Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяционная структура фитопатогенного гриба PHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT) de BARY в Московской области в 1991-1996 годах

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Популяционная структура фитопатогенного гриба PHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT) de BARY в Московской области в 1991-1996 годах"

РГб од

2 5 НОЯ 1323

На правах рукописи УДК 582.281.14:575.224:632.4

СМИРНОВ АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА ФИТОПАТОГЕННОГО ГРИБА PHYTOPHTHORA 1NFESTANS (MONT) de BARY В МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ В 1991 - 1996 ГОДАХ

(03.00.24 - микология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Диссертационная работа выполнена в 1993-1996 годах на кафедре микологии и альгологии Биофака МГУ имени М. В. Ломоносова и в институте фитопатологии.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Дьяков Ю. Т.

Официальные оппоненты: доктор сельско-хояйственных наук,

профессор Воловик А. С.

кандидат биологических наук Филиппов А. В.

Ведущая организация: Академия Сельско-Хозяйственных

Наук имени К. А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 20 декабря 1996 г. в на заседании

диссертационного совета Д.053.05.65 Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан ноября 1996 г.

Ученый секретарь , .

диссертационного совета

доктор биологических наук Лекомцева С. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В течение двадцатого столетия были разработаны две стратегии борьбы с P. infestons: получение устойчивых сортов и химическая защита, в этих рамках была создана система защиты картофеля и томатов. Однако многие методы, будучи эффективными в первые годы своего применения, оказывались позднее малополезными. Слабым местом этих стратегий был недостаток информации о природном многообразии P. infestons и механизмах его достижения.

Чтобы восполнить недостаток информации, в 1980-ые и 1990-ые годы стали проводить исследования популяций P. infestons. Были подобраны маркеры, характеризующие их состояние. Таким образом, появилась возможность отслеживать микроэволюционные изменения Р. infestons, искать их причины и механизмы.

Представляемая работа содержит результаты исследований популяций P. infestons Московской области. Полученные данные полезны для сравнения с результатами популяционного анализ;! Р. infestons в Европе и Америке. Кроме того, описанные в работе механизмы регуляции популяций P. infestons могут быть полезны при объяснении популяционных сдвигов возбудителя фитофтороза а также при разработке новых стратегий защиты.

Пели работы:

1. Определение статуса и способов размножения подмосковных популяций P. infestons.

2. Сравнение подмосковных популяций P. infestons на картофеле и томатах.

3. Установление биологических факторов, способных регулировать структуру и численность популяций P. infestons.

Задачи работы:

1. Определение частот типов совместимости, групп вегетативной совместимости, устойчивости и чувствительности к системному фунгициду металаксилу, аллелей изоферментных локусов, "томатных"' рас ТО и Т1, генов вирулентности к картофелю и "картофельных" рас.

2. Сравнение различных подмосковных популяций P.infestums по признакам, описанным выше.

3. Оценка влияния бактерий гифосферы на P.infestatts.

Практическая ценность работы. Полученные данные могут быть использованы для уточнения разрабатываемой сейчас стратегии антирезистентности и для корректировки дифференциальных методов -зашиты картофеля и томатов. Кроме того, данные по бактериям гифосферы P.infestans могут способствовать разработке биоконтроля P.itifestans. В целом, в работе приведены достаточно подробные характеристики подмосковных популяций патогена, которые можно использовать для прогноза, уточнения существующих а также разработки новых методов защиты против фитофтороза в условиях Московской области.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на II и III европейских конферециях по генетике грибов в Лунтерене (1994 г.) и Мюнстере (1996 г.), на всероссийской конференции по защите растений в Санкт-Петербурге (1995 г.) и на заседании кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ (1996 год).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, материалов и методов, двух глав, выводов, списка литературы и 2 приложений. Работа изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 48 работ отечественных и 173 работы зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы. В этой главе дан аналитический обзор работ по изучению популяционной биологии Р.infest ans в разных странах.

2. Материалы и методы. Сбор фитофторозных образцов осуществляли в Талдоме (1991 г.), Воскресенске (1991, 1993, 1995 годы), Одинцове (1992, 1993, 1995, 1996 годы) и Звенигороде (1995 и 1996 годы). В Одинцово и Звенигороде материал собирали с картофельных и томатных полей, расположенных близко друг от друга. Всего было выделено 155 изолятов P.infestans с картофеля и 191 изолят с томатов (табл. 1).

Типы патовой совместимости (AI и А2) и группы вегетативной совместимости (v-cl и v-c2) определяли в попарных культурах исследуемых изолятов с тестерами. В качестве тестеров использовали штаммы из коллекции кафедры микологии и альгологии IS1 (А2, v-c2) и Б5 (Al, v-cl). Отношение к металаксилу определяли путем сравнения роста гриба на средах с концентрациями металаксила О, I, 10 и 100 мкг/мл. Для контроля правильности определения для некоторых изолятов использовали метод дисков как описано у Kadish, Köllen (1987). Для определения "томатных" рас (ТО или Т1) исследуемыми изолятами заражали сорта томатов "Талалихин" (дифференциатор ТО) и "Огтава" (дифференциатор Т1). Для определения "картофельных" рас использовали картофельные сорта-дифференциаторы, входящие в набор Блэка (кроме R6). Приготовление проб P.infestans и горизонтальный электрофорез изоферментов в крахмальном (13%) и полиакриламидном (7,5%) гелях проводили как описано у Mickales & Bonds (1985) и у Остермана (1981), Для электрофореза были использованы 4 буферные системы - трис-цитрат (Adams, Joly, 1980), трис-цитрат - LiOH-борат (Ridgeway et al., 1970), трис-ЭДТА-борат (Guries, Ledig, 1978) и гистидин-HCl - трис-цитрат (Spielman et al., 1990). Окраску гелей и их

Табл. 1. Перечень исследованных популяций Р.infestam

Популяции P.infestans

Число изолягов, проверенных по признака

Год Растение- Место сбора Назва- Типы От- "То- "Кар Gpi- Рер- Me

хозяин ние сов- но- мат- то- 1 1

мес- ше- ные" фель

ти- ние расы ные"

мости к ме- расы

тала-

кснлу

1991 картофель Московская КМ91 26 26 26 - 10 7 10

область

Талдом КТ91 15 15 15 - 6 3 6

Воскресенск КУ91 11 11 11 - 4 4 4

1992 томаты Одинцово Т092 11 11 11 - 4 - 6

(плоды)

1993 картофель Московская КМ93 95 93 74 76 38 16 15

область

Воскресенск КУ93 15 15 12 11 3 3

Одинцово К093 80 78 62 65 35 13 12

(июль) К01-93 21 21 10 13 7 4

(август) К02-93 35 34 31 28 14 5

(август) К03-93 24 23 21 24 14 4

1993 томаты Одинцово ТМ93 35 35 20 24 27 15 17

листья ТЬ093 19 19 10 11 16 10 i:

плоды ТР093 16 16 10 13 9 5

1995 картофель Московская КМ95 15 17 10 10 11 6 7

область или

(Звенигород) К2У95

1995 томаты Московская ТМ95 127 130 24 44 39 35 38

область

плоды Звенигород ТР7У95 18 21 3 5 4 4

листья Звенигород ТЪ2у95 3 3 1 -

плоды Одинцово ТР095 41 41 12 25 20 19 Г

листья Одинцово ТШ95 21 21 5 11 11 8 1

плоды Воскресенск ТРУ95 14 14 3 3 4 4

Т996 картофель Московская КМ96 9 16 13 13 12

область - -

Одинцово К096 4 4 4 4 1

Звенигород 5 12 9 9 i

1996 томаты Московская ТМ96 9 15 10 10 10

область или - _

(Одинцово) Т096

плоды ТР096 5 10 8 8 i

листья ТШ96 4 5 2 2

срезов осуществляли как описано у Mauchenko (1994), Shaw & Prasad (1970) и Cheliak & Pitel (1984). Встречаемость морфологических

отклонений мицелия и бактерий шфосферы Р. т/с$1апх оценивали как описано в табл. 2.

Табл. 2. 6-бальные шкалы для оценки частот каждого

морфологического отклонения P.infestans и бактерий гифосферы.

Морфологические Бактерии гифосферы

отклонения мицелия

Б Число обнаруженных Встречаемость Число обнаруженных

а морфологических бактерий бактерий шфосферы

л отклонений каждого гифосферы в одном

л типа в одном микроскопическом

микроскопическом поле поле (0,43 мм2)

0 не обнаружено нет не обнаружены

1 <1 очень редко <3

2 1 - 2 редко 3 - 5

3 3 - 5 обычно 6 - 20

4 6 - 20 часто 21 - 50

5 >20 обильно >50

Статистическую обработку данных осуществляли как описано у Плохинского (1961), Nei (1975) и посредством пакета статистических программ 'STATGRAPHICS'. Кластерный анализ проводили посредством пакета статистических программ 'SYSTAT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3. Характеристика популяций по типам совместимости, группам вегетативной совместимости, отношению к металаксилу и "томатным" расам. Из анализа табл. 3 следует, что в большинстве подмосковных популяций P.infestans преобладал AI. В некоторых популяциях (на картофеле в 1991 г. и на одинцовских томатах в 1995 г.) соотношение AI и А2 было близким к 1:1. И лишь в 1995 г. в небольшой томатной популяции из Воскресенска доминировал А2. В 1996 году, согласно предварительным данным, из 9 картофельных изолятов (Одинцово и Звенигород) 5 были AI и 4 - А2. Из 9 томатных изолятов (Одинцово) 5 были AI, 1 - А2 и 3 изолята были самофертильными.

Табл. 3. Характеристика подмосковных картофельных и томатных популяций Р. Ь$е$1ат.

Типы совместимости Отношение к металаксилу** "Томатные" расы

Популяции % А1 % А2 % СФИ* % МИ. % М1 %М8 %Т0 %Т1

картофель, 1991

КМ91 54% 46% 0% 65% 19% 16% 100% 0%

КТ91 53% 47% 0% 53% 27% 20% 100% 0%

КУ91 55% 45% 0% 82% 9% 9% 100% 0%

томаты 1992

ТР092 100% 0% 0% 0% 0% 100% 0% 100%

каотосЬель. 1993

КМ93 97% 3% 0% 84% 2% 14% 65% 35%

К093 96% 4% 0% 97% 3% 0% 65% 35%

КУ93 100%Г б%1 0% 14% 0% 86% 67% 1 33%

томаты 1993

ТМ93 94% 3% 3% 3% 6% 97% 5% 95%

ТР093 94% 6% 0% 0% 0% 100% 10% 90%

TL093 90% 5% 5% 5% 10% 85% 0% 100%

картофель, 1995

К7.У95 73% 27% 0% 0% 11% 89% 70% 30%

томаты 1995

ГТМ95 78% 22% 0% 0% 5% 95% \Ъ%~ 87%

ТРгу95 100% 0% 0% 0% 0% 100% 33% 67%

ТЬ7.у95 100% 0% 0% 0% 100% 0% 100%

ТР095 78% 22% 0% 0% 4% 96% 8% 92%

ТШ95 67% 33% 0% 0% 10% 90% 0% 100%

ТРУ95 14% 86% 0% 0% 14% 86% 33% 67%

*СФИ-самофертильныс изоляты; **МК-изоляты, устойчивые к

металаксилу, МЬизоляты, среднеустойчивые к металаксилу, МБ-изоляты, чувствительные к металаксилу

Подавляющее большинство штаммов А1 принадлежало к у-с1 группе, штаммов А2 - к у-с2. Эти данные подтверждают наличие корреляции между половой совместимостью и вегетативной несовместимостью (Оо^оуа е1 а1., 1992). Отдельные штаммы с нечеткой реакцией вегетативной несовместимости, как правило, характеризовались нетипичным или ослабленным образованием ооспор с тестерами 181 и Б5.

Мы провели поиск ооспор in planta на 2 томатных подмосковных полях. В августе 1995 г. на материале (плодах и листьях) ооспор обнаружено не было. В сентябре 1996 г. в материале одного из полей (где в 1993, 1995 и 1996 годах доминировал А1), лишь в некоторых образцах были обнаружены единичные или редкие ооспоры. В материалах с другого поля (где в 1992 г. доминировал А1, но в 1993 и 1995 г. встречаемость А2 достигала 50%), в половине образцов встречались редкие или обильные ооспоры). Это распределение позволяет предполагать, что многие эти ооспоры имели гибридное происхождение.

Из табл. 3 видно, что среди картофельных популяций P.infestans встречались как устойчивые, так и чувствительные к металаксилу, томатные популяции были преимущественно чувствительными к металаксилу. В 1996 году, согласно предварительным данным, из 16 картофельных изолятов (Одинцово и Звенигород) 5 были устойчивыми, 1 - среднеустойчивый и 10 - чувствительными. Все 15 проверенных томатных изолятов (Одинцово) были чувствительными. Устойчивость к металаксилу встречалась преимущественно на полях, которые в годы сбора или ранее обрабатывали ридомилсодержащими препаратами. При пассировании на средах с металаксилом у многих устойчивых и чувствительных штаммов мы наблюдали значительное увеличение их устойчивости, иногда приводящее к зависимости от фунгицида. Этот эффект сопровождался морфологическими изменениями мицелия. При пересеве на среду без металаксила он ослаблялся вплоть до полного исчезновения. Таким образом, многие штаммы P. infestans характеризовались адаптивной устойчивостью к металаксилу.

Из табл. 3 следует, что во всех томатных популяциях P.infestans доминировала раса Т1. В картофельных популяциях 1991 г. P.infestans доминировала раса ТО, однако в картофельных популяциях 1993 и 1995 г. встречалась и раса Т1, ее частота достигала 35%. Различия в

поражении дифференциатора "Оттава" позволяют нам предполагать, что томатные штаммы единообразны по этому признаку, а многие картофельные штаммы, поражающие "Оттаву", напротив, представляют собой смесь рас ТО и Т1.

4. Характеристика популяций по генам вирулентности к картофелю. В 1993 г. картофельные популяции P. infestons характеризовались высокими частотами vir-генов, лишь частота гена а5 была несколько ниже (табл. 4). Томатные популяции по частотам генов al-a5 были сходными с картофельными, по частотам генов a7-all значительно уступали им. Средняя вирулентность популяций на картофеле была выше, чем у томатных популяций.

В 1995 картофельные и томатные популяции P. infestons были сходны по частотам vir-генов и средней вирулентности. Все популяции

Табл. 4. Частоты генов вирулентности в подмосковных картофельных и томатных популяциях P. infestons 1993 и 1995 годов.

Гены виг эулентности к картофелю

Популяции (см. табл. 1) al a2 a3 a4 a5 a7 a8 a9 alO ail Среда вирулентность

картофель, 1993

КМ93 97% 91% 93% 97% 68% 86% 82% 95% 91% 93% 9

К093 99% 91% 94% 97% 65% 83% 80% 97% 91% 94% 8,9

KV93 91% 91% 91% 100% 91% 100% 91% 82% 91% 91% 9,2

томаты, 1993

ТМ93 82% 88% 84% 80% 64% 44% 48% 52% 56% 68% 6,8

TL093 64% 82% 82% 82% 46% 36% 46% 55% 46% 55% 6

ТР093 1 100% 93% 86% 79% 79% 50% 50% 50% 64% 79% 7,4

картофель, 1995

KZv95 1100% | 80% 1100% 1100% I 20% f 100% 1100% f 90% 1 30% 1100% I 8,2

томаты, 1995

ТМ95 100% 81% 100% 100% 32% 95% 95% 95% 24% 93% 8

TPZv95 100% 60% 100% 100% 40% 100% 100% 100% 0% 100% 8

ТР095 100% 80% 100% 100% 24% 96% 96% 92% 28% 88% 8

TL095 100% 91% 100% 100% 27% 91% 91% 100% 27% 100% 8,1

характеризовались высокими частотами всех vir-генов, кроме а5 и а 10, которые встречались редко.

5. Расовый состав популяций.

1993 г. Среди 101 изолята P. infestans мы обнаружили 35 рас. 23 из них были на картофеле, 17 - на томатах; 18 рас встречались только на картофеле, 12 рас - только на томатах и 5 рас - на обоих растениях.

Во всех популяциях P. infestans доминировала раса 1,2,3,4,5,7,8,9,10,11, включающая все определяемые нами гены вирулентности. В картофельной популяции также преобладали расы 1,2,3,4,7,8,9,10,11 (12%) и 1,2,3,4,9,10,11 (5%). В томатной популяции часто встречалась раса 1,2,3,4,5,8,10,11, ее частота была 8%. Встречаемость остальных рас не превышала 4%.

1995 гол. Для 54 проверенных изолятов P. infestans были обнаружены 16 рас. 5 из них были на картофеле, 15 - на томатах. 1 расу обнаружили только на картофеле, 11 - только на томатах, 4 расы встречались на обоих растениях.

Во всех популяциях доминировала раса 1.2.3.4.7.8.9.11, достигая частоты 30-60%. В обоих популяциях также преобладали раса 1.2.3.4.7.8.9.10.11 (7-30%) и раса 1.3.4.7.8.9.11 (7-20%). В томатных популяциях часто встречалась "суперраса" 1.2.3.4.5.7.8.9.10.11 (7-9%). в картофельной популяции ее не обнаружили.

6. Анализ спектра изоферментов. Мы проверили 9 ферментов, используя 4 буферные системы. Для 8 из них были выявлены зоны активности, соответствующие, как мы полагаем, 17 аллозимным локусам.

Для ферментов супероксидцисмутаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, глюкозо-6-

фосфатдегидрогеназа и менадионоксидредуктаза были обнаружены одноаллельные мономорфные локусы Sod-1, Sod-2, Mdli-1, Mdli-2., G6pdh-1, G6pdh-2, Mnr-1 и Mnr-2 соответственно. Этот результат получен для 100 изолятов из различных популяций P. infestans.

Для ферментов фосфоглюкоизомераза, пептидаза и маликэнзим были получены как олигоаллельные полиморфные локусы ОрЫ (аллели 86 и 100), Рер-1 (аллели 92, 96 и 100) и Ме (аллели 90 и 100), так и одноаллельные мономорфные локусы Ор1-2, Рер-2 и Рер-3 соответственно. Предположительно мономорфные локусы этих ферментов выявлялись не во всех разгонках, соответствующие им зоны имели слабую активность.

Для фермента фосфоглюкомутаза мы обнаружили три предполагаемых локуса. Локусы Орт-1 были, на наш взгляд, одноаллельными и мономорфными, локус Срт-2 был представлен двумя аллелями, однако их разделение не всегда было достаточно четким, поэтому интерпретировать наблюдаемый полиморфизм мы не смогли. Для фермента лейцинаминопептидаза зон активности выявлено не было.

По локусу СрЫ изоляты из всех проверяемых популяций имели аллель 100 (генотип 100/100). Лишь в одинцовских томатных популяциях Р. 1992 и 1993 г. встречался генотип 86/100 (табл.

5). Буферная система ТЭБ показала наихудшее разделение полос СрЫ.

По локусу Рер-1 мы обнаружили аллели 100, 96 и 92. Зоны, соответствующие аллелям 100 и 96, имели близкую подвижность и разделение этих зон было в ряде случаев незначительным. Аллель 100 (генотип 100/100) преобладал в большинстве популяций (табл. 5). Исключением были одинцовские томатные изоляты, в которых часто встречался аллель 96 (генотипы 96/96 и 96/100). Аллель 92 (генотип 92/100) встречался в одинцовских томатных популяциях 1993 года.

По локусу Ме мы обнаружили аллели 100 и 90. Большинство изолятов из всех проверяемых популяций имели генотип 100/100. Генотип 90/100 встречался в различных популяциях Р. т/еНапь на картофеле и томатах. Генотип 90/90 мы обнаружили только у Воскресенских изолятов 1993 года, выделенных с картофеля.

Табл. 5. Частоты аллозимных генотипов по локусам ОрЫ, Рер-1 и Ме в подмосковных популяциях Р. т/с$1ат.

врЫ Рер -1 Ме

Популяции (см табл.1) 100/ 100 86/ 100 100/ 100 96/ 100 96/ 96 92/ 100 100/ 100 90/ 100 90/ 90

картофель, 1991

КТ91 100% 67% 33% 83% 17%

КУ91 100% 100% 75% 25%

томаты, 1992

ТР092 25% 75% - - 100%

картофель, 1993

К093 100% | 100% 1 92% 8%

КУ93 100% 100% 1 0% 100%

томаты, 1993

ТР093 89% 11% 100% 1 100%

ТШ93 50% 50% 50% 10% 40% 92% 8%

картофель, 1995

К2У95 100% 83% 17% 100%

томаты, 1995

ТР2У95 100% 100% 100%

ТР095 100% 53% 5% 42% Тоо%

Т1.095 100% 63% 25% 12% 100%

ТРУ95 100% 75% 25% 100%

картофель, 1996

К096 100% 100% I 75% 25%

Кгу96 100% 100% | 63% 37%

томаты, 1996

ТР096 100% 38% 62% | 100%

По ОрЫ, Рер-1 и Ме в Московской области наиболее часто встречались "новые" генотипы Р. ¡п/Ышк 100/100, 100/100, 100/100; 100/100, 100/100, 90/100; 100/100, 96/100, 100/100 и 100/100, 96/96, 100/100 (табл. 6). Генотип 100/100, 100/100, 90/90 встречался только на картофеле в Воскресенске в 1993 г. Генотипы "старого" типа 100/100, 92/100, 100/100; 86/100, 100/100, 100/100 и 86/100, 92/100, 100/100 встречались только на одинцовских томатах в 1992 и 1993 годах.

Из табл. 7 следует, что для всех сравнений межпопуляционное генное разнообразие превышает внутрипопопуляционное генное разнообразие.

Табл. 6. Частоты комплексных аллозимных генотипов по локусам

Gpi-1, Рер-1 и Ме в подмосковных популяциях Р. infestans.

Gpi-1 Рер-1 Ме

Популяции (см. табл.1) 100/100 100/100 100/100 100/100 100/100 90/100 100/100 100/100 90/90 100/100 96/100 100/100 100/100 96/96 100/100 100/100 92/100 100/100 86/100 100/100 100/100 86/1 (И 92/10< 100/10

картофель, 1991

KT9I 67% | 33%

KV91 1 75% | 25%

картофель, 1993

К093 92% 8% 1 I

KV93 100% I

томаты, 1993

ТР093 TLÖ93 100%

22% 11%, 1 11% 11% 11% 34%

картофель, 1995

KZv95 | 83% | | | 17% | 1 | |

томаты, 1995

TPZv95 100%

ТР095 47% Н 6% 47%

TL095 1 63% 25% 12%

TPV95 "1 100%

картофель, 1996

К096 75% 25%

KZv96 | 62% 38%

томаты, 1996

TPQ96 Т" " I \ | 38% [ 62%

Табл. 7. Сравенис внугрипопуляционного (Hs) и межпопуляционного (Gsr) генного разнообразия в подмосковных популяциях Р. infestans по

локусам Gpi-1, Рер-1 и Ме.

Популяции на картофеле Популяции на томатах Все популяции

Локусы Hs GST Hs Gst HS Gst

Gpi-1 _ А 0,09 0,36 0,05 0,38

Рер-1 0,08 0,33 0,23 0,38 0,15 0,38

Ме 0,16 0,55 - 0,09 0,64

Но 3 локусам 0,08 0,5 0,11 0,35 0,09 0,5

"Популяции Р. infestans высоко мономорфны по этому локусу.

7. Изменения популяции в течение вегетационного сезона.

Мы изучили одинцовскую картофельную популяцию P. infestons 1993 года, включающую в себя субпопуляции К093-1 (выделена из образцов, собранных в конце июля), К093-2 (выделена из образцов, собранных 1-5 августа) и К093-3 (выделена из образцов, собранных 5-7 августа), по основным маркерам.

Было обнаружено, что популяция К093 в основном мономорфна по типам совместимости, устойчивости к металаксилу и 3 аллозимным локусам (табл. 3, 5 и 6). По генам вирулентности и расам мы обнаружили полиморфизм и различия между субпопуляциями. Они сводились к следующему.

1) Увеличение средней вирулентности к картофелю за счет увеличения частот генов вирулентности а2, а4, а5 (особенно интенсивно), а7, а8, а10 и ail (фиг. 1).

2) Снижение разнообразия по "картофельным" расам. Этот эффект был более выражен для рас с селективно зависимыми генами (al-a4) и менее выражен для рас с селективно нейтральными генами (а5, а7-а 11). Частота "суперрасы" возрастала, частоты других рас уменьшались.

3) Снижение частоты "томатной" расы Т1 от 50% до 28%.

8. Определение основного способа размножения подмосковных популяций 1991-1996 годов. Закономерности, обнаруженные нами в полевых подмосковных популяциях 1991-1996 годов, сводятся к следующему.

1) Преобладание в большинстве популяций только одного типа совместимости.

2) Отсутствие ооспор в течение вегетационного сезона, обнаружение ооспор в отдельных популяциях перед зимовкой.

3) Значительное преобладание межпопуляционного генного разнообразия (по Gpi-1, Рер-1 и Me) над внутрипопуляционным разнообразием.

Фиг. 1. Изменение средней вирулентности к картофелю в одинцовской картофельной популяции Р. \nfestam 1993 г. в течение вегетационного сезона.

ГЕНЫ а1-а*

ГЕНЫ а5,а7-а11 ПОПУЛЯЦИИ ГЛИГЕЗТОНв В 1(033-1 а Х093-2 СЗ ХОЗЗ-З

ГЕНЫ а1-а5,а7-а11

4) Быстрое вытеснение расой со всеми генами вирулентности большинства остальных рас в течение 2-3 недель.

Исходя из этих фактов, мы полагаем, что подмосковные популяции Р. ш/вйшв 1991-1996 г. имели подразделенную клональную структуру, то есть они представляли собой совокупность клонов, связанных между собой миграционными взаимодействиями. В течение вегетационного сезона в популяциях преобладало бесполое размножение, в некоторых популяциях перед зимовкой было отмечено и половое размножение. Мы полагаем, что к 1996 г. в популяциях Р. и^сагат сформировалась смена способов размножения по типу, например, ржавчинных грибов: бесполое размножение - летом, половое

- перед зимовкой. Свидетельств паимиксии (свободного скрещивания при регулярном и частом половом размножении) мы не обнаружили.

9. Сравнение картофельных и томатных популяций P. infestans. Популяции P. infestans на картофеле были в основном сходны по частотам типов совместимости (табл. 3), vir-генов al-a4 (табл. 4) и аллозимных локусов Gpi-1 и Me (табл. 5). Большая часть картофельных и томатных популяций различались по частотам устойчивости к металаксилу (табл. 3), vir-генов а5, a7-all (табл. 4) и локуса Рер-1 (табл. 5), и лишь отдельные популяции были сходны по этим признакам. Наконец, популяции на картофеле и томатах в основном различались по расам ТО и Т1.

Частая встречаемость селективно зависимых vir-генов al-a4 а также высокое сходство картофельных и томатных популяций Р. infestans по этим генам (фиг. 2) свидетельствует, что в томатных популяциях гриба они возникли благодаря миграциям картофельных штаммов P. infestans на томаты.

По селективно нейтральным генам a5,a7-all все популяции Р. infestans 1993 года отличались от популяций 1995 года (фиг. 3). В 1993 г. картофельные и томатные популяции кластеризовались независимо друг от друга, в 1995 г. картофельные и томатные популяции кластеризовались частично раздельно, частично - совместно.

По локусам Gpi-1, Рер-1 и Me (фиг. 4) картофельные и томатные популяции P. infestans 1993 и 1995 года были частично сходны, частично различны. В 1996 г. картофельные и томатные популяции кластеризовались полностью независимо, это было обусловлено различиям! по локусу Рер-1.

В 1993 и 1995 г. одни и те же расы преобладали и в картофельных, и в томатных популяциях P. infestans. Однако в картофельных, и особенно в томатных популяциях были отмечены редкие расы, встречающиеся только в них. Поэтому индекс Шеннона

Фиг. 2. Сравнение подмосковных картофельных и томатных популяций Р. ¡н/с,исии 1993 и 1995 годов по частотам селективно зависимых генов вирулентности а1-а4 на основе дистанций Роджерса. Названия популяций - в табл. 1.

TREE DIAGRAM

0.000 TPZV95

KZV95 ТР095 TL095 К093 KV93 ТР093 TL093

DISTANCES

50.000

Фиг. 3. Сравнение подмосковных картофельных и томатных популяций P. infestans 1993 и 1995 годов по частотам селективно нейтральных генов вирулентности a5.a7-all на основе дистанций Роджерса. Названия популяций - в табл. 1.

TREE DIAGRAM

DISTANCES

100.000

0.000 TL093

ТР093

К093

KV93

TPZV95

KZV95

ТР095

TL095

Фиг. 4. Сравнение подмосковных картофельных и томатных популяций Р. Ы/еа1агк 1993, 1995 и 1996 годов по частотам аллозимных локусов врЫ, Рер-1 и Ме на основе дистанций Роджерса. Названия популяции - в табл. 1.

ГР.ЕЕ DIAGRAM

0.000 KV93 -

DISTANCES

100.000

KZV96 К096 К093 TPZV95 ТР093 KZV95 TPV95 TL095 ТР095 TL093 ТР096

для разнообразия рас в томатных популяциях был выше, чем в картофельных. Отметим, что наибольший вклад в общее разнообразие по расам вносило разнообразие по селективно нейтральным «г-генам.

В 1993 и 1995 по врЫ, Рер-1 и Ме в картофельных и томатных популяциях Р. ¡п/е&ат встречались как одни и те же так и различные комплексные генотипы (табл. 6). В популяциях 1996 г. генотипы в картофельных и тог —чых популяциях отличались друг от друга.

В отдельных случаях томатные популяции (как правило, с плодов, реже - с листьев томатов) кластеризовались более тесно с картофельными популяциями, чем с томатными популяциями из того же ареала (фиг. 2, 3, 4). В других случаях картофельные и томатные популяции гриба со смежных ареалов (полей) кластеризовались независимо друг от друга.

Таким образом, часть картофельных и томатных популяций были сходны друг с другом по большинству признаков. Поэтому, отвергая крайние точки зрения о тотальной дивергенции картофельных и томатных популяций P. infestons а также об их полном сходстве, мы приняли промежуточную точку зрения - модель комплексной структуры вида P. infestons с тенденцией к дивергенции. Томаты, на наш взгляд, -это особая экологическая ниша, в которой возможно более длительное сосуществование как клонов P. infestons, имеющих картофельное происхождение, так и специфических томатных клонов гриба. В этом заключается буферная функция томатной популяции - сохранение различного генетического материала на видовом уровне.

Возможность дивергенции картофельных и томатных популяций P. infestons определяется равновесием между прессом доминирующей картофельной популяции и изоляционными генетическими механизмами, присущими томатным популяциям. Вероятно, в таких случаях для фитопатогснных грибов действует общая закономерность. Гак, возможная дивергенция популяций гриба, паразитирующего (в одной и той же стадии жизненного цикла) на нескольких растениях, определяется степенью генетической и пространственной изоляции популяций хозяина а также их количественным соотношением. Если факторы изоляции отсутствуют или слабо выражены и популяция одного из растсний-хозяев преобладает, то дивергенции популяций паразита не будет, структуру вида паразита будет определять популяция на преобладающем растении. Если факторы изоляции (хотя бы один из

них) эффективны, но не полностью и популяция одного из хозяев преобладает, то структура вида паразита будет комплексной, но возможность появления дивершрующих популяций патогена на одном из растений всегда сохраняется (ситуация с P. infestons), И если факторы изоляции (хотя бы один из них) стабильны и эффективны и популяции хозяев количественно сопоставимы, то в таких популяциях патогена очень вероятны процессы дивергенции, ведущие к микроэволюции и видообразованию (ситуация с Phytophthora megasperma).

10. Оценка влияния бактерии гифосферы P. infestons на популяции гриба. Впервые мы обратились к этой теме, столкнувшись с нетипичными полосами изоферментов (Gpi, Mdh), обнаруженными при электрофорезе некоторых штаммов P. infestons. На гелях проявлялись нехарактерные для P. infestons полосы, в то время как обычные полосы P. infestons отсутствовали.

Проверив маточные культуры, используемые для электрофореза, мы обнаружили в них лизис мицелия, часто ведущий к центробежному лизису колоний на искусственных средах (фиг. 6), и многочисленные морфологические отклонения. Они выражались в пустых гифах с нетипипичным ветвлением и частыми септами (ненормальными выростами продольных стенок и сгущениями пристеночной цитоплазмы), зооспорангиев с нетипичными размерами, формой и содержимым. Всем этим явлениям сопутствовали бактерии, находящиеся в пределах гифосферы P. infestons.

Мы проверили картофельные и томатные образцы in planta, собранные в Томской и Московской областях, после их икубации во влажной камере при температуре 17-20°С в течение 1-6 суток. В аккуратно собранном воздушном мицелии P. infestons были также обнаружены лизисные явления и морфологические отклонения, всем им сопутствовали бактерии в гифосфере гриба.

С течением временем морфологические отклонения P. infestons in vitro и in planta возрастали, увеличивалась и частота встречаемости бактерий гифосферы.

В целом, между частотой морфологических отклонений P. infestons и встречаемостью бактерий гифосферы была обнаружена позитивная корреляция (табл. 8). Характерно, что в большей степени бактерии гифосферы сопутствовали лизису гиф и образованию в них септ, и в меньшей степени - изменениям ветвления и морфологии гиф.

Табл. 8. Число проверенных образцов P. infestans in vitro и in vivo, характеризующихся определенным суммарным индексом морфологических отклонений и встречаемостью бактерий гифосферы.

Суммарный иццекс оценки морфологических отклонений (баллы)*

in vitro in vivo

(68 проверенных образцов ); г=0,60** (63 проверенных образца); г=0,73

Встречаемость бактерий гифосферы 0 - 3 4, 5 > 5 0 - 3 4, 5 > 5

нет. единично 14 1 2 ■ 13 1 0

редко 4 12 10 5 20 2

обычно и чаще L. 2 _ 1 22 0 г-г-Я-'-^ 13

* Суммарный индекс - сумма баллов для всех 4 типов морфологических отклонений (пустые гифы, гифы с септами, гифы с нетипичным ветвлением и нетипичные зооспоранпш); **г-коэффициент корреляции.

Согласно визуальной оценке, в гифосфере бактерий (на лизируемых и нетипичных гифах а также внутри них) были обнаружены #яс/7Л«-подобные клетки и цепочки из нескольких клеток. Они присутствовали на начальной стадии развития лизиса мицелия гриба. По мере развития лизиса на гифах и внутри них мы наблюдали Зт'рШпусез-поАоЬиыс цепочки клеток, также преимущественно на

Фиг. 5. Бактерии на гифе P. infestons. Фиг. 6 Лизис колонии P. infestons

гифах мы наблюдали Pseudomonas-nojipbiiuc клетки (фиг. 5). Нередко бактерии образовывали на пораженных гифах чехловидные скопления, развивающиеся вдоль гиф. В одних случаях они представляли собой Pseudomonas-nojioÇume. бактерии, в других - смесь всех трех типов бактериальных клеток.

Мы предположили, что лизис P. infestons вызывается бактериями, сопутствующими грибу ;>î planta и in vitro и способными к облигатному

существованию в его гифосфере. Для этого мы предприняли несколько попыток выделения, испольуя гороховый агар, МПА и среду с добавкой ироавтоклавированного экстракта из растертого мицелия P. infestons. В большинстве случаев на этих средах роста культур при температурах 18, 25 и 33°С зарегистрировано не было. Несколько культур, которые все же удалось выделить, не вызывали лизиса мицелия P. infestons, сосуществуя с ним нейтрально. И лишь один из выделенных образцов, идентифицированный нами как смесь родов Bacillus и Streptomyces, уже на 5-ые сугки резаражения образовывал мощную чехловидную стадию и вызывал выраженный лизис мицелия гриба. Однако данные бактерии столь же интенсивно развивались на овсяном агаре без P. infestons, что указывает на отсутствие облигатных связей между ними.

Характер выделения показал, что бактерии гифосферы, облигатно сопутствующие начальной стации лизиса P. infestons in planta и in vitro, выделены не были. Мы надеемся решить эту проблему в будущем.

Установленные факты по в&мосвязям между P. infestons и бактериям ее гифосферы позволяют установить, что бактерии гифосферы сопутствуют мицелию гриба и способны вызывать его лизис.

Мы не исключаем, что бактерии гифосферы - фактор, способный регулировать структуру и численность природных популяций гриба. После специальных дополнительных исследований бактерии гифосферы можно будет использовать в биоконтроле против P. infestons.

ВЫВОДЫ

1. В большинстве подмосковных популяций P. infestons преобладали штаммы AI. Штаммы А2 встречались реже, лишь в отдельных популяциях их частота достигала 40-50%. Все популяции Р. infestons были высоковирулентны к картофелю. Картофельные популяции включали в себя преимущественно расу ТО, раса Т1 встречалась в них значительно реже. В картофельных популяциях встречались как устойчивые, так и чувствительные к металаксилу штаммы. В томатных популяциях доминировали раса Т1 и штаммы, чувствительные к металаксилу.

2. В подмосковных популяциях P. infestons доминировали генотипы "нового" типа, генотипы "старого"' типа были обнаружены лишь в томатных популяциях 1992 и 1993 годов. Полученные данные приводят к заключению, что замещение генотипов "старого" типа генотипами "нового" типа в подмосковных популяциях проходило в 1980-ые и 1990-ые годы.

3. Часть подмосковных популяций P. infestais на картофеле и томатах были сходны друг с другом, другие популяции отличались друг от друга. Мы полагаем, что в условиях Московской области вид Р. infestons имеет комплексную структуру с тенденцией к дивергенции по отношению к растениям-хозяевам.

4. В 1991-1995 годы популяции P. infestons л Московской области имели подразделенную структуру. В течении вегетационного сезона они размножались преимущественно бесполым путем. Перед зимовкой для некоторых популяций были обнаружены ооспоры. В последующие годы мы не исключаем возможности распространения в Подмосковье панмиксных популяции P. infestons.

5. В гифосфере образцов P. infestons в Московской области были обнаружены бактерии. Они относились к родам Bacillus, Streptomyces и Pseudomonas. Согласно нашим данным, они сопутствовали P. infestons in

vivo и in vitiv и вызывали лизис мицелия. Эти бактерии могут быть использованы для контроля численности популяций Л infestans.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Dolgova A.V., Dyakov Yu. Т. & Smirnov A. Distribution of mating types and vegetative compatibility groups in populations of Phytophthora infestans from Russia, Belorussia and Estonia // Phytophthora newsletter, 1992, # 18, pp. 4-5.

2. Dolgova A. V., Smirnov A. N., Dyakov Yu. T. Phytophthora infestans populations in former Soviet Union // in: 2-nd European Conference on fungal genetics, Lunteren, 1994, E29.

3. Дьяков Ю. Т., Аникина M. И., Багирова С. Ф., Долгова А. В., Колесников А. А., Малеева Ю. В, Смирнов А. Н. Популяции Phytophthora infestans на территории России и сопредельных стран (структура, динамика генотипического состава, регулирующие механизмы) // в материалах всероссийского съезда по защите растений, Санкт-Петербург, 1995, стр. 562.

4. MaJeeva J. V., Dolgova А. V.. Smirnov A. N., Bagirova S. F., Kolesnikov A. A., Shaw D. S. and Dyakov Yu. T. Phytophthora infestans populational diversity on potato and tomato in Moscow region // in: 3rd European Conference on fungal genetics, 1996, p. 96; Munster, Germany.

5. Долгова А. В., Смирнов A. H., Дьяков Ю. Т. Популяции Phytophthora infestans (Mont.) D By в России и некоторых странах бывшего СССР // Микология и фитопатология, 1996 г., т. 30, N 3, стр. 55-60.

Многоуважаемый Коллега.

Отзыв на эту диссертацию Вы можете послать по адресу:

119899 Москва, Воробьевы горы Московский государственный университет Биологический факультет

Секретарю диссертационного совета Д.053.05.65 д.б.н. Лекомцевой С. Н.

или по факсу: (933' 43 03