Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli.

Манувера, Валентин Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli.
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli."

На правах рукописи

0034G8378 Манувера Валентин Александрович

Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E.coli.

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 / I * -р

Москва -2009

003468978

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»),

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор, „ „ _ _

г т Веико Владимир Петрович

ФГУП «ГосНИИгенетика», г. Москва

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

ФГУП «ГосНИИгенетика», Честухина Галина Георгиевна

г. Москва

кандидат биологических наук, доцент, ФГУ НИИ Физико-химической медицины Минздравсоцразвития РФ, г. Москва

Ведущая организация:

Лазарев Василий Николаевич

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится » \ lCjL-A 2009г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».

Автореферат разослан «./У »

2009г.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.Г. Заиграева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность темы исследования

Активные исследования трансмембранного транспорта белков ведутся в течение последних четырех десятилетий, что позволило вскрыть молекулярные аспекты этого процесса. В тоже время, в данной области в настоящее время остается значительное количество нерешенных проблем. Доказано, что для транспорта полипептида через мембрану он должен иметь аминоконцевой участок с характерной структурой — т.н. сигнальный пептид (Pugsley А.,1993). Однако, как следует из большого количества экспериментов, его наличие в составе рекомбинантных белков далеко не всегда приводит к их транслокации. В настоящее время до конца не ясно, какое влияние на трансмембранный транспорт полипептидов оказывает структура их зрелой части, в частности, присутствуют ли в полипептидах какие-либо необходимые для переноса элементы, помимо сигнального пептида. Не разработана также проблема взаимного влияния структуры сигнального пептида и остальной части белка. Одной из нерешенных окончательно проблем остается эффективная секреция рекомбинантных белков в периплазматическое пространство или культуральную среду.

Основной системой трансмембранного транспорта белков у бактерий является Sec-транслоказа. Одним из характерных субстратов Бес-системы транслокации являются энтеротоксины грамположительной патогенной бактерии Staphylococcus aureus. В процессе размножения в организме млекопитающих, данный микроорганизм секретирует большое количество энтеротоксинов нескольких типов. По механизму действия они относятся к группе так называемых суперантигенов — белков, вызывающих неспецифическую активацию больших субпопуляций Т-лимфоцитов, что ведет к подавлению иммунной системы организма-хозяина. Действием стафилококковых энетеротоксинов обусловлен ряд заболеваний, в том числе пищевые отравления и синдром токсического шока. Особенности воздействия стафилококковых энтеротоксинов на иммунную систему человека делают их потенциальным объектом для создания медицинских препаратов различного назначения — иммуностимуляторов, усилителей иммунного ответа при вакцинации, компонентов противоопухолевых лекарств.

В настоящее время стафилококковые энтеротоксины получают, в основном, из культур S.aureus. Данный микроорганизм одновременно продуцирует большое количество различных токсинов, поэтому получение их индивидуальных препаратов со степенью очистки, допускающей медицинское применение, связано со значительными трудностями. Получение рекомбинантных энтеротоксинов в экспрессионной системе Escherichia coli позволяет

упростить наработку и выделение данных белков. Поскольку генно-инженерные методы для E.coli отработаны лучше, чем для любого другого организма, открываются широкие возможности по получению и модификации исходных белков посредством сайт-направленого мутагенеза и созданию комплексных многофункцирнальных препаратов в виде энтеротоксинов, слитых с другими белками.

Нами было показано, что аутентичные сигнальные пептиды ряда стафилококковых энтеротоксинов обеспечивают транспорт этих белков в периплазму при гетерологичной экспрессии в клетках E.coli. Несмотря на сходство пространственной структуры, разные типы стафилококковых энтеротоксинов имеют идентичность аминокислотной последовательности лишь около 30% и различные по структуре сигнальные пептиды. Данное обстоятельство позволило нам использовать полученные рекомбинантные токсины в качестве модели, комбинируя различные лидерные последовательности и зрелые части белков, заведомо способных к переносу в перплазматическое пространство E.coli. Подобный подход мы использовали для ответа на вопросы о том, является ли наличие сигнального пептида достаточным условием для трансмембранной транслокации полипептидов и в какой степени сигнальные последовательности могут быть взаимозаменяемыми.

1.2 Цели и задачи работы

Целью работы являлось:

1. конструирование штаммов-продуцентов E.coli для получения стафилококковых энтеротоксинов А и В;

2. выделение рекомбинантных энтеротоксинов А и В в гомогенной форме;

3. изучение влияния сигнальных пептидов на внутриклеточную локализацию белка на модели энтеротоксинов S.aureus при их гетерологичной экспрессии в E.coli.

В ходе работы ставились следующие задачи:

1. клонировать участки ДНК, кодирующие стафилококковые энтеротоксины А и В и получить экспрессионные плазмиды для E.coli;

2. отработать гетерологичную экспрессию стафилококковых энтеротоксинов А и В в E.coli, изучить их внутриклеточную локализацию;

3. отработать методы очистки энтеротоксинов А и В;

4. провести перекрестный обмен сигнальными пептидами между энтеротоксинами А, В, II из S.aureus, стрептавидином из Slreptomyces avidinii, а также получить формы этих белков с заменой аутентичного сигнала транслокации на сигнальный пептид белка

E.coli TorA, который является субстратом альтернативной Sec-транслоказе транспортной системы — TAT (twin arginine translocation);

5. исследовать внутриклеточную локализацию полученных гибридных белков;

6. изучить влияние ряда аминокислотных замен на функциональную роль сигнального пептида энтеротоксина А.

1.3 Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые получены штаммы E.coli, продуцирующие стафилококковые энтеротоксины А и В в растворимой форме. Показано, что аутентичные сигнальные пептиды данных белков обеспечивают их локализацию в периплазме при гетерологичной экспрессии в E.coli. Отработана высокотехнологичная хроматографическая методика выделения SEA и SEB и получены очищенные препараты данных белков. Сконструирован ряд гибридных полипептидов и исследована их локализация в клетках E.coli, в результате чего показано, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации данных белков.

1.4 Практическая значимость

Практическая значимость данной работы заключается в двух аспектах. Во-первых, полученные штаммы-продуценты SEA и SEB могут быть использованы для наработки препаратов данных белков в значительных количествах без использования в работе патогенных культур S.aureus. При этом открываются широкие возможности по модификации данных токсинов, генетическому и химическому конъюгированию их с другими белками. Это, в свою очередь, позволяет проводить исследования воздействия энтеротоксинов на иммунную систему млекопитающих и их противоопухолевой активности. В перспективе, модифицированные токсины могут найти практическое применение в медицинской практике — данному направлению в настоящее время уделяется большое внимание при конструировании противоопухолевых препаратов нового типа.

биотехнологии. Периплазматическая локализация существенно облегчает выделение и очистку рекомбинантных белков, а также позволяет избежать проблем, связанных с токсичностью продукта для продуцирующих его клеток и, в значительной степени, с образованием телец включения.

1.5 Апробация работы

Диссертационная работа была представлена на заседании секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 25 декабря 2008 г. Результаты настоящей работы докладывались на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, Россия, 2005 г.), на Международной конференции молодых ученых, посвященной 120-ти летию Н. И. Вавилова (Киев, Украина, 2007 г.) и на Российской школе-конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященной 40-летию института ГосНИИгенетика (Москва, Россия, 2008 г.).

1.6 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая две статьи, тезисы докладов и сообщений на конференциях.

1.7 Структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературных источников. Материалы диссертации изложены на -/У страницах машинописного текста и содержат таблиц и 33>

рисунков. Список литературных источников содержит_ссылок на работы зарубежных и

отечественных авторов.

2 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1 Клонирование генов, кодирующих SEA и SEB. Изучение их экспрессии в

E.cfíli

S.aitreus способен продуцировать большие количества энтеротоксинов (SE). При этом, данные белки накапливаются в культуральной жидкости, что существенно облегчает их последующее выделение. Однако, получение стафилококковых токсинов непосредственно из культуры данного микроорганизма имеет и ряд неудобств. В первую очередь, они связаны с необходимостью работы с высокопатогенной бактерией, что требует серьезных средств биологической защиты и связано с реальным риском. Во-вторых, S.aureus одновременно продуцирует разнообразный ассортимент различных токсичных белков, в том числе и несколько типов энтеротоксинов с близкими физико-химическими свойствами. В связи с этим, получение индивидуального высокоочищенного препарата определенного

энтеротоксина, не содержащего примесей других токсинов (например, для медицинского использования), связано со значительными трудностями.

Получение рекомбинантных энтеротоксинов, продуцируемых E.coli, позволяет избежать вышеперечисленных трудностей. Кроме того, данный подход открывает возможность в дальнейшем проводить самый широкий спектр работ по изменению их свойств с помощью сайт-направленного мутагенеза и получению SE, слитых с другими белками. Эти направления в настоящее время активно развиваются, имея целью получение противоопухолевых препаратов нового поколения.

В клетках S.aureus энтеротоксины А и В синтезируются в виде белков-предшественников. Они содержат детерминанту внеклеточной локализации, которая представляет собой N-концевой сигнальный пептид. Ранее было показано (Гулько и др.,2003), что предшественник стафилококкового энтеротоксина Н, имеющий в своем составе сигнальный пептид, при гетерологичной экспрессии в E.coli локализуется в периплазматическом пространстве. Подобным образом ведет себя и стрептавидин из Streptomyces avidinii. В литературе были также косвенные данные о том, что npo-SEB может частично процессироваться в клетках E.coli, однако напрямую его локализация в периплазме не показана. Из вышеприведенного следует, что, как минимум, некоторые сигнальные пептиды грамположительных бактерий обеспечивают транслокацию рекомбинантного про-белка при экспрессии в E.coli.

Компьютерный анализ структуры сигнальных пептидов энтеротоксинов А и В и данные из литературных источников позволили предположить, что при экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в E.coli, они, возможно, будут накапливаться в периплазматическом пространстве данного микроорганизма.

Рисунок 1. Схема строения плазмид pLSEA, pmSEA, pLSEB и pmSEB. Вставка - участок, кодирующий полноразмерные SEA или SEB с сигнальным пептидом (SP), либо зрелые формы данных белков. Pudp - промотор-операторная область гена udp E.coli.

С целью получения штаммов E.coli, продуцирующих рекомбинантные энтеротоксины А и В, а также для экспериментальной проверки возможности транслокации данных белков в периплазму под контролем аутентичных сигнальных пептидов, для каждого из энтеротоксинов получены экспрессионные плазмиды в двух вариантах — кодирующие пробелок и зрелую форму (рис. 1). Для этого проведено клонирование участков ДНК, кодирующих SEA и SEB вместе с их лидерными пептидами, т.е. открытые рамки считывания генов entA и entB, в расчете на транслокацию продукта в периплазму. Одновременно были клонированы фрагменты ДНК, кодирующие зрелые SEA и SEB без сигнальных пептидов (рис. 1). Все клонируемые фрагменты были получены путем ПЦР-амплификации тотальной ДНК S.aureus S6 с использованием специфичных олигонуклеотидов. В качестве реципиентной плазмиды использовалась pUC18Rudp (Вейко и др., 1995).

kDa 1 2а 2Ь За ЗЬ 4а 4Ь 5 6 7

6645.«

35*""*

25^

Рисунок 2. Электрофоретическое разделение в денатурирующем 12.5% ПААГ белковых фракций штамма-продуцента полноразмерного БЕВ (М01655/рЬ8ЕВ)(2), штамма-продуцента зрелого ЭЕВ (М01655/рт8ЕВ)(3) и очищенного препарата 8ЕВ(5-7). Окраска Кумасси 11-250. 1 - маркеры, 2 - М01655/рЬ8ЕВ, 3 - М01655/рт8ЕВ, 4 - контроль (N«31655/ рис 18Яиёр), 5,6,7 - очищенный 8ЕВ (0,5; 1 и 2 мкг, соответственно), а - периплазматическая фракция, Ь - лизат протопластов (все фракции, кроме периплазмы). Полоса, соответствующая БЕВ, выделена стрелкой.

Для определения уровня накопления и локализации рекомбинантных белков полученными плазмидами рЬБЕА, ршЭЕА, рЬЭЕВ и ртЭЕВ (рис. 1) были трансформированы клетки Е.соИ штамма К-12 МС1655. Рост культуры проходил в жидкой среде ЬВ при 37°С в присутствии ампициллина при различной концентрации глюкозы. Из культур штаммов-продуцентов получали периплазматические фракции и анализировали их белковый состав методом денатурирующего электрофореза по Леммли. Оптимальным был признан рост культуры в течение 16-18 часов (ОП«)о~2,4-2,5) в присутствии глюкозы (1 г/л). В результате было установлено, что при продукции рекомбинантного БЕВ в культуре клеток Е.соИ К-12 М01655/рЬ8ЕВ (про-ЭЕВ) продуцируемый белок практически полностью локализуется в периплазматической фракции, в то время как в случае Е.соИ К-12 М01655/рт8ЕВ (зрелая форма), энтеротоксин В в периплазму не переносится (рис. 2). Данный факт подтверждается также результатами иммуноблота с окраской

моноклональными антителами, специфичными к энтеротоксину В. Таким образом, показано сохранение функциональной активности сигнального пептида энтеротоксина В в клетках E.coli и его необходимость для транслокации рекомбинантного SEB в периплазму.

В клетках, трансформированных плазмидой pmSEA, накапливается рекомбинантный белок размером около ЗОкДа (что соответствует размеру зрелого SEA), причем в периплазматической фракции он практически отсутствовал и содержался только в лизате протопластов (фракции, полученной после отделения периплазмы), т.е. наблюдаемая картина соответствовала таковой для SEB с удаленным сигнальным пептидом (рис. 3). При этом содержание периплазматических белков относительно контроля существенно не изменялось. В клетках E.coli штамма К-12 MG1655, трансформировать плазмидой pLSEA, также обнаружилось накопление рекомбинантного белка, но при этом наблюдалась картина, значительно отличающаяся от таковой в случае SEB (рис. 3). Во-первых, SEA накапливался во фракции протопластов и не наблюдался в периплазме. Во-вторых, количество периплазматических белков (как по уровню накопления, так и по разнообразию) существенно превосходило таковое по сравнению с контрольным образцом (клетки E.coli К-12 MG1655, трансформированные плазмидой pUC18Rudp).

М 1 2 3 4 5 б 78

•з С ■■ ^(fe, ^ЯВВГ .....I ц ■■г' тИР»*!

35 Щ0Г

25 '

■ ■■'ЛЖ £ шшЯш ^¡¡Зйи» """ .......

Рисунок 3. Электрофоретическое разделение в денатурирующем 12.5% ПААГ белковых фракций штамма-продуцента полноразмерного про-SEA (MG1655/pLSEA)(l,2), штамма-продуцента про-SEA с измененным сигнальным пептидом (MG1655/pLM-SEA)(3,4) и штамма-продуцента зрелого SEA без сигнального пептида (MG1655/pmSEA)(5,6). Окраска Кумасси R-250. М-маркеры; 1 - MG1655/pLSEA, периплазма, 2 - лизат протопластов; 3 -MG1655/pLM-SEA, периплазма, 4 - лизат протопластов; 5 - MG1655/pSEA, периплазма, 6 -лизат протопластов; 7 - pUC18Rudp (контроль), периплазма, 8 - лизат протопластов. А, С -полноразмерный SEA, не транслоцированный в периплазму, В - процессированный SEA в периплазме, D - SEA без сигнального пептида.

2.2 Исследование влияния на эффективность трансмембранной транслокации

энтеротоксина А первичной структуры его сигнального пептида

Для выяснения причин потери функциональности сигнального пептида энтеротоксина А при его синтезе в клетках E.coli нами был получен ряд форм данного белка с измененной структурой лидерной последовательности. При этом мы исходили из результатов анализа

первичной структуры различных вариантов гена entA и литературных данных о субстратной специфичное™ Lep (сигнальной пептидазы первого типа E.coli).

Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента, содержащегося в полученной нами плазмиде pLSEA (GenBank FJ495182), путем ее сравнения с последовательностями из GenBank, показал, что клонирован один из аллельных вариантов гена entA, кодирующий SEA, который несколько отличается от наиболее распространенной формы (АР009351, табл. 1). В том числе, одна из нуклеотидных замен (G-47-T) приводит к аминокислотной замене в области сигнального пептида (Leu-16-Тгр). Неясна ситуация с заменами в позициях 20 и 22, так как нуклеотидные остатки, находящиеся в них, входят в состав олигонуклеотнда pSEB, использованного для ПЦР, структура которого опирается на последовательность АР009351, как наиболее распространенную. Нуклеотидная замена Т-22-С является незначимой и не приводит к изменению аминокислотной последовательности белка, в то время как С-20-Т ведет к аминокислотной замене Thr-7-Ile.

Таблица 1. Гетерогенность первичной структуры генов entA (SEA) из разных источников. В колонке «последовательность» приведены идентификационные номера базы GenBank.

Последовательность Позиция

20 22 47 133 250 258 333 390 450 685 731

PLSEA (FJ495182) С Т

АР009351 А

DQ530361 Г, G Thr А А А С А

ВХ571856 Т Не С Tip Asp Туг

L22566 G А

EF520720 А

АР009324

ВА000017 А

ВА000033 С Thr т т Leu Ala G Asn G G т G т Asn

ВХ571857

AY827552 G

Таким образом, первичная структура гена энтеротоксина А из разных источников полиморфна в двух позициях участка, кодирующего сигнальный пептид. Ввиду того, что исходно полученная нами форма (Thr7,Trpl6) не обеспечивала накопление рекомбинантного белка в периплазматической фракции клеток, мы получили ряд мутантных вариантов гена entA с измененным сигнальным пептидом для выяснения влияния отдельных мутаций в на процесс транслокации (табл. 2). В результате удалось добиться экспорта SEA в периплазму.

На первом этапе была внесена мутация в положение 16 сигнального пептида SEA. Мы предположили, что объемный ароматический радикал триптофана может препятствовать

процессу транслокации рекомбинантного SEA в периплазму E.coli за счет нарушения межмолекулярных взаимодействий при образовании предтранслокационного комплекса или вторичной структуры сигнального пептида. Для аминокислотных остатков Н-участка сигнального пептида наиболее характерны алифатические боковые группы, как у лейцина, поэтому с помощью сайт-направленного мутагенеза мы произвели замену Тгр на Leu в положении 16 сигнального пептида SEA. В результате была получена конструкция pLM-SEA, содержащая искомую нуклеотидную замену.

Таблица 2. Аминокислотная структура видоизмененных сигнальных пептидов SEA.

Плазмида Структура сигнального пептида Наличие белка в периплазме

pLSEA MKKTAFTLLLFIALTWTTSPLVNG -

pLM-SEA MKKTAFTLLLFIALTLTTSPLVNG +

PLSEA-mut MKKTAFTL LL FIALTWT T S P L AS A +++

pLSEA-2М MKKTAFTLLLFIALTLTTSPLASA +++

pLSEA-vari MKKTAFILLLFIALTWTT S PLVNG +

pLSEA-var2 MKKTAFILLLFIALTLTTSPLVNG +

pLSEA-var3 MKKTAFILLLFIALTWTTSPLASA +++

pLSEA-var4 MKKTAFILLLFIALTLTTSPLASA +++

В клетках E.coli штамма К-12 MG1655, трансформированых плазмидой pLM-SEA, обнаружилось накопление рекомбинантного белка как во фракции протопластов, так и в периплазме, т.е. сигнальный пептид частично восстановил свою функциональную активность. В то же время, SEA с исходным вариантом лидерной последовательности в периплазме не наблюдался (рис. 3). Электрофоретическая подвижность SEA в периплазматической фракции несколько превосходила таковую в лизате протопластов, и соответствовала уровню зрелой формы, что может говорить об отщеплении сигнального пептида в процессе трансмембранного переноса. Аутентичность белков в обеих фракциях подтверждена методом MALDI-TOF.

Более детальное фракционирование клеток E.coli показало, что большая часть SEA в обоих вариантах ассоциирована с мембраной фракцией (рис. 4, треки 1 и 2). Одной из возможных причин этого может являться неспособность сигнальной пептидазы отщепить зрелую часть белка после его транслокации. Сайт протеолиза сигнальной пептидазой, входящий в состав лидерного пептида SEA, имеет последовательность Val-Asn-Gly, и не обнаруживает прямого сходства с каноническим А1а-Х-А1а. Для проверки выдвинутого предположения мы провели методом сайт-направленного мутагенеза замену мотива Val-Asn-

Gly на Ala-Ser-Ala.

В дополнение к вышеперечисленным конструкциям, для выяснения влияния полиморфного остатка в положении 7 сигнального пептида SEA, с помощью сайт-направленного мутагенеза были получены плазмиды pLSEA vari-4 (табл. 2), в которых, введена мутация, ведущая к аминокислотной замене Thr-7-Ile.

35 —

Рисунок 4. Электрофоретическое разделение в денатурирующем 12.5% ПААГ периплазматической (А) и мембранной (В) фракций штаммов-продуцентов энтеротоксина А с различными формами сигнальных пептидов (табл. 2). 1 — исходный вариант (MG1655/pLSEA); 2 - замена Trp-16-Leu ( MG1655/pLM-SEA); 3 - замена сайта протеолиза Val-Asn-Gly на Ala-Ser-Ala (MG1655/pLSEA-mut); 4 — совместная замена Trp-16-Leu и Val-Asn-Gly на Ala-Ser-Ala (MG 1655/pLSEA-2M); 5 — гибридный белок, зрелая часть SEA слитая с сигнальным пептидом SEB (MG1655/pLB-SEA, п. 2.4); 6 — SEA без сигнального пептида (MG1655/praSEA); 7 - контроль (MG1655/pUC18Rudp). Видно, что периплазматическая фракция в треках 1 и 2 существенно обогащена белками относительно контроля.

В клетках E.coli штамма К-12 MG1655, трансформированных плазмидами pLM-SEA, pLSEA-varl и pLSEA-var2 (табл. 2) обнаружилось накопление рекомбинантного белка как в мембранной фракции, так и в периплазме, т.е. сигнальный пептид частично восстановил свою функциональную активность (рис. 5). При этом, большая часть рекомбинантного белка оставалась связанной с мембранами. На рисунке 4 (трек 2) приведен результат электрофоретического разделения периплазматической и мембранной фракций клеток E.coli, трансформированных плазмидами pLM-SEA. Основная часть белка сосредоточена в мембранной фракции, и лишь незначительное количество обнаруживается во фракции периплазмы. Данные, полученные для вариантов pLSEA-varl и pLSEA-var2 идентичны таковым для pLM-SEA и в работе не приведены. Возможно, что наличие белка в периплазматической фракции в данном случае объясняется неполным фракционированием и частичным загрязнением проб остатками мембран. Однако, по всей видимости, для вариантов SEA Leu 16, Не7 и Ile7+Leul6 имеет место специфичный транспорт части белка в

периплазму. Данный вывод сделан на основании серии повторных экспериментов, в которых сравнивались картины распределения периплазматических белков клеток E.coli, трансформированных плазмидами pLM-SEA, pLSEA-varl, pLSEA-var2 и pLSEA (рис. 5). В первых трех случаях отчетливо наблюдалась полоса, соответствующая целевому полипептиду, отсутствующая для исходного варианта SEA. Против предположения о том, что мутантные формы белка легче диссоциируют с мембраной, свидетельствует большая электрофоретическая подвижность SEA в периплазматической фракции по сравнению с мембранной, что говорит о процессинге сигнального пептида (рис. 3)

Характер накопления рекомбинантного белка в клетках E.coli штамма К-12 MG1655, трансформированных плазмидами pLSEA-mut, pLSEA-2M, pLSEA-var3 и pLSEA-var4, которые кодируют npo-SEA с измененным сайтом протеолиза сигнальной пептидазы, значительно отличался от описанных ранее вариантов. Количество SEA в периплазматической фракции у данных культур бактерий было радикально выше, чем в случае вариантов с аминокислотными заменами в положении 7 и 16, и нативным сайтом протеолиза Val-Asn-Gly (рис 5). При этом, количество рекомбинантного белка в мембранной фракции для всех исследованных форм оказалось сходным. В то же время, вариант зрелого энтеротоксина А, слитого с сигнальным пептидом SEB (см. ниже), в мембранной фракции не наблюдался (рис. 4), что, по всей видимости, свидетельствует о более полном процессинге данной формы белка.

kDa М 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рисунок 5. Электрофоретическое разделение в денатурирующем 12.5% ПААГ периплазматической фракции штаммов-продуцентов энтеротоксина А с различными формами сигнальных пептидов (табл. 2). 1 - М01655/рЬ8ЕА; 2 - М01655/рЕМ-8ЕА; 3 -1УЮ1655/рЕ8ЕА-тШ; 4 - М01655/рЬ8ЕА-2М; 5 - М01655/рЕ8ЕА-уаг1; 6- М01655/рЬ8ЕА-уаг2; 7 - М01655/рЕ8ЕА-уагЗ; 8 - М01655/р1.8ЕА-уаг4; 9 - контроль (М01655/риС18Кис1р).

Вышеприведенные факты, связанные с трансмембранной транслокацией энтеротоксина А с различными вариантами сигнального пептида, могут быть объяснены исходя из следующей модели (рис. 6). По современным представлениям, секретируемый полипептид в процессе синтеза связывается с шапероном БесВ, вслед за этим полученный комплекс взаимодействует с моторным белком БесА. В результате последующего взаимодействия с белок-проводящим

каналом SecYEG, сигнальный пептид образует трансмембранный сегмент с N-концом, направленным в цитоплазму, а зрелая часть белка пошагово выпетливается в периплазму за счет действия SecA. Таким образом, транслоцированный полипептид оказывается заякоренным в мембране посредством своей лидерной последовательности. Для его высвобождения необходимо, чтобы сигнальная пептидаза произвела гидролиз в сайте, расположенном в С-участке сигнального пептида. В случае, если сигнальная пептидаза не способна произвести расщепление, транслоцированный белок остается связанным с мембраной. Подобный эффект описан в литературе для различных белков (Dalbey et al,1997), и, по всей видимости, обуславливает мембраноассоциированный статус SEA с исходной структурой сигнального пептида.

Д SPase SecYEG

сайт протеолиза

ПстЯИ mmmmmmi дщР™® ...............................

зрелый белок

SecB

Рисунок 6. Образование мембраносвязанной формы транслоцируемых полипептидов. А — синтезируемый полипептид взаимодействует с SecB, а затем — с SecA; В - SecA направляет полученный комплекс в белокпроводящий канал SecYEG и проталкивает полипептид через пору за счет гидролиза АТФ, при этом сигнальный пептид внедряется в мембрану; С — после окончания транслокации полипептид оказывается заякоренным в мембране за счет сигнального пептида; D - для высвобождения белка в периплазму сигнальная пептидаза должна произвести отщепление сигнального пептида. В случае, если сигнальная пептидаза не отщепляет сигнальный пептид, транслоцированный белок остается связанным с мембраной (стадия С).

Однако, приведенные соображения не объясняют влияния на накопление SEA в периплазме при наличии аминокислотных замен Thr-7-Ile и Trp-16-Leu. Сигнальные пептидазы первого типа, в том числе и Lep E.coli, являются трансмембранными белками, у

которых каталитический домен экспонирован в периплазматическое пространство. По литературным данным, сигнальный пептид, образуя трансмембранный сегмент (TMS), приобретает спиральную конформацию. При этом, длина конечной структуры влияет на эффективность процессинга белка сигнальной пептидазой. Таким образом, взаимодействие фермента с транслоцированным полипептидом происходит в двумерной системе координат, задаваемой поверхностью мембраны. Для эффективного катализа, по-видимому, необходимо не только наличие определенного мотива из трех аминокислотных остатков в составе сигнального пептида, но и его стерическая доступность, определяемая, в том числе, и расстоянием до поверхности мембраны. Аминокислотные замены в TMS, образованном сигнальным пептидом, могут вести к изменению его конформации и смещению сайта протеолиза относительно поверхности мембраны. Так как положение активного центра сигнальной пептидазы в определенных пределах фиксировано, изменение геометрии TMS способно привести к ослаблению взаимодействия фермента и расщепляемого полипептида.

Таким образом, можно предположить, что в исследуемой системе на эффективность работы сигнальной пептидазы влияют, как минимум, два фактора. Первый из них — степень сродства фермента к субстрату. По-видимому, Lep E.coli эффективнее взаимодействует с мотивом Ala-Ser-Ala, чем с Val-Asn-Gly. Второй — стерическая доступность сайта протеолиза, определяемая конформацией трансмембранного сегмента сигнального пептида. Если данные предположения верны, то первый фактор играет более значительную роль. Об этом свидетельствует как его большее влияние на уровень накопления энтеротоксина А в периплазме, так и отсутствие заметной коррреляции в количестве рекомбинантного белка, имеющего мотив Ala-Ser-Ala, и аминокислотами заменами в положении 7 и 16 сигнального пептида.

2.3 Хроматографическая очистка рекомбинантных SEB и SEA

В работе (Schantz et al, 1965) описан трехстадийный метод выделения SEB из культуральной жидкости S.aureus путем сорбции белка с помощью катионообменника Ambrlite CG-50, последующей хроматографии на том же носителе и катионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе. При очистке SEB из периплазматической фракции E.coli путем хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе, без применения начальной очистки с помощью CG-50, нам удалось получить препарат, сильно обогащенный SEB относительно других белков. При этом, подбор условий проведения хроматографии не позволил добиться отделения ряда мажорных белковых примесей. В результате, для получения индивидуального препарата SEB мы использовали предварительную экспресс-

хроматографию с использованием Fractogel® TSK DEAE-650M (Merck) и последующую хроматографию на карбоксиметилсефарозе.

Для этого полученную из ночной культуры клеток E.coli К-12 MG1655, трансформированных плазмидой pLSEB, периплазматическую фракцию переводили в 50мМ TrisCl (рН8,0) путем ультрафильтрации. После этого полученный препарат наносили на хроматографическую колонку с сорбентом Fractogel® TSK DEAE-650M (Merck). В результате было установлено, что в данных условиях SEB, в отличие от большинства других белков периплазмы, не связывается с сорбентом, что позволило проводить быструю предварительную очистку рекомбинантного белка. Собранную фракцию, содержащую SEB, с помощью ультрафильтрации переводили в ЮмМ фосфатный буфер (рН6,2), после чего наносили на хроматографическую колонку с карбоксиметилсефарозой (CM-Sepharose CL-6B, Pharmacia). В этих условиях рекомбинантный белок количественно связывался с сорбентом. Колонку промывали фосфатным буфером с градиентом концентрации фосфата от 10 до 50мМ при постоянном значении рН (6,2). Элюцию связавшегося с сорбентом энтеротоксина В проводили фосфатным буфером с одновременным градиентом концентрации фосфата от 50 до 150мМ и рН от 6,2 до 6,8. SEB сходил с колонки одним симметричным пиком при рН около 6,5. При электрофоретическом анализе полученной фракции с окраской Кумасси R-250 посторонних белковых примесей не наблюдалось (рис. 2, треки 5-7).

По данным спектрофотометрического измерения (коэффициент экстинкции при длине волны 277нм E1%ial=14,0-14,4 ), выход энтеротоксина В составил около 10мг на литр бактериальной культуры.

Несмотря на достаточно высокую технологичность процесса выделения SEB, описанного в предыдущем параграфе, он является все же весьма трудоемким и включает пять стадий: получение периплазматической фракции, две ультрафильтрации и две хроматографии. Введение в молекулу энтеротоксина концевого гексагистидинового участка позволяет выполнить очистку в две стадии: получение периплазмы и хроматография на №2+-агорозном сорбенте. Исходя из этого, нами была получена форма SEB с шестью остатками гистидина на С-конце. Последующее хроматографическая очистка рекомбинантного белка подтвердила удобство и практичность данного подхода по сравнению с ионообменной хроматографией. В связи с этим, он был использован также и для выделения энтеротоксина А из периплазматической фракции штамма-продуцента E.coli. При конструировании штамма-продуцента энтеротоксина А была выбрана форма данного белка, в которой нативный сайт протеолиза сигнальной пептидазой Val-Asn-Gly заменен на мотив Ala-Ser-Ala. Это обусловлено тем, что исходный вариант SEA при экспрессии в E.coli ассоциирован с

мембранной фракцией, что значительно усложняет процесс выделения рекомбинантного белка. Кроме того, уровень накопления мутантной формы SEA в клетках Е.соИ существенно выше и в результате получается зрелая форма белка с отщепленным сигнальным пептидом.

Полученную из ночной культуры клеток Е. coli К.-12 MG1655, трансформированных соответствующей плазмидой (pLSEA(H) или pLSEB(H)), периплазматическую фракцию осаждали путем добавления сульфата аммнония, центрифугировали и растворяли в буфере для нанесения (25мМ Na2HP04; 0,5М NaCl; ЮмМ имидазол; рН8,0).

кРа М 1 2 3 4 5 6

66«Ь> ■ Хуг

45 «Я

-¡.ощ

18ч*

Рисунок 7. Электрофорез в денатурирующем 12.5% ПААГ белковых фракций, полученных в результате разделения периплазматической фракции культуры Е.соИ М01655/рЬ5ЕВ(Н) на колонке с Мг+-агарозой. Окраска Кумасси Я-250. М — маркеры молекулярной массы; 1 — исходный образец, нанесенный на колонку; 2 — фракция белков, не связавшихся с сорбентом; 3,4 — концентрированые фракции, сошедшие с колонки при пропускании отмывочного буфера в начале и в конце промывки; 5,6,7 — фракция, полученная при промывке колонки элюирующим буфером, нанесено около 1, 3 и 5 мкг БЕВ, соответственно.

М 1 2 3 4 5 6

кОа

116 -

66 — —.

45—»*

35-«*

25-»

18««к

14*- ,,__

Рисунок 8. Электрофорез в денатурирующем 12.5% ПААГ белковых фракций, полученных в результате разделения периплазматической фракции культуры Е.соИ MG1655/pLSEA(H) на колонке с Ni2+-arap030ñ. Окраска Кумасси R-250. М — маркеры молекулярной массы; 1 — исходный образец, нанесенный на колонку; 2 — фракция белков, не связавшихся с сорбентом; 3,4,5,6 — фракция, полученная при промывке колонки элюирующим буфером, нанесено около 0,5 (3), 2 (4), 5 (5) и 10 (6) мкг SEA.

Хроматографическое выделение SEB проводили на колонке с №2+-агарозой фирмы «Qiagen». Во фракции белков, не связавшихся с сорбентом, рекомбинантные белки не

наблюдались. После нанесения образца, колонку последовательно промывали буфером для нанесения и отмывочным буфером (25мМ NaiHPO*; 0,5М NaCl; 20мМ имидазол; рН8,0). При элюции буфером, содержащим ЗООмМ имидазола, целевой белок сходил с колонки асимметричным пиком, более крутым с восходящей стороны и плавно спадающим с нисходящей. Электрофоретический анализ хроматографических фракций показал, что выделяемые энтеротоксины количественно связываются с сорбентом. Незначительное SEB сошло при пропускании отмывочного буфера. В конечных образцах SEA (рис. 8) и SEB (рис. 7) являлись основными компонентами, мажорных белковых примесей визуально не наблюдалось.

По данным спектрофотометрического измерения (коэффициент экстинкции при длине волны 277 нм Е1%км=14,0-14,4), выход энтеротоксина В составил около 30мг на литр бактериальной культуры, а энтеротоксина А — приблизительно 10мг на литр.

Для проверки митогенной активности рекомбинантного SEB, его образец был передан в лабораторию иммунологии ГосНИИгенетика (зав. лаб. — к.м.н. B.JI. Юрин). Способность к митогенному активирующему действию энтеротоксинов исследовалась в тестах пролиферации Т-клеток in vitro по включению в ДНК радиоактивно-меченного тимидина. Было показано, что рекомбинантный SEB сохраняет свою нормальную митогенную активность.

2.4 Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбипантных белков в периплазматическое пространство E.coti на модели энтеротоксинов нз S. aureus

Накопление рекомбинаитных белков в периплазматической фракции E.coli дает ряд преимуществ по сравнению с цитоплазматической локализацией продукта. Они заключаются в облегчении выделения рекомбинаитных полипептидов, снижении риска образования телец включения, а также протеолиза целевого белка. По этим обстоятельствам, вывод продуктов гетерологичной экспрессии генов из цитоплазмы является одним из актуальных направлений современной биотехнологии. В тоже время, успехи в данной области невелики. Несмотря на многочисленные попытки, пока не удалось создать универсальной системы экспрессии у бактерий, обеспечивающей перенос разнообразных белков через плазматическую мембрану. Более того, в настоящее время не имеется никакой возможности предсказать заранее, как поведет себя конкретный полипептид, будучи слит с определенным сигнальным пептидом.

Данные обстоятельства навели нас на мысль о создании модельной системы на основе SE для изучения взаимного влияния отдельных элементов полипептидов на процесс

транслокации. При построении модельной системы мы руководствовались несколькими соображениями. Во-первых, необходимо было строго ограничить количество используемых объектов исследования для возможности последующей интерпретации результатов. Использование большого количества белков различной природы сильно затрудняет учет вклада зрелой части белка. Из этого следует, что все модельные полипептиды должны иметь общую природу и сходное строение. При этом, они должны различаться в той степени, чтобы эти различия явно проявлялись в ходе эксперимента, то есть необходимы действительно разные белки, а не формы одного из них. Во-вторых, модельные полипептиды должны заведомо обладать способностью к трансмембранной транслокации в сочетании как минимум с одним из сигнальных пептидов (например, аутентичным, как у SEH, SEB и SAV). В противном случае велика вероятность неудачи серии экспериментов ввиду полной невозможности транспорта определенного полипептида. В-третьих, со всеми выбранными объектами следует провести один и тот же набор стандартных манипуляций, с минимальными различиями от белка к белку. Это необходимо для минимизации посторонних факторов, трудно поддающихся учету. Подразумевается использование одной реципиентной плазмиды, общей схемы клонирования, одинаковых условий культивирования бактериальной культуры и т.п.

На наш взгляд, вышеприведенным критериям в значительной степени удовлетворяет система, включающая SEA, SEB, SEH и SAV и их сигнальные пептиды. Как было показано выше, сигнальный пептид энтеротоксина В сохраняет свою функциональную активность в качестве маркера локализации в клетках Е.соИ, по крайней мере в составе исходного полипептида. Данное утверждение верно и для таких белков, как SEH и SAV. В тоже время, SEA при гетерологичной экспрессии в Е.соН в периплазму не экспортируется, хотя S.aureus секретирует его во внешнюю среду. SE обладают общим планом строения, но при этом существенно различаются в деталях. SAV, как и SE, приспособлен для секреции, но при этом не имеет ничего общего с энтеротоксинами по строению молекулы, и его можно использовать для проверки значимости различий между SE при их взаимодействии с системой трансмембранного транспорта.

В данной работе рекомбинантные SEA, SEB, SEH и SAV, экспрессируемые в E.coli, были использованы в качестве модельных объектов в попытке ответить на вопрос о том, является ли наличие сигнального пептида достаточным условием для трансмембранной транслокации полипептидов и в какой степени сигнальные последовательности могут быть взаимозаменяемыми. В ходе работы был проведен перекрестный обмен сигнальными пептидами между SEA, SEH, SEB и SAV, а также получили формы этих белков с заменой

аутентичного сигнала транслокации на лидерный пептид белка Е.соН ТогА (субстрата ТАТ-системы транслокации, альтернативной Бес-системе). Необходимым условием проведения эксперимента являлось использование единого реципиентного штамма с нормально функционирующей системой трансмембранной транслокации белков. В качестве такового мы выбрали Е.соИ К-12 М01655. Для минимизации воздействия побочных факторов все плазмиды конструировались по единой схеме на основе вектора риС18Яис1р.

Таблица 3. Плазмиды, сконструированные для изучении транспорта гибридных белков в периплазму Е.соИ. *-(Ц - про-белок с сигнальным пептидом; **(М) - зрелый белок без сигнального пептида. 8ЕА(1Л6) и 8ЕА(А8А) - формы сигнального пептида, содержащие остаток Ьеи16 и остатки А1а225ег23А1а24, соответственно. __

№ Название Сигнальный пептид Полипептид № Название Сигнальный пептид Полипептид

1 pLSEA - SEA(L)* 21 pLA-SEH SEA SEH

2 pLM-SEA SEA(L16) SEA 22 pLA-SAV SEA SAV

3 pLSEA-mut SEA(ASA) SEA 23 pLAM-SEB SEA(L16) SEB

4 pmSEA - SEA(M)" 24 pLAM-SEH SEA(L16) SEH

5 pLSEB - SEB(L)* 25 pLAM-SAV SEA(L16) SAV

6 pmSEB - SEB(M)** 26 pLASA-SEB SEA(ASA) SEB

7 pLSEH - SEH(L)* 27 pLASA-SEH SEA(ASA) SEH

8 pmSEH - SEH(M)** 28 pLASA-SAV SEA(ASA) SAV

9 pSAV27.1 - SAV(L)* 29 pLB-SEA SEB SEA

10 pLTorA - TorA(L)* 30 pLB-SEB SEB SEB

11 pmTorA - TorA(M)** 31 pLB-SEH SEB SEH

12 pURLA SEA нет 32 pLB-SAV SEB SAV

13 pURLAM SEA(L16) нет 33 pLH-SEA SEH SEA

14 pURLA-ASA SEA(ASA) нет 34 pLH-SEB SEH SEB

15 pURLB SEB нет 35 pLH-SAV SEH SAV

16 pURLH SEH нет 36 pLT-SEA TorA SEA

17 pURLV SAV нет 37 pLT-SEB TorA SEB

18 pURLT TorA нет 38 pLT-SEH TorA SEH

19 pLA-SEA SEA SEA 39 pLT-SAV TorA SAV

20 pLA-SEB SEA SEB

Конструирование проводилось в два этапа. На первом были получены конструкции, несущие сигнальные пептиды SEA (в трех вариантах), SEB, SEH, SAV и ТогА. На втором этапе в полученные конструкции клонированы участки ДНК, кодирующие зрелые части выбранных белков. В итоге получены плазмиды, кодирующие SEA, SEB, SEH и SAV, слитые с различными сигнальными пептидами (рис. 9, табл. 3).

Рисунок 9. А - схема участка плазмид pURLA, pURLAM, pURLV, pURLT, содержащего фрагмент ДНК, кодирующий соответствующий сигнальный пептид. В - схема участка плазмид, кодирующих рекомбинантные белки, слитые с сигнальным пептидом. Pudp -промотор-операторная область гена уридинфосфорилазы E.coli.

С целью изучения накопления рекомбинантных белков и их внутриклеточной локализации, полученными плазмидами (табл. 3, № 19-39) были трансформированны клетки E.coli К-12 MG1655. Из клеток получали периплазматическую фракцию и совместно с лизатом протопластов анализировали методом денатурирующего электрофореза по Леммли. В результате было установлено, что часть химерных белков переносится в периплазму, а остальные не обнаруживаются ни в одной из клеточных фракций (табл. 4).

Таблица 4. Накопление рекомбинантных белков в культурах клеток E.coli К-12 MG1655. "+"- белок накапливается в периплазме, "-" - белок в периплазматической фракции не наблюдается, (о) - белок наблюдается во фракции протопластов. Затенены формы с аутентичным сигнальным пептидом.

Сигнальный пептид Белок

SEA SEB SEH SAV

SEA "(О) - - -

SEA (LI 6) + (О) - - -

SEA(ASA) + + + +

SEB + + + -

SEH - + + +

SAV + + + +

TorA + + + -

Из данных, приведенных в таблице 4, можно заключить, что перенос в периплазму всех четырех выбранных белков обеспечивают сигнальные пептиды стрептавидина и

энтеротоксина А в форме Ala22Ser23AIa24. При этом, исходные формы SEB, SEH и SAV с аутентичными сигнальными пептидами транслоцируются через плазматическую мембрану E.coli при гетерологичпой экспрессии, a SEA - нет (п. 2.2). Из белков, имеющих в своем составе сигнальный пептид SEB, только стрептавидин не обнаруживался в периплазме. Сигнальный пептид SEH не обеспечивает накопления в периплазме слитого с ним энтеротоксина А, а лидер ТогА - стрептавидина. Ни один из белков, слитых с сигнальным пептидом SEA в исходном варианте и в форме Leu 16 не обнаруживается ни в одной из фракций клеток, за исключением самого SEA.

Если исключить из рассмотрения формы, содержащие сигнальный пептид SEA в исходном варианте и в форме Leu 16, которые не обеспечивают эффективного переноса аутентичного полипептида, можно сделать вывод о том, что большинство полученных вариантов белков (17 из 20) накапливаются в периплазме. Если исключить также формы с аутентичными сигнальными пептидами, то это соотношение составит 14 из 17. SEB и SEH обнаруживаются в периплазме, будучи слиты с любыми из проверенных сигнальных пептидов (за вышеупомянутыми исключениями). SAV не обнаруживается в сочетании с лидерными последовательностями SEB и ТогА. SEA, не наблюдаемый в периплазме с аутентичным сигнальным пептидом, обнаруживается там, будучи с слит с сигнальными пептидами SEB, SAV, ТогА, но не SEH.

В полученных конструкциях на стыке сигнального пептида и последовательности зрелого белка присутствуют сайты рестрикции BglII (конструкции на основе pURLH) или BamHI (все остальные), что соответствует наличию в синтезируемом полипептиде двух дополнительных аминокислотных остатков Arg - Ser и Gly - Ser, соответственно. Сравнение картины электрофоретического разделения периплазматической фракции и фракции лизата протопластов культур клеток E.coli K-12MG1655, трансформированых плазмидами pLSEA и pLA-SEA, а также pLSEB и pLB-SEB не выявило каких-либо отличий. Это может свидетельствовать о несущественности влияния дополнительных аминокислотных остатков на функцию транслокации в данных случаях.

Следует отметить, что в случае, когда гибридные белки не наблюдались в периплазме, их не удавалось обнаружить и в других клеточных фракциях. При этом, сами энтеротоксины и SAV стабильны в цитоплазме в случае, если в клетках E.coli синтезируются их зрелые формы. Из этого можно заключить, что сигнальный пептид в составе белка служит дестабилизирующим фактором.

Из представленных результатов можно сделать вывод о том, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной

транслокации. В то же время, результаты данной работы и литературные источники не дают оснований предполагать наличие неких дискретных элементов первичной структуры, отвечающих за транслокацию, в составе зрелого белка. По-видимому, для успешного переноса белка через плазматическую мембрану E.coli, необходима некая совместимость белка и сигнального пептида, хотя ее природа остается неясной. С одной стороны, лидеры SEB и SEH обеспечивают транслокацию аутентичных белков, а также части других полипептидов, будучи слиты с ними (табл. 4) при синтезе в клетках E.coli, т.е. имеют все необходимые элементы для выполнения своей функции в комплексе с Sec-транслоказой данного организма. С другой стороны, слияние рассматриваемых сигнальных пептидов с некоторыми другими полипептидами, не приводит к накоплению рекомбинантных белков в периплазме. Так, SEA не обнаруживается в форме с лидером SEH, a SAV - с лидером SEB. В тоже время, SEA и SAV накапливаются в периплазме E.coli, если синтезируются в формах с рядом других сигнальных пептидов, что говорит об отсутствии в составе зрелой части данных белков элементов, препятствующих транслокации (как на уровне первичной структуры, так и структур более высокого порядка). Из всего вышесказанного можно заключить, что система «сигнальный пептид — полипептид» не является аддитивной. Объединение в одной молекуле частей, функциональных в других комбинациях, не всегда ведет к транслокационной компетентности новой формы. Таким образом, существуют дополнительные факторы, влияющие на транспорт, которые обусловлены суперпозицией элементов получаемого гибридного полипептида.

Существуют литературные данные (Kajava et al, 2000), свидетельствующие о влиянии начального участка зрелой части белка на эффективность его трансмембранного транспорта, в частности, показано снижение уровня транслокации щелочной фосфатазы в клетках E.coli вследствие увеличения суммарного положительного заряда в данной области полипептида. Несмотря на то, что среди использованных в данной работе модельных белков проследить подобной закономерности не удается, на основании наших данных можно предположить, что в определенных комбинациях полипептидов и сигнальных пептидов возможна супрессия неблагоприятных структурных факторов, а в других — нет. Другое возможное объяснение феномена совместимости может заключаться во взаимодействии сигнального пептида и зрелой части белка с образованием элементов вторичной структуры, препятствующих корректному взаимодействию с компонентами транслоказы.

Как уже отмечалось, во всех случаях в ходе выполнения данной работы, когда нам не удавалось обнаружить рекомбинантный химерный белок в периплазме, он не обнаруживался и в других клеточных фракциях (за исключением полноразмерного SEA дикого типа). Так как

у грамотрицательных бактерий не наблюдается ареста трансляции, можно предположить, что вновь синтезируемый полипептид, при невозможности транслоцироваться, не может приобрести нативную третичную структуру и подвергается протеолизу. В тоже время, исследованные полипептиды (зрелые SEA, SEH, SEB и SAV) устойчивы в цитоплазме E.coli в случае, когда клетка синтезирует их зрелые формы без сигнального пептида. Возможно, данный эффект обусловлен связыванием растущего полипептида, имеющего в своем составе лидерную последовательность, с компонентами транслоказы, в том числе с АТФазой SecA и шапероном SecB.

По современным литературным данным, в процессе адресации полипептида в трансмембранный канал задействовано большое количество множественных межмолекулярных контактов. В процессе синтеза с полипептидом связывается шаперон SecB, не позволяющий ему принять нативную конформацию. На следующем этапе важное значение имеет SecA, который помимо АТФ-зависимого перемещения транслоцируемой полипептидной цепи через трансмембранный канал, играет центральную роль в образовании предтранслокационного комплекса. SecA способен специфично взаимодействовать с большим количеством других молекул. Связываясь с главным белком ядра транслоказы — SecY, образующим канал в мембране, он изменяет конформацию. Вследствие этого SecA приобретает сродство к комплексу SecB и полипептида, одновременно взаимодействуя с шапероном, сигнальным пептидом и остовом зрелой части белка. Таким образом, существует три критические области взаимодействия комплекса полипептид-SecB с SecA. Мы предположили, что важную роль для успешной транслокации полипептида через мембрану играет, помимо них, структура перехода от сигнального пептида к зрелой части белка. По современным представлениям, следствием образования предтранслокационного комплекса является дальнейшее изменение конформации SecA. В результате, сигнальный пептид проникает между двумя лабильными трансмембранными сегментами SecY в липидный слой мембраны, a SecA, за счет гидролиза АТФ, снова изменяет свою конформацию и высвобождается в цитоплазму. Нарушение пространственной конфигурации комплекса вследствие некорректной структуры стыка сигнального пептида и зрелой части белка может привести к невозможности проникновения сигнального пептида в мембрану или его преждевременной диссоциации с SecA. В этом случае транслоцируемый полипептид остается в цитоплазме, связанный с компонентами транслоказы. Шаперон SecB не дает ему свернуться, и полипептид, скорее всего, будет расщеплен протеиназами.

Выдвинутое предположение, основанное на результатах, представленных в данной работе и литературных данных, носит во многом гипотетический характер. Однако, предложенный

механизм позволяет обозначить конкретные направления дальнейшего развития исследований в данной области. В их числе — изучение влияния на процесс транслокации структуры перехода от сигнального пептида к зрелой части и следующего за ним участка полипептидной цепи.

3 ВЫВОДЫ

1. Получены штаммы-продуценты на основе E.coli, синтезирующие рекомбинантные энтеротоксины А и В Staphylococcus aureus. Впервые достоверно показано, что в культуре клеток E.coli, продуцирующих про-энтеротоксин В, его зрелая форма накапливается в периплазматической фракции клеток. При продукции клетками E.coli зрелой формы энтеротоксина В он обнаруживается в цитоплазматической фракции. Показано, что в культуре E.coli, продуцирующих про-энтеротоксин А, рекомбинантный белок в периплазме не накапливается, а ассоциирован с мембранной фракцией клеток.

2. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены варианты энтеротоксина А с измененным сигнальным пептидом, которые приобрели способность к транслокации в периплазматическое пространство E.coli. Показано, что для внутриклеточной локализации данного белка существенную роль играет структура С-участка его сигнального пептида.

3. Отработаны методики очистки зрелых энтеротоксинов А и В. Белки выделены в гомогенной форме.

4. Исследовано взаимное влияние сигнального пептида и зрелой части белка на эффективность процесса трансмембранной транслокации. Показано, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации белков посредством Sec-системы. Для трансмембранного переноса белка дополнительно требуется совместимость его сигнального пептида и зрелой части.

4 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Lep - сигнальная пептидаза первого типа E.coli;

SAV- стрептавидин Streptomyces avidinii;

SE - энтеротоксины Staphylococcus aureus;

SEA, SEB, SEH - стафилококковые энтеротоксины А, В, H;

TMS - трансмембранный сегмент полипептидной цепи.

5 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Манувера В.А., Мордкович Н.Н., Гулько Л.Б., Окорокова Н.А., Вейко В.П., Дебабов В.Г. Разработка опухоль-адресованных препаратов для иммунотерапии рака. IV. Клонирование гена про-энтеротоксиа В (entB) из Staphylococcus aureus, исследование его экспрессии и секреции в Escherichia coli. Метод очистки рекомбинантного белка. Биотехнология, 2008, №3, с.27-33.

2. Манувера В.А., Мордкович Н.Н., Гулько Л.Б., Окорокова Н.А., Вейко В.П., Дебабов В.Г. Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков в периплазматическое пространство Escherichia coli на модели энтеротоксинов из Staphylococcus aureus. Биотехнология, 2008, №6, с.3-14.

Материалы конференций:

1. Манувера В.А. Гетерологичная экспрессия и получение чистого препарата стафилококкового энтеротоксина В. Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», Москва, 2005, с.193.

2. Manuvera V.A., Cheremnyh A.M., Syrkina M.S., Yurin V.L., Veiko V.P. The development of anti-tumor agent based on staphylococcal enterotoxin В and anti-mucin monoclonal miniantibody. Conference for young scientists, phD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120'1' anniversary of M.I.Vavilov, Abstract book. 2007, Kyiv, Ukraine, p. 175.

3. Манувера В.А., Вейко В.П. Значение сигнальных пептидов для транспорта в периплазматическое пространство E.coli рекомбинантных энтеротоксинов из Staphylococcus aureus. Материалы международной школы конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 40-летию Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов, 2008, Москва, с.62.

Заказ № 82/02/09 Подписано в печать 16.02.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 ^O^/'j www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Манувера, Валентин Александрович

1 Введение.

2 Трансмембранный транспорт белков у бактерий.

2.1 Истинная секреция у грамотрицательных бактерий.

2.2 Бес-система трансмембранной транслокации белков у бактерий.

2.2.1 Адресация синтезируемых полипептидов в транслоказу.

2.2.1.1 Структура сигнальной последовательности субстратов Secтранслоказы.

2.2.1.2 Адресация при участии SRP.

2.2.1.3 Адресация при участии шаперона SecB.

2.2.1.4 Взаимоотношение SRP- и SecB/SecA-зависимых способов адресации.

2.2.2 Структура и функции See-транслоказы.

2.2.2.1 Стехиометрия компонентов транслоказы.

2.2.2.2 SecA— молекулярный мотор транслоказы.

2.2.2.3 Трансмембранный комплекс SecYEG — кор транслоказы.

2.2.2.4 Роль Sec-транслоказы в биогенезе мембранных белков.

2.2.2.5 Сигнальные пептидазы первого типа (SPasel).

2.2.2.6 Общая схема функционирования Бес-системы транслокации.

2.2.3 Образование транслоцированными полипептидами нативной конформации в периплазме.

2.3 ТАТ-система трансмембранной транслокации белков у бактерий.

2.3.1 Сигнальные пептиды субстратов ТАТ-системы.

2.3.2 Структурные компоненты ТАТ-системы.

2.3.3 Особенности функционирования ТАТ-системы транслокации.

2.4 Использование трансмембранного транспорта при получении рекомбинантных белков.

3 Энтеротоксины Staphylococcus aureus.

3.1 Структура стафилококковых энтеротоксинов.

3.1.1 Пространственная структура.

3.1.2 Взаимодействие SE с молекулами МНС II.

3.1.3 Связывание с TCR.

3.2 Роль стафилококковых энтеротоксинов в патогенезе.

3.2.1 Стафилококковые пищевые отравления (SFP).

3.2.2 Синдром токсического шока (TSS).

3.3 Медицинское значение энтеротоксинов S.aureus.

3.3.1 Усиление специфичного иммунного ответа.

3.3.2 Терапия опухолей.

3.3.3 Создание вакцин против стафилококковых энтеротоксинов.

3.3.4 Перспективы медицинского применения стафилококковых энтеротоксинов.

4 Материалы и методы.

4.1 Материалы.

4.1.1 Реактивы.

4.1.2 Ферменты.

4.1.3 Бактериальные штаммы и плазмиды.

4.1.4 Микробиологические среды.

4.1.5 Олигонуклеотиды.

4.2 Методы.

4.2.1 Полимеразная цепная реакция.

4.2.2 Выделение хромосомной ДНК S.aureus.

4.2.3 Операции с ДНК.

4.2.4 Электрофоретическое разделение белков.

4.2.5 Иммуноблот.

4.2.6 Фракционирование клеток E.coli.

4.2.7 Очистка рекомбинантного SEB с помощью ионообменной хроматографии.

4.2.8 Очистка рекомбинантных SEA и SEB с помощью аффинной хроматографии.

5 Результаты и обсуждение.

5.1 Клонирование генов, кодирующих SEA и SEB. Изучение их экспрессии в

E.coli.

5.1.1 Получение плазмид для экспрессии SEA и SEB в E.coli.

5.1.2 Исследование экспрессии рекомбинантных SEA и SEB в клетках E.coli.

5.2 Исследование влияния на эффективность трансмембранной транслокации энтеротоксина А первичной структуры его сигнального пептида.

5.2.1 Конструирование форм энтеротоксина А с измененным сигнальным пептидом и исследование накопления рекомбинантных белков в клетках

E.coli.

5.2.2 Вероятный механизм влияния исследованных вариантов аминокислотных замен в сигнальном пептиде SEA на его функцию.

5.3 Очистка рекомбинантных SEB и SEA.

5.3.1 Очистка SEB путем ионообменной хроматографии.

5.3.2 Биологическое тестирование очищенного препарата SEB.

5.3.3.0чистка SEA и SEB путем аффинной хроматографии.

5.3.3.1 Получение форм SEA и SEB, несущих С-концевой гексагистидиновый мотив.

5.3.3.2 Проведение аффинной хроматографии.

5.4 Исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков в периплазматическое пространство E.coli на модели энтеротоксинов из S. aureus.

5.4.1 Клонирование гена, кодирующего ТогА и исследование его внутриклеточной локализации при гиперэкспрессии в E.coli.

5.4.2 Конструирование плазмид для исследование роли сигнальных пептидов в транслокации рекомбинантных белков.

5.4.3 Исследование накопления гибридных белков в клетках Е.coli.

5.4.4 Возможные механизмы взаимного влияния сигнального пептида и зрелой части белка на эффективность процесса транслокации.

6 Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli."

Бактериальная клетка отделена от внешней среды плазматической мембраной, основу которой составляет гидрофобный двойной слой липидов. Основополагающая функция мембраны — барьерная. Она отделяет содержимое клетки от окружающей среды, делая возможным поддержание гомеостаза и защищая от внешних воздействий. При этом, мембрана работает как высоко селективный фильтр, избирательно пропуская одни соединения, задерживая другие и активно перемещая третьи. Задачи транспорта решаются целым рядом селективных белковых каналов и активных транспортеров, ассоциированных с мембраной.

Для нормального функционирования клетки необходимо перенести через плазматическую мембрану или встроить в нее большое количество различных белков. Задачу по перемещению через гидрофобный слой высокомолекулярных полипептидных субстратов решают специальные системы, состоящие из большого количества компонентов и утилизирующие производимую клеткой энергию в виде нуклеозидтрифосфатов и/или трансмембранного электрохимического потенциала [2]. Основная система трансмембранного транспорта белков — 8ес-транслоказа. С её помощью происходит выведение из цитоплазмы наружу несвернутых полипептидов или их встраивание в мембрану. Открытая позднее ТАТ-система позволяет преодолевать мембранный барьер белкам, имеющим нативную третичную или даже четвертичную структуру [3].

Актуальность темы исследования.

Активные исследования трансмембранного транспорта белков ведутся в течение последних четырех десятилетий, что позволило вскрыть молекулярные аспекты этого процесса. В тоже время, в данной области в настоящее время остается значительное количество нерешенных проблем. Доказано, что для транспорта полипептида через мембрану он должен иметь аминоконцевой участок с характерной структурой — т.н. сигнальный пептид [2]. Однако, как следует из большого количества экспериментов, его наличие в составе рекомбинантных белков далеко не всегда приводит к их транслокации. В настоящее время до конца не ясно, какое влияние на трансмембранный транспорт полипептидов оказывает структура их зрелой части, в частности, присутствуют ли в полипептидах какие-либо необходимые для переноса элементы, помимо сигнального пептида. Не разработана также проблема взаимного влияния структуры сигнального пептида и остальной части белка. Одной из нерешенных окончательно проблем остается эффективная секреция рекомбинантных белков в периплазматическое пространство или кулыуральную среду.

Одним из характерных субстратов Бес-системы транслокации являются энтеротоксины грамположительной патогенной бактерии Staphylococcus aureus. В процессе размножения в организме млекопитающих, данный микроорганизм секретирует большое количество энтеротоксинов нескольких типов [4]. По механизму действия они относятся к группе так называемых суперантигенов — белков, вызывающих неспецифическую активацию больших субпопуляций Т-лимфоцитов. Их главная задача — подавление иммунного ответа организма-хозяина [4]. Действием стафилококковых энтеротоксинов обусловлен ряд заболеваний, в том числе пищевые отравления и синдром токсического шока [4]. Особенности воздействия стафилококковых энтеротоксинов на иммунную систему человека делают их потенциальным объектом для создания медицинских препаратов различного назначения — иммуностимуляторов, усилителей иммунного ответа при вакцинации, компонентов противоопухолевых лекарств (см. п. 3.3).

В настоящее время стафилококковые энтеротоксины, в том числе и рекомбинантные, получают, в основном, из культур S.aureus. Данный микроорганизм одновременно продуцирует большое количество различных токсинов, поэтому получение препарата со степенью очистки, допускающей медицинское применение, связано со значительными трудностями. Получение рекомбинантных энтеротоксинов в экспрессионной системе Escherichia coli позволяет упростить наработку и выделение данных белков. Поскольку генно-инженерные методы для E.coli отработаны лучше, чем для любого другого организма, при этом открываются широкие возможности по модификации исходных белков посредством сайт-направленого мутагенеза и созданию комплексных многофункциональных препаратов в виде энтеротоксинов, слитых с другими белками.

Нами было показано, что аутентичные сигнальные пептиды ряда стафилококковых энтеротоксинов обеспечивают транспорт этих белков в периплазму при гетерологичной экспрессии в клетках E.coli. Несмотря на сходство пространственной структуры, разные типы стафилококковых энтеротоксинов имеют идентичность аминокислотной последовательности лишь около 30% [5] и различные по структуре сигнальные пептиды. Данное обстоятельство позволило нам использовать полученные рекомбинантные токсины в качестве модели, комбинируя различные лидерные последовательности и зрелые части белков, заведомо способных к переносу в перплазматическое пространство E.coli. Подобный подход мы использовали для ответа на вопросы о том, является ли наличие сигнального пептида достаточным условием для трансмембранной транслокации полипептидов и в какой степени сигнальные последовательности могут быть взаимозаменяемыми.

Цели и задачи работы.

Целью работы являлось:

1. конструирование штаммов-продуцентов E.coli для получения стафилококковых энтеротоксинов А и В;

2. выделение рекомбинантных энтеротоксинов А и В в гомогенной форме;

3. изучение влияния сигнальных пептидов на внутриклеточную локализацию белков на модели энтеротоксинов S. aureus при их гетерологичной экспрессии в E.coli.

В ходе работы ставились следующие задачи:

3. отработать методы очистки энтеротоксинов А и В;

4. провести перекрестный обмен сигнальными пептидами между энтеротоксинами А, В, Н из S. aureus, стрептавидином из Streptomyces avidinii, а также получить формы этих белков с заменой аутентичного сигнала транслокации на сигнальный пептид белка E.coli ТогА, который является субстратом альтернативной Sec-транелоказе транспортной системы — TAT (twin arginine translocation);

5. исследовать внутриклеточную локализацию полученных гибридных белков;

6. изучить влияние ряда аминокислотных замен на функциональную роль сигнального пептида энтеротоксина А.

Научная новизна.

Практическая значимость.

Во-вторых, проведенные исследования влияния сигнальных пептидов на трансмембранный транспорт модельных белков позволяют определить несколько направлений анализа структурно-функциональных взаимоотношений в системе сигнальный пептид — секретируемый полипептид. Результаты, полученные в данной работе закладывают хорошую базу для дальнейших исследований в данной области, которые могут помочь в поиске путей оптимизации переноса рекомбинантных белков в периплазму E.coli, что является актуальной задачей современной биотехнологии. Периплазматическая локализация существенно облегчает выделение и очистку рекомбинантных белков, а также позволяет существенно уменьшить проблемы, связанные с токсичностью продукта для продуцирующих его клеток и, в значительной степени, с образованием телец включения.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Манувера, Валентин Александрович

6 Выводы

3. Отработаны методики очистки зрелых энтеротоксинов А и В. Белки выделены в гомогенной форме.

4. Исследовано взаимное влияние сигнального пептида и зрелой части белка на эффективность процесса трансмембранной транслокации. Показано, что наличие сигнального пептида является необходимым, но недостаточным условием для трансмембранной транслокации белков посредством Бес-системы. Для трансмембранного переноса белка дополнительно требуется совместимость его сигнального пептида и зрелой части.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Манувера, Валентин Александрович, Москва

1. Roberts R.J., Belfort М., Bestor Т., Bhagwat A.S., Bickle Т.А., et al. A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes // Nucleic Acids Res 2003 - Vol. 31 - №7 - R 18051812.

2. Pugsley A. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria //Microbiol. Rev 1993 - Vol.50 -№1 -P. 50-108.

3. Natale P., Briiser Т., Driessen A.J.M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane — distinct translocases and mechanisms //Biochim. Biophys. Acta -2008 -Vol. 1778 -P. 1735-1756.

4. Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M. Exotoxins of Staphylococcus aureus II Clin. Microbiol. Rev -2000 Vol. 13 -№1 -P. 16-34.

5. Beveridge T.J., Graham L.L. Surface layers of bacteria // Microbiol. Rev. -1991 -Vol. 55-№4 -P. 684-705.

6. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. М.:Мир, 1987.-567с.

7. Lee V.T., Schneewind О. Protein secretion and the pathogenesis of bacterial infections // Genes and Development 2001 - Vol. 15 - P. 1725-1752.

8. Kostakioti M., Newman C.L., Thanassi D.G., Stathopoulos C. Mechanisms of protein export across the bacterial outer membrane // J. Bacteriol. 2005 - Vol. 187 -№13-P. 4306-4314.

9. Henderson I. R., Navarro-Garcia F., Desvaux M., Fernandez R.C., Ala'Aldeen D. Type V protein secretion pathway: the autotransporter story // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004 - Vol. 68 - №4 - P. 692-744.

10. Lory S. Determinants of extracellular protein secretion in gram-negative bacteria // J. Bacteriol. 1992 - Vol. 174 - №11 - P. 3423-3428.

11. Holland I.B., Schmitt L., Young J. Type 1 protein secretion in bacteria, the ABC-transporter dependent pathway // Mol. Membr. Biol. 2005 - Vol. 22 - P. 2939.

12. Fath M.J., Kolter R. ABC transporters: bacterial exporters // Microbiol. Rev. -1993 Vol. 57-№4-P. 995-1017.

13. Sandkvist, M. Biology of type II secretion // Mol. Microbiol. 2001 - Vol. 40-P. 271-283.

14. Thanassi, D. G. Ushers and secretins: channels for the secretion of folded proteins across the bacterial outer membrane // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002 - Vol. 4-P. 11-20.

15. Ghosh P. Process of protein transport by the type III secretion system // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004 - Vol. 68 - №4 - P. 771-795.

16. Gauthier A., Thomas N.A., Finlay B. Bacterial injection machines // J. Biol. Chem. 2003 - Vol. 278 - P. 25273-25276.

17. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998 - Vol. 62 - №2 - P. 379-433.

18. Manting E.H., Driessen A. J. M. Escherichia coli translocase: the unravelling of a molecular machine // Mol. Microbiol. 2000 - Vol. 37 - №2 - P. 226-238.

19. Dalbey R.E., Kuhn A. Evolutionarily related insertion pathways of bacterial, mitochondrial, and thylakoid membrane proteins // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000 -Vol. 16-P. 51-87.

20. Harrison S.C., Rapoport T.A. X-ray structure of a protein-conducting channel // Nature 2004 - Vol. 427 - 36-44.

21. Robson A., Collinson I. The structure of the Sec complex and the problem of protein translocation // EMBO rep. 2006 - Vol. 7 - №11 - R 1099-1103.

22. Rusch S.L., Kendall D.A. Oligomeric states of the SecA and SecYEG core components of the bacterial Sec translocon. Biochim // Biophys. Acta 2007 - Vol. 1768- P. 5-12.

23. Bieker K. L., Phillips G. J., Silhavy T. J. The sec and prl genes of Escherichia coli // J. Bioenerg. Biomembr. 1990 - Vol. 22 - P. 291-310.

24. Schatz P. J., Beckwith J. Genetic analysis of protein export in Escherichia coli//Annu. Rev. Genet. 1990 - Vol. 24 - P. 215-248.

25. Hanada M., Nishiyama K.I., Mizushima S., Tokuda H. Reconstitution of an efficient protein translocation machinery comprising SecA and the three membrane proteins, SecY, SecE, and SecG (pi2) // J. Biol. Chem. 1994 - Vol. 269 - P. 2362523631.

26. Brundage L., Hendrick J.P., Schiebel E., Driessen A.J.M., Wickner W. The purified E.coli integral membrane protein SecY/E is sufficient for reconstitution of SecA-dependent precursor protein translocation // Cell 1990 - Vol. 62 - P. 649-657.

27. Blobel G., Dobberstein B. Transfer of proteins across membranes // J. Cell Biol. 1975 - Vol. 67 - P. 835-851.

28. Kim J., Kendall D.A. Sec-dependent protein export and the involvement of the molecular chaperone SecB // Cell Stress Chaperones 2000 - Vol. 5 - P. 267275.

29. Fekkes P., Driessen A.J.M. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999 - Vol. 63 -№1 - P. 161-173.

30. Choi J.H., Lee S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004 - Vol. 64 - P. 625-635.

31. Tuteja R. Type I signal peptidase: An overview // Arch. Biochem. Biophys. -2005-Vol. 441-P.107-111.

32. Nagai K., Oubridge C., Kuglstatter A., Menichelli E., Isel C., Jovine L. Structure, function and evolution of the signal recognition particle // EMBO J. -2003 Vol. 22 - №14 - P. 3479-3485.

33. Yamane K., Bunai K., Kakeshita H. Protein traffic for secretion and related machinery of Bacillus subtilis // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004 - Vol. 68 -№10-P. 2007-2023.

34. Batey R. T., Rambo R. P., Lucast L., Rha B., Doudna J. A. Crystal structure of the ribonucleoprotein core of the signal recognition particle // Science 2000 - Vol. 287 - P. 1232-1239.

35. Poritz M.A., Strub K., Walter P. Human SRP RNA and E.coli 4,5S RNA contain a highly homologous structural domain // Cell 1988 - Vol. 55 - P. 4-6.

36. Nakamura K., Fujii Y., Shibata T., Yamane K. Depletion of Escherichia coli 4,5S RNA leads to an increase in the amount of protein elongation factor EF-G associated with ribosomes // Eur. J. Biochem. 1999 - Vol. 259 - P. 543-550.

37. Ribes V., Romisch K., Giner A., Dobberstein B., Tollervey D. E.coli 4.5S RNA is part of a ribonucleoprotein particle that has properties related to signal recognition particle // Cell 1990 - Vol. 63 - P. 591-600.

38. Nakamura K., Imai Y., Nakamura A., Yamane K. Small cytoplasmic RNA of Bacillus subtilis: functional relationship with human signal recognition particle 7S RNA and Escherichia coli 4,5S RNA // J. Bacteriol. 1992 - Vol. 174 - №7 - P. 2185-2192.

39. Bernstein H. D., Poritz M. A., Strub K., Hoben P. J., BrennerS., Walter P. Model for signal sequence recognitionfrom amino-acid sequence of 54K subunit of signal recognitionparticle // Nature 1989 - Vol. 340 - P. 482-486.

40. Keenan R. J., Freymann D. M., Stroud, R. M., Walter P. The signalrecognition particle //Annu. Rev. Biochem. 2001 - Vol. 70 - P. 755-775.

41. Romisch It., Webb J., Lingelbach K., Gausepohl H., Dobberstein B. The 54-kD protein of signal recognition particle contains a methionine-rich RNA binding domain// J. Cell. Biol 1990-Vol. Ill-P. 1793-1802.

42. Zorf D., Bernstein H.D., Walter P. GTPase domain of the 54-kD subunit of the mammalian signal recognition particle is required for protein translocation but not for signal sequence binding // J. Cell Biol. 1993 - Vol. 120-P. 1113-1121.

43. Keenan R. J., Freymann D. M., Walter P., Stroud R. M. Crystal structure of the signal sequence binding subunitof the signal recognition particle // Cell 1998 -Vol. 94-P. 181-191.

44. Dekker C., de Kruijff B., Grosb P. Crystal structure of SecB from Escherichia coli // J. Struct. Biol. 2003 - Vol. 144 - P. 313-319.

45. Xu Z., Knafels J. D., Yoshino K. Crystal structure of the bacterial protein export chaperone SecB // Nat. Struct. Biol. 2000 - Vol. 7 - P. 1172-1177.

46. Knoblauch N., Rudiger S., Schonfeld H.-J., Driessen A.J.M., Schneider-Mergener J., Bukau B. Substrate specificity of the SecB chaperone // J. Biol. Chem. -1999-Vol. 274-P. 34219-34225.

47. Fekkes P., van der Does C., Driessen A. J. M. The molecular chaperone SecB is released from the carboxy-terminus of SecA during initiation of precursor protein translocation // EMBO J. 1997 - Vol. 16 - №20 - P. 6105-6113.

48. Hesterkamp T., Hauser S., Lutclce H., Bukau, B. Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 - Vol. 93 - P. 4437-4441.

49. Valent Q.A., Kendall D.A., High S., Kusters R., Oudega B., Luirink J. Early events in preprotein recognition in E. coli: interaction of SRP and trigger factor with nascent polypeptides // EMBO J. 1995 - Vol. 14 - №22 - P. 5494-5505.

50. Beck K., Wu L.F., Brunner J., Muller M. Discrimination between SRP- and SecA/SecB-dependent substrates involves selective recognition of nascent chains by SRP and trigger factor // EMBO J. 2000 - Vol. 19 - №1 - P. 134-143.

51. Lee H. C. and Bernstein H. D. Trigger factor retards protein export in Escherichia coli//J. Biol. Chem. 2002 - Vol. 277 - P. 43527-43535.

52. Nishiyama K., Hanada M., Tokuda H. Disruption of the gene encoding pl2 (SecG) reveals the direct involvement and important function of SecG in the protein translocation of Escherichia coli at low temperature // EMBO J. 1994 - Vol. 13 -№14-P. 3272-3277.

53. Tomkiewicz D., Nouwen N., Driessen A.J.M. Pushing, pulling and trapping -Modes of motor protein supported protein translocation // FEBS Let. 2007 - Vol. 581 - P. 2820-2828.

54. Rusch S.L., Kendall D.A. Oligomeric states of the Sec A and SecYEG core components of the bacterial Sec translocon // Biochim. Biophys. Acta 2007 - Vol. 1768-P. 5-12.

55. Vrontou E., Economou A. Structure and function of SecA, the preprotein translocase nanomotor // Biochim. Biophys. Acta 2004 - Vol. 1694 - P. 67-80.

56. Veenendaal A.K.J., van der Does C., Driessen A.J.M. The protein-conducting channel SecYEG // Biochim. Biophys. Acta 2004 - Vol. 1694 - P. 81-95.

57. Bessonneau P., Besson V., Collison I., Duong F. The SecYEG preprotein translocation channel is a conformationally dynamic and dimeric structure // EMBO J.-2002-Vol. 21 -№5-P. 995-1003.

58. Collinson I., Breyton C., Duong F., Tziatzios C., Schubert D., Or E., Rapoport T., Kuhlbrandt W. Projection structure and oligomeric properties of a bacterial core protein translocase // EMBO J. 2001 - Vol. 20 - №10 - P. 2462-2471.

59. Papanikolau Y., Papadovasilaki M., Ravelli R.B.G., McCarthy A.A., Cusack S., Economou A., Petratos K. Structure of dimeric SecA, the Escherichia coli preprotein translocase motor // J. Mol. Biol. 2007 - Vol. 366 - P. 1545-1557.

60. Breyton C., Haase W., Rapoport T.A., Kuhlbrandt W., Collinson I. Three-dimensional structure of the bacterial protein-translocation complex SecYEG //

61. Nature 2002 - Vol. 418 - P. 662-665.

62. Mitra K., Schaffitzel C., Shaikh Т., Tama F., Jenni S., Brooks C.L. 3rd, Ban N., Frank J. Structure of the E. coli protein-conducting channel bound to a translating ribosome // Nature 2005 - Vol. 438 - P. 318-324.

63. Cristobal S., Scotti P., Luirink J., von Heijne G., de Gier J.W. The signal recognition particle-targeting pathway does not necessarily deliver proteins to the sec-translocase in Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1999 - Vol. 274 - P. 2006820070.

64. Dalbey R., Chen M. Sec-translocase mediated membrane protein biogenesis // Biochim. Biophys. Acta 2004 - Vol. 1694 - P. 37-53.

65. Dabley R., Kuhn A. YidC family members are involved in the membrane insertion, lateral integration, folding, and assembly of membrane proteins // J. Cell Biol. 2004 - Vol. 166 - №6 - P. 769-774.

66. Dalbey R.E., Lively M.O., Bron S., Van Dijl J.M., The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases // Protein Sci. 1997 - Vol. 6 - P. 599604.

67. Missiakas D., Raina S. Protein folding in the bacterial periplasm // J. Bacteriol. 1997 - Vol. 179 - №8 - P. 2465-2471.

68. Sklar J.G., Wu Т., Kahne D., Silhavy T.J. Defining the roles of the periplasmic chaperones SurA, Skp, and DegP in Escherichia coli //Genes Dev. 2007 - Vol. 21 -P. 2473-2484.

69. Gleiter S., Bardwell J.C.A. Disulfide bond isomerization in prokaryotes // Biochim. Biophys. Acta. 2008 - Vol. 1783 - P. 530-534.

70. Bothmann H., Pluckthun A. The Periplasmic Escherichia coli peptidylprolyl cis,trans-isomerase FkpA. I. Increased functional expression of antibody fragments with and without cis-prolines // J. Biol. Chem. 2000 - Vol. 275 - P. 17100-17105.

71. Missiakas D., Betton J.M., Raina S. New components of protein folding in extracytoplasmic compartments of Escherichia coli SurA, FkpA and Skp/OmpH // Mol. Microbiol. 1996-Vol. 21 -№4-P. 871-884.

72. Ramm K., Pluckthun A. The periplasmic Escherichia coli peptidylprolylcis,trans-Isomerase FkpA. II. Isomerase-independent chaperone activity in vitro // J. Biol. Chem. 2000 - Vol. 275 - P. 17106-17113.

73. Chen, R., Henning, U. A periplasmic protein (Skp) of Escherichia coli selectively binds a class of outer membrane proteins // Mol. Microbiol 1996 - Vol. 19-P. 1287-1294.

74. Georgiou G., Segatori L. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects // Curr. Opin. Biotechnol. 2005 - Vol. 16- P. 538-545.

75. Meerman H.J., Georgiou G. Construction and characterization of a set of E.coli strains deficient in all known loci affecting the proteolytic stability of secreted recombinant proteins // Biotechnology (NY) 1994 - Vol. 12 - №11 - P. 1107-1110.

76. Sargent E, Bogsch E.G., Stanley N.R., Wexler M., Robinson C., Berks B.C., Palmer T. Overlapping functions of components of a bacterial Sec-independent protein export pathway//EMBO J. 1998 - Vol. 17 -№13 -P. 3640-3650.

77. Berks B., Sargent F., Palmer T. The Tat protein export pathway // Mol. Microbiol. 2000 - Vol. 35 - №2 - P. 260-274.

78. Palmer T., Berks B. C. Moving folded proteins across the bacterial cell membrane // Microbiol. 2003 - Vol. 149 - P. 547-556.

79. Blaudeck N., Kreutzenbeck P., Freudl R., Sprenger G.A. Genetic analysis of pathway specificity during posttranslational protein translocation across the Escherichia coli plasma membrane // J. Bacteriol. 2003 - Vol. 185 - №9 - P. 28112819.

80. Cristobal S., de Gier J.-W., Nielsen H., von Heijne G. Competition between Sec- and TAT-dependent protein translocation in Escherichia coli //EMBO J. 1999 -Vol. 18 -№11-P. 2982-2990.

81. Behrendt J., Standar K., Lindenstrauss U., Brtiser T. Topological studies onthe twin-arginine translocase component TatC // FEMS Microbiol. Lett. 2004 -Vol. 234-P. 303-308.

82. Bolhuis A., Mathers J.E., Thomas J.D., Barrett C.M.L., Robinson C. TatB and TatC form a functional and structural unit of the twin-arginine translocase from Escherichia coli //J. Biol. chem. 2001 - Vol. 276 - P. 20213-20219.

83. Pop O., Martin U., Abel C., Muller J. P. The twin-arginine signal peptide of PhoD and the TatAd/Cd proteins of Bacillus subtilis form an autonomous Tat translocation system // J. Biol. Chem. 2002 - Vol. 277 - P. 3268-3273.

84. Yen M.R., Tseng Y.H., Nguyen E.H., Wu L.F, Saier M.H. Jr. Sequenceand phylogenetic analyses of the twin-arginine targeting (Tat) protein export system // Arch. Microbiol. 2002 - Vol. 177 - P. 441-450.

85. Georgiou G, Segatori L. Preparative expression of secreted proteins in bacteria: status report and future prospects // Curr. Opin. Biotechnol. 2005 - Vol. 16 - P. 538-45.

86. Mergulhäo F.J., Summers D.K., Monteiro G.A. Recombinant protein secretion in Escherichia coli //Biotechnol. Adv. 2005 Vol. 23 - №3 - P. 177-202.

87. Carriö M.M., Villaverde A. Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies // J. Biotechnol. 2002 - Vol. 96 - P. 3-12.

88. Liao Y.D., Jeng J.C., Wang C.F., Wang S.C., Chang S.T. Removal of N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E. coli methionine aminopeptidase //Protein Sei. 2004 Vol. 13 - P. 1802-1810.

89. Lee S., Kim I., Kim D., Bae K., Byun S. High level secretion of recombinantstaphylokinase into periplasm of Escherichia coli // Biotechno 1. Lett. 1998 - Vol. 20-P. 113-116.

90. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA // J. Biotechnol. 2001 - Vol. 84-P. 175-185.

91. Kaderbhai M.A., Ugochukwu C.C., Kelly S.L., Lamb D.C. Export of cytochrome P450 105D1 to the periplasmic space of Escherichia coli // Appl. Environ. Microbiol. 2001 - Vol. 67 - P. 2136-2138.

92. Вейко В.П., Гулько Л.Б., Окорокова H.A., Дьяков H.A., Дебабов В.Г. Клонирование гена стрептавидина из Streptomyces avidinii и его экспрессия в E.coli. Секреция стрептавидина клетками E.coli // Биоорг. химия 1999 - Т. 25 -№3 - С. 185-189.

93. Mukherjee K.J., Rowe D.C.D., Watkins N.A., Summers D.K. Studies of single-chain antibody expression in quiescent Escherichia coli // Appl. Environ. Micobiol. 2004 - Vol. 70 - P. 3005- 3012.

94. Xu R., Du P., Fan J.J., Zhang Q., Li T.P., Gan R.B. High-level expression and secretion of recombinant mouse endostatin by Escherichia coli // Protein. Expr. Purif. 2002 - Vol. 24 - P. 453-459.

95. Kenny В., Haigh R., Holland I.B. Analysis of the haemolysin transport process through the secretion from Escherichia coli of PCM, CAT or beta-galactosidase fused to the Hly C-terminal signal domain // Mol. Microbiol. 1991 -Vol. 5-P. 2557-2568.

96. Gentschev I., Hess J., Goebel W. Change in the cellular localization of alkaline phosphatase by alteration of itscarboxy-terminal sequence // Mol. Gen. Genet. 1990 - Vol. 222 - P. 211 -216

97. Li Y., Chen C.X., von Specht B.U., Hahn H.P. Cloning and hemolysinmediated secretory expression of a codon-optimized synthetic human interleukin-6 gene in Escherichia coli //Protein Expr. Purif. 2002 - Vol. 25 - P. 437-447.

98. Fernandez L.A., Sola I., Enjuanes L., de Lorenzo V. Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernatants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system // Appl. Environ. Microbiol. 2000 - Vol. 66 - P. 50245029.

99. Palacios J.L., Zaror I., Martinez P., Uribe F., Opazo P., Socías T., Gidekel M., Venegas A. Subset of hybrid eukaryotic proteins is exported by the type I secretion system of Erwinia chrysanthemi // J. Bacterid. 2001 - Vol. 183 - №4 -P. 1346-1358.

100. Baker M.D., Acharya K.R. Superantigens: Structure-function relationships // Int. J. Med. Microbiol. 2004 - Vol. 293 - P. 529-537.

101. Torres B.A., Kominsky S., Perrin G.Q., Hobeika A.C., Johnson H.M. Superantigens: The Good, the Bad, and the Ugly // Exp. Biol. Med. (Maywood) -2001 Vol. 226 -№3 - P. 164-176.

102. Bavari S., Ulrich R.G., LeClaire R.D. Cross-reactive antibodies prevent the lethal effects of Staphylococcus aureus superantigens I I J. Infect. Dis. 1999 - Vol. 180 - №4 - P. 1365-1369.

103. Stiles B.G., Garza A.R., Ulrich R.G., Boles J.W. Mucosal vaccination with recombinantly attenuated staphylococcal enterotoxin B and protection in a murine model // Infect. Immun. 2001 - Vol. 69 - №4 - P. 2031-2036.

104. Alouf J.P., Muller-Alouf H. Staphilococcal and streptococcal superantigens: molecular, biological and clinical aspects // Int. J. Med. Microbiol. 2003 - Vol. 292 -P. 429-440.

105. Schad E. M., Zaitseva I., Zaitsev V.N., Dohlsten M., Kalland T, Schlievert P.M., Ohlendorf D.H., Svensson L.A. Crystal structure of the superantigen staphylococcal enterotoxin type A // EMBO J. 1995 - Vol. 14 - №14 - P. 32923301.

106. Petersson K., Forsberg G., Walse B. Interplay between superantigens and immunoreceptors // Scand. J. Immunol. 2004 - Vol. 59 - P. 345-355.

107. Petersson K., Hakansson M., Nilsson H., Forsberg G., Svensson L. A., Liljas A., Walse B. Crystal structure of a superantigen bound to MHC class II displays zinc and peptide dependence // EMBO J. 2001 - Vol. 20 - №13 - P. 3306-3312.

108. Petersson K., Pettersson H., Skartved N. J., Walse B., Forsberg G. Staphylococcal enterotoxin H induces Va-specific expansion of T cells // J. Immunol. -2003-Vol. 170-P. 4148-4154.

109. Kotb M. Bacterial pyrogenic exotoxins as superantigens // Clin. Microbiol. Rev. 1995 - Vol. 8 - №3 - P. 411-426.

110. Miethke T., Gaus H., Wahl C., Heeg K., Wagner H. T-celldependent shock induced by a bacterial superantigen // Chem. Immunol. 1992 - Vol. 55 - P. 172-184.

111. Florquin S., Goldman M. Immunoregulatory mechanisms of T-Cell-dependent shock induced by a bacterial superantigen in mice // Infect. Immun. 1996 - Vol. 64 - №9 - P. 3443-3445.

112. Torres B.A., Perrin G.Q., Mujtaba M.G., Subramaniam P.S., Anderson A.K., Johnson H.M. Superantigen enhancement of specific immunity: antibody production and signaling pathways // J. Immunol. 2002 - Vol. 169 - P. 2907-2914.

113. Ulrich R.G., Olson M.A., Bavari S. Development of engineered vaccines effective against structurally related bacterial superantigens // Vaccine 1998 - Vol.16.P. 1857-1864.

114. Kaempfer R. Peptide antagonists of superantigen toxins // Mol. Divers. -2004-Vol. 8-P. 113-120.

115. Llewelyn M., Cohen J. Superantigen antagonist peptides // Crit. Care. 2001 - Vol. 5-P. 53-55.

116. Kominsky S.L., Torres B.A., Hobeika A.C., Lake F.A., Johnson H.M. Superantigen enhanced protection against a weak tumor-specific melanoma antigen: implications for prophylactic vaccination against cancer // Int. J. Cancer. 2001 -Vol. 94-P. 834-841.

117. Mondai T.K., Bhatta D., Biswas S., Pal P. Superantigen-induced apoptotic death of tumor cells is mediated by cytotoxic lymphocytes, cytokines, and nitric oxide // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 - Vol. 290 - P. 1336-1342.

118. McConnell E.J., Pathangey L.B., Madsen C.S., Gendler S.J., Mukherjee P. Dendritic cell-tumor cell fusion and staphylococcal enterotoxin B treatment in a pancreatic tumor model // J. Surg. Res. 2002 - Vol. 107, P. 196-202.

119. Okamoto S., Kawabata S., Nakagawa I., Hamada S. Administration of superantigens protects mice from lethal Listeria monocytogenes infection by enhancing cytotoxic T cells // Infect. Immun. 2001 - Vol. 69 - №11 - P. 66336642.

120. Nichterlein Т., Kretschmar M., Mussotter A., Fleischer В., Hof H. Influence of staphylococcal enterotoxin В (SEB) on the course of murine listeriosis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995 - Vol. 11 - P. 213-218.

121. Mondal Т.К., Bhatta D., Biswas S., Pal P. Repeated treatment with S. aureus superantigens expands the survival rate of Ehrlich ascites tumor bearing mice // Immunol. Invest. 2002 - Vol. 31 - P. 13-28.

122. Rosendahl A., Kristensson K., Hansson J., Ohlsson L., Kalland Т., Dohlsten M. Repeated treatment with antibody-targeted superantigens strongly inhibits tumor growth // Int. J. Cancer. 1998 - Vol. 76 - P. 274-83.

123. Sundstedt A., Celander M., Hedlund G. Combining tumor-targeted superantigens with interferon-alpha results in synergistic anti-tumor effects // Int. Immunopharmacol. 2008 - Vol. 8 - P. 442-452.

124. Krakauer T. Chemotherapeutics targeting immune activation by staphylococcal superantigens // Med. Sci. Monit 2005 - Vol. 11 - P. 290-295.

125. Schlievert P.M.Enhancement of host susceptibility to lethal endotoxin shock by staphylococcal pyrogenic exotoxin type С // Infect. Immun. 1982 - Vol. 36 -№1 - P. 123-128.

126. Faulkner L., Cooper A., Fantino C., Altmann D.M., Sriskandan S. The mechanism of superantigen-mediated toxic shock: not a simple Thl cytokine storm // J. Immunol. 2005 - Vol. 175 - P. 6870-6877.

127. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

128. Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977 - Vol. 74 - P. 5463-5468.

129. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene 1989 -Vol. 77-P. 51-59.

130. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970 - Vol. 227 - P. 680 — 685.

131. Schantz E.J., Roessler W.G., Wagman J., Spero L., Dunnery D.A., Bergdoll M.S. Purification of staphylococcal enterotoxin В // Biochemistry 1965 - Vol. 4 -№6 - P. 1011-1016.

132. Iandolo J.J., Tweten R.K. Purification of staphylococcal enterotoxins // Methods Enzymol. 1988 - Vol. 165 - P. 43-52.

133. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0 // J. Mol. Biol. 2004 - Vol. 340 - P. 783-795.

134. Betley M.J., Mekalanos J.J. Nucleotide sequence of the type A staphylococcal enterotoxin gene // J. Bacteriol. 1988 - Vol. 170 - №1 - P. 34-41.

135. Jones C.L., Khan S.A. Nucleotide sequence of the enterotoxin В gene from

136. Staphylococcus aureus //J. Bacteriol. 1986 - Vol. 166 - №1 - P. 29-33.

137. Ranelli D.M., Jones C.L., Johns М.В., Mussey G.J., Khan S.A. Molecular cloning of staphylococcal enterotoxin В gene in Escherichia coli and Staphylococcus aureus// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1985 - Vol. 82-P. 5850-5854.

138. Kuhn A., Wickner W. Conserved residues of the leader peptide are essential for cleavage by leader peptidase // J. Biol. Chem. 1985 - Vol. 260 - P. 1591415918.

139. Koshland D., Sauer R.T., Botstein D. Diverse effects of mutations in the signal sequence on the secretion of beta-lactamase in Salmonella typhimurium // Cell 1982-Vol. 30-P. 903-914.

140. Dalbey R.E., Wickner W. Leader peptidase catalyzes the release of exported proteins from the outer surface of the Escherichia coli plasma membrane. J. Biol. Chem. 1985-Vol. 260-P. 15925-15931.

141. Ansaldi М., Theraulaz L., Baraquet С., Panis G., Mejean V. Aerobic TMAO respiration in Escherichia coli //Mol. Microbiol. 2007 - Vol. 66 - №2 - P. 484-494.

142. Buchanan G., Maillard J., Nabuurs S.B., Richardson D.J., Palmer Т., Sargent F. Features of a twin-arginine signal peptide required for recognition by a Tat proofreading chaperone // FEBS Lett. 2008 - Vol. 582 - P. 3979-3984.

143. Panahandeh S., Maurer C., Moser M., Delisa M.P., Miiller M. Following the path of a twin-arginine precursor along the TatABC translocase of Escherichia coli //

144. J. Biol. Chem. 2008 - Vol. 283 - P. 33267-33275.

Информация о работе

Манувера, Валентин Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение рекомбинантных энтеротоксинов Staphylococcus aureus в Escherichia coli. Исследование на их модели роли сигнальных пептидов в транслокации белков в периплазматическое пространство E. coli. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы