Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяции фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont. ) de Bary на территории России

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Популяции фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont. ) de Bary на территории России"

Московский Государственный Университет р у g ОД им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

2 1 ДЕН 1S38

На правах рукописи УДК 582.281.14:575.224:632.4

Еланский Сергей Николаевич

Популяции фитопатогенного гриба Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу

на территории России.

03.00.24 Микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Диссертационная работа выполнена в 1995-1998 г.г, на кафедре Микологии и Альгологии Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор Ю.Т. Дьяков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор C.B. Каменева

кандидат биологических наук А.В.Филиппов

Ведущая организация:

Московская Сельскохозяйственная Академия им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 25 декабря 1998 г. в 15 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.053.05.65 Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический ф-т, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 ноября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

С.Н.Лекомцева

Общая характеристика работы.

Актуальность темы.

Картофель - самая популярная овощная и техническая культура на территории России. Поэтому изучение биологии Phytophthora infestans-возбудителя фитофтороза картофеля и томатов - одна из важнейших задач современной микологии и фитопатологии.

Эпифитотии фитофтороза поражают картофель в Европе уже более 150 лет -начиная с 1845 г. За это время изобретено немало мер борьбы с возбудителем фитофтороза (прежде всего выведение устойчивых сортов и химическая защита), но очень высокая изменчивость гриба сводит на нет многие усилия специалистов по защите растений. Например, фунгицид металаксил был очень эффективен в первые годы применения. Однако по прошествии нескольких лет в популяциях Р. infestons стали преобладать устойчивые к металаксилу штаммы и препарат потерял эффективность. Чтобы накопление устойчивых к фунгицидам и вирулентных к сортам картофеля и томатов форм P. infestons не приводило к эпифитотиям, необходимо регулярно исследовать популяции паразитных грибов, фиксировать происходящие в них изменения, определять уровень резистентности популяций к фунгицидам и вирулентности к сортам растений и, в соответствии с полученными сведениями, строить систему защитных мероприятий.

Цель работы.

Целью работы было изучение популяций P. infestons. Наибольшее внимание уделялось следующим направлениям исследований:

1. Изучение изменений, произошедших в подмосковных популяциях за период 1991-1998 г.г.

2. Сравнение подмосковных популяций P. infestons на картофеле и томатах.

3. Сравнение российских популяций P. infestons.

4. Изучение возможных путей распространения патогена.

5. Исследование ооспорообразования как одного из механизмов возобновления популяций.

6. Проверка возможности полового размножения в подмосковных популяциях P. infestons.

7. Изучение устойчивости P. infestons к фунгицидам и индукторам окислительного стресса.

Задачи работы.

Для достижения указанных целей были определены следующие задачи:

1. Выделение коллекций P. infestons из природных популяций.

2. Изучение образования ооспор в пораженных фитофторозом растениях.

3. Изучение типа спаривания, устойчивости к металаксилу, плюмбагину и диметоморфу, исследование спектра изоферментов у изолятов P. infestons.

4. Изучение переноса спор P. infestons с воздушными течениями.

5. Исследование колонизации листьев картофеля и томатов выделенными с картофеля изолятами P. infestons. Измерение выделения листьями картофеля и томатов активного кислорода в ответ на внедрение P. infestons, возникновения некрозов и спороношения на пораженных листьях.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе представлены данные изучения российских популяций P. infestons с 1991 по 1998 г.г. Проанализирован большой фактический материал, позволивший определить основные тенденции в изменении популяций P. infestons.

Впервые проведены исследования встречаемости ооспор в пораженных фитофторозом растительных образцах.

Впервые исследовано воздействие циклических индукторов окислительного стресса на P. infestons и исследована встречаемость в популяциях устойчивых к циклическому индуктору окислительного стресса плюмбагину штаммов.

Впервые исследована микобиота воздушного бассейна г.Москвы и определены основные закономерности изменения концентрации грибных спор в атмосфере.

Полученные данные могут быть использованы при корректировке используемых стратегий химической защиты картофеля и томатов от фитофтороза, при разработке новых фунгицидов на основе циклических индукторов окислительного стресса и для целей прогноза развития эпифитотий фитофтороза в условиях Центрального региона России.

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на Всероссийской конференции «Современные проблемы микологии, фитопатологии и альгологии» (Москва, 1998), Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы охраны и рационального использования природных экосистем и биологических ресурсов» (Пенза, 1998), на конференциях молодых ученых «Атмосферный озон» (Москва, 1997) и «Малые примеси в атмосфере» (Москва, 1998 г.). Материалы исследований спор грибов в атмосфере Москвы представлялись на Международной Аэробиологической школе «Advanced Aerobilogy School - 1998» (Италия, Рива дел Гарда, 1998). Работа была представлена на заседании кафедры Микологии и Альгологии Биологического ф-та МГУ (Москва, 1998 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы или приняты к печати 12

работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав, посвященных полученным

юзультатам и их обсуждению, заключения, выводов, списка литературы и

[риложения. Диссертация изложена на_страницах, содержит_таблиц и

_ рисунков. Список литературы включает 61 работу на русском и 142 на

[ностранных языках.

Благодарности. Автор искренне благодарит проф. Ю.Т. Дьякова за юддержку, консультации и помощь в выполнении работы, А.Н. Смирнова, И.В. Еланскую, С.Н. Лекомцеву, Д.В. Рыжкина, А.В. Долгову, С.Ф. Багирову, А.В. Лпилева, И.И. Попову за большую помощь в работе, А.В. Филиппова, Ю.А. 1икина, Ань Цзянли и проф. Н.Р. Мейер-Меликян за предоставленные для »бработки образцы.

Содержание работы.

Обзор литературы. В этой главе представлен обзор работ, посвященных пучению P. infestons. Разделы данной главы показывают современное состояние ^следований в области популяционной биологии, выделения активных форм сислорода растениями в ответ на внедрение P. infestons, механизмов действия даклических индукторов окислительного стресса. В обзоре рассмотрены фименяемые в настоящее время для борьбы с фитофторозом фунгициды, особое шимание уделено металаксилу и диметоморфу.

Материалы и методы.

Материалы. Сбор пораженных фитофторозом образцов производили в уГосковской области (Талдом (1991), Воскресенск (1991, 1993, 1995), Одинцово 1992, 1993, 1995, 1996, 1997, 1998), Звенигород (1995,1996, 1997, 1998), Рузский 1997,1998) и Шаховской (1998) районы (рис. 1)). Для сравнения были 1роизведены сборы в Томске (1994,1995), Хабаровске (1997) и на Сахалине (1997). I! 1991 по 1997 г.г. были выделены изоляты из 47 популяции, включающих около '39 штаммов. Сборы в Подмосковье 1991-1993 г.г. проведены А.Н. Смирновым и ^.В. Долговой, сборы 1995-1998 г.г,- автором совместно с А.Н. Смирновым и А.В. Долговой; штаммы из сибирских и дальневосточных популяции собраны и ¡ыделены Ю.А. Чикиным, А.В. Филипповым и А.В. Долговой (табл. 1). В работе по пучению образования ооспор исследованы на наличие ооспор 433 пораженных фитофторозом образца листьев картофеля и томатов и плодов томатов из Иосковской области.

Методы. Изоляты гриба культивировали на овсяной агаризованной среде. Гипы спаривания (А1 и А2) определяли методом попарного посева на чашку с »веяной агаризованной средой исследуемого изолята и тестера. В качестве

Табл. 1. Результаты тестирования российских популяций 1991-1997 г.г.

Место дата число % Ме Рер1 % % %Т1

выделения,растен изол. А2 М1 РЬ

ие-хозяин 811

+И

1991 г.

МО,Талдом,К авг. 15 47 100:100-0,67 100:100-0,67 80 - 0

90:100-0,33 96:96-0,33

МО,Воскресенск,К авг. 11 46 100:100-0,75 100:100-1,0 91 - 0

90:100-0,25

1992 г.

Адлер, ТП июль 4 0 90:100-1,0 92:92-1,0 0 - 50

МО,Одинцова авг. и 0 100:100-1,0 - 0 - 100

Поле X» 2, ТП

1993 г.

МО,Одинцово Авг. 19 10 100:100-1,0 100:100-0,5 16 20 100

Поле № 1,ТЛ. 92:100-0,5

МО.Одинцово авг. 14 0 100:100-1,0 100:100-1,0 0 - 90

Поле № 1,ТП

МО.Одинцово авг. 2 50 - - 0 - 100

Поле № 2,ТП

МО.Одинцово,К июль 22 0 100:100-0,67 100:100-1,0 100 - 60

90:100-0,33

МО,Одинцово, К авг. 59 5 100:100-1,0 100:100-1,0 100 - 33

МО.Воскресенск, К авг. 15 0 90:90-1,0 100:100-1:0 13 0 6

1994 г.

Томск авг. 7 0 - 100:100-1,0 71 - -

1995 г.

МО,Звенигород, К авг. 15 27 100:100-1,0 100:100-0,83 13 - 30

96:100-0,17

МО,Звенигород, авг. 20 0 100:100-1,0 100:100-1,0 0 - -

ТП

МО.Одинцово авг. 17 35 100:100-1,0 100:100-0,75 12 - 100

Поле №2, ТЛ 96:100-0,25

МО.Одинцово авг. 28 33 100:100-1,0 100:100-0,46 4 0 90

Поле №2, ТП 96:100-0,08

96:96-0,46

МО.Одинцово авг. 14 0 100:100-1,0 100:100-1,0 7 0 100

Поле № 1,ТП

МО.Воскресенск, авг. 14 86 100:100-1,0 100:100-0,75 14 - -

ТП 100-0,25

Томск авг. 24 0 90:100-1,0 100:100-1,0 38 - -

Томск авг. 30 0 - 100:100-1,0 32 - -

Место выделения„раст. хозяин дата число изол. % А2 Me Pepl % Mt SR+R % Pb SR+R %T1

1996 г.

МО,Одинцово,К авг. 4 25 100:100-0,75 90:100-0,25 100:100-1,0 75 0 -

МО,Звенигород,К авг. 8 25 100:100-0,5 90:100-0,5 100:100-1,0 38 0 -

МО.Одинцово Поле № 1,ТП авг. 21 19 100:100-1,0 96:100-0,3 96:96-0,7 14 0 -

1997 г.

Москва, К авг. 19 0 100:100-1,0 100:100-0,6 100-0,4 48 0 -

МО, Орехово-Зуево, ТП авг. 39 3 100:100-1,0 96:96-1,0 12 0 -

МО,Одилцово Поле № 2, ТП 28.08 10 30 100:100-1,0 96:96-1,0 50 0 -

МО, Одинцово Поле № 2, ТП 8.09 21 14 100:100-1,0 96:100-0,13 96:96-0,87 70 0 -

МО,Руза, К 22.08 15 40 100:100-0,8 90:100-0,2 100:100-0,67 96:100-0,11 83:100-0,22 40 20

МО,Руза, К 28.08 5 40 100:100-1,0 100:100-1,0 17 17 -

МО, Руза, К 3.09 7 71 100:100-1,0 100:100-1,0 14 28 -

МО,Звенигород,К 13.08 14 24 100:100-1,0 100:100-0,67 96:100-0,33 15 16 -

МО,Звенигород,К 22.08 15 0 100:100-1,0 100:100-0,67 92:100-0,33 21 10 -

МО,Звенигород,К 28.08 10 30 100:100-1,0 100:100-0,5 96:100-0,25 92:100-0,25 0 38

МО,Звенигород,К 1.09 21 52 100:100-0,92 90:100-0,08 100:100-0,92 96:100-0,08 27 32 -

Сахалин,К 5.08 64 0 90:100-1,0 100:100-1,0 100 - -

Омск,К 2.09 20 0 90:100-1,0 100:100-1,0 100 10 -

Хабаровск,К 11.08 25 100 100:100-1,0 100:100-1,0 100 0 -

Данные по спектру изоферментов в популяции приведены в виде X:Y-Z, где: X и Y - аллели изоферментов. Для приведения обозначения аллелей в соответствие с международно принятыми нормами использовали штаммы с известными характеристиками, полученными от D.S. Shaw (UK) W.E. Fry (USA); Z - частота аллеля в популяции; SR+R - суммарная доля слабоустойчивых и устойчивых штаммов в популяции; / - / означает отсутствие данных, Pepl - локус 1 пептидазы, Me - малик-энзим, Mt -мета-лаксил, РЬ - плюмбагин.

Рис. 1. Места сбора образцов на территории Московской области.

тестеров использовали штаммы из коллекции каф. Микологии и Альгологии (М550-А2 и Б5-А1). Устойчивость к металаксилу определяли путем сравнения роста гриба на средах с концентрациями металаксила 0, 1, 10 и 100 мкг/мл, устойчивость к плюмбагину - 0, 2 и 4 мкг/мл, диметоморфу - 0 и 2 мкг/мл. Для определения томатных рас ТО и Т1 исследуемыми изолятами заражали сорта томатов Талалихин (без генов устойчивости) и Оттава (расти на нем способны только изоляты расы Т1). Электрофорез с целью изучения спектра изоферментов проводили в горизонтальном крахмальном (13%) геле (Mickales & Bonds, 1985). Для электрофореза были использованы 4 буферные системы - трис-цитрат (Adams, Joly 1980), трис-цитрат-ЫОН-борат (Ridgeway et al., 1970), трис-ЭДТА-борат (Guríes, Ledig 1978). Окраску гелей и их срезов осуществляли как описано у Manchenko (1994), Shaw & Prasad (1970), Cheliak & Pitel (1984). Выделение активного кислорода замерялось по методике Doke (1983) с использованием нитросинего тетразолия. Выделение тотальной ДНК для RAPD-анализа проводилось как описано в диссертации Малеевой (1996). Отбор образцов спор грибов в воздухе проводилось с помощью автоматической ловушки Херста, установленной на территории метеорологической обсерватории МГУ на высоте 15 м. Готовые образцы коллекций 1993 и 1996 г.г. были предоставлены каф. Высших растений МГУ, метеоданные-метеорологической обсерваторией МГУ. Визуальная идентификация грибных спор проводилась с помощью атласов спор (Smith, 1986, Nilsson, 1983); подсчет спор грибов в образцах проводился согласно методикам, изложенным в Methods for Aerobiology (1998).

Результаты исследований.

Устойчивость P. infestans к индукторам окислительного стресса и фунгицидам.

Устойчивость к индукторам окислительного стресса.

Активные формы кислорода (АФК) выделяются растениями в ответ на внедрение паразитов. Они продуцируются различными веществами и ферментами. Существуют вещества, способные генерировать кислородный радикал 02", перенося перехваченый из дыхательной цепи электрон на атом кислорода. Соединения, способные после переноса электрона на кислород восстанавливать исходное состояние, называются циклическими индукторами окислительного стресса.

В нашей работе исследовалось действие циклических индукторов окислительного стресса на изоляты P. infestans. Паракват и феназинметасульфат очень слабо подавляют рост гриба. Менадион в концентрации 60 мкг/мл и плюмбагин в концентрации 2 мкг/мл обладают более выраженным ингибирующим действием на рост P. infestans. При проверке большей выборки штаммов обнаружилась высокая положительная корреляция (К=0,9) между устойчивостями к менадиону и плюмбагину.

Для изучения адаптационных способностей P.infestans к воздействию агентов окислительного стресса исследовалась возможность возникновения мутаций устойчивости к плюмбагину. Методом посева на среду с градиентом концентрации плюмбагина из чувсвительного родительского штамма (рос на максимальной концентрации плюмбагина 0.5 мкг/мл) было отобрано 12 мутантов, способных расти на средах с концентрацией плюмбагина 2 мкг/мл. При дальнейшей работе с полученными мутантами удалось получить 2 штамма, способных расти на средах с 4 мкг/мл плюмбагина.

Для проверки предположения о большей агрессивности и вирулентности устойчивых к плюмбагину штаммов по сравнению с чувствительными были проведены анализы на листьях картофеля и томатов. Агрессивность изучали, опрыскивая из пульверизатора разложенные в кювете листья томатов. Концентрация зооспорангиев в распрыскиваемой жидкости доводилась до 1000 на мл. Вирулентность проверяли, заражая ломтики клубней картофеля сортов Санте, Брянская новинка, Белоснежка и Лина. Достоверных отличий по вирулентности и агрессивности от чувствительных штаммов найдено не было. Исследование скорости роста на питательной среде устойчивых и чувствительных штаммов (в том числе устойчивых мутантов) не выявило различий между ними.

Устойчивые к плюмбагину штаммы были отмечены в популяциях с листьев картофеля и томатов и не обнаружены в популяциях с плодов томатов (табл. 2).

Табл. 2. Доля устойчивых и чувствительных к плюмбагину штаммов Р. т/ез1ап5 из подмосковных популяций.

Растение- хозяин Проверено штаммов устойчивых (В%)

Листья томатов 32 9

Плоды томатов 114 0

Листья картофеля 146 16

Устойчивость Р. т/Жат к фунгициду диметоморфу.

Рост мицелия природных изолятов Р. ш/ёз/ага полностью подавляется диметоморфом в концентрации 2 мкг/мл. Ань Цзян Ли посредством обработок нитрозометилмочевиной получил устойчивые мутанты, способных расти на среде с 8 мкг/мл диметоморфа.

Мы изучали мутантов спустя 2 года после их получения. Мутанты Бт2Ь и БшЗЬ, способные расти при концентрации 4 мкг/мл диметоморфа полностью утратили устойчивость, у мутанта Эш1Ь устойчивость снизилась в 2 раза. У мутанта Dm ЗЫ, способного расти при концентрации 8 мкг/мл, устойчивость снизилась до уровня 3 мкг/мл. У потомков мутанта (БтЗЫ) и дикого типа (К27) И7 и Р42 порог устойчивости снизился с 8 до 2 мкг/мл. Мутант От ЗЫ и потомки и Р42 имели частое, неправильное ветвление гиф и единичные зооспорангии неправильной формы (рис.2).

Рис.2. Зооспорангии чувствительного к диметоморфу штамма дикого типа (А) и устойчивого к диметоморфу мутанта (В).

Рис. 3. Скорость роста (в мм/сут) изолятов P. infestons на агаризованной овсяной среде с добавлением 2 мкг/мл диметоморфа и без него.

Исследование популяций P. infesians показало практически полное отсутствие даже слабоустойчивых к диметоморфу штаммов в российских популяциях. Не обнаружено устойчивых штаммов и в популяции с острова Сахалин, где картофель подвергался обработке препаратом «Акробат» (диметоморф+манкоцеб). Единственный штамм с повышенным уровнем устойчивости к диметоморфу (рос в присутствии 2 мкг/мл диметоморфа) был обнаружен в 1993г. на листьях томатов в Подмосковье.

Для мутантов и диких чувствительных штаммов изучена скорость роста на овсяном агаре без фунгицида. В результате опытов выяснилось, что утратившие резистентность мутанты не отличались по скорости роста от чувствительного дикого типа, а сохранившие устойчивость мутанты росли медленнее (рис. 3).

Полученные данные демонстрируют резкое снижение приспособленности у устойчивых к диметоморфу штаммов и ее восстановление с утерей устойчивости.

Устойчивость к фунгициду металаксилу.

Изучению устойчивости изолятов P. infestons к металаксилу посвящено большое число работ. В данной работе мы ограничились изучением устойчивости к металаксилу российских популяций P. infestons. За период 1991-1998 г.г. было протестировано на устойчивость к металаксилу 675 изолятов из 44 подмосковных популяций P. infestons. Сводные данные по годам приведены на рис. 4.

Из рисунка видно, что доля устойчивых к металаксилу штаммов в целом выше в картофельных популяциях гриба. Одновременно заметно увеличение доли устойчивых изолятов в томатных и уменьшение в картофельных популяциях гриба в период 1991-1998 г.г. Это служит одним из доказательств слабого обмена между картофельными и томатными популяциями P. infestons.

100

'1

50

0

картофель

томаты

Рис. 4. Проценты устойчивых к металаксилу штаммов среди томатных и картофельных популяций 1991-1998 г.г.

Рис. 5 иллюстрирует преобладание устойчивых к металаксилу штаммов на листьях томатов. Показательны данные 1998 г. Поле № 2 (опытное поле института ВНИИССОК) в конце июля сотрудниками института было специально заражено устойчивым к металаксилу штаммом Р. т/вашпх. Он преобладал среди выделенных нзолятов в конце июля (71%). Через месяц мы исследовали пораженные плоды томатов с этого же поля и нашли очень мало устойчивых штаммов (11%). На поле № 1 в конце июля проводили обработку металаксилсодержащим препаратом авексил. Вероятно, это явилось причиной высокой доли устойчивых штаммов на листьях. На плодах обнаружено крайне мало устойчивых изолятов. По-видимому, на плодах томатов чувствительные штаммы имеют преимущество перед устойчивыми и вытесняют последних.

Рис. 5. Доли устойчивых к металаксилу штаммов в популяциях Р. т/ехШт с листьев и плодов томатов.

(%)

Dolgova et al. (1992) отмечали, что на популяционном уровне корреляция между А2 типом спаривания и устойчивостью к металаксилу прослеживается очень четко. Мы провели аналогичные рассчеты для 33 популяций 1991-1997 г.г. и корреляции не обнаружили (К=0,04 при значимости 0,82). Возможно, корреляция обнаруживалась только в период, когда происходило внедрение новых генотипов в подмосковные популяции. По-видимому, вновь пришедшие генотипы были А2 типа спаривания и устойчивыми к металаксилу.

Различия между популяциями P. infestans, паразитирующими на картофеле и томатах.

Сравнение изоферментных локусов в подмосковных популяциях

P. infestans.

Мы проводили анализ полиморфизма трех ферментов: фосфоглюкоизомераза (Gpi), пептидаза (Pep), и малик-энзим (Me, он же НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа). У штаммов, выделенных из томатов до 1995 г., с высокой частотой встречался аллель 86 gpi, характерный для "старых" популяций и исчезнувший к началу 90-х годов из западно-европейских популяций. В популяциях, паразитирующих на картофеле, уже в 1991 г. этот аллель отсутствовал. С 1995 г. аллель 86 перестал встречаться и у штаммов из томатов, после чего локус gpi стал полностью мономорфным. Однако взамен ему в популяциях на томатах началось накопление аллеля 96 pep, редкого в популяциях из картофеля (рис 6).

Рис. 6. Частоты аллеля рер-96 в популяциях P. infestons на картофеле и

томатах

Данные свидетельствуют о независимой эволюции популяций P.infestons на картофеле и томатах, а поскольку аллель рер-96 в последние годы стал доминировать в коллекциях из разных точек Московской области (Одинцовский,

Орехово-Зуевский, Воскресенский, Шаховской районы), возможно, он имеет адаптивное значение. Вытеснение аллеля 100 рер аллелем 96 в популяциях P.infestons из томатов, при отсутствии этого процесса в популяциях гриба на картофеле, свидетельствует о сильной генетической обособленности популяций из томатов и картофеля..

Выделение активного кислорода листьями картофеля и томатов при заражении изолятами P. infestons, выделенными с картофеля.

При внедрении в растение паразит преодолевает множество барьеров, одним из которых являются выделенные растением токсичные для гриба активные формы кислорода.

Для данной работы мы использовали 3 выделенных с картофеля штамма Р. .infestons: НШК 14 (ТО, А1, металаксил устойчивый), НШК 30 и НШК 30/2 ( ТО, А2, металаксил чувствительные). Для контроля замерялось выделение АФК неинокулированными листьями картофеля и томатов. При работе обнаружилось, что выделение АФК при инокулировании листьев тремя исследуемыми изолятами сходно. Поэтому для более наглядного представления результатов мы объединили и усреднили данные для трех различных изолятов. Данные контрольных измерений (выделение АФК неинокулированными листьями картофеля и томатов) вычтено из полученных значений, т.е. на графике представлены результаты, касающиеся выделения листьями АФК под влиянием заражения (рис 7).

По оси абсцисс отложено время в мин. от начала заражения, по оси ординат - скорость выделения АФК в условных единицах.

Рис. 7. Скорость выделения 02- листьями картофеля (сорт Лорх) и томатоЕ (сорт Талалихин), инфицированными выделенными с листьев картофеля штаммами Р.

Согласно представленным данным, при заражении томатов выделенными с картофеля изолятами происходит более активное выделение АФК, чем прг

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

50

110 180 240 300

заражении картофеля. По-видимому, мы замерили часть второго пика выделения АФК, ответственную за локализацию и уничтожение внедрившихся несовместимых рас паразита. Это может иметь большое эпидемиологическое значение, т.к. указывает на плохую приживаемость картофельных рас гриба на томатах, что создает преимущества штаммам P. infestons с томатов при заражении новых растений.

Выделение активного кислорода играет большую роль в механизме сверхчувствительности, уничтожая как внедрившегося паразита, так и собственые клетки вокруг места внедрения. Внешне реакция сверхчувствительности выглядит как некроз - почернение и отмирание клеток. Мы провели исследование некротизации тканей листьев томатов универсально восприимчивого сорта Талалихин вокруг места инокуляции. Инокуляцию проводили штаммами P. infestons, изолированными с листьев картофеля и томатов в Московской области. Учитывали цвет некроза, диаметр некроза и интенсивность спороношения. Тестирование показало различия между штаммами, выделенными с томатов и картофеля. Всего было проанализировано 15 изолятов с картофеля и 13 с томатов. Штаммы, выделенные с томатов давали интенсивное спороношение и не образовывали некрозов, в то время как выделенные с картофеля в большинстве случаев давали видимые некрозы и слабее (в целом) спороносили.

Частоты томатных рас ТО и Т1.

Известно, что раса ТО более патогенна для картофеля, чем раса Т1. После пассажа смеси спор рас ТО и Т1 через листья картофеля ТО вытесняет Т1 (Дьяков и др., 1975). Для томатов, напротив, более патогенна раса Т1 (Дорожкина, Псарева 1984, Дьяков и др., 1994). Изучение томатных и картофельных популяций гриба в 1991-1997 г.г. показало преобладание расы ТО на картофеле и расы Т1 на томатах (табл 3).

Таблица. 3. Доли рас ТО и Т1 среди штаммов P. infestons, изолированных с картофеля и томатов.

Процент штаммов типа Т1 и ТО

Год Число штаммов на картофеле на томатах

карт. Том. ТО Т1 ТО Т1

1991 26 100 0 - -

1992 - 15 - - 13 87

1993 73 21 73 27 5 95

1995 10 24 70 30 8 92

1997 15 14 100 0 21 79

* знак - означает, что наблюдения в тот год не проводились.

Основные различия между подмосковными популяциями Р. т/е51ат, выделенными с картофеля и томатов.

Изучение штаммов, выделенных из томатов и картофеля выявило значительные различия между ними. Изоляты с картофеля при заражении листьев томатов вызывают активизацию выделения активного кислорода, что приводит к образованию некрозов на листьях и препятствует распространению гриба внутри растения. Исследование популяций Р. ¡п/еМап.1; на картофеле и томатах показало значительные различия между ними (табл.4).

Табл. 4. Различия между подмосковными популяциями Р. т/еяюпх с картофеля и томатов.

Популяции Картофельные Томатные

Тип спаривания Нет отличий

Частоты изоферментов Частота штаммов с аллелем pep 96/96 не изменяется. Частота штаммов с аллелем рер 96/96 возрастаете 1991 по 1997 г.г.

Устойчивость к металаксилу Убываете 1991 по 1998 г.г. Возрастает с 1991 по 1998 г.г.

Томатные расы Преобладает ТО Преобладает Т1

Анализ полученных данных приводит к выводу о разделении томатных и картофельных популяций Р. т/ехСаю в Подмосковье. По-видимому, в Московской области к настоящему моменту определилась специализированная к паразитированию на томатах раса Р. ш/е^гаж, способная к самовозобновлению и не переходящая на картофель (вероятно, вытесняемая с посадок картофеля специализированными картофельными расами).

Изучение возможности полового процесса в подмосковных популяциях Р. т/е$1апв.

Половой процесс ведет к повышению генетического разнообразия популяций. Следовательно, если в популяции присутствует половой процесс, то величина генетического разнообразия будет увеличиваться с приближением отношения типов спаривания А1:А2 к 1:1. Для изучения данного вопроса мы разделили все исследованные подмосковные популяции на группы в зависимости от доли в них А2 типа спаривания и посчитали их среднее генетическое разнообразие (рис.8).

й О. Ю О

0

1 о-<и о и: о

Щ

>г

н

<и

К

ч

и О-

0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

¿171

Ч— со ю

о" о" о" 1 о" 1 о" 1

о ч—

см со ¥

о" о" о" о*

частота А2 типа спаривания

Рис.8. Зависимость генетического разнообразия популяций соотношения типов спаривания.

Из рисунка видно увеличение среднего генетического разнообразия, посчитанного по независимым изоферментным маркерам с приближением распределения А2:А1 к 1:1. По пилимому, половой процесс нее же существует в подмосковных популяциях Р. ¡п/сх/ат.

Изучение ооспоробразовашш у Р.ш/е5йт.у.

Целью настоящего исследования было подтвердить наличие ооспор в подмосковных полевых популяциях Р. \nfestam на картофеле и томатах и, в случае положительного ответа, изучить динамику их образования в течение вегетационного сезона в зависимости от присутствия мицелием А! и Л2 и в зависимости от интенсивности бесполого спороношения в фитофторозных образцах.

Встречаемость ооспор Р. т/е.ч(ан.ч в пораженных фитофторозом образцах.

Все обнаруженные ооспоры Р. ¡п/кч/ап.н находились по внутренних тканях листьев и плодов (рис. 9). На поверхности листьев и плодов ооспор обнаружено не было, там достаточно часто встречались зооспорангии гриба. Ооспоры Р. т/ез1ат встречались чаше в плодах томатов, чем в листьях томатов и картофеля.

Рис 9. Ооспоры P. infestons в плодах томатов на фоне эпидермиса.

Взаимосвязь между образованием ооспор и типами спаривания.

Для популяций P. infestons на картофеле не удалось выявить корреляции между средним количеством ооспор в популяции и долей А2 типа спаривания, однако доля образцов с ооспорами хорошо коррелировала с долей А2. Для популяций гриба на томатах существует корреляция между количеством ооспор и долей А2 типа спаривания и между процентом образцов с ооспорами и процентом А2 типа спаривания.

Взаимосвязь между образованием ооспор и образованием зооспорангиев.

Для популяций P. infestons на картофеле не было выявлено корреляции между средним количеством ооспор в популяции и долей штаммов с встречаемостью зооспорангиев более 100 на 100 полей зрения. Между процентом штаммов с ооспорами и процентом штаммов с встречаемостью зооспорангиев более 100 на 100 полей зрения была выявлена слабая негативная корреляция. Между долей А2 и долей штаммов с частой встречаемостью зооспорангиев также была обнаружена отрицательная корреляция (табл. 5).

Табл. 5. Коэффициенты корреляции для встречаемости ооспор, зооспорангиев и типов совместимости А2 в популяциях Р. ¡п/ачат на картофеле и томатах.

Среднее число ооспор/100 полей зрения % образцов с ооспорами % образцов с количеством зооспорангиев не менее 100 на 100 полей зрения. % А2

Среднее число ооспор на 100 полей зрения 1 0,7 ±0,2(К*) 0,0(К) 0,3 ±0,5(К)

% образцов с ооспорами 0,99 ±0,01(Т**) 1 -0,5 ±0,3(К) 0,6 ±0,2(К)

% образцов с колич. Зооспоран. не менее 100 на 100 пол. зрен. -0,99 ±0,01(Т) -0,97 ±0,04(Т) 1 -0,6 ±0,3 (К)

%А2 0,99 ±0,01(Т) 0,97 ±0,04(Т) -0,98 ±0,02(Т) 1

* К-популяции с листьев картофеля (7МСЛК, 7МГК, 7МНШК, 7МТК);

** Т - популяции с листьев и плодов томатов (7МОДТП, 7МОЗТП, 7МЗСТЛ).

Корреляции между встречаемостью ооспор и зооспорангиев установить не удалось, так как разброс значений был достаточно велик. Значение коэффициента корреляции было низким (г= -0,20).

Характеристика полевых популяций Р. ш/е^а/к в течение вегетационного сезона.

Популяции Р. ¡п/ез1ат на биостанциях ЗБС, "Глубокое озеро" и в Мичуринском саду МСХА имели различное распределение встречаемости ооспор, зооспорангиев и А2 в течение вегетационного сезона. Каких-либо закономерностей изменения интенсивности ооспорообразования в течение вегетационного сезона нам обнаружить не удалось, по-видимому, наша выборка недостаточна для этого.

В соответствии с выводами С.Ф.Багировой (1993) и Л.К. Гуркиной (1997) ооспоры могут перезимовывать и быть источником возобновления популяций гриба на томатах. Возможно, именно высокая интенсивность образования ооспор на томатах сделала возможным значительное обособление томатных популяций Р. infestons от картофельных, наблюдаемое в 1996 и 1997 годах.

Изучение миграции спор грибов в воздушных потоках.

Плантации томатов в Подмосковье малы по площади и разрознены, но в тоже время популяции P. infestons с них сильно отличаются от популяций с картофеля Эти различия, по- видимому, поддерживаются несколькими факторам! (возможностью перезимовки мицелия в почве в виде ооспор, завозом пораженногс растительного материала и т.д.), но один из вероятных путей возобновлени: томатных популяций в Средней полосе России - занос зооспорангиев с воздушным! течениями.

Проведенные исследования (de Weille 1964, Minogue, Fry 1981, Fry, Spielmar 1991) показали возможность сохранения зооспорангиями Р. infestan. жизнеспособности в воздухе нормальной влажности. Согласно расчетам Тверской и др. (1981) в воздухе при температуре около 20°С и относительной влажности 70°/ за 6-8 часов погибает около 90% зооспорангиев. В условиях эпифитотии на 1 гг картофельного поля образуется свыше 1012 спор гриба (Дьяков, 1984). Даже еш погибнет более 90% попавших в атмосферу спор, то оставшиеся жизнеспособным: зооспорангии за 8 часов смогут распространиться на десятки и даже сотн километров (Aylor, 1986) и их количество будет достаточным, чтобы вызвать новы очаги фитофтороза.

Рогожин и Филиппов (1983) экспериментально доказали (проводя забор! проб аэрозоля с самолета) наличие жизнеспособных конидий P. infestant способных заражать ломтики клубней картофеля, на высотах до 1000 м.

Поскольку зооспорангии фитофторы встречаются в воздухе достаточн редко и трудны для идентификации, мы решили выделить для работы нескольк четко идентифицируемых групп грибных спор, различающихся как механизмо освобождения, так и суточным ходом концентрации: Cladosporium, Leptosphaerü Alternaría, Ganoderma и суммарное количество грибных спор в воздухе.

В работе изучались корреляции между концентрацией спор грибов в возду> и метеопараметрами. Найдена достоверная корреляция (К=0,55) между числом спс и температурой воздуха. Не найдено достоверных корреляций с влажность! солнечной инсоляцией и осадками. Наши исследования приземного воздуха baoj трассы Владивосток - Москва (Еланский , Лекомцева, 1998), а также данные друг* исследований (Ли, Кендрик 1995) подтверждают увеличение концентрации грибнь спор в воздухе с повышением температуры.

Помимо корреляции концентрации спор грибов с метеопараметрами м изучали и суточную периодичность в концентрации спор грибов разных груп Cladosporium и Alternaría показывают «дневной тип» распределения концентраци!

;пор в воздухе (по Грегори, 1964) с максимумом в послеобеденное время, а :уточный ход концентраций спор Ganoderma и Leptosphaeria ближе к «ночному -ипу». Наибольшая концентрация суммарного числа спор грибов как в 1996 г., так и ! 1993 была отмечена в промежуток с 18 до 21 часа. В районе 6 часов наблюдалось увеличение численности спор групп Ganoderma, Leptosphaeria и Alternaría в 1996 г. í суммарного числа грибных спор в 1993 г. По-видимому, это объясняется /тренними конвекционными восходящими токами от прогреваемой солнцем земли здновременно с понижением границы слоя инверсии.

Интересную картину показывает изучение распределения концентрации спор три различных направлениях ветра (рис. 10). Максимальная концентрация спор грибов всех групп наблюдается при южных (Ю), юго-восточных (ЮВ) и восточных [В) ветрах. Подобное распределение концентраций спор в атмосфере наблюдалось и в 1993 г. Ландшафт юго-востока и северо-запада Московской области довольно сходен. Маловероятно предположение о том, что концентрация спор всех изученных групп спор, имеющих различные механизмы отчленения и распространения, выше на юго-востоке. Мы предположили, что подобное распределение спор должно объясняться метеорологическими параметрами.

С lad ospo riu m sp p .

суммарное число спор грибов

вюв

\~Nob ююв

G anoderm a sp р .

L ер to sp h a eria sp р.

Рис 10. Концентрации спор грибов в воздухе г. Москвы при различных направлениях ветра. По осям отложена концентрация спор в тыс. на куб.м.

По данным метеостанции, южные, юго-восточные и восточные ветры являются самыми сухими и теплыми и соответствуют антициклонической погоде

(рис. 11). Вайнхольд (цит. по Грегори, 1964) отметил, что скорость оседания урединиоспор ржавчинных грибов увеличивалась с увеличением влажности воздуха (1,03; 1,22; 1,23; 1,54 см/сек. при относительной влажности соответственно 24; 45; 52; 80 %). Аналогично скорость оседания падала с повышением температуры (с 1,06 см/сек при 23,4 до 0,94 см/сек при 39,9 °).

OCQCQCOQCOOOCO О О

Рис 11. Температура (в град. Цельсия) и влажность (относительная) ветров различных румбов (усредненные данные за май-сентябрь 1996 г.).

В воздушных массах, пришедших с юга, юго-востока и востока, наиболее сухих и теплых, споры оседают медленнее, летят дальше и их концентрация значительно выше, чем в воздухе с запада (3), северо-запада (СЗ) и севера (С). Вполне возможно, что это указывает на основной путь миграции спор и пыльцы в условиях Центральной России: с ЮВ на СЗ.

Миграции зооспорангиев P. infestons с ЮВ на СЗ могут играть роль в возобновлении эпифитотий на плодах томатов, поскольку занос происходит из более южных регионов, где преобладают посадки томатов и более мягкие погодные условия позволяют мицелию (или ооспорам) зимовать на растительных остатках.

Анализ генома изолятов P. infestans при помощи метода случайной амплификации ДНК (RAPD).

Тотальную ДНК изолятов P. infestans анализировали с помощью 8 различных десятинуклеотидных праймеров. Максимальное число различий между геномами исследуемых штаммов выявил праймер Р10 (5'-AGGCGGGTAC). Он был использован для тестирования 37 изолятов P. infestans из 11 популяций. Тестирование показало наличие 8 генотипов. Среди подмосковных изолятов были

отмечены все 8 генотипов; в то время как штаммы из Сибири и Дальнего Востока принадлежали к 3 генотипам.

Сравнение российских популяций Phytophthora infestans.

Сравнение подмосковных популяции и популяции с острова Сахалин, из Сибири, Приморского края (табл. 1) показало, что сибирские и приморские популяции характеризуются однообразием в распределении аллелей аллозимов, типов спаривания, томатных и картофельных рас и малым числом выделяемых при помощи RAPD-анализа генотипов. Подмосковные же популяции характеризуются высоким разнообразием указанных маркеров, наличием обоих типов спаривания в каждой популяции, в большинстве популяции встречаются ооспоры. Все изученные подмосковные популяции отличаются большим генетическим разнообразием.

Низкое разнообразие внутри сибирских и дальневосточных популяций при сильных различиях между популяциями позволяет предположить, что данные популяции представляют собой потомков отдельных случайно попавших в данный регион штаммов. Огромные территории Сибири, разрозненные посадки картофеля и томатов, использование для посадки местных клубней способствуют сохранению единообразия популяций.

Отмеченное нами ранее повышение генетического разнообразия подмосковных популяций с увеличением частоты типа спаривания А2 и корреляция доли образцов с ооспорами с частотой А2 указывают на возможность полового процесса в подмосковных популяциях..

Подмосковные популяции P. infestans на томатах отличаются от популяций на картофеле. По-видимому, плоды томатов - специфичный субстрат, на котором способны расти далеко не все штаммы фитофторы. Паразитирование на томатах- приспособление к узкой экологической нише, а это ведет к снижению генетического разнообразия (Чикин, 1996). Поэтому можно прогнозировать, что в будущем тенденция к разделению картофельных и томатных популяций P. infestans продолжится и увеличится однообразие томатных популяций.

Московская область находится в центре сильно заселенной и хорошо освоенной Европейской части России. В московский мегаполис постоянно подвозятся продукты питания ( в т.ч. томаты и картофель) из разных регионов России и мира. На юге Европейской части широко распространены посадки томатов, слабое промораживание почвы зимой способствует сохранению жизнеспособности ооспор. Это может иметь самое прямое воздействие на развитие подмосковных популяций P. infestans, ибо, как показано в работе, именно с Юго-Востока идет основная часть заноса грибных спор в Московскую область.

По-видимому, в современной России Московская обл. является центром, где образуются и накапливаются самые разные генотипы P. infestans и отбираются

(благодаря конкуренции между ними) наиболее приспособленные к условиям средней полосы России.

Выводы.

1. На территории России отмечены два типа популяций:

1) подмосковные популяции на томатах и картофеле, отличающиеся высоким разнообразием аллелей аллозимов, наличием штаммов обоих типов спаривания, образующие ооспоры;

2) популяции из Сибири и Дальнего Востока - обычно мономорфные по всем маркерам.

2. Наличие ооспор в пораженных образцах из подмосковных популяций коррелирует с долей А2 типа спаривания в популяции. С увеличением доли А2 типа спаривания увеличивается генетическое разнообразие популяции. Это дает основания предположить наличие полового процесса в подмосковных популяциях Я./и/аг/аш.

3. Показаны различия между популяциями Р.^п/езСагм, паразитирующими на картофеле и томатах.

Анализ спектра аллелей пептидазы на томатах показал увеличение доли штаммов , имеющих аллель 96 в период с 1991 по 1997 г.г., в то время как среди штаммов, выделенных с картофеля подобного увеличения не отмечено;

В популяциях, выделенных с картофеля, доля устойчивых к металаксилу штаммов убывает в период с 1991 по 1998 г.г., среди томатных популяций наблюдается возрастание процента устойчивых штаммов;

Томатная раса Т1 преобладает среди изолятов, выделенных с листьев и плодов томатов, среди выделенных с картофеля преобладает ТО;

Заражение листьев томатов универсально восприимчивого сорта Талалихин выделенными с картофеля штаммами Р.нт/ку/апу активизировало выделение листьями активного кислорода, образование пятен некрозов вокруг мест внедрения паразита и слабое спороношение. Инокуляция листьев томатными изолятами не вызывала выделения активного кислорода и появление некрозов, спороношение было обильным.

4. Изучение устойчивости к металаксилу показало различия между популяциями с листьев и плодов томатов. На плодах томатов много реже встречаются устойчивые к металаксилу изоляты. Видимо, при паразитировании на плодах чувствительные штаммы имеют преимущество перед устойчивыми к металаксилу.

5. Изучение устойчивости к плюмбагину штаммов из подмосковных популяций показало отсутствие устойчивых штаммов на плодах томатов, в то время как на листьях картофеля и томатов они присутствовали.

6. Анализ путей миграции спор грибов в атмосфере Москвы показал, что основная их часть заносится с ветрами Восточного, Юго-Восточного и Южного направлений. Занос спорангиев Р. ¡п[езШт с Юга и Юго-Востока, где большие

площади заняты под томатами и погодные условия мягче подмосковных, может способствовать заносу новых генотипов и возобновлению эпифитотий на томатах.

7.Изучение устойчивости к фунгициду диметоморфу показало, что приобретение устойчивости сопровождается нарушениями жизненно важных функций штаммов: резко замедлен рост устойчивых штаммов на овсяном агаре без фунгицида, зооспорангии образуются редко, частота ветвления гиф нарушается. При хранении, сопряженном с пересевами на овсяной среде, устойчивость к диметоморфу теряется и восстанавливается нормальная скорость роста на овсяной среде. В природных популяциях устойчивые и слабоустойчивые к диметоморфу штамы практически не встречаются, даже в подвергавшихся обработке диметоморфом популяциях.

Список опубликованных работ.

1.Еланский С.Н., Лекомцева С.Н. Споры грибов в приземном воздухе вдоль трассы Владивосток- Москва.// Атмосферный озон, труды конференции молодых ученых. М., Диалог-МГУ, 1997, стр. 53-59.

2.Еланский С.Н., Лекомцева С.Н. Встречаемость спор грибов различных систематических групп в приземном слое атмосферы средних широт России// Микология и фитопатология, 1998, т.32, в.1, стр. 37-43.

3.Еланский С.Н. Изучение биоразнообразия грибов с помощью установленных на поезде спороловушек// Проблемы охраны и рационального использованияприродных экосистем и биологических ресурсов. Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 125-летию И.И. Спрыгина Пенза, 1998 г. стр. 254-256.

4.Смирнов А.Н., Еланский С.Н., Долгова A.B. Ооспоры Phytophthora Infestans в плодах томатов в Московской области// Защита и карантин растений, 1998, № 5, стр 41.

5.Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Долгова A.B., Дьяков Ю.Т. Популяции Phytophthora infestans в Московской области. 1.Системы размножения.// Микология и фитопатология, в печати.

6.Еланский С.Н., Смирнов А.Н., Багирова С.Ф., Дьяков Ю.Т. . Популяции °hytophthora infestans в Московской области. 2. Дополнительные сведения о щвергенции популяций, паразитирующих на картофеле и томатах.// Микология и фитопатология, в печати.

7. Еланский С.Н., Рыжкин Д.В. Изменения концентрации и возможные пути миграции грибных спор в атмосфере Москвы// Малые примеси в атмосфере, руды конференции. М., Диалог, 1998, стр.70-77.

8.Еланский С.Н., Рыжкин Д.В. Изменения концентрации грибных спор в тмосфере Москвы и их связь с метеопараметрами// Микология и Фитопатология, в печати.

9.Еланский С.Н., Рыжкин Д.В. Споры грибов в атмосфере Москвы.//Сбориик трудов конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", в печати.

Ю.Еланский С.Н., Попова И.И. Устойчивость фитопатогенного гриба Phytophthora infestons (Mont.) de Вагу к индукторам окислительного стресса// Сборник трудов конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", в печати.

П.Смирнов А.Н.,Еланский С.Н. Роль ооспорообразования в изменчивости подмосковных популяций Phytophthora infestons.// Сборник трудов конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", в печати.

12.Долгова A.B., Смирнов А.Н.,Еланский С.Н., Багирова С.Ф., Малеева Ю.В., Дьяков Ю.Т. Структура и динамика генотипического состава популяций Phytophthora infestons на территории бывшего СССР.// Сборник трудов конференции "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии", в печати.