Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Методы культуры каллусов и клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Методы культуры каллусов и клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

РГ8 ОД На правах рукописи

' з М МАСЛЕННИКОВ Сергей Евгеньевич

УДК 633.31 : 631.147 : 573.6

МЕТОДЫ КУЛЬТУРЫ КАЛЛУСОВ И КЛЕТОК В СОЗДАНИИ ФОРМ ЛЮЦЕРНЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ФУЗАРИОЗУ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии НП( «Нива Ставрополья».

Научные руководители — доктор с.-х. наук, профессо Г. С. Посыпанов; кандидат биологических наук А. В. Мезен цев.

Официальные оппоненты: академик РАСХН, доктор с.-н профессор В. С. Шевелуха, кандидат биологических нау] Ю. И. Долгих.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский инстп тут сельскохозяйственной биотехнологии.

Защита состоится «&_» июня 1994 г. в _ час

г/?

мин. на заседании специализированного ученого совет Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академи имени К- А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49, секто; защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной на учной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного, совета — кандидат биологических

А. С. Лосев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований

Люцерна обладает наибольшей потенциальной продуктивностью среди бобовых культур-и высокими кормовыми достоинствами. Но урожайность и долголетие этой культуры сдерживается сильной вредоносностью корневых гнилей, главными возбудителями которых являются фузарии.

Селекция на устойчивость к фузариозу традиционными методами чребует много времени и больших материальных л интеллектуальных затрат.

Использование методов культуры каллусов й клеток в создании форм люцерны, устойчивых к фузариозу, повышает'эффективность селекционной работы и многократно сокращает время селекционного процесса.' Однако многие вопросы по регенерации растений и отбору клеток на селективных средах" с метаболитами грибов р. Fusarium недостаточно разработаны. Решение этих вопросов представляет теоретический и практический интерес.

Цель исследований: С использрванием культуры каллусов и клетох отобрать и оценить формы люцерны, устойчивые к фузариозу.

В связи с этим в задачц наших исследований входило:

1. Изучить калйусоГенную способность различных сортов и форм люцерны; •

2. Подобрать питательный состав агаровых сред, обеспечивающий наибольший выход каллусов;

3. Выявить формы люцерны, даюшие наибольший выход эмбриондов;

4. Определить концентрации и соотношение биологически активных веществ, обеспечивающие йалбольший выход регенерантов;

5. Выявить возможность получения оптимальной плотности клеточной суспензии из растений-регенерантов разных генотипов;

б Изучить «динамику образования эмбриоидоа на жидкой питательной среде; .

7. Подобрать питательную среду для получения культуральных фильтратов (ХФ) грибов р. Fusarium;

8. Оценить токсичность культуральных фильтратов различных видов грибов, выделяемых из корней люцерны; .

9. Отобрать наиболее токсичные культуральные фильтраты грибов р. Fusarium; . . •

10. Изучить степень угнетения роста каллусов, полученных из растений-регенератов разных генотипов, при увеличении концентраций культуральных фильтратов грибов;

11. Выявить диапазон концентраций' КФ грибов для отбора форм люцерны, устойчивых к фузариозу; t '

12. Отобрать каллусы и клетки, устойчивые к КФ грибов и получить растения-регенеранты;

13. В вегетационных опытах с почвенной культурой оценить получении растения-рсгснеранты на устойчивость к фузариозу.

Научная новизна. В данных исследованиях проведена оценка различны видов, сортов и форм люцерны на каллусо- и эмбриогенез. Предложена нова схема получения растений -регенератов, люцерны из культуры каллусов клеток. Отобраны генотипы люцерны с повышенным регенерационньи потенциалом. Определены наиболее токсичные изоляты грибов р. Fusariun Установлен диапозон концентраций культуральных фильтратов грибов дл отбора клеток на устойчивость к фузариозу. Отобраны устойчивые культуральному фильтрату клетки люцерны и получены растения-регенеранть Проведена оценка на устойчивость к фузариозу созданных форм на жестко! инфекционном фоне.

Практическая значимость. Предложенная схема получения устойчивых фузариозу форм люцерны с использованием методов культуры каллусов и клето; может стать, составной частью селекционного процесса. Полученные форм! • люцерны с повышенной устойчивостью к фузариозу, могут быть использованы селекции сортов, устойчивых к этому патогену.

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены в пял опубликованных работах. Отдельные этапы работы доложены на второ] Всесрюзной научной конференции СсИСАФ, КФ ТСХА, в Калуге, 1991, н межвузовской'научно-практической конференции СХИ,.в Ставрополе, 1991.

Объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописное текста, включает 8 таблиц 17 рисунков и 10 приложений.

Список литературы включает 100 наименований, в том числе 48 н иностранных языках. * , _

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. .

1. Использование методов культуры каллусчв и клеток в селекции сортов заданными свойствами (Обзор литературы). Изложено современное состояни вопроса. Описаны имеющиеся работа по культуре каллусов и клеток i регенерации из них растений люцерны. Показано, что данное направлени развивается сравнительно недавно и многие вопросы требуют дальнейшеп изучения. Показано, что хорошо отработаны методы работы с грибами р Fusarium, но их необходимо уточнить применительно к данной цел] исследований. Описаны работы по отбору устойчивых клеточных лини растений на селективных средах с различными метаболитами грибов р. Fusarium Отмеченр, что использование в качестве селективного агента хультуралъны фильтратов грибов или только отдельных токсинов имеет свой недостатки сведение' которых до минимума будет способствовать рттциацш селекционного процесса на уровне культуры каллусов и клеток. •

• 2- Объекты, место и условия проведения исследований. Лабораторные i вегетационные опыты были проведены на экспериментальной базе лабораторш биотехнологии НПО "Нива Ставрополья" в 1988 - 1993 гг. .

Исходным материалом служили: сорта люцерны Славянская мест., Цонская-2, Марусинская-425, Северная гибридная, Кевсала (Medicago varia Mart.); Майкопская-II, Кубанская желтая (М. falcata L.); сортообразцы К-1, 575/19 (М. varia Mart.); К-2 (М. glutinosa М.Р.); 3-8с (М: falcata L.); клоны 868 (из Ремблер) и 54 (из Дединовской), обладающие высоким эмбриогенным потенциалом.

В качестве эксплантов для получения каллусов служили листья, иногда бутоны и ткани проростков.

В качестве основной для получения каллусов и клеток использовалась методика А.В. Мезенцева.

Растительный материал поверхностно стерилизовали: 15-30 мин. промывка в проточной воде, 30-45 сек. в 70-% спирте, 20 мин. в 10 % хлорной извести, 3-4 раза промывка стерильной дистиллированной водой.

В качестве питательных сред: МБ5 (Мезенцев, 1980); МС (Murasliige, Skoog, 1962); Блейдиса (Blaydes, 1966), а также китайская среда N6.

Каллусы получали и выращивали в темноте, иногда на рассеянном свету.

Полученные растения-регенераты акклиматизировались первые 2-3 дня на рассеянном свету при повышенной влажности, затем 14 дней t - 24±1 С, освещенность 5 тыс. лк., влажность - 100 % и 18 часовой фотопериод; затем t -24±l" С, освещенность 10 тыс. лк., влажность 70-80 %.

Выделение грибов в чистую культуру велось на основе методик: М.Ф. Григорьев (1976); В.В. Котова, М.Ю. Степанова (1979); М.К. Хохряков (1969); В.И. Кривченко, Н.М. Коваленко (1984).

Использовались корни люцерны разных возрастов. Они отмывались, снимался поверхностный слой коры под проточной водой. Из корней в стерильных условиях нарезались кусочки 3-5 мм, стерилизовались К2Мп04 и высаживались на подкисленный картофельный агар.

Через 3-4 суток вокруг кусочков растительной ткани развивался мицелий гриба, который отсевали посевной иглой штрихами в ч.Петри с картофельной средой или средой Чапека.

Идентификация грибов проводилась на основе методик: В.И. Билай (1977); А.И. Райло (1950).

Выращивание грибов на жидких средах - на основе методик: М.Ф. Григорьев (1976); П.А. Лубенец и др. (1973); В.И. Билай (1982).

Культуральную жидкость получали при выращивании штаммов фузариев в жидкой среде Чапека-Докса на качалках при 110 об/мин., при t 25+1'* С, в колбах на 250 мл со 100 мл среды. В каждую колбу вносили по 5 мл споровой суспензии (5'10 спор/мл). После 10 суток культивирования содержимое колб фильтровалось через бумажный фильтр для отделения культуральной жидкости от мицелия гриба, а затем' через фильтры с диаметром пор 0,2 мкм для отделения спор.

Токсичность культуральных фильтратов определяли на проростках люцерны на основе методики О.А. Берестецкого (1973).

Оценку полученных растенйй-регенерантов на устойчивость к <.узариумам проводили на основе методик: Ю.Н. Фадеев (1979), Н.М. Коваленко (1984), В.И. Крнвченко, Н.М. Коваленко (1984).

Данные ■ обрабатывались статистическими методами дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2- Получение регенерантов люцерны с использованием каялусных и клеточных культур. При получении растенйй-регенерантов учитывался выход каллусов (табл. 1) и проведена визуальная оценка их роста по 4-бальной шкале (О - каллус не развивался; 1 - ,каллус слаборазвитый; 2 - среднее развитие каллуса; 3 - развитый каллус). В качестве каллусогенных использовались среды: МБ5 (по 8 мг/л 2,4Д и кинетина, 0,5 мг/л НУК); Блейдиса (по 2 мг/л - 2,4Д, кинетина и ИУК); МС (8 мг/л - 2,4Д; 100 мг/л дрожжевым экстракт).

Таблица 1

Выход каллусов (%) люцерны на питательных средах '

МБ 5, Блейдиса и МС. - ' •

Питательная среда МБ5 Блейдиса

МС

Сорта и формы всего разв. всего разв; всего разв.

Славянская мест. 91,6 50,0 100 35,3 • 72,3 5,6

Донская 2 100 5,9 100 38,9 100 62,5

Марусинская 425 94,4 ■ ' 16,7 100 43,8 45,5 5,0

Северная гибрид. 100 . 46,7 100 23,5 60,0 5,0

Майкопская 11 89,5 52,6 94,4 72,2 84,2 15,8,

Кубанская желтая 83,3 11,1 95,0 40",0 70,6 5,9

Кевсала 95,4 : 38,9 100 53,0 95,0 65,0.

К-1 100 33,4 100 21,1 , 92,8 21,4

К-2 100 60,0 100 50,0 93,7 37,5

675/19 .. 88,2 17,7 ,100 60,0 100 36,9

Клон - 868 100 22,2 100 35,0 - 72,2 11,1

Клон - 54 89,5 5,8 . ■ 100 ' 35,0 88,9 ■ 5,6

х 94,0±5,3 29,4± 99,1± . 42,3+ . 80,5±2,7 21,4±

0 3,23 0,64 3,33 0 9,79

По средам: вся выборка t0,5=l,96; 11-2=0; tl-3=2,27; t2-3=6,71

развитые t0,5=2,03; tl-2=4,27; tl-3^1,54; t2-3=6,01

Наибольший выход каллусов был на среде Блейдиса и МБ5, хуже каллусы росли на МС (табл. 1). Но по числу развитых каллусов значительно лучшей была питательная среда Блейдиса, что связано, в основном, с пониженными концентрациями гормонов в ней. На данной среде все сорта и формы имелц

хороший каллусогенез. Значительно уступали питательные среды МБ5 и МС, но зато на них контрастнее было видно влияние генотипа. Так, на среде Бледдиса разница между самым высоким (сорт Майкопская-] 1, сортообразец 675/19) и самым низким (Кубанская желтая) средним баллом развития - 0,6. На среде МБ5 этот показатель 1,3 (между сортообразцом К-2 и Кубанская желтая), а на МС повышался до 1,9 (между сортами Кевсала и Марусинская-425).

Всего по способности к регенерации было изучено 11 сортов и сортообразцов, из которых было получено 12 растений-регенерантов: из 4 не получено ни одного (Майкопская-11, Кубанская ж., Кевсала, сортообразец К-1); из 5 получено по одному (Славянская м., Донская-2, Северная гибридная, сортообразцы К-2 и 3-8с); из сортообразца 675/19 - 2 регенеранта; наибольшей регенерационной способностью обладал сорт Марусинская-425, из которого выделено 5 растений-регенерантов.

В дальнейшем в качестве питательной среды использовалась также китайская среда N6, так как на ней хорошо шли процессы каллусогенеза и регенерации.

В последующих опытах оценка роста каллусов велась по 6-бальной шкале (0 - каллус не растет, 1 - каллус неразвитый, 2 - каллус слаборазвитый, 3 -среднее развитие каллуса; 4 - хорошее развитие, 5 - максимальное развитие каллуса), а также учитывались такие показатели как цвет, структура, скорость роста и т.д.

Балл

4.5 у

4 ■

3.5 -

3 -

_ 2.5 ■ ? X

2

1.5

1

0.5 0

2,4-Д Кинетин НУК ИУК

N6

0.2 0.2

III IV

VI VII

Концентрация гормонов

0.5 0>5

•0.5

МБ5

Рис.1 Развитие каллусов образцов люцерны на питательных средах.N6 и МБ5 в зависимости от концентрации гормонов (мг/л).

На среде N6 каллусы не уступали по развитию каллусам, растущим на питательней среде МБ5 (рис. 1). "

При уменьшении концентрации гормонов в питательной среде N6 рост каллусов усиливался.

В следующем опыте была определена высокая корреляционная зависимость (0,76-0,87) между массой каллусов люцерны и визуальной оценкой их развития по 6-бальной шкале (табл. 2). , ■

Таблица 2

Корреляционная зависимость между массой каллусов люцерны и

визуальной оценкой развития каллусов по 6-бальной шкале._

Исходный сорт растения- регенеранта

Показатель ! Славянская мест. ! Донская - 2

Масса каллуса, мг.

Сырая Сухая Сырая Сухая

1* 724±20 36,4±0,94 585+13 33,2±0,54

2 . 413±14 26,0±0,84 32б±11 21,0±0,3б

X 595 32,1 474 27,9

х балл 3.31 3.31 3.01 3.01

Коффициент

корреляции 0,87 0,76 0,85 0,80

* Примечание: концентрация гормонов

1. 2,4-Д - 0,5 мг/л; кинетин - 0,5 мг/л.

2. 2,4-Д - 4 мг/л; кинетин - 4 мг/л.

Дальнейшие опыты, с культурой каллусов показали, что интенсивный рост каллусов не является определяющим фактором для регенерации.

На первом этапе изучения процессов регенерации были использованы каллусы сортообразца 3-8с, полученные, после двух пассажей на среде МБ5 (по 8 мг/л -2,4Д и кинетина, 0,5 мг/л НУК). В качестве эмбриогенных взяты

Таблица 3

Образование эмбриоидов на различных питательных средах, шт/каллус.

Концентрация гормонов ,м г /л' Питательная среда

■ N6 МБ 5

Кинетин- 0,3; ИУК- 0,3 2,75 0,75

БАП- 0,3; аргинин*- 1,7 г/л , 1,50 1,00 '

БАП-'0,3 1,00 0,75

БАП-0,3; НУК-0,5 1,00 " . : -. 0,25

БАП- 1,0; ИУК- 0,3 1,00 0

X 1,47 0,55 ' ••

РГ =2,05; П. = 1,95; НСР=1,51

питательные среды N6 и МБ5 (табл. 3). Наиболее подходящей для эмбриогенеза. •

оказалась китайская среда N6 (по 0,3 мг/л кинетин и ИУК). При использовании других вариантов сред эмбриогенез был ниже.

Регенерация у различных генотипов люцерны имела свои особенности. Так, у N 3-8с (из сортообразца 3-8с) эмбриогенез происходил только после высоких концентраций гормонов (по 4-8 мг/л 2,4Д и кинетина) в каллусогенных средах независимо от того, какой вариант регенерацйонной среды был использован (табл. 4). Эмбриоиды образовывались и на безгормональной среде М С.

• . Таблица 4

Эмбриогенез регенеранта 3-8с (шт/каллус) после различных концентраций гормонов в каллусогеиной среде МБ5

Калусопенная среда 2,4Д : кинетин (мг./л)

Регенерационная среда | 0,5 ; 0,5 1 4 :4 1 8 : 8

Кинетин : ИУК (мг./л) | I I

1. МС полная без гормон.. ' 0 15 2

2. МС 0,3: 0,3 0 2 22

' 3. N60,3:0,3 0 5 1 - 7

4. МБ 5 0,3 : 0,3, без

МН 4 N0 3 0 0 - 8 -

Однако у регенерантов N 193 (из Донской-2) и N 479 (из Дединовской) такой закономерности не наблюдалось и эмбриоиды образовывались уже после низких концентраций гормонов (по 0,2-1 мг/л 2,4Д и кинетина) в каллусогенной среде. '

Наибольший выход эмбриоидов (50 и более/на один каллус в пробирке) давали регенеранты N 193 (из Донской-2) и 3-8с (из сортообразца 3-8с). У других номеров данный показатель был значительно ниже (до 10 почек или эмбриоидов/ 1 каллус). •

Еще одним определяющим фактором для образования эмбриоидов являлось время нахождения каллуса на питательной среде. Обычно наиболее интенсивно регенерация происходила через 3 месяца после высадки эксппанта, т.е. два пассажа на каллусогенный и один на эмбриогенной или наоборот. При таком сроке нахождения каллуса на питательных средах образовывалось максимальное количество эмбриоидов, хотя первые эмбриоиды появлялись уже через 3 недели на регенерацйонной среде. Вероятно, в клеточной массе со временем накапливается фактор, который способствует данному процессу.

Для посадки эмбриоидов и черенков люцерны под5одшг< любые, обедненные вдвое безгормональные среды: МС; МБ5; Б1; N6. В то же гремя желательно использовать наиболее богатую по элементам питания МС или МБ5.

Таблица 5

Динамика образования эмбриоидов (шт/колбу) на жидкой питательной среде N 6. _ _____■

Суток

Повторность 8 9 И 13 •21

1 7 14 25 60 множ.

2 7 .15 30 100' множ.

3 8 17 35 • 125 множ.

X 7,3± ; 15± 30+ ■95± множ.

0,33 0,88 2,9 . У

4 3 3 3 11 множ.

5 0 1 4 20 . множ.

X 1,5 2 3,5 ' 15,5 множ.

6 0 0 0 0 30

Нормальный рост клеточной суспензии (в конце 2 недельного цикла до 500 тыс.кл/мл) происходил при пассаже каллусов со среды МБ5 (по 4-8 мг/л -;' 2,4Д -и кинетина) на жидкие среды МБ5 или китайскую N6 (по 0,5 мг/я 2,4Д и кинетина). В каждую колбу на 25 мл жидкой среды пассировались каллусы из 12 пробирок, что составляло 400-800 мг клеточной массы. Согласно йабяюдениям плотность клеточной суспензии зависела от многих факторов, важнейшие из которых: достаточная критическая масса клеток в Начале цикла и концентрация гормонов в питательной среде. -,

В качестве эмбриогенных использовались следующие варианты жидких сред МБ5 и N6:1 0,2мг/л БАЛ; II 2мг/л кинетин, 0,2 мг/л НУК; III 0,2 мг/л кинетин, 0,2 мг/л ИУК. • ' ■ _

Эмбриоиды выпадали на всех "вариантах сред, но наиболее стабильно и интенсивно этот процесс шел на среде N6 с 0,2 мг/л кинетина и 0,2 мг/л' ИУК. г \ Регенерация в жидких средах в среднем начиналась на 8-е сутки. После накопления определенного (7-8 шт/25 мл среды) критического количества ; эмбриоидов в среде происходило быстрое их наростание(табл. 5).

iL Получение наиболее токсичных культур альных фильтратов грибов р. Fusarium. "'■..;.■'.'■■'... ■■''■ ;

Из всех идентифицированных родов грибов, выделяемых с- Поверхности и из корней люцерны, более 50 % занимали грибы р. Fusarium..

Из них наибольшее распространение имели F. Oxysporum, меньше F. solani. Иногда вьщелялись грибы F. gibbosum и F. avenaceum. ' Достаточно часто встречались грибы p. Pénicillium, Plenodomus, Verticiffium. Для выделения грибов подобраны наиболее оптимальные, для данных исследований условия стерилизации материала: 0,5 %-ная концентрация К2Мп04, экспозиция 20 мин. При таком режимег первыми прорастали в основном грибы р. Fusarium и только

Потом постепенно появлялись другие виды грибов. При использовании меньших экспозиций, а тем более, меньших концентраций К2Мп04 для стерилизации, обильно и почти одновременно прорастали различные виды грибов.

Для получения культуральной жидкости грибов необходимо массовое спороношение. Оно получалось в условиях повышенной влажности (колбы, закрытые фольгой) t 25 * С на агаризованной картофельной среде или среде Чапека.

Проводился опыт, в котором сравнивали токсичность культуральных фильтратов, полученных на картофельной среде (100 гр картофеля/литр) и среде Чапека-Докса. Наиболее интенсивное накопление токсинов грибов р. Fusarium происходило на жидкой питательной среде Чапека-Докса.

Токсичность, %

Изолят

1 99.2 98.39 86.50 85.26 45.93

2 98.39 96.74 85.75 45.29 13.75

3 97.41 87.66 '78.86

4 97.30 79.08 72.29

5 / 96.55 72.61 ' 69.25

6 95.58 . 71.62 66.25

7 93.78 68.12 65.76

8 82.34 62.73 54.30. .

9 . 46.90 54.48 49.90) . 10 44.76 34.75'

Рис. 2 Токсичность культуральных фильтратов грибов по действию на прорастание семян люцерны. -Токсичность культуральных фильтратов грибов определялась на проростках люцерны по формуле: 21 1 кф

, Т = 100 % - (---------—— х 100 %), где

:";. ■'■ • ' 1к '

' Т - токсичность культурального фильтрата. , % 1кф - сумма длин проростков люцерны на КФ гриба.

1k - сумма длин проростков на воде - в контроле.

Еыла проведена оценка токсичности различных изолятов грибов, выделяемых из корней люцерны. Наибольшую токсичность показали изоляты (рибов Fusarium oxysporum (46-99 %). Менее токсичны бьши изоляты F. solani (45-98 %) :i грибов рода Verticillium (34-83 %) (рис. 2). Отобраны наиболее токсичные изоляты грибов р. Fusarium.

1 Оценка и отбор каллусов и клеток, устойчивых к культуральным фильтратам грибов p.Fusarium. Для работы с культуральными фильтратами грибов был определен на уровне каллусов диапазон селективных концентраций КФ. Через месяц в контроле каллусы всех генотипов имели максимальное развитие (табл. 6).

Таблица 6

Рост каллусов (балл) на культуральных фильтратах грибов р. Fusarium. Исх. Концентрация КФ грибов (%)

генотип раст. 0 регенер. 5 10 15 20' 25 30 40 X

Дон.-2 5,0± 5,0± 5,0± 5,0± 4,4± 4,4± . 4,0± 3,6± 4,5

0 0 0 0 0,24 0,24 0 0,24

Север.

гибр. 5,0± 4,4± 4,8± 4.8± 3,0± 1,0± 1,2± 0 3,0

0 0,24 0,26 0,28 0 0 . 0,2

С-ц

3-8 с 5,0± 5,0± 4,8± 4,6± 3,2± 2,2± 0 0 3,1

0 0 0,28 0,26 0,26 0,2

Мар.-

425 5,0± 4,2± 3,4± 2,0± 2,2± 1,2± 0. 0 2,2

0 0,2 0,24 0 0,2 0,2

Мар,-

425 5,0± 4,8± 5,0± 4,8± l,0i 1,0± 0 0 .2,7

0 0,28 0 "0,28 0 0

Слав.

мест. 5,0± 4,2± 4,6± 2,2± 1,8± 1,0± 0 0 2,3

0 0,2 0,26 0,2 0,2 0

С-ц

675/19 5,0± 4,6± 3,8± 3,6± 0 0 . 0 0 2,1

0 0,26 0,2 0,24

х 5,0 4,6 4,5 3,8 2,2 1.5 0,9 • 0,5 2,9

НСР 0,05 = 0,40

При концентрации КФ грибов 30 и 40 % каллусы большинства образцов люцерны гибли , а концентрации 20, 25 % были предельными. Для работы на селективных средах использовались 3 изолята грибов р. Fusarium. На КФ

наиболее токсичного изолята F. oxysporum, гибель каллусов растений . регенератов обычно наступала уже после концентрации 10 %.

■ Каллусы различных генотипов отличались по устойчивости к культуральным фильтратам грибов р. Fusarium. Наибольшую устойчивость показали каллусы N 193 (из Донской-2), которые продолжали расти при 30-40 % селективного агента.

На жидких средах с КФ грибов было сделано до 4-х пассажей. 'Концентрация культуральных фильтратов в селективных средах была от 5 до 30 %.. С каждого этапа выжившие клетки осаждались на бумажных фильтрах и пассировались: на каллусогенез и регенерацию; на ту же концентрацию КФ грибов; на большую концентрацию селективного агента, если клеточные суспензии продолжали хорошо развиваться. Такая схема селекционного отбора позволяет не терять регенерационной способности и в то же время выдержать клеточные суспензии на максимально возможной концентрации культурального фильтрата грибов.

Было получено 3 змбриоидд N 273 (из Марусинской-425), прошедшего 2 пассажа на селективных средах и 11 эмбриоидов N 193 (из Донской-2), прошедшего 4 пассажа на* средах с КФ грибов р. Fusarium.

После проведенных отборов получено 11 растений-регенерантов N 193 - из Донской-2.

б» Оценка коллекционных растений-регенерантов по их морфологическим и биологическим особенностям. Полученные растения-регенеранты пересаживались на искусственных питательных средах в течение 2,5 лет, а также периодически высаживались в вегетационных и полевых условиях.

Разброс признаков растений различных генотипов был довольно широк.

N 496 - из Славянской местной отличается высокой корнеобразующей способностью; N 291 - из Северной гибридной - карлик с мелкими листьями, корни в воде образовывались с трудом, но они активно появлялись после обработки ИУК. .

N 273 - из Марусинской-425 имеет прилистники. У данного регенеранта, а также одеты.

. N 152 - из сортообразца 675/19 - (имеет высокие, прямостоячие, негнущиеся стебли,

3-8 с - из сортообразца 3-8 с. Имеет особенно сочные, светлозеленые листья и стебли.

N 193 - из Донской -2. Имеет узкие, ланцетовидные, плотные листья, темнозеленую окраску. Вероятно, отличается, повышенным уровнем эндогенных гормонов.

- В вегетационном- опыте, была 'проведена предварительная оценка полученных растений-регенерантов на устойчивость к грибам р. Fusarium.

Инфекционный; фон в ящиках создавался путем смешивания 2 частей инфицированного овса с 1 частью почвы. Черенки люцерны укоренялись в воде.

характерные большие резные ' N 4 из того же сорта - желтые

Через 2 месяца развитые укорененные растения высаживались на инфекционный фон с грибами р. Fusarium. Учет проводили через 1,5 месяца. В контроле все растения прижились и были в хорошем состоянии.

Устойчивость к грибам рода Fusarium показали 3-8 с (из сортообразца 3-8 с), N 459 (из Ремблер), N 496 (из Славянской местной), N 193 ,(из Донской-2) и сорт Марусинская-425. Из растений M 191/1, полученных после селективных сред с культуральными фильтратами грибов, выжило более 30 %. Погибли все растения сортов Славянская местная и Донская-2, и регенерантов N 291 (из Северной гибридной), N 152 (из сортообразца 675/19), N 4 (из Марусинской-425).

ВЫВОДЫ " '

1. Различные сорта и формы люцерны отличались по способности каллусообразовйния. Устойчивый выход каллусов имели: сорта Кевсала, Донская-2, сортообразцы К-1, К-2, 675/19. Наименьший выход каллусов -наблюдался у Кубанской желтой. '

2. Всего по способности к регенерации было изучено 11 сортов и сортообразцов, из которых было получено 12 растений-регенерантов: из 4 не получено ни одного (Майкопская-'Ii,. Кубанская ж., Кевсала, сортообразец К-1); из 5 получено по одному регенерату (Славянская м., Донская-2, Северная гибридная, сортообразцы К-2 и 3-8с); из сортообразца 675/19 - 2 регенеранта; наибольшей регенерационной способностью обладал сорт Марусинская-425, из которго выделено 5 растений-регенерантов.

3. Выявлена высокая корреляционная зависимость (г = 0,76-0,87) между визуальной, бальной оценкой роста каллусов и учетом их массы.

4. Каллусы люцерны росли интенсивнее при пониженных концентрациях гормонов (0,2-1 мг/л - 2,4Д; 0,2-1 мг/л кинетина) в питательной среде.

Для эмбриогенеза лучшим сочетанием было: каллусогенная среда МБ5 (по 0,2-8 мг/л 2,4Д и кинетина) - эмбриогенная китайская N6 (по 0,2 мг/л кинетина и ИУК). Все генотипы люцерны можно условно разделить по способности к эмбриогенезу на две группы: для одних дортаточны. низкие концентрации гормонов (по 0,2-1 мг/л 2,4Д и кинетина) в каллусогенных средах; для других необходимы повышенные концентрации гормонов (по 4-8 мг/л 2,4Д и кинетина) в первичных средах.

5. Наибольший выход эмбриоидов давали регенеранты N 193 (из Донской-2) и 3-8 с (из сортообразца 3-8 с). . .

6. Нормальный рост клеточной суспензии (в конце 2-недельного цикла до 500 тыс.кл/мл) происходил при пассаже каллусов со среды МБ5 (по 4-8 мг/л 2,4Д и кинетина) на жидкие среды МБ5 или N6 (по 0,5 мг/л 2,4Д и кинетина). Для эмбриогенеза в жидких средах наилучшей была среда N6 (по 0,2 мг/л кинетина и ИУК). После накопления определенного (7-8 urr/25 мл среды), критического количества эмбриоидов в жидкой питательной среде происходило быстрое их наростание.

7. Наиболее интенсивное накопление токсинов грибов р. Fusarium . происходило на жидкой питательной среде Чапека-Докса.

8. Из всех идентифицированных родов грибов, выделяемых с поверхности и из корней- люцерны, более 50 % занимали грибы р. Fusarium, из которых наибольшую токсичность показали изоляты грибов F'. oxysporum (46-99 %). Менее токсичны были изоляты F, solani (45-98 %) и грибов рода Verticillium (3486 %). Отобраны наиболее токсичные изоляты грибов р. Fusarium.

9. Каллусы различных генотипов отличались по устойчивости к культуральным фильтратам грибов р. Fusarium. Наибольшую устойчивость показали каллусы N 193 - из Донской-2, которые продолжали расти при 30-40 % селективного arema. , ' ■

10. Для отбора каллусов и клеток, устойчивых к культуральным фильтратам грибов, в зависимости от их токсичности можно использовать концентрации от 5 до 30 %. ■

Разработана схема отбора клеточных линий люцерны на КФ грибов р. ' Fusarium: несколько пассажей на селективных средах, с каждого этапа клеточная масса'пассируется на каллусогенез и регенерацию, а также на те же или большие концентрации селективного агента.

После четырех пассажей клеток на селективных средах с КФ грибов р. Fusarium получено 11 растений-регенератов N 193 из Донской-2.

11.. Разработан эффективный метод оценки и отбора регенератов люцерны в вегетационных условиях на устойчивость к грибам р. Fusarium.

Устойчивость на жестком инфекционном фоне показали 3-8 с (из соргообразца 3-8 с), N 459 (из Ремблер), N 496 (из Славянской мест.), N 193 (из Донской-2) и сорт Марусинская-425.

Из растений N 193/1, полученных после селективных сред с культуральными фильтратами грибов, выжило более 30 %.

12. Собрана коллекция растений-регЬнерантбв люцерны, состоящая из 10 номеров, представляющая собой разнообразный материат, который может быть использован как для дальнейших исследований, так и в селекции сортов с заданными свойствами, в том числе устойчивых к фузариозу.

• ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ. •

Схема работы по созданию форм люцерны, устойчивых к фузариозу с использованием методов культуры каллусов и клеток.

I этап. Задача: Отобрать генотипы люцерны с высоким регенерационным потенциалом; для каждого; растения-регенеранта подобрать индивидуальные концентрации гормонов и другие условия для максимального эмбриогенеза.

Исходные сорта и формы люцерны : v .

Получение эмбриогенного каллуса

I по 0,2-1 мг/л - 2,4Д и II по 4-8 мг/л - 2,4Д и

кинетина кинетина v

Получение растений-регенератов с высокой регенерационнои способностью . '

китайская среда N6 (по 0,2 мг/л ккнетина и ИУК) v

Получение оптимальной клеточной суспензии v МБ5 и N6 (по 0,5 мг/л - 2,4Д и кинстина) у Эмбриогенез в жидких средах N6 (по 0,2 мг/л - кинетика и ИУК) v

В качестве сред для высадки эмбриоидов и черенкования люцерны in vitro - МБ5 или MC безгормональные 1/2 состава

II этап. Задача: получить наиболее токсичные культуральные фильтраты грибов р. Fusarium.

Выделение грибов из корней люцерны на подкисленном картофельном агаре v .

Получение чистых культур грибов на картофельной среде и Чапека v Идентификация грибов на среде Чапека v Получение культуральной жидкости грибов на среде Чапека-Докса (7-10 суток) V

Получение культурального фильтрата (микрофильтры 0,2 мкм) v Оценка токсичности культуральных фильтратов различных изолятов грибов на проростках люцерны. v

Огоор наиболее токсичных культуральных фильтратов.

III этап. Задача: Отобрать клетки, устойчивые к культуральным фильтратам грибов р. Fusarium и получить растения-регенеранты.

Пассаж высокоморфогенных каллусов на селективные среды с наиболее токсичными культуральными фильтратами грибов р. Fusarium. v Оценка и отбор устойчивых каллусов. ,

Определение диапазона селективных концентраций КФ грибов для отбора клеток люцерны, устойчивых к патогену. v

Пассаж клеточных суспензий с высоким регенерационным потенциалом на селективные среды с определенным диапазоном концентраций. . v

1 пассаж 2 и последующие

—> на халлусогенез и регенерацию

0 1----- —> 0

Концентрация КФ грибов 10 i---- —> 10

(%) 20 '---- —> 20

25;— —> 25

—> 30

[V этап. -Задача: Изучить полученные растения-регенеранты в лабораторных, вегетационных и полевых условиях. ,

1) Полученные на I и III этапах растения регенеранты высаживаются в вегетационных условиях на жестком инфекционном фоне с грибами р. Fusarium, размноженными на зерне, и отбираются устойчивые"растения.

2) Растения-регенеранты используются в дальнейших исследованиях, а также могут быть включены в селекцию сортов с заданными свойствами, в том числе устойчивых к фузариозу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ■ МАТЕРИАЛАМ 'ДИССЕРТАЦИИ.

1. Масленников С. Е. Отбор клонов люцерны с высокой регенерационной способностью // Методы интенсификации селекционного процесса: Сборник научных трудов / ВСГИ. - Одесса, 1990. - С. 93-94.

2. Масленников С. Е. Изучение токсичности грибов - возбудителей корневой гнили люцерны // Современные проблеммы генетики и селекции сельскохозяйственных растений / ВСГИ. - Одс;;а, 19?1. - СЛ09-110.

3. Масленников С.Е. Использование среды N 6 для культуры тканей и клеток люцерны // Тезисы докладов межвузовской научно - практической конференции молодых ученых и специалистов. - Ставрополь. - 1991. - С. 80-81.

4. Масленников С.Е. Влияние генотипических особенностей люцерны на образование каллусов и регенератов при использовании различных питательных сред И Биотехнология и селекция кормовых культур. - Ставрополь - 1991. - С. 39-48.

5. Масленников С.Е., Посыпанов. Г.С., Мезенцев А. В. Получение устойчивых к фузариозу форм люцерны с использованием культуры каллусов и клеток. // Известия ТСХА. - 1994, вып.З.