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-99». Москва. Тезисы докладов и стендовых сообщений, стр. 203-204 (1999). Устный доклад.

4. A. Komarova, L. Tchufistova, I. Boni. Functions of protein SI in translation of mRNAs bearing extended Shine-Dalgarno sequences. "RNA 2002" The Seventh Annual Meeting of the RNA Society. Madison, Wisconsin, USA. Program & Abstract book, p. 390 (2002). Poster presentation.

5. A. Komarova, L. Tchufistova, M. Dreyfus, I. Boni. Effect of the 5'-untranslated region on translation efficiency and mRNA stability in Escherichia coli. "Non coding RNA. Its role in translation and gene regulation." Jacques Monod Conference. Aussois, France. Program & Abstract book, p. 76 (2003). Oral presentation.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www stprint.ru e-mail: Takawastprint m тел 939-3338 Заказ № 365, тираж шт. Подписано в печать 04.09.2003

Р145 В У

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комарова, Анастасия Васильевна

Содержание

Список сокращений

Общая характеристика работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структурно-функциональные элементы в областях инициации трансляции мРНК и современные модели образования инициаторных комплексов у прокариот

1. Введение. Современные представления об инициации трансляции у прокариот и эукариот - сходство и различия

2. Каноническая схема инициации трансляции прокариотических мРНК

2.1. Участок связывания рибосомы (RBS)

2.2. Трансляционный инициаторный район (ТИР)

2.3. Роль вторичной структуры мРНК в RBS и ТИР

2.4. ТИР и возможные механизмы трансляционного усиления

2.4.1. Существует ли downstream box?

2.4.2.Трансляционные энхансеры в 5'-НТО и механизмы усиления трансляции

Полифункциональность рибосомного белка S

Строение и свойства белка S

Белок S1 и инициация трансляции

3. Неканонические механизмы инициации трансляции у прокариот

3.1. Примеры трансляции в отсутствие последовательности Шайна-Дальгарно

3.2. Примеры усложненных RBS и позитивная роль вторичной структуры в инициации трансляции

3.3. Область инициации трансляции мРНК белка малой субчастицы рибосомы S

3.4. Инициация трансляции на мРНК, не имеющих лидерной последовательности (безлидерных)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние функциональных элементов в лидерах прокариотических мРНК на эффективность инициации трансляции"

2. Эффективность трансляции мРНК, содержащих сильный SD-домен43

2.1. Выбор RBS.43

2.2. Создание хромосомных конструкций для оценки выхода белка с одной копии гена45

2.3. Результаты измерения р-галактозидазной активности в полученных рекомбинантных штаммах 48

2.4. Проверка эффективности образования тройного инициаторного комплекса in vitro с помощью метода тоупринт-анализ49

2.5. Возможные причины ингибирующего влияния протяженных SD дуплексов на трансляцию55

3. Эффективность трансляции мРНК, содержащих A/U-богатые участки в

5'-сторону от протяженной SD-последовательности 57

3.1. Антитерминация транскрипции оперонов рибосомных РНК. БоксА-элемент и его функциональные комплексы с клеточными белками57

3.2. Оценка эффективности образования трансляционного инициаторного комплекса in vivo и in vitro 61

3.3. Применение метода торможения в геле для оценки аффинности S1 к мРНК лидерам, содержащим и не содержащим трансляционные энхансеры 65

3.4. Биологический смысл A/U богатых последовательностей в лидерах прокариотических мРНК68

3.5. О возможной роли белка S1 в процессе антитерминации транскрипции 70

4. Зависимость стабильности мРНК от строения 5'-НТО 73

5. Заключение 83

Глава 3. МЛ ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ86

1. Материалы и оборудование86

1.1. Ферменты и реактивы 86

1.2. Оборудование87

1.3. Расходные материалы88

1.4. Буферные и другие растворы88

1.5. Микробиологические среды90

1.6. Концентрации антибиотиков: 91

1.7. Олигонуклеотиды, использованные в работе:91

1.8. Штаммы и плазмиды 92

2. Методы93

2.1. Получение плазмидных конструкций для экспериментов in vivo и in vitro93

2.2. Эксперименты in vivo95

Трансформация95

Гомологическая рекомбинация96

Р1-трансдукция97

А. Приготовление фагового лизата97

Б. Трансдукция с исползованием Р1-фаголизатов98

Измерение активности (3-галактозидазы в клеточных экстрактах99

Определение количества белка по методу Брэдфорд (Bradford)100

Выделение РНК из клеток для Нозерн блот-гибридизации: 100

2.3. Эксперименты in vitro101

Нозерн-блот гибридизация 101

ДНК-зонды для гибридизации:102

Анализ комплексов Sl-мРНК методом торможения в геле103

ДСН-ПААГ- электрофорез белков по методу Лэммли:105

Анализ формирования 30S-mPHK-tPHKIMc1 инициаторного комплекса in vitro тоупринтинг)106

Секвенирование вставок в вектор pEMBLA46 по Сэнгеру:108

Выводы 110

Список литературы111

Благодарности12 7

Список сокращений

НТО -нетранслируемая область

RBS - участок связывания рибосомы на мРНК (ribosome binding site)

TIR (ТИР) - трансляционный инициаторный район (translation initiation region)

SD - последовательность Шайна-Дальгарно

SELEX - Sistematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment pPHK - рибосомная рибонуклеиновая кислота тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота т.п.о. - (kilobase) - тыс. пар оснований п.о. - (base pairs) - пара оснований н.о.- нуклеотидный остаток ак.о.- аминокислотный остаток ед.акт. - единица активности

PCR или ПЦР - полимеразная цепная реакция dNTP- 2' -дезоксирибонуклеозид-5' -трифосфат ddNTP- 2',3'-дидезоксирибонуклеозид-5 '-трифосфат

ПААГ- полиакриламидный гель мкМ, цМ - микромолярная концентрация мМ, тМ- миллимолярная концентрация пмоль - пикомоль мкл - микролитр нм - нанометр

RT - ревертаза, обратная транскриптаза (reverse transcriptase)

Ampr и Amps - ампициллин резистентные и ампициллин чувствительные клеточные культуры

Tetr - тетрациклин резистентные клеточные культуры

X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-В-тиогалактопиранозид

IPTG - индуктор (3-галактозидазы - изопропил-Р-О-тиогалакгопиранозид

30S - малая рибосомная субчастица

ВВ и ХС - маркеры-красители бромфеноловый голубой и ксиленцианол ONPG - ортонитрофенил-р-Б-галактозид

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Эффективность белкового синтеза у прокариот зависит от эффективности инициации трансляции. Информация о том, как эффективно будет узнаваться мРНК малой субчастицей рибосомы, закодирована, главным образом, в структурно-функциональных элементах ее лидерных последовательностей. В общепринятой модели инициации трансляции ведущая роль в образовании инициаторных комплексов отводится последовательности Шайна-Дальгарно (SD), пурин-богатому участку перед инициаторным кодоном, образующему комплементарный дуплекс с 3'-концевой последовательностью 16S рРНК. В то же время, многие прокариотические мРНК эффективно транслируются и в отсутствие SD-последовательности. Имеющаяся информация о так называемых энхансерных элементах в 5'-нетранслируемых областях (5'-НТО) мРНК пока не обобщена в виде модели, так как механизмы трансляционного усиления все еще дискутируются. Таким образом, фундаментальные исследования молекулярных механизмов белкового синтеза представляют несомненную актуальность, поскольку до сих пор невозможно создать алгоритм, позволяющий предсказать эффективность инициации трансляции, а, следовательно, и процесса в целом, исходя из первичной структуры мРНК.

Цель и задачи работы. В узнавании мРНК рибосомой на этапе инициации трансляции принимают участи два компонента малой субчастицы рибосом - 3'-концевой участок 16S рРНК (aHTHSD), связывающий SD-последовательность, и рибосомный белок S1. Согласно данным, ранее полученным в нашей группе [Boni et al. 1991; Tzareva et al. 1994; Artamonova et al. 1998], белок SI взаимодействует с U- или A/U-богатыми участками в мРНК-лидерах, которые выполняют функцию трансляционных усилителей (энхансеров). Целью настоящей работы явилась оценка вклада РНК-РНК (SD-aHraSD) и РНК-белковых (Sl-мРНК) взаимодействий в эффективность трансляции. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Оценить вклад сильных SD-взаимодействий в эффективность трансляции in vivo.

2. В экспериментах in vitro (тоупринт-анализ) исследовать зависимость образования инициаторных комплексов на мРНК с протяженными SD-последовательностями от присутствия рибосомного белка S1.

3. Изучить влияние A/U-богатых участков-мишеней для белка S1 на эффективность трансляции мРНК с протяженными SD-элементами in vivo и образование инициаторных комплексов in vitro.

4. Исследовать зависимость стабильности мРНК от строения 5'-нетранслируемой области (от присутствия протяженных SD-элементов и S1-мишеней).

Научная новизна и практическая ценность работы. Для выполнения поставленных в работе задач была использована совокупность экспериментов in vivo и in vitro, позволяющая соотнести наблюдаемые in vivo эффекты с определенными молекулярными взаимодействиями. С помощью такого подхода в работе получены новые данные о негативном влиянии SD-последовательности с избыточной комплементарностью к 3'- концевому участку 16S РНК на эффективность трансляции in vivo; впервые показаны строгая необходимость присутствия рибосомного белка S1 при инициации трансляции даже при наличии протяженного SD-домена и способность белка S1 модулировать SD взаимодействия; найдена прямая корреляция между аффинностью белка S1 к мРНК-лидерам и эффективностью трансляции и показана возможность повышения продуктивности белкового синтеза при встраивании A/U-богатых S1 -мишеней в 5'-сторону от протяженного SD-домена; наконец, получены новые данные о том, что стабильность мРНК определяется, главным образом, эффективностью ее трансляции. Результаты работы позволили впервые представить экспериментально-обоснованную динамическую модель инициации трансляции, описывающую роль Sl-мРНК и SD-взаимодействий при образовании инициаторных комплексов in vivo. Полученные в работе данные об эффективности трансляции мРНК, содержащих сильный SD-домен, и о роли A/U-богатых элементов в лидерных последовательностях прокариотических мРНК могут быть использованы при оптимизации генно-инженерных конструкций для экспрессии гетерологичных генов в E.coli.

Публикация и апробация работы. По теме диссертационной работы опубликовано две статьи и одна статья готовится к печати. Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиуме для студентов и аспирантов «Ломоносов-99», г. Москва, Россия, 1999 г.; на Международной школе "Advanced Bacterial Genetics Course" (CSHL) Колд Спринг Харбор, США, 2001г.; на 7-ой Международной конференции Общества РНК (RNA Society) «RNA 2002»,

Висконсин-Мэдисон, США, 2002г.; на Международном симпозиуме «Нетранслируемая РНК: роль в трансляции и регуляции генов" г. Осуа, Франция, 2003г.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение,

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Комарова, Анастасия Васильевна

Выводы

1. Протяженная SD-последовательность негативно влияет на эффективность трансляции in vivo.

2. Присутствие рибосомного белка S1 в составе 308-субчастиц рибосом E.coli строго необходимо для формирования инициаторного комплекса на мРНК с протяженным SD-доменом.

3. Рибосомный белок S1 модулирует SD-взаимодействия, препятствуя образованию 10-звенного SD-дуплекса.

4. Сродство белка S1 к лидерными последовательностями прямо коррелирует с эффективностью трансляции мРНК in vivo.

5. Встраивание A/U- богатых мишеней для белка S1 в 5'-сторону от протяженного SD-домена приводит к повышению продуктивности белкового синтеза.

6. Sl-зависимое связывание лидеров мРНК является первым событием в инициации белкового синтеза, за которым следует образование SD-дуплекса (взаимодействие mPHK-16S рРНК) и попадание инициаторного кодона в Р-сайт рибосомы, где он связывается с инициаторной тРНК кодон-антикодоновыми взаимодействиями.

7. Сильного взаимодействия рибосом с инициаторной областью мРНК недостаточно для стабилизации lacZ мРНК E.coli\ стабильность этой мРНК может быть обеспечена только эффективной трансляцией.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комарова, Анастасия Васильевна, Москва

1. Adhya, S. and M. Gottesman (1978). "Control of transcription termination." Annu Rev Biochem 47: 967-96.

2. Artamonova, V. S., N. V. Tsareva and I. V. Boni (1998). "Regulation of synthesis of ribosomal protein L7-L12: role of intercistronic rplJL region as an enhancer of translation." Bioorg Khim 24(7): 530-8.

3. Balakin, A. G., S. L. Bogdanova and E. A. Skripkin (1992). "mRNA containing an extended Shine-Dalgarno sequence is translated independently of ribosomal protein SI." Biochem Int 27(1): 117-29.

4. Balakin, A. G., E. A. Skripkin, I. N. Shatsky and A. A. Bogdanov (1992). "Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage lambda repressor." Nucleic Acids Res 20(3): 563-71.

5. Bollen, A., R. Lathe, A. Herzog, D. Denicourt, J. P. Lecocq, L. Desmarez and R. Lavalle (1979). "A conditionally lethal mutation of Escherichia coli affecting the gene coding for ribosomal protein S2 (rpsB)." J Mol Biol 132(2): 219-33.

6. Boni, I. V., V. S. Artamonova and M. Dreyfus (2000). "The last RNA-binding repeat of the Escherichia coli ribosomal protein SI is specifically involved in autogenous control." J Bacteriol 182(20): 5872-9.

7. Boni, I. V., V. S. Artamonova, N. V. Tzareva and M. Dreyfus (2001). "Non-canonical mechanism for translational control in bacteria: synthesis of ribosomal protein S1." Embo J 20(15): 4222-32.

8. Boni, I. V., D. M. Isaeva, M. L. Musychenko and N. V. Tzareva (1991). "Ribosome-messenger recognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI." Nucleic Acids Res 19(1): 155-62.

9. Boni, I. V., I. V. Zlatkin and E. I. Budowsky (1982). "Ribosomal protein SI associates with Escherichia coli ribosomal 30-S subunit by means of protein-protein interactions." Eur J Biochem 121(2): 371-6.

10. Braun, F., E. Hajnsdorf and P. Regnier (1996). "Polynucleotide phosphorylase is required for the rapid degradation of the RNase E-processed rpsO mRNA of Escherichia coli devoid of its 3' hairpin." Mol Microbiol 19(5): 997-1005.

11. Butler, J. S., M. Springer, J. Dondon, M. Graffe and M. Grunberg-Manago (1986). "Escherichia coli protein synthesis initiation factor IF3 controls its own gene expression at the translational level in vivo." J Mol Biol 192(4): 767-80.

12. Butler, J. S., M. Springer and M. Grunberg-Manago (1987). "AUU-to-AUG mutation in the initiator codon of the translation initiation factor IF3 abolishes translational autocontrol of its own gene (infC) in vivo." Proc Natl Acad Sci U S A 84(12): 4022-5.

13. Bycroft, M., T. J. Hubbard, M. Proctor, S. M. Freund and A. G. Murzin (1997). "The solution structure of the SI RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold." СеД 88(2): 235-42.

14. Calogero, R. A., C. L. Pon, M. A. Canonaco and С. O. Gualerzi (1988). "Selection of the mRNA translation initiation region by Escherichia coli ribosomes." Proc Natl Acad Sci USA 85(17): 6427-31.

15. Carpousis, A. J., A. Leroy, N. Vanzo and V. Khemici (2001). "Escherichia coli RNA degradosome." Methods Enzymol 342: 333-45.

16. Carpousis, A. J., G. Van Houwe, C. Ehretsmann and H. M. Krisch (1994). "Copurification of E. coli RNAase E and PNPase: evidence for a specific association between two enzymes important in RNA processing and degradation." CeU 76(5): 889-900.

17. Castel, A., B. Kraal, A. Konieczny and L. Bosch (1979). "Translation by Escherichia coli ribosomes of alfalfa mosaic virus RNA 4 can be initiated at two sites on the monocistronic message." Eur J Biochem 101(1): 123-33.

18. Chang, A. C. and S. N. Cohen (1978). "Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the PI5A cryptic miniplasmid." JBacteriol 134(3): 1141-56.

19. Chen, H., M. Bjerknes, R. Kumar and E. Jay (1994). "Determination of the optimal aligned spacing between the Shine-Dalgarno sequence and the translation initiation codon of Escherichia coli mRNAs." Nucleic Acids Res 22(23): 4953-7.

20. Cho, К. O. and C. Yanofsky (1988). "Sequence changes preceding a Shine-Dalgarno region influence trpE mRNA translation and decay." J Mol Biol 204(1): 51-60.

21. Coburn, G. A. and G. A. Mackie (1999). "Degradation of mRNA in Escherichia coli: an old problem with some new twists." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 62: 55108.

22. Coburn, G. A., X. Miao, D. J. Briant and G. A. Mackie (1999). "Reconstitution of a minimal RNA degradosome demonstrates functional coordination between a 3' exonuclease and a DEAD-box RNA helicase." Genes Dev 13(19): 2594-603.

23. Cohen, S. N. and K. J. McDowall (1997). "RNase E: still a wonderfully mysterious enzyme." Mol Microbiol 23(6): 1099-106.

24. Cole, J. R. and M. Nomura (1986). "Changes in the half-life of ribosomal protein messenger RNA caused by translational repression." J Mol Biol 188(3): 383-92.

25. Comer, M. M., J. Dondon, M. Graffe, O. Yarchuk and M. Springer (1996). "Growth rate-dependent control, feedback regulation and steady-state mRNA levels of the threonyl-tRNA synthetase gene of Escherichia coli." J Mol Biol 261(2): 108-24.

26. Condon, C. (2003). "RNA Processing and Degradation in Bacillus subtilis." Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67(2): 157-174.

27. Diwa, A., A. L. Bricker, C. Jain and J. G. Belasco (2000). "An evolutionarily conserved RNA stem-loop functions as a sensor that directs feedback regulation of RNase E gene expression." Genes Dev 14(10): 1249-60.

28. Donovan, W. P. and S. R. Kushner (1986). "Polynucleotide phosphorylase and ribonuclease II are required for cell viability and mRNA turnover in Escherichia coli K-12." Proc Natl Acad Sci U S A 83(1): 120-4.

29. Dreyfus, M. (1988). "What constitutes the signal for the initiation of protein synthesis on Escherichia coli mRNAs?" J Mol Biol 204(1): 79-94.

30. Dreyfus, M. and S. A. Joyce (2002). The Interplay Between Translation and mRNA Decay in Procaryotes: A Discussion on Current Paradigms. Translation Mechanisms. J. L. a. L. Brakier-Gingras: 21.

31. Dreyfus, M. and P. Regnier (2002). "The poly(A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria." Cell 111(5): 611-3.

32. Ehretsmann, C. P., A. J. Carpousis and H. M. Krisch (1992). "Specificity of Escherichia coli endoribonuclease RNase E: in vivo and in vitro analysis of mutants in a bacteriophage T4 mRNA processing site." Genes Dev 6(1): 149-59.

33. Ellinger, Т., D. Behnke, H. Bujard and J. D. Gralla (1994). "Stalling of Escherichia coli RNA polymerase in the +6 to +12 region in vivo is associated with tight binding to consensus promoter elements." J Mol Biol 239(4): 455-65.

34. Ellington, A. D. and J. W. Szostak (1990). "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands." Nature 346(6287): 818-22.

35. Etchegaray, J. P. and M. Inouye (1999). "Translational enhancement by an element downstream of the initiation codon in Escherichia coli." J Biol Chem 274(15): 10079-85.

36. Fargo, D. С., M. Zhang, N. W. Gillham and J. E. Boynton (1998). "Shine-Dalgarno-like sequences are not required for translation of chloroplast mRNAs in

37. Chlamydomonas reinhardtii chloroplasts or in Escherichia coli." Mol Gen Genet 257(3): 271-82.

38. Farwell, M. A., M. W. Roberts and J. C. Rabinowitz (1992). "The effect of ribosomal protein S1 from Escherichia coli and Micrococcus luteus on protein synthesis in vitro by E. coli and Bacillus subtilis." Mol Microbiol 6(22): 3375-83.

39. Faxen, M., J. Plumbridge and L. A. Isaksson (1991). "Codon choice and potential complementarity between mRNA downstream of the initiation codon and bases 1471-1480 in 16S ribosomal RNA affects expression of glnS." Nucleic Acids Res 19(19): 5247-51.

40. Freier, S. M., R. Kierzek, J. A. Jaeger, N. Sugimoto, M. H. Caruthers, T. Neilson and D. H. Turner (1986). "Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stability." Proc Natl Acad Sci U S A 83(24): 9373-7.

41. Gallie, D. R. and С. I. Kado (1989). "A translational enhancer derived from tobacco mosaic virus is functionally equivalent to a Shine-Dalgamo sequence." Proc Natl Acad Sci U S A 86(1): 129-32.

42. Gold, L. (1988). "Posttranscriptional regulatory mechanisms in Escherichia coli." Annu Rev Biochem 57: 199-233.

43. Gold, L., D. Pribnow, T. Schneider, S. Shinedling, B. S. Singer and G. Stormo (1981). "Translational initiation in prokaryotes." Annu Rev Microbiol 35: 365403.

44. Gold, L., G. Stormo and R. Saunders (1984). "Escherichia coli translational initiation factor IF3: a unique case of translational regulation." Proc Natl Acad Sci U S A 81(22): 7061-5.

45. Golshani, A., V. Golomehova, R. Mironova, I. G. Ivanov and M. G. AbouHaidar1997). "Does the epsilon sequence of phage T7 function as an initiator for the translation of CAT mRNA in Escherichia coli?" Biochem Biophys Res Commun 236(2): 253-6.

46. Grill, S. (2000). The role of initiation factors in translation of prokaryotic leaderless mRNAs. Vienna, University of Vienna.

47. Grill, S., С. О. Gualerzi, P. Londei and U. Blasi (2000). "Selective stimulation of translation of leaderless mRNA by initiation factor 2: evolutionary implications for translation." Embo J 19(15): 4101-10.

48. Gualerzi, С. O. and C. L. Pon (1990). "Initiation of mRNA translation in prokaryotes." Biochemistry 29(25): 5881-9.

49. Hajnsdorf, E. and P. Regnier (1999). "E. coli RpsO mRNA decay: RNase E processing at the beginning of the coding sequence stimulates poly(A)-dependent degradation of the mRNA." J Mol Biol 286(4): 1033-43.

50. Hartz, D., D. S. McPheeters and L. Gold (1991). "Influence of mRNA determinants on translation initiation in Escherichia coli." J Mol Biol 218(1): 83-97.

51. Hartz, D., D. S. McPheeters, L. Green and L. Gold (1991). "Detection of Escherichia coli ribosome binding at translation initiation sites in the absence of tRNA." J Mol Biol 218(1): 99-105.

52. Hartz, D., D. S. McPheeters, R. Traut and L. Gold (1988). "Extension inhibition analysis of translation initiation complexes." Methods Enzymol 164: 419-25.

53. Herschlag, D. (1995). "RNA chaperones and the RNA folding problem." J Biol Chem 270(36): 20871-4.

54. Hui, A. and H. A. de Boer (1987). "Specialized ribosome system: preferential translation of a single mRNA species by a subpopulation of mutated ribosomes in Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci U S A 84(14): 4762-6.

55. Jackson, R. J. (2000). A comparative view of initiation site selection mechanisms. Translational control of gene expression. H. J. Sonnenberg N, Mathews MB. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press: 127-183.

56. Jacob, W. F., M. Santer and A. E. Dahlberg (1987). "A single base change in the Shine-Dalgarno region of 16S rRNA of Escherichia coli affects translation of many proteins." Proc Natl Acad Sci U S A 84(14): 4757-61.

57. Jain, C. and J. G. Belasco (1995). "RNase E autoregulates its synthesis by controlling the degradation rate of its own mRNA in Escherichia coli: unusual sensitivity of the me transcript to RNase E activity." Genes Dev 9(1): 84-96.

58. Jain, C. and N. Kleckner (1993). "IS10 mRNA stability and steady state levels in Escherichia coli: indirect effects of translation and role of rne function." Mol Microbiol 9(2): 233-47.

59. Jones, R. L., 3rd, J. C. Jaskula and G. R. Janssen (1992). "In vivo translational start site selection on leaderless mRNA transcribed from the Streptomyces fradiae aph gene." JBacterid 174(14): 4753-60.

60. Joyce, S. A. and M. Dreyfus (1998). "In the absence of translation, RNase E can bypass 5' mRNA stabilizers in Escherichia coli." J Mol Biol 282(2): 241-54.

61. Komarova, A. V., L. S. Chufistova, E. V. Supina and I. V. Boni (2001). "Extensive complementarity of the Shine-Dalgarno region and З'-terminal sequence of 16S ribosomal RNA is inefficient for translation in vivo." Bioorg Khim 27(4): 28290.

62. Komarova, A. V., L. S. Tchufistova, E. V. Supina and I. V. Boni (2002). "Protein SI counteracts the inhibitory effect of the extended Shine- Dalgarno sequence on translation." Rna 8(9): 1137-47.

63. Ma, J., A. Campbell and S. Karlin (2002). "Correlations between Shine-Dalgarno sequences and gene features such as predicted expression levels and operon structures." J Bacteriol 184(20): 5733-45.

64. McCarthy, J. E. and R. Brimacombe (1994). "Prokaryotic translation: the interactive pathway leading to initiation." Trends Genet 10(11): 402-7.

65. McCarthy, J. E. and C. Gualerzi (1990). "Translational control of prokaryotic gene expression." Trends Genet 6(3): 78-85.

66. McCarthy, J. E., H. U. Schairer and W. Sebald (1985). "Translational initiation frequency of atp genes from Escherichia coli: identification of an intercistronic sequence that enhances translation." Embo J 4(2): 519-26.

67. McCormick, J. R., J. M. Zengel and L. Lindahl (1994). "Correlation of translation efficiency with the decay of lacZ mRNA in Escherichia coli." J Mol Biol 239(5): 608-22.

68. McDowall, K. J., S. Lin-Chao and S. N. Cohen (1994). "A+U content rather than a particular nucleotide order determines the specificity of RNase E cleavage." J Biol Chem 269(14): 10790-6.

69. Melancon, P., D. Leclerc, N. Destroismaisons and L. Brakier-Gingras (1990). "The anti-Shine-Dalgarno region in Escherichia coli 16S ribosomal RNA is not essential for the correct selection of translational starts." Biochemistry 29(13): 3402-7.

70. Miczak, A., V. R. Kaberdin, C. L. Wei and S. Lin-Chao (1996). "Proteins associated with RNase E in a multicomponent ribonucleolytic complex." Proc Natl Acad Sci U S A 93(9): 3865-9.

71. Miller, J. (1972). Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

72. Miranda-Rios, J., M. Navarro and M. Soberon (2001). "A conserved RNA structure (thi box) is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria." Proc Natl Acad Sci USA 98(17): 9736-41.

73. Mogridge, J. and J. Greenblatt (1998). "Specific binding of Escherichia coli ribosomal protein S1 to boxA transcriptional antiterminator RNA." J Bacteriol 180(8): 2248-52.

74. Moll, I. (2000). Studies on translation initiation of leaderless mRNAs. Vienna, University of Vienna.

75. Moll, I., S. Grill, A. Grundling and U. Blasi (2002). "Effects of ribosomal proteins SI, S2 and the DeaD/CsdA DEAD-box helicase on translation of leaderless and canonical mRNAs in Escherichia coli." Mol Microbiol 44(5): 1387-96.

76. Moll, I., S. Grill, С. O. Gualerzi and U. Blasi (2002). "Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control." Mol Microbiol 43(1): 239-46.

77. Moll, I., M. Huber, S. Grill, P. Sairafi, F. Mueller, R. Brimacombe, P. Londei and U. Blasi (2001). "Evidence against an Interaction between the mRNA downstream box and 16S rRNA in translation initiation." J Bacteriol 183(11): 3499-505.

78. Morgan, E. A. (1986). "Antitermination mechanisms in rRNA operons of Escherichia coli." J Bacteriol 168(1): 1-5.

79. Morita, M. Т., Y. Tanaka, T. S. Kodama, Y. Kyogoku, H. Yanagi and T. Yura1999). "Translational induction of heat shock transcription factor sigma32: evidence for a built-in RNA thermosensor." Genes Dev 13(6): 655-65.

80. Mudd, E. A., H. M. Krisch and C. F. Higgins (1990). "RNase E, an endoribonuclease, has a general role in the chemical decay of Escherichia coli mRNA: evidence that rne and ams are the same genetic locus." Mol Microbiol 4(12): 2127-35.

81. Muniyappa, K. and E. Mythili (1993). "Phage lambda beta protein, a component of general recombination, is associated with host ribosomal SI protein." Biochem Mol Biol Int 31(1): 1-11.

82. Muto, А., С. Ushida and H. Himeno (1998). "A bacterial RNA that functions as both a tRNA and an mRNA." Trends Biochem Sci 23(1): 25-9.

83. Nagai, H., H. Yuzawa and T. Yura (1991). "Interplay of two cis-acting mRNA regions in translational control of sigma 32 synthesis during the heat shock response of Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci U S A 88(23): 10515-9.

84. Nahvi, A., N. Sudarsan, M. S. Ebert, X. Zou, K. L. Brown and R. R. Breaker (2002). "Genetic control by a metabolite binding mRNA." Chem Biol 9(9): 1043.

85. Nakahigashi, К., H. Yanagi and T. Yura (1995). "Isolation and sequence analysis of rpoH genes encoding sigma 32 homologs from gram negative bacteria: conserved mRNA and protein segments for heat shock regulation." Nucleic AddsRes 23(21): 4383-90.

86. Nivinskas, R., N. Malys, V. Klausa, R. Vaiskunaite and E. Gineikiene (1999). "Posttranscriptional control of bacteriophage T4 gene 25 expression: mRNA secondary structure that enhances translational initiation." J Mol Biol 288(3): 291-304.

87. O'Connor, M., T. Asai, C. L. Squires and A. E. Dahlberg (1999). "Enhancement of translation by the downstream box does not involve base pairing of mRNA with the penultimate stem sequence of 16S rRNA." Proc Natl Acad Sci U S A 96(16): 8973-8.

88. O'Connor, M. and A. E. Dahlberg (2001). "Enhancement of translation by the epsilon element is independent of the sequence of the 460 region of 16S rRNA." Nucleic Acids Res 29(7): 1420-5.

89. O'Donnell, S. M. and G. R. Janssen (2001). "The initiation codon affects ribosome binding and translational efficiency in Escherichia coli of cl mRNA with or without the 5' untranslated leader." J Bacteriol 183(4): 1277-83.

90. O'Donnell, S. M. and G. R. Janssen (2002). "Leaderless mRNAs bind 70S ribosomes more strongly than 30S ribosomal subunits in Escherichia coli." J Bacteriol 184(23): 6730-3.

91. Olins, P. O. and S. H. Rangwala (1989). "A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli." J Biol Chem 264(29): 16973-6.

92. Pedersen, S., J. Skouv, M. Kajitani and A. Ishihama (1984). "Transcriptional organization of the rpsA operon of Escherichia coli." Mol Gen Genet 196(1): 135-40.

93. Ptashne, M., K. Backman, M. Z. Humayun, A. Jeffrey, R. Maurer, B. Meyer and R. T. Sauer (1976). "Autoregulation and function of a repressor in bacteriophage lambda." Science 194(4261): 156-61.

94. Py, В., H. Causton, E. A. Mudd and C. F. Higgins (1994). "A protein complex mediating mRNA degradation in Escherichia coli." Mol Microbiol 14(4): 71729.

95. Py, В., С. F. Higgins, H. M. Krisch and A. J. Carpousis (1996). "A DEAD-box RNA helicase in the Escherichia coli RNA degradosome." Nature 381(6578): 169-72.

96. Rapaport, L. R. and G. A. Mackie (1994). "Influence of translational efficiency on the stability of the mRNA for ribosomal protein S20 in Escherichia coli." J Bacteriol 176(4): 992-8.

97. Resell, A., K. Tedin, A. Graschopf, E. Haggard-Ljungquist and U. Blasi (1995). "Ternary complex formation on leaderless phage mRNA." FEMS Microbiol Rev 17(1-2): 151-7.

98. Resch, A., K. Tedin, A. Grundling, A. Mundlein and U. Blasi (1996). "Downstream box-anti-downstream box interactions are dispensable for translation initiation of leaderless mRNAs." Embo J 15(17): 4740-8.

99. Richardson, J. P. (1991). "Preventing the synthesis of unused transcripts by Rho factor." Cell 64(6): 1047-9.

100. Ringquist, S., T. Jones, E. E. Snyder, T. Gibson, I. Boni and L. Gold (1995). "High-affinity RNA ligands to Escherichia coli ribosomes and ribosomal protein SI: comparison of natural and unnatural binding sites." Biochemistry 34(11): 36408.

101. Ringquist, S., S. Shinedling, D. Barrick, L. Green, J. Binkley, G. D. Stormo and L. Gold (1992). "Translation initiation in Escherichia coli: sequences within the ribosome-binding site." Mol Microbiol 6(9): 1219-29.

102. Roberts, M. W. and J. C. Rabinowitz (1989). "The effect of Escherichia coli ribosomal protein SI on the translational specificity of bacterial ribosomes." J Biol Chem 264(4): 2228-35.

103. Ruckman, J., S. Ringquist, E. Brody and L. Gold (1994). "The bacteriophage T4 regB ribonuclease. Stimulation of the purified enzyme by ribosomal protein SI." J Biol Chem 269(43): 26655-62.

104. Scherer, G. F., M. D. Walkinshaw, S. Arnott and D. J. Morre (1980). "The ribosome binding sites recognized by E. coli ribosomes have regions with signal character in both the leader and protein coding segments." Nucleic Acids Res 8(17): 3895907.

105. Schneider, T. D., G. D. Stormo, L. Gold and A. Ehrenfeucht (1986). "Information content of binding sites on nucleotide sequences." J Mol Biol 188(3): 415-31.

106. Sengupta, J., R. K. Agrawal and J. Frank (2001). "Visualization of protein SI within the 30S ribosomal subunit and its interaction with messenger RNA." Proc Natl Acad Sci US A 98(21): 11991-6.

107. Shean, C. S. and M. E. Gottesman (1992). "Translation of the prophage lambda cl transcript." Cell 70(3): 513-22.

108. Shine, J. and L. Dalgarno (1974). "The З'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites." ProcNatl Acad Sci U S A 71(4): 1342-6.

109. Skouv, J., J. Schnier, M. D. Rasmussen, A. R. Subramanian and S. Pedersen (1990). "Ribosomal protein SI of Escherichia coli is the effector for the regulation of its own synthesis." J Biol Chem 265(28): 17044-9.

110. Sorensen, M. AM J. Fricke and S. Pedersen (1998). "Ribosomal protein SI is required for translation of most, if not all, natural mRNAs in Escherichia coli in vivo." J Mol Biol 280(4): 561-9.

111. Sprengart, M. L., H. P. Fatscher and E. Fuchs (1990). "The initiation of translation in E. coli: apparent base pairing between the 16srRNA and downstream sequences of the mRNA." Nucleic Acids Res 18(7): 1719-23.

112. Sprengart, M. L., E. Fuchs and A. G. Porter (1996). "The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli." Embo J 15(3): 665-74.

113. Sprengart, M. L. and A. G. Porter (1997). "Functional importance of RNA interactions in selection of translation initiation codons." Mol Microbiol 24(1): 19-28.

114. Squires, C. L. and D. Zaporojets (2000). "Proteins shared by the transcription and translation machines." Annu Rev Microbiol 54: 775-98.

115. Stanssens, P., E. Remaut and W. Fiers (1986). "Inefficient translation initiation causes premature transcription termination in the lacZ gene." Cell 44(5): 711-8.

116. Steitz, J. A. (1969). "Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA." Nature 224(223): 957-64.

117. Stormo, G. D., T. D. Schneider, L. Gold and A. Ehrenfeucht (1982). "Use of the 'Perceptron' algorithm to distinguish translational initiation sites in E. coli." Nucleic Acids Res 10(9): 2997-3011.

118. Stormo, G. D., T. D. Schneider and L. M. Gold (1982). "Characterization of translational initiation sites in E. coli." Nucleic Acids Res 10(9): 2971-96.

119. Subramanian, A. R. (1983). "Structure and functions of ribosomal protein SI." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 28: 101-42.

120. Sussman, J. К., E. L. Simons and R. W. Simons (1996). "Escherichia coli translation initiation factor 3 discriminates the initiation codon in vivo." Mol Microbiol 21(2): 347-60.

121. Szer, W., J. M. Hermoso and S. Leffler (1975). "Ribosomal protein SI and polypeptide chain initiation in bacteria." Proc Natl Acad Sci U S A 72(6): 23259.

122. Szer, W. and S. Leffler (1974). "Interaction of Escherichia coli 30S ribosomal subunits with MS2 phage RNA in the absence of initiation factors." Proc Natl Acad Sci U SA 71(9): 3611-5.

123. Tedin, К., I. Moll, S. Grill, A. Resch, A. Graschopf, С. O. Gualerzi and U. Blasi1999). "Translation initiation factor 3 antagonizes authentic start codon selection on leaderless mRNAs." Mol Microbiol 31(1): 67-77.

124. Tedin, K., A. Resch and U. Blasi (1997). "Requirements for ribosomal protein SI for translation initiation of mRNAs with and without a 5' leader sequence." Mol Microbiol 25(1): 189-99.

125. Thao, M. L., N. A. Moran, P. Abbot, E. B. Brennan, D. H. Burckhardt and P. Baumann (2000). "Cospeciation of psyllids and their primary prokaryotic endosymbionts." Appl Environ Microbiol 66(7): 2898-905.

126. Tuerk, C. and L. Gold (1990). "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase." Science 249(4968): 505-10.

127. Vellanoweth, R. L. and J. C. Rabinowitz (1992). "The influence of ribosome-binding-site elements on translational efficiency in Bacillus subtilis and Escherichia coli in vivo." Mol Microbiol 6(9): 1105-14.

128. Venkatesh, Т. V. and С. M. Radding (1993). "Ribosomal protein SI and NusA protein complexed to recombination protein beta of phage lambda." J Bacteriol 175(6): 1844-6.

129. Vogel, U. and K. F. Jensen (1995). "Effects of the antiterminator Box A on transcription elongation kinetics and ppGpp inhibition of transcription elongation in Escherichia coli." J Biol Chem 270(31): 18335-40.

130. Wagner, L. A., R. F. Gesteland, T. J. Dayhuff and R. B. Weiss (1994). "An efficient Shine-Dalgarno sequence but not translation is necessary for lacZ mRNA stability in Escherichia coli." J Bacteriol 176(6): 1683-8.

131. Wilson, J. E., Т. V. Pestova, C. U. Hellen and P. Sarnow (2000). "Initiation of protein synthesis from the A site of the ribosome." Cell 102(4): 511-20.

132. Wimberly, В. Т., D. E. Brodersen, W. M. Clemens, Jr., R. J. Morgan-Warren, A. P. Carter, C. Vonrhein, T. Hartsch and V. Ramakrishnan (2000). "Structure of the 30S ribosomal subunit." Nature 407(6802): 327-39.

133. Winkler, W., A. Nahvi and R. R. Breaker (2002). "Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression." Nature 419(6910): 952-6.

134. Winkler, W. C., S. Cohen-Chalamish and R. R. Breaker (2002). "An mRNA structure that controls gene expression by binding FMN." Proc Natl Acad Sci U S A 99(25): 15908-13.

135. Winzeler, E. and L. Shapiro (1997). "Translation of the leaderless Caulobacter dnaX mRNA." J Bacteriol 179(12): 3981-8.

136. Wu, C. J. and G. R. Janssen (1996). "Translation of vph mRNA in Streptomyces lividans and Escherichia coli after removal of the 5' untranslated leader." Mol Microbiol 22(2): 339-55.

137. Wu, C. J. and G. R. Janssen (1997). "Expression of a streptomycete leaderless mRNA encoding chloramphenicol acetyltransferase in Escherichia coli." J Bacteriol 179(21): 6824-30.

138. Yarchuk, О., N. Jacques, J. Guillerez and M. Dreyfus (1992). "Interdependence of translation, transcription and mRNA degradation in the lacZ gene." J Mol Biol 226(3): 581-96.

139. Zengel, J. M. and L. Lindahl (1994). "Diverse mechanisms for regulating ribosomal protein synthesis in Escherichia coli." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 47: 33170.

140. Zhang, Y. В., S. Ayalew and S. A. Lacks (1997). "The rnhB gene encoding RNase HII of Streptococcus pneumoniae and evidence of conserved motifs in eucaryotic genes." J Bacteriol 179(12): 3828-36.1. Благодарности

141. Автор выражает благодарность старшему научному сотруднику ИБХ к.х.н. И.В.Бони за научное руководство и помощь при выполнении данной работы; Скапцовой Н.В. (ИБХ РАН) за синтез олигонуклеотидов;

142. М.Дрейфусу за помощь в выполнении работы по стабильности сконструированных lacZ мРНК и научное руководство в течение летней командировки в возглавляемую им лабораторию (M.Dreyfus, ENS, CNRS D1320, Paris).

143. Автор благодарит весь коллектив Лаборатории Структуры и Функции Генов Человека ИБХ РАН и особенно Г.С.Монастырскую, Е.В.Надеждина и Л.С.Чуфистову за создание и поддержание благоприятной атмосферы во время работы.