Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Построение карты генома Mycoplasma gallisepticum

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Построение карты генома Mycoplasma gallisepticum"

РОССИЙСКАЯ Л'СЛДЕГЛ'ИЯ' МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

на працах. рукописи

Построение карты генома Mycoplasma д

C»a.vipuü АкдроЛ Викторович

Специальности: 03.00.04 - биохммад

03.G0.0o - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание уччнсй степени кандидата биологических наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Института Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Центра РАМН.

Нг.учный руководитель - кандидат физико-математических наук, __. Бибилаишили Р.Ш.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор . Тер-АЕанесян МД.

- доктор биологических наук, Прасолов B.C.

Ведущее учреждение - Институт Общей Генетики

им. Н.И.Вавилова РАМН

■3d

Защита состоится .................19Э6 г.

Б -------часов на заседании диссертационного совета

К 001.22.02 в Кардиологическом Научном Центре РАМН (121552, г.ГЛосша, 3-я Чэрепковская ул., д. 15А)

С диссертацией v.c:kho ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического Научного Центра РАГДН.

49

Агторвфзрзт р._зоглг!; г.

Умсчый секретарь. :о-.г;тг15пС)нного оо.-та . U /"

6rtono»v4ccir;* наук_____/ "окгарова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.-- . "

туальность проблемы исследования. Микоплазмы.._-. прокариоты с

именьшим по размеру геномом, но способные к самостоятельному спрсиззеденив - представляются наилучший модельным организмом я исследований регуляции активности генов на уровне всей етки. Изучение микоплазм диктуется таг.же практической сбхгдимостью: многие виды играют существенную роль в патологии лоь«ка и сельскохозяйственных животных, а также являются .новныыи и наиболее трудно детектируемыми " контаминантами охул.а^р. Сднахс, использсзаниэ гзгкоплазм в качестве цельного организма затрудняет скудость знаний об их метаболизме генах. Частично ограниченность знаний объясняется тем, что при :учении микоплазм подходы классической биохимии и генётики :азызаются малоэффективными. Потеря микоплазмами части юсинтетических путей из-за уменьшения генома в процессе их юлгоции делает необходимым получение предшественников синтеза :::рсмоле;:ул "3 сггругтдзясЯ средь:, но вьпзсд о потере 1™коплаэмой федсленксго метаболического пути из-за отсутствия активности ютветст^ую'йих ферментов у одного штамма, не может быть обобщен ; весь пиз, т.к. нестабильность генома микоплазм приводит к ¡ачительным отличиям между штаммами.

Тем не мен г?е, за последние годы удалось значительно расширить ¡ания, что связано с применением подходов и методоз молекулярной юлогии для изучения метаболизма и генетики этих уникальных 1кроорганизмов. Задачей данной работы было клонирование, гоеделение последовательности нуклеотидов и картирспание гкоторых консервативных в ззолюции генов, продукты которых играют 1жнуп роль в метаболизме макромолекул, а также построение 13тгческой кпрти хромосомы Mycoplasma gallisepticuis птамм А5969. -Л-- исследования. Характеристика компонентов метаболизма 'жслокул Mycoplasma gallisepticum с ислол; sosa.i-ие.ч -тсгулярнс-биолог'^'ес^ого псдх?,"а, а та?с?:е изучен^0 хромосомы ^сс,- " -г'чз gallir,cpiicг.л.

эвиа^г результатов .'• . В работе определены последовательности /г_!.еотпяов и картированы гены, кодируют^ АТР-связывающую /бъединицу тог.сизомеразы типа IX, бета-суС'^единицу РНК-

полимеразы, рибосомные РНК Mycoplasma gallisepticum. Построен физическая карта хромосомы Mycoplasma gallisepticum А5969 проведено сравнение хромосом образцов штамма из разных коллекций. Практическая ценность работы. Полученые результаты, кроме решзни актуальной задачи разработки модельного организма для исследоаани регуляции экспрессии гонор на уровне целой клетки, . могут . быт использованы -при разработке средств диагностики и лечени микоплазменных заражений. Предложенный метод получения ДН микоплазм для анализа пульс-электрофорезом позволяет получать хранить в течение длительного времени ДНК охарактеризованны штаммов, что важно для препаратов, используемых при сравнительно характеристике штаммов. Предложенный метод " получени последовательных делеций секвенируемого фрагмента может быт использован . для определения последовательностей нуклеотидо протяженных фрагментов ДНК.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на школе семинаре FEMS "Быстрая диагностика микоплазм" (Иерусалим, Израиль 1991 г.), IX Конгрессе Международной Организации Микоплазмолого (1992 г., Аймс, США), X двустороннем Российско-Германско симпозиуме "Организация и экспрессия генома" (Суздаль, 1993 г.). Публикации." 'По' материалам диссертации опубликовано 6 "статей и статья находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из раздело "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результат и их обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список литературы" Работа изложена на 1^2. страницах машинописного текста, включающег 29 рисунков, 2 таблицы и список литературы, содержаний 119 ссылок Обзор литературы посвящен особенностям биологии микоплазм современным подходам к исследованию их метаболизма.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использованы стандартные методы молекулярной биолок-и биохимии, описанные в руководстве Сэмбрука и соавт..

В' качестве основного объекта исследований использовали шта! М. gallisepticum А5969, первоначально выделенный ван-Ройкел< (University of Massachusettes, Amherst, MA, США) из- трах« цыпленка. Образцы штамма были получены от С.Н.Борхсениуса - var.J

Роттема (The Hebrew University- Hadassah Medical School, ¡раиль) - var.R и С.Х.Клевена (University of Georgia, США) -ir.K. В "ходе" "работы M. gaiiisepticmir культивировали на твердых и

щких средах, применяя стандартные методики культивирования 1КОШТЭЗМ.

1гкий метод выделения полноразмерной хромосомной ДНК (1000 п.н.) в диализном мешке для пульс-электрофореза. Клетки .gallxsepticum собирали из 200 мл культуральной среды гнтрифугировакием. Осадок клеток ресуслекдирооали в 15 мл буфера,

-Aw,™_____ 10 Гг'-f-HCl, pHS, 0,1 иМ 3DTA. 0,1М НаС1 и-повторно

з&ирахи клетки центрифугированием: Сс'док плеток ресуспендироьали 15 мл буфера, содержащего 10 мМ Трис-HCl, рН8, 0,1'mM3DTA (ТЕ-уфер), и суспензию клеток переносили в диализный мешок. Затем в ешок добавляли протеиназу К и РНКазу А до конечной концентрации 00 и 20 мкг/мл- соответственно. Суспензию осторожно перемешивали и диализный мешок добавляли 0,2 мл 10%-ного раствора одецилсуль^ата натрия. Диализ проводили против 1 л буфера, одержащего !0 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 5 мМ ЭСТА и 0,1%-ный одецилсульфат натрия, при комнатной температуре в течение ночи, .иализный буфер меняли на раствор, содержащий 20 мН Трис-HCl, рН ,0, 10 мМ ЭОТЛ, 1%-ный додецилсульфат натрия, и диализ |родолжали в течение 2-х суток со сменой буфера 1 раз в сутки. Окончательно раствор ДНК диализовали против 4-х смен ТЕ-буфера в :ечение суток. Раствор ДНК осторожно переливали в стеклянные ■робирки с завинчивающимися пробками и хранили при +4°.

. nía рр**н<р

Рис. 1. Векторы рГМ 18(19).

Приведены

послеловательности

нукдеотидов

(-)-цепей

полилинкерных

участков

Пол;/чение делеционных производных секвенируемого фрагмента ДНК. Для получения делеционных производных секвенируемого фрагмента с

использованием нуклеазы Bàl31 созданы векторы рТМ 18(19). Вект.ор: сконструированы на основе pTZ18{19) путем введения фрагмент; размером 4,5 т.п.н. в несущественную область о-их плазмид так, чтобы он мог служить "буфером" при получении делецм секвенируемого фрагмента ДНК, встраиваемого в полилинкер (рис. 1).

Для получения делеционных производных ДНК плазмиды, содержаще! секвенируемый фрагмент, выделяли с использованием равновесногс центрифугирования в ■ градиенте плотности хлористого цезия £ присутствии бромистого этидия с последующим удаление*

низкомолекулярных примесей хроматографией на колонке Bio-Gel ASOm. Плазмидную ДНК линеаризовали рестриктазой, имеющей уникальное место узнавания ' в полилинкере (MCS) мёжду "буферным" и секвенируемым фрагментом. После проведения фенольной депротеинизации и переосаждения этанолом ДНК растворяли в воде до концентрации 150 мкг/мл. 225 мкл ДНК смешивали с равным объемом 2-x кратного буфера для нуклеазы Ва131 и добавляли 3 единицы Ва131. Реакцию проводили при температуре Й5°С. С интервалом в 30 минут из реакционной смеси отбирали пробы объемом 30 мкл, к которым

добавляли ЭДТА до концентрации ЮмМ для остановки реакции.

i < ■

Нуклеазу Bal 31 инактивировали прогреванием, проб при __65°С.. в течение 5 минут. Аликвоты из каждой отобранной пробы анализировали с помощью электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле. В пробы, содержащие делеции интересующего нас размера, добавляли ацетат натрия (pH 4,8) до концентрации ЗОмМ и 2,5 объема этанола. ДНК собирали центрифугированием и дважды промывали 70% этанолом. Затем ДНК растворяли в 50 мкл 1-кратного буфера для рестриктазы SmaI. К каждой пробе добавляли 5 единиц рестриктазы Smaï и инкубировали в течение 2-х часов при 25°С. Полноту гидролиза контролировали с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле. К каждой пробе добавляли по 5 ыкл 10-кратного буфера для лигирования и ДНК-лигазу Т4 до концентрации, рекомендованной. производителем для сшивания тупых концов ДНК. Затем проводили трансформацию компетентных клеток E.coli штамм TG1. Из двух случайно . выбранных клонов, соответствующих пробам, отобранным на стадии Bal-гияролиза, получали оя^онитевую плазмидную ДНК. Последовательность нуклеотидов делационных производных определяли модифицированным

етодом Сэнгера с олигонуклеотидом А в качестве затравки. Полную

оследовательность нуклеотидов фрагментов получали как уперпозицию перекрывающихся последовательностей делеционных роизводных и кониевых участков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. клонирование участков генома Mycoplasma gallisepticum А5969 var.3, 'ибридизующихся с рРКК-

Для изучения генов рРНК был проведен скрининг банка генов Mycoplasma gallisepticum штамм . А5969 var.fi с использованием в сачестве гибрмдизсцлонной пробы 16S тт 23S рРНК E.coli. Десять тонов, дающих при гибридизации сигнал, были выбраны для дальнейшего анализа. Для каждого клона построена физическая карта (рис. 2). Сравнение физических карт позволило разделить получение '_поны на 4 группы: 1 - MG7 и MG39; 2 -V MG77 и MG95; 3 - MG8 и 4G15; 4 - MG53 и MG92. Как видно из рис. 2, клоны, входящие в каждую группу, содержат перекрывающиеся фрагменты генома, а Ьрагиенты у представителей разных групп не перекрываются. Саузерн-анализ клонов с использованием пробы на 16S, 23S и 5S рРНК показал, что представители первой группы содержат рестрикционные фрагменты, гибридизующиеся с 16S, 23S и 5S рРНК; представители третьей и четвертой .группы содержат фрагменты, гибридизующиеся только с 16S рРНК; представители второй группы содержат рестрикционные фрагменты, гибридизующиеся с 23S и SS рРНК. Таким образом, полученые результаты свидетельствуют о наличии на хромосоме четырех независимых областей, содержащих генетические локусы, имеющие отношение к рибосомным РНК. Для выяснения природы участков ДНК, ответственных за гибридизацию, соответствующие рестрикционные фрагменты субклонировали в плазмидные векторы и определили последовательности нуклеотидов этих фрагментов.

Анализ последовательности нуклеотидов областей, гибридизующихся с пробами на риСосомные РНК, показал наличие в геноме даух наборов генов, кодирующих 16S, 23S и 5S рРНК, а также присутствие укороченной копии гена 16S рРНК (рис. 2).

Один набор генов организован в "классический" оперон рРНК эубактерий: 16S-23S-5S (ггпД), а во вторм наборе ген кодирующий 16S рРНК (ггп16) отдален от соседствующих генов 23S и 5S рРНК

Генетические лежу с ь- хромосомы Mycoplasma gaillaepticum A59G9 Vi г.В, имеющие отношение к рмбосомным- РНК.

rmA — ibs —Г

23S

и—

Учаслм кромоеомы Uimptmma ряДмркол) А5ИВ. WtoWITWH * проб"** ПК

■ itSt«« ESaSXW ■ 23S.5SIIPHK

int

16S

rrn16'

Рис. 2. Схематичное изображение участков хромосомы M.gallisepticum, содержащих фрагменты, гибридизукяциеся с пробами на рибосомные РНК. Слева на клонированых отрезках хромосомы вертикальными линиями показаны места узнавания рестриктазы HindLll, а взаимное положение клонов (сплошная линия) показано под хромосомными фрагментами.

{ггп23-5) на значительное расстояние (рис. 2) . Третий участок, гибридизующийся с пробой на 16S рРНК (гхп16'), содержит только часть кодирующей последовательности: первые 977 нуклеотидов 16S рРНК одинаковы с последовательностью нуклеотидов анализируемого фрагмента, тогда как остальные 500 нуклеотидов 16S рРНК не имеют сходства с последовательностью нуклеотидов анализируемого участка. Следовательно, геном M.gallisepticum А5969 var.B в дополнение к двум копиям полноразмерных генов 16S рРНК (часть гглЛ-оперона а ггп1б) содержит укороченную копию гена или псевдоген (ггп16') . '' Следует ' отметить результаты сравнения последовательностей нуклеотидов участков, - окружающих кодирующие области:

[редшествующие 33 нуклеотида и 150 нуклеотидов, следующие за солирующими 16S рРНК областями обоих полноразмерных генов, >динаковы (рис. 3) . В более удаленных областях сходства юследовательностай нуклеотидов не обнаруживается.

1оследозательность нуклеотидов, следующая за точкой обрыва солирующей последовательности псевдогена, не имеет сходства с юследовательностями нуклеотидов фрагментов, окружающих нормальные "■йчы. Однако, последовательность нуклеотидов фрагмента, тредшествующего псевдогену, одинакова на всем протяжении

-зкпгнированого участка (500 нуклеотидов) с последовательностью ¡уклеотидов фрагмента, предшествующего нормальному изолированному ?ену (рис. 3). Хотя отмеченного факта не достаточно для однозначных выводов, можно предполагать, что появление псевдогена з геноме связано с дупликацией нормального изолированного гена L6S рРНК.

Рис. 3. Анализ участков генома М.дгШгерИсит А5969, гибридизугащихся -УгГаП с рРНК. Схематичное изображение последовательностей нуклеотидов геномных фрагментов, содержащих полноразмерные (часть гглЛ-оперона и ггл16) и укороченную (гхл 16')

___копии генов 16Б рРНК.

"7 • - Незаполненными

прямоугольниками

показаны последовательности нуклеотидов рРНК. Заштрихованными прямоугольниками показаны идентичные последовательности в разных хгп фрагментах. Уникальные для каждого ггп фрагмента последовательности нуклеотидов показаны горизонтальными линиями.

4исло генов рРНК в геноме М.даШзерИсит.

Выяснение природы участков генома штамма А5969, гибрипизуюшихся с рРНК, позволяет найти причину противоречий, возникших при определении числа генов . рРНК. в М.даЩзерЫсцт. При определении числа генов 23Б и ' 5Э рРНК противоречий не возникло: все проверенные ранее опыты показали наличие двух генов, кодирующих 23Э и 5Э рРНК. При обсуждении количества участков геноыа.

гибридизующихся с пробей на 16Б рРНК, следует обратить внимаю на то, . что в экспериментах, давших противоречащие результат! исследовались разные штаммы М.даШзерЫсиш-. в опытах Чена соавт. - РС31 и Эб (два фрагмента, гибридизувщиеся с 165 рРНК), в опытах Амикаы и соавт.. и наших - А5969 (три), т.е. мояа .предполагать, что- разные штаммы содержат не одинаковое чис; хромосомных фрагментов, гибридизующихся с 16зТрРНК.

Для проверки гипотезы проведены опыты по Саузерн-гибридизащ хромосомной ДНК из разных штаммов М. даШзерЫсит и образце штамма А5969 из трех коллехций (список исследованных штамме приведен в подписи к рис.-4) с использованием двух типе гибридизационных проб.

Для первой серии опытов синтезированы три олигонуклеотида: С (ССССетСГСТСАСТССС) олигонуклеотид, комплементарный 5' концевой части 16Б рРНК. Данная последовательность присутствуе как в номадьных генах, так и в псевдогене.

Два других олигонуклеотида позволяют в опытах по гибридизада отличить псевдоген (Т) от нормальных генов [М) . Первичнь структуры этих олигонуклеотидов приведены на рис. 4.

ДНК разных штаммов М. даШверЫсиш обрабатывалась рестриктазс ЯХлсЯН. Продукты гидролиза разделялись электрофорезом в 0,6%

Рис. 4: Определение числа участков генома, гибридизующихся с 16Э рРНК разных штаммах М.даШэерНыт. Слева приведены последовательное нуклеотидов 1(3 рРНК, полноразмерных генов и псевдогена вблизи 9 нуклеотида 16Э рРНК. Последовательности - олигокуклеотидоа N и позволяющих по гибридизации отличить псевдоген от полноразмерного ге: подчеркнуты. . Справа приведет , результаты . Саузерн-гибридизац; хромосомной ДНХ штаммов А5969уаг.В (1), 36 (2), А5969уаг.К (3), К503-9 (4), А59697аг.К (5), К871.Я. (6) с олигонуклеотидами С, Н, Хромосомная ДНК бьаа обработана рестриктазой HincS.ll. :

¡гарозном геле и переносились на мембрану по Саузерну. Мембраны гибридизовались в "жёстких" условиях~с"каждым олигонуклеотидом.- -------

Как видно из рисунка 4, три полосы появляются при гибридизации элигонуклеотида с у всех вариантов -штамма А5969, в ДНК всех других итаммов выявляются две полосы. Близкие по размеру гибридизующиеся фрагменты в ДНК ' штамма Э6 могут быть разделены при более длительном проведении электрофореза.

- При гибридизации с олигонуклеодидом N в ДНК всех штаммов появляются две ьолосы, причем длина гибридиэующихся фрагментов одинакова с длиной фрагментов, выявляемой пробей с у ДНК всех штаммов, кроме А5969'. В ДНК образцов штамма А5969 совпадающими по длине оказываются два из трех фрагментов, выявляемых пробой С.

При гибридизации с олигонуклеотидом Г полосы появляются только в ДНК образцов штамма А5969, причем выявляются фрагменты, которые гибридизуются с С, но не гибридизуются с олигонуклеотидом n.

Следовательно, во всех вариантах штамма А5969 (и только в них) присутствует одинаковый псевдоген 16Б рРНК.

Результаты опытов по гибридизации с олигонуклеотидами не исключают наличия в других штаммах псевдогенов, отличающихся по "структуре от вышеописанного. Для окончательного решения вопроса о количестве геномных областей, содержащих 163-подобные фрагменты, проводили опыты по гибридизации с пробой, содержащей почти полную кодирующую последовательность 16Э рРНК М.даЩэерЫсит (5-1160 нуклеотиды) . При Саузерн-гибридизации в "мягких" условиях -гибридизующимися оказались три фрагмента в А5969 и два фрагмента в хромосомных ДНК остальных штаммов.

Суммируя результаты проведенных опытов, можно сделать вывод о том, что геном штамма А5969 содержит два набора полноразмерных генов, кодирующих 16?, 235 и 5Б рРНК, и одну копию укороченного псевдогена 16Б рРНК, причем псевдоген стабильно сохраняется в геноме. В остальных штаммах М.даШаерЫсша псевдогена нет, что свидетельствует об отсутствии у псевдогена жизненно важной функции в клетке. •

Клонирование и анализ последовательности нуклеотидов участк генома Mycoplasma gallisepticum, содержащего ген АТР-связывающе субъединицы ДВК-топоизомеразы типа II '. topXIB) ■

Ген АТР-слязывающей субъединицы ДНК-топоизомеразы ьторого тип (topIIB) клонирован из банка генов M.gallisepticum штам; A5963var.B в векторе AEMBL3A с использованием гомологичного геи. М.pneumoniae "в качестве гибридизационной проба. Гибридизующиес; фрагменты выбраного клона MG76 субклонированы в векторы серии рТ! и определена последовательность нуклеотидов гибридизующегос; участка генома. Секвенированный участок генома (рис. 5) содержи: полный ген, кодирующий В-субъединицу топоизомеразы типа II (TonoIIB); следующий за ним фрагмент, кодирующий аминоконцеву1 часть А-субъединицы топоизомеразы типа II (TonoIIA) ; а такж£ участок, предшествующий гену topIIB, содержащий полную рамк! считывания, кодирующую полипептид размером 99 или 8<i

аминокислотных остатка (ORF S9 или ORF 84). При сравнении

Локальная сложность нукл«отидного оовтаяа (1СС) Окно 90 нуклмтидоя

В

Топоизог.аераоа II т А

т т

А

■"Г

jss-

гг

.да.

Рис. 5. Функция

локальной сложности

нуклеотидного состава для исследуемогс

участка ■ • генома М. gallisepticum . В средней части рисунка показано положение

кодируемых пептидов. Черным цветом выделены консервативные области первичной структуры

белкой. 1 - АТР связываюдий участок В-субъединицы; 2 - С-концевой домен.

Положение вероятных

терминатор (Т> — и антитерминатор (А)-

подобных структур в значащей (над линией) к антисмысловой (под

линией) цепях показано в нижней части рисунка.

последовательностей нуклеотй'дов секвенированного фрагмета генома с дуг М.pneumoniae выявляются два протяженных участка, имеющих сходную первичную структуру:., участок,, расположенный мевду нуклеотидами 525-880 (аминокислотные остатки 29-130 TonoIIB), имеет гомологию 65% с ' соответствующим фрагментом гена дугВ М. pneumoniae, и участок от 1800 нуклеотида до конца проанализированного фрагмента (аминокислотные остатки 400-632 TonoIIB и 1-86 TonoIIA) имеет гомологию 60% с .соответствующим участком gyz М.pneumoniae. В центральных частях генов значимого сходства последовательностей .нуклеотидов не найдено. В отличие отгона дутв М.pneumoniae в гене topIIB M.gallisepticux триптофэчы кодируются как кодоном UGG (аминокислотные остатки 40, 311 и 550), так и кодоном UGA (аминокислотные остатки 170 и 622) .

Сравнение аминокислотной последовательности TonoIIB M.gallisepticum с последовательностями АТР-связывающих субъединиц топоизомераз типа II из других видов 'бактерий показывает, что аминокислотные последовательности TonoIIB M.gallisepticum и GyrB М.pneumoniae одинаковы на 45,3% (с учетом консервативных аминокислотных замен уровень гомологии составляет 66,4%), TonoIIB M.gallisepticum и GyrB B.coli одинаковы на 46,5% (63,3%), TonoIIB M.gallisepticum и ParE E.coli i;a 38% (60', 5%), TonoIIB M.gallisepticum и Gyr& B.subtilis на 47,1% (65,2%)'. Таким образом, сходство первичных структур TonoIIB M.gallisepticua и гомологичных субъединиц как из близкородственных грам-положительных, так и более филогенетически отдаленных грам-отрицательных бактерий оказывается примерно одинаковым. Отмеченное выше примерно одинаковое сходство аминокислотных последовательностей субъединиц TonoII M.gallisepticum и аминокислотных последовательностей субъединиц как ДНК-г'иразы, так и TonoIV E.coli не позволяет на основании данных только о первичной структуре предсказать, будет ли фермент обладать гпразной активностью. Для ответа на этот вопрос необходимы дополнительные исследования.

Как следует из результатов проведенных ранее опытов, N-концевая часть полипептидной, цепи субъединицы В ДНК-гиразы E.coli формирует АТР-связывающий центр, а С-концевая участвует во взаимодействии с субъединицей А гиразы. Сравнение первичных

В-субъединицы

Hp MEOiflJKTQAYDSSSIKILEGbEAVRKRPGMYIGST.GEEGLHHMIWEIIDNSXDEA 55

.-' -I:.. 11:1.111:1 I II mini I 111 I:: 11:: 11.: I 11

Mg 1 (WSimJEKHIKVUiGbEFVRKRPGMYIGST.DTRGLHHbVWELFDNAVDEA 50

I -.1:.. 11IIi iI::I 1111 11111. I I. I I I I: I: I:.111:I 11 EC 1 MSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEWDNAIDEA'il

Mp 56 MGGFASTVKLTLKDNFVTTVEDDGRGIPVDIHPKTNRSTVETVFTVLHAG 105

:.| I..:.:. I.: .11.1:111111: : II 111:11:111111 Mg 51 LNGSANKIEWHKKDGSXIVTDNGRGIPVGKNLATNLSTVDTVYTVLHAG 100

I.I ...I I. . I.I: I J : I I 11 I • I : ...: I..:.: 111111 Ec 52 LAGHCKEIIVTIBADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAG 101

MP 106 GKFDNDSYKVSGGLHGVGASWNALSSSFKVWVAREHQQYFLAFHNGGE 154

11 I I::. 1111111111 111 111 I 11 ••: II I: ■ I :::ll. Mg 101 GKFDDQAYKVSGGIJiGVGASVVNALSRKLIVTVHRDGGMYESIYQDGGK 149

Mill ..millnm.Ullin.il :.::|:l :. 11:. I.. Ec 102 GKFDDNSYKVSGGLHGVGVSWNALSQKLELVXQREGKIHRQIYEHGVP 150

Рис. 6. .Сравнение аминокислотных последовательностей J! 'Концевых частей субъедини« TonoII М. gallisepticum (Mg) с _ гомологичными субъединицами ДНК-гираз Ы. pneumoniae (Hp) и E.Coli (Ее). Аминокислоты N-

концевого фрагмента GyrB Е. Coll, которые по данным

рентгеноструктурного анализа

непосредственно участвуют во

взаимодействии с АТР, отмечены

звездочками.

А-субъединицы

Hp MAKOQOaiDKIRQELAQSMKHISLSSELERSniEYAMSVIVARALPDARDGLKPVHRKVLYGA 64

:... I . .1.. :. II II. :l .Mill 1111111:111111 Mg HDKKiIFQKDLDDIHSLSFGKYAXYIIQERALPDIRDGl.KPVQBJ?VLYGM 50

:.l . :::: :. I; " II. :l : 11111:1 1111 И:11111:1

EC KSOIAKEITPVHIEEELTSSYLDiftMSVIVGRALPOVUDGLRPVRRRVLTfAM 55

MP YTGGMHHDRPFKKSARIVGDVMSRFHPHGDHAIYDT 100

I. 1:..::.::))) . 11:1::1111111 .11:. Mg raiGLYYKKSYRKSAAIVGEViaCFHPHGDSSIVEA 86 II : 11.1:111 • 11: II11:1f11 11•:I: -

EC NVLGHDWNKATKKSAAVVGDYIGKYHPHGDSAVYDT 88

структур показывает, что аминокислотные остатки N-концевого фрагмента субъединицы В ДНК-гиразы ' E.coli, которые по данным рентгеноструктурного . анализа непосредственно участвуют во

взаимодействии с АТР, и соответствующие им аминокислотные остатки TonoIIB М. gallisepticum одинаковы (рис. 6).

■ Взаимное расположение генов, кодирующих А и В субъединицы топоиземеразы типа II, одинаково у И. gallisepticum и

M. pneumoniae: последний нуклеотид стоп колона ТАА гена,,

кодирующего субъединицу В, одновременно является первым нуклеотидом инициирующего "колона" гена, кодирующего субъединицу А, однако следует отметить, что в отличие от GyrA И.pneumoniae, VonoIIA M.gallisepticum не содержит 13-членного лидерного гидрофобного пептида на N-конце (рис. 6).

Анализ участков начала репликации хромосом грам-положительных и грам-отрицательных бактерий • позволил сделать вывод о консервативном порядке следования генов зубактерий в этих участках: rnpA-rpmK-dnaA-recF-gyrB. Анализ последовательности нуклеотидов фрагмента, предшествующего гену topIIB

M.gallisepticum, показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей полипептид из 99 аминокислотных остатков (ORF 99, рис. 5), однако этой рамке не предшествует последовательность, комплементарная 3'-концу 16S рРНК. Тетрануклеотид AAGA, за которым на расстоянии одного нуклеотида расположен инициирующий кодон ATG, встречается внутри участка, кодирующего ORF99, при этом размер альтернативного полипептида оказывается равным 84 аминокислотным остаткам (ORF84). Первичные структуры ORF99 и ORF84 сопоставили с первичными структурами продуктов.,геноа, представленных.в GenbanJc, но последовательностей, имеющих значительную гомологию, не выявлено.

В последовательности нуклеотидов секвенированного фрагмента проведен поиск вероятных регуляторных элементов транскрипции: промотор-подобных структур, терминатор-подобных структур.(шпилька-олигоТ), антитерминатор-подобных структур; а также проведен анализ функции локальной сложности куклеотидного состава (LCC, рис. 5). Поиск промотор-подобных структур в областях, предшествующих клонированным генам, не привел к однозначному результату: фрагментов, точно совпадающих со среднестатистическими "консенсус"-последовательностями, вблизи участков -35 и -10 эубактериального промотора не найдено, а при использовании менег строгих критериев из-за высокого содержания AT в метенгой области можно выделить' несколько фрагментов, имеющих примерно одинаковые отклонения от "консенсус"-последовательностей. Следует отметить, что расположение вероятных регуляторных элементов транскрипции в анализируемом фрагменте не коррелирует с расположением участков,

кодирующих полипептиды, (рис. 5). С другой стороны, из анализа функции локальной сложности нуклеотидного состава видно (рис. 5), что пики функции LCC четко выражены и указывают на межцистронные участки, а плато приходятся на наиболее консервативные домены В-субъединицы: АТР-связываюший и домен/ участвующий во" взаимодействии с А-субъединицей (рис. 5).

Клонирование и определение последовательности нуклеотидов гена гроВ.

Ген бета-субъединицы РНК-полимеразы {грсВ) клонирован из банка генов M.gallisepticum штамм А5969 с использованием гомологичного гена M.genitalium. Результаты определения и анализа последовательности представлены на рис. 7-8.' Секвенированиый участок генома содержит . полный ген гроВ М. gallisepticwn, кодирующий бета-субъединицу РНК полимеразы; начало кодирующей последовательности бета-штрих субъединицы IrpoC); а также участок, предшествующий генам jrpoB-zpoC, содержащий полную рамку

считывания, кодирующую полипептид из 276 аминокислотных остатков (orf 276). Следует также отметить, что в области между 1 и 690 нуклеотидами секвенированного фрагмента протяженных открытых рамок трансляции не найдено.

" Результата сравнения аминокислотных •последовательностей P.PÖB М. gallisepticwn и соответствующих субъедикиц РНК-полимераз Е. coli, B.subtilis и Saccharomyces cerevisiae приведены на рис. 7. На первичной структуре бета-субъединиц РНК-полимеразы E.coli отмечены девять консервативных в эволюции сегментов (A-I), выявленных при сравнении аминокислотных последовательностей вторых по величине субъединиц РНК-полимераз прокариот и эукариот. Как видно из рис. 7, .^положение областей сходства аминокислотных последовательностей соответствует консервативным сегментай B-I, однако, протяженность областей сходства превышает размер консервативных сегментов. Кроме того, отсутствует область сходства последовательностей, соответствующая консервативному сегменту А. В первичных структурах вторых по размеру субъединиц РНК-полимераз из разных организмов кроме сегме'нтов консервативных для РНК-полимераз найдены функциональные консервативные мотивы, встречающиеся не только в РНК-полимеразах, но и в других белках: мотив связывания

Рис. 7. Сравнение первичной структуры RpoB М.gallisepticum (M.gal RPOB) с гомологичным! субъединииами PffiC-полкмераз из E.coli (E.Coli RPOB),

B.subtilis (B.subtilis RPOB), а также со второй по величине субъединицей РНК-полимеразы II Sacch3ro~yces cerevisina

(Byiii.pep). Для сравнения использовалась программа

(WIÍKÍÍW=30, striqency^Qi .

Положения на первичных

структурах ß—субъединиц РНК-полимераз1 ■ E.coli и

М. gallisepticum консервативных сегментов (A-I) показано утолщенными линиями.

M.ifti кров 1-:

пуринозых нуклеотидоь GX¿_5GK(T) (111!; Zn- связывающий мотив

CX2CGX7_24CX2C (103, IOS, 111). Последний'присутствует а первичных структурах зторых по размер!' субъединиц РНК-полимераз эукариот и отсутствует у прокариот. В RPOB М. gallisepticum Zn-связываюший мотив описанного типа отсутствует, а нуклестид-связывающий мотив расположен . в консервативном сегменте G (аминокислоты 966-373). Необходимо также отметить, что б из 7 аминокислот, котооые избирательно метятся аналогами инициирующих субстратов в öe субъединице РНК-полимеразы E.coli, консервативны в .КРОВ М. gallisepticum. (сегменты Н и . 1), причем аминокислоты, соответствующие 1065 и 1237 остаткам бета субъединицы E.coli, которые по биохимическим и генетическим данным непосгедств ;:iao вовлечены в формирование каталитического центра, оказываются одинаковыми в RPOB обеих бак-.-грий (Lys-1051 и Н. '/46 М. rrallisenticum).

Гены гроВ-гроС в E.coli и B.subtilis являются частью оперо:;а, ,в состав которого входят также" гены rplJL, кодируют^, рибосоиные белки L10 и L7/12, причем гены рибосомных 'белков расположены перед

Рис. 8. Функция

локальной сложности нуклеотидного состава для исследуемого

участка генома

М. даЩзерСгсит. В

нижней части рисунка' показано положение

кодируемых пептидов (заштрихованные прямоугольники), вероятных терминаторов (Т) и промоторов транскрипции . (направление , транскрипции указано стрелкой).' Зачерненными прямоугольниками на

первичной структуре Еров yai^isepc¿CIглJ выделены участки, отвечающие консервативным - в эволюции сегментам первичной структуры вторых по величине субъединиц РНК-полимераз из эу- и прокариоу. В средней части рисунка зачерненными прямоугольниками показаны области сходства последовательностей аминокислотных остатков ЙроВ из М.даШгерИсит и В.зиЬЬЩэ.

генами гроВ-гроС. При анализе последовательности нуклеотидов участка хромосомы М.даШверЬхсит, предшествующего гроВ-гроС, найдена .протяженная открытая .рамка считывания, кодирующая, полипептидную цепь из'276 аминокислотных остатков (01^276, рис. 8) с направлением трансляции, противоположным направлению трансляции гроВ и гроС. С использованием программы ТГАБТА первичную структуру 01^276 сопоставили с первичными структурами продуктов геноЕ, представленных в СепЬапк и не выявили гомологов.

В секвенирозанном фрагменте генома Н.даШэер^сша проведен также поиск потенциальных регуляторных элементов транскрипции и анализ функции локальной сложности нуклеотидного состава (ЬСС, рис. 8). Подобно обсуждавшейся выше последовательности нуклеотидов участка генома, содержащего ген топоизомеразы типа II, последовательность нуклеотидов участка генома, содержащего ген гроВ, характеризуется наличием глубоких минимумов функции • локальной • сложности' нуклеотидного состава.'Из рис. 8 видно, что три • самых глубоких минимума ЬСС обрамляют оба участка секвенированного фрагмента, содержащих открытые рамки трансляции, а проекции остальных значимых минимумов на карту гена бета-

субъединицы РНК-полимеразы хорошо ' вписываются между консервативными сегментами аминокислотной последовательности.

Можно предположить, что описанная корреляция имеет функциональное значение (хотя накопленных данных недостаточно для строгого статистического анализа).

Физическая карта генома Mycoplasma qallisepticum штамм А5969 и определение положения на ней некоторых генов.

ДНК микоплазм отличается высоким содержанием А-Тпар (АТ-состав хромосомой ДНК M.gallisepticum составляет 65%), поэтому расщейление ее - рестриктазами, узнаваемая последовательность которых состоит только из оснований G и С, приводит к образованию небольшого числа фрагментов. Для построения физической карты генома M.gallisepticum птаим А5969 гаг.В были выбраны рестриктазы Smal и Bgll, расцепляющие хромосому на 7 и 12 фрагментов соответственно.

Продукты гидролиза хромосомной ДНК размером 20 т.п.н. и более разделяли пульс-электрофорезом (рис. 9), а маленькие анализировали с помощью обычного

электрофореза в 0,7% агарозном геле. Фрагменты нумеровали в соответствии с длиной, используя буквы латинского алфавита. Размер хромосомы, 980Ш50 т.п.н., оценили, суммируя размеры индивидуальных фрагментов. Взаимное расположение фрагментов

установлено в три этапа:

1. На первом этапе устанавливали, какие Smal и Bgll фрагменты перекрываются (рис.10). Для этого продукты гидролиза хромосомной ДНК рестриктазами Smal и Bgll (п некоторых случаях .налтзклвали также прйдукты совместного гидролиза) разделяли с помощью пульс-электрофореза и. переносили • на Z-probe мембрану.. Мембрану гибридизовали с ДНК клона, случайно выбранного, из банка генов M.galliseptlcum AS969 var.B в векторе Л EMBL3A. Факт гибридизации

Рис. 9. Пульс-электрофорез продуктов гидролиза хромососной ДНК

М. даШгерЬхсит итамм А5969 уаг.В рестриктазами £та! и Вд11., Приведена

нумерация фрагментов с использованием

букв латинского

алфавита. Указаны размеры в т.п.н..

£Ут0— Вд1 С—

1 2 3

12 3

гт2Э~$ 1 ' гроВС 1 гтА 1 1 ЦОС 1 горд • \ ля/5 ' |/п)/<Г

о | с |Г-Р| А 1 в В

1 А * в 1 Е | с 1 О-Р м 3

I

30

I

74

I

60

I 1 . .

27 25 22 | 23

Рис. 10. Анализ взаимного положения больших 5та1 й ВдП фрагментов. I Определение перекрывающихся фрагментов гибридизацией с ДНК. клонов, случайно выбранных из банка генов. А - Саузерн-гибридизация хромосомной, ДНК обработанной рестриказами 5л?а1 (1> и ВдП - (2) с радиоактивномеченной ДНК клона МС25. Б -повторная гибридизация мембраны с хромосомной ДНК М.даШзерЫсит. II - Схема расположения фрагментов и обобщенные данные о гибридизации геномных клонов. Числа соответствуют номерам клонов, стрелки указывают на - гибридизуюшиеся фрагменты. Стрелки с прерывистой линией соответствуют гибридизации ДНК клонов с фрагментами, положение которых на схеме неоднозначно. ' Схема . расположения построена с учетом размеров фрагментов.

единичных 5/яа1 и ВдП фрагментов с ДНК одного и того же клона свидетельствует о их перекрывании на хромосоме. Для определения

I

взаимного расположения фрагментов использовались также- данные по гибридизации проб на уникальные гены и рибосомные РНК (рис. 10, Таблица 1). Использованный подход позволил определить положение всех фрагментов размером более 50 т.п.н., однако с его помощью нельзя ' определить взаимное расположение нескольких фрагментов, получающихся при гидролизе одной из рестриктаз, если они целиком умещаются внутри фрагмента, образованного другой рестриктазой: Бта! Е'-Г внутри ВдП. фрагмента В; ВдП О-Г внутри Эта! В (рис. 10, II) .

2. Для определения взаимного расположения фрагментов • £даа1 Е' и Р проводили полный гидролиз хромосомной ДНК ВдП, а затем частичный гидролиз рестриктазой 5гаа1. Продукты разделяли пульс-электрофорезом и переносили на мембрану. Мембрану гибридизовали с ' использованием в качестве пробы ДНК клона, содержащего участок

ТАБЛИЦА 1.

Положение генетических локусов на хромосоме М.даШзерЬхсит штамм

А5969.

Генетический локус Функция Положение на хромосоме ПроОа

Бта! | Ве11

rrnA, tuf нерасщепленныи оперон рРНК, ген фактора элонгации ЕЕ-Ти. А В

S10 rSecY-map - let -ггп23-5 аналог БЮ оперона рибосомных Оелков,ген Селка гомологичного Эес^, гены ыатионинаыинопелтидазы, лактатдегидрогеназы, соседствующие гены 23Б и 5Б рРНК.- С А -

rrnló изолированный ген IЬЗ рРНК Е Р -

rrn¡6' псевдоген 163 рРНК Е Н

rpoBC гены /2 и субъеяиниц РНК-пелимеразы А-1; В 4 т. п. н. 5а IV фрагмент MG47

loplJ гены А и В суОъеданпц топоизомеразы типа II А С 1,7 т•п/к. HinOlll фрагмент MG76

une оперон субъединиц АТФазы А Е рСЖ201

хромосомы, расположенный на одном из концов Вд11 В фрагмента (МЙ40, рис. 10, II) . Анализ картины гибридизации позволил однозначно определить порядок следования Эта! Е' и Г фраГ!*.:ТОВ (аналогичный прием использовался для ЗдИ V ч Р фрагментов) . 3. Анализ продуктов рестрикции в 0.7% агарозном геле пок,- ^эшает, что фрагментов меньше 20 т.п.н. при гидролизе хромосомной ДНК М.даШзерЫсит штамм А5969 таг.В рестриктазой Бта! че образуется, тогда как гидролиз рестриктазой ВдП приводит к образовании трех

фрагментов размером 5 т.п.н. - I, 1,6 т.п.н. - а и "0,7 т.п.н. -К. Фрагменты выделяли из геля и использовали в качестве пробы для скрининга банка генов. Анализ физических карт отобранных клонов позволил определить положение маленьких ВдН фрагментов . на хромосоме.

Окончательный вид физической карты приведен на рис. 11.

ВдН

Рис. 11. Физическая карта'хромосомы Мусор1азта даШверИситштамм А5969 иаг.В и положение на ней картированных генетических локусов.

Сравнение физических карт.

Сравнение картин гидролиза рестриктазами ВдН и БшаХ хромосомных ДНК штамма А5969 из коллекций проф. Клевена ^аг. К), Роттема (таг. Я) и нашей (уаг. в) показало.их отличие в случае ■уаг.К'от одинаковых между собой картин з случае var.Il и Уаг.В . Из анализа картины рестрикции следует (рис. 12, X) > что хромосома ' А5969 уаг.К больше по размеру. Отличаются фрагмент А ¿та! -

гидролизата и фрагменты В и С ВдН - гидролизата. Остальные %

•лВ у .К Э в Э В Э В

А кттаетвввзй!

•^зг.П

гроЗС 1 и ПС 1 ЮрИЗ ш I --

5пза| ) м А 1")

адп ( Б Г'е" 1 С /

/ / ! 1 1 : \ 1 \

5та\ 1 1 1 1 '

ВдП

Рис. 12. Сравнение хромосом вариантов штамма А5969. v.B - уаг.В, штамм из нашей коллекции; У.К - var.K, штамм из коллекции проф. Клевена; у.И - var.R., штамм из коллекции проф. Клезена. Хромосомная ДНК обработана рестриктазами 3 - ЗтаХ, В - Вд11. Стрелками показаны рестрикционные фрагменты var.B и даны их названия, а также соответствующие фрагменты var.K. Гель после пульс-электрофореза окрашен бромистым этидием. Справа приведены фрагменты физических карт хромосом т/аг.В ч \ггг.У. ~ отличающейся, области и положение на них лосб, использованных для гибоидизации.

фрагменты одинаковы по длине длп обеих хромосом (анализировали фрагменты размерзц более 30 т.п.н., рис. 12, Г). Сопоставлял изменения в картинах рестрикции var. К с физической картой чат. 3(рис. 11), можно предположить, что изменения затронули лбг области хромосомы: область пересечения 5,тлз1-А и Бд11-Ъ фрагментов, а также Ята1-&. и £д!1-С- фрагментов, причем фрагмент^' Вд11-Е, расположенный между Вд11-В и ЗдЛ-С фрагментами, остался незатронутым. Изменение фрагмента, соответствующего Вс '1-С, оказалось таким, что он совпал по длине с Вд11-А (рис 12) . Для проверки были проведены опыты по гибридизаций с использованием проб на соответствующие участки генома, подтвердившее чксказакное предположение.

Полученные результаты показывают, что события, пригляяпиг к значительным вариациям размера хромосомы, происходят в М.даШвсрСхсит даже у представителей одного и того же штамма',, причем в результате этих событий изменения могут затрагивать даже удаленные друг от друга участки хромосомы.

Ранее были опубликованы физические карты штаммов M.gallisepticum R и АТСС 19610, а также карта хромосомы штамма S6. Прямое сравнение физических карт оказывается невозможным, т. к. число мест узнавания рестриктазы SmaX оказалось разным на хромосомах штаммов R, АТСС 19610 - 8 и А5969, S6 - 7, а фрагменты, образующиеся при гидролизе ДНК'" разных штаммов, значительно отличаются по размеру. Сама по себе разница в длине фрагментов не представляется удивительной, учитывая приведенные в настоящей работе, а также опубликованные ранее данные о вариациях размера хромосомы M.gallisepticum. Установить соответствие между

с

фрагментами, анализируя взаимное расположение генов, также пока нельзя из-за небольшого числа картированных генов (в работе Тигса и Миниона определено положение только генов 16S рРНК).

Полученная в настоящей работе карта хромосомы M.gallisepticum штамм А5969 может служить 'основой для анализа природы гетерогенности .геномов . 'штаммов M.gallisepticum. Результаты проведенных опытов показывают, что более надежными, че»л, положения мест узнавания рестриктаз, отправными точками для сравнения хромосом разных штаммов являются положения охарактеризованных генов, либо протяженных уникальных фрагментов ДНК. Дальнейшее продвижение по пути' выяснения природа гетерогенности геномов требует определения положения большего числа генов на их хромосомах. ""

ВЫВОДЫ.

1. Определенны -последовательности нуклеотидов генов гроВ . ф— субъединица РНК-полимеразы), topIIB (АТР-связывающая субъединица топоизомеразы типа II).

2. Клонированы и охарактеризованы .участки генома Mycoplasma gallisepticum А5969 var.B, гибридизующиеся с рибосомными РНК. Определена последовательность нуклеотидов гхпЛ-оперона, а также других участков, .гибридизующихся с 16S рРНК. Показано, что:

- геном Mycoplasma gallisepticum А5969. var.B содержит два набора генов 16S, 23S и 5S рРНК;. •'

- гены первого набора расположены на хромоссме б классическом для ггл-оперонов эубакт;ркй порядке 16S-23S-5S, а во втором наборе ген

16S рРНК отделен от соседствующих генов 23S-5S рРНК на значительное расстояние;

- кроме-двух наборов-генов 16S. 23S и 5S-рРНК, геном-Mycoplasma' gallisepticuw А5969 var.B содержит укороченную копия гена (псевдоген) 16S рРНК. Первичные структуры псевдогена и нормального

изолированного гона 16S рРНК одинаковы, начиная с области, предшествующей кодирующей части (размер проанализированного

участка - 500 нуклестидов) и кончая 977 нуклеотидом кодирующей части 16S рРНК. .

3. Показано, что псевдоген 16S рРНК присутствует в геномах всех образцов штамма А5969 и отсутствует в других штаммах Myccplasxz gallisepticum. ' ■

4. Построена физическая карта хромосомы Mycoplasma gallisepticum А5969 var.B для рестриктаз Smal и Bgll. Картированы генетические локусы ггпА, ггп23-5, rrnl6, rrnl6'; опероны une, rpoBC, topll, S3,0; гены tuf, let, map, secY.

5. Проведено сравнение хромосом образцов штамма Mycoplasma

gallisepticum А5969. Показаны значительные вариации размера хромосомы у образцов штамма из разных коллекций, причем изменения локализованы не в одной области, а затрагивают удаленные участки хромосом.

6. Сконструированы- векторы рТМ18(19) для получения, последовательных делений а секвенируемсм фрагменте ДНК с использованием нуклеазы Ва131.

7. Предложен метод,выделения хромосомной ДНК микоплазм в диализном

пешке для анализа хромосомной ДНК методом пульс-электрофорез?

Список публикаций по теме диссертации.

1. A.Scamrov, R. Beabealashvilli Mycoplasma gallisepticum strain S6 genome contains three regions hybridizing with 16S rRK? arid tvo regions hybridizing with 235 and 5S rRNA ,7 FEBS Lett. -1991.-V.291.-P.71-74.

2. А.В.Скамров, Я.Класоза, M Л. Годъдман, Е.П.Дег.jBep, И.Н.Рыбалкин, А.А. Кжаков, Р.Ш.ВиОилишвили Взаимное расположение

■ оперона рРНК и гена tuf в геноме Mycoplasma galliseptic-.:я II Молекулярная биология.- 1991.-Т.25.-С.1643-1649.

3. А.В.Скамров, Р.Ш.Бибилашвили Идентификация итамма Mycoplasma с помощью фингерпринтирования рестриктазных гидролизатов хромосомной ДНК П Молекулярная биология - 1994.-Т.28.-С.1293-1298.

4. A.Skamrov, M.Goldman, Ja. Klasova, R.Beabealashvilli Mycoplasma gallisepticum* 16S rRNA genes. // FEMS Microbiol. Lett..- 1995,-V.128.-P.321-325.

5. А.В.Скамров, Е.С.Феоктистова, Р.Ш.Бибилашвили Клонирование и анализ последовательности нуклеотидов участка генома Mycoplasma gallisepticum, содержащего ген АТР-связываюздей субъеденицы топоизомеразы типа II (topIIB) // Молекулярная биология - 1995.-Т.29.-С.'1293-1298. ■ ■ -

6. А.В.Скамров, Т.А.Розовская, М.А. Гольдман, Е.С.Феоктистова, Р.Ш:Бибилашвили Определение последовательности нуклеотидов участка генома Mycoplasma gallisepticum, содержащего ген гроВ с использованием Bal-pTM методики получения последовательных делеций секвенируемого фрагмента // Молекулярная биология - 1996.-Т.30.-С.1-15.

7. А.В.Скамров, Р.Ш.Бибилашвили Физическая карта генома Mycoplasma gallisepticum штамм А5969 и определение положения на ней некоторых генов. // Молекулярная биология - 1996.-Т.30. (принята к печати).