Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2

Столбоушкина, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2"

На правах рукописи

г9625

СТОЛБОУШКИНА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2

03.00.03 - Молекулярная биология

автореферат 1 5 окт 20и9

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003479625

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Гарбер Мария Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Фролова Людмила Юрьевна

доктор химических наук

Шатский Иван Николаевич

Ведущая организация:

Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится « » _2009 года в часов на заседании

совета Д 501.001.76. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «Дл£_» г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, {Ч/^*? ¿V-, ___

кандидат биологических наук г^ — ' И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инициация биосинтеза белка на рибосоме -важнейший этап в реализации генетической информации и клеточной регуляции. Это сложное многоэтапное событие, в котором участвуют различные белковые факторы, молекулы РНК и низкомолекулярные соединения. Наименее изучен механизм инициации трансляции у архей. Чтобы разобраться в этом сложном процессе необходимо знание функциональной роли и структурной организации белковых факторов инициации трансляции. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка у архей играет гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (aIF2ccßy), который осуществляет доставку инициаторной метионил-тРНК в Р-участок малой рибосомной субчастицы и гомологичен эукариотическому фактору eIF2. Кроме этого, архейная у-субъединица aIF2 имеет неканоническую функцию: защищает мРНК, на 5-конце которых находится трифосфат, от 5'—>3' направленной деградации. Исследования структуры e/aIF2 очень актуальны ввиду важности его функции. Такие исследования в последние годы ведутся интенсивно в лабораториях ряда стран.

Цель работы: исследование структуры aIF2 из гипертермофильной архей Sulfolobus solfataricus (SsoIF2).

Основные задачи работы:

- получение штаммов-суперпродуцентов Escherichia coli для всех субъединиц белка SsoIF2 и инициаторных тРНК Е. coli и S. solfataricus и разработка методов выделения данных макромолекул из клеток штаммов-суперпродуцентов,

- получение гетеротримера SsoIF2,

- разработка метода сборки тройственного комплекса Met-tRNAf»SsoIF2aD3T'GDPNP in vitro из индивидуальных компонентов,

- кристаллизация у-субъединицы SsoIF2 в нескольких функциональных состояниях (в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ), интактного гетеротримерного SsoIF2 и тройственного комплекса Met-tRNA,*SsoIF2aMyGDPNP,

- экспериментальная проверка предположения о том, что дополнительный сайт связывания ГТФ на у-субъединице SsoIF2 является местом для взаимодействия 5'-концевого гуанозин-трифосфата мРНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые были получены кристаллы полноразмерного архейного фактора инициации трансляции 2, на основе которых была определена его пространственная структура. Анализ этой структуры выявил высокую подвижность в а- и ß-субъединицах данного фактора. Определение структуры изолированной у-субъединицы SsoIF2 в различных состояниях привело к выдвижению оригинальной модели взаимодействия aIF2 с инициаторной метионил-тРНК и к обнаружению дополнительного, ранее никем не обнаруживавшегося, сайта связывания ГТФ на поверхности белка. Этот дополнительный ГТФ-связывающий сайт, согласно проведенным в данной работе экспериментам, может являться местом для взаимодействия 5'-концевого гуанозин-трифосфата мРНК. Также впервые в данной работе получены кристаллы тройственного комплекса Met-tRNAf-,SsoIF2aD37,GDPNP.

Результаты по структуре гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 и по структурам комплексов у-субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер и могут быть включены в курсы лекций по молекулярной биологии, читаемых на биологических факультетах различных ВУЗов. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом. Штаммы-суперпродуценты Е. coli для всех субъединиц белка SsoIF2 и инициаторной тРНК Е. coli, полученные в данной работе, используются в ИБ РАН. Препарат фактора SsoIF2 предоставлен для функциональных исследований в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют рисунков и -¿Г таблиц. Общий объем диссертации *//3 страниц. Библиография включает¿¿Зг названий.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты данной работы докладывались на Российских и международных конференциях.

Обзор литературы посвящен структурным и функциональным особенностям второго фактора инициации трансляции эукариотического типа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение гетеротримерного фактора SsoIF2 и его субъединиц

С 2002 года в печати стали появляться структуры отдельных субъединиц фактора инициации трансляции 2 как эукариотического так и архейного происхождения. Четыре года назад мы подключились к этим исследованиям и приступили к выделению и кристаллизации aIF2 из гипертермофильной археи S. solfataricus. Ранее SsoIF2 и его изолированные субъединицы никем не выделялись в препаративных количествах, поэтому нам пришлось разрабатывать собственные методики. Доктором У. Блэзи (Венский биоцентр, Австрия) нам были предоставлены плазмиды, содержащие гены субъединиц SsoIF2. С этих плазмид можно было получить субъединицы SsoIF2 с олигогистидиновыми «хвостами» на С-концах. Мы переклонировали гены субъединиц SsoIF2 в экспрессионные векторы без нуклеотидной последовательности для олигогистидинового «хвоста». Экспрессию клонированных генов проводили в клетках Е. coli штамм BL21(DE3). В отличие от а- и ß-субъединиц, синтез у-субъединицы наблюдался на низком уровне. Этот белок смогли наработать только в клетках штамма C41(DE3), предназначенного для продукции токсичных белков, причем продукция белка была настолько низкой, что идентифицировать его удалось только с помощью масс-спектрометрии. Поэтому для получения у-субъединицы SsoIF2 в препаративных количествах нам пришлось выращивать культуру клеток штамма-суперпродуцента в большом объеме.

Общая схема выделения субъединиц SsoIF2 из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli изображена на рис. 1А. Очистка термостабильных субъединиц SsoIF2 была существенно облегчена тем, что прогрев белковых

экстрактов при 65°С приводил к денатурации и выпадению в осадок большей части белков клетки-хозяина. После этой процедуры субъединицы БбоИ очищали всего лишь в две стадии колоночной хроматографии (рис. 1Б). Как правило, выделение белка из клеток суперпродуцента осложняется его неспецифическим взаимодействием с нуклеиновыми кислотами в клеточном экстракте. В растворах с высокой ионной силой возможно разрушение таких ассоциатов. Поэтому для очистки всех субъединиц 8зо1Р2 использовали гидрофобную хроматографию, которая позволяет связать белок с носителем при высоких концентрациях солей. Включение в схему выделения катионообменной хроматографии обусловлено щелочной природой субъединиц. Расчетные изоэлектрические точки (р1) для субъединиц ЭэоП^ лежат в пределах 8.3 - 9.2. Обычно белки оказываются достаточно заряженными и хорошо сорбируются на обменник при значениях рН, отличающихся от р1 примерно на единицу. Для работы мы использовали буфер с рН 7.5. Однако р-субъединица при таком значении рН не задерживалась на катионообменнике и свободно проходила через колонку, что скорее всего обусловлено недостаточно выраженным положительным зарядом белка. Между тем при сдвиге значения рН буфера в кислую сторону нам не удавалось полностью сорбировать (3-субъединицу на катионообменник. Поэтому для очистки (3-субъединицы мы провели повторно гидрофобную хроматографию и добились этим желаемой чистоты препарата. Описанные в данной работе методики выделения изолированных субъединиц 85о1Р2 позволяют получать из 1 л культуры до 10 мг белка (в случае у-субъединицы только 2 мг) с чистотой не менее 95% (рис. 1 В).

А разрушение биодлассы Б

суперпродуцента -

осаждение дебриса

j ■ дебрис

прогрев клеточного экстракта (65°) (в случае выделения у-суб"ьединицы -предварительное удаление рибосом)

осаждение денатурированных белков осадок ■ денатурированных белков

хроматография №1

хроматография №2

Название субъединицы SsoIF2, выделенной из биомассы суперпродуцента Название носителя для хроматографии №1 Название носителя для хроматографии №2

а или aD3 S-сефароза Bütyl-Toyopearl 650S

Р Butyl-Toyopearl 6S0S Butyl-Toyopearl 650S

У Butyl-Toyopearl 650S КМ-сефароза

Рис. 1 .А - Схема выделения изолированных субъединиц SsoIF2 из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli. Б - Таблица стадий хроматографической очистки изолированных субъединиц SsoIF2. В - Электрофоретический анализ (в 15%-ном ДДС-Ыа-ПААГ) чистоты препаратов изолированных субъединиц SsoIF2, полученных на конечной стадии хроматографической очистки.

Полноразмерный 8зо1Р2 можно получить, если смешать очищенные заранее субъединицы, а затем провести гель-фильтрацию реконструированного гетеротримера. Недостатки такого подхода - многостадийность и невысокий выход 85о1Р2, недостаточный для широкого поиска условий кристаллизации. В 2006 году была опубликована более эффективная методика получения и очистки рекомбинантного а№2 51. зо1/шапсш [Уайте а/., 2006]. Авторы смешивали клетки штаммов-суперпродуцентов субъединиц в равных количествах, разрушали, дебрис удаляли, клеточный лизат прогревали и фракционировали на смолах 8-сефароза и супердекс-75. Преимуществом такой методики является то обстоятельство, что сборка и очистка а1Б2 происходит с самого начала и это обуславливает достаточно высокий выход очищенного гетеротримера. В своей работе мы предлагаем модификацию вышеописанного метода (рис. 2). Основанием для изменений послужил тот факт, что нам не удавалось осуществить реконструкцию 8зо1Р2 в клеточном лизате до стадии прогрева. Модифицированная нами методика начинается с того, что клетки суперпродуцентов разрушали и клеточный лизат прогревали индивидуально для каждой субъединицы, а уже затем супернатанты объединяли и фракционировали. Мы также учитывали разный уровень синтеза субъединиц в клетках и по этой причине увеличивали количество биомассы суперпродуцента у-субъединицы в три раза. Таким способом мы получали до 40 мг I биологически активного ЭзоП^ из 5 л общей культуры клеток. Важно, что полученный препарат 8зо1Р2 с течением времени не подвергался протеолитическому расщеплению в отличие от препарата а1Р2, который был выделен в работе Уайте ег а/., 2007.

разрушение биомассы суперпродуцента для а-субъединицы

разрушение биомассы

суперпродуцента для ß-субъединицы

разрушение биомассы

суперпродуцента для у-субъединицы

осаждение дебриса

J ' дебрис

осаждение дебриса осаждение дебриса

| * дебрис | ■ дебрис

прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°) прогрев клеточного экстракта (65°)

1 1 1

осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков осаждение денатурированных белков

осадок ■ денатурированных белков

осадок - денатурированных белков

денатурированных белков

объединение супернатантов

хроматография на смоле 5-сефароза

хроматография на смоле гепарин-сефароза

хроматография на смоле супердекс-200

Рис. 2. А - Схема выделения и очистки полного гетеротримера SsoIF2 из клеток штаммов-продуцентов Е. coli. Б - Электрофоретический анализ (в 15%-ном ДДС-Ыа-ПААГ) чистоты препарата SsoIF2, полученного на конечной стадии хроматографической очистки.

2. Кристаллизация SsoIF2 и исследования его структуры

На тот момент, когда мы приступили к кристаллизации SsoIF2, были известны структуры только изолированных субъединиц фактора инициации трансляции 2 [Cho and Hoffman, 2002; Nonato et al, 2002; Schmitt et a!., 2002; Dhaliwal and Hoffman, 2003; Gutierrez et al., 2004; Ito et al., 2004; Roll-Mecak et al., 2004; Yatime et al., 2005]. Позднее появились структуры межсубъединичных димеров ay и ßy [Sokabe et al., 2006; Yatime et al., 2006], затем структура неполноразмерного гетеротримерного aIF2, в котором первый и второй домены а-субъединицы были удалены [Yatime et al., 2007]. В течение четырех лет мы вели интенсивный поиск условий кристаллизации полноразмерного фактора инициации трансляции 2, и нам, в конце концов, удалось получить пригодные к структурным исследованиям кристаллы, на базе которых структура интактного aIF2 была определена [Stolboushkina et al., 2008].

Поиск условий кристаллизации SsoIF2 мы проводили, используя препарат, полученный уже после первой стадии хроматографической очистки, и получили две формы микрокристаллов. Однако этот результат оказался невоспроизводимым. Анализ причин невоспроизводимости кристаллов показал, что белок в растворе с течением времени агрегирует, а примесь даже небольшого количества агрегатов ингибирует кристаллизацию. Можно было убрать агрегаты гель-фильтрацией и получить гомогенный препарат SsoIF2, который начинал кристаллизоваться, но после непродолжительного времени в растворе снова появлялись белковые агрегаты. Мы предположили, что агрегация SsoIF2 связана с окислением SH-rpynn белка и образованием межмолекулярных S-S-связей, и стали добавлять в буферные растворы ß-меркаптоэтанол или ДТТ на всех стадиях выделения SsoIF2, а по окончании очистки препарат белка либо сразу переводили в условия кристаллизации, либо замораживали в жидком азоте и хранили при - 70°С.

После отработки условий выделения и хранения кристаллизуемых препаратов SsoIF2 мы приступили к оптимизации условий его кристаллизации. Перспективными условиями для получения кристаллов пригодных для рентгеноструктурного анализа оказались те, в которых осаждающий реагент состоял из формиата натрия и смеси полиэтиленгликолей. Появление кристаллов сильно зависело от pH раствора. Белок кристаллизовался только при pH 8.5, т. е. вблизи своей изоэлектрической точки. Оптимальная концентрация белка в капле была 1012 мг/мл, а температура 22°С. Решающим фактором для появления крупных кристаллов SsoIF2 оказалось добавление в кристаллизационную смесь ММЭПЭГ 5000 до конечной концентрации 1%. Следует отметить, что от выделения к выделению препараты SsoIF2 отличались по способности образовывать высокоупорядоченные одиночные кристаллы. Наилучшие по качеству кристаллы были получены из объединенных фракций со склонов пика SsoIF2 при хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой. Такие кристаллы (рис. 3) были получены только один раз, они отражали рентгеновские лучи с разрешением до 2.8 Â и были использованы для сбора дифракционных данных.

Набор дифракционных данных, использовавшийся для определения кристаллической структуры, был собран на синхротроне в Гамбурге (линия Х12 станции DESY, Германия) при температуре 100°К. Непосредственно перед заморозкой в струе жидкого азота кристаллы SsoIF2 переносили в криораствор.

Криораствор содержал следующие компоненты: 15%-ный этиленгликоль, 80 мМ Tris-HCl, рН 8.5, 600 мМ формиат натрия, 7.5 %-ный ПЭГ 8000, 7.5 %-ный ПЭГ 1000, 1 %-ный ММЭПЭГ 5000. Кристаллы SsoIF2 принадлежат к пространственной группе Р2{ с параметрами элементарной ячейки а = 79.2 Â, b = 162.92 Â, с = 161.28 Â, а = у = 90°, р = 90.04°. Ассиметричная часть элементарной ячейки содержит четыре молекулы SsoIF2.

Работа по решению и анализу структуры SsolF2 проводилась совместно с группой C.B. Никонова (ИБ РАН, Пущино). Фазовая проблема решалась методом молекулярного замещения. Процесс решения включал два этапа. Вначале в качестве стартовой поисковой модели использовали определенную нами ранее структуру SsoIF2y, в результате чего удалось получить модель ау-димера, которая затем использовалась для поиска положения Р-субъединицы в структуре полного гетеротримера. Поиск положения р-субъединицы SsoIF2 значительно осложнялся из-за твиннинга кристаллов. С помощью программы PHENIX была получена электронная плотность для целой р-субъединицы, но только для двух из четырех молекул SsoIF2. Для остальных двух молекул SsoIF2 в ассиметричной части элементарной ячейки карту электронной плотности смогли построить только для N-концевой а-спирали р-субъединицы. Таким образом, окончательная модель SsoIF2 включает по четыре молекулы а- и у-субъединиц, две молекулы р-субъединицы и две 7^-концевых а-спирали SsoIF2p, что в целом соответствует 3023 аминокислотным остаткам. Координаты атомов данной модели занесены в банк белковых структур (PDB код 3cw2). Следует отметить, что у одной из четырех молекул у-субъединицы отсутствует электронная плотность для аминокислотных остатков с 36 по 45, которые соответствуют району петли switch 1. Кроме того, ни в одном из цинк-связывающих мотивов Р- и у-субъединиц не обнаружено атомов цинка. В результате С-концевые домены р-субъединиц в нашей структуре SsoIF2 слабо структурированы, a Cys 109 в одной из молекул Р-субъединицы образует дисульфидный мостик с Cysl27, тогда как Cysl09 второй молекулы р-субъединицы завязывает водородную связь с Glu25. В целом доменная организация a-, Р-, у-субъединиц SsoIF2 схожа с ранее описанными в литературе структурами субъединиц фактора инициации трансляции 2.

Общими очертаниями молекула SsoIF2 напоминает английскую букву L, длинное плечо которой образовано а-субъединицей, короткое - Р-субъединицей, a угол - у-субъединицей (рис. 4). Подвижные и функционально значимые участки у-субъединицы, петли-переключатели switchl и switch2, расположены у внутреннего угла L-образной молекулы SsoIF2, между а- и Р-субъединицами. Центральная у-субъединица взаимодействует с двумя другими субъединицами, тогда как а- и Р-субъединицы SsoIF2 между собой не контактируют. G-домен у-субъединицы

Рис. 3. Кристаллы белка $5о1Р2, полученные в присутствии 0.05 М Тте-НО, рН 8.5, 0.36 М формиата натрия, 4.5%-ного ПЭГ 8000, 4.5%-ного ПЭГ 1000, 1%-ного ММЭПЭГ 5000, появлялись через 2-3 дня и росли в течение недели до размеров 600x200x40 мкм.

связывает Л^-концевую а-спираль и С-концевой цинк-связывающий домен р-субъединицы, а второй домен у-субъединицы взаимодействует с третьим доменом а-субъединицы. Полученный нами результат находится в хорошем соответствии с данными по структуре ау-димера и неполного гетеротримера [Уайте е? а/., 2004; Реёи11а е1 а/., 2005, Уайте е1 а1., 2006; 2007]. Имеется, однако, различие со структурой Ру-димера Р. /ипояш, где у-субъединица взаимодействует не с С-концевым, а с центральным доменом р-субъединицы [ЗокаЬе е? а/.,2006].

Между а- и у-субъединицами SsoIF2 образуются две области контактов, расположенные друг от друга на расстоянии 12А. Одна из них содержит три водородные связи, в результате которых формируется антипараллельный р-лист, сложенный из тяжей рб, Р7, р8 а-субъединицы и р7-тяжа у-субъединицы. Второй участок связывания включает две водородные связи, образованные петлей р7-р8 и TV-концевой частью аб-спирали а-субъединицы и петлей р 13—аб у-субъединицы. В свою очередь Р-субъединица формирует тоже два межсубъединичных интерфейса с у-субъединицей SsoIF2 площадью 1135 А2 (между а 1-спиралью р-субъединицы и участком у-субъединицы, содержащим петли р5-а4, а4-Р6, а4-спираль и рб-тяж) и 376 А" (между участком С-концевого домена р-субъединицы, остатки 134 - 139 и N-концевой частью switch 1 и петли Р2-РЗ у-субъединицы). Области указанных контактов между р- и у-субъединицами стабилизированы водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Следует отметить, что в изолированном состоянии р-субъединица имеет неструктурированную TV-концевую часть, которая приобретает а-спиральную структуру, по-видимому, при связывании с у-субъединицей. Эта yV-концевая а-спираль содержит высококонсервативные аминокислотные остатки, которые важны для узнавания и связывания у-субъединицы. Четыре молекулы гетеротримера SsoIF2, расположенные в ассиметричной части кристалла, хотя и эквивалентны по структуре, но не идентичны. Наиболее нестабильную структуру имеет р-субъединица. Во всех четырех молекулах у-субъединицы конформации функционально-важных switch участков несколько отличаются друг от друга.

Рис. 4. Схематическое изображение пространственной структуры SsoIF2 (PDB код 3cw2). Римскими цифрами обозначены домены. Петли switch 1 и switch2 обозначены как swl и sw2, соответственно.

Чтобы проанализировать конформационную гибкость и взаимное расположение субъединиц в гетеротримере, было проведено наложение всех известных структур этих субъединиц на структуру гетеротримера. Субъединицы e/aIF2a накладывались по третьему домену, который жестко связан с у-субъединицей. Оказалось, что домены 1 и 2 aIF2a очень подвижны и могут свободно вращаться в плоскости, расположенной под углом около 120° относительно длинной оси домена 3. Следует отметить, что в первом домене a-субъединицы aIF2 расположен Ser48, который в пространстве занимает положение аналогичное положению Ser51 эукариотической а-субъединицы. Известно, что фосфорилирование Ser51 приводит к ингибированию синтеза белка в клетках эукариот. В археях роль второго фактора инициации трансляции в регуляции трансляции не определена, но показано, что Ser48 в aIF2a фосфорилируется эукариотической дцРНК-зависимой киназой PKR, активируемой при вирусной инфекции, а также её архейным гомологом, обозначенным как Ph0512p [Tahara et al, 2004]. Благодаря тому, что первый и второй домены a-субъединицы свободно вращаются на угол 180° относительно ее третьего домена, смещение участка фосфорилирования может достигать 90А. Пока неизвестно, имеет ли такая подвижность сайта фосфорилирования a-субъединицы функциональное значение.

Районы aIF2y, контактирующие с aIF2p в структуре гетеродимера aIF2(3y и двух структурах гетеротримера (неполноразмерного и интактного aIF2), накладывались друг на друга, чтобы найти соответствующие позиции aIF2p. Оказалось, что только УУ-концевая а-спираль aIF2(3 (остатки 7-16) сохраняет свои позиции в трех структурах. Конформации центральной части и цинк-связывающего домена aIF2p отличаются во всех рассмотренных структурах.

Таким образом, по нашим данным фактор инициации трансляции 2 можно рассматривать как молекулу, состоящую из конформационно-стабильной центральной части и двух подвижных «крыльев». Центральная часть включает в себя у-субъединицу, третий домен a-субъединицы и yV-концевую а-спираль Р-субъединицы, а «крылья» - первый и второй домены a-субъединицы, с одной стороны, и центральный и С-концевой домены р-субъединицы, с другой стороны. По-видимому, такая высокая внутримолекулярная подвижность фактора инициации трансляции 2 необходима для его функционирования. Другими словами, такая гибкость молекулы позволяет белку менять свое сродство к лигандам и обеспечивает переход белка из одного состояния в другое.

3. Кристаллизация и исследования структуры и свойств у-субъединицы SsoIF2

Кристаллизаиия и исследования структуры у-субъединииы SsoIF2

Помимо полноразмерного гетеротримера SsoIF2, нами были получены также кристаллы изолированной у-субъединицы этого фактора. Мы кристаллизовали у-субъединицу как в свободной (рис. 5А), так и в нуклеотид-связанной (рис. 5Б) формах. Кристаллы у-субъединицы SsoIF2 в комплексе с нуклеотидами были получены сокристаллизацией белка с десятикратным избытком коммерческого препарата нерасщепляемого аналога ГТФ - GDPNP. Мы ожидали увидеть в нуклеотид-связывающем кармане белка именно этот нуклеотид, однако, к своему удивлению обнаружили там ГДФ. Проверка качества использовавшегося нами

коммерческого препарата вОРИР показала, что он содержал до 30% примеси ГДФ. Кристаллы свободной и нуклеотид-связанной у-субъединицы 8бо1Р2 были получены в одних и тех же условиях, используя малонат натрия, рН 4.5, и хлорид кадмия в качестве добавки. Добавление в кристаллизационный раствор хлорида кадмия позволяло увеличить размеры и улучшить качество кристаллов.

(

Рис. 5. А - Кристаллы свободной от нуклеотида 88о№2у. Б - БзоИу, сокристаллизованная со смесью ООРЫР/ООР. Кристаллы у-субъединицы в обоих функциональных состояниях появлялись через 2 дня и росли до размеров 450x100х 100 мкм.

Сбор дифракционных данных с кристаллов производили на синхротроне в Гамбурге (линия Х12 станции DESY, Германия). Кристаллы свободной и сокристаллизованной со смесью GDPNP/GDP SsoIF2y принадлежат к разным пространственным группам РЪ\2\ (а = b = 94.84 А, с = 166.43 Ä, а = ß = 90°, у = 120°) и РЗ, (a = b = 95.06 Ä, с = 165.67 А, а = ß = 90°, у = 120°), соответственно. Ассиметричная часть элементарной ячейки кристалла SsoIF2y содержит одну I молекулу белка, тогда как в кристалле нуклеотид-связанной SsoIF2y - две молекулы белка в асимметричной части элементарной ячейки, связанные между собой осью | симметрии второго порядка. Структуры свободной и нуклеотид-связанной SsoIF2y были определены методом молекулярного замещения с разрешением 2.9 А и 2.65 А, соответственно. В качестве модели использовали структуру у-субъединицы в составе гетеродимера SsoIF2ayGDPNP-Mg2+ (PDB код 2aho), определенную ранее французской группой [Yatime et al., 2006]. Несмотря на то, что кристаллизация I SsoIF2y со смесью нуклеотидов GDPNP/GDP проводилась в присутствии хлорида магния, тем не менее, ион магния вблизи места связывания фосфатного остатка нуклеотида в определенной нами структуре не обнаружен. Атом цинка в цинк-связывающих участках белка также не был найден. Ассиметричная часть элементарной ячейки содержит две молекулы белка, на каждую из которых приходится по одной молекуле ГДФ и по три молекулы пирофосфата. В одной из молекул белка был обнаружен также и аналог ГТФ - GDPNP (рис. 6), поэтому мы можем обозначать данную структуру как SsoIF2y*GDPNP/GDP. Координаты атомов обоих моделей SsoIF2y и SsoIF2yGDPNP/GDP занесены в банк белковых структур (PDB код 2plf и 2pmd, соответственно).

e/aIF2y является рибосомозависимой ГТФазой и по своей структуре относится к семейству белков eEFlA (EF-Tu). Общая доменная организация SsoIF2y и SsoIF2y«GDPNP/GDP схожа с таковой в опубликованных ранее структурах у-субъединицы, а также с доменной организацией фактора элонгации EF-Tu в его ГТФ-связанной форме. Все домены G, II и III пространственно сближены, что соответствует «закрытой» ГТФ-связанной активной форме EF-Tu. Структуры SsolF2y и SsoIF2y'GDPNP/GDP хорошо совпадают между собой, за исключением I локальных конформационных изменений вокруг нуклеотид-связывающего кармана и switch участков.

пирофосфат j-дф

Рис. 6. Иллюстрация трехмерной структуры Ббо^у'ООРОТЛЖР . Римскими цифрами обозначены домены.

пирофосфаты

Несмотря на то, что к тому времени, как нами была определена структура у-субъединицы SsoIF2, уже было известно несколько структур этой субъединицы из различных организмов, анализ нашей структуры SsoIF2y привел к интересным и неожиданным результатам. Во-первых, исходя из литературных биохимических данных об одинаковом сродстве архейной у-субъединицы фактора инициации трансляции 2 к ГДФ и ГТФ [Pedulla et al., 2005], можно было ожидать, что в нуклеотид-связывающем кармане белка свяжется аналог ГТФ, концентрация которого в использовавшемся для сокристаллизации препарате была вдвое выше, чем концентрация ГДФ. Однако в нуклеотид-связывающем кармане в обеих молекулах SsoIF2y в ассиметричной части ячейки кристалла был обнаружен ГДФ. Это прямое свидетельство в пользу большего сродства у-субъединицы aIF2 к ГДФ, чем к ГТФ или, по крайней мере, к нерасщепляемому аналогу ГТФ - GDPNP.

Известно, что при переходе из ГТФ- в ГДФ-связанное состояние в структуре EF-Tu происходит существенный сдвиг доменов 2 и 3 относительно домена 1, и одновременно с этим происходят скоординированные конформационные изменения в петлях-переключателях switch 1 и switch2. При этом участки switch 1 и switch2 переходят из конформации «ON» в «OFF», а «тело» самого белка EF-Tu из активной «закрытой» конформации в «открытую» неактивную. Основываясь на сходстве структур у-субъединицы с фактором элонгации EF-Tu, можно было ожидать, что происходят значительные конформационные изменения при переходе e/aIF2y из ГТФ- в ГДФ-связанную форму. Оказалось, однако, что у-субъединица aIF2 во всех трех состояниях: свободном, ГТФ-связанном и ГДФ-связанном, принимает конформацию аналогичную «закрытой» ГТФ-связанной конформации EF-Tu, когда все три домена сближены друг с другом. Что касается зависимости конформации switch районов у-субъединицы aIF2 от природы связанного нуклеотида, то такой четкой картины как в EF-Tu здесь не наблюдается, хотя некоторые изменения в конформации этих районов и просматриваются.

Гипотетическая модель взаимодействия иниииаторной метионш-тРНК с фактором инициации трансляиии 2

В структуре SsoIF2yGDPNP/GDP, помимо ГДФ, были найдены также три молекулы пирофосфата. Один из этих пирофосфатов находится в щели между доменами II и III (рис. 6). Этот участок, при внимательном рассмотрении, оказался очень удобным стерически для расположения в нем акцепторного черешка тРНК. Докинг к этому участку Met-TPHKj, взятой из структуры 70S рибосомы Thermus thermophilus [Selmer et а!., 2006], привел к оригинальной модели (рис. 7Б) комплекса ау-димера aIF2 с инициаторной метионил-тРНК [Nikonov et al., 2007].

н н

Рис. 7. Гипотетические модели комплексов TPHK'aIF2ayFT<t>. А - EF-Tu подобная модель [Yatime et al., 2006]. Б - Модель, предложенная О.С. Никоновым, на основе наших структурных данных [Nikonov et al., 2007].

Met-TPHKf

Эта модель принципиально отличается от ранее опубликованной модели данного комплекса [Yatime et al., 2006], которая, в сущности, повторяла известную структуру комплекса Phe-tRNAPhe,EF-Tu»GDPNP (PDB код lttt). Основываясь на структурной гомологии у-субъединицы aIF2 с фактором элонгации EF-Tu, авторы вышеупомянутой модели провели наложение структуры тройственного комплекса Phe-tRNAphe,EF-Tu*GDPNP на структуру у-субъединицы в кристаллографической модели SsoIF2ayGDPNP (рис. 7А). Данная модель не отвечает на два важных вопроса. Во-первых, каким образом отсутствие прямого контакта между а-субъединицей и тРНК может объяснить тот факт, что только в присутствии а-субъединицы, а именно ее третьего домена, инициаторная Met-тРНК образует стабильный комплекс с у-субъединицей. Во-вторых, открытым остается вопрос, почему фактор инициации трансляции 2 специфически связывает только инициаторную Met-тРНК и не может взаимодействовать с элонгаторными тРНК. Авторы предположили, что a-субъединица опосредованно влияет на процесс связывания Met-тРНК; с у-субъединицей aIF2, помогая каким-то образом у-субъединице, связанной с ГТФ, приобретать такие конформации в районах switch 1 и switch2, при которых у-субъединица становится способна образовывать стабильный комплекс с Met-TPHKj. Однако при сравнении конформаций switch 1 и switch2 в структурах у-субъединицы в свободном и нуклеотид-связанном состояниях в изолированном виде и в составе димеров с а- и р-субъединицами из S. solfataricus никаких специфических конформационных изменений в этих участках обнаружено не было.

В оригинальной модели, предложенной в нашей работе, ориентация акцепторного черешка тРНК перпендикулярна по отношению к таковой в модели, предложенной французской группой. В такой ориентации тРНК должна образовывать обширную зону контакта с а-субъединицей, что объясняет стабилизацию тройственного комплекса. Более того, предложенная модель демонстрирует каким образом может осуществляться специфическое связывание тРНК: уникальный выступ на поверхности инициаторной тРНК, образованный двумя выпяченными нуклеотидами, стерически подходит к участку с вогнутой поверхностью на а-субъединице. Конечно, хотя предложенная модель и удовлетворяет известным экспериментальным фактам, она является гипотетической и может быть подтверждена или опровергнута только при экспериментальном определении структуры тройственного комплекса. Кристаллы такого комплекса, пригодные к структурным исследованиям, были нами недавно получены (см. пункт 4).

Дополнительный сайт связывания ГТФ на у-субъединиие aIF2

Сравнение карт электронной плотности для свободной от нуклеотида и сокристаллизованной со смесью GDP/GDPNP у-субъединицы привели к неожиданному обнаружению молекулы GDPNP на поверхности одной из двух молекул у-субъединицы, содержащихся в асимметричной части элементарной ячейки кристалла. Оказалось, что наряду с ГДФ, расположенном в каноническом нуклеотид-связывающем кармане белка, одна из молекул у-субъединицы содержит GDPNP в районе домена II (рис. 6). Это место, назовем его неканоническим нуклеотид-связывающим карманом, расположено между доменами 1(G) и II и образовано тяжами 07, 08, 011, р 14, петлей pi 1-012 и остатками 40-45 петли switchl. Молекула GDPNP завязывает водородные связи с Asp222 и Arg280 домена II и Glu40 петли switchl. Во второй молекуле у-субьединицы указанный неканонический ГТФ-связывающий сайт претерпел конформационные изменения, которые не позволили связаться нуклеотиду. Аминокислотный остаток Met45 закрывает этот сайт, формируя водородную связь с Lys225 и гидрофобное «пятно» вместе с Phe221, Val223, Val237.

Связывание GDPNP в дополнительном месте на у-субъединице можно было бы расценить как артефакт, обусловленный кристаллизацией и особенностями данного нерасщепляемого аналога, содержащего перед (у)-фосфатом NH группу, которая образует водородную связь с кислородом Asp222 в главной цепи белка. Поэтому для подтверждения существования на у-субъединице второго сайта связывания ГТФ были получены кристаллы и определена структура SsoIF2y в комплексе с другим нерасщепляемым аналогом ГТФ - GDPCP, который не содержит NH группу перед (у)-фосфатом, и следовательно, не способен образовать дополнительную водородную связь (структура определена с разрешением 2.5 А, PDB код 3ilf).

Как и в структуре, полученной сокристализацией SsoIF2y со смесью GDPNP/GDP, в структуре комплекса SsoIF2yGDPCP неканонический нуклеотид-связывающий сайт сформирован 0-л истом домена II (07, 08, (312, 013) и мобильным участком switchl G домена (остатки 41-44). Сравнение аминокислотных последовательностей белков семейства eEFIA показало, что участок структуры, формирующий неканонический сайт связывания нуклеотида на поверхности у-субъединицы, образован консервативными и высоко консервативными

аминокислотными остатками, часть из которых образует сеть водородных связей с нерасщепляемым аналогом ГТФ. Это также говорит в пользу существования второго сайга связывания ГТФ в у-субъединице aIF2.

Влияние гуаниновых нуклеотидов на связывание SsoIF2 с мРНК. Гипотетический сайт связывания 5'-конца мРНК на поверхности у-субъединииы

Имеет ли второй сайт связывания ГТФ на у-субъединице alF2 функциональное значение? Ранее нашими австрийскими коллегами была установлена дополнительная функция у-субъединицы SsoIF2 похожая на ту, которую выполняет кэп-связывающий фактор eIF4E у эукариот [Hasenohrl et al., 2008]. Они обнаружили, что свободная от нуклеотида SsoIF2y связывает мРНК и защищает их от 5'—>3' направленной нуклеолитической деградации. Причем в качестве субстрата может выступать любая мРНК, на 5'-конце которой находится трифосфат (моно- и дефосфорилированные по 5'-концу мРНК не связываются с у-субъединицей aIF2). В работе наших коллег были использованы мРНК, полученные исключительно транскрипцией in vitro с использованием Т7-РНК-полимеразы. Известно, что характерной чертой подавляющего большинства промоторов фаговых РНК-полимераз является использование ГТФ в качестве первого нуклеозид-трифосфата при синтезе РНК. Более того, 5'-концевыми нуклеозидами в природных мРНК чаще всего являются пуриновые нуклеозиды (G или А). Мы предположили, что сайтом для узнавания является не просто трифосфат, а гуанозин-5'-трифосфат на 5'-конце мРНК и обнаруженный неканонический участок связывания GDPNP в нашей структуре SsoIF2y есть то самое место, с которым взаимодействует 5'-конец мРНК. В таком случае, добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к у-субъединице должно было бы ингибировать ее связывание с мРНК.

Чтобы проверить это предположение, была проведена серия экспериментов по взаимодействию aIF2 и его субъединиц с 5'-концевыми фрагментами мРНК в присутствии различных нуклеотидов. В работе были использованы три фрагмента мРНК, полученных транскрипцией in vitro: SsoACATmPHK-30, MvaLlMPHK-36 и MjaLlMPHK-49. (Структуры двух последних фрагментов мРНК, закристаллизованных в комплексе с архейным рибосомным белком L1, были ранее определены в нашей лаборатории). В первой серии опытов мы исследовали влияние гуаниновых нуклеотидов на связывание изолированной у-субъединицы с мРНК, смешивая компоненты в эквимолярных соотношениях и в разной последовательности. В первом варианте, мРНК добавляли к у-субъединице, преинкубированной с одним из нуклеотидов ГДФ, ГТФ, GDPNP, GDPCP, а во втором - нуклеотид смешивали с у-субъединицей, преинкубированной с мРНК. Наличие в реакционной смеси РНК-белковых комплексов регистрировалось с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях (методом гель-шифта).

Из результатов экспериментов, приведенных на рис. 8А, видно, что в случае предварительной инкубации у-субъединицы с ГТФ или его аналогами комплексообразование между мРНК и белком подавляется, тогда как ГДФ подобного эффекта не оказывает и во всех случаях комплекс у-субъединицы с мРНК образовывается. В то же время, добавление ГТФ, GDPNP или GDPCP к ранее образованному мРНК-белковому комплексу не приводит к его разрушению. Для остальных выбранных нами фрагментов мРНК были получены идентичные результаты. Следует отметить, что в присутствии АТФ, УТФ или ЦТФ образование комплекса между мРНК и у-субъединицей не ингибировалось ни одним из использованных нуклеотидов (данные не представлены).

Рис. 8. А, Б - Электрофоретический анализ взаимодействия у-субъединицы SsoIF2 с MjaLlinPHK-49 в присутствии гуаниновых нуклеотидов (в 3%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях). 1А - мРНК; 2А - SsoIF2yMPHK; ЗА -[SsoIF2yrT<D]+MPHK; 4А - [SsoIF2yMPHK]+rT®; 5А - [SsoIF2y-rflO]+MPHK; 6А - [SsoIF2yMPHK]+rfl®; 7A - [SsoIF2yGDPCP]+MPHK; SA - [SsoIF2yMPHK] +GDPCP; 9A - [SsoIF2yGDPNP]+MPHK; 10A -[SsoIF2yMPHK]+GDPNP; 1Б - мРНК; 2Б -[SsoIF2rrA<P (1:10)] + мРНК; ЗБ - [SsoIF2y-MPHK] + десятикратный избыток ГДФ; 4Б - SsoIF2y + смесь [мРНК + ГТФ]; 5Б - ^эоШуГДФ (1:10)] + смесь [мРНК + ГТФ]; 6Б - [[SsoIF2yrfl® (1:10)] + ГТФ] + мРНК; 7Б-[[SsoIF2y-rfl® (1:10)] + мРНК] + ГТФ. За исключением десятикратного избытка ГДФ в дорожках 2Б, ЗБ, 5Б, 6Б, 7Б, во всех остальных случаях в реакционной смеси использовали эквимолярные количества нуклеотида, мРНК и белка.

Из полученных данных следует, что связывание ГТФ и мРНК с у-субъединицей есть взаимоисключающее событие: связывание того или другого субстрата зависит от порядка их прибавления к белку. Это в свою очередь указывает на то, что оба субстрата реагируют с идентичным местом на у-субъединице. Причем, ГТФ избирательно связывается с у-субъединицей и не может быть заменен ни другими нуклеозид-трифосфатами, ни гуанозин-5'-дифосфатом. Однако он может быть заменен негидролизуемыми аналогами ГТФ - GDPNP или GDPCP. Это значит, что мы имеем дело с неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом, с которым ГДФ не взаимодействует, а избирательно связывается гуанозин-5'-трифосфат на 5'-конце мРНК.

Для дополнительного подтверждения данного утверждения, вышеописанные опыты были повторены с SsoIF2y, преинкубированной с десятикратным избытком ГДФ (рис. 8Б). При такой постановке эксперимента канонический нуклеотид-связывающий сайт на у-субъединице должен быть занят ГДФ, что позволяет проверить конкуренцию между мРНК и ГТФ за связывание со вторым -неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом. Из рисунка 8Б видно, что ГДФ не подавляет образования комплекса между мРНК и белком даже при десятикратном избытке (дорожки 2, 3). В то же время, в присутствии в реакционной смеси десятикратного избытка ГДФ эквимолярное по отношению к белку количество ГТФ ингибирует образование мРНК-белкового комплекса (дорожка 6). Эти эксперименты показывают также, что мРНК и ГТФ взаимодействуют с SsoIF2y с одинаковым сродством и ни мРНК, ни ГТФ не в состоянии вытеснить друг друга из комплекса с у-субъединицей (дорожки 4, 5, 7). Рисунок 8Б (дорожка 4) показывает, что одновременное прибавление к белку ГТФ и мРНК приводит к связыванию обоих субстратов в равной пропорции, причем, присутствие десятикратного избытка ГДФ не влияет на результат (дорожка 5). Анализ структуры позволяет предположить, что связавшийся с неканоническим сайтом ГТФ запирается изменившим свою конформацию участком switch 1. Этот участок switch 1 может работать как «замок», который не позволяет ни одному из субстратов вытеснить конкурентную молекулу,

ГТФ ГДФ GDPCP GDPNP

И -

комплекс ' »4 Mf «f -' || Ц

мрнк «иг ' • mm «щ»

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1-1 компле

1 2 3

связанную в неканоническом сайте. Таким образом, эксперименты по конкурентному связыванию позволяют сделать вывод, что трифосфат на 5'-конце мРНК узнается неканоническим нуклеотид-связывающим сайтом, расположенным между доменами I и II а1Г2у.

Во второй серии опытов мы решили проверить действие ГТФ на мРНК-связывающие свойства гетеродимеров ау и и Ру и целого гетеротримерного фактора БбоИ и получили интересные результаты. Для этого в эквимолярных соотношениях гетеротример или гетеродимеры предварительно инкубировали с ГТФ, а потом смешивали с мРНК. Заведомо известно, что РНК-белковые комплексы несут отрицательный заряд на своей поверхности. Комплекс 8зо1Р2*мРНК является исключением из правил и заряжен положительно, по-видимому, в силу более основной природы 88оШ2а (р1 9.2) по сравнению с остальными субъединицами. Поэтому в работе с полным фактором 8зо1Р2 использовали горизонтально расположенные пластины геля, позволяющие визуализировать РНК-белковые комплексы, миграция которых происходит к катоду. Из рисунка 9 видно, что по сравнению с изолированной у-субъединицей, добавление ГТФ к 85оШ2 не приводит к полному ингибированию его связывания с мРНК. Димер Ру в присутствии ГТФ перестает ассоциировать с мРНК, тогда как ау-димер, подобно целому фактору 85о1Р2, частично сохраняет связывание с мРНК. В то же время, делеция двух подвижных доменов а-субъединицы в ау-димере исключает связывание его с мРНК при наличии ГТФ. Однако сама по себе а-субъединица не взаимодействует с мРНК, даже в условиях двадцатикратного избытка.

Рис. 9. Электрофоретический анализ взаимодействия ЭвоМ, его димеров и субъединиц с М]аЫмРНК-49 в ® присутствии ГТФ (в 3%-ном агарозном * геле в неденатурирующих условиях). Третий домен а-субъединицы обозначен как аоз. Двадцатикратный избыток а-субъединицы отмечен звездочкой. Справа схематично показано ,. направление движения РНК-белковых © комплексов к катоду (-) или аноду (+).

Из полученных данных можно сделать несколько заключений. Во-первых, а-субъединица, а именно ее подвижные первый и второй домены, вносят вклад в ассоциацию 8бо1Р2 с мРНК, которую, главным образом промотирует у-субъединица. Во-вторых, несмотря на то, что изолированная а-субъединица не обладает выраженными мРНК-связывающими свойствами, не исключено, что а-субъединица непосредственно контактирует с мРНК в составе фактора. Согласно литературным данным первый домен а-субъединицы обладает общими РНК-связывающими свойствами [Уайте е1 а1., 2004]. В-третьих, наличие а-субъединицы дает возможность БвоИ^ в присутствии в окружающей среде ГТФ связывать мРНК. Это наводит на мысль, что в клетке, где концентрация ГТФ на порядок превышает концентрацию ГДФ, должен существовать механизм, позволяющий второму фактору инициации трансляции взаимодействовать с мРНК. По-видимому, а-субъединица занимает далеко не последнее место в реализации такого механизма.

4. Получение и кристаллизация тройственного комплекса Met-TPHKf-SsoIF2aD3yGDPNP

Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры у-субъединицы и гетеротримерного фактора нами в течение четырех лет велась работа по получению и кристаллизации тройственного комплекса Met-TPHKj,SsoIF2,rTO. Для получения тройственного комплекса, в первую очередь, необходимо было наладить выделение биологически активных инициаторных тРНК в препаративных количествах.

Получение биологически активных иниииатоуных тРНК

Согласно опубликованным биохимическим данным архейный фактор инициации трансляции 2, практически, с одинаковым сродством взаимодействует как с архейной инициаторной Met-TPHKi; так и с бактериальной Met-TPHKf. [Yatime et al., 2004; 2006]. Поэтому для кристаллизации решено было получить обе РНК: архейную тРНК, S. solfataricus и бактериальную TPHKf Е. coli. Эта работа проводилась совместно с Н.В. Зелинской и Е.А. Шепелем. Для суперпродукции бактериальной TPHKf достаточно было встроить в вектор геномный фрагмент, содержащий ген предшественника тРНК, ограниченный собственными природными промотором и терминатором. В результате процессинга в клетках образуется зрелая тРНКс с уникальными 5'- и З'-концами и необходимыми модификациями. Сложнее обстоит дело с продукцией в клетках Е. coli чужеродной тРНК, т.к. природный промотор транскриптона архейной тРНК; не может использоваться РНК-полимеразой Е. coli. В таких ситуациях прибегают к методу получения синтетического гена тРНК [Meinnel et al., 1988]. В вектор встраивается кассета, содержащая синтетический липопротеиновый промотор 1рр, ген зрелой инициаторной тРНК S. solfataricus и терминатор ггпС оперона Е. coli. Суперпродукцию обеих инициаторных тРНК проводили в специальном штамме Е. coli - MRE600, не содержащим РНКазы I. Уровень синтеза рекомбинантных инициаторных тРНК оценивали по степени их аминоацилирования меченым метионином, для чего использовали препараты суммарной тРНК из штаммов-суперпродуцентов. Получение препаратов суммарной тРНК проводили по классической методике Zubay (1962) с небольшими изменениями. Аминоацилирование метионином проводили с помощью каталитического домена метионил-тРНК-синтетазы Е. coli, выделенного из клеток штамма-суперпродуцента Е. coli BL21(DE3)/pET28(+)-Me/Ä5'547e><ffi! [Alexander and Schimmel, 1999]. Из рисунка 10 видно, что в штаммах-суперпродуцентах для тРНК; S. solfataricus и TPHKf Е. coli содержание инициаторной тРНК в 5 раз и в 40 раз, соответственно, больше, чем в исходном штамме. Поскольку продукция бактериальной TPHKf оказалась значительно выше, чем продукция ее архейного гомолога, мы предпочли нарабатывать для кристаллизации инициаторную тРНК Е. coli. Для получения очищенной инициаторной тРНК препарат суммарной тРНК фракционировали на колонке с ионообменной смолой MonoQ в линейном градиенте концентрации хлорида натрия. Эта методика позволяет с 1 литра культуры штамма-продуцента получать до 3 мг гомогенной TPHKf Е. coli.

Рис. 10. Содержание рекомбинантных инициаторных тРНК в препаратах суммарной тРНК, полученных из штаммов-суперпродуцентов. Контроль - исходный штамм MRE600; MRE 600(Есо) - штамм-суперпродуцент для тРНКг Е. coli; MRE 600(Sso) - штамм-суперпродуцент ДЛЯ тРНК; S. solfataricus.

Реконструкция тройственного комплекса Met-mPHKfSsoIF2amyGDPNP и его кристаллизация

Сборку тройственного комплекса Met-TPHKfSsoIF2-rTO проводили из очищенных индивидуальных компонентов. Чтобы увеличить шансы на успех в получении кристаллов, решено было использовать для кристаллизации конформационно-стабильную сердцевинную часть фактора SsoIF2, состоящую из у-субъединицы и третьего домена а-субъединицы (SsoIF2aD3y). Следует отметить, что SsoIF2aD3y связывает инициаторную Met-тРНК с той же аффиностью, что и целый фактор [Yatime et al., 2004, 2006]. Делецию двух подвижных доменов SsoIF2a проводили с помощью генно-инженерных методов, заменив кодон Glul74 на инициирующий ATG кодон. Выделение третьего домена SsoIF2a проводили по той же методике, что и выделение целой a-субъединицы. Смешивая очищенные у- и аОз-субъединицы и применяя гель-фильтрацию, мы получали гомогенный препарат аБзу-гетеродимера.

Известно, что использование вместо ГТФ его негидролизуемых аналогов приводит к образованию более стабильного и долгоживущего тройственного комплекса, что крайне важно для кристаллизации. Мы использовали препарат GDPNP фирмы Sigma, который очищали от примеси ГДФ ионообменной хроматографией на MonoQ, а также препарат GDPCP фирмы Jena Bioscience, который не содержал примесей и не требовал дополнительной очистки. При кристаллизации комплекса и с тем и с другим аналогом были получены одинаковые результаты. Окончательно для кристаллизации был выбран комплекс с GDPNP.

Met-TPHKi в свободном состоянии спонтанно деаминоацилируется за короткое время. Поэтому все операции производили умерено быстро и на холоду. После реакции аминоацилирования Met-TPHKf депротеинизовали фенолом и осаждали этанолом. Осадок Met-TPHKf под спиртом можно хранить при - 70 С до месяца без потери активности. Обессоливание препарата Met-TPHKf проводили гель-фильтрацией на сефадексе G25. Полученный водный раствор Met-TPHKf смешивали с SsoIF2aD3y, который предварительно инкубировали с одним из негидролизуемых аналогов ГТФ в молярном соотношении белок:нуклеотид равном 1:4. В свою очередь, молярное соотношение РНК:белок в реакционной смеси составляло 1.5:1. Избыточное количество Met-TPHKf над белком брали из расчета, что не вся инициаторная тРНК находится в аминоацилированном состоянии. После 20-ти минутной инкубации препарат реконструированного тройственного комплекса наносили на колонку с супердексом-75, чтобы очистить тройственный комплекс от

избытка свободной тРНК^ и нуклеотида. Фракции, содержавшие по данным гель-электрофореза комплекс МеМГШАс'ЗзоП^авдуООРОТ, объединяли, и тройственный комплекс осаждали добавлением сульфата аммония.

Рис. 11. Кристаллы тройственного комплекса МеМШЧАгЗзоП^апзуООРМР. Первая форма (А); вторая форма кристаллов

да.

Подбор условий кристаллизации методом диффузии паров в висящей капле вели при 12°С в присутствии сульфата аммония, используя коммерческий набор растворов Natrix для кристаллизации РНК-белковых комплексов. Были получены две формы кристаллов Met-tRNAf*SsoIF2aD3Y'GDPNP. На рис. 11А представлены кристаллы, образующиеся из раствора тройственного комплекса с концентрацией 3-4 мг/мл в смешанном буфере Hepes-KOH с MES, рН 7.0, содержащем сульфат аммония в концентрации 28% насыщения, 7 мМ MgCl2, 0.5 мМ ДТТ, 0.2 мМ GDPNP. Размер кристаллов составлял 70x50x180 мкм. Вторая форма кристаллов (рис. 11 Б) тройственного комплекса размером 600х200х40 мкм была получена из ] раствора комплекса с концентрацией 23 - 25 мг/мл в буфере какодилат-Ыа, рН 6.0, содержащем 0.68 M сульфата аммония, 6 мМ ацетата магния, 7-10 мМ MgCl2, 1 мМ GDPNP и 1-1.2 мМ CdCl2. Как видно из рисунка 11 во вторых условиях были получены значительно более крупные кристаллы Met-tRNAf*SsoIF2aD3yGDPNP, но менее упорядоченные и на внешний вид слоистые. Предварительные кристаллографические исследования показали, что данные кристаллы отражают рентгеновские лучи с низким разрешением (до 7-8 Â) и имеют высокую мозаичность, тогда как кристаллы, полученные в первых условиях, давали дифракционную картину с разрешением до 3.2 Л. Кристаллы первой формы были использованы для сбора дифракционных данных на синхротроне в Берлине (линия BL2 станции BESSY II, Германия). В настоящее время совместно с группой C.B. Никонова (ИБ РАН, Пущино) ведется работа по определению структуры тройственного комплекса Met-tRNAf*SsoIF2<xD3yGDPNP.

выводы

В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты:

1. Получены штаммы-суперпродуценты Е. coli для всех субъединиц белка aIF2 S. solfataricus и инициаторных тРНК Е. coli и S. solfataricus. Разработаны процедуры выделения данных макромолекул, а также гетеротримера SsoIF2 в препаративных количествах.

2. Получены кристаллы изолированной у-субъединицы SsoIF2 в свободной форме и в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ, что позволило определить пространственные структуры этого белка в нескольких состояниях.

3. Показано, что нуклеотид-связывающий карман, расположенный на G-домене у-субъединицы, обладает более высоким сродством к ГДФ, чем к негидролизуемому аналогу ГТФ.

4. Впервые обнаружен дополнительный сайт связывания ГТФ на у-субъединице aIF2. Проверено предположение, что этот сайт может являться местом для взаимодействия 5'-концевого гуанозин-трифосфата мРНК с у-субъединицей: показано, что добавление ГТФ или его негидролизуемых аналогов к у-субъединице ингибирует ее связывание с мРНК, тогда как ГДФ подобного действия не оказывает.

5. Получены кристаллы интактного гетеротримерного SsoIF2, что позволило впервые определить и проанализировать полную структуру этого фактора. Показано, что фактор aIF2 состоит из конформационно-стабильной сердцевинной части (у-субъединица и 3 домен а-субъединицы) и двух подвижных «крыльев» (1 и 2 домены а-субъединицы, центральная и С-концевая части ß-субъединицы).

6. Разработана методика реконструкции in vitro тройственного комплекса Met-tRNAfSsoIF2ctD3yGDPNP. Выращены крупные кристаллы этого комплекса, с которых собраны дифракционные данные с разрешением до 3.2 Ä.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Столбоушкина Е.А., Никонов О.С., Гарбер М.Б. (2009) Выделение и кристаллизация гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 из Sulfolobus solfataricus. Биохимия 74(1), 70-77.

2. Stolboushkina Е., Nikonov S., Nikulin A., Blasi U., Manstein D.J., Fedorov R., Garber M., Nikonov O. (2008) The crystal structure of the trimeric archaeal translation initiation factor 2 reveals very high conformational flexibility of the a- and fl-subunits. J. Mol. Biol., 382,680-691.

3. Nikonov O.S., Stolboushkina E.A., Nikulin A.D., Hasenohrl D., Blasi U., Manstein D.J., Fedorov R.V., Nikonov S.V., Garber M.B. (2008) New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA. Abstract book of the HHMI Meeting of International Research Scholars, Lisbon, Portugal, 19-22 June, 28.

4. Столбоушкина E.A., Никонов О.С., Никулин А.Д., Никонов С.В., Блэзи У., Гарбер М.Б. (2008) Кристаллизация и РНК-связывающие свойства архейного фактора инициации трансляции 2 (aIF2). Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, 11-15 Май, 88.

5. Nikonov О., Stolboushkina Е., Nikulin A., HasenOhrl D., Blasi U., Manstein D.J., Fedorov R., Garber M., Nikonov S. (2007) New insights into the interactions of the translation initiation factor 2 from archaea with guanine nucleotides and initiator tRNA. J. Mol. Biol., 373, 328-336.

6. Stolboushkina E.A., Nikonov O.S., Nikulin A.D., Nikonov S.V., Garber M.B., Blasi U. (2007) Crystallization of the heterotrimeric archaeal translation initiation factor aIF2. 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences. Abstract book of the International Conference on «Protein Biosynthesis, Structure and function». Pushchino, Russia, 9-13 June, 23.

7. Stolboushkina E., Zelinskaya N., Shepel E., Nikulin A., Nikonov O., Nikonov S., Garber M., Hasenohrl D., Blasi U. (2006) Translation initiation factor aIF2 from the archaeon Sulfolobus solfataricus. Abstract book of the FEBS Advanced Course «Advanced methods in macromolecular crystallization II». Nove Hrady, Czech Republic, 6-13 October, 212.

8. Столбоушкина E.A., Гуськов А.И., Никулин А.Д., Никонов С.В., Гарбер М.Б. (2006) Пространственная структура у-субъединицы гетеротримерного фактора инициации трансляции aIF2 из археи Sulfolobus solfataricus. Сборник тезисов 10-ой международной пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». Пущино, Россия, 17-21 Апрель, 51.

Заказ № 54-а/09/09 Подписано в печать 09.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 ' С^У' \v\vw.с/г.ги; е-таИ:'т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Столбоушкина, Елена Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ТИПА -СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ

1. Краткая характеристика системы инициации трансляции у бактерий, архей и эукариот.

2. Фактор инициации трансляции 2 эукариотического типа.

2.1. Общая организация молекулы e/aIF2.

2.2. Взаимодействие e/aIF2 с ииициаторной метиоиил-тРНК и малой рибосомной субчастицей.

2.3. Роль факторов elFl, elFIA, eIF2B, eIF3 и eIF5 в работе eIF2.

2.4. Участие eIF2 в регуляции трансляции.

2.5. мРНК-связывающие свойства e/aIF2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы и реагенты.

2. Буферы и среды.

3. Бактериальные штаммы и плазмиды.

4. Приборы.

5. Методы генной инженерии и микробиологии.

5.1. Клонирование генов субъединиц SsoIF2.

5.2. Экспрессия клонированных генов sso a, ssoaD3, ssossoy в клетках Е. coli.

5.3. Конструирование плазмид для суперпродукции инициаторных mPHKE. coli и S. solfataricus в клетках Е. coli.

5.4. Выделение больших количеств плазмидной ДНК.

5.5. Проведение расщепления ДНКрестриктазами.

5.6. Получение компетентных клеток Е. coli с применением хлористого кальция.

5.7. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

6. Биохимические методы.

6.1. Препаративная очистка GDPNP.

6.2. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов.

6.3. Препаративное выделение и очистка изолированных субъединиц SsolF2 из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli.

6.4. Препаративное выделение и очистка гетеротримера SsoIF из клеток штаммов-суперпродуцентов Е. coli.

6.5. Выделение и очистка метиотш-тРНК-синтетазы Е. coli.

6.6. Получение и очистка фрагментов матричных РНКархей.

6.7. Получение мРНК-белковых комплексов.

6.8. Препаративное выделение и очистка инициаторных mPHKE. coli и S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов.

6.9. Аминоацилирование тРНК.

6.10. Получение и препаративная очистка

Met-tRNAfSsoIF2aD3yGDPNP(GDPCP) комплекса.

6.11. Спектрофотометрическое определение концентраций белков, нуклеиновых кислот и нуклеотидов.

6.12. Электрофорез ДНК в геле агарозы.

6.13. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях.

6.14. Электрофорез в геле агарозы РНК-белковых комплексов.

6.15. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДДС-Na.

6.16. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде.

6.17. Получение кристаллов полноразмерного SsoIF2 и кристаллов у-субъединицы в свободной и нуклеотид-связанной формах.

6.18. Кристаллизация Met-tRNAfSsoIF2aD3yGDPNP(GDPCP) комплекса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение гетеротримерного фактора SsoIF2 и его субъединиц.

2. Кристаллизация SsoIF2 и исследования его структуры.

3. Кристаллизация и исследования структуры и свойств у-субъединицы SsoIF2.

4. Получение и кристаллизация тройственного комплекса

Met-TPHKf SsoIF2aD3yGDPNP.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2"

Инициация биосинтеза белка на рибосоме - важнейший этап в реализации генетической информации и клеточной регуляции. Это сложное многоэтапное событие, которое обеспечивает точное узнавание начала кодирующей последовательности и задает фазу всего дальнейшего считывания мРНК по триплетам. В инициации трансляции участвует большое количество различных факторов - белков, молекул РНК, низкомолекулярных соединений. Большое число работ было опубликовано по механизму инициации трансляции у эукариот и бактерий, значительно меньше известно об инициации трансляции у архей. Известно, что система инициации трансляции у архей сочетает в себе как черты бактериальной системы, так и эукариотической. .Что касается белковых факторов инициации трансляции, известно, что архейные факторы гомологичны эукариотическим и не похожи на бактериальные.

Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка играет второй фактор инициации трансляции (IF2), который осуществляет доставку инициаторной тРНК в Р-участок малой рибосомной субчастицы. У эукариот и архей фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2) состоит из трех субъединиц (сфу). Тогда как у бактерий IF2 является мономерным белком и не имеет гомологии ни с одной субъединицей e/aIF2. У эукариот фосфорилирование а-субъединицы eIF2 является важнейшим механизмом регуляции синтеза белка в клетке. Имеются данные, что у архей также существует киназа, которая способна фосфорилировать aIF2 по остатку серина, расположенного в структуре архейной а-субъедииицы практически там же, где фосфорилируемый остаток серина расположен в эукариотическом гомологе. Недавно у архей была обнаружена неканоническая функция у-субъедипицы aIF2 — защита мРНК от 5'—>3' направленной деградации. Причем в качестве субстрата может выступать любая мРНК, на 5-конце которой находится трифосфат.

За последние 30 лет накоплен большой объем информации о функционировании второго фактора инициации трансляции эукариотического типа. Однако структурные исследования e/aIF2 начались значительно позднее, 7 лет назад. К настоящему времени опубликовано ряд работ по структурному анализу изолированных субъединиц, межсубъединичных димеров ау, Ру и неполноразмерного aIF2, в котором первый и второй домены а-субъединицы удалены. Определена также структура комплекса а-субъединицы eIF2 с каталитическим доменом протеин-киназы PKR. Основная масса структурных исследований сделана на факторе aIF2 из гипертермофильных архей. Отставание в рентгеноструктурных исследованиях эукариотического eIF2 обусловлено техническими трудностями выделения гомогенных препаратов этого фактора из клеток эукариот, большой сложностью клонирования эукариотических генов и получения суперпродуцентов, а также проблемами с получением совершенных кристаллов эукариотических белков. Структурное сходство архейного и эукариотического факторов e/aIF2 позволяет аппроксимировать кристаллографические данные для aIF2 на многочисленные функциональные данные для эукариотического eIF2, что вносит существенный вклад в наше понимание того, как устроен механизм инициации белкового синтеза не только у архей, но и у эукариот.

Целью данной работы явилось структурное исследование aIF2 из гипертермофильной археи Sulfolobus solfataricus (SsoIF2). В настоящей работе представлены методические разработки по выделению отдельных субъедипиц и полноразмерного гетеротримерного SsoIF2, а также инициаторной тРНК Escherichia coli в препаративных количествах. Нами впервые были получены кристаллы полноразмерного архейного фактора инициации трансляции 2, па основе которых была определена его пространственная структура. Сравнительный анализ полученной структуры и определенных ранее структур межсубъединичных димеров ау, Ру и неполноразмерного aIF2 позволил выявить высокую подвижность в а- и Р-субъединицах данного фактора, что, по-видимому, необходимо для функционирования этого фактора в клетке. Мы также закристаллизовали изолированную у-субъединицу SsoIF2 в нескольких функциональных состояниях (в свободном от нуклеотида и в комплексах с ГДФ, ГТФ и аналогами ГТФ). Полученные кристаллы позволили определить структуру SsoIF2y в нескольких состояниях, а анализ этих структур привел к выдвижению оригинальной модели взаимодействия aIF2 с инициаторной метионил-тРНК. Кроме того, анализ структур SsoIF2y в составе различных комплексов выявил дополнительный, ранее никем не обнаруживавшийся, сайт связывания ГТФ на поверхности у-субъединицы, который согласно проведенным нами экспериментам по конкурентному связыванию может являться местом для взаимодействия 5'-концевого гуанозин-5'-трифосфата мРНК. Мы также впервые получили кристаллы тройственного комплекса Met-TPIIKfaIF2*rTO, что открывает перспективы для структурных исследований этого важнейшего компонента инициации трансляции.

Обзор литературы посвящен структурным и функциональным особенностям второго фактора инициации трансляции эукариотического типа. В начале обзора дана краткая характеристика системы инициации трансляции у бактерий, архей и эукариот.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ТИПА - СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Столбоушкина, Елена Александровна

выводы

В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты:

6. Разработана методика реконструкции in vitro тройственного комплекса Met-tRNAf*SsoIF2aD3yGDPNP. Выращены крупные кристаллы этого комплекса, с которых собраны дифракционные данные с разрешением до 3.2 А.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Столбоушкина, Елена Александровна, Москва

1. Дмитриев С.Е., Теренин И.М., Рубцова М.П., Шатекий И.Н. (2003) Незначительные вариации вторичной структуры 5'-нетранслируемой области мРНК |3-глобипа изменяют требования к концентрации фактора инициации eIF2. Молекулярная биология, 37, 494-503.

2. Abrahams J.P., Kraal В., Clark B.F. and Bosch L. (1991) Isolation and stability of ternary complexes of elongation factor Tu, GTP and aminoacyl-tRNA. Nucleic Acids Res., 19, 553-557.

3. Alexander R.W. and Schimmel P. (1999) Evidence for breaking domain-domain functional communication in a synthetase-tRNA complex. Biochemistry, 38, 16359-16365.

4. Algire M.A., Maag D. and Lorsch J.R. (2005) Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation. Mol. Cell, 20, 251— 262.

5. Allende J.E., Monro R. and Lipmann F. (1964) Resolution of the E. coli amino acyl sRNA transfer factor into two complementary fractions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 51, 1211-1216.

6. Alone P.V. and Dever Т.Е. (2006) Direct binding of translation initiation factor eIF2gamma-G domain to its GTPase-activating and GDP-GTP exchange factors eIF5 and eIF2B epsilon. J. Biol. Chem., 281, 12636-12644.

7. Alone P.V., Cao C. and Dever Т.Е. (2008) Translation initiation factor 2 gamma mutant alters start codon selection independent of Met-tRNA binding. Mol. Cell. Biol., 28, 6877-6888.

8. Andreev D.E, Terenin I.M., Dunaevsky Y.E., Dmitriev S.E., and Shatsky I.N. (2006) A leaderless mRNA can bind to mammalian 80S ribosomes and direct polypeptide synthesis in the absence of translation initiation factors. Mol Cell Biol., 26, 3164-3169.

9. Anthony D.D.Jr., Kinzy T.G. and Merrick W.C. (1990) Affinity labeling of eukaryotic initiation factor 2 and elongation factor 1 alpha beta gamma with GTP analogs. Arch. Biochem. Biophys., 281, 157-162.

10. Antonsson B. and Leberman R. (1982) Stabilization of the ternary complex EF-Tu.GTP.valyl-tRNAval by ammonium salts. Biochimie, 64, 1035-1040.

11. Arlinghaus R., Favelukes G. and Schweet R. (1963) A ribosome-bound intermediate in polypeptide synthesis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 11, 92-96.

12. Asano K., Clayton J., Shalev A. and Hinnebusch A.G. (2000) A multifactor complex of eukaryotic initiation factors, elFl, eIF2, eIF3, eIF5, and initiator tRNA(Met) is an important translation initiation intermediate in vivo. Genes Dev., 14, 2534-2546.

13. Balakin A.G., Skripkin E.A., Shatsky I.N. and Bogdanov A.A. (1992) Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage X repressor. Nucleic Acids Research., 20, 563-571.

14. Barrieux A. and Rosenfeld M.G. (1977) Comparison of mRNA binding by Met-tRNAf binding protein and mRNA-associated proteins. J. Biol. Chem., 252, 392-398.

15. Bell S.D. and Jackson S.P. (1998) Transcription and translation in Archaea: a mosaic of eukaryal and bacterial features. Trends Microbiol., 6, 222—228.

16. Benelli D., Maone E. and Londei P. (2003) Two different mechanisms for ribosome/mRNA interaction in archaeal translation initiation. Mol. Microbiol., 50, 635-643.

17. Benne R. and Hershey J.W. (1978) The mechanism of action of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes. J. Biol. Chem., 253, 3078-3087.

18. Benne R., Wong C., Luedi M. and Hershey J.W. (1976) Purification and characterization of initiation factor IF-E2 from rabbit reticulocytes. J. Biol. Chem., 251, 7675-7681.

19. Berchtold H., Reshetnikova L., Reiser C.O.A., Schirmer N.K., Sprinzl M. and Hilgenfeld R. (1993) Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature, 365,126-132.

20. Birnboim H.C. and Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 1, 1513-1523.

21. Bommer U.A. and Kurzchalia T.Y. (1989) GTP interacts through its ribose and phosphate moieties with different subunits of the eukaryotic initiation factor eIF-2. FEBS Lett., 244, 323— 327.

22. Boyce M., Bryant K.F., Jousse C., Long K., Harding H.P., Scheuner D., Kaufman R.J., Ma D., Coen D.M., Ron D. and Yuan J. (2005) A selective inhibitor of eIF2alpha dephosphorylation protects cells from ER stress. Science, 307, 935-939.

23. Brown J.R. and Doolittle W.F. (1997) Archaea and the prokaryote-to-eukaryote transition. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 61, 456-502.

24. Castilho-Yalavicius В., Thompson G.M. and Donahue T.F. (1992) Mutation analysis of the Cys-X2-Cys-X19-Cys-X2-Cys motif in the beta subunit of eukaryotic translation initiation factor 2. Gene Expr., 1992, 297-309.

25. Chakrabarti A. and Maitra U. (1991) Function of eukaryotic initiation factor 5 in the formation of an 80 S ribosomal polypeptide chain initiation complex. J. Biol. Chem., 266, 14039-14045.

26. Cherbas L. and London I.M. (1976) On the mechanism of delayed inhibition of protein synthesis in heme-defecient rabbit reticulocyte lysates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 35063510.

27. Cho S. and Hoffman D.W. (2002) Structure of the beta subunit of translation initiation factor 2 from the archaeon Methanococcus jannaschii: a representative of the eIF2beta/eIF5 family of proteins. Biochemistry, 41, 5730-5742.

28. Choi S.K., Lee J.H., Zoll W.L., Merrick W.C. and Dever Т.Е. (1998) Promotion of met-tRNAiMet binding to ribosomes by yIF2, a bacterial IF2 homolog in yeast. Science, 280, 17571760.

29. Cigan A.M., Feng L. and Donahue T.F. (1988) tRNAi(met) functions in directing the scanning ribosome to the start site of translation. Science, 242, 93-97.

30. Clark S.J., Ashford A.J., Price N.T. and Proud C.G. (1989) Casein kinase-2 phosphorylates serine-2 in the beta-subunit of initiation factor-2. Biochim. Biophys. Acta., 1010, 377—380.

31. Clemens M.J., Bushell M. and Morley S.J. (1998) Degradation of eukaryotic polypeptide chain initiation factor (elF) 4G in response to induction of apoptosis in human lymphoma cell lines. Oncogene, 17, 2921-2931.

32. Colthurst D.R. and Proud C.G. (1986) Eukaryotic initiation factor 2 from rat liver: no apparent function for the beta-subunit in the formation of initiation complexes. Biochim. Biophys. Acta, 868, 77-86.

33. Condo I., Ciammaruconi A., Benelli D., Ruggero D. and Londei P. (1999) Cis-acting signals controlling translational initiation in the thermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. Mol. Microbiol., 34, 377-384.

34. Dar A.C., Dever Т.Е. and Sicheri F. (2005) Higher-order substrate recognition of eIF2alpha by the RNA-dependent protein kinase PKR. Cell, 122, 887-900.

35. Das A., Bagchi M.K., Ghosh-Dastidar P. and Gupta N.K. (1982) Protein synthesis in rabbit reticulocytes. A study of peptide chain initiation using native and beta-subunit-depleted eukaryotic initiation factor 2. J! Biol. Chem., 257, 1282-1288.

36. Das S., Maiti Т., Das K. and Maitra U. (1997) Specific interaction of eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) with the beta-subunit of eIF2. J. Biol. Chem., 272, 31712—31718.

37. Davies D. and Segal D. (1971) Protein crystallization: microtechniques involving vapor diffusion. Methods Enzymol., 22, 266-269.

38. De Benedetti A. and Baglioni C. (1983) Phosphorylation of initiation factor eIF-2 alpha, binding of mRNA to 48S complexes, and its reutilization in initiation of protein synthesis. J. Biol. Chem., 258, 14556-14562.

39. Deckwerth T.L. and Johnson E.M.Jr. (1993) Temporal analysis of events associated with programmed cell death (apoptosis) of sympathetic neurons deprived of nerve growth factor. J. Cell. Biol., 123, 1207-1222.

40. Del Angel R.M., Papavassiliou A.G., Fernandez-Tomas C., Silverstein S.J. and Racaniello V.R. (1989) Cell proteins bind to multiple sites within the 5' untranslated region of poliovirus RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 8299-8303.

41. Dever Т.Е., Feng L., Wek R.C., Cigan A.M., Donahue T.F. and Hinnebusch A.G. (1992) Phosphorylation of initiation factor 2 alpha by protein kinase GCN2 mediates gene-specific translational control of GCN4 in yeast. Cell, 68, 585-596.

42. Dever Т.Е., Glynias M.J. and Merrick W.C. (1987) GTP-binding domain: three consensus sequence elements with distinct spacing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1814—1818.

43. Di Segni G., Rosen H. and Kaempfer R. (1979) Competition between alpha- and beta-globin messenger ribonucleic acids for eukaryotic initiation factor 2. Biochemistry, 18, 2847-2854.

44. Donahue T.F., Cigan A.M., Pabich E.K. and Valavicius B.C. (1988) Mutations at a Zn(II) finger motif in the yeast eIF-2p gene alter ribosomal start-site selection during the scanning process. Cell, 54, 621-632.

45. Dorris D.R., Erickson F.L. and Hannig E.M. (1995) Mutations in GCD11, the structural gene for eIF-2 gamma in yeast, alter translational regulation of GCN4 and the selection of the start site for protein synthesis. EMBOJ., 14, 2239-2249.

46. Drabkin H.J. and RajBhandary U.L. (1998) Initiation of protein synthesis in mammalian cells with codons other than AUG and amino acids other than methionine. Mol. Cell. Biol., 18, 51401547.

47. Drabkin H.J., Helk B. and RajBhandary U.L. (1993) The role of nucleotides conserved in eukaryotic initiator methionine tRNAs in initiation of protein synthesis. J. Biol. Chem., 268, 25221-25228.

48. Elson N.A., Adams S.L., Merrick W.C., Safer B. and Anderson W.F. (1975) Comparison of fMet-tRNAf and Met-tRNAf from Escherichia coli and rabbit liver in initiation of hemoglobin synthesis. J. Biol. Chem., 250, 3074-3079.

49. Engelberg-Kulka H., Sat В., Reches M., Amitai S. and Hazan R. (2004) Bacterial programmed cell death systems as targets for antibiotics. Trends Microbiol., 12, 66-71.

50. Erickson F.L. and Hannig E.M. (1996) Ligand interactions with eukaryotic translation initiation factor 2: role of the gamma-subunit. EMBOJ., 15, 6311-6320.

51. Erickson F.L., Harding L.D., Dorris D.R. and Hannig E.M. (1997) Functional analysis of homologs of translation initiation factor 2gamma in yeast. Mol. Gen. Genet., 253, 711-719.

52. Fabian J.R., Kimball S.R., Heinzinger N.K. and Jefferson L.S. (1997) Subunit assembly and guanine nucleotide exchange activity of eukaryotic initiation factor-2B expressed in Sf9 cells. J. Biol. Chem., 272, 12359-12365.

53. Farrell P.J., Balkow K., Hunt Т., Jackson R.J. and Trachsel H. (1977) Phosphorylation of initiation factor elF-2 and the control of reticulocyte protein synthesis. Cell, 11, 187-200.

54. Fessenden J.M. and Moldave K. (1963) Studies on aminoacyl transfer from soluble ribonucleic acid to ribosomes. Resolution of two soluble transferring activities. J. Biol. Chem., 238,1479-1484.

55. Flynn A., Oldfield S. and Proud C.G. (1993) The role of the beta-subunit of initiation factor eIF-2 in initiation complex formation. Biochim. Biophys. Acta, 1174, 117-121.

56. Flynn A., Shatsky I.N., Proud C.G. and Kaminski A. (1994) The RNA-binding properties of protein synthesis initiation factor eIF-2. Biochim. Biophys. Acta, 1219, 293-301.

57. Gaspar N.J., Kinzy T.G., Scherer B.J., Humbelin M., Hershey J.W. and Merrick W.C. (1994) Translation initiation factor eIF-2. Cloning and expression of the human cDNA encoding the gamma-subunit. J. Biol. Chem., 269, 3415-3422.

58. Gomez E., Mohammad S.S. and Pavitt G.D. (2002) Characterization of the minimal catalytic domain within eIF2B: the guanine-nucleotide exchange factor for translation initiation. EMBO J., 21,5292-5301.

59. Gonsky R., Lebendiker M.A., Harary R., Banai Y. and Kaempfer R. (1990) Binding of ATP to eukaryotic initiation factor 2. Differential modulation of mRNA-binding activity and GTP-dependent binding of methionyl-tRNAMetf. J. Biol. Chem., 265, 9083-9089.

60. Gonsky, R., Itamar, D., Harary, R. and Kaempfer, R. (1992) Binding of ATP and messenger RNA by the beta-subunit of eukaryotic initiation factor 2. Biochimie, 74, 427—434.

61. Gonzatti M.I. and Traugh J.A. (1988) 2,3-Bisphosphoglycerate inhibits hemoglobin synthesis and phosphorylation of initiation factor 2 by casein kinase II in reticulocyte lysates. Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 134-139.

62. Gordon J. (1968) A stepwise reaction yielding a complex between a supernatant fraction from E. coli, guanosine 5'-triphosphate, and aminoacyl-sRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59, 179-183.

63. Greenshpan H. and Revel M. (1969) Initiator protein dependent binding of messenger RNA to ribosomes. Nature, 224, 331—335.

64. Grill S., Gualerzi C.O., Londei P. and Blasi U. (2000) Selective stimulation of translation of leaderless mRNA by initiation factor 2: evolutionary implications for translation. EMBO J., 19, 4101-4110.

65. Gross M, Wing M., Rundquist C. and Rubino M.S. (1987) Evidence that phosphorylation of eIF-2(alpha) prevents the eIF-2B-mediated dissociation of eIF-2 X GDP from the 60S subunit of complete initiation complexes. J. Biol. Chem., 262, 6899-6907.

66. Gupta N.K., Chatterjee N.K., Bose K.K., Bhaduri S. and Chung A. (1970) Roles of methionine transfer RNA's in protein synthesis in rabbit reticulocytes. J. Mol. Biol., 54, 145-154.

67. Harary R. and Kaempfer R. (1990) Distinct epitopes in eukaryotic initiation factor 2 for binding of mRNA and for ternary complex formation with methionyl-tRNA(f) and GTP. Biochim. Biophys. Acta, 1050, 129-133.

68. Harbitz I. and Hauge J.G. (1976) Purification and properties of a methionine formylmethionyl-tRNA-binding initiation factor from pig liver. Arch. Biochem. Biophys., 176, 766-778.

69. Harding H.P., Zhang Y. and Ron D. (1999) Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature, 397, 271—274.

70. Hartz D., McPheeters D.S. and Gold L. (1989) Selection of the initiator tRNA by Escherichia coli initiation factors. Genes Dev., 3, 1899—1912.

71. Hasenohrl D., Lombo Т., Kaberdin V., Londei P. and Blasi U. (2008) Translation initiation factor a/eIF2(gamma) counteracts 5' to 3' mRNA decay in the archaeon Sulfolobus solfataricus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 2146-2150.

72. Flashimoto N.N., Carnevalli L.S. and Castilho B.A. (2002) Translation initiation at non-AUG codons mediated by weakened association of eukaryotic initiation factor (elF) 2 subunits. Biochem. J., 367, 359-368.

73. Hepler J.R. and Gilman A.G. (1992) G proteins. Trends Biochem. Sci., 17, 383-387.

74. Hinnebusch A.G. (1996) Translation control of GCN4: gene-specific regulation by phosphorylation of eIF2. In Translation Control of Gene Expression, Gold Spring Harbor, NY, 199-244.

75. Horikami S.M., De Ferra F. and Moyer S.A. (1984) Characterization of the infections of permissive and nonpermissive cells by host range mutants of vesicular stomatitis virus defective in RNA methylation. Virology, 138, 1-15.

76. Housman D., Jacobs-Lorena M., Rajbhandary U.L. and Lodish H.F. (1970) Initiation of haemoglobin synthesis by methionyl-tRNA. Nature, 227, 913-918.

77. Huang H.K., Yoon PI., Hannig E.M. and Donahue T.F. (1997) GTP hydrolysis controls stringent selection of the AUG start codon during translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev., 11, 2396-2413.

78. Imataka H., Gradi A. and Sonenberg N. (1998) A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-depcndent translation. EMBO J., 17, 7480-7489.

79. Itamar D., Gonsky R., Lebendiker M. and Kaempfer R. (1984) The nature of the interaction of eukaryotic initiation factor 2 with double-stranded RNA. Eur. J. Biochem., 145, 373-379.

80. Ito, Т., Marintchev, A. and Wagner, G. (2004) Solution structure of human initiation factor eIF2alpha reveals homology to the elongation factor eEFlB. Structure, 12, 1693-1704.

81. Janssen J.R. (1993) Eubacterial, archaebacterial and eukaryotic genes that encode leaderless mRNAs. In Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Washington DC: American Society for microbiology, 59-67.

82. Jay G. and Kaempfer R. (1974) Sequence of events in initiation of translation: a role for initiator transfer RNA in the recognition of messenger RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3199-3203.

83. Jay G. and Kaempfer R. (1975) Initiation of protein synthesis. Binding of messenger RNA. J. Biol. Chem., 250, 5742-5748.

84. Kaempfer R. and Konijn A.M. (1983) Translational competition by mRNA species encoding albumin, ferritin, haemopexin and globin. Eur. J. Biochem., 131, 545-550.

85. Kaempfer R., Hollender R., Abrams W., and Israeli R. (1978a) Specific binding of messenger RNA and methionyl-tRNA by the same initiation factor for eukaryotic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 209-213.

86. Kaempfer R., Rosen H. and Israeli R. (1978b). Translation control: recognition of the methylated 5' end and an internal sequence in eukaryotic mRNA by the initiation factor thai binds methionyl-tRNAfMet. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 650-654.

87. Kaempfer R., Van Emmelo J. and Fiers W. (1981) Specific binding of eukaryotic initiation factor 2 to satellite tobacco necrosis virus RNA at a 5'-terminal sequence comprising the ribosome binding site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1542-1546.

88. Kapp L.D. and Lorsch J.R. (2004) GTP-dependent recognition of the methionine moiety on initiator tRNA by translation factor cIF2. J. Mol. Biol., 335, 923-936.

89. Kimball S.R., Everson W.V., Myers L.M. and Jefferson L.S. (1987) Purification and characterization of eukaryotic initiation factor 2 and a guanine nucleotide exchange factor from rat liver. J. Biol. Chem., 262, 2220-2227.

90. Kimball S.R., Heinzinger N.K., Horetsky R.L. and Jefferson L.S. (1998) Identification of interprotein interactions between the subunits of eukaryotic initiation factors eIF2 and cIF2B. J. Biol. Chem., 273, 3039-3044.

91. Kjeldgaard M, Nissen P, Thirup S. and Nyborg J. (1993) The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure, 1, 35-50.

92. Kjeldgaard M. and Nyborg J. (1992) Refined structure of elongation factor EF-Tu from Escherichia coli. J. Mol. Biol., 223, 721—742.

93. Kolakofsky D., Ohta T. and Thach R.E. (1968) Junction of the 50S ribosomal subunit with the 30S initiation complex. Nature, 220, 244-247.

94. Kozak M. (1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell, 15, 1109-1123.

95. Kozak M. (1980) Role of ATP in binding and migration of 40S ribosomal subunits. Cell, 22, 459^167.

96. Kozak M. (1999) Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 234, 187— 208.

97. Kyrpides N.C. and Woese C.R. (1998) Archaeal translation initiation revisited: The initiation factor 2 and eukaryotic initiation factor 2B a-b-d subunit families. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3726-3730.

98. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

99. Laurino J.P., Thompson G.M., Pacheco E. and Castilho B.A. (1999) The beta subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 binds mRNA through the lysine repeats and a region comprising the C2-C2 motif. Mol. Cell. Biol., 19, 173-181.

100. Lee J.H., Choi S.K., Roll-Mecak A., Burley S.K. and Dever Т.Е. (1999) Universal conservation in translation initiation revealed by human and archaeal homologs of bacterial translation initiation factor IF2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 4342-4347.

101. Lloyd M.A., Osborne J.C. Jr., Safer В., Powell G.M. and Merrick W.C. (1980) Characteristics of eukaryotic initiation factor 2 and its subunits. J. Biol Chem., 255, 1189-1193.

102. Lo H.J., Huang H.K. and Donahue T.F. (1998) RNA polymerase I-promoted HIS4 expression yields uncapped, polyadenylated mRNA that is unstable and inefficiently translated in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol., 18, 665-675.

103. Lomakin I.B., Kolupaeva V.G., Marintchev A., Wagner G. and Pestova T.V. (2003) Position of eukaryotic initiation factor elFl on the 40S ribosomal subunit determined by directed hydroxyl radical probing. Genes Dev., 17, 2786-2797.

104. Londei P. (2005) Evolution of translational initiation: new insights from the archaea. FEMS Microbiol Rev., 29, 185-200.

105. Lucas-Lenard J. and Lipmann F. (1966) Separation of three microbial amino acid polymerization factors. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 55, 1562-1566.

106. Lutsch G., Bielka H., Enzmann G. and Noll F. (1983) Electron microscopic investigations on the location of rat liver ribosomal proteins S3a, S5, S6, S7 and S9 by means of antibody labeling. Biomed. Biochim. Acta, 42, 705-723.

107. Lutsch G., Noll F. Theise H., Enzmann G. and Bielka H. (1979) Localization of proteins SI, S2, S16 and S23 on the surface of small subunits of rat liver ribosomes by immune electron microscopy. Mol Gen. Genet., 176, 281-291.

108. Lutsch G., Stahl J., Kargel H.J., Noll F. and Bielka H. (1990) Immunoelectron microscopic studies on the location of ribosomal proteins on the surface of the 40S ribosomal subunit from rat liver. Eur. J. Cell Biol, 51, 140-150.

109. Maag D., Fekete C.A., Gryczynski Z. and Lorsch J.R. (2005) A conformational change in the eukaryotic translation preinitiation complex and release of elFl signal recognition of the start codon. Mol Cell, 17, 265-275.

110. Mandel M. and Higa A. (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol Biol, 53, 159-162.

111. Marck C. and Grosjean H. (2002) tRNomics: analysis of tRNA genes from 50 genomes of Eukarya, Archaea, and Bacteria reveals anticodon-sparing strategies and domain-specific features. RNA, 8, 1189-1232.

112. Marintchev A. and Wagner G. (2004) Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Quarterly Reviews of Biophysics, 37, 197—284.

113. Marissen W.E., Guo Y., Thomas A.A., Matts R.L. and Lloyd R.E. (2000) Identification of caspase 3-mediated cleavage and functional alteration of eukaryotic initiation factor 2 alpha in apoptosis. J. Biol Chem., 275, 9314-9323.

114. Martin M.E., Alcazar A. and Salinas M. (1990) Subcellular and regional distribution of casein kinase II and initiation factor 2 activities during rat brain development. Int. J. Dev. Neurosci., 8, 47-54.

115. Meinnel Т., Mechulam Y. and Fayat G. (1988) Fast purification of a functional elongator tRNAmet expressed from a synthetic gene in vivo. Nucleic Acids Res., 16, 8095-8096.

116. Mitsui K., Datta A. and Ochoa S. (1981) Removal of beta subunit of the eukaryotic polypeptide chain initiation factor 2 by limited proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4128^4132.

117. Moll I., Grill S., Gualerzi C.O. and Blasi U. (2002) Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control. Mol. Microbiol., 43, 239-246.

118. Moll I., Hirokawa G., Kiel M.C., Kaji A. and Blasi U. (2004) Translation initiation with 70S ribosomes: an alternative pathway for leaderless mRNAs. Nucleic Acids Res., 32, 3354— 3363.

119. Morley S.J., McKendrick L. and Bushell M. (1998) Cleavage of translation initiation factor 4G (eIF4G) during anti-Fas IgM-induced apoptosis does not require signalling through the p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase. FEBSLett., 438, 41-^18.

120. Murzin A.G. (1993) OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBOJ., 12, 861—867.

121. Nika J., Rippel S. and Hannig E.M. (2001) Biochemical analysis of the eIF2 beta gamma complex reveals a structural function for eIF2 alpha in catalyzed nucleotide exchange. J. Biol. Chem., 276, 1051-1056.

122. Nika J., Yang W., Pavitt G.D., Hinnebusch A.G. and Hannig E.M. (2000) Purification and kinetic analysis of eIF2B from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 275, 26011-26017.

123. Nishizuka Y. and Lipmann F. (1966) Comparison of guanosine triphosphate split and polypeptide synthesis with a purified E. coli system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 212-219.

124. Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F. and Nyborg J. (1995) Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science, 270, 1464-1472.

125. Nonato M.C., Widom J. and Clardy J. (2002) Crystal structure of the yV-terminal segment of human eukaryotic translation initiation factor 2 alpha. J. Biol. Chem., 277, 17057-17061.

126. Nyborg J., Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G. and Clark B.F. (1996) Structure of the ternary complex of EF-Tu: macromolecular mimicry in translation. Trends Biochem. Sci., 21, 81-82.

127. Nygard O., Westermann P. and Hultin T. (1980) Met-tRNA-Met-f is located in close proximity to the beta subunit of eIF-2 in the eukaryotic initiation complex, eIF-2*Met-tmAMetf GDPCP. FEBS Lett., 113, 125-128.

128. O'Donnell S.M. and Janssen G.R. (2002) Leaderless mRNAs bind 70S ribosomes more strongly than 30S ribosomal subunits in Escherichia coli. J. Bacteriology, 184, 6730-6733.

129. Olsen D.S., Savner E.M., Mathew A., Zhang F., Krishnamoorthy Т., Phan L. and Hinnebusch A.G. (2003) Domains of elFIA that mediate binding to eIF2, eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBOJ., 22, 193-204.

130. Panniers R. and Henshaw E.C. (1983) A GDP/GTP exchange factor essential for eukaryotic initiation factor 2 cycling in Ehrlich ascites tumor cells and its regulation by eukaryotic initiation factor 2 phosphorylation. J. Biol. Chem., 258, 7928-7934.

131. Panniers R., Rowlands A.G. and Henshaw E.C. (1988) The effect of Mg2+ and guanine nucleotide exchange factor on the binding of guanine nucleotides to eukaryotic initiation factor 2. J. Biol. Chem., 263, 5519-5525.

132. Passmorc L.A., Schmeing T.M., Maag D., Applefield D.J., Acker M.G., Algire M.A., Lorsch J.R. and Ramakrishnan V. (2007) The eukaryotic translation initiation factors elFl and elFIA induce an open conformation of the 40S ribosome. Mol. Cell, 26, 41-50.

133. Pathak V.K., Nielsen P.J., Trachsel H. and Hershey J.W. (1988) Structure of the beta subunit of translational initiation factor eIF-2. Cell, 54, 633-639.

134. Pavitt G.D., Ramaiah K.V., Kimball S.R. and Hinnebusch A.G. (1998) eIF2 independently binds two distinct eIF2B subcomplexes that catalyze and regulate guanine-nucleotide exchange. Genes Dev., 12, 514-526.

135. Pedulla, N., Palermo, R., Hasenohrl, D., Blasi, U., Cammarano, P. and Londei, P. (2005) The archaeal eIF2 homologue: functional properties of an ancient translation initiation factor. Nucleic Acids Res., 33, 1804-1812.

136. Perez-Bercoff R. and Kaempfer R. (1982) Genomic RNA of mengovirus V. Recognition of common features by ribosomes and eucaryotic initiation factor 2. J. Virol., 41, 30-41.

137. Pestova T.V. and Kolupaeva V.G. (2002) The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev., 16, 29062922.

138. Pestova T.V., Borukhov S.I. and Hellen C.U. (1998) Eukaryotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons. Nature, 394, 854-859.

139. Pestova T.V., Lomakin I.B., Lee J.H., Choi S.K., Dever Т.Е. and Hellen C.U. (2000) The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature, 403, 332-335.

140. RajBhandary U.L. and Chow C.M. (1995) Initiator tRNAs and initiation of protein synthesis. In tRNA: structure, biosynthesis, and function, American Society for Microbiology, Washington, 511-528.

141. Ramaiah K.V., Dhindsa R.S., Chen J.J., London I.M. and Levin D. (1992) Recycling and phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 on 60S subunits of 80S initiation complexes and polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 89, 12063-12067.

142. Roll-Mecak, A., Alone, P., Cao, C., Dever, Т.Е. and Burley, S.K. (2004) X-ray structure of translation initiation factor eIF2y: implications for tRNA and eIF2a binding. J. Biol. Chem., 279, 10634-10642.

143. Rosen H. and Kaempfer R. (1979) Mutually exclusive binding of messenger RNA and initiator methionyl transfer RNA to eukaryotic initiation factor 2. Biochem. Biophys. Res. Commun., 91, 449^155.

144. Rosen H., Di Segni G. and Kaempfer R. (1982) Translational control by messenger RNA competition for eukaryotic initiation factor 2. J. Biol. Chem., 257, 946-952.

145. Rosen H., Knoller S. and Kaempfer R. (1981) Messenger ribonucleic acid specificity in the inhibition of eukaryotic translation by double-stranded ribonucleic acid. Biochemistry, 20, 3011— 3020.

146. Rowlands A.G., Panniers R. and Henshaw E.C. (1988) The catalytic mechanism of guanine nucleotide exchange factor action and competitive inhibition by phosphorylated eukaryotic initiation factor 2./. Biol. Chem., 263, 5526-5533.

147. Rowlands A.G., Panniers R. and Henshaw E.C. (1988) The catalytic mechanism of guanine nucleotide exchange factor action and competitive inhibition by phosphorylated eukaryotic initiation factor 2. J. Biol. Chem., 263, 5526-5533.

148. Safer B. (1983) 2B or not 2B: regulation of the catalytic utilization of eIF-2. Cell, 33, 7-8.

149. Safer В., Adams S.L., Anderson W.F. and Merrick W.C. (1975) Binding of Met-tRNAf and GTP to homogeneous initiation factor MP. J. Biol. Chem., 250, 9076-9082.

150. Salimans M., Goumans H., Amesz H., Benne R. and Voorma H.O. (1984) Regulation of protein synthesis in eukaryotes. Mode of action of eRF, an eIF-2-recycling factor from rabbit reticulocytes involved in GDP/GTP exchange. Eur. J. Biochem., 145, 91-98.

151. Sat В., Hazan R., Fisher Т., Khaner H., Glaser G. and Engelberg-Kulka H. (2001) Programmed cell death in Escherichia coli: some antibiotics can trigger mazEF lethality. J. Bacteriol., 183,2041-2045.

152. Satoh S., Hijikata M., Handa H. and Shimotohno K. (1999) Caspase-mediated cleavage of eukaryotic translation initiation factor subunit 2 alpha. Biochem. J., 342, 65-70.

153. Scheper G.C., Thomas A.A. and Voorma H.O. (1991) The 5' untranslated region of encephalomyocarditis virus contains a sequence for very efficient binding of eukaryotic initiation factor eIF-2/2B. Biochim. Biophys. Acta, 1089, 220-226.

154. Schmitt, E., Blanquet, S. and Mechulam, Y. (2002) The large subunit of initiation factor aIF2 is a close structural homologue of elongation factors. EMBO J., 21, 1821-1832.

155. Schreier M.H. and Staehelin T. (1973) Initiation of eukaryotic protein synthesis: (Met-tRNAf-40S ribosome) initiation complex catalysed by purified initiation factors in the absence of mRNA. Nat. New Biol., 242, 35-38.

156. Schreier M.H., Erni B. and Staehelin T. (1977) Initiation of mammalian protein synthesis. I. Purification and characterization of seven initiation factors. J. Mol. Biol., 116, 727—753.

157. Scott C.E. and Adebodun F. (1999) 13C-NMR investigation of protein synthesis during apoptosis in human leukemic cell lines. J. Cell. Physiol., 181, 147—152.

158. Seal S.N., Schmidt A. and Marcus A. (1989) Ribosome binding to inosine-substituted mRNAs in the absence of ATP and mRNA factors. J. Biol. Chem., 264, 7363-7368.

159. Shatkin A.J. (1976) Capping of eucaryotic mRNAs. Cell, 9, 645-653.

160. Shi Y., Vattem K.M., Sood R., An J., Liang J., Stramm L. and Wek R.C. (1998) Identification and characterization of pancreatic eukaryotic initiation factor 2 alpha-subunit kinase, РЕК, involved in translational control. Mol. Cell. Biol., 18, 7499-509.

161. Shulman R.G., Hilbers C.W. and Miller D.L. (1974) Letters to the editor: nuclear magnetic resonance studies of protein-RNA interactions. I. The elongation factor Tu-GTP aminoacyl-tRNA complex. J. Mol Biol, 90, 601-607.

162. Slupska M.M., King A.G., Fitz-Gibbon S, Besemer J., Borodovsky M. and Miller J.H. (2001) Leaderless transcripts of the crenarchaeal hyperthermophile Pyrobaculum aerophilum. J. Mol. Biol., 309, 347-360.

163. Sokabe, M., Yao, M., Sakai, N., Toya, S. and Tanaka, I. (2006) Structure of archaeal translational initiation factor 2Py-GDP reveals significant conformational change of the (3-subunit and switch 1 region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 13016-13021.

164. Sonenberg N. (2008) Translation control of learning and memory. Abstract book of the HHMI Meeting of International Research Scholars, Lisbon, Portugal, 19-22 June, 44.

165. Studier F., Rosenberg A., Dunn J. and Dubendorff J. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. J. Methods EnzimoX., 185, 60-89.

166. Sundari R.M., Stringer E.A., Schulman L.H. and Maitra U. (1976) Interaction of bacterial initiation factor 2 with initiator tRNA. J. Biol. Chem., 251, 3338-3345.

167. Szer W. and Leffler S. (1974) Interaction of Escherichia coli 30S ribosomal subunits with MS2 phage RNA in the absence of initiation factors. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 71, 3611-3615.

168. Tahara M., Ohsawa A., Saito S. and Kimura M. (2004) In vitro phosphorylation of initiation factor 2 alpha (aIF2 alpha) from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii OT3. J. Biochem., (Tokyo) 135, 479^185.

169. Tarun S.Z.Jr. and Sachs A.B. (1995) A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes Dev., 9, 2997-3007.

170. Tarun S.Z.Jr. and Sachs A.B. (1996) Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF-4G. EMBOJ., 15, 7168-7177.

171. Tarun S.Z.Jr., Wells S.E., Deardorff J.A. and Sachs A.B. (1997) Translation initiation factor eIF4G mediates in vitro poly(A) tail-dependent translation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 9046-9051.

172. Terenin I.M., Dmitriev S.E., Andreev D.E. and Shatsky I.N. (2008) Eukaryotic translation initiation machinery can operate in a bacterial-like mode without eIF2. Nat. Struct. Mol. Biol., 15, 836-841.

173. Thomas N.S., Matts R.L., Levin D.H. and London I.M. (1985) The 60S ribosomal subunit as a carrier of eukaryotic initiation factor 2 and the site of reversing factor activity during protein synthesis. J. Biol. Chem., 260, 9860-9806.

174. Thompson G.M., Pacheco E., Melo E.O. and Castilho B.A. (2000) Conserved sequences in the beta subunit of archaeal and eukaryal translation initiation factor 2 (eIF2), absent from eIF5, mediate interaction with eIF2gamma. J. Biochem., 347, 703-709.

175. Ting N.S., Kao P.N., Chan D.W., Lintott L.G. and Lees-Miller S.P. (1998) DNA-dependent protein kinase interacts with antigen receptor response element binding proteins NF90 and NF45. J. Biol. Chem., 273, 2136-2145.

176. Tolstrup N„ Sensen C.W., Garrett R.A. and Clausen I.G. (2000) Two different and highly organized mechanisms of translation initiation in the archaeon Sulfolobus solfataricus. Extremophiles, 4, 175-179.

177. Trachsel H. and Staehelin T. (1979) Initiation of mammalian protein synthesis. The multiple functions of the initiation factor eIF-3. Biochim. Biophys. Acta, 565, 305-314.

178. Trachsel H., Erni В., Schreier M.H. and Staehelin T. (1977) Initiation of mammalian protein synthesis. II. The assembly of the initiation complex with purified initiation factors. J. Mol. Biol, 116, 755-767.

179. Udagawa Т., Shimizu Y. and Ueda T. (2004) Evidence for the translation initiation of leaderless mRNAs by the intact 70 S ribosome without its dissociation into subunits in eubacteria. J Biol Chem., 279, 8539-8546.

180. Valasek L., Nielsen K.H. and Hinnebusch A.G, (2002) Direct eIF2-eIF3 contact in the multifactor complex is important for translation initiation in vivo. EMBOJ., 21, 5886-5898.

181. Van der Hofstad G.A., Foekens J.A., Bosch L. and Voorma H.O. (1977) The involvement of a complex between formylmethionyl-tRNA and initiation factor IF-2 in prokaryotic initiation. Eur. J. Biochem., 11, 69-75.

182. Van Heugten H.A., Kasperaitis M.A., Thomas A.A. and Voorma H.O. (1991) Evidence that eukaryotic initiation factor (elF) 2 is a cap-binding protein that stimulates cap recognition by elF-4B and eIF-4F. J. Biol. Chem., 266, 7279-7284.

183. Van Heugten H.A., Thomas A.A. and Voorma H.O. (1992) Interaction of protein synthesis initiation factors with the mRNA cap structure. Biochimie, 74, 463-475.

184. Varshney U., Lee C.P., Seong B.L. and RajBhandary U.L. (1991) Mutants of initiator tRNA that function both as initiators and elongators. J. Biol. Chem., 266, 18018-18024.

185. Vasile F., Pechkova E. and Nicolini C. (2007) Solution structure of the beta-subunit of the translation initiation factor aIF2 from archaebacteria Sulfolobus solfataricus. Proteins, 70, 11121115.

186. Vermeer C., van Alphen W., van Knippenberg P. and Bosch L. (1973) Initiation factor-dependent binding of MS2 RNA to 30-S ribosomes and the recycling of IF-3. Eur. J. Biochem., 40, 295-308.

187. Von Pawel-Rammingen U., Astrom S. and Bystrom A.S. (1992) Mutational analysis of conserved positions potentially important for initiator tRNA function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol., 12, 1432-1442.

188. Wagner Т., Gross M. and Sigler P.B. (1984) Isoleucyl initiator tRNA does not initiate eucaryotic protein synthesis. J. Biol. Chem., 259, 4706-4709.

189. Walton G.M. and Gill G.N. (1975) Nucleotide regulation of a eukaryotic protein synthesis initiation complex. Biochim. Biophys. Acta, 390, 231—245.

190. Walton G.M. and Gill G.N. (1976) Preferential regulation of protein synthesis initiation complex formation by purine nucleotides. Biochim. Biophys. Acta, 447, 11-19.

191. Wells S.E., Hillner P.E., Vale R.D. and Sachs A.B. (1998) Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol. Cell, 2, 135-140.

192. Welsh G.I., Price N.T., Bladergroen B.A., Bloomberg G. and Proud C.G. (1994) Identification of novel phosphorylation sites in the beta-subunit of translation initiation factor eIF-2. Biochem. Biophys. Res. Commun., 201, 1279—1288.

193. Westermann P., Heumann W., Bommer U.A., Bielka H., Nygard O. and Hultin T. (1979) Crosslinking of initiation factor eIF-2 to proteins of the small subunit of rat liver ribosomes. FEBS Lett.,91, 101-104.

194. Westermann P., Nygard O. and Bielka FI. (1981) Cross-linking of Met-tRNAf to eIF-2 beta and to the ribosomal proteins S3a and S6 within the eukaryotic inhibition complex, elF-2-GMPPCP'Met-tRNAf'small ribosomal subunit. Nucleic Acid Res., 9, 2387-2396.

195. White B.N. and Bayley S.T. (1972a) Methionine transfer RNAs from the extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Biochim. Biophys. Acta, 272, 583-587.

196. White B.N. and Bayley S.T. (1972b) Functional aspects of tRNA from the extreme halophile, Halobacterium cutirubrum. Biochim. Biophys. Acta, 272, 588-595.

197. Yang W. and Plinnebusch A.G. (1996) Identification of a regulatory subcomplex in the guanine nucleotide exchange factor eIF2B that mediates inhibition by phosphorylated eIF2. Mol. Cell. Biol., 16, 6603-6616.

198. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S. and Schmitt, E. (2006) Structural switch of the у subunit in an archaeal aIF2ay heterodimer. Structure, 14, 119-128.

199. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S. and Schmitt, E. (2007) Structure of an archaeal heterotrimeric initiation factor 2 reveals a nucleotide state between GTP and GDP states. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 18445-18450.

200. Yatime, L., Schmitt, E., Blanquet, S. and Mechulam, Y. (2004) Functional molecular mapping of archaeal translation initiation factor 2. J. Biol. Chem., 279, 15984-15993.

201. Yatime, L., Schmitt, E., Blanquet, S. and Mechulam, Y. (2005) Structure-function relationships of the intact aIF2a subunit from the archaeon Pyrococcus abyssi. Biochemistry, 44,

202. Zubay G. (1962) The isolation and frac" " 111 'bonucleic acid./. Mol. Biol., 4,8749-8756.3161.347.356.

Информация о работе

Столбоушкина, Елена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы