Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСОВ И КЛЕТОК В СОЗДАНИИ ФОРМ ЛЮЦЕРНЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСОВ И КЛЕТОК В СОЗДАНИИ ФОРМ ЛЮЦЕРНЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ"

3099%

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА 4

И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи МАСЛЕННИКОВ Сергей Евгеньевич

УДК 633.31 : 631.147 : 573.6

МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСОВ И КЛЕТОК В СОЗДАНИИ ФОРМ ЛЮЦЕРНЫ, УСТОЙЧИВЫХ к ФУЗАРИОЗУ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

МОСКВА 1994

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии НПО «Нива Ставрополья».

Научные руководители — доктор с.-х. наук, профессор Г. С. Посыпанов; кандидат биологических наук А. В. Мезенцев.

Официальные оппоненты: академик РАСХН, доктор с -н, профессор В. С. Шевелуха, кандидат биологических наук Ю. И. Долгих.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии , _

*

Защита состоится «. ..._» июня 1994 г в * час

мин. на заседании специализированного ученого совета Д 120 35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева

Адрес 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д 49, сект<)р защиты диссертаций

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь спеииализиповянногп совета —

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований . .

■'- , Люцерна обладает наибольшей потенциальной продуктивностью среди бобовых-культур»и высокими кормовыми достоинствами. Но,урожайность и Долголетие этой культуры сдерживается сильной вредоносностью корневых Гнилей, главными возбудителями которых являются фузарии.Г. . , ;

Селекция на устойчивость к фузариозутрадиционными методами требует много времени и больших материальных л интеллектуальных затрат.'

Использование методов культуры каллусов й клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу, повышает • эффективность селекционной работы и многократно сокращает время селекционного процесса." Однако многие вопросы по регенерации растений и отбору клеток на селективных средах* с метаболитами грибов р.. Fusarium недостаточно разработаны. Решение этих вопросов представляет теоретический и практический интерес. ; '--.-■ Цель исследований: С использованием культуры , каллусов и * клеток отобрать и оценить формы люцерны, устойчивые к фузариозу. ч " В связи с этим в задачи наших исследований вхолило: V 1»'• Изучить каллусоГенную. способность различных сортов и форм люцерны; .. '"*.-;? -V- .-•■"."■'*■.'- •

- ■ " 2. Подобрать питательный состав .агаровых сред, обеспечивающий наибольший выход каллусов;

- 3. Выявить формы люцерны, дающие наибольший выход эмбриоидов; .'4. .'Определить концентрации и соотношение биологически активных веществ, обеспечивающие Наибольший выход регенерантов;

, S. Выявить Возможность получения оптимальной плотности клеточной суспензии из растений-регенерантов разных генотипов; .

6. .Изучить «динамику образования эмбриоидов "на жидкой питательной 'среде; . ' ' : - •. •' г ■ -.

• - 7. Подобрать питательную среду для получения культуральных фильтратов (КФ) грибов р. Fusarium; ':. * • " - 8. Оценить токсичность культуральных фильтратов различных видов грибов, выделяемых из корней люцерны; '

' 9. Отобрать наиболее токсичные культуральные фильтраты грибов р. Fusarium;. > ■ . , . ' • , ,"»'•

10. Изучить степень угнетения роста каллусов, полученных из растений-регенерантов разных генотипов, при увеличении концентраций культуральных фильтратов п>ибов; . ■ ' . . ''

• 11. Выявить диапазон \ концентраций" КФ грибов для отбора форм люцерны, устойчивых к фузариозу;

растения-реге неранты;

12. Отощать каллудЫ и |Ц1р^кн>у^той'1Ивы«' к КФ грибов и получить

илу і мК • С.:, • • • t-'ил >..ск-.<а з. г. 1ПД-»: і «но.тзссі

Von і. з. г. іпдлуии

Ин

■А-л&т

13 В вегетационных опытах с почвенной культурой оценить полученные растения регенеранты на устойчивость к фузариозу

Научная новизна В данных исследованиях проведена оценка различных видов, сортов и форм лктерны на каллусо- и эмбриогенез Предложена новая схема получения растений-регенерактов люцерны из культуры каллусов и клеток Отобраны генотипы люцерны с повышенным регенераиионным потенциалом Определены наиболее токсичные изоляты грибов р Ризалит Установлен диапазон концентраций культуральных фильтратов грибов для отбора клеток на устойчивость к фузариозу Отобраны устойчивые к культуральному фильтрату клетки люцерны и получены растения-регенеранты * Проведена оценка на устойчивость к фузариозу созданных форм на жестком инфекционном фоне

Практическая значимость Предложенная схема получения устойчивых к фузариозу форм люцерны с использованием методов культуры каллусов и клеток • может стать составной частью сетекционного процесса Полученные формы люцерны с повышенной устойчивостью к фузариозу, могут бьггь использованы в селекции сортов, устойчивых к этому патогену

Апробация работы Основьые положения диссертации изложены в пяти опубликованных работах Отдельные этапы работы доложены на второй Всесоюзной научной конференции СоИСАФ, КФ ТСХА, в Калуге, 1991, на межвузовской научно-практической конференции СХИ, в Ставрополе, 1991

Объем работы Диссертация изложена на 8 $ страницах машинописного текста, включает 8 таблиц 17 рисунков и 10 приложений

Список литературы включает 100 наименований, в том числе 48 на иностранных языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Использование методов культуры каллусов и клеток в селекции сортов с заданными свойствами (Обзор литературы) Изложено современное состояние вопроса Описаны имеющиеся работы по культуре каллусов и клеток и регенерации из них растений люиерны Показано, что данное направление развивается сравнительно недавно и многие вопросы требуют дальнейшего изучения Показано, что хорошо отработаны методы работы с грибами р Ривапит, но их необходимо уточнить применительно к данной цели исследований Описаны работы по отбору устойчивых клеточных линий растений на селективных средах с различными метаболитами грибов р Ризалит Отмечено, что использование в качестве селективного агента культуральных фильтратов грибов или только отдельных токсинов имеет свои недостатки, сведение которых до минимума будет способствовать оптимизации селекционного процесса на уровне культуры каллусов и клеток

2 Объекты, место и условия проведения исследований Лабораторные и вегетационные опыты были проведены на экспериментальной базе лаборатории биотехнологии НПО "Нива Ставрополья в 1988 - 1993 гг

. i - Исходным материалом служили: сорта люцерны Славянская, мест., Донская-2, Марусинская-425, Северная гибридная,' Кевсала (Medicago varia Mart.); ; Майкопская-11, Кубанская желтая (M. falcata L.); сортообразцу К-1, 675/19 (M. varia Mart.); К-2 (M. glutinosa М.Р.); 3-8с (M: falcata L.); клоны 868 (из Ремблер) и, 54 (из Дединовской), обладающие высоким эмбриогенным потенциалом. " , . .

В качестве эксплантов для получения каллусов служили листья, иногда бутоны и ткани проростков. . . '•

д ' ' В ■ Качестве основной для получения каллусов и клеток использовалась методика А. В. Мезенцева. ■

Растительный материал поверхностно стерилизовали: 15-30 мин. промывка в проточной воде, 30-4S сек; в 70-% спирте, 20 мин. в 10 % хлорной извести, 3-4 раза промывка стерильной дистиллированной водой. ; '

.• / В "качестве питательных сред: МБ5 (Мезенцев, 1980); МС (Murashige, Skoog, 1962); Блейдиса (Blaydes, 196б)| а также китайская среда N6.

Каллусы получали и выращивали в темноте, иногда на рассеянном свету. Полученные растения-регенераты акклиматизировались первые 2-3 дня ;на рассеянном свету при повышенной влажности, затем 14 дней t - 24±l".C, освещенность 5 тыс. лк., влажность - 100 % и 18 "часовой фотопериод; затем t -24±1* С, освещенность 10 тыс. лк., влажность 70-80 %„

• ' Выделение грибов в чистую культуру велось на 'основе методик; М.Ф. Григорьев (1976); В.В. Котова, М.Ю. Степанова (1979); М.К. Хохряков (1969); В.И. Кривченко, Н.М. Коваленко (1984).

., * Использовались ^ корни люцерны разных возрастов. Они отмывались, снимался поверхностный слой коры иод проточной водой. Из корней в стерильных условиях нарезались кусочки 3-5 мм, стерилизовались К2Мп04 и высаживались на подкисленный картофельный агар. • ■ .■- . -

. Через 3-4 суток вокруг кусочков растительной ткани развивался мицелий гриба, который -отсевали посевной иглой штрихами в ч.Петри с картофельной средой или средой Чапека. ' , •

Идентификация грибов проводилась на : основе методик: В.И. Билай (1977); АИ.Райло (1950).

. ; Выращивание грибов на жидких : средах - на основе методик: М.Ф. Григорьев (1976); П.А. Лубенец и др. (1973); В.И. Билай (1982).

J Культуральную жидкость получали при выращивании штаммов фуэариев в жидкой среде Чапека-Докса на качалках при 110 об/мин., при t 25±1 С, в колбах на 250 мл со 100 мл среды. В каждую колбу вносили по 5 мл споровой суспензии (5-10 спор/мл). После 10 суток культивирования содержимое колб фильтровалось через бумажный фильтр для отделения культуральной жидкости от мицелия гриба, а затем' через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм для отделения спор. * * ' *......

• Токсичность культуральных фильтратов определяли на проростках люцерны на основе методики Û.A. Берестецкого (1973).

Оценку полученных растений-регенерантов на устойчивость к г,-/зариумам проводили на основе методик Ю Н Фадеев (1919), Н М Коваленко (1984), В И Кривченко, Н М Коваленко (1984)

Данные обрабатывались статистическими методами дисперсионного анализа

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

і Получение регёнерантов люиерны с использованием каплусных и клеточных культур При получении растений-регенерантов учитывался выход каллусов (табл I) и проведена визуальная оценка их роста по 4-бальной шкале (О - каллус не развивался, 1 - каллус слаборазвитый, 2 - среднее развитие каллуса, 3 - развитый каллус) В качестве каллусогеяных использовались среды МБ5 (по 8 мг/т 2,4Д и кинетина, 0,5 мг/л НУК), Блейдиса (по 2 мг/л - 2,4Д, кинетина и ИУК), МС (8 иг/1 - 2,4Д, 100 мг/л дрожжевый экстракт)

Таблица 1

Выход каллусов (%) люцерны на питательных средах МБ 5, Блейдиса и МС

Питательная среда

_У1Б5_Блейдиса_МС

N Сорта и формы всего разв всего раз» всего разв

п

/

п ___

1 Славянская мест 91,6 50,0 100 35,3 72.3 5.6

2 Донская 2 100 5,9 100 38,9 100 62,S

3 Марусинская 425 94,4 16,7 100 43,8 45,5 5,0

4 Северная гибрид 100 46,7 100 23,5 60,0 ' 5,0

5 Майкопская 11 89,5 52,6 94,4 72,2 84,2 15.8,

б Кубанская желтая 83,3 11,1 95.0 40,0 70,6 5,9

7 Кевсала 95,4 38,9 100 53,0 95,0 65,0.

8 К-1 100 33,4 100 21,1 . 92,8 21,4

9 К-2 100 60,0 100 50,0 93,7 37,5

1 л 675/19 88,2 17,7 100 60,0 100 36,9

и 1 1 Клон - 868 100 22,2 100 35,0 72,2 ИД

і 1 -> Клон - 54 89,5 5,8 100 35,0 88.9 5.6

"х 94,0±5,3 29,4± 99.1іг 42,3± S0,5±2,7 21,4±

0 3,23 0,64 3,33 0 9,79

По средам вся выборка 10,5=1,96, И-2-=0,11-3=2,27, 12-3=6,71 _'__развитые 10,5°2,03, 4-2=4,27, 11-3=1,54, 12-3=6,01

Наибольший выход каллусов был на среде Блейдиса и МБ5, хуже каллусы росли на МС (табл 1) Но по числу развитых каллусов значительно лучшей была питательная среда Блейдиса, что связано, в основном, с пониженными концентрациями гормонов в ней На данной среде все сорта и формы имели

хрроший каллусогенез. Згдоопелыю уступали питательные среды МБ5 и МС, но зато на них контрастнее было видно влияние генотипа. Так, на среде Блейдиса разница между самым высоким (сорт; Майкопская-11," сортообразсц 675/19) и самым низким (Кубанская желтая) средним баллом развития - 0,6. На среде МБ5 этот показатель 1,3 (между сортообразцом К-2 и Кубанская желтая), а на

МС повышался до 1,9 (между сортами Кевсала и Марусинская-425).

Всего по способности к регенерации было изучено 11 сортов и . сортообразцов, из которых было получено 12 растений-регенерантов: из 4 не получено ни одного (Майкопская-11, Кубанская, ж., Кевсала, сортообразец К-1); из 5 получено по одному (Славянская м., Донская-2, Северная гибридная, сортообразцы К-2 и 3-8с); из сортообразца 675/19 - 2 регенерата; наибольшей регенерационной способностью обладал' сорт Марусинская-425, из которого выделено 5 растений-регенерантов. •

В дальнейшем в: качестве питательной среды использовалась также китайская среда N6, так как на ней хорошо шли процессы каллусогенеза и регенерации. ' '

В последующих опытах оценка роста каллусов велась по б-бальной шкале (0 - каллус не растет, 1 - каллус неразвитый, 2 - каллус слаборазвитый, 3 -среднее разюгше каллуса; 4 - хорошее развитие, 5 - максимальное развитие каллуса), а также учитывались такие показатели как цвет, структура, скорость роста и т.д. „ ' ' ' . ' .. ;

Балл . - .'".'" ■

2,4-Д Кинетин НУК ИУК

0.2 0.2

2 2

8 8

0.5

N6.

8 .8 8 8 . 0,5

■0.5

_МБ5__1

Концентрация гормонов

Рис.1 Развитие каллусов образцов люцерны на питательных средах. N6 и МБ5 в зависимости от концентрации гормонов (мг/л).

На среде N6 каллусы не уступали по развитию каллусам, растущим на питатечьнсй среде МБ5 (рис 1) "

При уменьшении концентрации гормонов в питатетьной среле N6 рост каллусов усиливался

В следующем опыте была определена высокая корреляционная зависимость (0,76-0,37) между массой каллусов люцерны и визуальной оценкой их развития по 6-бальнои шкале (табл 2) .

Таблица 2

Корреляционная зависимость между массой каллусов чюцерны и визуальной оценкой развития калл) сов по 6-бальной шкале_____

Исходный сорт растения - регенеранта

Показатель 1 Славянская мест ' Донская ■ ■ 2

Масса каллуса. мг

Сырая Сухая Сырая Сухая

I* 724±20 36,4±0,94 585±13 33,2±0,54

2 413±14 26,0±0,84 326± 11 21,0±0,3б

595 32,1 474 27,9

х балл 331 331 3 01 301

Коффиииент

корреляции 0.87 0,76 0,85 0,80

* Примечание концентрация гормонов

1 2,4-Д - 0,5 иг/т, кинетин - 0,5 мг/л

2 2,4 Д - 4 мг/ч, кинетин - 4 мг/л

Дальнейшие опыты с культурой каллусов показали, что интенсивный рост каллусов не является определяющим фактором для регенерации

На первом этапе изучения процессов регенерации были использованы каллусы сортообразца 3-8с, полученные, после двух пассажей на среде МБ5 (по 8 мг/л -2.4Д и кинетика, 0,5 мг/л НУК) В Качестве эмбриогенных взяты

Таблица 3

Образование эмбриоидов на различных питательных средах, шт/каллус

Концентрация гормонов ,м г /л Питательная среда

N б МБ 5

Кинетин- 0,3, И УК- 0,3 2.75 0,75

БАП- 0,3, аргинин*- 1,7 г/л 1,50 1,00

БАЛ- 0,3 1,00 0,75

БАЛ- 0,3. НУК- 0,Э 1,00 0,25

БАП- 1,0, ИУК- 0,3 1,00 0

Тс 1,47 0,55 *

РГ =2,05. И. =1,95, НСР=1,51

питательные среды N6 и МБ5 (табл. 3). Наиболее подходящей для эмбриогенеза. • -

оказалась' китайская среда N6 (по 0>3 мг/л кинетин и ИУК). При использовании других вариантов сред эмбриогенез был ниже. - -

Регенерация у различных генотипов люцерны имела свои особенности. Так, у N 3-8с (из сортообразца 3-8с) эмбриогенез происходил только после высоких концентраций гормонов (по 4-8 мг/л 2,4Д и кинетина) в каллусогенных средах . независимо от того, какой вариант регенерационной среды был использован (табл. 4). Эмбриоиды образовывались и на безгормональной среде МС. . •

, • . Таблица 4

Эмбриогенез регенерата 3-8с (шт/каллус) после различных концентраций

гормонов в каллусогенной среде МБ5

Калусогенная среда

2.4Д : кинетин (мг./л)

Регенерационная среда | 0,5 , 0,5 1 4:4 1 8:8

Кинетин : ИУК (мг./л) I 1 1

1. МС полная без гормон.. ' 0 15 2

2. МС 0,3 : 0,3 0 2 22

" 3. N60,3:0,3 . 0 5 ■ ■ 1 - 7

4. МБ 5 0,3 : 0,3, без

МН4МОЗ 0 0-8 -

Однако у регенерантов N 193 (из Донской-2) и N 479 (из Дединовской) такой закономерности не наблюдалось и эмбриоиды образовывались уже после низких концентраций гормонов (по 0,2-1 мг/л 2,4Д и кинетина) в каллусогенной среде. •

Наибольший выход эмбриоидоа (50 и более/на один каллус в пробирке) давали регенеранты N 193 (из Донской-2) и 3-8с (из сортообразца 3-8с). У других номеров данный показатель был значительно ниже (до 10 почек или эмбриоидов/1 каллус).. " •

Еще одним определяющим фактором для образования эмбриоидов являлось время нахождения каллуса на питательной среде. Обычно наиболее интенсивно регенерация происходила через 3 месяца после высадки экспланта, т.е. два пассажа на каллусогенный и один на эмбриогенной или наоборот. При таком сроке. нахождения каллуса на питательных средах образовывалось максимальное количество эмбриоидов, хотя первые эмбриоиды появлялись уже через 3 недели" на регенерационной среде. Вероятно, и клеточной массе со временем накапливается фактор, который способствует данному процессу.

Для посадки эмбриоилов и черенков тюцерны ПОДХОДИЛ 1 любые, обедненные вдвое безгормональные среды МС, М135, Б1, N6 В то же время желатетьно использовать наиболее богатую по элементам питания МС или МБ5

Таблица 5

Динамика образования эчбриоидов (щт/колбу) на жилкой питательной

среде N 6_

Суток

|1omoDHOCTb 8 q И 13 21

1 7 14 25 60 множ

2 7 15 30 100 множ

3 8 17 35 125 множ

X 7,3± 15± 30± 95± множ

0,33 0,88 2,9 V

4 3 3 3 и множ

S 0 V 4 20 множ

X 1,5 2 3,5 15,5 множ

6 0 0 0 0 ÎÛ

Нормальный рост клеточной суспензии (в конце 2 недельного цикла до S00 тыс кя/мл) происходил при пассаже каллусов со среды МЕ5 (по 4-8 мг/ч -2,4Д и кинетина) на жидкие среды МБ5 или китайскую N6 (по 0,5 мг/л 2,4Д и кинетина) В каждую колбу на 25 мл жидкой среды пассировались каллусы из 12 прооирок, что составляло 400-800 мг клеточной массы Согласно йабяюдениям плотность клеточной суспензии зависела от многих факторов, важнейшие из которых достаточная критическая масса клеток в начале цикла и концентрация гормонов в питательной среде

В качестве эмбриогенньк кспвльзовались следующие варианты жидких сред МБ5 и N6 I 0,2чг/Ч БАП, И 2мг/л кинетин, 0,2 чг/т НУК, III 0,2 мг/л кинетин, 0,2 мг/л ИУК

Эмбриоиды выпадали на всех вариантах сред, но наиболее стабильно и интенсивно этот процесс шел на среде N6 с 0,2 мг/т кинетина и 0,2 мг/л ИУК

Регенерация в жил ките средах в среднем начиналась на 8-е сутки После накопления определенного (7 8 шт/25 мл среды) критического количества эмбриоилов в среде происходило быстрое их наростаняе(табл 5)

4, Получение наиболее токсичных культуральных фильтратов грибов р Fusarium

Из всех идентифицированных родов грибов, выделяемых с поверхности и из корней тюцерны, ботее 50 % занимали грибы р Fusanum

Из них наибольшее распространение имели F oxysporum, меньше F solanj Иногда выделялись грибы F gibbosum и F avenacemn " Достаточно часто встречались грибы р Pénicillium, Plenodomus, Vecticilhum Для выделения грибов подобраны наиболее оптимальные для данных исследований условия стерилизации материала 0,5 %-ная концентрация К2Мп04, экспозиция 20 чин

При таком режиме первыми прорастали в основном грибы р Fusarium и только

«

потом постепенно появлялись другие висы грибов При использовании меньших экспозиций, а тем более, меньших концентраций К2Мп04 шя стерилизации, обильно и почти одновременно прорастали различные виды грибов

Для получения культуральной жидкости грибов необходимо массовое спороношение Оно получалось в условиях повышенной влажности (колбы, закрытые фольгой) t 25* С на агаризованной картофельной среде или среде Чапека

Проводился опыт, в котором сравнивали токсичность культуральных фильтратов, полученных на картофельной среде (100 гр картофеля/титр) и среде Чапека-Докса Наиболее интенсивное накопление токсинов грибов р Fusarium происходило на жидкой питательной среде Чапека-Докса Токсичность, %

F oxysp

Verttc

Изолят

1 992 98 39 86 50

2 98 39 96 74 85 75

3 97 41 87 66 *78 86

4 97 30 79 08 72 29

S 96 55 72 61 69 25

6 95.58 7! 62 66 24

7 93 78 68 12 65 76

8 82 34 62 73 54 за

9 46 90 54 48 49 90!

10 44 76 34 75

85 26 45 29

45 93 13 75

Рис 2 Токсичность культуральных фильтратов грибов по действию на прорастание семян люцерны •Токсичность культуральных фильтратов грибов определялась на проростках люцерны по формуле 2 I кф

. Т - 100 % - (---------------х 100 %), где

2 1 к

Т - токсичность культурального фильтрата X 1кф - сумма длин проростков чюцерны на КФ гриба

1С

J 1k- сумма длин проростков на воде - в контроле.

Была проведена оценка токсичности различных изолятов грибов, выделяемых из корней люцерны. Наибольшую токсичность показали изоляты грибов Fusarium oxysporum (46-99 %). Менее токсичны были изоляты F. solani (45-98 %) и п>ибов рода Verticillium (34-85 %) (рис. 2). Отобраны наиболее токсичные изоляты грибов р. Fusarium. ' . •

JL Оценка и отбор каллусов и клеток, устойчивых к культуральным фильтратам грибов p.Fusarium. Для работы с" культураль'ными фильтратами 1рибов бып определен на уровне каллусов диапазон селективных концентраций КФ. Через месяц в контроле каллусы всех генотипов имели максимальное развитие (табл. 6).

Таблица 6

Рост каллусов (балл) на кулм>ральных фильтратах грибов р. Fusarium.

Исх. генотип раст. 0 регенер. 5 Концентрация КФ грибов (%) 10 15 20' 25 30 40 X

Дон.-2 5,0± 5,0± 5,0± . 5,0± 4,4± 4,4± ,4,0± „w •Ь\ н- 4.5

0 0 0 О 0,24 . 0,24 • 0 0,24

Север.

гибр.' 5,0± 4,4± 4,8± 4.8± 3,0± 1,0± 1,2± 0 3,0

0 0,24 0,26 0,28 0 0 0,2

С-ц

3-8 с 5,0± . 5,0± 4,8± 4,6± 3,2± 2,2± 0 0 3,1

0 0 0,28 0,26 0,26 0,2

Мар.-

425 5,0± 4,2± 3,4± 2,0± 2,2± 1,2± о. 0 2,2

0 0.2 0,24 0 0,2 0,2

Мар.-

425 5,0± 4,8± 5,0± • 4,8± 1,0± 1,0± 0 0 . 2,7

0 0,28 0 '0,28 0 0

Сдав.

мест. 5,0± 4.2± 4,6± 2,2± 1,8± 1,0± 0 0 2.3

0 0,2 0,26 0,2 0,2 0

С-ц

S75/19 5,0± 4,6± 3,8± 3,6± 0 0 . 0 0 2,1

0 0,26 0,2 0,24

х 5,0 4,6 4,5 3,8 2,2 1,5 0,9 • 0,5 2,9

НСР 0,05 = 0,40_ . ___, • .

При концентрации КФ грибов 30 и 40 % каллусы большинства образцов люцерны гибли , а концентрации 20, 25 % были предельными. Для работы на селективных средах использовались 3 иэолята грибов р. Fusarium. На КФ

наиболее токсичного изолята р охуїрогиіп, гибеїь каллусов растений регенерантов обычно наступала уже после концентрации 10 %

Каллусы различных генотипов отличались по устойчивости к культуральным фильтратам грибов р Ризалит Наибольшую устойчивость показали каллусы N 193 (из Донской-2), которые продолжали расти при 30-40 °т селективного агента

На жидких средах с ЇСФ грибов было сделано до 4-х пассажей _ • Концентрация культуральных фшшт>атов в селективных средах была от 5 до 30 % С каждого этапа выжившие клетки осаждались на бумажных фильтрах и пассировались на каллусогенез и регенерацию, на ту же концентоашно КФ грибов, на большую концентрацию селективного агента, если клеточные суспензии продолжали хорошо развиваться Такая схема селекционного отбора позволяет не терять рггенерационной способности и в то же время выдержать клеточные суспензии на максимально возможной концентрации культурального фильтрата грибов

Было получено 3 эмбриоида N 273 (из Марусинской-425), прошедшего 2 пассажа на селективных средах и 11 эмбриоидов N 193 (из Донской 2), прошедшего 4 пассажа на*средах с КФ грибов р рихапшп

После проведенных отборов получено 11 растеннй-регенерантов N 193 - из Донской-2

Оценка коллекционных растений-регенерантов по их морфологическим и биологическим особенностям Полученные растения-регенераты пересаживались на искусственных питательных средах в течение 2,5 тет, і также периодически- высаживались в вегетационных и полевых условиях

Разброс признаков растений различных генотипов был довольно широк N 496 - из Славянской местной отличается высокой корнеобразующеи способностью, N 291 - из Северной гибридной - карлик с мелкими тистьями, корни в воде образовывались с трудом, но они активно появлялись посте обработки И УК |

N 273 - из Марусинской-425 имеет характерные большие разные прилистники У данного регенерата, а также у N 4 из того же сорта - жетгые вдеты |

N 152 - из сортообразца 675/19 - имеет высокие, прямостоячие, негнущиеся стебли

3-8 с - из сортообразца 3-8 с Имеет особенно сочные, светчозетеные листья и стебли

N 193 - из Донской 2 Имеет узкие, ланцетовидные, плотные іистья, темнозеленую окраску Вероятно, отличается, повышенным уровнем эндогенных гормонов

В вегетационном, опыте была * проведена предварительная оценка полученных растений-регенерантов на устойчивость к грибам р Рікапшп

Инфекционный фон в ящиках создавался путем смешивания 2 частей инфицированного овса с 1 частью почвы Черенки люцерны укоренялись в воде

Через 2 месяца развитые укорененные растения высаживались на инфекционный фон с грибами p. Fusarium. Учет проводили через 1,5 месяца. В контроле все растения прижились и были в хорошем состоянии.

Устойчивость к грибам рода Fusarium показали 3-8 с (из сортообразца 3-8 с), N 459 (из Ремблер), N 496 (из Славянской местной), N 193,(из Донской-2) и сорт Марусинская-425. Из растений N 191/1,- полученных'после селективных сред с культуральными фильтратами грибов, выжито более 30 %. Погибли все растения сортов Славянская местная и Донская-2, и регенератов N 291 (из Северной гибридной), N 152 (из сортообразца 675/19), N 4 (из Марусинской-425). • • *

ВЫВОДЫ ■ ' - ,

1. Различные сорта и формы люцерны' отличались по способности каллусообразования. Устойчивый выход каллусов имели: сорта Кевсала, Донская-2, сортообразцы К-1, К-2, 675/19. Наименьший выход каллусов наблюдался у Кубанской желтой. .'

2. Всего по способности к регенерации было изучено 11 сортов и сортообразцов, из которых бьшо получено- 12 растений-регенерантов: из 4 не получено ни одного (Майкопская-Кубанская ж., Кевсала, сортообразец К-1)', из 5 получено по одному регенеранту (Славянская м., Донская-2, Северная . гибридная, сортообразцы К-2 и 3-8с); из сортообразца 6-75/19 - 2 регенеранта; наибольшей регенерационной способностью обладал сорт Марусинская-425* из которго выделено 5 растений-регенерантов. . - • ' . . '

3. Выявлена высокая корреляционная зависимость (г = 0,76-0,87) между визуальной, бальной оценкой роста каллусов и учетом их массы. ,

4. Каллусы люцерны росли интенсивнее при пониженных концентрациях гормонов (0,2-1 мг/л - 2,4Д; 0,2-1 мг/л кинетина) в питательной среде.

Для эмбриогенеза лучшим сочетанием было: каллусогенная среда МБ5 (по *' 0,2-8 мг/л 2,4Д и кинетина) - эмбриогенная китайская N6 (по 0,2 мг/л кинетина и ИУК). Все генотипы люцерны можно условно разделить по способности к эмбриогенезу на две группы: для одних дортаточкы. низкие концентрации гормонов (по 0,2-1 мг/л 2.4Д и кинетина) в каллусогенных средах; для других необходимы повышенные концентрации гормонов (по 4-8 мг/л 2,4Д и кинетина) в первичных средах. • ' - ' ■ ' . -"'

5. Наибольший выход эмбриоидов давали регенеранты N 193 (из Донской-2) и 3-8 с (из сортообразца 3-8 с). . - , - ■--■ "'

■ 6. Нормальный рост клеточной суспензии (в конце 2-недельного цикла до 500 тыс.кл/мл) происходил при пассаже каллусов со среды МБ5 (по 4-8 мг/я 2,4Д и кинетина) на жидкие среды МБ5 или N6 (по 0,5 мг/л 2,4Д и кинетина). 'Для эмбриогенеза в жидких средах наилучшей была среда N6 (по 0,2 мг/л кинетина и ИУК). После накопления определенного (7-8 цгт/25 мл среды), критического количества эмбриоидов в жидкой питательной среде происходило быстрое их наростание.

7. Наиболее интенсивное накопление токсинов грибов р Fusarium _ происходило на жидкой питательной среде Чапека-Докса

8 Из всех идентифицированных родов грибов, выделяемых с поверхности и из корней люцерны, более 50 % занимали грибы р Fusarium, из которых наибольшую токсичность показали изоляты гриоов F oxysporum (46-99 Менее токсичны были изоляты F Solan? (45-98 %) и грибов рода Verticilhum (3486 %) Отобраны наиболее токсичные изоляты грибов р Fusarium

9 Каллусы различных генотипов отличались по устойчивости к культуральньгм фильтратам грибов р Fusarium Наибольшую устойчивость показали каллусы N 193 - из Донской-2, которые продолжали расти при 30-40 % селективного агента

10 Для отбора каллусов и клеток, устойчивых к культур ал ьн им фильтратам грибов, в зависимости от их токсичности можно использовать концентраиии от 5 до 30 %

Разработана схема отбора клеточных линий люцерны на КФ грибов р " Fusarium несколько пассажей на селективных средах, с каждого этапа клеточная масса'пассируется на'каллусогенез и регенерацию, а также на те же или большие концентрации селективного агента

После четырех пассажей клеток на селективных средах с КФ грибов р Fusarium получено И растений-регенерантов N 193 из Донской-2

Ц, Разработан эффективный метод оценки и отбора регенерантов люцерны в вегетационных условиях на устойчивость к грибам р Fusarium

Устойчивость на жестком инфекционном фоне показали 3-8 с (из сортообразца 3-8 с), N 459 (из Ремблер), N 496 (из Славянской мест), N 193 (из Донской-2) и сорт Марусинская-4^5

Из растений N 193/1, полученных после селективных сред с культу ралькыми фильтратами грибов, выжило более 30 %

12 Собрана коллекция растений-регенерантов люцерны, состоящая из 10 номеров, представляющая собой разнообразны^ материал, который может быть использован как для дальнейших исследований, гак и в селекции сортов с заданными свойствами, в том числе устойчивых|к фузариозу ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ Схема работы по созданию форм люцерны, устойчивых к фузариозу с использованием методов культуры каллусов и клеток

I этап Задача Отобрать генотипы люцерны с высоким регенерационным потенциалом, для каждого растения-регенеранта подобрать индивидуальные концентрации гормонов и другие условия для максимального эмбриогенеза Исходные сорта и формы люцерны v . Получение эмбриогенного каллуса I по 0,2-1 мг/л - 2,4Д и II по 4-8 мг/л - 2,4Д и

кинетина кинетина v

Получение растений-регенерантов с высокой регенераиионной способностью

китайская среда N6 (по 0,2 мг/л ккнетина и ИУК) v

Получение оптимальной клеточной суспензии V * .. .' -МБ5 и N6 (по 0,5 мг/л - 2,4Д и кииетмна) v .; - ; ■ Эмбриогенез в жидких средах N6 • , - : Ч

(по 0,2 мг/л - юшетина и ИУК) v :

В качестве сред для высадки эмбриондов и черенкования люцерны in vitro - МБ5 или MC безгормональные 1/2 состава ' 'V • . ■'- . . Г' ,

II этап. Задача: получить наиболее токсичные культуральные фильтраты грибов р. Fusarium. • ■ . s . : : •

Выделение грибов из корней люцерны на подкисленном картофельном агаре ' , V . . ~ '

Получение чистых культур грибов на картофельной среде и Чапека -ч v Идентификация грибов на среде Чапека; V"

Получение культуральной жидкости грибов на среде Чапека-Докса " ' • " (7-10 суток) V . , ' " '■.'*'■''•"' .:: . . •.

Получение культурального фильтрата (микрофильтры 0,2 мкм)" v Оценка токсичности культур альных фильтратов различных изолятов грибов на проростках люцерны. . v : . . ~ :„ .;„'-'• •• -

Отбор наиболее токсичных культур альных фильтратов. > ,

III этап. Задача: Отобрать клетки, устойчивые к кульгуральным фильтратам грибов р. Fusarium и получить растения-регенеранты.. \

Пассаж высокоморфогенньи каллусов на селективные среды с. наиболее токсичными культуральными фильтратами грибов р. Fusarium. v ' , ' <

Оценка и отбор устойчивых каллусов. • .', ' . ',••" ' .• ■

Определение диапазона селективных концентраций КФ !рибов для отбора клеток люцерны, устойчивых к патогену. V - • , .

Пассаж клеточных суспензий с высоким ре генерационным потенциалом на селективные среды с определенным диапазоном концентраций. . v

1 пассаж ., - 2 и последующие .

--------> на каллусогенез и регенерацию

0 <------—> 0 '. '

Концентрация КФ грибов 10 i-----—> 10 ■•"*.',

(%) 20 •--------> 20 .

25 ¡--------> 25 "

''-----—> 30 ' " : -Д

IV этап.. -Задача: Изучить полученные растения-регенеранты ; в лабораторных, вегетационных и полевых условиях.. ■ ' ...

1) Полученные на I и Ш этапах растения регенераты высаживаются в вегетационных условиях на жестком инфекционном фоне с грибами р. Fusarium, размноженными на зерне, и отбираются устойчивые'растения. - , ; . •.. '

2) Растения-регенеранты используются в дальнейших исследованиях; а также могут быть включены в селекцию сортов с заданными свойствами, в том числе устойчивых к фузариозу. ' • ;. > ■ ,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Масленников С Б Отбор клонов люцерны с высокой регенерационной способностью // Методы интенсификации сетекиионного проиесст Сборник научных трудов / ВСГИ - Одесса 1990 - С 93-94

2 Масленников С Е. Изучение токсичности грибов - возбудигепеи корневой гнили люцерны // Современные проблеммы генетики и сепекшш сельскохозяйственных растений / ВСП1 - Оде.-а, 19a I - С 109-110

3 Масленников С Е Использование среды N б для культуры тканей и клеток люцерны '// Тезисы докладов межвузовской научно - практической конференции молодых ученых и специалистов - Ставрополь - 1991 - С S0-S1

4 Масленников С Е Влияние генаптических особенностей тюцерны на образование каллусов и регенерантов при использовании различных питательных сред // Биотехнология и селекция кормовых культур - Ставрополь - 1991 - С 39-48

5 Масленников С Е, Посыпанов Г С, Мезенцев А В Получение устойчивых к фузариозу форм тюцерны с использованием культуры каллусов и клеток // Известия ТСХА - 1994, зып 3

Объем 1 п л Заказ 631 Тираж 100

Типография Московской с -х академии им А Тимирязева 127550, Мос<ва И 550 Тимирязевская ул, -44