Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний

Сыркина, Марина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний"

О1

На правах рукописи

СЫРКИНА Марина Сергеевна

Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 ОКТ 2012

Москва-2012

005053064

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального Государственного Унитарного Предприятия «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук профессор Вейко Владимир Петрович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им Н.М. Эмануэля РАН, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-генетических исследований.

Лазарев Василий Николаевич, доктор биологических наук, доцент, Федеральное Государственное Учреждение «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины», заведующий лабораторией генной инженерии.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Медико-Генетический Научный Центр» РАМН.

Защита состоится 11 «октября» 2012 г. в 14:00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, ауд.389.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан 10 «сентября» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И А Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Учитывая уровень смертности от рака в мире (свыше 7,5 млн. человек в год, по данным ВОЗ, что составляет более 13 % всех случаев смерти), в последнее время все острее чувствуется потребность в эффективных противораковых препаратах и диагностических средствах. Накопленные к настоящему времени знания о механизмах злокачественной трансформации, функционировании и молекулярном составе клеток, претерпевших такую трансформацию, а также определенные успехи в исследовании онкомаркеров - молекул, позволяющих различить нормальные и опухолевые клетки, - формируют прочную теоретическую базу для создания агентов, способных к селективному воздействию на раковые клетки.

Для отработки схемы получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы при создании бинарных противоопухолевых препаратов и диагностических средств, в качестве моделей нами были выбраны рак железистых органов и метастазирующая меланома человека. Эти два типа онкологических заболеваний обладают высоким метастатическим потенциалом и являются причиной летального исхода.

Терапия рака железистых органов при помощи методов, реализуемых в клинической практике, не всегда проходит успешно: в частности, гиперэкспрессирующиеся на поверхности раковых клеток муциновые гликопротеиды создают гидрофильный барьер для многих химиотерапевтических препаратов. Успехи в области таргетной терапии, в основном, связаны с использованием препарата Herceptin™ (Герцептин) производства Roche (Швейцария), представляющего собой антитело, специфически узнающее маркер рака молочной железы Her-2/neu. Однако данный онкомаркер присутствует только у 25-30 % больных раком молочной железы, что указывает на необходимость дополнительного поиска маркеров для клеток данного типа злокачественного новообразования.

Установлено, что при раке железистых органов в опухолевых клетках наблюдается гиперэкспрессия муцина MUC1. Кроме того, опухолевый MUC1 характеризуется нарушением апикальной локализации и аберрантным гликозилированием, приводящим к обнажению белкового кора в области тандемных повторов (VNTR) экстрацеллюлярного домена, в норме экранированного разветвленными олигосахаридами. Учитывая тот факт, что VNTR опухоль-ассоциированного муцина обладает иммуногенностью, приводящей к выработке у

ряда пациентов антител, взаимодействующих с дегликозилированной формой белка, можно было предположить, что VNTR, частично или полностью лишенный гликозилирования, применим при разработке противоопухолевых вакцин.

В настоящее время продемонстрирована эффективность вакцин, содержащих пептиды из области VNTR муцина MUC1 человека. В частности, липосомальная вакцина Stimuvax™ (Стимувакс) производства Merck KGaA (Германия) проходит клинические испытания как препарат для активной специфической иммунотерапии немелкоклеточного рака легкого.

Однако при получении вакцин часто используют короткие пептиды, содержащие около 1,5 повторов из области VNTR. Во многом это обусловлено возможностями и особенностями химического синтеза пептидов. Тем не менее, в ряде работ было показано усиление иммунного ответа на вводимый антиген при полимеризации антигенных детерминант. В связи с этим, получение белков, содержащих не менее пяти повторов из области VNTR муцина MUC1 человека является весьма существенным для разработки противораковых вакцин.

Для усиления индукции иммунного ответа на вакцинирующий препарат применимы белки, обладающие характеристиками суперантигенов. С этой целью могут быть использованы бактериальные энтеротоксины, для которых продемонстрирована высокая способность к активации Т-лимфоцитов. В настоящее время достаточно подробно изучены энтеротоксины Staphylococcus aureus -определена их структура, функции и механизм активации иммунной системы. В экспериментах на мышах слитые бели, содержащие энтеротоксин A (SEA), продемонстрировали высокую эффективность при терапии солидных опухолей. Результаты этих экспериментов позволяют рассматривать энтеротоксины из S. aureus как перспективный иммуностимулирующий компонент вакцин, позволяющий существенно увеличить их эффективность.

Одной из основных проблем терапии онкологических заболеваний является метастазирование, т.к. метастазы и микрометастазы трудноидентифицируемы. Тем не менее, существует ряд молекулярных маркеров, позволяющих выявить опухолевые клетки, приобретшие способность к метастазированию. Одним из таких маркеров является маркер агрессивной фазы развития меланомы - интегрин av03. Было продемонстрировано, что в клетках меланомных линий человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, экспрессия интегрина av|33 увеличена в 50100 раз по сравнению с экспрессией в клетках меланомных линий с низким метастатическим потенциалом.

Исследования взаимодействия интегрина av|33 с внеклеточными лигандами позволили установить, что к высокоаффинному связыванию с экстрацеллюлярным доменом рецептора обладает трипептид Arg-Gly-Asp (RGD).

На данный момент существует ряд противоопухолевых препаратов на основе RGD, некоторые из них уже проходят клинические испытания.

Однако экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, выявили ряд требований к пространственной организации и аминокислотному окружению RGD-мотива, выполнение которых обеспечивает высокую эффективность и селективность связывания агента на основе RGD с мишенью. Кроме того, необходимо подчеркнуть положительную роль «поливалентности» меланома-узнающего адреса в увеличении эффективности связывания RGD-содержащего агента.

Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что к настоящему времени при разработке противоопухолевых препаратов были достигнуты определенные успехи. Однако, результаты последних исследований открывают новые перспективы для создания эффективных терапевтических препаратов и диагностических средств, что определяет актуальность настоящей работы.

Цель работы:

1) Конструирование генов и экспрессионных плазмид для микробиологического синтеза в клетках Е. coli рекомбинантных белков, применимых в диагностике и терапии онкологических заболеваний человека.

2) Отработка методов выделения и очистки рекомбинантных белков.

3) Исследование биологических свойств и оценка терапевтического потенциала полученных рекомбинантных белков.

Экспериментальные задачи:

1) создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli рекомбинантного белка Hisi0-VNTR22, содержащего опухоль-ассоциированные антигенные эпитопы муцина MUC1 человека;

2) создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli энтеротоксинов из Staphylococcus aureus Н (SEH) и В (SEB), слитого со стрептавидином (SAV-SEB), отработка метода выделения данных белков и исследование их иммуностимулирующей способности;

3) создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli слитых со стрептавидином белков (SdR), содержащих меланома-адресующие RGD-

пептиды, отработка метода выделения и очистки таких рекомбинантных белков, а также оценка их селективности по отношению к клеткам меланомных линий человека и мыши.

Научная новизна и практическая ценность работы

1) Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках Е. coli нового слитого белка HiSio-VNTR22. С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, специфичные к природному дегликозилированному VNTR муцина MUC1, способны к связыванию рекомбинантного HiSio-VNTR22. Полученные данные указывают на подобие структуры и конформации данного белка опухоль-ассоциированному VNTR муцина MUC1 человека. Это дает возможность использования данного рекомбинантного белка при создании онковакцины.

2) Созданы экспрессионные конструкции для получения в клетках Е. coli новых синтетических гибридных белков SdR, содержащих RGD-пептид, слитой со стрептавидином. Продемонстрировано селективное связывание таких гибридных белков с меланомными клетками человека и мыши. Этот факт позволяет предложить данные гибридные белки в качестве адресующих агентов при создании противомеланомных препаратов и диагностических средств.

3) Создана конструкция для гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli предшественника энтеротоксина Н из S. aureus (SEH). Продемонстрировано, что лидерный пептид SEH обеспечивает транслокацию рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток Е. coli. Отработана методика хроматографической очистки рекомбинантного SEH.

4) Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках Е. coli энтеротоксина стафилококка В, слитого со стрептавидином (SAV-SEB). Структурное подобие SEB-компонента в составе химерного белка SAV-SEB природному SEB подтверждено результатами конкурентного связывания с антителами, полученными на природный SEB. Продемонстрировано, что белок SAV-SEB проявляет митогенную активность, характерную для природных энтеротоксинов из S. aureus. Этот факт позволяет предложить данный гибридный белок в качестве иммуностимулирующего агента при создании препаратов для адресной иммунотерапии рака, в том числе, двухфазной.

Предложенные схемы выделения и очистки вышеупомянутых рекомбинантных белков могут послужить основой для разработки способов получения противораковых терапевтических агентов и диагностических средств.

Структура диссертации

Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы». Работа содержит список цитируемой литературы (156 ссылок), 45 рисунков, 8 таблиц. Общий объем диссертации страниц.

Апробация работы и публикации

Диссертационная работа была представлена на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 5 марта 2012 г. Результаты настоящей работы были представлены на конференциях: Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2007), VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, Россия, 2010). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественном журнале, входящем в перечень ВАК РФ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Перспективные подходы к созданию бинарных агентов для диагностики и терапии онкологических заболеваний

Одним из перспективных направлений в диагностике и терапии онкологических заболеваний в настоящее время является использование адресующих (таргетных) молекул, специфически узнающих онкомаркеры на поверхности опухолевых клеток.

/ \

адресующая действующая адресующая «адаптор» действующая

часть часть часть часть

Рис. 1. Схематическое изображение бинарного агента.

Таргетные молекулы, как правило, представляют собой бинарные агенты, состоящие из адресующей части, узнающей онкомаркер на поверхности раковой

клетки, и действующей части - визуализирующей (диагностика) или разрушающей (терапия) клетку, с которой произошло связывание агента (рис. 1).

Между адресующей и действующей частями бинарного агента может быть помещен «адаптер». В идеальном случае он должен представлять собой структуру, позволяющую легко комбинировать различные адресующие и действующие части, для получения широкого спектра противоопухолевых терапевтических препаратов и диагностических средств.

В роли такого адаптера может выступать молекула стрептавидина, который обладает рядом характеристик, приближающих его к «идеальному» адаптору.

Во-первых, стрептавидин, способен к высокоаффинному связыванию остатка с?-биотина (Ка=10'15 М), что создает предпосылки для его модификации при помощи биотинилированных токсических, визуализирующих или адресующих агентов.

Во-вторых, способность стрептавидина к тетрамеризации позволяет получать поливалентные структуры. Для поливалентных адресующих молекул в целом ряде случаев продемонстрировано увеличение эффективности связывания с мишенью. В случае визуализирующих или токсических агентов поливалентность может приводить к амплификации сигнала или увеличению токсичности, соответственно.

БА\/

Уч

' - остаток биотина

- действующая часть

- адресующий агент

Рис. 2. Схематическое изображение различных способов получения бинарных агентов, содержащих в роли «адаптера» стрептавидин:

а - присоединение биотинилированного адресующего агента к гибридному белку Э/Ш-действующий агент;

б - присоединение биотинилированного визуализирующего/токсического агента к гибридному белку ЭА\/-адресующий агент;

в - присоединение биотинилированного адресующего и биотинилированного действующего агента к рекомбинантному стрептавидину.

Таким образом, использование стрептавидина в качестве адаптора при создании бинарных терапевтических и диагностических агентов может быть реализовано несколькими способами (рис. 2):

а) конструирование гибридных белков стрептавидин - действующий агент, которым могут быть сообщены различные адресующие характеристики благодаря использованию биотинилированных адресующих молекул;

б) конструирование гибридных белков стрептавидин - адресующий агент, которым могут быть приданы как токсические, так и диагностические свойства благодаря использованию биотинилированных «действующих» молекул;

в) образование комплексов «свободных» биотинилированных адресующих и действующих агентов с рекомбинантным стрептавидином посредством стрептавидин-биотинового взаимодействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ген vntr22 был получен рестрикцией плазмиды pEGFP-VNTR22 (сконструирована ранее в лаборатории) по сайтам Xho\ и ВатН\. ДНК-фрагменты, содержащиеся в рестриктной смеси, разделяли при помощи электрофореза в 1 % агарозном геле, и выделяли фрагмент vntr22 из агарозного геля.

Ген энтеротоксина В (seb) и ген предшественника энтеротоксина Н (pro-seh) из S. aureus были получены PCR-амплификацией соответствующего фрагмента геномной ДНК S. aureus с использованием специфических синтетических олигонуклеотидов, содержащих искусственно введенные сайты рестрикции для облегчения последующего клонирования.

Гены меланома-адресующих пептидов d4k-rgd10, d4k-rgd13 и d4k-rgd15 были получены в результате отжига и PCR-достройки синтетических олигонуклеотидов, содержащих искусственно введенные сайты рестрикции для последующего клонирования.

Экспрессионная конструкция pET16b-His«rVNTR22 была получена на основе вектора pET16b (Novagen, США).

Для создания экспрессионной конструкции pLSEH был использован вектор pUC18Rudp, созданный ранее в лаборатории на основе плазмиды pUC18 (Fermentas, Литва) и содержащий последовательность промотор-операторной области гена уридинфосфорилазы Е. coli.

Для создания экспрессионных конструкций, содержащих гены слитых со стрептавидином белков (pSAV-SEB, pSdRIO, pSdR13 и pSdR15) была использована плазмида pflSAV19, созданная ранее в лаборатории на основе pUC18 (Fermentas, Литва) и содержащая ген предшественника стрептавидина (лишенный кодона терминирующего трансляцию про-стрептавидина) под контролем промотора уридинфосфорилазы Е. coli. Ген seb был клонирован в составе экспрессионной конструкции pLSAV-SEB по сайту HincftW. Гены меланома-адресующих пептидов d4k-rgd10, d4k-rgd13 и d4k-rgd15 были клонированы в составе экспрессионных конструкций pSdRIO, pSdR13 и pSdR15 по сайтам Xho\ и HindIII, соответственно.

Реакции PCR, рестрикции и лигирования, выделение плазмид, а также выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью наборов фирмы Fermentas (Литва), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя.

Для продукции рекомбинантных белков полученными экспрессионными конструкциями трансформировали клетки штаммов Е. coli MG1655 и BL21(DE3).

В клетках штамма MG1655 Е. coli осуществляли наработку белков SAV-SEB, SEH, SdR10, SdR13, SdR15. Трансформированные клетки культивировали в жидкой среде LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, при +37 °С в течение 14-18 часов в шейкере-инкубаторе (250 об/мин). Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере (20 % сахарозы, 10 mM EDTA, 20 - 25 тМ Tris, 1 мг/мл лизоцима; pH 8) и инкубировали при помешивании на +4 °С в течение 20 - 30 минут, после чего центрифугировали и отбирали супернатант, содержащий белки периплазматической фракции. SEH очищали при помощи ионообменной хроматографии. Стрептавидин-содержащие белки очищали на 2-иминобиотин агарозе (Sigma-Aldrich, США), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя.

Наработку белка HÍS10-VNTR22 осуществляли в клетках штамма Е. coli BL21(DE3). Трансформированные клетки культивировали в жидкой среде LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, при +37 °С до достижения логарифмической фазы роста, после чего индуцировали 1 mM IPTG в течение 3-6 часов. Затем клетки подвергали разрушению, инкубируя в дистиллированной воде в течение 20 минут при 80 - 90 °С. Целевой белок выделяли из фракции растворимых белков, устойчивых к нагреванию, при помощи хроматографии на Ni-NTA (QiaGen), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя.

Все полученные белки фильтровали с использованием мембран для ультрафильтрации (Amicon, США), лиофилизировали и хранили при -20 "С.

Моноклональные антитела на дегликозилированный муцин MUC1 человека, поликлональные антитела на природный SEB, а также моноклональные антитела на природные SEB и SEA, были получены в лаборатории иммунологии ФГУП «ГосНИИгенетика». Исследование пролиферативной активности Т-лимфоцитов в ответ на природные SEB, SEA и рекомбинантный SAV-SEB, иммуноферментный и радиоиммунологический анализ SAV-SEB были проведены в лаборатории иммунологии ФГУП «ГосНИИгенетика».

Расщепление белков SdR10, SdR13 и SdR15 легкой цепью энтеропептидазы быка (Sigma-Aldrich, США) осуществляли, следуя рекомендациям фирмы-изготовителя.

В работе были использованы клетки меланомных линий человека (MeWo) и мыши (B16F10), предоставленные РОНЦ им. Н.Н.Блохина, а также клетки немеланомных линий человека - рака шейки матки (линия HeLa) и первичные фибробласты (линия HEF1698), предоставленные лабораторией структурно-функциональной организации хромосом Института Биологии Гена РАН.

Эксперименты по связыванию белков SdR10, SdR13 и SdR15 с клетками меланомных и немеланомных линий человека и мыши были проведены на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение рекомбинантного белка HíSkj-VNTRm, содержащего 22 тандемных повтора из области VNTR муцина MUC1 человека, для иммунотерапии рака железистых органов

Одним из маркеров рака железистых органов является муциновый гликопротеид MUC1. Этот полипептид синтезируется в клетках эпителия, выстилающего протоки желез, и представляет собой гетеродимер. Экстрацеллюлярная N-концевая субъединица представлена, преимущественно, высокогликозилированной областью тандемных повторов (VNTR), содержащей 20 -125 повторяющихся фрагментов, состоящих из 20 аминокислотных остатков (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA), и выполняет, в основном, функцию лубрификации железистого эпителия. Трансмембранная С-концевая субъединица содержит несколько сайтов фосфорилирования в цитоплазматическом домене и участвует в передаче сигнала в клетку, влияя на ее пролиферацию и выживаемость.

При злокачественной трансформации клеток происходит резкое увеличение экспрессии гена тис1, сопровождающееся аберрантным гликозилированием продукта экспрессии, а также потерей им апикальной локализации. Следствием аберрантного гликозилирования области VNTR MUC1 является обнажение участков белкового кора, в норме экранированного гликозидами, что переводит VNTR в разряд онкомаркеров. Учитывая тот факт, что VNTR опухоль-ассоциированного муцина обладает иммуногенностью, приводящей к выработке у ряда пациентов антител, взаимодействующих с дегликозилированной формой белка, можно было предположить, что VNTR, лишенный гликозилирования, применим при разработке противоопухолевых вакцин.

Ранее в лаборатории была сконструирована экспрессионная плазмида, содержащая ген гибридного белка, в состав которого входил стрептавидин (SAV), и полипептид VNTR22, составленный из 22 повторов из области VNTR муцина MUC1 человека. Ген vntr¡2 был сконструирован при помощи последовательного лигирования-расщепления фрагментов tr, собранных из синтетических олигонукпеотидов. Фрагменты, лигировавшиеся в правильной ориентации, не подвергались расщеплению, так как содержали гибридный сайт рестрикции BamHilBcft. Фрагменты, лигировавшиеся в неправильной ориентации, расщеплялись эндонуклеазами рестрикции ВатН\ и ßc/l и вновь подвергались лигированию.

Рекомбинантный белок SAV-VNTR22 был выделен из фракции периплазматических белков Е. coli на 2-иминобиотин агарозе. Была продемонстрирована способность SAV-VNTR22 к взаимодействию с антителами, специфичными к негликозилированным областям опухолевого муцина MUC1 человека. Это свидетельствует о структурном и конформационном соответствии фрагмента VNTR22 в составе рекомбинантного гибридного белка структуре и конформации VNTR природного опухоль-ассоциированного муцина MUC1. Кроме того, была установлена высокая иммуногенная активность гибридного SAV-VNTR22 при иммунизации мышей линии Balb/c. Существенным является также то, что антитела сывороток, полученных после иммунизации белком SAV-VNTR22, взаимодействуют с муцином MUC1 поверхности карциномных клеток человека (линия T-47D).

Полученные результаты дали возможность предполагать, что прообразом вакцины могут являться повторы VNTR22 без стрептавидина.

С этой целью были созданы экспрессионные конструкции на основе рЕТ-16Ь, содержащие ген полипептида VNTR22 (клонированный по сайтам Xhoi и ßamHI) под

контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Р-г?) (рис. 3, а). Для облегчения выделения и очистки синтезируемый белок содержал на Ы-конце 10 остатков гистидина.

Рис. 3. Схематическое изображение экспрессионного вектора рЕТ16Ь-Н'15ю-ЧЫТК22 (а); электрофоретическое разделение в 12% ПААГ (б) и иммуноблоттина с использованием моноклональных антител на область VNTR дегликозилированного муцина (в) белков цитоплазматической фракции штамма-реципиента (В121(ОЕЗ)) (дорожка 1), белков цитоплазматической фракции штамма продуцента белка Н/в^М/ТЯ^ (дорожка 2), выделенного и очищенного на М^ТА белка НкнгМ/ТЯгг (дорожка 3).

Рг, - промотор РНК-полимеразы бактериофага 77. Ар - ген устойчивости к ампициллину.

В результате индукции 1 мМ 1РТй в течение 6 часов в цитоплазме клеток происходит накопление белка НетЛ/МТРи. Для выделения целевого белка клеточную массу ресуспендировали в дистиллированной воде, инкубировали на водяной бане при 90-95 °С в течение 10-15 мин., медленно охлаждали раствор до комнатной температуры и осаждали денатурированные белки центрифугированием. Полипептид Н^оЛ/М!^ выделяли из фракции устойчивых к нагреванию цитоплазматических белков с применением Мнхелатной хроматографии (рис. 3, б). Соответствие выделенного белка области У№~14 дегликозилированного природного муцина М11С1 человека было установлено при помощи иммуноблоттинга (рис. 3, в).

Способность белка Н^юА/МТР^ к взаимодействию с антителами, полученными на дегликозилированный УЫТВ муцина М11С1 человека, указывает на правильную укладку полипептида, обеспечивающую презентацию узнаваемых моноклональными антителами антигенных эпитопов. Наличие таких антигенных эпитопов может свидетельствовать о наличии у полипептида Н^юА/ЫТРгг иммуногенных свойств, характерных для опухолевого муцина МиС1 Таким образом, данный полипептид

также может быть использован для создания противоопухолевых вакцинирующих препаратов.

Кроме того, белок НПэ-ю-Х/МТЯгг был использован при создании панели моноклональных антител для диагностики рака железистых органов и дискриминации фаз развития онкологического заболевания. Данные антитела также могут быть конъюгированы с биотином для получения бинарных диагностических средств и препаратов для иммунотерапии рака железистых органов (рис. 2, а, в).

Получение высокоселективных меланома-адресующих белковых молекул

Было показано, что в клетках меланомных линий человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, экспрессия интегрина ау03 увеличена в 50100 раз по сравнению с экспрессией в клетках меланомных линий с низким метастатическим потенциалом, что явилось причиной повышенного интереса к интегрину как к специфическому маркеру рака кожи человека. Исследования взаимодействия интегрина тфЗ с внеклеточными лигандами позволили установить первичную структуру короткого пептида, связывающегося с экстрацеллюлярным доменом рецептора, - это аминокислотная последовательность ЯОО. Для эффективного и селективного взаимодействия с рецепторами на поверхности меланомных клеток данный мотив должен быть стабилизирован в «изогнутой» конформации и иметь определенное аминокислотное окружение. Опираясь на результаты, полученные НбНд et а/. при отборе с помощью фагового дисплея РКЗО-содержащих пептидов по способности связывания с клетками различных линий, нами были выбраны пептиды 140010, Я0013 и 140015 (табл. 1), продемонстрировавшие высокую эффективность связывания с клетками меланомных линий человека. Такие пептиды содержат ЯОО-мотив, фланкированный остатками цистеина, для его стабилизации в «изогнутой» конформации.

название пептида аминокислотная поледовательность название гена нуклеотидная последовательность кодирующей цепи ДНК гена (5'-> 3')

(«ЗОЮ DGARYC.RGDC.FDG гдбЮ в АТСОСй САССГТАТТС ССв Тй СТв АТ ТССТТССАТССТТСА

1*3013 LSG.CRGP.CFEE гдб13 СТСАСССССТСССетССТСАТТССТТС САССАСТСА

ОСРРССРСОСБОЕ гдб15 САТСССТТСССАССТТССССТССТСАТ ТССАСТСАбСААТСА

Таблица 1. Аминокислотные последовательности Н60-содержащих пептидов и нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Пунктирной линией подчеркнут мотив Явй, фланкированный остатками цистеина, и последовательность нуклеотидов, кодирующая данный пентапептид.

На основании первичных структур пептидов РКЗРЮ, Р«3013 и РСй15 были выведены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов (табл. 1), которые были получены в результате отжига и достройки синтетических олигонуклеотидов.

Pudp Г---ь" prosav d4k-rgd

............... , , , ^" j

" ■ ■ . . г "•; ■ . 7"?. ■ ■ ном:

BamH\/Bcl\ Xba 1 HindU\

Рис. 4. Схематическое изображение слитого гена pro-sav-d4k-rgd из плазмиды pSdR с расположением сайтов рестрикции, использовавшихся при конструировании, а также промотор уридинфосфорилазы Е. coli (Pudp), контролирующий экспрессию данного гена.

На базе плазмиды pLSAVdS(H), содержащей ген предшественника стрептавидина (pro-sav) под контролем промотора уридинфосфорилазы E.coli, были получены экспрессионные конструкции pSdR (10, 13, 15), содержащие ген про-стрептавидина (pro-sav), слитой с геном узнающего меланомные клетки RGD-пептида (rgd10, rgd13, rgd15), и располагающуюся между генами pro-sav и rgd последовательность (d4k), кодирующую сайт расщепления энтеропептидазы (DDDDK) (рис. 4).

Рис. 5. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ:

а - белков периплазматических фракций клеток штамма Е.соИ МС1655, трансформированных плазмидой р11С18 (дорожка К); рЭд^О (дорожка 1), pSdR13 (дорожка 2), рЭдРНб - (дорожка 3), очищенного рекомбинантного стрептавидина, гЭА V (дорожка 4); б - растворов белков, полученных на различных стадиях хроматографической очистки белка вс/ИЮ: суммарные белки периплазматической фракции штамма-продуцента (дорожка 1); суммарные белки, не связавшиеся с сорбентом (дорожка 2); очищенного рекомбинантного белка (дорожка 3).

Данные конструкции давали устойчивую наработку слитых белков Зс1К в клетках штамма Е.соЧ 1\/Ю1655 (рис. 5, а). Полученные белки очищали методом аффинной хроматографии на 2-иминобиотин-агарозе (рис. 5, б).

Структурный анализ белков методом МАШ-ТОЯ масс-спектрометрии был выполнен в НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ. В результате исследования были определены молекулярные массы слитых белков ЗсИЧЮ (18864±5 Да), ватз (18640±5 Да), 5бК15 (18798±5 Да), а также гЗАУ(16616±5 Да). Кроме того, было установлено, что все проанализированные белки соответствуют заявленным структурам.

Полученные белки анализировали с точки зрения функциональности отдельных

компонентов в составе химеры.

Сохранение у стрептавидина способности к тетрамеризации подтверждают данные элеетрофоретического разделения неденатурированных слитых белков. В отсутствие денатурирующих условий БаИЮ, ватз и ват 5, также как и рекомбинантный стрептавидин, представлены тетрамерами, которые существенно отличаются по электрофоретической подвижности от мономерных форм (рис. 6, а).

Сохранение у стрептавидина в составе слитых белков способности к связыванию производных биотина оценивали по связыванию ЯТС-биотина (рис. 6, б). По молярному соотношению стрептавидина и ПТС-биотина, участвующих в реакции связывания, и соотношению связанного и свободного Р1ТС-биотина (определяемого визуально по свечению продуктов реакции, подвергшихся электрофоретическому разделению в неденатурирующих условиях) было установлено, что все биотин-связывающие сайты стрептавидина доступны для взаимодействия с производными биотина.

Доступность ЯЮО пептидов в составе слитого полипептида для белок-белковых взаимодействий оценивали по способности энтеропептидазы расщеплять слитые белки БсИО, 13 и 15 (рис. 6, в). Все слитые белки расщепляются энтеропептидазой, следовательно, их С-концевые меланома-адресующие фрагменты доступны для взаимодействия с рецепторами на поверхности клеток.

Рис. 6. Определение структурных характеристик слитых белков.

а - Способность стрептаеибина в составе слитых белков к тетрамеризации. Электрофореграмма неденатурированных (дорожки 1, 3, 5, 7) и денатурированных (дорожки 2, 4, 6, 8) белков Эс/ИЮ, БсНИЗ, вс/Шб, гЭАЦ соответственно, б - Доступность биотин-связывающих сайтов стрептавидина. Электрофореграмма реакционных смесей, содержащих очищенные белки на основе стрептавидина и Р1ТС-биотин. Свечение Р/ТС-биотина в неокрашенном геле при облучении ультрафиолетом (длина волны 312 нм). Взаимодействие Р1ТС-биотина с: гвАУ (дорожки 1, 2), ЭйРНО (дорожки 3, 4), вс/ГИЗ (дорожки 5, 6), Эс/Шб (дорожки 7, 8). Соотношение белокЛТС-биотин, равное 1:4 (дорожки 1, 3, 5, 7), 1:8 (дорожки 2, 4, 6, 8). Дорожка 9 - свободный Р1ТС-биотин (40 нг). Закрашенная стрелка указывает на тетрамеры стрептавидин-содержащих белков; пустая стрелка указывает на свободный РПС-биотин. в - Доступность для взаимодействия С-концевой области слитого белка с энтеропептидазой. Электрофореграмма продуктов расщепления слитых белков Эс/ШО, вс/ШЗ и ЭсН-Н 5легкой цепью бычьей энтеропептидазы. Дорожка 1 - гвЛУ; дорожки 2, 4. 6 - нерасщепленные белки вс/ИЮ, Эс/ШЗ и 5ЬИ15, соответственно; дорожки 3, 5, 7 -расщепленные белки ЭйНЮ, вс/МЗ и в6И15, соответственно. Закрашенная стрелка указывает на нерасщепленные белки вс/Н' пустая стрелка указывает на расщепленные белки

М - белки-маркеры.

С помощью гель-фильтрации на носителе 5ирегс)ех-200 было установлено, что рекомбинантные белки БсЛЧЮ, Эс1Р13 и Зс1Н15, а также гБАХ/, не подвержены агрегации.

Результаты эксперимента по оценке селективности связывания слитых белков Эс1Н10, 5сЖ13 и с клетками меланомных и немеланомных линий человека и

мыши представлены на рис. 7 и 8. Для постановки эксперимента клетки линий MeWo (меланома человека) и B16F10 (меланома мыши), а также клетки двух контрольных линий (HEF1698 и HeLa) высевали на 6-ти луночные культуральные планшеты и растили в течение 13 - 15 часов. Исследуемые белки SdR10, SdR13 и SdR15 и контрольный белок rSAV растворяли в PBS, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и метили биотин - флуоресцеином.

rSAV + :!ТС-биотин

SdR13+ FITC-биотин

SdR10 + ITC-биотин

SdR15+ FITC-биотин

меланома мыши

первичн. фибробласты

Рис. 7. Клетки меланомных и немеланомных линий человека и мыши после взаимодействия с FITC-мечеными слитыми белками. Снимки выполнены: 1 - при облучении образца возбуждающим светом с длиной волны 495 нм; 2-е проходящем свете. Увеличение микроскопа - 400.

Из лунок культуральных планшетов удаляли среду, промывали клетки 3 раза однократным PBS, после чего в лунки вносили DMEM без сыворотки и раствор исследуемых белков, меченых FITC, в соответствующей концентрации. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% С02. Для удаления несвязавшихся белков клетки промывали 3 раза однократным PBS, после чего

Г" " •■

вносили в лунки по 3 мл DMEM без сыворотки и незамедлительно анализировали полученные препараты с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DMI6000 (Германия), оснащенного модулем для прижизненной съемки (37 °С, 5%

С02).

0,125 мкМ раствор белка SdR13

1,25 мкМ раствор белка SdR13

клетки линии MeWo + (SdR13+^ITC-biotin)

клетки линии B16F10 + (SdR13+FITC-biotin)

Рис. 8. Флуоресценция клеток меланомных линий человека (Ме\Л/о) и мыши (В16Р10) после взаимодействия с растворами Р1ТС-меченых белков 8с1И различной концентрации. Снимки выполнены: 1 - при облучении образца возбуждающим светом с длиной волны 495 нм; 2-е проходящем свете. Увеличение - 400.

В случае каждой линии клеток было проанализировано 12 следующих экспериментальных точек в двух повторностях:

1 - «Контроль 1» (без SdR, без Р1ТС-биотина, без гвА\/)

2 - «Контроль 2» (5,4 мкМ раствор Р1ТС-биотина)

3 - «Контроль 3» (0,625 мкМ раствор гЭАХ/, меченый Р1ТС)

4, 5, 6 - 0,125 мкМ, 0,625 мкМ и 1,25 мкМ раствор SdR10, меченого Р1ТС, соответственно.

7 д д _ о,125 мкМ, 0,625 мкМ и 1,25 мкМ раствор Бс1Р13, меченого Р1ТС, соответственно.

10, 11, 12-0,125 мкМ, 0,625 мкМ и 1,25 мкМ раствор Эс1Н15, меченого РГГС, соответственно.

По результатам связывания с клетками меланомных и немеланомных линий человека и мыши было установлено, что полученные слитые белки обладают селективностью по отношению к клеткам меланомных линий. Кроме того, выявлено, что селективность обусловлена наличием на С-конце таких белков РКЗР-содержащего пептида, так как рекомбинантный гБАУ не связывает клетки ни одной из проанализированных линий (рис. 7).

Наконец, эффективность связывания клеток меланомных линий человека существенно выше эффективности связывания клеток меланомных линий мыши (рис. 8), причем, в большей степени эффект наблюдается при взаимодействии клеток с Р1ТС-биотинилированными белками ЭЬтЗ и ЗбЯЛб. Таким образом, белки и ЗсНЧ15 могут быть использованы при создании противомеланомных препаратов и диагностических средств (рис. 2, б).

Получение белков-суперантигенов для активной иммунотерапии онкологических заболеваний

При разработке препаратов для иммунотерапии, в частности, для активной иммунотерапии онкологических заболеваний, возникает проблема выбора токсической части для эффективного уничтожения опухолевых клеток, несущих узнаваемые «адресующей» частью онкомаркеры. Одним из перспективных подходов является использование молекул, вызывающих индукцию пролиферации цитотоксических Т-кпеток.

В качестве таких молекул могут быть использованы т.н. «суперантигены» (ЭАд), обладающие уникальной способностью к активации иммунной системы. Данные белки участвуют в формировании трехкомпонентного комплекса, ТСК-ЭАд-МНСИ, имитирующего классическое распознавание чужеродных антигенов. Однако связывание БАд молекулами ТСЯ и МНСИ происходит за пределами областей связывания обычных антигенов, что приводит к поликлональной активации до 20 % всех периферических Т-клеток. В результате такой активации происходит пролиферация, стимуляция и индукция цитотоксических Т-клеток, сопровождающаяся продукцией хемокинов и цитокинов.

К семейству суперантигенов принадлежат знтеротоксины S. aureus. Механизм действия данных токсинов достаточно хорошо изучен, следовательно, они потенциально могут быть использованы в качестве иммуностимулирующих агентов при создании бинарных «адресующих» препаратов для иммунотерапии рака с целью привлечения цитотоксических Т-клеток к местам скопления опухолей, экспрессирующих узнаваемые «адресующей» частью онкомаркеры. Каждый энтеротоксин имеет «свои» участки связывания на молекулах TCR и МНС. В ряду энтеротоксинов S. aureus особенно выделяется SEH - в то время как сайты связывания других энтеротоксинов располагаются на ß-цепи TCR, энтеротоксин H связывается с а-цепью рецептора.

Такое разнообразие в механизмах связывания приводит к различиям в митогенной активации.

Были созданы экспрессионные конструкции, одна из которых содержала ген энтеротоксина В, слитой с геном прострептавидина (prosav-seb) (рис. 9, а), а другая - ген предшественника энтеротоксина Н (рис. 9, б).

Рис. 9. Схематическое изображение экспрессионных векторов, содержащих гены энтеротоксинов S. aureus: а - pSAV-SEB содержит ген про-стрептавидина (pro-sav), слитой с геном энтеротоксина В (seb); б - pLSEH содержит ген про-энтеротоксина Н (pro-seh).

Pudp - промотор уридинфосфорилазы Е. coli. Ар" - ген устойчивости к ампициллину.

Оба белка были выделены из смеси белков периплазматической фракции: SAV-SEB - при помощи аффинной хроматографии на 2-иминобиотин агарозе (рис. 10, а), SEH - при помощи ионообменной хроматографии (рис. 10, б).

Исследование свойств рекомбинантного SAV-SEB было проведено в лаборатории иммунологии ФГУП «ГосНИИгенетика». Пролиферативную активность

Т-лимфоцитов в ответ на обработку гибридным белком SAV-SEB, а также белками SEA и SEB, исследовали по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток.

Рис. 10. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ:

а - белков периплазматической фракции штамма-реципиента (дорожка 1) и штамма-продуцента (дорожка 2) рекомбинантного слитого белка SAV-SEB; дорожка 3 -очищенный рекомбинантный белок SAV-SEB;

б - белков периплазматической (дорожка 1) и цитоплазматической фракции (дорожка 2) штамма-реципиента, белков периплазматической (дорожка 3) и цитоплазматической фракции (дорожка 4) штамма-продуцента рекомбинантного слитого белка SEH; дорожка 5 - очищенный рекомбинантный белок SEH. М - белки-маркеры

На основании полученных результатов, представленных на рис. 11, а, было установлено, что рекомбинантный SAV-SEB обладает способностью вызывать поликлональную пролиферацию Т-клеток в дозах, сравнимых с дозами суперантигенов SEA и SEB (10"12-10"13 М). Вместе с тем, рекомбинантный белок обладает сниженным по сравнению с SEB и SEA «апоптозным» потенциалом -гибель Т-клеток наступает при концентрации SAV-SEB, превышающей концентрацию SEA и SEB более, чем в 50 раз.

Согласно литературным данным, «токсический» эффект суперантигенов обусловлен вовлечением в образование комплекса токсина с TCR и MHCII костимуляторной молекулы CD28, сайт связывания которой был обнаружен у энтеротоксинов стафилококка А, В, С, Н, TSST-1 и располагался в удалении от сайтов связывания TCR и МНСИ. Было показано, что мыши CD28", в отличие от мышей CD28+, не погибали от токсического шока, вызванного введением SEB, но при этом имели сравнимые уровни активации Т-лимфоцитов. Таким образом, есть основания предполагать, что благодаря наличию в слитой молекуле SAV-SEB стрептавидина и образованию тетрамерной структуры возникают пространственные препятствия, нарушающие взаимодействие SEB с костимуляторной молекулой CD28.

Кроме того, проводили оценку эффективности связывания нативного ЭЕВ и рекомбинантного БАУ-БЕВ с иммобилизованными поликлональными антителами кролика, полученными на БЕВ, методом конкурентного РИА с использованием 1251-БЕВ (рис. 11, б). Также осуществляли исследование характера взаимодействия иммобилизованных белков БЕВ и БАУ-БЕВ с моноклональными антителами, полученными на различные конформационно-зависимые антигенные детерминанты природного БЕВ (рис. 11, в).

Рис. 11. Эффективность и особенности активации пролиферации Т-клеток белком SAV-SEB (а) и взаимодействие SAV-SEB белка с поли- и моноклональными антителами, специфичными к природному SEB (б, в):

а - пролиферативный ответ нормальных Т лимфоцитов крови человека на SEA, SEB суперантигены и рекомбинантный белок SAV-SEB;

б - ингибирование взаимодействия иммобилизированных поликпональных анти-SEB антител с 125I-SEB природным токсином SEB и рекомбинантным слитым белком SAV-SEB;

в - иммуноспецифичность взаимодействия анти-SEB (S4F11 и S4B2) и анти-SEA (S1) моноклональных антител с иммобилизованным на полистироле SEB и химерным белком SAV-SEB.

Полученные результаты позволяют сделать вывод об идентичности иммунохимических характеристик природного БЕВ и рекомбинантного БЕВ в составе

слитого белка БА\/-БЕВ.

Конформационное подобие БЕВ-компонента в составе слитого белка БАУ-БЕВ природному БЕВ в совокупности с его высокой митогенной активностью и сниженным «апоптозным» потенциалом позволяют рассматривать БАУ-БЕВ как потенциальный терапевтический агент, применимый при создании препаратов для

иммунотерапии рака.

Химерному белку БАУ-БЕВ могут быть сообщены адресующие свойства в результате присоединения биотинилированных адресующих молекул (рис. 2, а).

В то же время, свободный БЕН, выделенный из фракции периплазматических белков Е.соН, может быть биотинилирован с целью получения конъюгатов со стрептавидином, обладающих токсическими характеристиками (рис. 2, б-в).

выводы

Методом гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli получены рекомбинантные белки HiSio-VNTR22, SdR10, SdR13, SdR15, SEH, SAV-SEB, которые могут быть использованы как потенциальные компоненты противоопухолевых и диагностических агентов.

1. Установлено, что рекомбинантный белок Hism-VNTR22, содержащий 22 тандемных повтора из области VNTR муцина MUC1 человека, формирует антигенные эпитопы, характерные для VNTR природного дегликозилированного муцина. Белок Hisio-VNTR22 может быть использован при получении онковакцины.

2. Продемонстрирована способность гибридных белков SdR10, SdR13 и SdR15, содержащих слитой со стрептавидином меланома-адресующий пептид (RGD10, RGD13 или RGD15, соответственно), к селективному узнаванию клеток меланомных линий человека (MeWo) и мыши (B16F10). Данные рекомбинантные белки могут найти применение в диагностике меланомы, а также при создании противомеланомных терапевтических агентов.

3. Показана способность лидерного пептида энтеротоксина Н из S. aureus к транслокации рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток Е. coli. Установлена идентичность иммунохимических характеристик рекомбинантного SEH и природного SEH. Рекомбинантный SEH может быть использован в качестве компонента при создании бинарных агентов для иммунотерапии рака.

4. Продемонстрирована идентичность иммунохимических характеристик рекомбинантного SEB в составе слитого белка SAV-SEB и природного SEB. Установлена способность белка SAV-SEB к индукции цитотоксических Т-лимфоцитов, что позволяет использовать его в качестве токсического агента при создании бинарных агентов для активной иммунотерапии различных видов онкологических заболеваний.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гулько Л.Б., Воюшин К.Е., Окорокова Н.А., Кривенко М.С., Ратманова К.И., Вейко ВП Дебабов В.Г. Создание опухоль-адресованных генно-инженерных препаратов' для иммунотерапии рака. I. Конструирование гибридного гена энтеротоксина В из Staphylococcus aureus, слитого с геном стрептавидина из Streptomyces avidinii, и его экспрессия в Escherihia coli. // Биотехнология. 2003. №5. С. 81-87.

2. Гулько Л.Б., Воюшин К.Е., Флуер Ф.С., Окорокова Н.А., Кривенко М.С., Вейко В П Создание ' опухоль-адресованных генно-инженерных препаратов для иммунотерапии рака. II. Клонирование гена проэнтеротоксина Н (seh) из Staphylococcus aureus и его экспрессия в Escherihia coli. Исследование секреции энтеротоксина Н клетками Е. coli. II Биотехнология. 2003. №6. С. 72-78.

3. Кривенко М.С., Гулько Л.Б., Окорокова Н.А., Вейко В.П. Создание опухоль-адресованных генно-инженерных препаратов для иммунотерапии рака. III. Конструирование экспрессионной плазмиды и получение на основе рекомбинантного штамма-продуцента Е. coli вакцинирующего онкопептида VNTR22 (MUC1) человека. // Биотехнология. 2005. № 2. С. 11-17.

4 Krivenko M.S., Voyushin К.Е., Gul'ko L.B., Okorokova N.A., Levitsky S.A., Mukharyamova K.I., Veiko V.P. Cloning of mucin (MUC1) gene and studing of its expression in eucariotic cells. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 annivrsary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine. Kyiv (Ukraine) 2003. P. 171.

5 Manuvera V.A., Cheremnyh A.M., Syrkina M.S., Yurin V.L., Veiko V.P. The development of anti-tumor agent based on staphylococcal enterotoxin В and anti-mucin monoclonal miniantibody. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov. Kyiv (Ukraine). 2007. P. 175.

6 Сыркина M.C., Широков Д.А., Вейко В.П. Разработка системы для конструирования диагностических и терапевтических противомеланомных препаратов // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010». Москва (Россия) 2010. Т. 4. С. 134-137.

Подписано в печать: 08.09.2012 Тираж: ЮОэкз. Заказ №908 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сыркина, Марина Сергеевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В 15 ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ РАКА

1. Основные способы диагностики и терапии онкологических заболеваний

1.1. Способы терапии, реализуемые в практической медицине

1.1.1. Краткая характеристика

1.1.2. Трудности, возникающие при терапии

1.2. Основные способы диагностики онкологических заболеваний

1.3. Онкомаркеры как мишень для высокоселективных 22 противоопухолевых препаратов и диагностических средств

1.3.1. Злокачественная трансформация клетки и причины появления 23 онкомаркеров

1.3.2. Типы онкомаркеров

1.4. Методы молекулярной диагностики онкологических 26 заболеваний

1.5. Методы таргетной (направленной) терапии онкологических 28 заболеваний

1.5.1. Подавление экспрессии онкогенов на уровне трансляции.

1.5.2. Способы иммунотерапии рака.

1.5.3. Бинарные агенты в диагностике и терапии онкологических 35 заболеваний

2. Муцин миС1 как специфический маркер рака железистых 38 органов

2.1. Краткая характеристика муциновых гликопротеидов

2.2. Мембранный муцин МУС 1. Структура и свойства

2.3. Транспорт муцина MUC1 в ядро

2.4. Участие муцина MUC1 в передаче сигнала

2.5. Функционирование муцина MUC1 в здоровых тканях

2.6. Функционирование муцина MUC1 в опухолевой ткани

2.6.1. Сравнение нормального и опухоль-ассоциированного муцина 49 MUC

2.6.2. Модификация функций муцина MUC1 при злокачественной 51 трансформации клеток

2.7. Иммуногенность муцина MUC1 и роль области VNTR в 53 развитии естественного иммунного ответа организма

2.7.1. Аминокислотная последовательность и пространственная 53 организация области VNTR

2.7.2. Антигенные эпитопы области VNTR опухоль- 55 ассоциированного муцина MUC1 человека

2.8. Муцин MUC1 в адресной терапии и иммунотерапии рака

3. Интегрин avp3 как специфический маркер метастатической 57 меланомы человека

3.1. Краткая характеристика интегринов

3.2. Строение и свойства интегриновых рецепторов

3.3. Интегрин ауРз как член семейства интегриновых рецепторов

3.3.1. Экспрессия интегрина ау(3з при онкологических заболеваниях

3.3.2. Последовательность и пространственная организация 66 минимального интегрин ау(Зз-узнающего пептида

3.4. RGD-содержащие пептиды в диагностике и терапии рака

4. Энтеротоксины Staphylococcus aureus при создании препаратов для иммунотерапии рака

4.1. Общая характеристика энтеротоксинов S. aureus

4.2. Строение энтеротоксинов S.aureus и природа индукции Т- 73 клеточного ответа

4.3. Токсичность и участие костимуляторных молекул в развитии 77 суперантиген-индуцируемого Т-клеточного ответа

4.4. Мутантные формы суперантигенов, обладающие сниженным 79 «токсическим» действием на Т-лимфоциты.

ВЫВОДЫ 83 II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

1.1. Реактивы

1.2. Ферменты и антитела

1.3. Культуры клеток, бактериальные штаммы и плазмиды

2. Методы

2.1. Общие методы

2.2. Выделение суммарной ДНК из клеток S. aureus

2.3. Проведение полимеразной цепной реакции

2.4. Выделение и очистка Hisi0-VNTR

2.5. Выделение и очистка рекомбинантного SEH

2.6. Выделение и очистка рекомбинантных стрептавидин- 88 содержащих белков

2.7. Электрофоретический анализ белков

2.8. Масс-спектрометрический анализ белков

2.9. Иммуноблоттинг

2.10. Иммуноферментный анализ

2.11. УФ-спектроскопия

2.12. Количественное определение рекомбинантного белка Hisi0- 90 VNTR

2.13. Взаимодействие стрептавидин-содержащих белков с FITC- 90 биотином

2.14. Расщепление белков легкой цепью бычьей энтеропептидазы

2.15. Гель-фильтрация белков

2.16. Исследование связывания слитых белков БсШЛО, 8сШ.13, 8<Ж с клетками меланомных линий человека и мыши III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор адапторной части при конструировании бинарного агента

1.1. Функции адаптора и требования к «идеальному» адаптору

1.2. Примеры молекул-адапторов и их характеристика

1.3. Молекула стрептавидина в роли адаптора 95 2. Получение «адресующей части» бинарного агента

2.1. Различные подходы к получению адресующих частей. 97 Бинарные агенты в иммунотерапии онкологических заболеваний

2.2. \nSiTR муцина МиС1 человека - онкомаркер и «адрес» для создания онковакцин

2.2.1. Подходы к получению VNTR муцина MUC

2.2.2. Иммуногенность рекомбинантного VNTR муцина MUC

2.2.3. Получение белка Hisi0-VNTR22 в клетках Escherichia coli

2.2.3.1. Создание генетических конструкций, содержащих ген vntr22 103 под контролем промотора уридинфосфорилазы Е. coli

2.2.3.2. Создание генетических конструкций, содержащих ген vntr22 105 под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т

2.2.3.3. Выделение и очистка белка Шбю-УШТ^

2.2.4. Определение структуры и свойств белка Шбю-УТЧЛИ^

2.2.4.1. Ультрафиолетовая спектроскопия

2.2.4.2. Иммуноблоттинг

2.2.4.3. MALDI масс-спектрометрия рекомбинантного белка His ю

2.2.5. Разработка метода количественного определения белка Hisi0- 111 VNTR

2.2.6. Использование белка Hisi0-VNTR22 при создании 115 диагностических и терапевтических агентов

2.3. Получение высокоселективных меланома-адресующих 119 белковых молекул

2.3.1. Способы получения RGD-пептидов.

2.2.1.1. Методы поддержания изогнутой конформации RGD-мотива

2.2.1.2. Подходы к получению поливалентных структур

2.3.2. Получение химерных белков SdRIO, SdR13, SdR15, 121 содержащих меланома-узнающие RGD-пептиды

2.3.2.1. Создание экспрессионных векторов pSdRIO, pSdR13 и pSdR15 122 для наработки белков SdR в клектах Е. coli

2.3.2.2. Выделение и очистка химерных белков SdRIO, SdR13 и SdR

2.3.3. Исследование структуры и свойств выделенных слитых белков 126 SdRIO, SdR13, SdR

2.3.3.1. Исследование способности слитых со стрептавидином белков 126 SdRI O, SdR13 и SdR15 к тетрамеризации

2.3.3.2. Исследование гомогенности белковых препаратов SdRIO, 127 SdR13 и SdR

2.3.3.3. MALDI масс-спектрометрия

2.3.3.4. Связывание химерных белков с FITC-биотином.

2.3.3.5. Расщепление слитых белков при помощи легкой цепи бычьей 131 энтеропептидазы

2.3.4. Исследование специфичности белков SdR по отношению к 133 клеткам меланомных линий

3. Получение «действующей» (терапевтической) части бинарного агента.

3.1. Различные подходы к выбору «действующих» частей при 136 создании бинарного агента. «Действующая» часть онковакцины

3.2.1.

3.2.2.

3.2.3.

3.2.4.

3.2.5.

3.2.6.

Получение энтеротоксинов S.aureus - энтеротоксина Н (SEH) и 137 гибридного белка SAV-SEB, содержащего энтеротоксин В (SEB) слитой со стрептавидином (SAV)

Создание экспрессионных векторов для наработки белка SEH в 137 клетках прокариот

Выделение белка SEH

Создание экспрессионных векторов для наработки слитого 141 белка SAV-SEB в клетках Е. coli

Выделение химерного белка SAV-SEB

Исследование структуры химерного белка SAV-SEB

Исследование митогенной активности и цитотоксичности 144 химерного белка SAV-SEB по отношению к Т-лимфоцитам

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний"

Актуальность темы. Учитывая высокий уровень смертности от онкологических заболеваний (по данным ВОЗ, свыше 7,5 млн. человек в год (Jermal et al., 2011), что составляет более 13 % всех случаев смерти), а также ежегодный прирост заболеваемости, увеличивается потребность в разработке эффективных противораковых препаратов и диагностических средств нового поколения. Накопленные к настоящему времени знания о механизмах злокачественной трансформации, функционировании и молекулярном составе клеток, претерпевших такую трансформацию, а также определенные успехи в исследовании онкомаркеров - молекул, позволяющих различить нормальные и опухолевые клетки, - формируют прочную теоретическую базу для создания агентов, способных к селективному воздействию на раковые клетки.

Для отработки схемы конструирования рекомбинантных белков, которые могут быть использованы при создании бинарных противоопухолевых препаратов и диагностических средств, в качестве моделей нами были выбраны два типа онкологических заболеваний - рак железистых органов и метастазирующая меланома человека. Данные формы рака обладают высоким метастатическим потенциалом и с высокой степенью вероятности приводят к летальному исходу.

Терапия рака железистых органов при помощи методов, реализуемых в клинической практике, не всегда проходит успешно. Причиной этому, в частности, являются гиперэкспрессирующиеся на поверхности раковых клеток высокомолекулярные гликопротеиды (Bansil & Turner, 2006), создающие гидрофильный барьер для многих химиотерапевтических препаратов. Успехи в области таргетной терапии, в основном, связаны с использованием препарата Herceptin™ (Герцептин) производства Roche (Швейцария), представляющего собой антитело, специфически узнающее маркер рака молочной железы Нег-2/neu (Hudis, 2007). Однако данный онкомаркер присутствует только у 25-30 % больных раком молочной железы, что указывает на необходимость дополнительного поиска маркеров для клеток данного типа злокачественного новообразования.

Было установлено, что при раке железистых органов в опухолевых клетках наблюдается гиперэкспрессия муцина MUC1. Кроме того, для опухолевого MUC1 характерно нарушение апикальной локализации и аберрантное гликозилирование, приводящее к обнажению белкового кора в области тандемных повторов (VNTR) экстрацеллюлярного домена, в норме экранированного разветвленными олигосахаридами (Hanisch & Ninkovic, 2006). Учитывая тот факт, что VNTR опухоль-ассоциированного муцина обладает иммуногенностью, приводящей к выработке у ряда пациентов антител, взаимодействующих с дегликозилированной формой белка (von Mensdorff-Pouilly et al., 2006), можно было предположить, что VNTR, частично или полностью лишенный гликозилирования, применим при разработке противоопухолевых вакцин.

В настоящее время уже продемонстрирована эффективность вакцин, содержащих пептиды из области VNTR муцина MUC1 человека. В частности, липосомальная вакцина Stimuvax™ (Стимувакс) производства Merck KGaA (Германия) проходит клинические испытания как препарат для активной специфической иммунотерапии немелкоклеточного рака легкого (Sangha & Butts, 2007).

Для усиления индукции иммунного ответа на вакцинирующий препарат применимы белки, обладающие характеристиками суперантигенов. С этой целью могут быть использованы бактериальные энтеротоксины, для которых продемонстрирована высокая способность к неспецифической активации Т-лимфоцитов. В настоящее время достаточно подробно изучены энтеротоксины Staphylococcus aureus - определена их структура, функции и механизм активации иммунной системы. В экспериментах на мышах слитые белки, содержащие энтеротоксин A (SEA), продемонстрировали высокую эффективность при терапии солидных опухолей (Sun et al., 2011). Результаты этих экспериментов позволяют рассматривать энтеротоксины из S. aureus как перспективный иммуностимулирующий компонент вакцин и адресующих (таргетных) белков, позволяющий существенно увеличить их эффективность.

Одной из основных проблем терапии онкологических заболеваний является метастазирование, т.к. метастазы и микрометастазы трудноидентифицируемы. Тем не менее, существует ряд молекулярных маркеров, позволяющих выявить опухолевые клетки, приобретшие способность к метастазированию. Одним из таких маркеров является маркер агрессивной фазы развития меланомы - интегрин av(33. Было продемонстрировано, что в клетках меланомных линий человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, экспрессия интегрина av(33 увеличена в 50-100 раз по сравнению с экспрессией в клетках меланомных линий с низким метастатическим потенциалом (Gehlsen et al., 1992).

Исследования взаимодействия интегрина ау(3з с внеклеточными лигандами позволили установить, что к высокоаффинному связыванию с экстрацеллюлярным доменом рецептора обладает трипептид Arg-Gly-Asp (RGD).

На данный момент существует ряд противоопухолевых препаратов на основе RGD, которые уже проходят клинические испытания (Mas-Moruno et al., 2010).

Однако экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, выявили ряд требований к пространственной организации (Saudek et al., 1991) и аминокислотному окружению RGD-мотива (Hölig et al, 2004), выполнение которых обеспечивает высокую эффективность и селективность связывания агента на основе RGD с мишенью. Кроме того, необходимо подчеркнуть положительную роль «поливалентности» меланома-узнающего адреса (Kok et al., 2002) в увеличении эффективности связывания RGD-содержащего агента.

2) Отработка методов выделения и очистки рекомбинантных белков.

Научная новизна.

1) Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках Е. coli нового белка Hisi0-VNTR22. С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, ■ специфичные к природному дегликозилированному VNTR муцина MUC1, способны к связыванию рекомбинантного Hisio-VNTR22. Полученные данные указывают на подобие структуры и конформации данного белка опухоль-ассоциированному VNTR муцина MUC1 человека. Это дает возможность использования данного рекомбинантного белка при создании онковакцины.

3) Создана генетическая конструкция для гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli предшественника энтеротоксина Н из S. aureus (SEH). Продемонстрировано, что лидерный пептид SEH обеспечивает транслокацию рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток E.coli. Отработана методика хроматографической очистки рекомбинантного SEH.

4) Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках Е. coli энтеротоксина В из S. aureus, слитого со стрептавидином (SAV-SEB). Структурное подобие SEB-компонента в составе химерного белка SAV-SEB природному SEB подтверждено результатами конкурентного связывания с антителами, полученными на природный SEB. Продемонстрировано, что белок SAV-SEB проявляет митогенную активность, характерную для природных энтеротоксинов из S. aureus. Этот факт позволяет предложить данный гибридный белок в качестве иммуностимулирующего агента при создании препаратов для адресной иммунотерапии рака, в том числе, двухфазной.

Предложенные схемы получения и очистки вышеупомянутых рекомбинантных белков могут послужить основой для разработки способов получения противораковых терапевтических агентов и диагностических средств.

Практическая ценность работы.

Сконструированы экспрессионные векторы и получены штаммы-продуценты для наработки в клетках E.coli слитых белков Hisi0-VNTR22, содержащих 22 тандемных повтора из области VNTR муцина MUC1 человека. Продемонстрирована способность моноклональных антител, полученных на природный дегликозилированный VNTR муцина MUC1 человека, связывать полипептид His,0-VNTR22, что свидетельствует о наличии у полипептида His]0-VNTR22 способности презентировать опухоль-ассоциированные антигенные эпитопы. Полученные результаты раскрывают потенциал данного белка при создании диагностических средств и вакцинирующих препаратов для активной иммунотерапии и профилактики рака молочной железы. Предложена схема выделения и очистки полипептида Hísio-VNTR22. Данная схема может быть положена в основу разработки способа получения противоопухолевых вакцин.

Сконструированы экспрессионные векторы и получены штаммы продуценты для наработки в клетках E.coli энтеротоксинов из S. aureus Н (SEH) и В (SEB), слитого со стрептавидином (SAV-SEB). Для гибридного рекомбинантного белка SAV-SEB продемонстрирована способность к индукции пролиферации цитотоксических Т-лимфоцитов, сравнимая с природными SEB и SEA. Это предполагает использование данного гибридного белка в качестве иммуностимулирующего агента при создании противораковых препаратов. Предложены схемы выделения и очистки полипептидов SAV-SEB и SEH. Данные схемы могут быть положены в основу способа получения препаратов для иммунотерапии онкологических заболеваний.

Сконструированы экспрессионные векторы и получены штаммы продуценты для наработки в клетках Е. coli белков, содержащих RGD-пептид, слитой со стрептавидином (SAV). Продемонстрирована способность таких белков к узнаванию клеток меланомных линий человека и мыши. Таким образом, белки SAV-RGD могут быть использованы для создания противомеланомных терапевтических препаратов и диагностических средств посредством присоединения биотинилированного токсического или визуализирующего агента, соответственно. Предложенная схема получения и очистки белков SAV-RGD создает предпосылки для разработки способа получения терапевтических и диагностических средств.

I. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ

И ТЕРАПИИ РАКА (Обзор литературы)

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сыркина, Марина Сергеевна

выводы

Методом гетерологичной экспрессии в клетках Е. coli получены рекомбинантные белки Hisio-VNTR22, SdRIO, SdR13, SdR15, SEH, SAV-SEB которые могут быть использованы как потенциальные компоненты противоопухолевых и диагностических агентов.

1. Установлено, что рекомбинантный белок Hisi0-VNTR22, содержащий 22 тандемных повтора из области VNTR муцина MUC1 человека, формирует антигенные эпитопы, характерные для VNTR природного дегликозилированного муцина. Белок Hisi0-VNTR22 может быть использован при получении онковакцины.

2. Продемонстрирована способность гибридных белков SdRIO, SdR13 и SdR15, содержащих слитой со стрептавидином меланома-адресующий пептид (RGD10, RGD13 или RGD15, соответственно), к селективному узнаванию клеток меланомных линий человека (MeWo) и мыши (B16F10). Данные рекомбинантные белки могут найти применение в диагностике меланомы, а также при создании противомеланомных терапевтических агентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сыркина, Марина Сергеевна, Москва

1. Abe M., Kufe D. Structural analysis of the DF3 human breast carcinoma-associated protein. // Cancer Res. 1989. V. 49. P. 2834-2839.

2. Abrahmsen L., Dohlsten M., Segren S., Bjork P., Jonsson E., Kalland T. // Characterization of two distinct MHC class II binding sites in the superantigen staphylococcal enterotoxin A. EMBO J. 1995. V. 14. P. 2978-2986.

3. Albelda S.M., Mette S.A., Elder D.E., Stewart R., Damjanovich L., Herlyn M., Buck C.A. Integrin distribution in malignant melanoma: association of the beta 3 subunit with tumor progression. // Cancer Res .1990. V. 50. P. 6757-6764.

4. Allen T.M. Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy. // Nat. Rev. Cancer. 2002. V. 2. P.750-763.

5. Arnaout M.A., Goodman S.L., Xiong J.P. Structure and mechanics of integrin-based cell adhesion. // Curr Opin Cell Biol. 2007. V. 19. P. 495-507.

6. Bafna S., Kaur S., Batra S.K. Membrane-bound mucins: the mechanistic basis for alterations in the growth and survival of cancer cells. // Oncogene. 2010. V. 29. P. 2893-2904.

7. Baker M.D., Acharya K.R. Superantigens: Structure, Function, and Diversity. // Methods Mol Biol. 2003. V. 214. P. 1-31

8. Bakker A.B., Marland G., de Boer A.J., Huijbens R.J., Danen E.H., Adema

9. G.J., Figdor C.G. Generation of antimelanoma cytotoxic T lymphocytes from healthy donors after presentation of melanoma-associated antigen-derived epitopes by dendritic cells in vitro. // Cancer Res. 1995. Vol. 55. P. 5330-5334.

10. Bansil R., Turner B.S. Mucin structure, aggregation, physiological functions and biomedical applications. // Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2006. V. 11. P. 164-170

11. Baxevanis C.N., Papamichail M., Perez S.A. Toxicity profiles of HER2/neu peptide anticancer vaccines: the picture from Phase/I and II clinical trials. //

12. Expert Rev Vaccines. 2012. V. 11. P. 637-640.

13. Bayer E.A., Ben-Hur H., Hiller Y., Wilchek M. Postsecretory modifications of streptavidin. // Biochem J. 1989. V. 259. P. 369-76.

14. Belmont H.J., Price-Schiavi S., Liu B., Card K.F., Lee H.I., Han K.P., Wen J., Tang S., Zhu X., Merrill J., Chavillaz P.A., Wong J.L., Rhode P.R., Wong

15. H.C. Potent antitumor activity of a tumor-specific soluble TCR/IL-2 fusion protein. // Clin Immunol. 2006. V. 121. P. 29-39.

16. Bette M., Schafer M.K., van Rooijen N., Weihe E., Fleischer B. Distribution and kinetics of superantigen-induced cytokine gene expression in mouse spleen. // J Exp Med. 1993. V. 178. P. 1531-1539

17. Beum P.V., Bastola D.R., Cheng P.W. Mucin biosynthesis: epidermal growth factor downregulates core 2 enzymes in a human airway adenocarcinoma cell line. // Am J Respir Cell Mol Biol. 2003. V. 29. P. 48-56.

18. Bitler B.G., Menzl I., Huerta C.L., Sands B., Knowlton W., Chang A., Schroeder J.A. Intracellular MUC1 peptides inhibit cancer progression. // Clin Cancer Res. 2009. V. 15. P. 100-109.

19. Brayman M., Thathiah A., Carson D.D. MUC1: a multifunctional cell surface component of reproductive tissue epithelia. // Reprod Biol Endocrinol. 2004. V. 2. P. 4-13.

20. Bringmann A., Held S.A., Heine A., Brossart P. RNA vaccines in cancer treatment. // J Biomed Biotechnol. 2010. V. 2010 P. 1-12.

21. Buckle A.M., Schreiber G., Fersht A.R. Protein-protein recognition: crystal structural analysis of a barnase-barstar complex at 2.0-A resolution. // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 8878-8889.

22. Burchell J, Taylor-Papadiiiiitriou J. Boshell M, Gendler S, Duhig. T. A short sequence, within the amino acid tandem repeat of a cancer-associated mucin, contains immunodominant epitopes. // Int J Cancer. 1989. V. 44. P. 691 -696.

23. Ceballos C. Adopting Molecular Tools for Diagnosis and Monitoring Malignant Hematological Disease: From Morphology to Genetic-Molecular Profile. //Cancerologia. 2007. V. 2. P. 121-136.

24. Chuang KH, Wang HE, Chen FM, Tzou SC, Cheng CM, Chang YC, Tseng WL, Shiea J, Lin SR, Wang JY, Chen BM, Roffler SR, Cheng TL. Endocytosis of PEGylated Agents Enhances Cancer Imaging and Anticancer Efficacy. // Mol Cancer Ther. 2010. V. 9. P. 1903-1912.

25. Conrads T.P, Zhou M, Petricoin E.F, Liotta L. and Veenstra T.D. Cancer diagnosis using proteomic patterns. // Expert Rev. Mol. Diagn. 2003. V. 3. P. 411-420.

26. Croce M.V, Isla-Larrain M.T, Capafons A, Price M.R, Segal-Eiras A. Humoral immune response induced by the protein core of MUC1 Mucin in pregnant and healthy women. // Breast Cancer Res. Treat. 2001, V. 69. P. 1-11.

27. Dalerba P, Cho R.W, Clarke M.F. Cancer stem cells: models and concepts. // Annu Rev Med. 2007. V. 58, P. 267-84.

28. Decoster L., Wauters I., Vansteenkiste J.F. Vaccination therapy for non-small-cell lung cancer: review of agents in phase III development. // Ann Oncol. 2012 V. 23. P. 1387-1393.

29. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module. // Nature Biotechnology. 2003. V. 21. P. 1486-1492.

30. Dinges M.M., Orwin P.M., Schlievert P.M. Exotoxins of Staphylococcus aureus. // Clin. Microbiol. Rev. 2000. V. 13. P. 16 34.

31. Dong, Y.; Walsh, M.D.; Cummings, M.C.; Wright, R.G.; Khoo, S.K.; Parson, P.G.; McGuckin, M.A. Expression of MUC1 and MUC2 mucins in epithelial ovarian tumors. //J. Pathol. 1997. V. 183. P. 311-317

32. Dubey P.K., Mishra V., Jain S., Mahor S., Vyas S.P. Liposomes modified with cyclic RGD peptide for tumor targeting. // J Drug Target. 2004. V. 12. P. 257264.

33. Edelhoch H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. //Biochemistry. 1967. V. 6. P. 1948-54.

34. Farlow S.J., Wang R.J., Pandori M.W., Sano T. A chimera of a gelatinase inhibitor peptide with streptavidin as a Afunctional tumor targeting reagent. // FEBS Lett. 2002. V. 516. P. 197-200.

35. Finn O.J. Cancer Immunology. // N Engl J Med. 2008. V. 358. P. 2704-2715.

36. Fioretti D., Iurescia S., Fazio V.M., Rinaldi M. DNA vaccines: developing new strategies against cancer. // J Biomed Biotechnol. 2010 V. 2010. P. 174378.

37. Fong L., Brockstedt D., Benike C., Wu L., Engleman E.G. Dendritic cells injected via different routes induce immunity in cancer patients. // J Immunol. 2001. V. 166. P. 4254-4259.

38. Fraser J.D. Clarifying the mechanism of superantigen toxicity. // PLoS Biol. 2011. V. 9. P. el001145.

39. Gehlsen K.R., Davis G.E., Sriramarao P. Integrin expression in human melanoma cells with differing invasive and metastatic properties. // Clin Exp Metastasis. 1992. V. 10. P. 111 -120.

40. Gendler S.J., Spicer A.P., Lalani E.N., Duhig T., Peat N., Burchell J., Pemberton L., Boshell M., Taylor-Papadimitriou J. Structure and biology of a carcinoma-associated mucin, MUC1. //Am. Rev. Respir. Dis. 1991. V. 144. P. 42 47.

41. Gendler S., Taylor-Papadimitriou J., Duhig T., Rothbard J., Burchell J. A highly immunogenic region of a human polymorphic epithelial mucin expressed by carcinomas is made up of tandem repeats. // J.Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 12820- 12823.

42. Greaves M., Maley C.C. Clonal evolution in cancer. // Nature. 2012. V. 481. P. 306-313.

43. Green N.M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. // Biochem J. 1963. V. 89. P. 599-609.

44. Gurrath M., Millier G., Kessler H., Aumailey M., Timple R. Conformation/activity studies of rationally designed potent anti-adhesive RGD peptides. //Eur J Biochem 1992. V. 210. P. 911-921.

45. Haluskovâ J. Epigenetic studies in human diseases. // Folia Biol. 2010. V. 56. P. 83-96.

46. Han Y., Albericio F., Barany G. Occurrence and Minimization of Cysteine Racemization during Stepwise Solid-Phase Peptide Synthesis(l)(,)(2). // J Org Chem. 1997. V. 62. P. 4307^312.

47. Hanisch F.-G., Muller S. MUC1: the polymorphic appearance of a human mucin. // Glycobiology. 2000. V. 10. P. 439-449.

48. Hanisch F.G.; Ninkovic T. Immunology of O-glycosylated proteins: Approaches to the design of a MUC1 glycopeptide-based tumor vaccine. // Curr. Protein Pept. Sci. 2006. V. 7. P. 307-315.

49. Hartley R.W. Barnase-barstar interaction. // Methods Enzymol. 2001. V. 341. P. 599-611.

50. Hilkens J., Ligtenberg J.L., Vos H.L., Litvinov S.V. Cell membrane-associated mucins and their adhesion-modulating property. // Trends Biochem Sei. 1992. V. 17. P. 359-363.

51. Hofmann K., Wood S.W., Brinton C.C., Montibeller J.A., Finn M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. // Proc Natl Acad Sei USA. 1980. V. 77. P. 4666-4668.

52. Hölig P., Bach M., Völkel T., Nahde T., Hoffmann S., Müller R., Kontrmann R.E. Novel RGD lipopeptides for the targeting of liposomes to integrin-expressing endothelial and melanoma cells. // Protein Eng Des Sei. 2004. V. 17. P. 433-441.

53. Hollingsworth M.A., Swanson B.J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. // Nat Rev Cancer. 2004. V. 4. P. 45-60.

54. Hoption Cann S.A., van Netten J.P., van Netten C. Dr William Coley and tumour regression: a place in history or in the future. // Postgrad Med J. 2003. V. 79. P. 672-680.

55. Huang L., Liao X., Beckett M., Li Y., Khanna K.K., Wang Z., Kharbanda S., Weichselbaum R., Kufe D. MUC1-C Oncoprotein Interacts Directly with ATM and Promotes the DNA Damage Response to Ionizing Radiation. // Genes Cancer. 2010. V. 1. P. 239-250.

56. Huang L.^Ren J., Chen D., Li Y., Kharbanda S., Kufe D. MUC1 cytoplasmic domain coactivates Wnt target gene transcription and confers transformation. // Cancer Biol Ther. 2003. V. 2. P. 702-706.

57. Huang Z.H., Shi L., Ma J.W., Sun Z.Y., Cai H., Chen Y.X., Zhao Y.F., Li Y.M. A totally synthetic, self-assembling, adjuvant-free MUC1 glycopeptide vaccine for cancer therapy. // J Am Chem Soc. 2012. V. 134. P. 8730-8733.

58. Hudis C.A. Trastuzumab — Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. // N Engl J Med. 2007. V. 357. P. 39-51.

59. Hynes R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. // Cell. 2002. V. 110. P. 673-687.

60. Inouye S., Sato J., Sasaki S., Sahara Y. Streptavidin-aequorin fusion protein for bioluminescent immunoassay. // Biosci Biotechnol Biochem. 2011. V. 75. P. 568-571.

61. Ito K., Bassford P.J. Jr., Beckwith J. Protein localization in E. coli: is there a common step in the secretion of periplasmic and outer-membrane proteins? // Cell. 1981. V.24. P. 707-717.

62. Izard J.W., Kendall D.A. Signal peptides: exquisitely designed transport promoters. // Mol. Microbiol. 1994. V.13. P. 765 773.

63. Jemal A., Bray F., Center M.M., Ferlay J., Ward E., Forman D. Global cancer statistics. // CA Cancer J Clin. 2011. V. 61. P. 69-90.

64. Joshi B.P, Wang T.D. Exogenous Molecular Probes for Targeted Imaging in Cancer: Focus on Multi-modal Imaging. // Cancers. 2010. V. 2. P. 1251-1287.

65. Julian J, Dharmaraj N, Carson D.D. MUC1 is a substrate for gamma-secretase. // J Cell Biochem. 2009. V. 1084. P. 802-815.

66. Jungbluth A.A, Chen Y.T, Stockert E, Busam K.J, Kolb D, Iversen K, Copian K, Williamson B, Altorki N, Old L.J. Immunohistochemical analysis of NY-ESO-1 antigen expression in normal and malignant human tissues. // Int J Cancer. 2001. V. 92. P. 856-860.

67. Kaminskas L.M, Kelly B.D, McLeod V.M, Sberna G, Owen D.J, Boyd B.J, Porter C.J. Characterisation and tumour targeting of PEGylated polylysine dendrimers bearing doxorubicin via a pH labile linker. // J Control Release. 2011. V. 152. P. 241-248.

68. Kay B.K, Thai S, Volgina V.V. High-throughput biotinylation of proteins. // Methods Mol Biol. 2009. V. 498. P. 185-196.

69. Kempf A.C., Zanger U.M., Meyer U.A. Truncated human P450 2D6: expression in Escherichia coli, Ni(2+)-chelate affinity purification, and characterization of solubility and aggregation. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 20. P. 277-288.

70. Khodarev NN, Pitroda SP, Beckett MA, MacDermed DM, Huang L, Kufe DW, Weichselbaum RR. MUC1-induced transcriptional programs associated with tumorigenesis predict outcome in breast and lung cancer. // Cancer Res. 2009. V. 69. P. 2833-2837.

71. Koivenen E., Wang B., Ruoslahti E. Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes ligand specificities of the RGD-directed integrins. // Biotechnology. 1995. V. 13. P. 265-70.

72. Krakauer T. Immune response to staphylococcal superantigens. // Immunol. Res. 1999. V.20. P. 163- 173.

73. Kramer R.H., Vu M., Cheng Y.F., Ramos D.M. Integrin expression in malignant melanoma. // Cancer Metastasis Rev. 1991. V. 10. P. 49-59.

74. Krivenko M.S., Voyushin K.E., Gul'ko L.B., Okorokova N.A., Levitsky S.A., Mukharyamova K.Sh., Veiko V.P. Cloning of mucin (MUC1) gene and studing of its expression in eucaryotic cells// Conference for young scientists,

75. PhD students and students on molecular biology and genetics. Kyiv (Ukraine). 2003. P.171.

76. Kuroda K., Liu H., Kim S., Guo M., Navarro V., Bander N.H.Saporin toxin-conjugated monoclonal antibody targeting prostate-specific membrane antigen has potent anticancer activity. // Prostate. 2010. V. 70. P. 1286-1294.

77. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

78. Lambert L.A., Gibson G.R., Maloney M., Durell B., Noelle R.J., Barth R.J. Intranodal immunization with tumor lysate-pulsed dendritic cells enhances protective antitumor immunity. // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 641-646.

79. Lamphear J.G., Bohach G.A., Rich R.R. Structural dichotomy of staphylococcal enterotoxin C superantigens leading to MHC class II-independent activation of T lymphocytes. // J Immunol. 1998. V. 160. P. 21072114.

80. Leng Y., Cao C., Ren J., Huang L., Chen D., Ito M., Kufe D. Nuclear import of the MUC1-C oncoprotein is mediated by nucleoporin Nup62. // J Biol Chem. 2007. V.- 282. P. 19321-19330.

81. Levitin F., Stern O., Weiss M., Gil-Henn C., Ziv R., Prokocimer Z., Smorodinsky N.I., Rubinstein D.B., Wreschner D.H. The MUC1 SEA module is a self-cleaving domain. // J Biol Chem. 2005. V. 280. P. 33374-33386.

82. Li H., Llera A., Malchiodi E.L., Mariuzza R.A. The structural basis of T cell activation by superantigens. // Annu Rev Immunol. 1999. V. 17. P. 435-466.

83. Li Y., Ren J.,Yu W., Kuwahara H., Yin L., Carraway K.L. 3rd, Kufe D. The epidermal growth factor receptor regulates interaction of the human DF3/ MUC1 carcinoma antigen with c-Src and h-catenin. // JBiol Chem. 2001 V. 276. P.35239-35242.

84. Lillehoj E.P., Kim H., Chun E.Y., Kim K.C. Pseudomonas aeruginosa stimulates phosphorylation of the airway epithelial membrane glycoprotein Mucl and activates MAP kinase. // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2004. V. 287P. L809-815.

85. Limacher J.M., Quoix E. TG4010: A therapeutic vaccine against MUC1 expressing tumors. // Oncoimmunology. 2012. V. 1. P. 791-792.

86. Linde S.K., Sheng Y.H., Every A.L., Miles K.M., Skoog E.C., Florin T.J,. Sutton P., McGuckin M.A. MUC1 Limits Helicobacter pylori Infection both by Steric Hindrance and by Acting as a Releasable Decoy // PLoS Pathog. 2009. V. 5.P. el000617.

87. Lu S.Y., Sui Y.F., Li Z.S., Ye J., Dong H.L., Qu P., Zhang X.M., Wang W.Y., Li Y.S. Superantigen-SEA gene modified tumor vaccine for hepatocellular carcinoma: an in vitro study. // World J Gastroenterol. 2004. V. 10. P. 53-57.

88. Malhotra V., Perry M.C. Classical chemotherapy: mechanisms, toxicities and the therapeutic window. // Cancer Biol Ther. 2003. V. 2. P. S2-S4.

89. Mas-Moruno C., Rechenmacher F., Kessler H. Cilengitide: the first anti-angiogenic small molecule drug candidate design, synthesis and clinical evaluation. // Anticancer Agents Med Chem. 2010. V. 10. P. 753-768.

90. Millard M., Odde S., Neamati N. Integrin targeted therapeutics. // Theranostics. 2011. V. 1. P. 154-88.

91. Mittrucker H.W., Shahinian A., Bouchard D., Kundig T.M., Мак T.W. Induction of unresponsiveness and impaired T cell expansion by staphylococcal enterotoxin В in CD28-deficient mice. // J Exp Med. 1996. V. 183. P. 2481-2488.

92. Morrison R., Schleicher S.M., Sun Y., Niermann K.J., Kim S., Spratt D.E., Chung C.H., Lu B. Targeting the mechanisms of resistance to chemotherapy and radiotherapy with the cancer stem cell hypothesis. // J Oncol. 2011. V. 2011. P.941876.

93. Mosolits S., Ullenhag G., Mellstedt H. Therapeutic vaccination in patients with gastrointestinal malignancies. A review of immunological and clinical results // Ann. Oncol. 2005. V. 16. P. 847-862.

94. Morse M.A., Coleman R.E., Akabani G., Niehaus N., Coleman D., Lyerly H.K. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastatic malignancies. // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 56-58.

95. Mukhopadhyay P., Chakraborty S., Ponnusamy M.P., Lakshmanan I., Jain M., Batra S.K. Mucins in the pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis, prognosis and therapy. // Biochim Biophys Acta. 2011. V. 1815. P. 224-240.

96. Nestle F.O., Alijagic S., Gilliet M., Sun Y., Grabbe S., Dummer R., Burg G., Schadendorf D. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic cells // Nat. Med. 1998. V. 4. P. 328-332.

97. Nilsson H., Bjork P., Dohlsten M., Antonsson P. Staphylococcal enterotoxin H displays unique MHC class II-binding properties. // J Immunol. 1999. V.163. P. 6686-6693.

98. O'Donoghue J.A., Bardies M., Wheldon T.E. Relationships between tumor size and curability for uniformly targeted therapy with beta-emitting radionuclides. // J Nucl Med. 1995. V. 36. P. 1902-1909.

99. Ozaki H., Matsuzaki H., Ando H., Kaji H., Nakanishi H., Ikehara Y., Narimatsu H. Enhancement of metastatic ability by ectopic expression of ST6GalNAcI on a gastric cancer cell line in a mouse model. !L Clin Exp Metastasis. 2012. V.29. P. 229-238.

100. Pace C.N. Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. // Protein Science. 1995. V. 4. P. 2411-2423.

101. Palasek S.A., Cox Z.J., Collins J.M. J. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. // J Pept Sci. 2007. V. 13. P. 143-148.

102. Patton S., Gendler S.J., Spicer A.P. The epithelial mucin, MUC1, of milk, mammary gland and other tissues. // Biochim Biophys Acta. 1995. V. 1241. P. 407-423.

103. Pattillo C.B., Sari-Sarraf F., Nallamothu R., Moore B.M., Wood G.C., Kiani M.F. Targeting of the antivascular drug combretastatin to irradiated tumors results in tumor growth delay. // Pharm Res. 2005. V. 22 P. 1117-1120.

104. Pellet-Many C, Frankel P, Jia H, Zachary I. Neuropilins: structure, function and role in disease. Biochem J. 2008 Apr 15;411(2):211-26.

105. Pleasance E.D., Cheetham R.K., Stephens P.J., McBride D.J., Humphray S.J., Greenman C.D. et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome // Nature. 2010. V. 463. P. 191-196.

106. Pochampalli M.R., el Bejjani R.M., Schroeder J.A. MUC1 is a novel regulator of ErbBl receptor trafficking. // Oncogene. 2007. V. 26. P. 1693-1701.

107. Rabinovich G.A., Gabrilovich D., Sotomayor E.M. Immunosuppressive strategies that are mediated by tumor cells. // Annu Rev Immunol. 2007. V. 25. P. 267-296.

108. Rahn J.J., Chow J.W., Home G.J., Mah B.K., Emerman J.T., Hoffman P., Hugh J.C. MUC1 mediates transendothelial migration in vitro by ligating endothelial cell ICAM-1. // Clin Exp Metastasis. 2005. V. 22. P. 475-^83.

109. Rajabi H., Jin C., Ahmad R., McClary C., Joshi M., Kufe D. Mucin 1 oncoprotein expression is supressed be the miR-125b oncomir // Genes Cancer. 2010. V. 1. P. 62-68.

110. Ranelli D.M, Jones C.L, Johns M.B, Mussey G.J, Khan S.A. Molecular cloning of staphylococcal enterotoxin B gene in Escherichia coli and Staphylococcus aureus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V.82. P. 58505854.

111. Rasku M.A, Clem A.L, Telang S, Taft B, Gettings K, Gragg H, Cramer D, Lear S.C, McMasters K.M, Miller D.M, Chesney J. Transient T cell depletion causes regression of melanoma metastases. // J Transl Med. 2008. V. 6. P. 1-18.

112. Reardon D.A, Nabors L.B, Stupp R, Mikkelsen T. Cilengitide: an integrin-targeting arginine-glycine-aspartic acid peptide with promising activity for glioblastoma multiforme. // Expert Opin Investig Drugs. 2008. V. 17. P. 12251235.

113. Ren J, Bharti A, Raina D, Chen W, Ahmad R, Kufe D. MUC1 oncoprotein is targeted to mitochondria by heregulin-induced activation of c-Src and the molecular chaperone HSP90. // Oncogene. 2006. V. 25. P. 20-31.

114. Ren K, Bannan J.D, Pancholi V, Cheung A.L, Robbins J.C, Fischetti V.A, Zabriskie J.B. Characterization and biological properties of a new staphylococcal exotoxin. // J. Exp. Med. 1994. Y.180. P. 1675-1683.

115. Ries F, Klastersky J. Nephrotoxicity induced by cancer chemotherapy with special emphasis on cisplatin toxicity. // Am J Kidney Dis. 1986. V. 8. P. 36879.

116. Saha B., Harlan D.M., Lee K.P., June C.H., Abe R. Protection against lethal toxic shock by targeted disruption of the CD28 gene. // J Exp Med. 1996. V. 183. P. 2675-2680.

117. Saline M., Rodstrom K.E., Fischer G., Orekhov V.Y., Karlsson B.G., Lindkvist-Petersson K. The structure of superantigen complexed with TCR and MHC reveals novel insights into superantigenic T cell activation. // Nat Commun. 2010. V. 1 P. 119.

118. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Vol. 1, 2, 3; 2nd edition // New York; Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. V.l-3.

119. Sangha R., Butts C. L-BLP25: a peptide vaccine strategy in non small cell lung cancer. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. P. s4652-s4654.

120. Sano T., Glazer A.N., Cantor C.R. A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials withmany different heavy metal ions. // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89. P. 1534-1538.

121. Saudek V., Atkinson R.A., Pelton J.T. Three-dimensional structure of echistatin, the smallest active RGD protein. // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 7369-7372.

122. Senapati S., Das S., Batra S.K. Mucin-interacting proteins: from functions to terapeutics. // Trends Biochem Sei. 2010. V. 35. P. 236-45.

123. Schmitz, M.L., Baeuerle, P.A. Bacterial expression, purification, and potential use of His-tagged GAL4 fusion proteins. // Methods Mol. Biol. 1997. V. 63. P. 129-137.

124. Schreiber G. Methods for studying the interaction of barnase with its inhibitor barstar. // Methods Mol. Biol. 2001. V. 160. P. 213-226.

125. Schroeder J.A., Adriance M.C., Thompson M.C., Camenisch T.D., Gendler S.J. MUC1 alters ß-catenin-dependent tumor formation and promotes cellular invasion. // Oncogene. 2003. V. 22. P. 1324-1332.

126. Siddiqui M.A., Perry C.M. Human papillomavirus quadrivalent (types 6, 11, 16, 18) recombinant vaccine (Gardasil). // Drugs. 2006. V. 66. P. 1263-1271.

127. Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. // Annu Rev Immunol. 1991. V. 9. P. 271-296.

128. Studier F.W., Rosenberg A.H. Dunn JJ, Dubendorff JW. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. //Methods in Enzymology. 1990. V. 185. P. 60-89.

129. Su Y.C., Wong A.C. Identification and purification of a new staphylococcal enterotoxin, H. // Appl Environ Microbiol. 1995. V.61. N.4. P. 1438-1443.

130. Sugahara K.N., Teesalu T., Karmali P.P., Kotamraju V.R., Agemy L., Girard O.M., Hanahan D., Mattrey R.F., Ruoslahti E. Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors. // Cancer Cell. 2009. V. 16. P. 510520.

131. Sun J., Zhao L., Teng L., Lin F., Zhang H., Li Z., Gao Q. Solid tumor-targeted infiltrating cytotoxic T lymphocytes retained by a superantigen fusion protein. // PLoS One. 2011. V. 6. P. el6642.

132. Sundaram R., Dakappagari N.K., Kaumaya P.T. Synthetic peptides as cancer vaccines. // Biopolymers. 2002. V. 66. P. 200-216.

133. Suntharalingam G., Perry M.R., Ward S., Brett S.J., Castello-Cortes A., Brunner M.D., Panoskaltsis N. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. // N Engl J Med. 2006. V. 355. P. 1018-1028.

134. Szarewski A. Cervarix®: a bivalent vaccine against HPV types 16 and 18, with cross-protection against other high-risk HPV types. // Expert Rev Vaccines. 2012. V. 11. P. 645-57.

135. Tjalsma H., Bolhuis A., Jongbloed J.D., Bron S., van Dijl J.M. Signal peptide-dependent protein transport in Bacillus subtilis: a genome-based survey of the secretome. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V.64. P. 515-547.

136. Thornton D.J., Rousseau K., McGuckin M.A. Structure and function of the polymeric mucins in airways mucus. // Annu. Rev. Physiol. 2008. V. 70. P. 459-486.

137. Varner J.A., Cheresh D.A. Integrins and cancer. // Curr Opin Cell Biol. 1996. V. 8. P. 724-730.

138. Vermeer P.D., Einwalter L.A., Moninger T.O., Rokhlina T., Kern J.A., Zabner J., Welsh M.J. Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor. // Nature. 2003. V. 422. P. 322-326.

139. Wegener K.L., Partridge A.W., Han J., Pickford A.R., Liddington R.C., Ginsberg M.H., Campbell I.D. Structural basis of integrin activation by talin. // Cell. 2007. V. 128. P. 171-182.

140. Wei X., Xu H., and Kufe D. Human MUC1 oncoprotein regulates p53-responsive gene transcription in the genotoxic stress response. // Cancer Cell. 2005 V. 7. P. 167-178/

141. Wei R.D. // Methods Enzymol. 1970. V. 18A. P. 424 427.

142. Wesseling J., van der Valk S.W., Hilkens J. A mechanism for inhibition of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion by the membrane-associated mucin episialin/MUC 1. // Mol Biol Cell. 1996. V. 7. P. 565-577.

143. Wülfing C., Plückthun A. Correctly folded T-cell receptor fragments in the periplasm of Escherichia coli. Influence of folding catalysts. // J Mol Biol. 1994. V. 242. P. 655-669.

144. Xia H.P. Great Potential of MicroRNA in Cancer Stem Cell MicroGene. // J. Cancer Mol. 2008. V. 4. P. 79-89.

145. Xiong J.P., Stehle T., Zhang R., Joachimiak A., Frech M., Goodman S.L., Arnaout M.A. Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand. // Science. 2002. V. 296. P. 151-155.

146. Xu M., Wang X., Cai Y., Zhang H., Yang H., Liu C., Zhang C. An engineered superantigen SEC2 exhibits promising antitumor activity and low toxicity. // Cancer Immunol Immunother. 2011. V.60. P. 705-713.

147. Xue L.Y., Chiu S.M., Oleinick N.L. Atg7 deficiency increases resistance of MCF-7 human breast cancer cells to photodynamic therapy. // Autophagy. 2010. V. 6. P. 248-255.

148. Zhou X., Hu W., Qin X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B-cell lymphoma: implications for therapy. // Oncologist. 2008. V. 13. P. 954-966.

149. Вейко В.П., Гулько Л.Б., Окорокова H.A., Дьяков H.A., Дебабов В.Г. Клонирование гена стрептавидина из Streptomyces avidinii и его экспрессия в Escherichia coli. Секреция стрептавидина клетками Е. coli. // Биоорган, химия. 1999. Т.25. №3. С. 184-188.

150. Вейко В.П., Сипрашвили 3.3., Ратманова К.И., Гулько Л.Б., Андрюхина Р.В., Дебабов В.Г. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli тимидинфосфорилаэы под контролем промотора урдинфосфорилазы // Биотехнология. 1994. № 4. С. 2-4.

151. Волченко H.H., Славнова E.H. Цитологические критерии диагностики рака щитовидной железы. // Сибирский онкологический журнал. 2006. Т. 19. №3. С. 5-7.

152. Гулько Л.Б., Воюшин К.Е., Окорокова H.A., Кривенко М.С., Ратманова К.И., Вейко В.П., Дебабов В.Г. // Биотехнология. 2003, №5, 81-87.

153. Гулько Л.Б., Окорокова H.A., Воюшин К.Е., Дьяков H.A., Честухина Г.Г., Вейко В.П., Дебабов В.Г. Получение полипептидного препарата VNTR{22}(MUC1) с потенциальной вакцинирующей противоопухолевой активностью // Биотехнология. 2000. № 3. С. 3-8.

154. Дыхно Ю.А, Селин С.М, Батухтина Ю.В. Результаты хирургического лечения больных кардиоэзофагеальным раком. // Сибирский онкологический журнал. 2003. Т.6. №2 С. 30-32.

155. Имянитов Е.Н, Хансон К.П. Молекулярная генетика в клинической онкологии. // Сибирский онкологический журнал 2004. Т. 10-11. №2-3. С. 40-47.

156. Лукашина М.И., Смирнова A.B., Алиев В.А., Самойленко И.В., Семенов H.H., Вейко В.П., Михайлова И.Н., Барсуков Ю.А., Барышников А.Ю. Дендритные вакцины в терапии колоректального рака. // Вестник РОНЦ им. H. Н. Блохина РАМН, 2008. Т. 19, №3. С. 35-42.

157. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей. // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 8. С. 32-40.

158. Поляновский O.JL, Лукаш C.B., Стремовский O.A., Карпенко Д.В., Деев С.М. Экспрессия рекомбинантных генов противораковых IgE- и IgG-подобных антител в эукариотических клетках. 2008. Т. 44. № 8. С. 10231028.

159. Порханова Н.В. Значение биомаркеров для формирования групп риска и ранней диагностики опухолей (на примере рака яичников и рака молочной железы). // Практическая онкология 2011. Т. 12. № 4. С. 155165.

160. Сакаева Д.Д. Адъювантное и неоадъювантное лечение больных раком ободочной и прямой кишки. // Практическая онкология. 2005. Т. 6. № 2. С. 103-111.

161. Степанов В.М. Молекулярная Биология. Структура и функции белков./Под ред. A.C. Спирина // М.: Высш. шк. 1996. С. 111-113.

162. Суслова В.А. Поздние лучевые осложнения у больных раком шейки матки после сочетанной лучевой и химиотерапии с использованием брахитерапии низкой мощностью дозы в импульсном режиме. // Онкологический журнал 2010. Т. 4. №1. С. 61-65.

163. Тюбиана М., Дютрекс Ж., Дютрекс А. Физические основы лучевой терапии и радиобиологии. // Медицина М.1969.

164. Дарьялова C.J1., Бойко A.B., Черниченко A.B. Современные возможности лучевой терапии злокачественных опухолей. //Рос. онкол. журн. 2000. № 1 С. 48-55.

165. Флуер Ф.С., Вейко В.П., Гулько Л.Б., Воюшин К.Е., Веткова Л.Г., Прохоров В.Я. Получение энтеротоксической сыворотки к стафилококковому энтеротоксину типа Н (SEH). // VI Российский съезд врачей-инфекционистов. Санкт-Петербург (Россия). 2003.

166. Якубовская Р.И., Кармакова Т.А., Манзюк Л.В., Артамонова Е.В. Результаты І-ІІ фазы клинических испытаний препарата Имутеран. // Российский биотерапевтический журнал. 2006. N 2. С. 93-97.

Информация о работе

Сыркина, Марина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы