Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Получение устойчивых к FUSARIUM и VERTICILLIUM исходных форм люцерны методом клеточной селекции

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Получение устойчивых к FUSARIUM и VERTICILLIUM исходных форм люцерны методом клеточной селекции"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИИ

получение устойчивых к ривл^им

и уеяпашим исходных форм люцерны методом клеточной селекции

Специальность 06.01.11 — защита растений от вредителей и болезней

На правах рукописи

белявский юрий викторович

УДК fi3.-J.31 : 032.4/938.1

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград — Пушкин

1990

ЯаОо^а выпсдшуа во Возоойзноы наушо-исоледоьатёилоклл

институте вдглта растений.

НаущиД руководи тель - доктор биологических наук, профессор К.Н.Гусева

Официальные оппонент»:

¿.октор биологических наук, зав.отделом, руководителя нелекшопиаго центра кормовых культур В.З.гЛаг-т;

.Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.И.Ларина.

Ьедуцее учреждение - Научно-производственное объединение

"Рологорка". . ,

Зи1й'.та даосертацгш состоится 195^г.

в '{О часов на заоздыши Спс:шалиэирошнного совета Д 020.01.01 по аадате диссертаций на аоискшше ученой степени доктора наук пул Всесоюзном цаучно-носледозате.'ьокгм институте за'яитн растеши!.

Адрес: 189620, Лешшгрвд-Пуикин-б, щоссэ Подбельского,

д.з, з;;зр.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного лаушо-исследолательсксго института защити растг.тгй.

Автореферат разослан " ^С/С^/^ 1990 г. Ученый секретарь

ОЩЛЯ X A PA J {TEH 1С 11Щ. РЛ1ШИ

Актуальность тс-.мы. Одной из причин медленного решения проб-леш увеличения производства и улучшения качества кормов лвляет-сл шзкпя устойчивости кормомос растений, в том числе люцерны к .оредным организмам. Переход на пропшлленлув технологию возделывания .шцерш, концеьграция посевов, нарупешге севооборотов увеличивают распространенность и повивают значительную вредоносность возбудителей оунариозного (¡Очакова, 1300;Дталарова,198Э) п вортпциллезного увлданпл. Вежнпл роль в улучлегсш сиабненкл населения продуктами гпта;шя и увеличении производства продеты животного,пства отводится сс.эдагалэ устойчивых к болезням сортов коряока культур, в том число люцерны. Потери урожая от возбудителя ^узариоза сосдаьяяют 1045,1 (Хдакова, Гусот и др., 1ШГ>). Гюнолъзог.щшп традувдонзпж методов сслекют ко присело к созданию доноров и сортов люцерна устойчпгих к возбудителям шлтл. Практнчеаагй интерес дтя селекции устойчивых форм люцерн» методами биотехнологии представляет использование культуралышх фильтратов грибов в качество селективного фона. Работу целзсосб-разно нр020,гить с грибами^ у котсрих отмочена пело.тлтельиая горГ'Ж.ц'л !.'<!?ду латогеиностьк атаг.лсв к синтезом (Тлтотоксичес-¡W terTwiojmcs. 5то даст возможность достаточно эффективно вести отбор устсЛ'лш« ноходлцх ферм лвдрны.

Цель и задачи иселпдова'шй. Целью давних исследовании ЯВЛЯЛОСЬ П0ЛучеН1!2 yoToii'BlBsDC К Fu.s.-irium 11 Vertioilllu'm ИСХОД} ШХ ц5орм люцер-.ш, для чего предстояло рзс/.ть следукцле задачи:

- изучить ицтогмшость штаммов л гас характеристику по био-сштеэу фузариевей кислоты и активности пектолитичесюзс ферментов ;

- определить оптимальный состав питательных сред для куль-титлроганил грибов с ковншенншл накоплением фитотоксинов и роста клллуешх культур различных cojwo3 люцерны;

- подобрать сублеталыше концентрация селективных агентов и осуществить ступелчитгп! отбор устойчивых ioictok лвцернн на этом фоне с последугзцсй регенерацией растений;

- оцепить рг.стспия-регепергштн люцерны на устойчивость к фузпрлозналу л вертицидлезному увядашга.

Научая -повязка. Подобран оптималь'ий .состав питательных сред дал кулътшшроватнл грибов,' способствувдШ нчтенеяпшлу

биосинтезу лузариеной кислоты и повышению активности гшктшшти-ческих ферг.'.ентов. Выявлен вфдек'х- синергизма в смешанных культурах, вирокаищтйсп в возрастании <р1тотокг.итескогп депстпш куль-турадьного фильтрата, подобраны сштш.шшнне смеси культур грибов. Оптпдшзировап cocían иктательшх срод для каллуссгенеза 4-х сортов люцерну, повышена их регенерадаоннал способность. Отмечено пошшоше уровня устойчивости растеплД-рогенираитов при ступенчатом скрпшшго клеточжсс популяции на селективном фоне.

Практическая ценность. Выявлены и*йрш грибов с высокой способностью к биосинтезу токсинов, определены сублетальные концентрации ИХ ЗСуЛЪТурйЛЫЩХ фНЛЬТреЮ!!, СНОООбСТЗуЩИХ отбору холерам чих .каллусов. Разработана технология, обеспечивающая ш-;:од толерантных к шлту и их культуралышм Фильтратам растеиий-регенерантов люцернн. Определены параметры культивирования грибов, обеспечивающие высокую (Ьитотэксичпооть культуралыюй жидкости. Отобраны растмзш-регенеранты, устойчивые к двум вилто-зьу патогеншл и отдельно к каждому п условиях tn vnro,

Апробация. Основные нолокеиш диссертационной работы доло-jíeíiu на заседаниях производственного совешшшя лаборатории иммунитета растений к видным орг&шшлам iil2P (Лешшг^шс, 1"8£3;19й9), на £нтошггатогичеоко!'1 секции Всесоюзного Ботанического обнесла (Ленинград, 1йВ8), на совещании "Состояние заболеваемости фуза-риоБншл вилтон средне и тонковолокнистых сортов хлопчатника и пути его снижения" (Ташкент, 1909), 5 Международном симпозиуме по вертициллиуну" (Ленинград, IáSO).

Публикации¿ Основные положения диссертационной работы опубликованы в 5 печатных работа.

Структура и o6i.f.i диссертант. Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав» выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 110 страницах магищопкекого текста, содержит С7 таблиц и 15 рисунков. Список используемой литературы включает '.ЛО наименовании, ь том числе 121 зпрубсяэд« авторов.

УСЮШй, МАТЕРИАЛ И í.lETC,^. ПССЛЕД0И'\Ши'1

Работа выполнялась и 190 7 по 1Ш9 года во Всесоюзной нз.учно-ii"следовательском инсаптуче гшдени растений в лаборатории ш-лу-¡глета расшшй к ы«дани оргашжаа и Киргизском Н1ГШ тстсиц п кормов.

Б oiuxax баи;: использованы раионлро* ue и перспективные для 1йготкх:н copra лингрин (Ь=.1«::е, Ч'.ж:л.а.л.ч :.bíítbsui, lUastieK-

екая, Ярославна). Стандарт зосприт/пшвос:та - сорт Жидруне. Шгем-ш грибов, возбудителей аузариояного и вертшдалезного увядшим киргизского происхождения, вмделенше из псражеиспс растешгИ лэдерны. Осношкми показателями уюта болезной растений в лгхЗоро-торхшх условиях слугопи распространенность и интенсигпессь рпа-гнтяя óms'j;jí. ИдонтлсТшаидо идтогзков преподали но Гллай В.И, (1077), В.В.Филтаиовсй, ЛЛЬЛндреозсй ц др, (I'JCO). Ha-roremtooTi, язучаемнх ш'шдмов определит и лабораторных услошгк кп esvotiax и проростках лвцерки согласно "Методочэским указали.'»« :\о o:toíi;:r-усгоЛчизостл -лсвора лугового к бачеглшм" (ШЗР, IC0G). Tíaroron-,'гость штаммов и íí.v сшсбЗ ояредплялг яри инокуляция пророст :;ot» суепонэпей шшдий патогена, Контролем слуш;лл зцорогш itpoiX'CT-ки лкцерш. Иоу/ошю зитотохсмиюпто кгылкоэ соэйудих^'!:.'!! гг«л?а иройодили по доЯсшш культуралъией лидкоати üa проросла! ллц-зрш.

Сматрс^огсшярмесисз определена* осдортлгшл уyr.apíioí■;■.'! кислоты проподали lio Hofcun (1055) з моди^пемв« Я.Г.С-гслогзц CX0CG) с 0-го но 21-й дни культивирования грзйа. Опкгаскуя ш:ст-НОС'Л» раствора, содорг'лщего ПГЛОН - ТОКСИН VertloUliun »luhliAe

i oil пуделяли на спектрофотометре с 7 по 17-э сутки куль-тивлрслтии гриба, при дллне волны 410 юле. Лспользуоиио в patío-ro voKciíHucíúio соединения - фузарпевал кислота (гриб- ?> oxyspo-ГМЯ| , г тента .4 0) и яглен (гри<3-v.iiahiina ) представяеш лабораторией химии природных соединений хчм^шеа ТашГУ (Тен Л.II., Стз-riami'iOHKO il.A.). Оценку «телглоц но активности пектолихических ({ерГЛОИТОВ ПрОЛОДИЛП "ГЛП-!КС»'Л'" истодоп, модю|явдрошинш в лабораторий иммунитета БЯ5Р (Гусзга, 1975; "Методические указания по изучению популлщЗ возбудителей фузариозного и ьерпнрулеоного шлта сельскохозяйственных растеюШ", 1985).

В качестве эксплантата для получения тканошх культур на нитателыюй среде Гаыборга Ü-5 (ВПК, 1980) использовали листовые пластинки люцерш. Оптимизацию состава питательных сред для повышения биосинтеза фузариевой кисдоты и процесса каллусогенеза проводили на средах Чапека-Докса и Гамборга В-5 о использовашем метода математического плшшровшшя эксперимента (Гастегаев и др., I9B2), Полученные данные обрабатывали на ЗИЛ 0.1-4 по программе " "-Multi ". Статистическая обработка дшшых проводилась методами вариационной статистики и дисперсионного анализа (Доспехов, 1985).

Учет роста каллукшх тканей и шжншемость клеток люцерны на селективном фоне осуществляли согласно общепринятых методик (Калинин, Сарнадкая, Полищук, 1980;. Подбор концентраций и отбор устойчивых клеток люцерны проводили согласно ряда работ ( Hart -man et al 4 I98'l¡ Toyoüa ot al' 1984; Arcdori «t al ., 1987; no coy i IÖ38). Полученные растения-регенераты, устойчи-ше к фузариозу и вертициллезу, оценивали по J.H.Kiüin (1984) в лаборатории ¡щеточной селекции и иммунитета Киргизского КИГН пастбищ и кормов и лаборатории иммунитета растений ШЗР,

ЭКСПЕЙ1М1Т1ШНАЛ ЧАСТЬ

Характеристика патогенности и ^итотоксичносги штаммов шлтошх патогенов

При проведении селекционных работ на клеточна.! уровне важ-нш этаном являетоя отбор из коллекции наиболее патогенных и фи-тотоксичн-нх штаммов. Выявлено различие штаммов tusariun ох,у.«рп -

runi Sohlecht Snjd et Hans ПО EX ПаТОГвННООТК И $»1ТОТОКОИЧКОСТН

з отношение сортов люцерны различающихся по уровню устойчивости к вдлту. К слабопатогемгоыу штамму отнесли й II-8 с развитием болезни на сорте Еерэке- 19,9$, к среднелатогенным - Л 15 и JÄ420 - 37,0 - 48,0$. К скльнопатогенным итаммам отнесены J6 9, Si 419 о высоким процентом раевития болезни - Gü, 3-75,0$. Стандарт восприимчивости - сорт йщруне порэжелеч <£узариоэо..1 на 74,1 -I00/J, Токмакская местная - 41,0-67,0$. Установлена оуществешпе различия по патогенности ыезду штаммам F.oxyu'orun и по поражен-ности сортов. Выявлена высокая степень фитотоксичностй штаммов Ä 419, № 420 f¿ bxjsporum i Степень развития болезни у сорта Жидруне составила 40,2-59,2$, на другкх сортам люцерш 30,443,В большинстве опытов степень фнтотокекчности кудьтураль-ннх фильтратов f* oxjs^orüm была Нике показателей патогенности этих rpídOB. Наделены агрессившб птаммн фузариозного вглта по патогенности к фмотоксичности - К 419, № 420.

Бертициляезннм вилтом сорт .лщруиэ поражался на 85-90$, с развитием болезии 5.1,3-78,0$?. В целом сорта люцерны поражались веригдцллееным увяданием значительно слабее, чем $узариэбныы. Отмечена белее шеокал пагогенность и /Титотокспчность культурац-hoi'c фильтрата у штаммов v.ti»hii«ie но сравнению с v. aibo-ut- . r-дт . Например, у сорта Ток.:акокая гестна- • пцюгенлость - 50; и 29,6%, ф!тотоксичиостЬ - 53,15? и 16,1$ с эдп-гье.'кне. Прозе-

деншш исследования показали, что наиболее патогенными и фито-токс .-шиш были штаммы гриба ох^яропш - В 419 и К 420 и КИРГИЗСКИЙ ИТШ.1Ы V. 'ЛчНИаи .

Синергизм возбудителей тшлта люцерны посевной

По биосинтез/ фуэашевой кислоты штаммы возбудителя фузарио-за разделены были на 3 группы: 1-е низким содержанием токсина-№ 9, № 420 (2,3-9,9 кг/л); 2 - со средним содержанием - Л 15, И 10 (18,3-26,8 мг/л); 3 - содержание токсина в пределах 34,8 -40,3 мг/л (Л> 11-8, № 415). Максиму!,1 накопления фузариевоп кислоты чистчми иганмачи гриба гиз-л-1ч:п отмечался на 16 день культивирования, Значительное накопление фузариевой кислоты не всегда соответствует высокой агрессивности штаммов. Биосинтез фузариевой кислоты, как показатель степени агрессивности штаммов грибок, существенно усиливается в смешанных культурах, в частности, в присутствшг возбудителя вергициллезного увядания, который не обладает способностью ее продуцировать. Отмечен эффект синергизма, внратлющгйся в стимуляции биосинтеза фузариевой кислоты н увеличении фктотоксичностн культурального фильтрата. Этот процесс впервые был отмечен Г.Геперндзе (1936) на перцэ и баклажанах.

Колнчоство токсина в наших опытах варьировало от С до 107,8 мг/л. итлммп гр:;ба г'ияаПшл в чистом виде синтезировали 2,840,3 мг/л. фузариевой кислоты (рясЛ). Смеси штаммов Р.охуярогиш 1я 11-8+ Л 9 л Л 15 + Л 419 накапливали в среднем 77,3-101,2 мг/л фузариевой кислоты ;; проявляли высокую агрессивность. Смеси, вклмчаюшпе птачш. обеих вилтовых патогенов, накапливали 55,0 -77,0 мг/л фугарневой кислоты, У наиболее патогенных смесей превышение составляло 20-25 раз. Штамм Р.охузрогит ц 420 в чистом виде накапливал 2,8 г т/л фузариевой кислоты, в смеси с V .<иъ -11,че - 19,0 мг/л; д смеси с киргизским штаммом 15,8 иг/л; а с у.-льо-.^пт - 66,0 мг/л продуцируемого токсина. У штамма Л 419 в смссп о у.^вЪИч.^ показатели биосинтеза токсина достигали 55,3-55,3 мг/л (рисЛ). Отобраны шталмн возбудителя фузарнозного шита (Л 9, Я 10, Л 420), которые в смеси с 7с. гъ 1 с 1111 <>гь характеризовались, повышенным накоплением фузариевой кислотЯ - ('6,5-105,6 мг/л в сравнении с чистой культурой - 2,828,8 мг/л. В большинстве вариантов по максимальному накоплению токсина отличались смеси, включающие шта-м у.с1аЫ1яс и один кз штаммов огип - № 9, $ 15,гё 419.

ДоОзпшшс n xajihyii сргду Чологл-Докса иало.чьчатюх aoötscon или ..та лчкгини luwii 'зчряило биосинтез фузорявиой ыслотн как в смесях, так и п монокультуре. 'лаксашльноо накопяокпп тсксшм смг-!ц.тлооь к 13-14 дню кульгигароиашш грльа. Ро&матно, ото связано о акта визоптей процесса •'•яосинтвза с последующим превращением Towm¡a в другие оо<?-зЯ1С'п;я и одновременной работой ндтсгслати-ччсптх ОтсОрсчи мамщ к.охуз^огит с гсюсксЯ корре-

ляцией пят01'сш!г. r: ¡1 йюс1шт0 эом jytíapheboíf jsjftsokh

(i? 9, Л 15, .'•> 419, .'5 .-.Си).

Iv&eKï cmiepma: г сдг-нген и в культурачыпсс ';"льтрпл(<х есй по c:uecnnie~y яглонл - • сходка v. и,»Ы1чч с гакслч.умеч накошюшя на IG-J.7 пень. Со/у-ртэпю ravxm в с.мосях прсв'шхло иго количество n ^шсто;: култ,тл? п 2-0 раз. Работа лроа»дена ооп-местно с И.П.Степанлчекко. Сдногрепенисе y«o.:t:mime в з'.ультуратт— iicîî среде биосинтеза двух токсинов шлтонис натогеИо» лкцерпн от; ючено вперше.

Шяплоннче пииболпо иптгешшв ~л ¡¿:тотокс'л1пп:о сшел, ветк-чазоелс возбудителен млтотхч! х'рунш, ваяло нсппльзолтгь при- создания салектипного («сна т> клаточно;!' селскад с Tccï>ipoivucto..i по одиоРГ'стшому лэкопсеиг.» л культурачьнсм ^¡лырато Счтотокслиов ;; пктмЫ1'кг«м '.огстспиточг.отаге ферментов.

Подыми (ШТИ!Я!:к!:.';1 состав сред Чапска-Докел п П-5 для культлшрогеимя грибов с целью пошехмгая биосинтеза. фуодлейей кислоты. Пз^кнна лотхебксстя л компонентах сред;, за поклвченя-ем игл , показало, что ¡¡стройность п елларозо, Pc.'jo, и pH среди не изменялась, хотя отличалась от оригинально:: прописи. Кснцоит-ршщя Fe.'io,. ухлличг-ка в 10 раз, что подтверждает то, что процесс бнссжезаЧузз риелей кислот лнляется .т.елогозаглехл.;!!:.': (Гусева и др., К-35). Концентрация слхарозц сти:сна в 4 раза. Бисокке концентрации кн^го, необ>-од:-.ш грибу на рашых стаданх разви-ткл. Через неделя иотр-'бтастъ сыпалась в 2 раза п оставалась . практичоска ис:тэмсшшЛ. Потребность в ï.'îOj и i/gao. колебалась в пределах 1,5-2,0 г/л. В результате оксг:эр;::.:елта било устаноншю, что бпсс:я'тез ^узарксвсЛ кислотп на оптишзировашюЛ среде Чапека-Док са к ¡рос с 27,5 иг/л до 73,5 ¡.т/л, т.е. и 2,7 раза (табл.1). При oraa-¡i¡c.j?i¡¡ сро^ы Киборга 3-5 в 1«эллчшх вариантах каксп-ма'шное накопление токсина набродилось на 8,20 и 25 сутки культивировании гриба. Пошлина концентрация .макроэлементов в 1,4-1,5 раза. Потребность и углеводах снижена в' 1,5-1,G раза по сравнению

а

Тц&ткца I

Оптимизация соотава питательной скды Чапака-Докоа для бпооингеза Фузарпевой кислоты

Состав среди

КГ

Т

Стандартный состав Чапекв-Докса (г/д)

■~р——■— ■" ..........•

Оптимизированный сос-I таь Чанека-Докса (г/л)

Fa.'JU^

сахароза

KCl

Р'Л

1,0 0,5 0,01 й.-о

20,0 0.5

6,0

Тж7%Ш

lby3ü]«f!Bofl iüiaioTH i i I I I М И

1,0 - 2,0 1,7 - 1,8 0,1

1,5 - 2,0 ti,О 0,5

5,2

1 270 • Лузариозой Kit слоты

I I

со стандартной сродой. IIa ранНей стадии роста гриба необходимы высокие концентрации х.елата коле за (до 2 СО ur/л) , в дальнейшем потребность стабилизируется в пределах 65 мг/'л. С, ростом гриба необходимо увеличить содершше шткроэлеменхов в среднем в 2,6 раза. Высокие концентраций штошиов в среде необходимы грибу ухе на 4-й день, к 2Ь-му дню потребность ошкагтея. Увеличена в 2,5 раза (до 5 мг/л) концентрация ¿пзс • У*®.зиваот на то, что продуцироватш фузарпеЕой кислоты возбудителей фг/зари о за явглотсл цяикзависимыы процесса.!.

В дальнейших исследованиях использовали oitTnnusnpoainiyio питательную среда Чанеш-Докоа, характсрнк.| показателем которой яьлишоь ее С1а0иль11ооть, Ионы жэлеза в составе среды chocccSot-аовали росту мицелия гриба. Наибольший вес мицелия - до 0,6000,620 г/100 мл среды Получен на 16-21-й день шращавенид гриба при стабильном накоплении фуаараевой кяслоты - 66,52-01,90 мг/л. IIa стандартных шггателышх средах максимальнее накопление шце~ лия отмечено t:a 16-11» на олтимизировалйшх - 20-21-й день. На среде В-о отмечена шеокая корре-чцг.ончая связь между концентрацией ¿узарюьой кислоты, скоростью ее изменения, и массой мицелия (г = 0.Ь9±0,16), и описывается уравнением - 1/(у+У„) == /,+в/ (;:+!.,). На среде Чали^-Докеа шяЕлена отрицательная зависим', сть М'лг.,- i.iancor- мицелая гриба и скоростью накопления фузаряезой гс:г.дота (г = -0,9Э±0,13). ' '

Сгорсги- развития <: слезал на растении в природе зависит от ур--"л ar.TitisKOciu пег'гал'-.ткчеекпх JcpL - -.в. Псслс довагае их

активности показало, чг>; штаммы патогенов у.схуярог,1т , у.агп -11а> , 7.jLbo—arum различаются по уроида акгавнооги ферментов, их накоплению. Максимальное ншюнлоииз и активность пекто-лктических ферментов отмез чена у штаммов .'5 9, П-8, !' 420. На актикюс.ь ферментов существенное влияние оказывают питательные суботратн. чс-за тог о происходит смещение дня максимального накопления гектолнтичеспг:. ферментов. Активность пекицшотнлэоте-pacu (1Ш) на лщерноьом субстрате находилась п прздвлах 6475,40125,0 относительных единиц. Лктпеность поллгалыиуронази колебалась г. пределах Ь372,7-25041,0 отн.едшшц. Наибольшую активность отмечая: у штаммов J.'1 9, 1>- 420 - р.охул^огш •

В результато проведенных исследований нош были отобраны наиболее- агресол.ыше шгпмш ьз популист патогенов для использования в клеточной селекции лкцерпы па устойчивость к возбудителям вилта. Отмечена заппсшлость межи у патогенноотыэ и блосинте-зом фугариевой кпсяотн. Низкая корреляционная ошзь (г =0,29) установлена между патогешюстыо и акгкьностьа ГСУО. Выянчен высокий коэффициент корреляции мозду иатогенноотпП и фптотоксич-постьк шгоммов ( г - -С,99+С,09).

Кгетошол сечекцля лзовдрнп на вилтоустойчивость

J пр'л е/еншк чесдидотнзях У изученных сорюв отмечена средня?: способность к каллусогенезу: от 14,0$ у Ярославну до 36,СС У сорта Борею.-. Однако, быстрое потемнение каиуса, шоо-кап его аютность и низкая рогенерашонная сноосбнооть показали необходимость о.чтиыизщии состава питательных сред для гсаллусо-генеза о учетом шбраплых генотипов. Ра&ультаты оптимизации показали, что сорта лвцерни различаются по потребности в кинетике- 4,5-7,5; 1-НУЛ - 0,45-1,50 от/л я. витаминах - 0,1-4,4 мг/л. Оптимальные концентрации 2,4-Д для всех сортсв били примерно одинекош - 1,0 мг/л. 3) процессе куль титрования на оитимпзиро-иишей среде наблщалсл равномерный интенсивник рост каллуса, без образования некротических пятег. Вес каллуса увеличился з среднем с 405,9 до 447,6 иг (тнбл.2). Значительное увеличение калдуичел массы отмечено у сортов лвдорны Бореке и Товдак-ская местная - от 93,6 до 190,0 мг. Вес каллуса сорта Пишюкская ?штзи.'ол с 505,0 до "Л6,0 мг, по улушилась регенерациошая способность каплуса.

Мою, •-tcroiínKToj'Horo анализа с лсосткой матрицей сочетали

'iaojaav-i

Ijoût кадлуснои иасси лщврим на с-игш. лэдьошшой питательной ир^де Гамборга (B-5)

Сорт

L'acea эксплантата,

кг

i Пасса каллуса на 30 день,

■ м i

JiJ

! среда ! стаддарт-JЛШ__

среда г'Пти-

I гпзнроиан-__

4 к ставдар! ной среде

йс-реке

Токглдксхея местная

Пп^ЛЮКСГДЯ Ярославна

Î, 85+0,15 337,0+85,7 чсО.Й+М,^

270,0+27, У 468,0^)0,3 E05,0i<';0,3 340,0+40,2 2,9-1+0,15 4(31,7*6,7 516,Oj:I.O,7

2 ,90^0,15 2 , S'2+0,15

+ 93,6

+108,0 -159,0 + 3-1,3

уровней факторов варьирования нспапь&овалая при подборе состава сред для каждого сорта индивидуально. В результате пошсидась регенерациопная способность сорта Яуослг.пт на 26,9$ при отсутствии рпзогенеза. Кпзкг.й виход рпстенлк-рсгснералтов отыече-н у сорта Пшпекская - 01,0;«, с впсоп:;.1 числе:i химерных растешй-16,4$.

В процессе подбора концентраций оелетгдисого фона для юш-точных популяшп льцерпн изучаемых сортов отмечеш существенные различия (табл.3).

Использовали следующие кокцзпграши культурильлого ¡йитрата: ДЛЯ грибв, Fu3-iri\ira - ОТ О ДО 1$%', ДЛЯ Vei-ticllli'-ш -от 0 до 25-30$. Отмечена 100$ гибель клетог люцерны всех 4-х сортов при 15$ кощентрацип культуролкшх фильтратов гриба F .ох;/яроги!л. Полная гибель суспензионных îc&inyciiux меток сохла Токмакекая местная установлена при содержании в среде 7$ куль-турального фильтрата (шт.419), Использование в качестве селектав-пого (Joua смеси шт. № 419 + от. v. lUMiae (кирг.) не показало существенных различил по срагнснпю с чисты iî 4Т.9, хотя на среде с Iîi-i содержанием культурального (Шльтрата шшшаеыость субиеязии клеток сорта Береке ои«а соответственно 29,1 и 3,3$. 100$ гибель каллу синх клеток лкцерпи установюна на фоле гриба Vertioiiiium с 20-25;? концентрацией фильтрата, Добавление ё среду культурального фильтрата гриба v.diihii.u вызывает гибель клеток на 70,0-71,8$ при 15$. Отмечено влияние ita выживаемость каллуачык ¡слеток видового состава гриба v-rticimùm . Оелек-

'Гаоляна З

йкшваемость кяеток лкцерш на селективном фоне грибов K'ls.iriiirp !! V ;rtloii linn .

--1-1—:---—----~f--

MW,, 1 Jsosiibcuocib ¡«сток лшерш!,

ici ¡'Kb' j

! !кснтро.ъ! 5 ! 7 ! 10 !

Fwoari'.m 0X7 '., о run,

Тереке ■И'У 94,8 ri^- Л. 7j . 3 49,0 о ; т - , :

4-:0 Ш,? 91,0 во, G2.5 0.0

•11Р+ i'5,9 34,8 60, 1. 44,4 3,3

Токмакотсая * местная 410 100,0 27, о 0,0 0,0 0,0

Шшпексгдл 4 J 9 К, 9 - 11! .0 12,0

Ярославна 420 98,2 -• ;>:;, 0,0 0/1

Yd rti "Л 1 Li иг. • l..tiLi Ч (Ю'РГ.)

Оорт йгкшгмость клан, нглшентаация культурой к, % НОИ ■сщи UL.Kij ,1

контроль ! 10 ! 15 I 20

Береке 90,7 - 26,2 0,0

Токмакская

местная 100,0 72,6 30,0 . 0,0

Пиипэкская 92,9 23,1 0,0 0,0

Ярославна 100,0 50,0 0,0 0,0

тинный фон с участием фильтрата гриба Y.d^hii^e бил белее яесткггм, чеМ о фильтратом v.albo-.itrum

Данные таблицы позволили целенаправленно веспг ступенчатый отбор на устойчивость со следуйщши рабочими концентрациями: 1-11% культуральНого днльТрата возбудителя а.узариэеа и 10-15% -для возбудителя вертпциллеза.

ОтупенчатггЛ бкр'гШшг устойчивых форм в отношении двух возбудителей

К рекомендации об использовании ступенчатого отбора при клеточной с еле мши люцерны На устойчивость к двук вялтошм пато-

генам ш иршшш с учетом следующих положешй! I - нзосходлмость использовать разнпе концентрация токсических метаболитов раанич-ншс патогенов ^изапиш и Vbi-tioiiiium ; 2 - трудность контроля за концентрациями токсшюв и ферментов в смешанной культуре, К бол&а ЕКТИЕНЫЙ рост грибов рода Fusarium препшшвдй рост Varticiiiium , примерно в 10 раз; 3 - в проведенннх нами екопериыентах различий ыелду чисти шташаш rpsiöoB и их смесями при отборе устойчигых каллусов получено не било.

Критешеи отбора служила внапваемость каллусншс клеток лю-цзркы в присутствии культуральной жадности. Растущие части каллуса поддерживались в экспоненциальной стадии роста на жидкой среде В-5 в присутствии селсптлших агентов в течение 14-1С дней. Пассировали на контрольные питательные среди без токсшюв. Учет вшодвшх клеточнкх популяций проводили по окраске каллуса и скорости накопления сиро;; массы клеток в течение 12-16 дней. Боспршилчпвый :саллуо в опита;; и контроле иелтел или тешел и нз был -поообен к возсбисмоншо роста. Часть каллуса замедляла рос? или прекращала растл в течение 4-6 дней, осхракяд зеленую окраску н иреянви плс-тносгь каллуса. Возобновление роста устойчивых каллусов часто нач/пшюсь с одной или ряда клеток, тогда как вся остальная ?;;гсса гсшгела и отмирала (гибель клеток достигала 90-95,?). Устоичише каллуспые секторы сохраняли свзхло-зеленув, желтую окраску л бистро возобновляли рост. Скорость нарастания каллусной массы из устойчивых гдето:с в несколько раз пре вышла рост каллусьоЛ пассы до обработки. lia ..-еде для органогенеза отпечено усиление процесса ризогенсза устойчивой каллусной ! лас си. При ;тш хяллуг., с селективно! среда, хулв регенерировал на среде В-5 без точечное. Продажатильность этапа регене-рац?ш увеличили на 1-3 недели. в связи с чем здросло ч.;сло химерных фору растении.

Процесс отбора ¿слеток люцетяш на ¿'руппозуа устойчивое?:., к эо£Судитеж»1 вилта пкеазая иа примере сорта 3iepe;ce (рис.2) .Представлена схема ступекчатсго отбора, последовательно, к :дадо;лу патогену. Першй этап вклотал скрининг кяеток лвдерны к шта^уу Я 420 - е. oxyr.j-cru.;. . '.асспрованле ¡леточинх линий на селективном qoi'e (I пассач;) сопровождалось обязательным контролем (2 пасса*:). л качоезгво которого слугпла среда сс дегскацгл Т>-г/% кулъ-5у,»алып>го фильтрата /ушлого гр.юа. Црц третьи- кассажо ког-целт--рацля ф;:лътрата рсзрастила до 10-13/'. Соответственно nomaarai и

i i

О

КО 'I

И в "i— о >о

H trt • M tq feitf»

о,Ч о o fe о .

I О У m Е: нон S

о и Е?

Гс1 ¿

J H -H

'Hií

I?;

S В

0) С^М к О) fí ЯЛ'

s H

о о fi

H

л

I пасса-; - кугъташровшше, в теченяэ 14-10 I

дней суспензии клеток на оптимизированной i

для каллусогепоза среде В-5 с 7-10/5 куль- |

[туральным фш>тратой (к.ф.) гриба____

ш1х

• пассаж - кульхишповаьяе в^жиших клеточ-] X иояуляндй на среде Б-5с5-7/» к.ф. гриба )

- - " ~~о JO-IgS к.ф. грлба]

< |Э пассаж — " -

{4~щсс5лГ— " -ном (То;;е голоа

на 7-10/Гсёлоктив-

¡Рагмнол-ениа устойчивого дате риала на ага:- i Ipi-rsoBaimoíi оцтдшзпровакной среде Б-о___j

¡Проверка устойчивости - 2-3 naocaza"

, ' ¡¡i ___íf i_______

1 пассаж - культшшравмиз, в течете И-16 длей, суспензии устойчивы:: после I этапа клеток на оптимизированной среде В-5 с | |10-К% к.ф. гриба___ i

ППпассаж. - отбор вьаашннх кдето'ших попу-' 1ЛЯЩНЙ lia среде В-5 с 5-10% к.ф. гшба_

И

пассат. -

с 13-15% к.ф.гриба1

с 10-15;» к.ф. гриба ]

¡?азмнояе!ше устойчивих кяегочшхх популяций лвдерш на агаризаванной очйшиЕирсвачйо]! среде В-5____

¡Проверка устойчивости - г-3 пассажа

■ Получение растенкИ-реГенерантоз лг.нзрнн устойчивых к фуэарисзу и верищейлеэу

Рис.2-, Схета' отбора клеток лгцерш на групповуэ устойчивость к возбудителя/.! вилта на ' ' примере сорта Еереке.

селективного (¿она в 4 тесаке - 7-105», т.е. достигали уровня концентрации при первом иассаде. Получении!! устон-ч;шй материал, рпзглнсзсенний на оптимизированной среде В-5, внеьь контролировали 1:0 устойчивости на среде с V—J0?» концентрацией 5;:льтх'ата гриса.

lia втором зтаг.е скрининга первоначальное концентрации куль-туряяьнси кпдкости гриба v. d-hiiue били сшшеш с 15 до 10-12$. Клотсчиге линии после первого этапа отбора били оалдб-леш и на фоне с 15% фильтратом устойчивей материал почти вось иогпоал, из-за чего cíluü затруднена эффективность отбора. Концентрации кулътурзльного фильтрата Y.djhiiae в процессе пассирования варьировали о 5-IO-/5 до 13-15/«. Контроль за устойчивостью осуществляли на селективном фоне, так и на среде без токсинов. Устойчише клеточные линии, прошедшие оба этапа отбора, после раз;лга:.:екия на оптимпзиротшюй среде В-5, также пересевали для проьеркл устойчивости на селокгивкий фон в течение 2-3 пас~ал:ей. Получение растений-регенерантов люцерны из устойчива i^ieTO'fiiiK поиуллшш и их укоренение осуществляли на среде содйр;шг;еп бонз:аа;.;::нопурии (б'-БЛП) в концентрации 0,1-0,2 иг/л и ьцда'ллуксусную кислоту (ПУК) - 0,5-1,0 мг/л (Калинин и др., I960). Ьв-щу того, что токсин мо;.;ет блокировать ростошс процсс-OU праетлчеэкя в 10 раз, получение растений-рогенерантов прогс-д;шi на средо без токсических метаболитов.

Полог^телы:!:« результаты в селекции лкцернн на устойчивость колуч'.'Ии с использованном ллотоак опсилант^-ОБ сорта Есроие и Кроояййка. Р&бота с калсуюйш лш:яш сорта Тызякская постлал п Итаизязкая била зитрудаена вследствие бодшсЛ вариабельности п:< по усто:-тл:востл и низке it регеиердогогоюй способности .

Е Результате проэздошшх исследований получены растеннл-ре-з'епергли ладерпц о групповой устойчивостью к ьилтовым патогенам в условия.-: 1г. vitro . Устойчивый исходннй материал передан в ла-Co¿5a'.op:;:j плеточной селекции и л'лмунитста КпргШГШ пастй.ц i: кормов длл поеледувдай оцени! к местнпм популяциям шлтовш: патогенов и ддахиеЛьей ce.-.o';-.u:«3io!i доработки. Передаш раечншя-pcronspcJti-j лкц-дош (пробирочная культура) в количестве. 121 зг-3o.v..¿":.'.'pon л 13П казлуоше вонуляюш, подучетше методом клеточной аелеа-ш на устойчивость к '¿узариоаншу п ьзрювдш.егпилу унядапл:.;. Пронзенная предварительная проверка на устойчивость

1С культуралышм ¿яиьтратам данных патогенов показала, что образцы обладают различной характеристикой устойчивости (табл.4). Проанализировано 110 растений от сорта Береке и 53 растения с происхождением от сорта лщсрш Ярославна. С увеличением числа пассажей на селективном $оне отмечено повышение устойчивости.

Таблица 4

Лабораторная оценка устойчивости растений-регеиеран-тов люцерш

Сорт

(балл

(Число пае-¡Получено |Устой-швость

¡сажей кал-;растз- ; лораяетая)_

¡Л'/Са 11а С&тНПЙ-реге-! Киз.1г1-|Гизиг1-| У .сЫЪ-

•.лектеваом '.нерантоэ 5 чпнУег-КшОаг. ц4»

1

•йадвае-мооть, .

..зреке

контроль 1-2

К культуралшому фильтрату 2-4

50 12 о

О 1-2 3-4

62,0 45,3

4-5

53 34

0-1

23,В

I

О

Ярославна контроль 1-2 50 6 16 2-4 1-2 - 0 45,3

Береке 17 0-1 4-5 12 К возбудителям вялта контроль 50 3-4 1-2 2 2-3 3 1-2 0 23,8

4-5 9 4 0-1 0-1 -

Ярославна контроль 1-2 50 3 10 2-4 1-Я - 0

4-5 3 8 0-1 - 0

Растезсш-х/егенераиты от сорта Берзке, подученные при культивировании суспензнс;шых клеточных культур на селекционном фоне в течение 1-2 пассажей, поражались при обработке культураль-ным фильтратом на 1-2 балла. Тогда, как после 4-5 пассаяеи, поражение растении составляло 0-1 балл. Растения люцерны устойчивые к фильтратам обота патогенов были получены согласно представленного рас.2.

Контрольные растення-регенеранты соответствующих сортов имели <5апл поражения - 2-4. С увеличением числа пассаже:! снижалась прлгнвае:,гость растений: в контроле - 62,0$, при 1-2 пассатах - 45,3$, при 4-5 - 23,6$. На отдельных этапах отбора получено 34 растения от сорта Береке, устойчивых к фильтрату гриба фуэарпум и 12 растении от сорта Ярославна, устойчивых к фильтрату гриба вертихрлллум. Среда растешй-регенерантов, устойчивых к культуратышм егьльтратам обонх возбудителей отобрано 90 образцов с поражением 0-2 балла.

Приведенная по общепринятой методике оценка устойчивости отосланных форм люцерны, непосредственно к вилтовнм патогена;.!, показала следующее (табл.4). О поражением 0-2 балла отобрано 9 форм люцерны сорта J-ореке и 6 ¿[орм сорта Ярославна, сочетании-: устойчивость к обоим возбудителям вклта. Проявили высокую устойчивость к Еертициллэзу 18 растеши исходного сорта Ярославна.

Ирош&даые полевую оцешеу ycioiiчип.ie фор.и люцерны используются селекционерами для дальнейшей селекционной доработки,

выводи

1. Среди изученных 9 цтаммов грибов рода Fusariirn И Ver-tf.cü.iinm отаечело варьирование но показателям катогешосл:, фг:тсхсоксичнооти культуралыюй жидкости, а такте способности к биосинтезу токсинов и исктолит::че сп:х ферментов. Выяатенп наиболее патогенные штаммй, которые снособш служить эффективными продуцентами токсинов. .

2. При смешанном культишровашш ряда штампов f.3.:,v"i,c,r,1'n а такке нря совместном шрощиваши их с vcrticillium отмечен синергический эффект, га:.ат,з.\;шйся в стимуляции биосинтезе), фуза-риовои i'.i:слоты в 1,5-2,0 раза и в увеличении фптотоксичнооти ку.'1ьтурап.ьНой жидкости.

3. Здгрше отмечено явление синергизма но уаелцчешш концентрации Лгтотокснча (в 2-5 раза) у гртба у. <uhii..e л прнсутст-

бш1 f.oxjrsjJOruri .

4. Оптимизирован состав питательных сред для культавироьа-ния грибов рода Fusarinn и Vertíciliiiira 3 направлении по-вшеюш биосинтеза ({узарлевоР кислоты (с 27,5 до 73,5 иг/л) а нектотнгичесгнх фершюов (в зависимостя от субстрата в 1,5-4,2 раза).

5. Оптимизировала питательная среда для каллусогензза 4-х сортов люцерны я на 11,2-26,9$ погашена регенерацпонная способность каллуса.

в. ¡Швленл оптимьлышз концентрации селскгишш агентов для стбора устсЦчивюс камусов лацерпч при первой пассале: р,0xj -з|.огуп! - 5-10$ культураиьисго фильтрата; v.dahiiae ч v.aloo -at rum - 10-20$ культуралыюго фильтрата. На исследугхых ¡этапах отбора концентрацию селективного фона увеличивала на 30^.

7. IIpi использовании в клеточной селекция метода ступенчатого отбора на сплективгасс оптимизированных токсипосодерсквдгх средах отобрано 90 растении от сортов Береке, Нрославиа о устойчивостью 0-2 балла к куль ту рады шм Фильтратам гриба Pusariua и

V ert i с 111 iurr , из них 15 форм с групповой устойчзгвостьг! к возбудителям вялга.

8. Разработана слет селекции получения исходная '¿»р: i лкиер-HU уотоичивнх к группе возбудителен i-mariu-a 1: v^rticíiiiua .

Предложения для селекционной практики

1. Методика получения устойчнвах исходных уорм лэдернн к возбудителям $узариозйого и вертицнллезнсго увдцашя методом клеточной селекции

2. Оптимизированные питательные среди для повасеняя фито-токскчноста и процесса каллусообразоЕаИкя.

3. Устойчише in vitro н in иуо гастени ля;еры (15 форм) передали в Киргизский ЮПИ пастбищ к корпев для селеэдзся-ноЛ дсрабсткн.

Осноешс полезэкоя дассертгизш спублЕКованц в следуютх рай от ах:

I. Белявский b.D. i Д-к?лгрова Г.А., Гусева H.H. ИичгЕСдега-чесгае исследования фузариоза лгцернн // Состояние забалещеисе-тп, средне- и тонковолокнистых сортов хлопчатника Фуа&рисгнш

вил том и пути его снижения / Материалы совещшшя, Ташкент, 6-7 июня 1989 г., Тажент: "Фан",- 1990.- 0.39-43.

2. Платов В.М., Белявский Ю.В., Гусева H.H. Использование метода клеточной инженерии в получении устойчивых исходных, форм сельскохозяйственных pacxemiii // Состояние заболеваемости средне- и тонковолокнистых сортов хлопчатника фузариоззшк вилтом и пути его скшконкя / Ыатериалн согегдашя, Таикент, 6-7 июня 1989 г., Ташкент: "Фан".- 1930.- 0.43-47.

3. Матсароз К.А., Тиран Т.Л., Логинова A.B., Белявский Ю.В. Изучение устойчивости сортов лзцерни к Зузаргюзу // Сб. науч. тр. Вопросы кормопроизводства в Киргизии.- Фрунзе, 1990.- Buk. 8,- С.90-92.

4. Белявский Ю.Б. Оптимизация состава питательной сред*.' для каллусогеиеза различных сортов люцерны к фузариозу // Сб. науч. тр. Вопроси кормопроизводства в Киргизии.- Фрунзе, 1990.-йш. 8.- С.90-92.

5. Гусева H.H., Белявский Ю.В. Получение устойчива к вилту исходных форм люцерны методом клеточной селекции // Тезиси 5-го Международного симпозиума по вортициллиуму, 25-30 июня 1990 г., Леш1нград, СССР.- С.71.