Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перестройки в геноме Mycoplasma gallisepticum

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Перестройки в геноме Mycoplasma gallisepticum"

На правах рукописи

ФЕОКТИСТОВА ЕВГЕНИЯ СЕРГЕЕВНА

ПЕРЕСТРОЙКИ В ГЕНОМЕ MYCOPLASMA GALLISEPTICUM

Специальность 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва 2007

003063087

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Института экспериментальной кардиологии Федерального Государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию, г Москва

Научный руководитель

Кандидат биологических наук, А. В. Скамров. Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор, В С Прасолов кандидат биологических наук, М О Агафонов

Ведущая организация Российский Государственный медицинский университет

Защита состоится 24 мая 2007 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208 073 02 в ФГУ РКНПК Росздрава по адресу 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15 А

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ РКНПК Росздрава

Автореферат разослан апреля 2007 года Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. На рубеже XX—XXI веков стали активно анализироваться не только отдельные гены, но и полные геномы организмов Сравнение последовательностей нуклеотидов целых геномов дало возможность поставить вопросы о минимальном числе генов, достаточном для жизнедеятельности клетки Подсчет, проведенный с использованием разных предположений, дает оценку числа минимального набора в 250-350 генов

Микоплазмы представляют собой класс объектов, чрезвычайно привлекательный для молекулярной биологии, поскольку существует возможность полной характеристики наиболее просто организованной самореплицирующейся клетки Число генов в геноме микоплазм (примерно 500) близко к минимальному набору самовоспроизводящейся клетки

При анализе полных геномов обнаруживаются новые факты, связанные с различными перестройками хромосомы В частности, при изучении порядка следования генов в разных организмах, выяснилось, что порядок этот неконсервативен Более пристальное изучение данной проблемы показало, что на коротких расстояниях, как правило, порядок генов сохраняется, то есть более консервативным является ближний порядок генов, причем длина консервативных участков в большинстве случаев определяется размером оперона Таким образом, геном представляет собой динамическую структуру, в которой происходит обмен частями, и единицей обмена чаще всего является оперон При анализе границ консервативных участков было показано, что большинство этих перестроек связано с перемещениями мобильных элементов или является результатом гомологичной рекомбинации

Некоторые особенности строения генома остаются пока недоступны для понимания, поскольку непонятны механизмы их возникновения В связи с этим возникают задачи, имеющие отношение не столько к структурному анализу генома, сколько к пониманию механизмов процессов, лежащих в основе формирования, поддержания и изменчивости этой структуры

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение процессов, приводящих к крупным изменениям хромосомы

Ранее в нашей лаборатории обнаружен ряд особенностей в геномной организации Mycoplasma gallisepticum Было показано, что варианты штамма А5969 из разных коллекций могут значительно отличаться по размеру хромосомы. Кроме того, в геноме штамма А5969 была обнаружена уникальная особенность, а именно число генов 16S рРНК оказалось не равным числу генов 23S и 5S рРНК Во всех исследованных до настоящего времени бактериях количество генов 16S, 23S и 5S одинаково Дальнейшие исследования показали, что дополнительная копия 16S рРНК представляет собой не полноценный ген, а укороченную копию Кроме того, два набора генов рРНК отличаются по организации гены первого набора рибосомных РНК собраны в «классический» для прокариот оперон с порядком генов 16S - 23 S - 5S рРНК, во втором наборе ген 16S рРНК отделен от соседствующих генов 23S - 5S рРНК на значительное расстояние Все это говорит о том, что у М gallisepticum произошли крупные изменения в структуре хромосомы

В связи с этим в настоящей работе были поставлены следующие задачи

1 - картировать участки ДНК М gallisepticum. штамм А5969, содержащие расщепленный оперон рибосомных РНК и укороченный ген 16S рРНК,

2 - определить последовательность нуклеотидов этих участков, а также окружающих их областей хромосомы;

3— изучить состав и расположение генов, а также особенности организации кластеров генов в картированных участках,

4 - выяснить устройство длинного прямого повтора в М gallisepticum штамм А5969

Научная новизна и практическая значимость работы Пре,пложена модель, объясняющая происхождение двух крупных перестроек, обнаруженных в геноме М gallisepticum Первая перестройка привела к расщеплению оперона рибосомных РНК и кластера S10, в результате чего один из двух оперонов рибосомных РНК М gallisepticum расщепился и ген 16S рРНК отделился от

генов 238-58 рРНК Кроме того, эта перестройка привела к образованию нового оперона генов рибосомных белков т/А-грВб-грз 13 -гроА-гр1 17-/7« 16-1ппО-грИ9 Вторая перестройка привела к дупликации протяженного участка ДНК

Детально описаны необычные по структуре и составу консервативные в эволюции кластеры генов, что расширяет наши знания о возможном разнообразии геномов и способах размещения генов Предложен способ анализа организации транскрипции протяженных кластеров генов с помощью ОТ-ПЦР

Определена организация кластера генов ЖуА (тимидилат-синтетазы) в М galllseptlcum штамм А5969 Показано, что один из генов этого кластера кодирует составной полипептид — дигидрофолат-редуктазу-дезоксицитидилат-дезаминазу

Охарактеризованные в работе изменения в структуре генома М galllseptlcum позволяют разработать метод ДНК-диагностики, различающий штаммы этой микоплазмы между собой

Изучение геномных перестроек на примере высших организмов сопряжено со множеством технических трудностей Микоплазмы являются удобным объектом молекулярно-генетического анализа из-за ограниченного набора генов Поэтому использование микоплазм в качестве модельного организма значительно облегчит изучение общих механизмов, обеспечивающих геномные перестройки, а также позволит выявить механизмы генетической рекомбинации, которые не поддаются анализу в более "сложных" организмах

Публикации По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 2 тезисных сообщения

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы» Работа изложена на 110 страницах, содержит 39 рисунков, 6 таблиц и список литературы, включающий 117 ссылок

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве основного объекта исследований использовали штамм М galhsepticum А5969, первоначально выделенный Ван-Ройкелем (University of Massachusettes, Amherst, MA, США) из трахеи цыпленка Образцы штамма были получены от С Н Борхсениуса - вар В, Ш Роттема (The Hebrew University -Hadassah Medical School, Израиль) — вар R и С X Клевена (University of Georgia, США) - вар К. Другие штаммы М galhsepticum (S6, К503-904С, К781 TL, К703) предоставленны проф С Клевеном (University of Georgia, США)

В ходе работы М galhsepticum культивировали на твердых и жидких средах, применяя стандартные методики культивирования микоплазм

В работе использованы стандартные методы молекулярной биологии, описанные в руководстве (Sambrook et al, 1989)

Высокомолекулярную хромосомную ДНК для анализа методом пульс-электрофореза получали в агарозных блоках (Cantor et al, 1988), а также в диализном мешке (Скамров et al, 1994) Делеционные производные фрагментов получали при помощи нуклеазы Па1Ъ\ в векторе рТМ18/19 Определение последовательности нуклеотидов проводили методом Сэнгера с использованием терминирующих аналогов ddNTP(3'F) (Квасюк et al, 1989) Для анализа последовательностей использовали пакеты программ GCG, PC Gene, PredictProtein, Sequm и банки данных GenBank, Pfam, Swiss-Prot, PROSITE Тотальную РНК микоплазм выделяли, используя стандартный протокол Qiagen Rneasy (Clontech)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Взаимное расположение rrslé и ml 6' на хромосоме. Из проведенных ранее исследований известно, что изолированный ген 16S рРНК (rrs 16) и псевдоген (rrs 16') находятся друг от друга на расстоянии, не превышающем 30т пн Для построения рестриктной карты фрагмента хромосомы, содержащего локусы rrs 16 и rrs 16% из геномной клонотеки М galhsepticum штамм А5969 вар В в векторе X EMBL3A были отобраны 5 Х-клонов при помощи гибридизации с зондом на 16S рРНК - AMG 10, XMG66, XMG92,

XMG 64 и XMG 53 (рис 1) Затем для каждого клона была построена физическая карта по рестриктазам ЕсоШ и HindlU Рестриктная карта фрагмента хромосомы М gallisepticum получена суперпозицией рестриктных карт ),-клонов (рис 1) Дополнительным подтверждением верности предложенной рестриктной карты явился анализ двух перекрывающихся между собой космидных клонов из клонотеки М gallisepticum штамм А5969 в векторе pcosRW2 — cos35 и cos92, покрывающих тот же участок хромосомы

cos 35

cos 92_

rrs 16 правое плечо _ml6' левое плечо ЕсоШ \2.1\\24\11\ 85 ¡2 5|f 6|Т 2| 9» \2 6\1 2\3 9 \4 1 \ 6 0 f

НтШ | 75 М 42 |Т ДI 43 | 40 4 2 |Т5| 43 |

MG1Q___ MG64

MG66_ _ MG92

MG53-

секвенированный участок (GenBank L35043)

Рис. 1. Рестриктная карта областей, гибридизующихся с 16S рРНК Цифрами обозначены размеры фрагментов ДНК в т п н Длины фрагментов изображены без соблюдения масштаба MG - клоны из космидной клонотеки, cos — клоны из клонотеки фага X Линия внизу показывает область, где определяли последовательность нуклеотидов (44930 п н)

Анализ рестриктной карты показал, что ЕсоШ фрагменты 2,5, 1,6 и 1,2 тп н , а также НтШ\ фрагменты 1,2, 4,2, 1,5 и 4,3 тпн повторяются два раза внутри анализируемой области хромосомы, что свидетельствует о наличии протяженного повтора внутри области Порядок следования фрагментов говорит о том, что повтор является прямым, то есть повторяющиеся последовательности следуют друг за другом в конфигурации «голова к хвосту» Левая и правая части повтора названы соответственно левым и правым плечами повтора

Сложность в секвенировании повторяющегося участка заключается в том, что перечисленные выше фрагменты, относящиеся к разным плечам повтора, одинаковы по длине и последовательности нуклеотидов, и необходимо было убедиться в принадлежности фрагмента правому либо левому плечу Для этого EcoRI-фрагменты 2,5, 1,6, 1,2 т п н из левого плеча повтора субклонировали из

XMG 64, аналогичные по длине фрагменты из правого плеча субклонировали из XMG 66, а EcoRI-фрагмент 1,2 т.п н - из XMG 53. #ш<Я11-фрагменты левого плеча 1,2, 4,2, 1,5; 4,3 тпн субклонировали из XMG 64, а аналогичные фрагменты правого плеча - из X.MG 53 и IMG 66 (рис 1) Рестриктные фрагменты субклонировали в плазмидный вектор рТМ18/19, получали делеционные производные и определяли их последовательность нуклеотидов

2. Анализ последовательности пгуклеотидов повтора. Для картирования генов в нуклеотидной последовательности искали открытые рамки трансляции (ОРТ), кодирующие полипептиды длиннее 30 аминокислотных остатков (Seqiun) Выписанные ОРТ идентифицировали по сходству первичных структур продукта с использованием пакета программ PredictProtein Окончательно предсказанные белки сравнивали с базой данных Pfam Результаты анализа приведены в таблице 1

Таблица 1. Открытые рамки трансляции в области длинного прямого повтора М ^аИкерИсит штамм А5969

Координаты Длина Pfam Ген Продукт гею

269-415 48 PF00471 10 гр/33 белок 506-субьед рибосомы 1ЛЗ

432-806 124 PF00584 11 secE транслоказа БесЕ

829-1632 267 PF023579 nusG антитермтгатор траискршции Ми^С

1514-33099 длшшый прямой повтор (LaDR)

1514-17292 левое плечо ЬаОЯ

1657-2217 186 ORF 186 L полппешпд с неизв функцией*

2249-3058 269 ORF269 L полипептид с неизв функцией*

2964-3692 242 PF025275 gidB L меттгргисфераза В

3685-5520 611 PF01134 12 gidA L метилтргнсфераза А

5771-6259 162 PF07672 3 ORF 162 транспортный белок МРБ **

6369-7349 326 PF076723 ORF326 транспортный белок МББ **

7414-8028 204 РГ01327 10 def L деформилаза

8078-8665 195 PF00625 10 gmk L гуанилаткиназа

8665-9459 264 PF00481.12 ptsl протеинбосфатаза

9452-10714 420 PF00069.15 spsl серин/треошш протешпсиназа

10714-11538 274 PF03193 6 ORF274 L АТР/ОТР-связывагощий белок

11569-12855 428 PF003428 Pgi L гшокозо-6-фосфат-изомераза

12855-13502 215 PF008349 rpe L рибулозо-фосфат-3-изомераза

13633-15792 719 PF01131 10 topA L ДНК топоизомераза I

15848-16150 100 PF0008510 Irx L тиоредокснн

16316-17292 rrs псевдоген 168 рРНК

17293-17322 спейсер

Таблица 1 (продолжение).

Координаты Длина Pfam Ген Ироду кт гена

17323-33099 правое плечо LaDR

17466-18026 186 ORT 186 R полипептид с неизв функцией*

18058-18867 269 ORF269 R полипептид с неизв функцией*

18773-19501 242 PF025275 gid.В R метилтрансфераза В

19494-21329 611 PF0I134 12 ZidA R метшггрансфераза А

21580-23157 525 PF076723 ORF525 транспортный белок MFS **

23222-23836 204 PF01327 10 def R деформилаза

23886-24473 195 PF00625 10 %mk R гуанилаткиназа

24473-25267 264 PF00481 12 ptsl протеинфосфатаза

25260-26522 420 РГ00069 15 spsl серин/треонин протешгкиназа

26522-27346 274 PF03193 6 ORF274 R ATP/GTP-связывагащий белок

27377-28663 428 PF00342 8 pgi R глкжозо-6-фосфат-изомераза

28663-29310 215 PF00834 9 rpe R рибулоэо-фосфат-З-изомераза

29441-31600 719 PF01131 10 top К R ДНК топоизомераза I

31656-31958 100 PF00085 10 trx R тиоредоксин

32123-33641 /TS 16 16SpPHK

34060-34272 70 PF01176 8 infh фактор инициации трансляции IF1

34286-34399 37 PF004449 гр13в 505-рибосомный белок L36

34403-34777 124 PF00416 12 rpsli ЗОБ-рибосомный белок S13

34787-35152 121 PF004118 rps\ 1 308-рибосомный белок SI 1

35170-36147 325 PF01000 16 rpoA ДНК-завис -РНК-полимераза, о-цепь

36156-36629 157 PF01196 9 rpltf 50S рибосомный белок L17

36704-36946 80 PF008869 rps\6 30S рибосомный белок S16

36956-37660 234 PF01746 11 trmD tRNA (guanme-Nl) метилтрансфераза

37665-38033 122 PF01245 9 rpl 19 50S-pn6ocoMiibiñ белок L19

38063-39349 428 PF025885 ORF428 консерв полипептид с неш ф ***

39363-40186 274 PF01926 12 vfeF GTPase

40216-41193 325 PF01515 9 pta фосфат-анстил/бутарил трансфераза

41197-42069 290 PF08282 1 ORF290 белок семейства гидродаз

42055-42303 82 полипептид снеизв функцией*

42404-43348 314 PF00561 10 mhpC гидролаза/ацетилтрансфераза

43298-44686 462 PF04095 5 ORF462 NAPRTase

44683-44930 82 asnA лигаза

Принятые обозначения

Pfam - регистрационный номер по базе данных Pfam, * —потипептид с неизвестной функцией, то есть для данного полипептида не обнаружено гомологов в других организмах, **— ORF525 в левом плече повтора, кодирующий транспортный белок семейства MFS, специфичный для микоплазм, прерывается иясерцией Т в позиции 486-487 кодирующгй последовательности, MFS - Major Facilitare Superfamily, *** — консервативный полипептид с неизвестной функцией подобный MPN6572 М pneumoniae

Общая длина секвенированного участка составляет 44930 и н (последовательность нуклеотидов депонирована в GenBank под номером L35043) В исследованном участке подтверждено наличие rrsl6 и rrs\f>\ обнаружен длинный прямой повтор, а также картированы открытые рамки трансляции

Длина повтора составляет 31586 пн. Две части повтора (правое и левое плечи) расположены друг за другом в конфигурации «голова к хвосту» и разделены коротким (30 пн.) фрагментом ДНК (спейсером) Каждое плечо повтора составляет 15778 п н в длину Повтор начинается внутри кодирующей части гена nusG Далее каждое плечо содержит 15 открытых рамок считывания (табл 1) На конце каждого плеча повтора расположен ген 16S рРНК, причем правое плечо содержит полную кодирующую последовательность 16S рРНК, а в левом плече эта последовательность обрывается на 977 нуклеотиде, т е левое плечо повтора заканчивается псевдогеном. Остальные гены, входящие в состав повтора, не содержат мутаций, влияющих на аминокислотный состав продукта Примечательно, что продукты генов, составляющих повтор, не объединены в один метаболический, либо сигнальный, либо регуляторный путь

3. Спейсер между правым и левым плечами повтора. Правое и левое плечи повтора разделены спейсером длиной 30 п н, который уникален для повтора При помощи программы BLAST сравнили спейсер с представленными в GenBank последовательностями нуклеотидов и обнаружили, что в М gallisepticum А5969 есть еще одна область, где встречается последовательность спейсера, а именно ген rplR. из кластера рибосомных белков S10

Для того, чтобы проверить, не встречается ли данный фрагмент в геноме

М. gallisepticum А5969 еще раз, а также определить, сколько раз эта

последовательность встречается в других штаммах этой микоплазмы, были

проведены опыты по Саузерн-гибридизации ДНК имеющегося набора

штаммов и вариантов штамма А5969 М gallisepticum (список исследованных

8

штаммов приведен в подписи к рис 2) обрабатывали рестриктазой Нт&II Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили на мембрану и гибридизовали с меченым олигонуклеотидом, покрывающим часть последовательности ДНК спейсера

4.0 1.6

12 3 4 5 6 7

О о

С^У «£*»

Рис. 2 Определение числа участков генома, гиб-ридизующихся с участком гена гр!К в разных штаммах М galllseptlcum Результаты Саузерн-гибридизации хромосомной ДНК штаммов А5969 вар В (1), Б6 (2), А5969 вар Я (3), А5969 вар К (4), К503-904С (5), К781 Л (6), К703 (7) с фрагментом ДНК спейсера Длины фрагментов приведены в т п н

Как видно из рисунка, две полосы появляются при гибридизации олигонуклеотида у всех вариантов штамма А5969 (рис 2, дорожки 1, 3, 4), в ДНК других штаммов выявляется одна полоса (рис 2, дорожки 2, 5, б, 7) Фрагмент длиной 4тпн содержит спейсер, фрагмент длиной 1,6тпн содержит ген рибосомного белка гр!К В штаммах Б6, К781 Б1, К703 (рис 2, дорожки 2, 6, 7) видна полоса, которая соответствует 1,6 т п н -НгпсШ.1-фрагменту, содержащему ген гр!К в штамме А5969 Фрагмент, появляющийся при гибридизации ДНК штамма К503-904С (рис 2, дорожка 5), имеет размер около 4,0 тпн, но меньше, чем длина близкого по длине гибридизующегося фрагмента в вариантах штамма А5969 Поскольку в штамме А5969 рядом с Яш^Ш-фрагментом 1,6тпн, содержащим ген гр1К, находится НтсйII-фрагмент длиной 2,3 тпн, можно предпоюжить, что в штамме К503-904С произошла мутация в месте узнавания рестриктазы НтсП II, сайт инактивировался, и образовался более длинный фрагмент (1,6 + 2,3 = 3 9 т п н ), что мы и наблюдаем при гибридизации

Следовательно, у всех вариантов штамма А5969 последовательность спейсера повторяется два раза в геноме один раз - между плечами повтора, второй - в гене гр19^ тогда как для других штаммов эта последовательность уникальна и расположена в гене гр!К

4. Дот-плот анализ. Большинство известных на сегодняшний день в разных организмах перестроек связаны либо с гомологичной рекомбинацией между протяженными участками ДНК, либо с' перемещением транспозоноподобных элементов Во всех случаях на краях фрагментов, изменивших свое местоположение, обнаружены «следы» перемещений либо прямые, либо инвертированные повторы разной длины

Поэтому было проведено сравнение последовательностей нуклеотидов участков ДНК, окаймляющих повтор Были выбраны три фрагмента, один из которых покрывал начало левого плеча повтора, второй захватывал конец левого плеча, спейсер и начало правого плеча, а третий включал конец правого плеча(рис 3)

в

1

в ,,

В

\ /

, \ /

/ У ' ' /

/ У у \

лев спейсер прав плечо плечо

А

уч ДНК до левого плеча

левое плечо

Рис. 3. Сравнение последовательности нуклеотидов методом дот-плот анализа. 1 — поиск прямых повторов внутри участка В 2 — поиск обратных повторов между фрагментами А и В

Последовательности нуклеотидов этих фрагментов сравнивали между

собой, а также проводили пои«: прямых повторов и самокомплементарных

последовательностей внутри каждого из участков В качестве примера на

рисунке 3 изображен результат поиска прямых повторов внутри фрагмента А и

поиск обратных повторов (или комплементарных участков) между

фрагментами А и В Как видно из рисунка, наблюдается ряд коротких повторов,

равномерно распределенных по длине сравниваемых фрагментов

Примечательно, что проведенный анализ не выявил повторяющихся участков

10

на границах плечей повтора (пограничные участки показаны тонкими вертикальными и горизонтальными линиями) Кроме того, участки ДНК, граничащие с повтором, не имеют существенных отличий по количеству коротких повторов от соседних участков ДНК Сходные картины наблюдаются при сравнении всех трех фрагментов как между собой, так и внутри каждого из фрагментов

Таким образом, в результате проведенных исследований в М gallisepticum А5969 был обнаружен длинный прямой повтор, отличительные особенности которого

- длина плеча повтора составляет 15778 п н ;

- плечи повтора разделены коротким спейсером размером 30 п и, последовательность нуклеотидов спейсера одинакова с последовательностью нуклеотидов гена rplR из кластера S10,

- внутри повтора картировано 15 открытых рамок считывания, из которых для 12 функция определена, для остальных — не определена, все гены с известной функцией являются полноценными, картированные гены не объединены в один метаболический, либо сигнальный, либо регуляторный путь, то есть относятся к разным функциональным группам,

- на границах плечей повтора не обнаружено ни прямых, ни обратных повторяющихся последовательностей

5. Анализ участка ДНК, расположенного за нормальным изолированным геном 16S рРНК. На следующем этапе был проанализирован участок, расположенный за повтором Гены mfA-}pB6-rps\?>-rpoA-i-pl\7, расположенные у М gallisepticum непосредственно после гена 16S рРНК (рис 4), у близкородственных микоплазм (А/ gemtalium, Ureaplasma urealyticum, М pneumoniae) и у Bacillus subtilis являются концевой частью кластера рибосомных белков S10 Следующие за ними гены rps\6~trmD-rpI[9 у М gemtalium, U urealyticum и В subtilis формируют отдельный кластер, не связанный ни с рибосомными РНК, ни с S10-кластером

Таким образом, в М gallisepticum обнаружен новый кластер рибосомных белков infA-rpB6-rpsl3-rpoA-rpll-rpsl6-trmD-rpll9 (рис 4) Надо отметить, что относительный порядок генов в обоих кластерах не изменился

Расстояние между кодирующими последовательностями внутри каждого кластера составляет 4-18 пн Относительно большое расстояние (74пн) между гр1П и rps\6 может свидетельствовать о независимой транскрипции концевой части кластера рибосомных белков S10 и кластера trmD

грВв

topA trx гм16 /и/А га? 13 rp.il 1 rpoA rplYJ rps\6 trmD

J JJ JJ J J J

Ol 02 03 04 05 Об 07 08

Рис. 4. ОТ-ПЦР анализ кластера рибосомных белков infA-rpl36-rpsl3-rpoA-rpl\7-rps\6-trniD-rpl\9 Схема расположения генов вокруг участка 16S рРНК из расщепленного оперона на хромосоме М gallisepticum А5969 Стрелками показано направление транскрипции Мишени для олиго-пуклеотидов (01-08), которые использовались в качестве праймеров для синтеза кДНК, показаны под схемой хромосомного региона Под кДНК -праймерами показано положение ампликонов гро, rpol и trm Результаты ОТ-ПЦР показаны на фотографии Пары праймеров, использованные в ПЦР, показаны справа М -маркер 100 п н 00 - синтез кДНК в отсутствии экзогенных праймеров Дорожки 00-08 ОТ-ПЦР анализ РНК М gallisepticum штамм А5969

Для того, чтобы выяснить, транскрибируется ли новый кластер

рибосомных белков как оперон, был проведен ОТ-ПЦР-анализ Используя

набор антисмысловых олигонуклеотидов (рис 4, 01-08) к РНК М gallisepticum

в качестве праймеров, а РНК М gallisepticum в качестве матрицы, был

12

гро rpol trm

231н 304н. ЗОЗн

М 00 01 02 ОЗ 04 05 Об 07 08

mm 400

200

400 200

егнк»«»» — — ГР° ~ rpol

400 trm

200

синтезирован набор кДНК Полученная кДНК использовалась как матрица в ПЦР с тремя парами праймеров, названных rpo-, rpol- и trm-ампликоны (рис 4). Эти ампликоны использовались для выявления кДНК

Как и ожидалось, фрагменты не амплифицировались, если кДНК, используемая как матрица, была синтезирована с праймеров, расположенных левее тестируемого ампликона (рис 4, гро 01-03, rpol'01-05, trm 01-06) При использовании праймеров, расположенных правее соответствующего ампликона, получался ПЦР-продукт (гро 04-08, rpol 06-08, trm 07-08)

В случае использования кДНК, синтезированной с 07 и 08, полоса, соответствующая ампликону, появлялась всегда (дорожки 07 и 08) Это свидетельствует о существовании единой молекулы РНК для генов infA-rpB6-rps 13-rpoA-rpl\ 1-rps 16-trmD-rpl 19, то есть все гены, входящие в новый кластер рибосомных белков, транскрибируются как оперон Причем проведенный ОТ-ПЦР-анализ не описывает гены, следующие за rpll9 Т е. возможно, что гены, расположенные правее rpl 19 и не вошедшие в наш анализ, транскрибируются вместе с кластером infA-rpl\9

6. Анализ последовательности нуклеотидов участка хромосомы М. Kallisepticum А5969, содержащего локусы f/iyA-wrrfFEI, S10 и ггп23-5.

На рисунке 5 приведена физическая карта участка хромосомы, содержащего локусы тг23-5, S10, thyA-nrdFEl Фрагменты космид клонировали, секвенировали и анализировали, как описано выше В результате выявлено 34 предполагаемых гена, которые приведены в таблице 2

Idh

th\'A _^ тар

nrdV dhfr-dcdh Ч> "dk

nrdl f- кластер S10 secY ,,

nrdE <- -» ^

1« 1 42 1 34 И 0| 22 | 15 Ш I

.1

cos 100

GenBank AF036708, AF152114

Рпс. 5. Физическая карта участка хромосомы М £а1Ыер11сит штамм А5969, содержащего локусы гЛуА-шгД-Е1,810 и пп2Ъ-5 Показаны места узнавания рестриктазы £соШ, цифры соответствуют длинам фрагменшв ДНК в т п и Вверху обозначены картированные генетические локусы Внизу показано положение фрагментов хромосомы, содержащихся в космидах соя100 и со.я102 Стрелками указано направление транскрипции генов

Таблица 2 Открытые рамки трансляции в участке хромосомы М gallisepticum штамм А5969 (GenBank AF036708, AF152114)

Координаты [iiiniajPfam Ген Продукт гена

лг</Е-кластер

32-2200 722 PF02867 nrdV. большая субъед рибон^'клеотид-редуктазы

2297-2752 151 PF07972 nrdl Nrdl

2755-3774 339 PF00268 nrdF малая субьединица рибонуклеотид-редуктазы

4320-5189 289 PF00303 thyA тимидилат-синтетаза

5189-6142 317 PF00186 dhfr дигидрофолат-реду ктаза

PF00383 dedh дезоксщитидилат-дезамнназа

SlO-кластер

791-1672 293 - ORF293

1925-2290 121 PF00338 12 /ртЮ S10

2322-3032 236 PF00297 11 rpB L3

3059-3688 209 PF00573 11 rp!4 L4

3691-4017 108 РГ00276 10 rpm L23

4064-4915 283 PF039477 грП L2

4936-5199 87 PF00203 10 rps\9 S19

5210-5644 144 PF002378 ip!22 L22

5647-6438 263 IT00189 9 rps3 S3

6444-6821 125 РГ002528 rpl\6 L16

683 7-7298 153 PF00831 12 rpQ9 L29

7304-7561 85 PF003669 rps\l S17

7589-7963 124 PF002389 rpllA L14

7974-8303 109 PF00467 18 rPm L24

8303-8860 185 PF00673 10 rpl5 L5

8853-9038 61 РГ00253 10 ?pil4 S14

9062-9463 133 PF00410 8 rps% S8

9482-10033 183 РГ00347 13 rp\G L6

10040-10399 119 PF00861 12 rpm L18

10413-11078 221 PF03719 4 rps5 S5

11094-11537 147 PF013058 rpl 15 L15

11550-13046 498 PF00344 10 secY SecY

13040-13684 214 PF00406 11 adk аденилаткнназа

13695-14447 250 PF00557 13 map метионннаминопептидаза

14629-15600 323 PF00056 12 Idh лактатдегидрогеназа

ггп23-5

¡6058-18959 rrl 23S рРНК

19036-19148 rrf 5S рРНК

19160-19672 171 - ORT171

19287-19679 129 - ORF129

Принятые обозначения

Длина - размер полипегггидной цепи (ко'ияеетво аминокислотных остатков), * - ORF293 кодирует полипептид, первичная структура которого обладает сходством с белками А/ gemtalmm (MG 135) и Л/ pneumoniae (А65 ORT285), **-гомологов ORF 129/ORT171 не выявлено

Кластер генов рибосомных белков S10 и локус wi23-5. Исследованный фрагмент хромосомы М galhsepticum штамм А5969 содержит участки, кодирующие полноценные 23S рРНК (2902 н) и 5S рРНК (102 н), разделенные спейсером из 74 нуклеотидов, и не содержит гена 16S рРНК

Исследуя участок, содержащий локус ггп23-5, мы обнаружили необычное ращепление кластера генов рибосомных белков S10 Мы сравнили порядок генов в разных бактериях (рис 6) и оказалось, что порядок следования генов от rps 10 до тар одинаков у четырех эубактерий (М galhsepticum, М gemtalium, М pneumoniae и В subtilis), за исключением того, что у микоплазм нет гена г/)/30 Однако М galhsepticum отличается от М gemtalium, М pneumoniae и В subtilis отсутствием генов infA-rpl36-rpsl3-rpoA-rpll7 непосредственно за геном тар (рис 6), которые находятся за изолированным геном 16S рРНК, как описано в разделе 5

М gemtalium S10 L3 L4 L23 L2 S19 L22 S3 L16 L29 S17 L14 L24 L5 S14 S8 М pneumoniae

М galhsepticum S10 L3 L4 L23 L2 S19L22 S3 L16 L29 S17 L14 L24 L5 S14 S8 А5969

Рис 6. Порядок генов в оперонах 810 родственных бактерий Гены обозначены по названию белкового продукта. №1 - ген фактора инициации трансляции, а - ген а-субъединицы РНК-полимеразы

Взаимное расположение ОРТ позволяет предположить, что в состав кластера 810 кроме генов рибосомных белков входят гены транспортного белка 8есУ, аденилаткиназы и метионинаминопептидазы Данное предположение основано на небольшом расстоянии между кодирующими фрагментами соседствующих генов грПБ-яссУ-асОс-тар (13-9-10 п н., соответственно), тогда

В subtilis

В subtilis М gemtalium М pneumoniae

(L30)

L6L18S5 L15 SecY Adk Map IF1 L36 Sl3aL17

M galhsepticum L6 LI 8 S5 L15 SecY Adk Map A5969

Ldh ТТИ23-5

как ген тар удален от leih на 181 п н и, более того, межгенный участок тар -Idh содержит терминатороподобную структуру Т е , ген лактатдегидрогеназы, как и в других эубактериях, по-видимому, представляет собой отдельную транскрипционную единицу

Локус thyA-nrdFlE. Гены nrdE и nrdF кодируют а- и ß-субъгдиницы рибонуклеотид-дифосфат-редуктазы класса lb и вместе с геном nrdl формируют «микоплазма-подобный» локус nrdFlE (рис 7) Такое взаимное расположение генов (nrdF-nrdl-nrdE) характерно для многих микоплазм, в отличие от порядка (nrdR)-nrd\-nrdE-nrdF, который наблюдается в других бактериях (Е coli, Lactococcus lactis и В subtilis)

В М genitahum и М pneumoniae перед локусом nrdFlЕ расположены гены thyA-dhfr (тимидилат-синтетазы - дигидрофолат-редуктазы), причем все гены кластера thyA-dhfr транскрибируются в одном направлении (рис 7) Анализ участка М gallisepticum, предшествующего nrdF\H, показал существование двух открытых рамок считывания длиной 869 и 953 п н По анализу гомологий первый ген - это тимидилат-синтетаза (thy А) Вторая рамка кодирует составной белок длиной 317 а к остатков N-концевая часть его сходна с дигидрофолат-редуктазой (около 160 а к остатков), а С-концевая часть похожа на дезоксицитидилат-дезаминазу (140 а к остатков) катализирующую дезаминирование dCMP до dUMP и обеспечивающую субстрат для тимидилат-синтетазы Отсутствие стоп-кодона между двумя частями составного белка показано разными способами на наборе штаммов М gallisepticum

Рис 7. Взаимное расположение генов dcdA, dhfr, thy А и кластера /¡rtfFIE на хромосомах микоплазм

М gallisepticum М synoviae М pulmonis

М mobile

М gemtalium М pneumonia

dcdA/dhfr thy А игоИЕ

dcdA dhfr thy A nrdF IE i--►

rr thvA nn

dhfr thy A wt/FIE dhfr thy A nrd^ IE

^cdA ¡IcdA

Надо отметить, что ближайшие родственники М. gallisepticum (М. genitalium и М. pneumoniae) вообще не кодируют дезоксицитидилат-дезаминазу. Самыми филогенетически близ им и по этому белку к М. gallisepticum оказались микогшазмы из группы hominis (М. synoviae, М. pulmonis, М. mobile). Интересно, что для этой группы организмов характерно такое же взаимное расположение локуса nrdEP и кластера thyA-dhfr, как и у М. gallisepticum, в отличие от М. genitalium и М. pneumoniae (рис. 7). Более того, у М. synoviae ген dcdA расположен следом за геном дигидрофолат-редуктазы, только продукт этих генов не является составным. У М. hominis, М- mobile ген dcdA находится далеко от кластера thyA-dhfr. Примечательно, что М. synoviae, хотя и относится к другой филогенетической группе, также, как и М. gallisepticum является паразитом птиц.

7. Картирование участка начала репликации ДНК. Известно, что у многих бактерий участок ori расположен в непосредственной близости к гену dnaA. Поэтому участок ori картировали с помощью гибридизацион ного зонда на ген dnaA. Для этого анализировали крупные фрагменты ДНК, полученные с помощью рестриктаз Smal и Bgfl, которые расщепляют хромосому на 8 и 12 фрагментов соответственно. Эти фрагменты разделяли пульс-электрофорезом (рис. 8, /) и гибридизовалн с зондом на ген dnaA. Гибридизующиеся фрагметы идентифицировали, сравнивая картину гибридизации и полную картину рестрикции (рис. 8, 2).

Bgll Smal

ч

BgJI Smal

Рис. 8. Картирование гена йпаК на хромосоме М. хаНиерИсит А5969. 1 - Пульс-электрофорез хромосомной ДНК М. %аШзерИсит штамм Д5969, гидролизе ванной рестриктазами В%11 и Бта\. 2 - Саузерн-гиб-ридизация хромосомной ДНК исследуемого штамма М. gаШхерНсит, обработанной рестриктазамн ВшЛ и &на1, с радиоакгивно меченной пробой, специфичной для гена ёпаА.

Как видно из рисунка, гибридизующимися оказались Bg!l - А фрагмент и Бта\ - Б фрагмент Таким образом, полученные результаты позволяют определить местоположение участка начала репликации ДНК {опС) на хромосоме М galhseptlcum А5969 в месте пересечения обоих гибридизующихся фрагментов (рис 9)

Кластер гп 16 гг.? 16' оп

Рис. 9 Положение на хромосоме М ^аИшерПсит А5969 вар В участка оп, и исследованных генетических локусов

8 Механизмы возникновения перестроек генома М иа11Ьерисит А5969. Таким образом, мы подробно исследовали последствия двух перестроек, одна из которых (расщепление оперона рРНК и кластера рибосомных белков 510) характерна для всех штаммов М gaUlseptlcum, а другая, приведшая к возникновению длинного прямого повтора, уникальна для штамма А5969

Анализируя первую перестройку, мы обнаружили два факта, благодаря которым появилась возможность говорить о наличии нового механизма возникновения этой перестройки 1 - оба перемещения генов происходили поперек оси репликации, 2 - транслоцированные фрагменты оказались расположены на примерно одинаковом расстоянии от оп Наиболее вероятный на наш взгляд сценарий событий, приведших к описанным перегруппировкам, изображен на рисунке 10

Можно предположить, что родоначальник микоплазм обладал целыми кластерами рибосомных РНК и рибосомных белков, поскольку родственные М galhsepílcum бактерии содержат нерасщепленные опероны рРНК и кластер

18

Б10 Оперон рРНК и БЮ-кластер располагались на хромосоме по разные стороны от оп Репликация микоплазменной ДНК идет в обе стороны от участка начала репликации После того, как вилка 1 реплицировала ген 16Б рРНК, а вилка 2 - ген тар (входящий в набор генов Б10), вилки поменялись местами друг с другом. Дальнейший синтез ДНК происходил обычным образом, однако левую часть хромосомы реплицировала вилка 2, а правую часть — вилка 1 Таким образом, ошибка в процессе репликации привела к к развороту части хромосомы, и гены 238-58 и концевая часть ЭЮ-кластера поменялись местами

Рис. 10. Схема перестройки в М gallisepticum, затронувшей гены рРНК и кластера S10

Перемещенная часть SlO-кластера сформировала вместе с генами rps\6, trmD и rpl\9 новый кластер, транскрибирующийся как оперон

Кроме вопроса о механизмах перемещений генов, возникает также вопрос, почему эта перестройка закрепилась в ряду поколений Считается, что в бактериях объединение генов в кластеры отражает необходимость их координированной экспрессии, тк. как правило, гены, входящие в кластер, являются опероном Например, гены рибосомных РНК организованы в опероны Транскрипционная организация кластера рибосомных белков S10 видоспецифична например, у В subtilis гены транскрибируются как одна молекула РНК, тогда как у Е coli этот набор генов формирует три оперона (S10, spc и а), однако, во всех случаях порядок генов, а также их состав весьма консервативны Эти факты говорят о наличии эволюционного механизма, который поддерживает SlO-набор генов внутри одного хромосомного фрагмента, несмотря на видоспецифичные вариации регуляции транскрипции

19

С другой стороны, следует отметить, что перемещенные у М galhsepticum гены - это гены, относящиеся к процессам транскрипции и синтеза белка Ранее Борком и соавт было высказано предположение о "супер-опероне" (Lathe et al, 2000) Авторы данной гипотезы предположили, что существуют более крупные организации генов, чем опероны В частности, гены, участвующие в синтезе белков (транскрипции и трансляции), можно отнести к единому супер-оперону, и внутри этого супер-оперона возможен разный порядок генов, объединенных в опероны Перетасовки генов внутри супер-оперона не нарушают глобальную систему регуляции и не наносят ущерба организму, то есть являются нейтральными и могут быть закреплены в ряду поколений

Анализируемая перестройка затрагивает гены рибосомных белков и гены транскрипции, то есть гены, входящие в супер-оперон Таким образом, перемещения произошли внутри супер-оперона и, с точки зрения гипотезы Борка, могут быть закреплены в ряду поколений Но, с другой стороны, нарушен порядок генов SlO-кластера, который в других организмах консервативен независимо от состава оперонов

Вторая перестройка, описанная нами, является штаммоспецифичной, она привела к возникновению длинного прямого повтора Несмотря на то, что повторенные участки расположены по одну сторону от ori, возникновение этой дупликации можно объяснить с помощью схемы, близкой к предложенному нами сценарию для первой перестройки, т к плечи повтора разделены участком (спейсером), происходящим из кластера S10 Эта схема изображена на рисунке 11 Остановка репликативной вилки 1, идущей влево от on, происходит в тот момент, когда реплицированными оказались 977 нуклеотидов гена 16S рРНК После этого вилка 1 «перескакивает» на фрагмент хромосомы М galhsepticum, реплицирующийся вилкой 2, и удваивает 31 нуклеотид из гена rplK, находящегося приблизительно в середине SlO-кластера Потом вилка 1 возвращается обратно и возобновляет репликацию «своей» стороны хромосомы, но возвращается она не на исходную позицию, откуда произошел скачок, а раньше на 15778 нуклеотидов, в результате чего последовательность нуклеотидов от гена nusG до гена 16S рРНК оказывается повторенной дважды

20

Вилка 2, идущая вправо от оп, нормально удваивает ДНК Т о, предложенная схема объясняет все уникальные свойства повтора, которые были упомянуты выше

вилка1 вилка2

Э10

Рис. 11. Механизм возникновения длинного прямого повтора в М %аШверПсит

А5969

Микоплазмы - это бактерии, которые отличаются высокой частотой геномных перестроек Поэтому представляется удивительным, что более 15 т п и «лишней» информации не элиминируются из генома Надо отметить, что длинные прямые повторы нестабильны, поскольку известно, что они сами по себе являются горячими точками рекомбинации Возможно, стабильность описанного повтора связана с тем, что механизмы, ответственные за элиминацию, отсутствуют или не работают в данном штамме

Еще одна вероятная причина устойчивого сохранения длинного повтора - это наличие двух генов, необходимых для существования клетки, которые в результате мутаций оказались «нерабочими», причем «нерабочие» копии генов находятся в разных плечах повтора Тогда клетке необходимы были бы оба плеча, содержащие «рабочие» копии генов Но анализ последовательности повтора показал полноценность всех генов в обоих плечах

Суммируя все вышеизложенное, надо признать, что что причина сохранения повтора остается неясной Наиболее вероятным представляется отсутствие аппарата, позволящего этот повтор удалить

При внимательном изучении литературы оказалось, что повторы такого размера, не связанные с транспозицией и не ограниченные повторяющимися элементами, в других организмах описываются крайне редко Возможно, это

связано, с одной стороны, с трудностью обнаружения таких повторов и со сложностью их интерпретации, а с другой стороны - с быстрой элиминацией длинных прямых повторов в других организмах В связи с этим, штамм А5969 может стать моделью для изучения такого рода перестроек, т к он, по-видимому, обладает необходимым аппаратом для осуществления крупноразмерных дупликаций и не содержит аппарата для их элиминации, то есть повторенные участки долго сохраняются, и их можно зарегистрировать и исследовать

ВЫВОДЫ

1 В геноме М ^аШьерисит обнаружена перестройка, которая привела к расщеплению двух высококонсервативных локусов одного из двух оперонов рибосомных РНК и кластера генов рибосомных белков Б10 В результате расщепления оперона рибосомных РНК ген 16Б рРНК отделился от генов 23Б-

рРНК Гены т/А, грВв, грэ 13, гроА, гр\\1, отделившиеся от кластера Б10, образовали новый кластер с генами гр$ 1 б, тпЪ, гр1\9 Гены нового кластера составляют единый оперон

2 В геноме штамма А5969 М galhseptгcum обнаружен длинный прямой повтор, состоящий из двух одинаковых участков размером 15778 пар нуклеотидов (плечи повтора), разделенных 30-нуклеотидным спейсером Спейсерный участок идентичен участку гена гр!Я из кластера Б10, расположенного в другом локусе генома Каждое плечо содержит 15 полноценных рамок считывания. На конце каждого плеча расположен ген 16Б рРНК, причем одно из них содержит полную кодирующую последовательность 168 рРНК, а другое заканчивается укороченным геном 16Б рРНК

3 Предложена модель, позволяющая объяснить расщепление оперона рРНК и кластера Б10, а также модель возникновения длинного прямого повтора

4 Определена организация кластера генов МгуА (тимидилат-синтетазы) в М ^аИиерПсит штамм А5969 Показано что один из генов этого кластера кодирует составной полипептид —■ дигидрофолат-редуктазу-дезоксицитидилат-дезаминазу

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Skamrov А, Feoktistova Е, Goldman М, Beabealashvilh R. Mycoplasma gallisepticum rpoA gene cluster // FEMS Microbiol Lett - 2002. - V 208(2) -P 281-285

2 Skamrov A, Feoktistova E, Goldman M, Beabealashvilh R Gene rearrangement and fusion m Mycoplasma gallisepticum thyA-nrdFEl locus // FEMS Microbiol. Lett -2001 -V 200(1) -P 31-35

3. Скамров А В , Гольдман M A , Феоктистова E С , Бибилашвили Р Ш Определение и анализ последовательности нуклеотидов участка хромосомы Mycoplasma gallisepticum штамм А5969, содержащего опероны S10 и тг23-5 //Молекулярная биология -2000 -Т 34 - С 390-396

4 Феоктистова Е С., Скамров А В , Гольдман М А, Бибилашвили Р.Ш Определение и анализ последовательности нуклеотидов участка хромосомы Mycoplasma gallisepticum штамм А5969, содержащего оперон S10 Горизонты физико-химической биологии (школа-конференция) - 2000 - Т 1 -С 278

5 Feoktistova Е , Skamrov А , Goldman М , Beabealashvilh R Peculiar properties of Mycoplasma gallisepticum genome organization (large direct repeat m strain A5969 varB) // 13th International Congress of IOM Program and Abstracts -2000 -P 124.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

рРНК - рибосомная РНК,

тпн - тысячи пар нуклеотидов,

а к остаток — аминокислотный остаток,

ОРТ (ORF) - открытая рамка трансляции,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

ОТ - обратная транскрипция,

ггпА - классический оперон рибосомных РНК Mycoplasma galhsepticum А5969 , rrs 16 - изолированный полноценный ген 16S рРНК из расщепленного оперона Mycoplasma galhsepticum А5969 ,

rrslS' - укороченная копия 16S рРНК Mycoplasma galhsepticum А5969, гги23-5 - гены 23S и 5S рРНК из расщепленного оперона Mycoplasma galhsepticum А5969, вар — вариант,

FIGE - гель-электрофорез в инвертируемом поле (field inversion gel electrophoresis)

Подписано в печать 18 04 2007 г Исполнено 19 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 382 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Феоктистова, Евгения Сергеевна

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Общая характеристика микоплазм.

3.2. Структура и организация генома микоплазм.

3.2.1. Повторяющиеся элементы в геномах микоплазм.

3.2.1.1. Характеристика семейства вариабельных генов vlhA в Ы. gallisepticum.

3.2.1.2. Типы повторяющихся элементов микоплазм.

3.2.2. Сравнительный анализ геномов микоплазм.

3.3. Системы репарации микоплазм.

3.3.1. Двуцепочечные повреждения ДНК.

3.3.2. Механизмы репарации двуцепочечных разрывов.

3.3.3. Рекомбинационная репарация.

3.3.4. SOS-ответ и прямая реактивация.

3.3.5. Репарация неспаренных нуклеотидов.

3.3.6. Эксцизионная репарация.

3.4. Механизмы возникновения геномных перестроек.

3.4.1. Типы рекомбинации.

3.4.2. Мобильные генетические элементы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Перестройки в геноме Mycoplasma gallisepticum"

На рубеже XX—ХХ1 веков стали активно анализироваться не только отдельные гены, но и полные геномы организмов. Сравнение последовательностей нуклеотидов целых геномов дало возможность поставить вопросы о минимальном числе генов, достаточном для жизнедеятельности клетки. Подсчет, проведенный с использованием разных предположений, дает оценку числа минимального набора в 250-350 генов. Микоплазмы привлекательный возможность представляют для собой класс объектов, поскольку просто чрезвычайно существует молекулярной биологии, наиболее полной характеристики организованной самореплицирующейся клетки. Число генов в геноме микоплазм (примерно 500) близко к минимальному набору самовоспроизводящейся клетки. Анализ полных геномов открывает перед нами тонкие детали устройства хромосомы. Например, выяснилось, что, большинство генов прокариот транскрибируется по направлению движения репликативной вилки. Кроме того, получила дальнейшее подтверждение гипотеза о возможности межвидового (горизонтального) переноса генов. Обнаруживаются новые факты, связанные не только с поиском и аннотированием ранее неизвестньгх генов, но и с различными перестройками хромосомы. В частности, при изучении порядка следования генов в разных организмах, пристальное выяснилось, изучение что порядок проблемы этот неконсервативен. Более данной показало, что на коротких расстояниях, как правило, порядок генов сохраняется, то есть более консервативным является ближний порядок генов, причем длина консервативных участков в большинстве случаев определяется размером оперона. Таким образом, геном представляет собой динамическую структуру, в которой происходит обмен частями, и единицей обмена чаще всего является оперон. При анализе границ консервативных участков было показано, что большинство этих перестроек связано с перемещениями мобильных элементов или является результатом гомологичной рекомбинации. Некоторые особенности строения генома остаются пока недоступны для понимания, поскольку непонятны механизмы их возникновения. В связи с этим возникают задачи, имеющие отношение не столько к структурному анализу генома, сколько к пониманию механизмов процессов, лежащих в основе формирования, поддержания и изменчивости этой структуры. На протяжении многих лет в нащей лаборатории изучали бактерию Mycoplasma gallisepticum. Интерес к представителю рода Mycoplasma связан с небольшим общим числом генов, что делает привлекательным использование микоплазм в качестве модели для изучения взаимосвязи генов на уровне экспрессии в целой клетке. При изучении Mycoplasma gallisepticum был обнаружен ряд особенностей в геномной организации. Было показано, что варианты штамма А5969 из разных коллекций могут значительно отличаться по размеру хромосомы. Кроме того, в геноме штамма А5969 была обнаружена особенность, а именно: число генов 16S рРНК уникальная (определенное по гибридизации) оказалось не равным числу генов 23S и 5S рРНК. Во всех исследованных до настоящего времени бактериях количество генов 16S, 23S и 5S одинаково. Дальнейшие исследования показали, что дополнительная копия 16S рРНК представляет собой не полноценный ген, а укороченную конию. Кроме того, два набора генов рРНК отличаются по организации: гены первого набора рибосомных Р1Ж собраны в «классический» для прокариот оперон с порядком генов 16S 23S 5S рРНК, во втором наборе ген 16S рРНК отделен от соседствующих генов 23S 5S рР1Ж на значительное расстояние. Все это говорит о том, что в процессе эволюции у М gallisepticum произошли крупные изменения в структуре хромосомы. Целью настоящей работы было изучение процессов, приводящих к крупным изменениям хромосомы. Для достижения этой цели анализировались перестройки генома М gallisepticum штамм А5969. В данной работе изучали структуру и организацию фрагментов ДНК, содержащих рибосомные РНК, и окружающие их участки, вовлеченные, но-видимому, в процессы, связанные с изменениями хромосомы. В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1 картировать участки ДНК М. gallisepticum штамм А5969, содержащие расщепленный оперон рибосомных РНК и укороченный ген 16S рРЬЖ; 2 определить последовательность нуклеотидов этих участков, а также окружающих их областей хромосомы; 3 —изучить состав и расположение генов, а также особенности организации кластеров генов в картированных участках; 4 выяснить устройство длинного прямого повтора в М. gallisepticum штамм А5969.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Феоктистова, Евгения Сергеевна

7. ВЫВОДЫ

1. В геноме М. §аШ8ерНсит обнаружена перестройка, которая привела к расщеплению двух высококонсервативных локусов: одного из двух оперонов рибосомных РНК и кластера генов рибосомных белков Б10. В результате расщепления оперона рибосомных РНК ген 16Б рРНК отделился от генов 23858 рРНК. Гены т/А, гр/36, гря 13, гроА, гр1\1, отделившиеся от кластера 810, образовали новый кластер с генами ф,у16, гр1\9. Гены нового кластера составляют единый оперон.

2. В геноме штамма А5969 М. £а1ШерИсит обнаружен длинный прямой повтор, состоящий из двух одинаковых участков размером 15778 пар нуклеотидов (плечи повтора), разделенных 30-нуклеотидным спейсером. Спейсерный участок идентичен участку гена гр1К из кластера 810, расположенного в другом локусе генома. Каждое плечо содержит 15 полноценных рамок считывания. На конце каждого плеча расположен ген 168 рРНК, причем одно из них содержит полную кодирующую последовательность 168 рРНК, а другое заканчивается укороченным геном 168 рРНК.

3. Предложена модель, позволяющая объяснить расщепление оперона рРНК и кластера 810, а также модель возникновения длинного прямого повтора.

4. Определена организация кластера генов /ЛуА (тимидилат-синтетазы) в М. gallisepticum штамм А5969. Показано, что один из генов этого кластера кодирует составной полипептид — дигидрофолат-редуктазу-дезоксицитидилат-дезаминазу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Феоктистова, Евгения Сергеевна, Москва

1. Борхсениус С.Н., Чернова O.A., Чернов В.М., Вонский М.С. Микоплазмы // Наука.-2002.-316с.

2. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas // MMBR. 1998. - V. 62. - N. 4. - P. 1094-1156.

3. Neimark H.C., Lange C.S. Pulse-field electrophoresis indicates full-length mycoplasma chromosomes range widely in size // Nucleic Acids Res. 1990. -V. 18.-P. 5443-5448.

4. Mushegian A., Koonin E.V. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. -V. 93.-P. 10268-10273.

5. Vasconcelos A.R., Ferreira H.B., Bizarro C.V., Bonatto S.L., Carvalho M.O., Pinto P.M., Almeida D.F., Almeida L.G.P., Almeida R., Alves-Filho L., Assun?ao

6. Himmelreich R., Plagens H., Hilbert H., Reiner B., Herrmann R. Comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium II Nucleic Acids Research. 1997. - V. 25. - No. 4. - P. 701-712.

7. Marri P.R., Bannantine J.P., Golding G.B. Comparative genomics of metabolic pathways in Mycobacterium species: gene duplication, gene decay and lateral gene transfer // FEMS Microbiol Rev. 2006. - V. 30(6). - P. 906-25.

8. Conners S.B., Mongodin E.F., Johnson M.R., Montero C.I., Nelson K.E., Kelly R.M. Microbial biochemistry, physiology, and biotechnology of hyperthermophilic Thermotoga species // FEMS Microbiol Rev. 2006. - V. 30(6). - P. 872-905.

9. Gupta R.S., Griffiths E. Chlamydiae-specific proteins and indels: novel tools for studies // Trends Microbiol. 2006. - V. 13.

10. Koonin E.V. The origin of introns and their role in eukaryogenesis: a compromise solution to the introns-early versus introns-late debate? // Biol Direct. -2006.-V. 14.-P. 1-22.

11. Lozada-Chavez I., Janga S.C., Collado-Vides J. Bacterial regulatory networks are extremely flexible in evolution // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34(12). -P. 3434-45.

12. Chen B., Zhong D., Monteiro A. Comparative genomics and evolution of the HSP90 family of genes across all kingdoms of organisms // BMC Genomics. -2006.-V. 7(156).-P. 1-19.

13. Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A., Fleischmann R.D., Bult C.J., Kerlavage A.R., Sutton G., Kelley J.M., Fritchman R.D., Weidman J.F., Small K.V., Sandusky M., Fuhrmann J., Nguyen D., Utterback T.R., Saudek

14. Minion F.C., Lefkowitz E.J., Madsen M.L., Cleary B.J., Swartzell S.M., Mahairas G.G. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis // J Bacteriol. 2004. - V. 186(21). - P. 7123-7133.

15. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B.C. Herrmann R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. II Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - P. 4420-4449.

16. Rocha E.P., Blanchard A. Genomic repeats, genome plasticity and the dynamics of Mycoplasma evolution. // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30(9). - P.2031-42.

17. Jeffery N., Browning G.F., Noormohammadi A.H. Organization of the Mycoplasma synoviae WVU 1853T vlhA gene locus // Avian Pathol. -2006. -V. 35(1).- P. 53-57.

18. Allen J.L., Noormohammadi A.H., Browning G.F. The vlhA loci of Mycoplasma synoviae are confined to a restricted region of the genome. // Microbiology. -2005. -V. 151.-P. 935-40.

19. Chernov V.M., Gorshkov O.V., Chernova O.A., Baranova N.B., Akopian T.A., Trushin M.V. Variability of the Vaa cytoadhesin genes in clinical isolates of Mycoplasma hominis II New Microbiol. 2005. - V. 28(4). - P. 373-376.

20. Baseggio N., Glew M.D., Markham P.F., Whithear K.G., Browning G.F. Size and genomic location of the pMGA multigene family of Mycoplasma gallisepticum //Microbiology. 1996.-V. 142.-P. 1429-35.

21. Liu L., Payne D.M., van Santen V.L., Dybvig K., Panangala V.S. A protein (M9) associated with monoclonal antibody-mediated agglutination of Mycoplasma gallisepticum is a member of the pMGA family I I Infect Immun. 1998. -V. 66(11).-P. 5570-5.

22. Markham P.F., Glew M.D., Whithear K.G., Walker I.D. Molecular cloning of a member of the gene family that encodes pMGA, a hemagglutinin of Mycoplasma gallisepticum II Infect Immun. 1993. - V. 61(3). - P. 903-909.

23. Liu L., Panangala V.S., Dybvig K. Trinucleotide GAA repeats dictate pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum by affecting spacing between flanking regions.//J. Bacterid.-2002.-V. 184(5).-P. 1335-1339.

24. Zheng J., Mcintosh M.A. Characterization of IS 1221 from Mycoplasma hyorhinis: expression of its putative transposase in Escherichia coli incorporates a ribosomal frameshift mechanism // Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 669-685.

25. Frey J., Cheng X., Kuhnert P., Nicolet J. Identification and characterization of IS 1296 in Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC and presence in related mycoplasmas // Gene. 1995. - V. 160. - P. 95-100.

26. Calcutt M.J., Lewis M.S., Wise K.S. Molecular genetic analysis of ICEF, an integrative conjugal element that is present as a repetitive sequence in the chromosome of Mycoplasma fermentans PG18.1 I J.Bacteriol. 2002. - V. 184(24). -P. 6929-41.

27. Hochhut B., Waldor M. K. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC // Mol. Microbiol. 1999. - V. 32. - P. 99-110.

28. Glass J.I., Lefkowitz E.J., Glass J.S., Heiner C.R., Chen E.Y., Cassell G.H. The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum II Nature. -2000. V. 407(6805). - P. 757-62.

29. Carvalho F.M., Fonseca M.M., De Medeiros S.B., Scortecci K.C., Blaha C.A.G., Agnez-Lima L.F. DNA repair in reduced genome: The mycoplasma model // Gene. -2005.-V. 360.-P. 111-119.

30. Hoeijmakers J.H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer // Nature. 2001. - V. 411. - P. 366-374.

31. Bidnenko V., Ehrlich S.D., Michel B. Replication fork collapse at replication terminator sequences // The EMBO Journal. 2002. - V. 21. - P. 3898-3907.

32. Cromie G.A., Connelly J.C., Leach D.R.F. Recombination at double-btrand breaks and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans // Molecular Cell. 2001. - V. 8. - P. 1163-1174.

33. Kuzminov A. Collapse and repair of replication forks in Escherichia coli // Mol Microbiol. 1995. - V. 16. - P. 373-384.

34. Kuzminov A. Single-strand interruptions in replicating chromosomes cause double-strand breaks // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. - V. 98. - P. 8241-8246.

35. Seigneur M., Bidnenko V., Ehrlich S.D., Michel B. RuvAB acts at arrested replication forks // Cell. 1998. - V. 95. - P. 419-430.

36. Flores M.J., Bierne H., Ehrlich S.D. Michel B. Impairment of lagging strand synthesis triggers the formation of a RuvABC substrate at replication forks. // EMBO. -2001. V. 20. - P. 619-629.

37. Michel B. Replication fork arrest and DNA recombination // Trends Biochem Sci. 2000. - V. 25. - P. 173-178.

38. Michel B., Flores M.J., Viguera E., Grompone G., Seigneur M. Bidnenko V. Rescue of arrested replication forks by homologous recombination // Proc.Natl. Acad. Sci. USA.-2001.-V. 98.-P. 8181-8188.

39. Rothstein R., Michel B., Gangloff, S. Replication fork pausing and recombination or "gimme a break" // Genes Dev. 2000. - V. 14. - P. 1-10.

40. Michel B., Grompone G., Flores M.-J., Bidnenko V. Multiple pathways process stalled replication forks//PNAS.-2004.-V. 101(35).-P. 12783-12788.

41. Fiords M.J., Sanchez N., B. Michel. A fork-clearing role for UvrD // Molecular Microbiology. -2005. -V. 57(6). -P. 1664-1675.

42. Bowater R., Doherty A. J. Making ends meet: repairing breaks in bacterial DNA by non homologous end-joining // PLoS Genetics. 2006. - V. 2(2). - P. 00930099.

43. Pastwa E., Biasiak J. Non-homologous DNA end joining // Acta Biochim Pol. -2003.-V. 50(4).-P. 891-908.

44. Longhese M.P., Mantiero D., Clerici M. The cellular response to chromosome breakage // Molecular Microbiology. 2006. - V. 60(5). - P. 1099-1108.

45. Eisen J.A., Hanawalt P.C. A phylogenomic study of DNA repair genes, proteins, and processes // Mutat. Res. 1999. - V. 435. - P. 171- 213.

46. Fernandez S., Ayora S., Alonso J.C. Bacillus subtilis homologous recombination: genes and products // Res. Microbiol. 2000. - V. 151. - P. 481486.

47. Amundsen S.K., Smith G.R. Interchangeable parts of the Escherichia coli recombination machineiy // Cell. 2003. - V. 112. - P. 741-744.

48. Cox M.M. The nonmutagenic repair of broken replication forks via recombination // Mutat. Res. 2002. - V. 510. - P. 107-120.

49. Phillips R.J., Hickleton D.C., Boehmer P.E., Emmerson P.T. The RecB protein of Escherichia coli translocates along single-stranded DNA in the 3V to 5V direction: a proposed ratchet mechanism // Mol. Gen. Genet. 1997. - V. 254. -P. 319-329.

50. Ayora S., Carrasco B., Doncel E., Lurz R., Alonso J.C. Bacillus subtilis RecU protein cleaves Holliday junctions and anneals singlestranded DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2004. - V. 101. - P. 452-457.

51. Dillingham M.S., Spies M., Kawalczykowski S.C. RecBCD enzyme is a bipolar DNA helicase // Nature. 2003. - V. 423. - P. 893-897.

52. O.Chow K.H., Courcelle J. RecO acts with RecF and RecR to protect and maintain replication forks blocked by UV-induced DNA damage in Escherichia coli II J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - P. 3492-3496.

53. Bork J.M., Cox M.M., Inman R.B. The RecOR proteins modulate RecA protein function at 5V ends of single-stranded DNA // EMBO J. 2001. - V. 20. - P. 73137322.

54. Labarere J., Barroso G. Lethal and mutation frequency responses of Spiroplasma citri cells to UV irradiation // Mutat. Res. 1989. - V. 210. - P. 135-141.

55. Schofield M.J., Hsieh P. DNA mismatch repair: molecular mechanisms and biological function // Annu. Rev. Microbiol. 2003. - V. 57. - P. 579-608.

56. Lindahl T. Keynote: past, present, and future aspects of base excision repair // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. - V. 68. - P. 17-30.

57. Wang D., Kreutzer D.A., Essigmann J.M. Mutagenicity and repair of oxidative DNA damage: insights from studies using defined lesions // Mutat. Res. 1998. -V. 400.-P. 99-115.

58. Kow Y.W. Repair of deaminated bases in DNA // Free Radic. Biol. Med. -2002.-V. 33.-P. 886-893.

59. Dillingham M.S., Soultanas P., Wiley P., Webb M.R., Wigley D.B. Defining the roles of individual residues in the single-stranded DNA binding site of PcrA helicase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. - V. 98. - P. 8381-8387.

60. Goodman M.F. Error-phone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryote // Ann. Rev. Biochem. 2002. - V. 71. - P. 17-50.

61. KuninV., Ouzounis C. A. The balance of driving forces during genome evolution in prokaryotes //- Genome Res. 2003. - V. 13. - P. 1589-1594.

62. Slack A., Thornton P.C., Magner D.B., Rosenberg S.M., Hastings P.J. On the mechanism of gene amplification induced under stress in Escherichia coli. // PLoS Genetics. 2006. - V. 2(4). - P. 0385-0398.

63. Achaz G., Rocha E.P.C., Netter P., Coissac E. Origin and fate of repeats in bacteria //Nucleic Acids Research. 2002. - V. 30. - No. 13. - P. 2987-2994.

64. Kondrashov F.A., Rogozin I.B., Wolf Y.I., Koonin E.V. Selection in the evolution of gene duplications // Genome Biology. 2002. - V. 3(2). - P. 0008100089.

65. Rocha E.P.C, Cornet E., Michel B. Comparative and evolutionary analysis of the bacterial homologous recombination systems // PLoS Genet. 2005. - V. 1(2). -P. 0247-0259.

66. Bi X., Liu L.F. A replicational model for DNA recombination between direct repeats. // JMB. -1996. V. 256(5). - P. 849-58.

67. Lovett S.T. Encoded errors: mutations and rearrangements mediated by misalignment at repetitive DNA sequences // Molecular Microbiology. 2004. -V. 52(5).-P. 1243-1253.

68. Dianov G.L., Kuzminov A.V., Mazin A.V., Salganik R.I. Molecular mechanisms of deletion formation in Escherichia coli plasmids. I. Deletion formation medated by long direct repeats. // Mol Gen Genet. 1991. - V. 228. - P. 153-159.

69. Lovett S.T., Drapkin P.T., Sutera-Jr., V.A., Gluckman-Peskind T.J. A sister-strand exchange mechanism for reck-- independent deletion of repeated DNA sequences in Escherichia coli II Genetics. 1993. - V. 135. - P. 631-642.

70. Lovett S.T., Gluckman T.J., Simon P.J., Sutera- Jr.V.A., Drapkin P.T. Recombination between repeats in Escherichia coli by a recA- independent, proximity-sensitive mechanism // Mol Gen Genet. 1994. - V. 245. - P. 294-300.

71. Bi X., Liu L.F. rec^-independent and recAdependent intramolecular plasmid recombination. Differential homology requirement and distance effect // J Mol Biol. -1994.-V. 235.-P. 414-423.

72. Tillier E.R.M., Collins R.A. Genome rearrangement by replication-directed translocation // Nature genetics. 2000. - V. 26. - P. 195-197.

73. Eisen J.A., Heidelberg J.F., WhiteO., Salzberg S.L. Evidence for symmetric chromosomal inversions around the replication origin in bacteria // Genome Biol. -2000.-V. 1(6).-P. 00111-00119.

74. Sambrook J., Fritsch R.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989.

75. Devereux J., Haeberli P., Smithies О. A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX //Nucl. Acids. Res. 1984. - V. 12. - P. 387-395.

76. Rost B. PHD: predicting one-dimensional protein structure by profile based neural networks // Methods Enzymol. 1996. - V. 266. - P. 525-539.

77. Bateman A., Birney E., Cerruti L., Durbin R., EtwillerL., Eddy S. R., GriffithsJones S., Howe K.L., Marshall M., Sonnhammer E.L.L. The Pfam Protein Families Database // Nucleic Acids Research. -2002. V. 30. - No. 1. - P. 276-280.

78. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL in 1999 // Nucleic Acids Research. 1999. - V. 27(1). - P. 4954.

79. Falquet L., Pagni M., Bucher Ph., Hulo N., Sigrist C.J.A., Hofmann K., Bairoch A. The PROSITE database, its status in 2002 // Nucleic Acids Research. 2002. -V. 30.-No. 1.

80. Razin S., Tully (eds.) Methods in Mycoplasmology // N.Y. Academic Press. -1983.-700 p.

81. Hayflick L. The tissue cultures and mycoplasmas // Tex. Rep. Biol. Med. -1965.-V. 23.-P. 285-303.

82. Cantor C.R. Smith C.L., Mathew M.K. Pulsed-field gel electrophoresis of very large DNA molecules. // Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1988. - V. 17. -P. 287-304.

83. Скамров A.B., Бибилашвили Р.Ш. Идентификация штамма М. gallisepticum с помощью фингерпринтирования рестриктазных гидролизатов хромосомной ДНК // Мол. Биол. 1994. - Т. 28(6). - С. 1293-1298.

84. Hattori М., Sakai Y. Dideoxy sequencing method using denatured plasmid templates // Anal. Biochem. 1986. - V. 152. -P. 232-238.

85. Краев A.C. Простая схема клонирования в фаге М13 и секвенирования ДНК с терминаторами // Молекулярная биология. 1988. -Т. 22. - С. 11641196.

86. Скамров А.В, Бибилашвили Р.Ш. Физическая карта Mycoplasma gallisepticum штамм А5969 и определение положения на ней некоторых генов // Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - С. 585-594.

87. Skamrov A., Goldman М., Klasova J., Beabealashvilli R. // Mycoplasma gallisepticum 16S rRNA genes. // FEMS Microbial.Lett. 1995. - V. 128(3). -P. 321-325.

88. Scamrov,A., Beabealashvilli R. Mycoplasma gallisepticum strain S6 genome contains three regions hybridizing with 16 S rRNA and two regions hybridizing with 23 S and 5 S rRNA // FEBS Lett. 1991. - V. 291 (1). - P. 71-74.

89. Timofeeva A.V., Skiypina N.A. Background activity of reverse transcriptases // Biotechniques. -2001. V. 30. - P. 22-24.

90. Cordwell S., Basseal D., Pollack J., Humphery-Smith I. // Gene. 1997. -V. 195.-P. 113-120.

91. Jordan A., Aslund F., Pontis E., Reichard P., Holmgre, A. Characterization of Escherichia coli NrdH. A glutaredoxin-like protein with a thioredoxin-like activity profile // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 18044-18050.

92. Nordlund P., Eklund H. Structure and function of the Escherichia coli ribonucleotide reductase protein R2 //J. Mol. Biol. 1993. - V. 232. - P. 123-164.

93. Woese C.R., Maniloff J., Zablen L.B. Phylogenetic analysis of mycoplasmas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980 - V. 77. - P. 494-498.

94. Snel B., Bork P., Huynen M. Genome evolution: gene fusion versus gene fission // Trends Genet. 2000. - V. 16. - P. 9-11.

95. Galperin M., Koonin E., Who's your neighbor? New computational approaches for functional genomics // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 609-613.

96. Cox K., Robertson D., Fites R. Mapping and expression of a Afunctional thymidilat synthase, dihydrofolate reductase gene from maize // Plant Mol. Biol. -1999.-V. 41.-P. 733-739.

97. Lathe W.C. Illrd, Snel B., Bork P. Gene context conservation of a higher order than operons // Trends. Biochem. Sci. 2000. - V. 25. - P. 474-479.

98. Che D., Li G., Mao F., Wu H., Xu Y. Detecting uber-operons in prokaryotic genomes// Nucleic Acids Research. 2006. - V. 34. - No. 8. - P. 2418-2427.

99. Gorton T.S., Goh M.S., Geary S.J. Physical mapping of the Mycoplasma gallisepticum S6 genome with localization of selected genes // J Bacteriol. 1995. -V. 177(1).-P. 259-63.