Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кристаллизация и исследования структуры фактора инициации трансляции 2 из эукариот и архей

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кристаллизация и исследования структуры фактора инициации трансляции 2 из эукариот и архей"

На правах рукописи

АРХИПОВА ВАЛЕНТИНА ИВАНОВНА

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 ИЗ ЭУКАРИОТ И АРХЕЙ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук _ -> л|/т

Москва - 2015

005563086

Работа выполнена в лаборатории структурных исследований аппарата трансляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт белка Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна

Официальные оппоненты:

Шатский Иван Николаевич, доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, руководитель лаборатории регуляции синтеза белка

Алкалаева Елена Зиновьевна, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта Российской академии наук, группа регуляции инициации трансляции эукариот, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук

Защита диссертации состоится {О Обкси)/-*^ 2015 г. в У/ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.7(6 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций) и на сайте www.bio.msu.ru.

Автореферат разослан Ь0 ^¡Л-ТхА^М2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белка. Инициация синтеза полипептидной цепи на рибосоме - сложный процесс, в котором немаловажную роль играют белковые факторы. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка выполняет гомологичный между эукариотами и археями гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2aßy), который доставляет инициаторную метионил-тРНК (Met-TPHKj) в Р-участок малой субчастицы рибосомы. Интенсивные структурные исследования e/aIF2 ведутся в лабораториях ряда стран. Настоящая диссертационная работа является продолжением исследований структурной организации архейного фактора aIF2, ведущихся в Институте белка РАН. В данной работе описано получение кристаллов и определение структуры тройственного комплекса сердцевинной части aIF2 с метионилированной инициаторной тРНК и аналогом ГТФ. Эта работа делалась коллективом сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции ИБ РАН при непосредственном участии автора диссертации. Автором работы проводились эксперименты по получению новых, более совершенных кристаллических форм комплекса полноразмерного aIF2 с Met-TPHKj и ГТФ, а также были начаты эксперименты по выделению и кристаллизации субъединиц эукариотического фактора eIF2, пространственная структура которого до сих пор неизвестна (определена структура только его а-субъединицы). Несмотря на гомологию, архейный фактор aIF2 не является идеальной моделью для интерпретации данных по функционированию eIF2, и определение пространственной структуры eIF2 необходимо для понимания и корректного описания на молекулярном уровне механизма инициации трансляции у эукариот. Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры e/aIF2 в данной работе проводилось изучение дополнительной функции у-субъединицы архейного фактора aIF2. Помимо основной роли в связывании инициаторной метионил-тРНК в составе гетеротримерного фактора, у-субъединица aIF2 как в составе фактора, так и в изолированном состоянии способна связывать и защищать мРНК от 5-3' направленной деградации, однако на сегодняшний день данная функция aIF2y мало изучена.

Цель работы: исследование структуры фактора инициации трансляции 2 из археи Sulfolobus solfataricus и дрожжей Saccharomyces cerevisiac; исследование механизма взаимодействия aIF2y с мРНК.

Основные задачи работы: Получение кристаллов и исследование структуры архейного тройственного комплекса aIF2,GDPNP,Met-TPHKf. Получение штаммов-продуцентов Escherichia coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae и разработка методов выделения этих белков. Получение и кристаллизация гетеротримера eIF2 и/или его химерных форм с субъединицами архейного фактора aIF2, а также получение химерных тройственных комплексов e/aIF2*GDPNP*Mct-TPHKf и их кристаллизация. Сайт-направленный мутагенез предполагаемых участков узнавания 5'-концевого нуклеозидтрифосфата мРНК на у-субъединице aIF2 S. solfataricus. Кристаллизация aIF2y дикого типа и ее мутантных форм в различных функциональных состояниях (в свободной форме, в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ).

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены кристаллы сердцевинной части архейного тройственного комплекса aIF2al)3Y*GDPNP*Met-TPIII<f, на основе которых была определена его пространственная структура. Показано, что, несмотря на структурную гомологию у-субъединицы aIF2 с бактериальным фактором элонгации EF-Tu, способы взаимодействия этих белков с тРНК принципиально отличаются. Разработаны методики выделения а- и ß-субъединиц eIF2 дрожжей. Впервые получены кристаллы химерных тройственных комплексов e/aIF2«GDPNP»Met-TPHKf, что открывает перспективы для определения структур субъединиц эукариотического фактора eIF2. Впервые показано, что канонический нуклеотид-связывающий сайт aIF2y является специфическим местом связывания 5'-концевого гуанозинтрифосфата мРНК. Определение кристаллических структур aIF2y в различных функциональных состояниях позволило построить схему конформационных переходов, происходящих в этом белке при связывании ГТФ, его гидролизе и освобождении ГДФ.

Результаты по структуре архейного тройственного комплекса aIF2 с ГТФ и инициаторной метионил-тРНК и структурам комплексов у-субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер. Полученные в ходе работы генетические конструкции и штаммы-продуценты Е. coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae используются в ИБ РАН. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты данной работы докладывались на российских и международных конференциях.

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах работы, а именно: проведение генно-инженерных экспериментов, выделение белков и РНК, получение белок-белковых и РНК-белковых комплексов, кристаллизация, сбор дифракционных данных с полученных кристаллов и сравнительный анализ, проведение кинетических исследований.

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 38 рисунков и 15 таблиц. Общий объем диссертации 135 страниц. Библиография включает 236 названий.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2»GDPNP*Met-TPHKf

Важная роль архейного и эукариотического факторов инициации трансляции 2 в процессе инициации биосинтеза белка определяет большой интерес к их пространственным структурам. В отличие от эукариотических белков белки гипертермофильных архей обладают повышенной термостабильностью, что существенно облегчает работу по их выделению и кристаллизации. Это обстоятельство позволило добиться успехов в исследовании структуры архейного

фактора aIF2, для которого были определены структуры изолированных субъединиц, гетеродимеров и неполного гетеротримера. В 2008 году нашей группой была впервые определена кристаллическая структура полноразмерного гетеротримера aIF2, анализ которой выявил высокую междоменную подвижность в а- и ß-субъединицах (Stolboushkina et al., 2008). Было показано, что молекула aIF2 состоит из конформационно-стабильной центральной части, содержащей у-субъединицу, 3-ий домен а-субъединицы и //-концевую а-спираль ß-субъединицы, и двух подвижных «крыльев» - 1-ый и 2-ой домены а-субъединицы и центральный и С-концевой домены ß-субъединицы (здесь и далее домены а-субъединицы e/aIF2 обозначены арабскими цифрами: 1, 2 и 3, чтобы отличать их от доменов у-субъединицы: I, II и III).

Следующим этапом было определение пространственной структуры тройственного комплекса фактора инициации трансляции 2 с ГТФ и инициаторной метионил-тРНК. Это наиболее важное функциональное состояние данного фактора, в котором он взаимодействует и с тРНК, и с рибосомой. Для кристаллизации тройственного комплекса был выбран конформационно-стабильный гетеродимер у-субъединицы aIF2 с изолированным 3-им доменом а-субъединицы (aIF2aD3y), который согласно литературным данным необходим и достаточен для того, чтобы фактор aIF2 связал инициаторную тРНК (Yatime et al., 2004).

Выделение aIF2y осуществляли по ранее разработанной методике (Nikonov et al., 2007), включающей прогрев белкового экстракта при 65°С и две стадии колоночной хроматографии. Делецию двух подвижных доменов aIF2a S. solfataricus проводили с помощью генно-инженерных методов путем замены кодона Glul74 на инициаторный ATG кодон. При выделении aIF2aD3, аналогично выделению aIF2y, использовали прогрев клеточного лизата при 65°С, после чего белок очищали с использованием ионообменной (S-сефароза) и гидрофобной хроматографий. Гомогенный препарат а03у-гетеродимера получали смешиванием у-субъединицы с небольшим избытком 3-его домена а-субъединицы aIF2 (в молярном соотношении 1 : 1.2) с последующей гель-фильтрацией на смоле супердекс-75.

Для получения тройственного комплекса мы использовали бактериальную Met-TPHKf, поскольку согласно биохимическим данным архейный фактор инициации трансляции 2, практически, с одинаковым сродством взаимодействует как с архейной инициаторной Met-тРНК;, так и с бактериальной Met-TPHKf (Yatime et al., 2004, 2006). Суперпродукцию TPHKf проводили в штамме Е. coli MRE600, не содержащем РНКазы I. Такие клетки трансформировали плазмидой pUC18-metY (Столбоушкина, 2009), содержащей ген предшественника бактериальной инициаторной тРНК, ограниченный собственными природными промотором и терминатором. В результате процессинга в клетках образуется зрелая TPHKf с уникальными 5'- и 3'-концами и необходимыми модификациями. Препарат суммарной тРНК получали по ранее описанной методике (Zubay, 1962). Гомогенный препарат TPHKf Е. coli получали хроматографией на колонке с анионообменной смолой MonoQ. Аминоацилирование тРНКг метионином проводили с помощью каталитического домена метионил-тРНК-синтетазы Е. coli.

При сборке тройственного комплекса препарат aIF2aD3y инкубировали с негидролизуемым аналогом ГТФ (GDPNP) в молярном соотношении белок : нуклеотид равном 1 :4. Использование вместо ГТФ его негидролизуемых

аналогов приводило к образованию более стабильного тройственного комплекса, что увеличивало шансы на успех в получении кристаллов. Препарат GDPNP фирмы Sigma, который, как было показано ранее (Nikonov et al., 2007), содержит примесь ГДФ, предварительно очищали с помощью хроматографии на смоле MonoQ.

К смеси белка и нуклеотида добавляли полученный препарат Met-TPHKf в молярном соотношении белок: РНК равном 1:1.5 из расчета, что не вся инициаторная тРНК находится в аминоацилированном состоянии. Препарат реконструированного тройственного комплекса инкубировали и очищали от избытка тРНК и нуклеотида с помощью гель-фильтрации на колонке со смолой супердекс-75. Фракции, содержавшие комплекс aIF2aD3yGDPNP'Met-TPHKf, объединяли и концентрировали, затем тройственный комплекс осаждали добавлением сульфата аммония.

Поиск условий кристаллизации проводили методом диффузии паров в висящей капле с использованием коммерческого набора растворов Natrix для кристаллизации РНК-белковых комплексов. Эта работа проводилась совместно с Е.А. Столбоушкиной. В результате нам удалось получить кристаллы комплекса aIF2aD3yGDPNP*Met-TPHKf в условиях, где в качестве осаждающего реагента использовался сульфат аммония. Кристаллы появлялись при температуре 12°С через 6-8 дней и достигали максимальных размеров 70x50x180 мкм (табл. 1).

Табл. 1. Результаты экспериментов по кристаллизации комплекса aIF2aD3Y'GDPNP»Met-TPHKf

Объект и фото кристалла Условия кристаллизации Статистика набора

aIF2aD3yGDPNP-Met-TPHKf тшш 0 f ЖШ , ' - Л В капле: 45% насыщения (МНЛ-^Ол. 30 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 300 мМ ЫЭБВ 195 В противопастворе: 60-70% насыщения (N114)3804 Температура 12°С Крио: 20% этиленгликоль. 50% насыщения (¡Ч^^Ол, 0.5 М ШБВ 195, 2 мМ ДТТ, 1 мМ вОРЫР Предел разрешения 3.2 А Пространственная группа Р3,21 Параметры ячейки: 93.68, 93.68, 220.03 (А) 90.00, 90.00, 120.00 (°) Доля твиннинга 0.5 РБВ код 308У

На синхротроне в Гамбурге (линия XI2 станции DESY, Германия) был собран набор дифракционных данных. Анализ этих данных показал, что кристалл содержит элементарные ячейки в двух различных ориентациях, причем процентное содержание таких ячеек одинаково (совершенный твиннинг). Работа по решению и анализу структуры тройственного комплекса проводилась совместно с группой C.B. Никонова (ИБ РАН, Пущино). В результате структуру комплекса удалось определить с разрешением 3.2 Â (рис. 1) (Stolboushkina et al., 2013).

Рис. 1. Схематическое изображение пространственной структуры тройственного комплекса а1Р2аозуООРКР» Ме^тРНКс. Общими очертаниями молекула комплекса напоминает правильный треугольник со стороной около 90 А, в вершинах которого расположены «цинковый палец» у-субъединицы, 3-ий домен а-субъединицы и антикодоновая петля тРНК.

Анализ структуры тройственного комплекса показал соответствие структурных данных с полученными ранее биохимическими данными и данными химического пробинга по взаимодействию Met-xPHKj с доменами у-субъединицы и с доменом 3 а-субъединицы aIF2 (Yatime et al., 2004; Pedullä et al., 2005; Shin et al., 2011). Несмотря на структурную гомологию aIF2y с бактериальным фактором элонгации EF-Tu, эти белки по-разному связывают тРНК: взаимодействие элонгаторной тРНК с фактором элонгации EF-Tu происходит по Т-шпильке (Nissen et al., 1995, 1999), тогда как инициаторная тРНК взаимодействует с фактором инициации aEF2 D-шпилькой (рис. 2а, б). Таким образом, различия в нуклеотидной последовательности Т-шпильки инициаторной и элонгаторных тРНК могут предотвращать связывание инициаторной тРНК с EF-Tu, а различия в D-шпильке могут предотвращать связывание элонгаторных тРНК с aIF2.

Одновременно с нами французской группой была определена структура

тройственного комплекса, содержащего полноразмерный гетеротример aIF2aßy, в которой однако отсутствовала электронная плотность для большей части ß-субъединицы (Schmitt et al., 2012). Данная структура была определена с более низким разрешением (5 Ä), и принципиально отличается от полученной нами структуры. Хотя в обеих структурах тРНК обращена к белку своей D-стороной, она ; взаимодействует с разными участками у- и а-субъединиц (рис. 26, в). В нашей

; структуре наиболее существенный контакт образуется между III доменом аШ2у и

D-шпилькой тРНК, что соответствует биохимическим данным и данным химического пробинга (Yatime et al., 2004; Shin et al., 2011), тогда как в предложенной французской группой модели III домен у-субъединицы не участвует в связывании тРНК, а самые обширные контакты образуются между тРНК и 1-ым и 2-ым доменами а-субъединицы, которые по биохимическим данным и по данным пробинга не должны взаимодействовать с тРНК. Для кристаллизации тройственного комплекса французской группой был использован ПЭГ в качестве осаждающего агента: 5% (w/v) ПЭГ 20 000, 200 мМ КС1, 50 мМ MES, рН 5.7, 10 мМ MgCl2. Возможно, невысокая ионная сила в условиях кристаллизации способствовала сохранению неспецифических контактов между aIF2a и тРНК.

5

Рис. 2. Схематическое изображение пространственных структур комплексов (a) EF-Tu*GDPNP»Phe-TPHKphe Thermus aquaticus (PDB код 1TTT), (6) aIF2aD3yGDPNP'Met-TPHKf £ solfataricus (PDB код 3QSY) и (в) aIF2aPy«GDPNP'Met-TPHKf S. solfataricus (PDB код 3V11). j Римскими цифрами 1(G), II, III обозначены домены EF-Tu и aIF2y; домены а-субъединицы aIF2 обозначены oidi, йог и аоз- Ориентация тРНК на рисунке во всех трех случаях одинакова. !

Хотя наша структура тройственного комплекса хорошо согласуется и с j биохимическими данными, и с результатами прямого пробинга комплекса I гидроксильными радикалами, нельзя исключать, что отсутствие 1-го и 2-го доменов а-субъединицы aIF2 привело к изменению взаимной ориентации тРНК и белка, что, в свою очередь, обусловило более выгодные условия для связывания ССА конца I тРНК в щели между I и III доменами у-субъединицы.

Чтобы прояснить природу противоречий между двумя структурами, мы приступили к кристаллизации различных вариантов тройственного комплекса в \ новых условиях. Для образования тройственных комплексов мы получили два варианта архейного гетеротримера aIF2aPy, отличающиеся размером ; a-субъединицы: была использована как полноразмерная aIF2a, так и укороченная с j TV-конца на один домен форма белка (aIF2aD23). Для удаления подвижного 1-го домена aIF2a с помощью генно-инженерных методов была проведена замена кодона Asp88 на ATG кодон. Выделение aIF2aD23, а также р-субъединицы aIF2 осуществляли с использованием двух последовательных гидрофобных хроматографий. Гомогенный препарат комплекса aIF2Py получали путем смешивания у-субъединицы aIF2 с небольшим избытком aIF2p и проводили гель-фильтрацию на смоле супердекс-75. Аналогично путем добавления небольшого избытка aIF2aD23 к препарату гетеродимера получали гетеротример aIF2aD23PY-

Полноразмерный гетеротример aIF2aPy был выделен и очищен по ранее разработанной схеме (Stolboushkina et al., 2008). Согласно этой методике

i образование комплекса происходит при смешивании прогретых клеточных лизатов j для каждой из субъединиц aIF2 с последующей очисткой гетеротримера с помощью | ионообменной (S-сефароза) и аффинной (гепарин-сефароза) хроматографий.

В дальнейшем препараты гетеротримеров а1К2а02зР7 и aIF2aPy использовали ! для образования тройственных комплексов аналогично получению комплекса ! aIF2aD3y,GDPNP'Met-TPHKf. В результате поиска условий кристаллизации были получены кристаллы в условиях, в которых осаждающим реагентом был хлорид лития (табл. 2). Тонкие гексагональные пластинки появлялись при 4°С через 3-5 ; дней и легко таяли при повышении температуры. Такие добавки, как NDSB, j 1,8-диаминооктан и 1,6-диаминогексан растворяли образующийся в капле осадок и способствовали росту кристаллов в толщину (до 70 мкм). С наиболее крупных кристаллов комплекса aIF2aPy*GDPNP»Met-TPHKf на синхротроне в Берлине (линия BL14.1 станции BESSY II, Германия) нам удалось собрать набор дифракционных данных, но только с низким разрешением (4.8 А). В настоящее время мы продолжаем оптимизировать условия кристаллизации.

Табл. 2. Результаты экспериментов по кристаллизации комплексов aIF2»GDPNP'Met-TPHKf

Объект и фото кристаллов | Условия кристаллизации | Статистика наборов

aIF2aD23prGDPNP'Met-TPHK

Г ^ Ш Ы Л В капле: 2М LiCl. 25 мМ Hepes-NaOH, рН 7.0, 5 мМ MgCl2, 3% (w/v) 1,8-диаминооктан В противорастворе: 4 М LiCl, 50 мМ Hepes-NaOH, рН 7.0, 10 мМ MgCl2 Температура 4°С; Крио: 5 М LiCl Отражали до 5.5 А

aIF2apyGDPNP«Met-TPHKf

щ - 3 В капле: 2М1ЛС1, 25 мМ Нереэ-ЫаОН, рН 7.0, 5 мМ MgCl2) 3% (\у/у) Э-сорбитол В противорастворе: 4 М ЫС1, 50 мМ Нерез-1ЧаОН, рН 7.0, 10 мМ М§С12 Температура 4°С: Крио: 5 М 1лС1 Предел разрешения 4.8 А Пр. группа И^! Параметры ячейки: 86.97, 86.97, 330.25 (А) 90.0, 90.0, 120.0 (°) Доля твиннинга 0.5

■i В капле: 2М ЫС1, 25 мМ Нереэ^аОН, рН 7.0, 5 мМ 1^С12, 300 мМШБВ 195, 0.4% (w/v) натриевая соль ПАК 5100, 10 мМ АТФ В противорастворе: 4 М 1ЛС1. 50 мМ Нереэ-ЫаОН, рН 7.0, 10 мМ М§С12, 0.8% (ш/у) натриевая соль ПАК 5100; Температура 4°С Не тестировали

. -1 ■ В капле: 1.25 М КС1,25 мМ какодилат натрия, рН 6.0, 100 мМ МеС12, 300 мМ N088 221, 0.2% (\у/у) натриевая соль ПАК 5100, 4% (у/у) 2,5-гександиол В противорастворе: 2.5 М КС1, 50 мМ какодилат натрия, рН 6.0, 200 мМ М§С12 Температура 4°С Не тестировали

I 2. Выделение субъединиц е№2 >5. cerevisiae

В отличие от быстро развивающихся структурных исследований архейного фактора а№2 и его комплексов, структурные исследования его эукариотического гомолога еШ2 продвигаются значительно медленнее, и к настоящему времени известна только структура а-субъединицы еШ2 (По е/ а/., 2004; Ншэат е? а1., 2014). Необходимо отметить, что в моделях 408 рибосомной субчастицы в комплексе с

eIF2«rT®'Met-TPHKi (Hashem et al., 2013; Lläcer et al., 2015), полученных недавно с помощью крио-электронной микроскопии, электронная плотность в области тройственного комплекса низкого разрешения (11.6-15.0 Ä), и для ее интерпретации были использованы структуры субъединиц архейного фактора aIF2.

Субъединицы эукариотического фактора отличаются от своих архейных гомологов по размеру, они больше соответствующих субъединиц архейного фактора. При этом ß-субъединица архейного фактора aIF2 почти в два раза меньше по размеру, чем eIF2ß, и гомологична ее С-концевой части. Более того, архейный фактор aIF2 не способен полностью заменять функции эукариотического фактора eIF2 в системе инициации трансляции у эукариот (Dmitriev et al., 2011). Таким образом, структура архейного aIF2 не может являться совершенной моделью для интерпретации экспериментальных данных по функционированию эукариотического фактора eIF2. Поэтому мы приступили к работе с фактором инициации трансляции 2 из эукариот.

Плазмида YEp\3/GCDl l{m^)/SUI2/SUI3 (Erickson and Hannig, 1996) с генами субъединиц eIF2 S. cerevisiae была нам любезно предоставлена доктором Э. Хеннигом (Техасский Университет, США). Однако в лаборатории Э. Хеннига для выделения рекомбинантных субъединиц фактора eIF2 S. cerevisiae в аналитических количествах использовалась дрожжевая экспрессионная система, которая у нас отсутствует. Для препаративного выделения этих белков мы клонировали гены каждой субъединицы eIF2 S. cerevisiae по отдельности в экспрессионный вектор pETllc. Полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки Е. coli штамма BL21(DE3), несущего плазмиду pLacIRARE (Novagen) с генами тРНК, узнающих редкие для Е. coli кодоны. Использование этой плазмиды позволяет избежать ошибок, которые могут возникнуть при синтезе эукариотических белков в клетках бактерий. Таким образом, нами были получены штаммы-продуценты для каждой из субъединиц дрожжевого фактора eIF2. По данным электрофореза после трех часов инкубации культуры клеток при 37°С в присутствии ИПТГ наблюдалась значительная продукция а- и ß-субъединиц eIF2, при этом уровень синтеза у-субъединицы был очень низким, и идентифицировать белок удалось только с помощью масс-спектрометрии.

При разрушении клеток-продуцентов оказалось, что большая часть синтезируемых белков осаждается вместе с клеточными обломками. Мы пытались перевести белки в растворимую форму, варьируя условия индукции и выделения. Для сохранения eIF2a в растворимой форме наиболее эффективным оказалось понижение температуры инкубации клеток после добавления индуктора до 30°С при увеличении времени инкубации до 12 ч. После удаления рибосом из клеточного экстракта первой стадией очистки белка была выбрана анионообменная хроматография на Q-сефарозе (при pH 8.0), что обусловлено кислой природой eIF2a (pi 4.9). Оставшиеся в препарате белка примеси удалось удалить с помощью рехроматографии на Q-сефарозе с понижением значения pH буфера до 6.0 и последующей гель-фильтрацией на смоле супердекс-75.

При поиске оптимальных условий выделения eIF2ß клетки штамма-продуцента суспендировали в буфере с 1 М хлоридом натрия. После осаждения клеточного дебриса к супернатанту добавляли сухой сульфат аммония и для очистки белка использовали гидрофобную хроматографию. Добиться желаемой

чистоты препарата позволило повторное использование гидрофобной хроматографии. Разработанные схемы выделения а- и ß-субъединиц eIF2 S. cerevisiae позволяют получать с 1 л культуры клеток порядка 20 и 8 мг белка, соответственно, с чистотой не менее 95%.

При получении растворимой формы eIF2y S. cerevisiae помимо оптимизации условий индукции экспрессии и разрушения клеток мы пробовали наработать белок в клетках штамма C41(DE3), предназначенного для продукции токсичных белков; пытались получить ау- или ßy-димеры eIF2 путем смешивания соответствующих клеток штаммов-продуцентов до разрушения, надеясь, что связывание с а- или ß-субъединицей eIF2 позволит избежать агрегации eIF2y. Объединение с убиквитином в одну полипептидную цепь, а также клонирование гена у-субъединицы eIF2 человека (плазмиды, несущие гены субъединиц eIF2 Homo sapiens, были любезно предоставлены Е.З. Алкалаевой, ИМБ РАН, Москва) тоже не помогло избежать образования телец включения при наработке eIF2y в бактериальной системе экспрессии. Во всех этих случаях наблюдалась низкая продукция белка eIF2y, который при выделении осаждался с клеточными обломками. Таким образом к настоящему времени нам пока не удалось получить у-субъединицу эукариотического фактора eIF2 в растворимой форме. На данный момент совместно с Ю.Н. Лежниным (ИМБ РАН, Москва) ведется работа по получению eIF2y S. cerevisiae в дрожжевой секреторной системе экспрессии.

3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов e/aIF2«GDPNP»Met-TPHKf

Поскольку мы не смогли получить препарат eIF2y, мы использовали у-субъединицу архейного фактора aIF2 S. solfataricus для связывания с а- и ß-субъединицами eIF2 S. cerevisiae и получения химерных гетеродимеров и гетеротримера. Возможность формирования химерного фактора e/aIF2 является одним из подходов к определению пространственной структуры субъединиц эукариотического eIF2. Параллельно нашим исследованиям биохимические и функциональные исследования тройственных комплексов химерного фактора e/aIF2 с ГТФ и Met-TPHKf ведутся в лаборатории Э. Шмитт во Франции (Schmitt et al., 2012; Naveau et al., 2013). Однако пока нет ни одной публикации о получении кристаллов таких комплексов. Кристаллизация химерных комплексов может способствовать определению структур субъединиц эукариотического фактора, которые сами по себе пока не были закристаллизованы.

Гомогенный препарат химерного комплекса eIF2ß/aIF2y мы получали путем смешивания aIF2y с небольшим избытком eIF2ß и проводили гель-фильтрацию на смоле супердекс-75. Аналогично путем добавления небольшого избытка eIF2a или aIF2a к препарату гетеродимера получали гетеротримеры eIF2aß/aIF2y и eIF2ß/aIF2ay, соответственно. При этом мы использовали как полноразмерную а-субъединицу aIF2 S. solfataricus, так и ее укороченные формы aIF2aD23 и aIF2aU3.

Известно, что а-субъединица эукариотического фактора eIF2 имеет неупорядоченный С-концевой «хвост», функциональная роль которого не определена. Поскольку подвижные участки молекулы белка могут мешать при кристаллизации, у а-субъединицы eIF2 S. cerevisiae с С-конца был удален участок длиной 30 а. о. (e!F2aÜC) с помощью генно-инженерных методов путем замены

кодона 01и275 на стоп-кодон. Поскольку при выделении е1Р2адс возникли трудности, химерный комплекс е1Р2адср/а1Р2у получали аналогично выделению архейного гетеротримера а!Р2ару. Клетки штаммов-продуцентов субъединиц а1Б2у, е1Р2аДс и е№2р (с 2, 1 и 0.5 л культуры, соответственно, с учетом разного уровня синтеза субъединиц в клетках) разрушали ультразвуком, дебрис удаляли, клеточный лизат а№2у прогревали и центрифугировали, после чего супернатанты для каждой субъединицы смешивали и фракционировали на смолах 8-сефароза и гепарин-сефароза. Описанная методика позволила получить до 50 мг комплекса е1Р2адср/а]Р2у с 3.5 л общей культуры клеток.

С полученными химерными гетеротримерами е/а1Р2 мы образовывали | тройственные комплексы с ГТФ и инициаторной Ме^тРНК. Был проведен поиск условий кристаллизации изолированной Р-субъединицы е1Р2, химерных межсубъединичных комплексов и химерных комплексов с Ме^тРНКс. Однако из всех объектов на сегодняшний день удалось закристаллизовать только препараты химерных тройственных комплексов (табл. 3). По-видимому, подвижные домены а-и Р-субъединиц е/а!Р2, которые препятствуют кристаллизации белковых препаратов, стабилизируются в присутствии тРНК.

Табл. 3. Результаты экспериментов по кристаллизации химерных тройственных комплексов

Объект и фото кристаллов | Условия кристаллизации | Статистика наборов

е1Р2р/а1Р2ашуОВРЫР>Ме1-тРНКг

— [ 1 В капле: 2М 1ЛС1. 25 мМ Нерез-ЫаОН. рН 7.0, 5 мМ 1\^С12, 3% (w/v) 1,8-диаминооктан В противорастворе: 4 М 1ЛС1. 50 мМ Нереэ-ЫаОН, рН 7.0, 10 мМ МвС12 Температура 4°С; Крио: 5 М 1лС1 Предел разрешения 4.9 А Пр. группа Р3\2\ Параметры ячейки: 87.59, 87.59, 333.8 (А) 90.0, 90.0, 120.0 (°) Доля твиннинга 0.5

Р В капле: 0.8 М ЬМОл. 25 мМ Нереэ-КаОН. рН 7.0, 25 мМ М§804, 83 мМ ЫОБВ 195, 0.5% (\у/у) натриевая соль ПАК 5100 В противорастворе: 1.6 М ЬьБО^. 50 мМ Нерез-ЫаОН, рН 7.0, 50 мМ Мё804 Температура 4°С Не тестировали

еШгр/аШгапшуСОРЫР'Ме^тРНКг

В капле: 2М 1ЛС1. 25 мМ Нереэ-ЫаОН. рН 7.0, 5 мМ MgCl2, 220 мМ ЫОвВ 211 В противорастворе: 4 М 1ЛС1. 50 мМ Нереэ-ЫаОН, рН 7.0, 10 мМ 1У^С12 Температура 4°С: Крио: 5 М ЬЮ Предел разрешения 5.5 А Пр. группа Р3221 Параметры ячейки: 86.93, 86.93, 332.62 (А) 90.00, 90.00, 120.00 (°) Доля твиннинга 0.5

е1Р2р/а1Г'2ауООРЫР-Мй-тРНКг

■ь ■кчинй __ : ^Цвд В капле: 1.25 М КС1. 25 мМ каколилат натрия, рН 6.0, 100 мМ М§С12, 3%(\у/у) 1,6-диаминогексан В противорастворе: 2.5 М КС1. 50 мМ какодилат натрия, рН 6.0, 200 мМ М§С12 Температура 4°С; Крио: 20% (\/\) этиленгликоль, 2.5 М КС1, 50 мМ какодилат натрия, рН 6.0, 200 мМ М^С12 Отражали до 8.5 А

Кристаллы химерных комплексов были получены при 4°С в условиях, где осаждающими реагентами являются сульфат и хлорид лития, соответственно. С

' полученных кристаллов комплексов eIF2p/aIF2aD3y,GDPNP,Met-TPHKf, и | eIF2(3/aIF2aD23yGDPNP'Met-TPHKf на синхротроне в Берлине (BL14.1, BESSY II, Германия) были собраны наборы дифракционных данных с разрешением 4.9 и 5.5 А, ; соответственно. Решение и анализ структур таких химерных тройственных • комплексов может позволить определить структуру Р-субъединицы j эукариотического фактора eIF2.

I

4. Исследование мРНК-связывающих свойств aIF2y S. solfataricus

j Удо Блэзи с соавторами (Венский биоцентр, Австрия) показали, что

■> у-субъединица архейного фактора aIF2 S. solfataricus помимо центральной роли в связывании Met-тРНК; имеет дополнительную функцию: aIF2y способна связывать ! мРНК, на 5'-конце которых находится трифосфат, и защищать их от 5'-3'-направленной деградации (Hasenohrl et al., 2008). Известно, что эукариотический фактор eIF2 также способен связывать мРНК (Barrieux and Rosenfeld, 1977; Kaempfer et al., 1978a, 1978b). Однако в отличие от архей у эукариот за связывание ; мРНК отвечает Р-субъединица eIF2 (Gonsky et al., 1992).

) Центральная субъединица e/aIF2, у-субъединица, является рибосомной

J ГТФазой, состоит из трех доменов: 1(G), II и III, и по своей структуре относится к семейству белков eEFIA (наиболее изученный представитель семейства -бактериальный фактор элонгации EF-Tu). Известны кристаллические структуры у-субъединицы архейного фактора aIF2 в свободном состоянии и в комплексе с ГТФ и ГДФ, в изолированном виде и в составе ау- и Ру-гетеродимеров и гетеротримера | (Schmitt et al., 2002; Roll-Mecak et al., 2004; Yatime et al., 2006, 2007; Sokabe et al., ; 2006; Nikonov et al., 2007; Stolboushkina et al., 2008; Dubiez et al., 2015). Во всех I известных структурах aIF2y домены белка пространственно сближены, что соответствует «закрытой» ГТФ-связанной активной форме EF-Tu (Berchtold et al., 1993).

Как и у других ГТФаз консервативный (канонический) сайт связывания нуклеотидов расположен в G-домене у-субъединицы aIF2. В нашей лаборатории в результате кристаллизации aIF2y S. solfataricus со смесью ГДФ и нерасщепляемого аналога ГТФ, GDPNP, был обнаружен дополнительный (неканонический) сайт связывания ГТФ, расположенный на поверхности домена II (Nikonov et al., 2007) (рис. 3). Кроме того было показано, что мРНК и ГТФ конкурируют друг с другом за связывание с у-субъединицей aIF2 (Столбоушкина, 2009). Это позволило предположить, что один из нуклеотид-связывающих сайтов aIF2y (неканонический или канонический) может служить местом связывания 5'-конца мРНК. j Чтобы локализовать участок связывания мРНК на aIF2y, мы попытались

I получить пригодные к структурным исследованиям кристаллы комплекса j у-субъединицы aIF2 с разными фрагментами мРНК. Однако наши попытки не | увенчались успехом, поэтому было решено провести направленный мутагенез обоих j нуклеотид-связывающих сайтов белка, чтобы выявить, какие мутации приводят к , изменению сродства aIF2y к ГТФ и мРНК, и таким образом, выяснить какой их двух ; нуклеотид-связывающих сайтов является местом связывания 5'-конца мРНК. )

канонический сайт

неканонически! сайт GDPNP

CV

Рис. 3. Схематическое изображение пространственной структуры аШ2у 5.5о//а/апсм5 в комплексе с ГДФ в каноническом и негидролизуемым аналогом ГТФ (СОР1МР) в неканоническом нуклеотид-связывающих сайтах (РОВ код 2РМО). Черными шариками отмечены Са-атомы соответствующих аминокислотных остатков, измененных с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Сайт-направленный мутагенез нуклеотид-связывающих сайтов aIF2y

Сначала был проведен мутагенез в области неканонического нуклеотид-связывающего сайта aIF2y. Анализ кристаллической структуры aIF2y в комплексе с нуклеотидами показал, что положение молекулы нерасщепляемого аналога ГТФ в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте стабилизировано за счет стэкинг взаимодействия рибозы гуанозина с высококонсервативным Phe221 и за счет водородных связей между основанием нуклеотида и Arg280 и кислородом главной цепи А1а296, а также между у-фосфатом нуклеотида и Lys225. Кроме того одну из сторон неканонического нуклеотид-связывающего сайта белка формируют аминокислотные остатки петли-переключателя switch 1 (рис. 4а).

Агд43

А|а296

Asp222

Рис. 4. Анализ положения нуклеотида в (а) неканоническом и (б) каноническом нуклеотид-связывающих сайтах а!Р2у (РОВ коды структур ЗПР и 4М53, соответственно). Пунктирными линиями обозначены водородные связи. Ш - молекула воды. - ион магния (1у^2+).

П1В9/

На основании этих данных в аминокислотной последовательности а№2у с помощью сайт-направленного мутагенеза методом QuikChange® (Stratagene) были проведены одиночные замены К225А, Я280А, двойная замена К225А/Я280А и

12

тройная замена F221A/K225A/R280A, а также делеции пяти (А41-45) и одиннадцати (А37-47) аминокислотных остатков петли switch 1. Выделение мутантных форм aIF2y осуществляли аналогично выделению белка дикого типа. Для исследования взаимодействия с aIF2y были использованы фрагменты мРНК, полученные транскрипцией in vitro. С помощью метода гель-шифта мы наблюдали изменение электрофоретической подвижности фрагмента мРНК, если он образовывал комплекс с белком (комплекс РНК с белком двигается медленнее, чем сама РНК). Все мутантные белки также как и aIF2y дикого типа образовывали комплекс с мРНК в эквимолярных соотношениях, а ГТФ и мРНК конкурировали за связывание с белком. Таким образом, мы выяснили, что ни одна из введенных мутаций в области неканонического нуклеотид-связывающего сайта aIF2y не повлияла на способность белка связывать мРНК.

Далее мы исследовали влияние мутаций в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2y на связывание мРНК. Этот сайт образован двумя консервативными участками 149NKVDi52 и i84SALHi87, окружающими основание нуклеотида, Р-петлей (18-23 а. о.), которая взаимодействует с фосфатными группами, и переключателем switch 2 (93-113 а. о.) (рис. 46). Чтобы нарушить связывание нуклеотида в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2y, в аминокислотной последовательности белка осуществляли замены, которые могли привести к разрыву водородных связей с нуклеотидом либо создать стерические препятствия для его связывания. С помощью сайт-направленого мутагенеза в аминокислотной последовательности aIF2y были проведены одиночные замены H20F, G21V, N149Y, N149F, D152A и двойная замена H20F/D152A. Мутантные формы aIF2y получали по методике выделения белка дикого типа. С помощью метода гель-шифта мы показали, что замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте существенно повлияли на связывание aIF2y с мРНК (рис. 5).

Рис. 5. Электрофоретический анализ образования комплексов aIF2y дикого типа и ее мутантных форм с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте с MvaLlMPHK-36 (в 8%-ном ПААГ, неденатурирующие условия). 1. мРНК; 2. aIF2y + мРНК; 3. aIF2yH20F + мРНК; 4. aIF2yD152A + мРНК; 5.aIF2yH20F/D152A + мРНК; 6.aIF2yN149Y + мРНК; 7. aIF2yN149F + мРНК; 8. aIF2yG21V + мРНК. В реакционной смеси использовали эквимолярные количества мРНК и белка.

Чтобы количественно оценить влияние введенных мутаций на формирование и стабильность комплекса aIF2y с мРНК, мы использовали метод поверхностного резонанса плазмонов (SPR). Работа проводилась совместно с лабораториями С.А. Мошковского (ИБМХ, Москва) и Е.А. Пермякова (ИБП РАН, Пущино). В экспериментах был использован сенсорный чип с иммобилизованным фрагментом мРНК. Полученные данные были обработаны с помощью программы BIAevaluation (табл. 4). Кинетический анализ показал, что aIF2y дикого типа связывает фрагмент мРНК (SsoACATmPHK-ЗО) с константой Kdравной 2.36x10"10 М, тогда как замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте D152A, H20F и H20F/D152A ухудшают связывание мРНК на 1, 2 или 3 порядка, соответственно. В случае

комплекс

РНК

мутантных форм а1Р2у с одиночными заменами №49У, N149? и С21У связывания белка с мРНК зафиксировано не было. С помощью метода БРИ. мы также показали, что формы у-субъединицы а1Р2 с мутациями в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте связывают мРНК с тем же сродством, что и белок дикого типа. В целом полученные данные указывают на то, что связывание мРНК происходит в районе канонического нуклеотид-связывающего сайта а!Е2у 5. яо1/а(аг1сш.

Табл. 4. Кинетический анализ взаимодействия у-субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных

aIF2y Константа скорости ассоциации, k, (М"У) Константа скорости диссоциации, кл (s"1) Кажущаяся константа диссоциации, Kd (М)

wt 1.08x105 2.54x10 s 2.36x10"'°

D152A 7.21 х I О3 6.21x10-' 8.62х109

H20F 1.07x10" 6.41Х10"4 5.97х10'8

H20F/D152A 1.98х103 1.15x10'3 5.82х10'7

К225А 9.21x10" 3.21 х I0"5 3.48x10"'°

R280A 7.48x10" З.ЗЗхЮ"5 4.46x10-'°

K225A/R280A 6.37x10" 3.57х10'5 5.61x10"'°

F221A/K225A/R280A 1.08x105 2.79x105 2.60x10"'°

Д4М5 9.22x10" 2.56x10"5 2.78x10"'°

Д37-47 9.77x10" 2.61 х Ю-5 2.67x10"'°

Далее чтобы выяснить, связывают ли мутантные формы aIF2y с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте нуклеотид, мы использовали флуоресцентно меченый аналог ГДФ (MANT-GDP). Наличие комплекса aIF2y с MANT-GDP анализировали электрофорезом в неденатурирующих условиях. Оказалось, что мутантные белки aIF2y с одиночными заменами H20F и D152A, а также с двойной заменой H20F/D152A связывают меченый ГДФ, в отличие от белков с заменами N149Y, N149F и G21V. Таким образом, замены N149Y, N149F и G21V приводят к тому, что мутантные белки aIF2y не связывают ни мРНК, ни ГДФ.

Кристаллизаиия мутантных форм aIF2y с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте

Чтобы посмотреть, какие изменения произошли в структуре у-субъединицы aIF2 в результате введенных нами мутаций, мы провели эксперименты по кристаллизации этих мутантных форм белка для определения их структуры. Белки с заменами H20F, D152A и H20F/D152A, которые связывали флуоресцентно меченый ГДФ, нам не удалось закристаллизовать в свободном состоянии, а только в комплексе с нуклеотидами. Кристаллы были получены сокристаллизацией белка с десятикратным избытком нуклеотида (ГТФ или его нерасщепляемых аналогов, GDPNP и GDPCP). Препарат ГТФ очищали с помощью хроматографии на ионообменной смоле MonoQ. В работе использовали GDPNP фирмы Sigma, содержащий примесь ГДФ, и GDPCP фирмы Jena Bioscience, который согласно результатам тонкослойной ионообменной хроматографии не содержит примесей. К смеси белка и нуклеотида добавляли равный объем противораствора: 3.6 М формиат натрия, 0.1 М какодилат натрия, рН 6.5. Кристаллы белка появлялись через 2-3 дня при 28°С и достигали своего максимального размера (100-400 мкм) в течение

14

1-1.5 недель (рие.6). Непосредственно перед сбором дифракционных данных кристаллы подвергались кратковременному вымачиванию в криорастворе (3 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль), после чего были мгновенно заморожены при температуре 100 К в струе жидкого азота. Часть кристаллов тестировали на лабораторной рентгеновской установке Proteum Х8 (Bruker, Германия), данные с остальных кристаллов были собраны на синхротроне в Берлине (BL14.1, BESSY II, Германия). Все полученные кристаллы принадлежат к кубической пространственной группе /23 с параметрами элементарной ячейки: а = 6 = с=188А, а = Р = у = 90°.

aIF2yH20F- aIF2yH20F- aIF2yH20F- aIF2yD152A- aIF2yH20F/D152A-

GDP GDPNP/GDP GDPCP GDPCP GDPCP

3.1 Â 2.7 Â 2.3 A 2.2 A 3.27 A

Рис. 6. Фотографии кристаллов мутантных форм aIF2y с заменами в каноническом нуклеотид-связывающем сайте.

Совместно с группой C.B. Никонова (ИБ РАН, Пущино) были определены структуры мутантных форм aIF2y методом молекулярного замещения. При кристаллизации aIF2yH20F с очищенным препаратом ГТФ молекула ГДФ была обнаружена в каноническом нуклеотид-связывающем сайте. Мы предположили, что в растворе происходит быстрый гидролиз ГТФ, после чего белок кристаллизуется в комплексе с ГДФ. Данное предположение подтвердилось в опубликованной недавно работе, результаты которой свидетельствуют о том, что гидролиз ГТФ на aIF2y эффективно происходит in vitro (Dubiez et al., 2015).

Несмотря на то, что мутантные белки имели пониженное сродство к мРНК, их структуры не выявили существенных изменений, и нуклеотид по-прежнему связывался в каноническом нуклеотид-связывающем сайте. Таким образом, хотя замены H20F и D152A сохраняют способность aIF2y связывать нуклеотид, крупная молекула мРНК, взаимодействующая с измененным сайтом, диссоциирует с большей вероятностью.

Структуры aIF2yH20F*GDPCP, aIF2yDI 52A-GDPCP и aIF2yH20F/D152A-GDPCP были депонированы в банк белковых структур (PDB коды 4NBS, 4QFM, и 4QHY, соответственно). К сожалению, не связывающие нуклеотид мутантные формы aIF2y с заменами N149Y, N149F и G21V пока закристаллизовать не удается.

Влияние природы 5'-концевого нуклеотидного остатка мРНК на связывание aIF2y

По данным группы У. Блэзи в качестве субстрата aIF2y может выступать любая мРНК, на 5'-конце которой находится трифосфат (моно- и дефосфорилированные по 5'-концу мРНК не связываются с у-субъединицей aIF2) (Hasenôhrl et al., 2008). В экспериментах, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что из четырех нуклеозидтрифосфатов только ГТФ конкурирует с мРНК за связывание с aIF2y (Столбоушкина, 2009). Это позволило предположить, что для связывания мРНК необходимо присутствие на ее 5'-конце не просто трифосфата, а

именно гуанозинтрифосфата. Известно, что характерной чертой подавляющего большинства промоторов фаговых РНК-полимераз является использование ГТФ в качестве первого нуклеозидтрифосфата при синтезе РНК. Более того, 5'-концевыми нуклеозидами в природных мРНК S. solfataricus чаще всего являются пуриновые нуклеозиды (А или G) (Wurtzel et al., 2010). Мы решили сравнить, как aIF2y связывает мРНК с аденозинтрифосфатом и с гуанозинтрифосфатом на 5 '-конце. Для этого транскрипцией in vitro с помощью Т7-РНК полимеразы с двух разных промоторов (Coleman et al., 2004) были получены фрагменты мРНК, начинающиеся с G или А.

Оказалось, что мРНК с 5'-концевым гуанозинтрифосфатом (ошрАмРНК-40) связывалась с белком (рис. 7, дорожка 2), в то время как связывания мРНК, несущей аденозинтрифосфат на 5'-конце (А-ошрАмРНК-41), не наблюдалось (рис. 7, дорожка 7). Таким образом, мы подтвердили, что для связывания с aIF2y важен именно 5'-концевой гуанозинтрифосфат мРНК.

Рис. 7. Электрофоретический анализ влияния 5'-концевого нуклеотидного остатка мРНК на связывание aIF2y (8%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). Использованы фрагменты мРНК с 5'-концевым ГТФ (отрАмРНК-40) или АТФ (А-отрАмРНК-41). 1. отрАмРНК-40; 2. aIF2y + отрАмРНК-40; 3. [aIF2y + ГТФ] + отрАмРНК-40; 4*. alF2y + отрАмРНК-40; 5*. [aIF2y + ГТФ] + отрАмРНК-40; 6. А-отрАмРНК-41; 7. aIF2y + А-отрАмРНК-41; 8*. aIF2y + А-отрАмРНК-41. Звездочкой отмечены дорожки, где препарат был прогрет при 65°С. В реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка.

Влияние температуры на конкуренцию между ГТФ/ГДФ и мРНК за связывание с aIF2y

Согласно нашим данным ГТФ конкурирует с мРНК за связывание с aIF2y (рис. 7, дорожка 3), однако из литературных данных было известно, что ни ГТФ, ни ГДФ не препятствуют формированию РНК-белкового комплекса (Hasenohrl et al., 2008). Оказалось, что существенным фактором является температура, при которой формировали комплекс. Мы ставили эксперименты при комнатной температуре (25°С), а наши коллеги из лаборатории У. Блэзи использовали температуру 65-70°С, т.к. aIF2y был взят из термофильного организма. Чтобы проверить влияние температуры, мы поставили параллельно эксперимент при комнатной температуре и с прогревом при 65°С и выяснили, что после прогрева комплекс с мРНК остается стабильным (рис. 7, дорожка 4), а ГТФ, предварительно добавленный к aIF2y в эквимолярных количествах, не мешает связыванию мРНК (рис. 7, дорожка 5).

По-видимому, при прогреве ГТФ уходит из сайта связывания, уступая место мРНК. Это говорит о том, что при 65°С сродство мРНК к aIF2y выше, чем сродство нуклеотида. Использованный в данном эксперименте 40-нуклеотидный фрагмент мРНК (отрАмРНК-40) имеет неструктурированный 5'-конец. Если в эксперименте использовали фрагмент мРНК, 5'-конец которого участвует в формировании стабильной шпильки (MvaLlMPHK-36) (Tishchenko et al., 2006), то после прогрева в присутствии ГТФ только часть РНК уходила в комплекс с белком (рис. 8, дорожка 5

ошрАмРНК-40 А-ошрАмРНК-41

комплекс

отрАмРНК-40 Муа1ЛмРНК-36 1 2 3 4* 5* 1 2 3 4* 5*

справа). По-видимому, мРНК, 5'-конец которой вовлечен в формирование вторичной структуры, обладает меньшим сродством к а1Р2у, чем мРНК, 5'-конец которой является частью одноцепочечной структуры и экспонирован в растворитель.

Рис. 8. Электрофоретический анализ влияния подвижности 5'-конца мРНК на связывание с а1Р2у (8%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). Использованы фрагменты мРНК, у которых 5'-концевой н. о. свободен (ошрАмРНК-40) или участвует в формировании шпильки (МуаЫмРНК-36). 1. мРНК; 2. а№2у + мРНК; 3. [аШ2у + ГТФ] + мРНК; 4*. а№2у + мРНК; 5*. [а1Р2у + ГТФ] + мРНК. Звездочкой отмечены дорожки, где препарат был прогрет при 65°С. В реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка.

Если при комнатной температуре ГДФ или ГТФ, добавленные к а1Е2у в эквимолярном соотношении, препятствуют связыванию мРНК и не вытесняют уже связанную с белком мРНК (рис. 9, дорожки 3-6), то при 65°С конкуренция снижается (рис. 9, дорожки 9-12) и, чтобы предотвратить образование комплекса с мРНК, необходимо увеличение количества нуклеотида, по крайней мере, в 10 раз.

комплекс «1.4 У и щт ^т У М♦ •

РНК У У у у у ЩЯЯ шш ^^

ГТФ

ГТФ

1 2 3 4 5 6 7* 8* 9* 10*11*12*

комплекс МММ Ум - м

РНК ПНР ЧИР ЩЩ-

Рис. 9. Электрофоретический анализ влияния ГДФ и ГТФ на связывание а№2у с Муа1ЛмРНК-36 при 25°С и 65°С (8%-ный ПААГ, неденатурирующие условия). 1. мРНК; 2. а1Р2у + мРНК; 3. [а1Р2у + ГДФ] + мРНК; 4. [а№2у + мРНК] + ГДФ; 5. [а1Р2у + ГТФ] + мРНК; 6. [аШ2у + мРНК] + ГТФ; 7*. мРНК; 8*. а1Р2у + мРНК; 9*. [а1Г2у + ГДФ] + мРНК; 10*. [а1Р2у + ГДФ(1:10)] + мРНК; 11*. [а1Р2у + ГТФ] + мРНК; 12*. [а1Р2у + ГТФ(1:10)] + мРНК. Звездочкой отмечены дорожки, где препарат был прогрет при 65°С. За исключением десятикратного избытка нуклеотида в дорожках 10 и 12, во всех остальных случаях в реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка.

Конкуренция между ГТФ/ГДФ и мРНК за связывание с а№2у и результаты сайт-направленного мутагенеза позволяют впервые утверждать, что связывание 5'-концевого гуанозинтрифосфата мРНК в каноническом нуклеотид-связывающем сайте а1Р2у определяет специфическое взаимодействие мРНК с данным белком. Логично предположить, что свободный ГТФ и гуанозинтрифосфат на 5'-конце мРНК взаимодействуют с каноническим нуклеотид-связывающим сайтом а№2у схожим образом. Ранее проведенные эксперименты (Реёи11а е/ а1., 2005; НавепоМ е/ а1., 2008) и наши кинетические исследования показывают, что сродство а№2у к мРНК с гуанозинтрифосфатом на 5'-конце (Кй= 1.0х10"8 -5- 2.4x10"'° М) выше, чем к ГТФ (4.8х10"7М) или ГДФ (4.0х10"7М). Это предполагает существование дополнительных контактов между белком и мРНК. С помощью метода тоу-принтинг ранее было показано, что в присутствии а!Р2у обратная транскриптаза

останавливается в положении +4 по отношению к 5'-концу мРНК (Hasenôhrl et al., 2008). Это указывает на расположение специфического сайта связывания aIF2y вблизи 5'-конца мРНК и на отсутствие дополнительных прочных контактов белка с остальной частью мРНК. На основании этих данных совместно с группой C.B. Никонова (ИБ РАН, Пущино) были смоделированы возможные структуры комплекса aIF2y»MPHK, для которых были выполнены расчеты молекулярной динамики (МД) (рис. 10).

aIF2yMjaLlMPHK-49

й

1(g)

aIF2y»MvaLl мРНК-36

л- V/^ ко

5' ГТФ

Рис. 10. Гипотетические модели комплексов а1Р2у1УЦа1ЛмРНК-49 и аШгуМуаЫмРНК-Зб (сверху) и модели этих комплексов после МД расчетов с длиной траектории 100 нс (снизу), полученные В.Г. Кляшторным и О.С. Никоновым. Для моделирования были использованы структуры а№2у, М]аЫмРНК-49 и МуаЫмРНК-36 (РОВ коды 4М4Б, Ш63 и 2HW8, соответственно). Общим для построенных моделей было начальное положение 5'-концевого гуанозин-трифосфата мРНК, повторяющее положение нуклеотида в каноническом нуклеотид-связывающем сайте а1Р2у. а1Р2у показана светло-серым цветом, фрагменты мРНК - темно-серым, 5'-концевой гуанозинтрифосфат

(5' ГТФ) - черным.

Несмотря на то, что в ходе вычисления молекулярно-динамических траекторий взаимное расположение основной части фрагментов мРНК и а[Р2у значительно изменялось, положение 5'-концевого гуанозинтрифосфата мРНК в каноническом нуклеотид-связывающем сайте белка оставалось неизменным. Эти данные могут свидетельствовать о том, что исследуемый контакт является необходимым и достаточным для специфического узнавания мРНК у-субъединицей а1Р2. Предполагаемая высокая подвижность фрагмента мРНК, связанного с аШ2у специфическим, но непротяженным контактом, может объяснять трудности, возникающие при кристаллизации такого комплекса, даже если фрагмент мРНК имеет стабильную структуру.

5. «Рабочий» цикл aIF2y S. solfataricus

Мутантные формы aIF2y с заменами и делениями в области неканонического нуклеотид связывающего сайта связывали мРНК с тем же сродством, что и белок дикого типа. Мы закристаллизовали эти белки, чтобы выяснить, какие изменения произошли в структуре aIF2y в результате введенных мутаций. Кристаллы были получены главным образом в растворах, содержащих формиат или малонат натрия в качестве осадителя, и использованы для сбора дифракционных данных на синхротроне в Берлине (BL14.1, BESSY II, Германия) (табл. 5). Определение структур мутантных форм aIF2y и их анализ были проведены совместно с группой C.B. Никонова (ИБ РАН, Пущино).

Табл. 5. Результаты экспериментов по кристаллизации мутантных форм а1Р2у с заменами в неканоническом нуклеотид-связывающем сайте и а!Р2у дикого типа

|

Объект и фото кристаллов Условия кристаллизации Статистика наборов

а1Р2уК225А»СОРЫР/СЭР В капле: 16% (му/у) ММЭПЭГ 5000. 45 мМ ацетат натрия рН 5.5, 5 мМ ОЭР№ В поотиворастворе: 36% (\у/у) ММЭПЭГ 5000, 100 мМ ацетат натрия, рН 5.5 Температура 22°С: Крио: 30% Ы/\) ММЭПЭГ 5000, 85 мМ ацетат натрия, рН 5.5, 15% (у/у) этиленгликоль Предел разрешения 3.4 А Пр. группа ,Р2|2|2! Параметры ячейки: 71.94 166.53,247.06 (А) 90.0, 90.0, 90.0 (°)

а1Р2уК280А- GDPNP/GDP ? ( } В капле: 1.6 М формиат натрия. 43 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 5 мМ СБРЫР В противорастворе: 3.1 М (Ьормиат натрия. 87 мМ какодилат натрия, рН 6.5. Температура 28°С: Крио: 3.0 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (у/у) этиленгликоль Предел разрешения 2.2 А Пр. группа Й32 Параметры ячейки: 142.53,142.53,218.52 (А) 90.0, 90.0, 90.0 (°)

а1Р2уР221А/К225АЖ280А* вОРСР В капле: 4.5% ЫМ малонат натрия. рН 5.5. 4.9 мМ йБРСР В противорастворе: 18% ЫМ малонат натрия, рН 4.5, 5% (у/у) МПД Температура 28°С; Крио: 30% (\у/у) малонат натрия, рН 5.5, 15% (у/у) этиленгликоль Предел разрешения 2.0 А Пр. группа Р1 Параметры ячейки: 76.71,76.75, 146.79 (А) 101.5,92.1,96.0 (°)

а1Р2уР221А/К225АЖ280А' ГДФ 1Щ о В капле: 1.6 М формиат натрия. 43 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 1 мМ ГТФ В противорастворе: 3.6 М (Ьормиат натрия. 100 мМ какодилат натрия, рН 6.5 Температура 28°С: Крио: 3.0 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (у/у) этиленгликоль Предел разрешения 2.25 А Пр. группа /?32 Параметры ячейки: 142.86, 142.86,218.41 (А) 90.0, 90.0,120.0 (°) РЭВ код 4М48 (рис.11. а1Р2уГДФ»РМТ)

а!Е2уД41 -45-ООРЫР/СОР Предел разрешения 2.8 А Пр. группа Р3|21 Параметры ячейки: 94.75,94.75, 165.37 (А) 90.0,90.0, 120.0 (°) ров код звлг

и' М ш 5.5 мМ ОЭР№ В противорастворе: 15% (у/М малонат натрия, рН 4.7 Температура 28°С; Крио: 25.5% (\у/у) малонат натрия, рН 4.7, 15% (у/у) этиленгликоль

а1Р2уД41-45«ГДФ В капле: 1.2 М формиат натрия. 33 мМ Предел разрешения 2.5 А Пр. группа /23 Параметры ячейки: 187.25, 187.25, 187.25 (А) 90.0, 90.0, 90.0 (°)

1 '' ' какодилат натрия, рН 6.5, 3 мМ ГДФ В противорастворе: 3.6 М (Ьормиат натрия. 100 мМ какодилат натрия, рН 6.5 Температура 28°С; Крио: 3.0 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (у/у) этиленгликоль

а1Р2уД41 . \ ^^ \ -45 щ В капле: 0.7 М 1л,80а. 23 мМ Нере5-1МаОН. рН 7.0,23 мМ М§804, 270 мМ 1-ГО8В 195. В противорастворе: 1.6 М ЬьвОд. 50 мМ Нерев-ЫаОН, рН 7.0, 50 мМ MgSO^ Температура 12°С: Крио: 2.0 М Ь^О,. 50 мМ Нерез-ИаОН, рН 7.0, 50 мМ Ме804, 270 мМ ШвВ 195, 15% (у/у) этиленгликоль Предел разрешения 2.15 А Пр. группа Р3|21 Параметры ячейки: 95.82,95.82, 165.24 (А) 90.0 , 90.0, 120.0 (°) РЭВ код 4М2Ь (рис. 11. аШ2у)

Объект и фото кристаллов Условия кристаллизации Статистика наборов

aIF2yA37-47'GDPNP/GDP В капле: 1.8 М формиат натрия. 44 мМ Предел разрешения 2.3 А Пр. группа/23 Параметры ячейки: 187.12, 187.12, 187.12 (А) 90.0, 90.0, 90.0 (°) РОВ код ЗРЕЯ

Щ щЛ v мян какодилат натрия, рН 6.5, 5 мМ GDPNP В противооаствоое: 3 М формиат натрия. 83 мМ какодилат натрия, рН 6.5 Температура 28°С; Крио: 3.0 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль

a!F2yA37-47'GDPCP В капле: 1.8 М формиат натрия. 44 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 4.9 мМ GDPCP В противорастворе: 3.2 М формиат натрия, 90 мМ какодилат натрия, рН 6.5 Температура 28°С: Крио: 3.0 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль Предел разрешения 2.0 А Пр. группа /23 Параметры ячейки: 186.89, 186.89, 186.89 (А) 90.0, 90.0, 90.0 О РОВ код 4М53

•1 ->з \

aIF2yGDPCP В капле: 1.2 М формиат натрия. 33 мМ Предел разрешения ) .64 А Пр. группа /23 Параметры ячейки: 186.25, 186.25, 186.25(А) 90.0, 90.0, 90.0 О РОВ код 4R.IL (рис. 11. а1Р2уЮОРСР)

г* т какодилат натрия, рН 6.5, 1.2% (w/v) ММЭПЭГ 5000, 1 мМ GDPCP В противорастворе: 3.2 М формиат натрия, 90 мМ какодилат натрия, рН 6.5 Температура 28°С; Крио: 3.0 М формиат натрия, 85 мМ какодилат натрия, рН 6.5, 15% (v/v) этиленгликоль

аШ2уГДФ В капле: 7.5% (w/v) ПЭГ 4000, 100 мМ Предел разрешения 2.6 А Пр. группаР\2\\ Параметры ячейки: 86.05, 106.55, 156.30 (А) 90.00, 90.63, 90.00 (°) РОВ код 4М0Ь (рис. 11. а1Р2уГДФ)

Трис-HCl, рН 7.5, 90 мМ КВг, 0.5 мМ ГТФ В противорастворе: 13% (w/v) ПЭГ 4000. 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 180 мМ КВг Температура22°С; Крио: 13%(w/v)n3r 4000, 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 180 мМ КВг, 15% (v/v) этиленгликоль

Наложение полученных структур на структуру aIF2y дикого типа не выявило существенных отклонений в ходе полипептидной цепи. Однако сравнение большого числа кристаллических структур aIF2y, полученных с высоким разрешением, позволило выявить структурные особенности не тронутых мутациями подвижных участков G-домена белка. Полученные структурные данные позволили построить схему конформационных переходов в у-субъединице aIF2, которая циркулирует между активным (ON) ГТФ-связанным и неактивным (OFF) ГДФ-связанным состояниями, проходя через промежуточные формы, когда белок может быть связан одновременно с ГДФ и неорганическим фосфатом или не содержать нуклеотид. Нами были получены структуры aIF2y в четырех этих состояниях (рис. 11).

1

air^yi ДФ

< v;' -

kg) . , j .v■-■-

A

аГПуГДФ

OFF (ГДФ)

ш

Рис. 11. «Рабочий» цикл a!F2y S. solfataricus. Кристаллические структуры aIF2y в свободном состоянии, в ГТФ(ООРСР)- и ГДФ-связанном состояниях и в промежуточной форме в комплексе с ГДФ и формиат-ионом (FMT); PDB коды 4M2L, 4RJL, 4M0L и 4M4S, соответственно. В скобках указаны состояния у-субъединицы aIF2 в ее «рабочем» цикле. Предполагается, что структура а1Р2уГДФ«РМТ соответствует промежуточному состоянию белка в комплексе с ГДФ и Фм.

При кристаллизации aIF2y или ее мутантных форм с очищенным препаратом ГТФ, как и в случае кристаллизации aIF2yH20F с ГТФ, мы обнаруживали молекулу ГДФ в каноническом нуклеотид-связывающем сайте. В условиях с высокой концентрацией формиата натрия, который был использован в качестве осадителя, в сформировавшемся комплексе а1Р2уГДФ формиат-ион (FMT) стабилизировал switch участки белка в конформации, характерной для активного (ON) ГТФ-связанного состояния aIF2y и EF-Tu. В полученной структуре а!Р2у ГДФ-FMT атом кислорода формиат-иона образует водородные связи с атомами азота главной цепи Gly96 и His97 петли switch 2 и Thr46 петли switch 1. Дополнительно формиат-ион взаимодействует через молекулу воды с ионом магния, (3-фосфатом нуклеотида и Lys22 .Р-петли. В целом формиат-ион занимает положение, близкое к положению неорганического фосфата (Фн) в структуре а1Р2а0зРуГДФ,Ф„ (Yatime et al., 2007), которая, как предполагают авторы, отражает состояние белка непосредственно после гидролиза ГТФ - в комплексе с ГДФ и Фн. В этой структуре гетеротримера, определенной с разрешением 3.2 А, промежуточное состояние белка поддерживается неким лигандом, возможно, фосфат-ионом, который взаимодействует с обоими switch участками aIF2y. На основании этих данных мы предположили, что в полученной нами с разрешением 2.25 А структуре a I F2y • Г Д Ф • F М Т формиат-ион имитирует отщепленный от ГТФ неорганический

фосфат. В таком случае данная структура может представлять промежуточное состояние аШ2,у,ГДФ,Фн, в котором Ф„ сохраняет связь с белком и положение switch участков соответствует активному состоянию у-субъединицы.

В ранее определенных структурах aIF2y координаты атомов для большинства аминокислотных остатков петли switch 1 не были определены из-за большой подвижности полипептидной цепи этого участка. В структуре аП^уГДФ^МТ в области переключателя switch 1 мы впервые наблюдали хорошо интерпретируемую электронную плотность. Центральная часть switch 1 (36-44 а. о.) формирует а-спираль, а остатки 31-35 образуют ß-тяж, входящий в состав семи-тяжевого ß-листа.

Чтобы выяснить роль формиат-иона в конформационных перестройках aIF2y, мы закристаллизовали белок дикого типа с ГДФ в присутствии формиата натрия. Полученная структура была полностью идентична структуре а1Р2у*ГДФ*РМТ. Это свидетельствует о том, что не ГТФ, присутствующий в растворе при кристаллизации, а именно формиат-ион в высокой концентрации стабилизирует связанную с нуклеотидом у-субъединицу aIF2 в ON конформации. Полученные в этих условиях кристаллы aIF2y с негидролизуемым аналогом ГТФ, GDPCP, позволили определить структуру этого белка с самым высоким на тот момент разрешением - 1.64 А (рис. 11). В этой модели впервые стала видна полная структура переключателя switch 1 в составе ГТФ-связанной aIF2y.

При кристаллизации aIF2y с ГТФ в условиях, не содержащих формиат натрия, был снова закристаллизован комплекс а1Р2уГДФ (табл. 5), но в отсутствие формиат-иона петли-переключатели принимали характерные OFF конформации. Сравнение структур OFF и ON состояний aIF2y впервые продемонстрировало смещение доменов II и III относительно домена 1(G), хотя и не столь значительное как в EF-Tu факторе. Вращение II и III доменов aIF2y происходит на 10-15° вокруг оси, соединяющей Ca атомы 292-293 а. о. Стоит отметить, что взаимное расположение доменов у-субъединицы, не связанной с нуклеотидом, соответствует промежуточному положению между ГТФ- и ГДФ-связанным состояниями белка. Это может объяснять одинаковое сродство aIF2y S. solfataricus к ГТФ и ГДФ (Pedullä et al., 2005).

Основные изменения в структуре aIF2y, происходящие при связывании ГТФ, его гидролизе и переходе белка в свободное состояние, обусловлены структурными перестройками подвижных участков G-домена белка (рис. 11). Сравнительный анализ полученных структур позволил описать структурные перестройки в aIF2y, происходящие при гидролизе ГТФ. При переходе aIF2y из ГТФ- в ГДФ-связанное состояние центральная часть переключателя switch 1 поворачивается на 60° по часовой стрелке, что приводит к значительным конформационным перестройкам на его N- и С-концах. Конформацию сохраняет только a-спираль (аА) и прилегающий к ней Met45. Участки switch 1, включающие 34-38 и 44-48 а. о., теряют a-спиральную конформацию, и С-конец aA-спирали смещается в сторону switch 2. Практически все водородные связи, стабилизирующие структуру центрального участка switch 1 и его положение в молекуле, разрушаются, и стабильность его конформации значительно снижается. Гидролиз ГТФ смещает у-фосфат в положение, которое ранее занимала молекула активной воды, и дестабилизирует switch 1, стимулируя его дальнейшие перестройки, которые ведут к удалению у-фосфата и переходу aIF2y в неактивную ГДФ-связанную форму.

выводы

1. Получены кристаллы тройственного комплекса aIF2aD3y»GDPNP*Met-TPHKf, что позволило впервые определить и проанализировать пространственную структуру этого комплекса с разрешением 3.2 Ä. Показано, что, несмотря на структурную гомологию alF2y и EF-Tu, взаимодействие инициаторной тРНК с фактором инициации aIF2 происходит по D-шпильке, тогда как элонгаторные тРНК взаимодействуют с фактором элонгации EF-Tu по Т-шпильке.

2. В условиях с высокой ионной силой получены кристаллы полноразмерного тройственного комплекса aIF2aßy,GDPNP»Met-TPHKf, с которых собраны дифракционные данные с разрешением до 4.8 А.

3. Получены штаммы-суперпродуценты Е. coli для а- и ß-субъединиц eIF2 S. cerevisiae и разработаны методики выделения этих белков.

4. Получены препараты различных вариантов химерного фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов с GDPNP и Met-TPHKf. Найдены условия кристаллизации химерных тройственных комплексов. С кристаллов комплекса eIF2ß/aIF2aD3yGDPNP'Met-TPHKf собран набор дифракционных данных с разрешением 4.9 А.

5. Показано, что замены в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2y S. solfataricus снижают или полностью подавляют способность белка связывать мРНК. Для связывания с aIF2y необходимо наличие у мРНК 5'-концевого гуанозинтрифосфата; белок не связывает мРНК с аденозинтрифосфатом на 5'-конце. Эти данные позволяют впервые утверждать, что связывание 5'-концевого гуанозинтрифосфата мРНК в каноническом нуклеотид-связывающем сайте aIF2y определяет специфическое взаимодействие мРНК с данным белком.

6. Получены кристаллы мутантных форм у-субъединицы aIF2 S. solfataricus в свободной форме, в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ. Получены кристаллы aIF2y дикого типа в комплексе с негидролизуемым аналогом ГТФ, что позволило определить пространственную структуру этого белка с разрешением 1.64 А. На основе полученных кристаллических структур была построена схема рабочего цикла aIF2y, отображающая структурные перестройки подвижных участков G-домена белка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ

1. Stolboushkina Е., Nikonov S., Zelinskaya N., Arkhipova V., Nikulin A., Garber M., Nikonov O. Crystal structure of the archaeal translation initiation factor 2 in complex with a GTP analogue and Met-tRNAfMct. // J. Mol. Biol. 2013. V. 425. P. 989-998.

2. Архипова В.И., Столбоушкина E.A., Никонов O.C., Габдулхаков А.Г., ГарберМ.Б. Кристаллизация мутантных форм у-субъединицы архейного фактора инициации трансляции 2. // Кристаллография. 2014. Т. 59. С. 76-79.

3. Nikonov О., Stolboushkina Е., Arkhipova V., Kravchenko О., Nikonov S., Garber M. Conformational transitions in the у subunit of the archaeal translation initiation factor 2. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2014. V. 70. P. 658-667.

4. Arkhipova V., Stolboushkina E., Kravchenko O., Kljashtorny V., Gabdulkhakov A., Garber M., Nikonov S., Martens В., Blasi U., Nikonov O. Binding of the 5'-triphosphate end of mRNA to the y-subunit of translation initiation factor 2 of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. // J. Mol. Biol. 2015. doi: 10.1016/j.jmb.2015.07.020.

Тезисы докладов

5. Arkhipova V., Stolboushkina E., Nikonov O., Nikulin A., Nikonov S., Garber M. Crystallization and investigation of the structure of the complexes of archaeal translation initiation factor 2 with RNA. // Abstract book of the FEBS combined Practical and Lecture Course «Advanced methods in macromolecular crystallization IV». Nove Hrady, Czech Republic. 2010. V. 17(3a). P. 37.

6. Архипова В.И., Столбоушкина E.A., Никонов O.C., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Клонирование генов и выделение субъединиц эукариотического фактора инициации трансляции 2. // Материалы международной конференции «Биология - наука XXI века». Москва, Россия. 2012. С. 69-70.

7. Архипова В.И., Столбоушкина Е.А., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Образование химерных комплексов эукариотического и архейного факторов инициации трансляции 2. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXV международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, Россия. 2013. С. 50.

8. Столбоушкина Е.А., Архипова В.И., Гарбер М.Б. Получение и кристаллизация фактора инициации трансляции 2 (e/aIF2). // Сборник трудов IV международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань, Россия. 2014. С. 73.

9. Архипова В.И., Столбоушкина Е.А., Никонов О.С., Никонов С.В., Гарбер М.Б. Исследование мРНК-связывающих свойств у-субъединицы архейного фактора инициации трансляции 2 с помощью сайт-направленного мутагенеза. // Сборник тезисов 16-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, Россия. 2012. С. 89-90.

10. Arkhipova V., Stolboushkina Е., Nikonov О., Kravchenko О., Resch A., Nikonov S., Blasi U. and Garber M. Binding site for mRNA on the y-subunit of archaeal translation initiation factor 2. // 40th FEBS Congress «The Biochemical Basis of Life». Berlin, Germany. 2015. FEBS J. V. 282 (suppl. 1). P. 341.

Заказ № 95-А/09/2015 Подписано в печать 28.09.2015 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:zak@cfr.ru