Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантной фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы с LISTERIA MONOCYTOGENES и оценка ее диагностической значимости

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантной фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы с LISTERIA MONOCYTOGENES и оценка ее диагностической значимости"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ мм.Н.ф.ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

ЕРМОЛАЕВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОСалТН'ЧЛННОЗИТОЛ-СПЕЦИФИЧНОЙ •ЮС*ОЛИПАЭЫ С ЫЭТЕША МОМОСУТООЕМЕЭ И ОЦЕНКА ЕЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ

ЗНАЧИМОСТИ

(03.00.07 - микробиология) (03.00.15 -'генетика)

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени Институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.».Гамалеи Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители: доктор Биологических наук

И.С.Тартаковский доктор биологических наук А.Л.Гинцбург Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Е.А.Ведьмина

доктор биологических наук Т.С.Ильина

Ведущее учреждение: Московская медицинская академия

ям.И.М.Сеченова

Зацита состоится 'ЛО 1995г-

часов на заседании специализированного Совета К 001.07.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098 Москва, ул.Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИН эпидемиологии я микробиологии им Н.*.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор медицинских наук

Е.Н.Коптелова

Актуальность темы

К концу ХХ-ого века в силу изменения экологической обстановки и условий жизни людей значительную роль в структуре инфекционной патологии сталк играть возбудители оппортунистически» такие ti-tCiiA monnr-y*r^Jues, Levion~11ä pneumophz /а, Klebsi-

ella aerogenes, Pseudomonas aeroginosa и др.

С начала 80-х было зарегистрировано несколько крупных вспышек листериоза с высоким процентом смертности. В связи с этим резко усилился интерес к изучению механизмов патогенности возбудителя лнстерноэа L.monocytogenes.

Одним из факторов патогенности листернй является фосфатиди-линоэитол-специфнчная фосфолнпаэа С (PI-PLC). Листериоэная PI-PLC принадлежит к семейству бактериальных секретируемых фосфолипаэ, специфичных к липиду эукарнотнческой мембраны фосфатидилинозитолу. Высокий процент гомологии и сходство функционирования этих ферментов с эукариотическимн фосфолнпазами привели к предположению о возможной имитации бактериальными фосфолипаэами действия эукарио-тических (Ikezaws, 1936). Эукарнотнческне фосфолипазы, как было установлено в начале 80-х, являются ключевыми ферментами в регуляции многих внутриклеточных процессов эукариот. Продуцируя собственные ессфолипаэы, бактерия могла бы изменять метаболизм эука-риотической клетки п нужном для себя направлении, например, ингк-бкруя бактерицидный отпет, приспосабливая обмен веществ эукарнотнческой клетки к метаболическим потребностям бактерии и тому подобным образом.

Мутанты I.monocytogenes, дефектные по гену PI-PLC ptcA демонстрирует пониженную вирулентность. Это свидетельствует о необ-

ходимости PI-PLC для полного проявления вирулентных свойств лис-терий. С другой стороны было показано, что ген PI-PLC plcA присутствует только у патогенных представителей рода Listeria, что делает его потенциальный маркером для дифференциации патогенных к непатогенных листернй.

Таким образом,-изучение PI-PLC L. monocytogenes имеет как глубокий научный интерес, так и практическое значение.

Пель и задачи исследования

Цель» работы было изучение . экспрессии клонированного гена фосфатидилиноэктол-специфичной фосфолипазы С (PI-PLC) L,monocytogenes в В.col i, и возможности использования PI-PLC и ее гена в качестве видоспецифических маркеров.

Для достижения »той цели были поставлены следующий задачи«

- клонирование гена PI-PLC р1сЛ в В. coi i м конструирование рекомбинантных плазмнд, необходимых для изучения его экспрессии;

- сравнение уровня экспрессии гена plcA в В.col i из-под собственного и ге1-ерологичного промоторов;

- получение инмунореактивного рекомбинантного белка, на основе создания гибридного белка, Protein А :: PI-PLC

«в

- получение мокоспецифической антисыворотки к PI-PLC]

- скрининг коллекции штаммов L.monocytogenes на предмет изучения продукции ими PI-PLC;

- разработка системы для выявления L.monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции;

-апробация разработанной системы в условиях экспериментального заражения мишей.

Научная новизна работц

В результате изучения клонированного гена PI-PLC L.monocytogenes plcA детально исследованы процессы его транскрипции н трансляции в E.coli.

Создана оригинальная геннч« j ибоилинй ген

st>a: t г>1 СЛ, З'-кои«'; готорого представляет собой фрагмент гена зря Белка A (Protein A) S. aureus, а З'-конец - геи PI-PLC plcA.

Показано, что Гибридный белок Protein A::PI-PLC эаспрессиру-ется в E.coli в виде полноразмерного продукта. Разработана технология очистки гибридного белка Protein А :: PI-PLC.

Установлено, что поликлональная антисыворотка к гибридному белку Protein А :: PI-PLC способна выявлять иатнвкую PI-PLC, что свидетельствует о тон, что входя в состав гибридного белца, PI-PLC сохраняет, по крайней мере частично, антигенные детерминанты и, следовательно, нативную конформацию.

Впервые установлен факт наличия значительных вариаций в уровне экспрессии PI-PLC разными штаммами L.monocytogenes.

Практическую значимость работы составляет создание амплифи-кацнонных систем для выявления I.monocytogenes, основанных на последовательностях генов PI-PLC ¡>1сА и листериолизина hly. Обе системы являются видоспецифнчными и высокочувствительными. Чувствительность систем« на основе гена plcA достигает 1000 клеток в образце, чувствительность системы на основе гена hly колеблется между 10 и 100 клетками в образце. Разработана методика, позволяющая выявлять L.monocytogenes с помощью амплнфикационных систем в тканях животных.

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела - Медицинской Микробиологии НИИЭМ ни.Н.Ф.Гамалеи

РАМН (16 нюня 1994г.) По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции по проблемам листериоза (1993г., Покров), на У1|сонференции "Новые направления в биотехнологии" (1994г., Пуцино).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста м иллюстрирована 20-ю рисунками и 5-ю таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований я их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 100 источников.

Работа выполнена на базе лабораторий легмонеллеза (руководитель - доктор биологических наук И.С.Тартаковский) и лаборатории молекулярной генетики патогенных микроорганизмов (руководитель -доктор биологических наук А.Л.Гинцбург).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Использованные атаммы и плазмиды

В работе 'были использованы атаимы микроорганизмов н плазмиды, приведенные в таблица 1.

нрлзкулярнр-генетичзскнс МСТРДН

Выделение хромосомной ДНК L.monocytogenes проводили методом Marmuг et al (1961).

Аналитическое выделение плазмидной ДНК hj B.coli проводили методой Holmes and Quigly (1981). Препаративное выделение проводили методом Birnboim and Doly (1979).

Расцепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, электрофоретичес-сое разделение фрагментов ДНК, трансформацию B.coii осуществляли как описано в руководстве Маниатнс и др.(1984).

Таблица 1 Использование штаммы н пл&эмнди

серогруппа или описание

ИСТОЧНИК

Listeria полосу testasa EGD

КСТС 5343 NCTC 5214 КСТС 10527 КСТС 19117 55143

Кост»ченбо

Нелюбова 12

Q12 -75

PSÖ-32

p::-sr>

i P87-34S j РЗО-124 j Р53-194 1 Q3-14 Р27-Н7 273-316

Р25-84

Р40-14 : - . • ■ РЗО-130 lirtsri-i iahoi

'.ICC 3723.

SLCC'3379 Listecia

SLC? 13/1Ofi

! pzibootiiae

321

128

BncllJua subti Из

*63

Bacillus сегсия lanion*\ls. pssumophiia Mycoplasma fermeat&a Mycoplasma pneumoniae Escherichia coli

1/2»

l/2a

l/2c

4ft

4b

4d

1

i/2a 4 b

и.о.' l/2a l/2b 4b 4Ъ п. о 4 b 4b

■1b 4b

6b

бе

■ iipo- i

ДЙСГ1В.КЯ npo<J) В.Гооелеи* тот je тот ze тот xe тот xe тот же тот xe НИИЭМ ни.Гакален клик. изолят тот 'xe

тот ге тот яе тот яе тот ге тот же тот де тот же тот же тот зе тот хе

тот хе

ТЭТ JiC тот ~е

любезно предо ставлен проф В.Гобелем*

тот ЖЪ

НИИЭМ як.Гамалей хлин. кзолят любезно предо ставлен проф Костиковой H.H. тот I

коллекция } НИИЭМ ии.Гамалеи тот за тот же тот ао

НВ101 F-, AscfS20(r«-traa-) ,recA13 тот же

- ara 1, рюА2, JacYl, galK2

rpsL2 (SmT), xylS, mtll,

- supE44,

JM109 F'traD3G, (lac pro),thi, тот.же

racr-4,supE44, hsdR17,

proAB, Sacl* ,iacZ MIS/recAl

gyrA96 (Nalr )

N4830.1 F-,hls~, ilv-,galK-, (chID- тот же

pgin BamN+ CI8S7 Hl]

Пл&зыиды

Р0С19 Apr (Messins et

al., 1981)

PLC2 pUCl 9яр1сЛ данная работа

рЬСЗ pUC19:iplcA данная работа

PRIT2T Apr . spa Pharmacia

pLC7 производная pRIT2T, данная работа

spa::plcA

• Dr. W.Goebel, Universität Wurzburg, Germany

Выделение фрагментов ДНК и? агарозного геля проводили, мето- -дои "замораживания-оттаивания" согласно CawronrBurke and Clewell (1984) .*

Для приготовления образцов L.monocytogenes для анализа р Ш'Р клетки обрабатывали последовательно лиэоцимом (ЗОмин) и Протеина-эой К (ЗОмин), после чего либо прямо использовали в ПЦР, либо осаждали дебрис центрифугированием в михроцектрифуге "Eppendorf" (5мин 14тыс.об./мин), и концентрировали ДНК этиловым спиртом

Полимеразную цепну» реакцию осуществляли в термоциклере "Perkin-Elmer", (Англия) по программе: для праймеров Plcl, Р1с2 ~ 93°С-1мин, SOC-Imhh, 72С-1мин30сек в течение 35 циклов; для праймеров Hlyl, Н1у2 - 93С-1мин, 60С-1мин, 72-1мин в течение 5 циклов, 93-1мин, S7C-1мин30сек, 72-1мин30сек - 5циклов, 93С-1мин, 35-1мнн30сек, 72С-2мин - 20 циклов.

Обратную транскрипцию проводили с использованием обратной транскриптаэы M-MuLV фирмы "Диа-М" в условиях, рекомендованных изготовителем.

Биохимические методы

Очистку гибридного белка БелокА::Фосфолипаза проводили еле-

образом: находящийся а нерастворимой фракции клеточного лнзата белен переводили в растворкиое состояние обработкой 0,5'.i; ТрнтонХ-JOO, затем подвергала афиннoil хроматографии на колонке IgG-Sepharose 4В (Pharmacia-LKB, Специя). Для этого, после и»«-— сениа "¿"¿уаыаалн • <> «Ч Tri: "Сi Зуфе-

Г~**> "рП=Т-4 « добавлением 0.2 М NaCI н 0.1% Тритона Х-100. Элюцию рекомбинантного белка осуществляли IX уксусной кислотой с 0.1» Тритоном Х-100.

Электрофорез белков в вертикальном геле осуществляли в системе Laemmli (1970).

Перенос белков на ннтроцеллюлоэную нембрану (MilHpore, США) и яыауноблотннг осуществляли как описано Маниатис я др.(1984).

реологические метолц

Иммунизацию кролика осуществляли путей подкожного введения на 1й, 10й дни и внутривенного введения на 20Й, ЗОЙ дни 200 икг очищенного белка разово. Сыворотку крови получали спустя 10 дней после последней инъекции антигена.

Эксперименты по выявлению L.колосуtogencr в- селезенке нишей проводили на шдяах линии Balb/c, весон 12-1ir, которых инфицировали внутривенно L.Bonocytogenes, отаии Костюченко (выделенный от больного). IX определенные сроки животных стерильно вскрывали для взятия селезенки. Половинку селезенки мыши растирали в ступке с 1мя стерильного физиологического раствор.' 100' икл взвеси высевали на агарнзованнуи среду ВНХ и инкубировали чайка в течение ночи.-Для осаждения крутшх обломков эукариотнческих клеток взвесь откручивала на кикроцентрнфугв 5* при 2 тис. об. /айн» из суг.ернатанта-бактерии осаждали центрифугированием в течение 5* при 8 тыс.об./мин н дважды отмывали физиологическим раствором. После этого клетки обрабатывались также как и клетки ночной культуры L.monocytogenes.

Рис.1 Схема конструирования рекомбинантных плазмид

. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ь. Клонирование гена PI-PLC vlcA a S.coll

Первым этапом работы являлось клонирование гена PI-PLC plcA.

А _

Клонирование осуществлялось не основе опубликованной последовательности фрагмента хромосомы L.monocytogenes, содержащего ген plcA (Leimelster-Wachter et al., 1989). Схема клонирования приведена на рис.1. EcoRI-фрагмент хромосомы ¿.monocytogenes (штамм ECD) размером около 1?00н.п. был очищен из агароэного геля и встроен в вектор pUC19 по сайту узнавания эндокуклеаэы EcoRI. Эхидалось появление двух типов плазмид, различающихся направлением считывания гена plcA относительно направления считывания с лактозного промотора вектора.

Отбирались клоны, дающие положительный сигнал в Полимеразной цепной реакции с прайыерами Р1с1,Р1с2 , специфичными к гену plcA.

Было отобрано 2 клона иэ 56. Рестрикционный анализ показал, что отобранные клоны содерхалн идентичную плазмнду, содержащую

вставку размера около 1900 и.«. Рсстриктная карта вставки созг-ветствовала опубликованной последовательности гена plcA. Это, .i также положительные результаты ПЦР доказывают, что нами был клонирован ген PI-PLC и составе плазимд, которые были обозначены PLC2 и pLC2(l), Дальнейпая работа поопл»«--;^ ¿ „ля-»иг»~-* Н-п'-йлеи«« ¡¡IcÁ а псЯ (как н о pLC2(l)) было

противоположно направлению считывания с лактозного промотора вектора»

Наличие экспрессии рекомбинантного белка, кодируемого плаз-мндой pLC2, мы пытались обнаружить по появлению ферментативной активности, при выр&цив&ння рекомбинантного птамма HBÍ01-pLC2 на среде, содержащей фосфатидялнноэнтод. Наличие гндролнэугсцей активности должно было проявляться как появление непрозрачного гало вокруг колоний. Однако этик cnocoöoa выявить присутствие рскоиби-нантного бглха не удалось.

Ни объяснили это аозмслныа отсутствием транскрипции рекомбя-«антного ггна. а Б.colt вследствие того, что собгтзепкыД нроиотор ген« p!sA к.чоот неканоническую -35 область в силу этого, может ив узнап'.тьоя РПХ-.юлимеразов Е.соП. С целы» проверки этого предположения была поставлена эадяча сравнить экспрессию рекоиби-нантного гена с сойгтэениого промотора и ггтерологнчного.

В качестве гетерологмчного проиотора был вибран промотор

: ■ л

лактозного оперона S.coli, входящий в состав вехтора р1)С19(рис. 1) „ Плазмида pLC2 была обработана эндонуклеаэами EcoRI и HincII. Hin-clI-конец фрагмента, содержащего геи plcA, расположен в положении -46 от начала транскрипции. 'Объединение aro с HincII-концом вектора приводит к получению плезмиды, содержащей ген PI-PLC под

контролем собственного промотора и промотора лактозного оперона. Полученная плазмида была названа pLC3.

Наличие транскрипции гена PI-PLC в штаммах -В.col i, содержащих плазмиды pLC2 и pLC3, было исследовано с помощью последовательных реакции обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции. Реакция обратной транскрипции проводилась на суммарной клеточной РНК В.coi i. В ходе реакции обратной транскрипции проходил избирательный синтез кДНК фосфолипазы, инициируемый внесенным в реакционную смесь праймером Piel, комплементарным фосфолипазной мРНК. Полученный препарат кДНК использовался в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции, в ходе которой на кДНК фосфолипаэы амплифицировался специфический фрагмент двунитевой ДНК.

Наличие специфического продукта ПЦР было выявлено при использовании в качестве матрицы кДНК штаммов HB101~pLC2 и HB101-pLC3 (рис.2). В качестве отрицательного контроля использовались кДНК, полученная на штамме HB101-PUC19, а также РНК штаммов HB101-p.LC2 и HBt0t-pLC3, не прошедшая стадию обратной транс-6 5 4 3 2 1

Рис.2 Анализ транскрипции рекомбинантного гена plcA в E.coli 1 - ыаркер, 2 - КДНК HB101-pUC19, 3- кДНК HB101-pLC2, 4 - РНК. HDI01-pLC2, 5- кДНК HB101-pLC3, б - РНК HB101-pLC3

i

- И - -

крипцни.

Таким образом было показано, что транскрипция гена р1сА осуществляется в В.col i как с собственного промотора, так и с гете-рологичиого. Уровень выхода продукта ПЦР с кДНК штамма HB101-PLC3 превышал соответствуй»»«® -раиииь- е-"""- JÍStOl-pLC? лряблаццтвльно ь 3-* рвза. Это качественно указывает на то, что уровень транскрипции с промотора лахтозного оперона значительно випе, чем с собственного. Поскольку в нашей системе разница а количестве продукта ПЦР в 3-4 раза указывает на разницу в количестве вносимой матрицы в 100 и более раз.

3.Получение гибридного рекомбииаитного белка Protein A::PI~PLC

С целью получения легко выделяемого иммунологически активного белка ми поставили своей задачей создать конструкцию, кодирующую гибридный белок Protein A::PI-PLC. Protein А из Staphylococcus aureus обладает чрезвычайно високии сродство* к Fe области иммуноглобулинов . Он часто используется для создания гибридных бел-нов, т. г.. гкбряднмЯ белок, содержаний а качестве N-конца Protein А, легко mosst быть очицен с помощью афннной хроматографии.

«S ■ .

Для создания гибридной конструкция мн мепользопали вектор

г Ч"

р""Т2Т. Эактор несет фрагиеит гена ври, кодирующий нмиуноглобу-л[;:;-сзязиэайг;нй доиен Protein Л, с иоликлокалышм сайтом клонирования на 3'-конца. В ©тот сайт был встрое:; ливенный промотора структурный геи PI-PLC. Схеиа конструирования представлена на рнс.1. Accl-SaИ-фрагмент плазыиды pLC2 был подвергнут обработке эидоиухлсазоЗ НаеХИ в условиях недорестри«ции. Тупой конец На-elII-SalI-фрагиентй,содержащего ген pIcA, располокеи в положен»:: -5 от мачаяд трансляции. Объединение его со Smal-концом вектора

Рис.3 а)Анализ экспрессии рекомбинантного белка, кодируемого плезмидой pLC7 с помощью неспецифических антител, меченых перок-сидазой хрена;1-лизат штамма N4830.l-pRIT2T, 2-лиэат штамма N4830.l-pLC7t б)очистка гибридного белка Protein А :: PI-PLC: 1-J маркеры молекулярного веса 1 2-нсрастаоримая фракция лизата,

3-фракция, полученная в результате обработки 0,5Х Тритоном Х-100,

4-очищенный белок

приводило к образованию гибридного гена spa::plcA. Полученная плазмида была обозначена pLC7.

Поскольку в полученной конструкции гены spa и plcA находятся в одной райке считывания мы рассчитывали получить гибридный белок Protein A::PI-PLC размером около бб кДа. N-копец этого белка представлял собой имиуноглобулин-связывающнй фрагмент ProteinA размером около 30 кДа, а С-конец - PI-PLC размером 36 кДа.

С цельга исследования продукта, кодируемого плааиидой pLC7,

был проведен иммуноблотинг лиэата штамма N4830.l-pLC7. Иммунобло-тш1Г проводился с коньюгатом неспецифических антикролкчьих антител. Неспеннфнческое взаимодействие с антителами обеспечивалось иммуноглобулнн-связывающим доменом ProteinA. В качестве контроля использовался несущий векторную плаэмиду штамм N4S30.1-PRIT2T. Контрольный штамм npoaviiup»s-."T ас-лецийши^гт;! яйкУнореактияч!«^ 'белое, с массой es г; л о 30 кДа, соответствующий кодируемому им домену ProteinA. В штамме, содержащий рекомбинантную плаэмиду pLC7, был выявлен неспецифически иммунореактивный белок размером около 66 кДа, что соответствует расчетному размеру гибридного белка Protein Ä::PI~PLC (Рис.За). Это доказывает созданная нами конструкция обеспечивала продукцию в E.coli полноразмерного гибридного белка ProtеinA::PI-PLC.

Приступи^ к очистке гибридного белка, мы обнаружили, что он находится в нерастворимой фракции клеточного лизата E.coli IJB101-pLC7 и, видимо, связан с мембранами. Гидрофобность гибридного белка определяется его фосфолипазной частью, т.к. кодируемый вектором pRlT2T иммуноглобулин-свяэивающий домен ProteinA полностью находится в растворииой фракции. Обработка еллбкги детергентом (0,355 Triton Х-100) нерастворимой фракции клеточного лизата позиолила перевести гибридный белок а растворимое . состояние. После чего он бил очищен с помощью аффинной хроматографии как описано в Материалах и Методах (Рис.36).

б. Получение моноспециФической аптисыноротки к фосфолипаэе

Нашей следующей задачей было получение моноспецифической ан -тисыворотки, выявляющей PI-PLC. Приступая к иммунизации мы предполагали, что 1) фосфолипаэа сама по себе не будет являться сильным иммуногеиом, т.к. анализ ее структуры по методу (Норр and Woods, 1981) не выявил присутствия сильных антигенных детерминант, она слабо-гидрофильна и кроме того имеет гомологию с эукариоти-ческими PI-PLC (Leimeister-Wachter et al., 1991); 2) что в соста-

ве гибридного белка фосфолипаза сохраняет, по крайней мере час-

тично, свою нативную структуру, и, следовательно, антигенные детерминанты, и 3} что повторяющаяся структура фрагмента Белка А может стимулировать иммунный ответ в том числе и на фосфолипаэную часть гибридного белка.

На основании этих соображений мы не стали выделять PI-FLC из состава гибридного белка. Иммунизация кролика проводилась очищенным препаратом гибридного белка Protein A::PI-PLC с целью получить сыворотку, специфично определяющую PI-PLC.

Иммунизация проводили как описано в Материалах и Методах. В общей сложности кролик был иммунизирован 800 мкг чистого белка. Полученная антисыворотка использовалась в разведениях 1:200 1:1000.

л-i |

67 43 30 20

14,4'

Рис.4 Изучение специфичности ... антисыворотки• к гибридному белку Protein A::PI-PLC в отношении нативной фосфолипазы, присутствующей в культуральной

Для контроля специфичности мы использовали культураль-' ную жидкость L.monocytogenes (штамм NCTC7973). Поликлоиаль-. пая антисыворотка к гибридному белку Protein A:sPl-PLC выявляла присутствие в культу-ралы^ой жидкости иммунореак-тивпого белка с молекулярной массой около 34 кДа, что соответствует массе зрелой форны PI-PLC (Рис.4). Т.о. иолучен-

жндкости L.monocytogenes NCTC7973 нал нами поликлональная анти-

1-антисыворотка к белку ProteinA: сыворотка к гнбркдноиу белку

:PI-PLC, 2-конгрольная Protein A::PI-PLC спецнфн-

антнсыворотка неиииуьлого чески выявляет нативную

животного PI-PLC.

Это является свидетельством факта, что PI-PLC сохраняет но крайней мере частично, свои антигенные детерминанты в составе гибридного белка Protein A::PI-PLC.

7 Анализ экспрессии рекомбинантного гена plcA в E.coli Полученная антисыворотка Ru»- -te:; .¡.¡¡»зовя"«i- »-f '¿.¡¡злиза ногг*?'--.; ¿¿¡¡a PI-PLC в E.coli.

В штамме N4830.1-pLC3 было выявлено присутствие имммунореак-тивного белка с массой около 36 кДо, что соответствует массе ре-комбинаптной фосфолипазы. В контрольном штамме этот белок отсутствует. Это доказывает,что в штамме E.coli, содержащем ген plcA под контролем промотора лактозного оперона, происходит экспрессия рекомбинантпой PI-PLC. обладающей иммунологическими свойствами нативного белка.

Количество продуцируемого рекомбинантного белка било оценено исходя из сравнения иммуноблотов растнтрованного лизата N4830.1 -pLC3, содержащего известное Количество клеток, с растнтропкой культуральной гидкости L.monocytogenes (штамм NCTC7973),количество фосфолипазы в которой было известно (данные предоставлены Ю.Ф.Белым). Оценка показало, что количество рекомбинантного белка не превышает 5 мкг в литре культуры. Относительно низкий уровень продукции рекомбннантной PI-PLC ми связали с возможным низким уровнем инициации трансляции гена plcA, связанным как со строением сайта связывания рибосом, так и с неканоническим инициирующим кодоиом (TTG вместо ATO).

В штамме N4830.1-pLC2, в котором экспрессия гена plcA контролируется только собственным промотором, присутствие рекомбннантной PI-PLC с помощью антисыворотки выявлено не было. В то хе время в нем было продемонстрировано наличие транскрипции гена plcA. Мы предполохили, что этот факт отражает низкий уровень

транскрипции с собственного промотора. По-видимому он мог бить детектирован только благодаря высокой чувствительности использованного для выявления мРНК метода Обратной Транскрипции-Полнме-разной Цепной Реакции. Чувствительности метода иммуиоблотинга не достает для детекции соответствующего количества рекомбинаитного, белка.

8 Анализ Различий в уровне продукции PI-PLC разными ит^ц-

мами t./ppnpfiytp^nga

Изучение штаммоспецифических особенностей продукции PI-PLC

'листериями преследовало цели» во-первых, установления возможных

t

корреляционных связей уежду источником выделения и уровнем продукции PI-PLC, во-вторых, изучения возможности создания на базе моноспсцифической антисыворстки к PI-PLC иммуноферментной системы для выявления-I.monocytogenes. '

Был проведен скрининг коллекции штаммов L.monocytogenes, принадлежащих к разным серогруппам и выделенных из различных нс^. точников. Параллельно все штаммы проверялись на наличие гена plcA с помощью ПЦР.

' Результаты представлены в. таблице 2. Всего был проверен 21 штамм L.monocytogenes Были обнаружены значительные штаммоспецифи-ческие отличия в уровне продукции PI-PLC: от четко выявляемой до не выявляемой. Четкой корреляции между уровнем экспрессии и источником выделения не наблюдалось. Так, из 11 штаммов, выделенных от людей, продукция PI-PLC отсутствовала в 4, из них три птаыма

Таблица 2 Скрининг штаммов L.monocytogenes

атами источник се'рогруппа выявление ПЦР с

PI-PLC праймерами

Р1с Н1у

L.monocytogenes . . -- - - — : - ; —

NCTC 7973 колле «»•»•• "СТС -- - « *** '' * i ~ ■ л. ' 4-

i пег -«.— •■ rsr "s» . • i/2a - + +

ыстс ;343 TOT 3S 1/2с + + +

NCTC 5214 тот xe 4а + + +

NCTC 10527 тот xe 4Ъ + + +

NCTC 19117 тот xe 4d ++ + +

12 клин. 1/2а + + +

Нелюбова КЛИН., менингит« 1 ' • - + +

Костюченко КЛИН. 1 + + +

Q18-7.6,. клин., беременная 4Ь + + +

Р18-32 клин. и.о. • ' + +

Р22-69 хлин., беременная 1/2а + +

Р87-345 клин., новорожденный 1/2Ь - + +

РЗО-124 клин., здоровий 4Ь - + +

Р53-194 клин., беременная 4Ь + + +

Q9-14 клнн., менингит н.о - + +

Р27-117 клин., новорожденный 4Ь + +

Р78-Э16 окружающая среда, сточные воды 4Ь + + +

Р26-84 пищевые прод.,молоко 4Ь - + +

Р40-144 пищевые продукты 4Ь - . +

РЭ0-130 пищевые прод., сыр 4Ь + + .

L. innocua .

SLCC3723 коллекция NCTC бЬ ■ - - -

SLCC3379 тот хе ба - - -

L.sceligeri

18/100 тот же « - -

Streptococcus

pneumoniae

321 коллекция НИИЭМ -

128 им.Гамалеи - -

Bacillus

subtil is

168 тот хе - - -

Bacillus

cereus тот хе ~ - и/о

Eschcrichi i

coli

HB101 тот хе -

Legionella '

pneumophi1 -

Philadelph al тот хе _ . - н/о

Mycoplasma ^ -'

fermentas тот хе ' . •;'- - н/о

Mycoplasma

pneumoniae тот же - н/о

и/о - не определялось

били выделены от бальных людей и 1 - от здорового, из 3 штампов, выделенных изпродуктов питания продукция была выявлена в 1, и такхе PI-PLC была обнаружена в единственном штамме, выделенном из окружающей среды. С другой стороны у всех штаммов было выявлено присутствие гена plcA.

*

Интересно, что в штамме EGD, из которого, собственно, был клонирован ген plcA, продукция находится на чрезвычайно низком уровне и едва различима при анализе иммуноблота. Другой штамм, NCTC19117, относящийся к ссрогруппе 4d, имел значительно повышенный уровень продукции. За базовый уровень был принят уровень

вт&мма NCTC7973, приблизительно соответствующий среднему уровню.

>

Т.о. мы показали, что уровень экспрессии PI-PLC в разных штаммах значительно различается, вплоть до невозможности выявления продукции PI-PLC с помощью иммуноблотинга, поэтому разработка/ иммунологической системы для выявления ,L.monocytogenes на основе ионоспецифическок сыворотки к PI-PLC, по-видимому, не имеет перспектив. С другой стороны положительные результаты ПЦР говорят о перспективности разработки системы для выявления возбудителя на основе ПЦР.

9 Разработка амплиФикаиионных систем для выявления l.monocvtp-

zenes

Суть метода полимераэной цепной реакции заключается в многократной амплификации специфического фрагмента ДНК матрицы, дозволяющей визуализировать этот фрагмент на гель-электрофорезе или с помощью блот-гкбрндизацик.

" Специфичность реакции обеспечивается использованием в качестве затравки специфичных для матрицы праймероа и подбором таких условий проведения реакции, что наличие единичных нуклеотид-

них замен в последовательности матрицы мкгибирует реакцих».

Разработанная нами амплнфикацнонная система па основе последовательности гена plcA давала полозгателышй результат со всеми исследованными итаммпми ¡..monocytogenes, принлдлегащныи к cepoi— руппам 1/2а,1/2с, 4а, 4Ь, 4d (Табл.2). С пп«"1. 4111»-«^'

..-л L. 1 nnnrn? '--U-U.U. .¿1-ССЭ723, 3LCC3379), L.seeli-

geri (ятаим SLCC 18/100) результат был отрицательным. Специфичность системы била такасе проверена на ряде других микроорганизмов: B.cereus (имеющую гомологичный геи), B.subtilis (штамм 168), Б. coli '(НВ101), L.pneumophila (Philadelphia), Mycoplasma pneumoniae, M.fermentas. В использованных нами условиях'неспецнфичес-ких продуктов реакции с ними не наблюдалось. Т.о.разработанная система специфичио выявляет фрагмент ДНК L.nonocyiogcnes и мохет бить использована для анализа бактериальных культур.

Чувствительность ПЦР определяли, используя клеточные лнзаты L.monocytogenes (ятамм EGD), содержащие от 10s до единичных юле-—• ток. Чувствительность нашей системы составила 1000 клетск а образце.

С целью сравнения разработанной нами системы с ухе имеющимися мы использовали систему на основе последовательности гена листе-риолизина Ыу, описанную в работе Deneer and BoycheJc (1989). Авторы показали, что эта система обеспечивают видоспецифичесхое проведение ПЦР. Наши данные это подтвердили. Был исследован 21 атаки L.monocytogenes (табл.2), все они давали положительные результаты. Отрицательные результаты били получены с L.innocua (SLCC3723, SLCC3379), L.seTsligeri (SLCC18/100), Streptococcus pneumoniae (321, 128), B.subtilis (1С»), S.coti (HB101).

Чувствительность при использовании системы на основе после-

дователыюсти гена Ыу у пас достигала 10 клеток в'образце, что существенно превышало чувствительность системы на основе последовательности гена р/сл.

10 Разработка методики выявления листерий в тканях животных ц ее апробация в условиях экспериментального заражения мышей

Разрабатывая методику выявления листерий в тканях животных, мы использовали амплмфикационную систему на основе последовательности гена листериолизииа hly.

Табл.3

Выявление Listeria monocytogenes в селезенке экспериментально эара£еных кыаей

1 I ":"...... 1 ■ i ' 1.........1

| срок | доза заражения | наличие 174 н.п. | высев |

1 1 (клеток) | продукта ПЦР 1 i

I I 13 дня | 1 10» j - + i 1 Г + 1

1 1 1 1 10* | j + 1 + i

17 дней { Ю* J + 1 + !

1 1 10« | * 1 + | j j

114 дней} 10» J + 1 1

1 1 10* . 1 + 1 +- 1

1 I 1 1 i

| 21 день} 10* J ' -

I 1 10« ; | 1 |

| 28 дней] 10« j

1 1 10* | - 1 ■ I

I.,.. 1 ,1 i 1 !

+_ - отдельные колонии

Рутинно применяемая методике фенольной экстракции ДНК из животных тканей приводит К значительный потерям, что значительно уменьшает чувствительность. Коми была разработана методика безфв-нолыюй грубой экстракции ДНК, позаолик^щая получить грубо.очицек- .

ные, но не ипгибирующие ПЦР препараты. В модельных экспериментах с внесением клеток листернй а образцы селезенки здоровых мышей, нам удавалось выявлять до 100 клеток в образце.

Разработанная система была использована для определ»""«; листернй и г-.т-зеай.а Зкепепво-гггзл^ц заражении* гнвотных. Заражение провсднлось внутривенно сублетальними дозами 10« и 10s клеток (штамм Костюченко). Параллельно проводились высевы на твердую питательную среду (табл.Э).

В ПЦР возбудитель выявлялся на сроках до 2-х недель, что хорошо коррелировало с результатами высевов. При высевах на 14 день обнаруживались только отдельные колонии (до 10). Тем не менее в ПЦР возбудитель четко выявлялся. Это свидетельствует о том, что в селезенке мышей находились ухе не жизнеспособные, но еще сохранившие ДНК бактерии.

Т.о. разработанная нами методика выявления возбудителя на основе ПЦР является одновременно видоспецифйчной и высокочувствительной и представляется перспективной для создания соответствующего диагностикума. - ^ "

ВЫВОДЫ

1. При клонировании гена фосфатидилинозитол-специфичной фосфолнпазы С (PI-PLC) plcA из Listeria monocytogenes в В.coli установлено:

- транскрипция гена plcA в E.coli может осуществляться как с собственного промотора, так и с лактоэного;

- выявляемый рекомбинантный белок обладает. антигенными свойствами, аналогичными свойствам натианой фосфолнпазы;

- экспрессия рекомбинантного белка с лактозного промотора

составляет около 5 мкг/литр культуры, что значителыю превышает уровень экспрессии с собственного промотора.

2. Сконструирована плазмида, несущая гибридный ген spa::р!сл, 5'-копец которого является частью гена белка A (spa) из Staphylococcus aureus, а 3'- конец - лишенным промотора геном, р!сА. Показано, что полученная конструкция детерминирует синтез в E.coli полноразмерного гибридного белка Protein A::PI-PLC.

3. Получен очищенный препарат гибридного белка Protein А: :PI-PLC и поликлональная кроличья аитисыворотка к нему. Полученная антисыворотка к гибридному белку специфично выявляет нативную фосфолипазу, что свидетельствует о сохранении антигенных детермк-. нант фосфолипазы в составе гибридного белка.

4. Выявлены значительные вариации в уровне продукции PI-PLC разными штаммами L.monocytogenes, вплоть до невозможности выявления экспрессии фосфолипазы в некоторых, в то же время ген PI-PLC plcA присутствует у всех исследованных штаммов.

5. Разработаны две видоспецифичные системы для выявления L.monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции. Показано, что чувствительность системы на основе последовательности гена листериолизина hly выше аналогичной системы на основе гена pic А и составляет около 10 клеток в пробе, против 1000 клеток у второй системы. Видоспсцифичность систем показана при скрининге 29 штаммов листерий и др. микроорганизмов.

б. Разработанная амплификационная система на основе последовательности гена hly в условиях экспериментального заражения мышей выявляет возбудитель листериоза в органах и тканях мышей в течение двух недель, не уступает по чувствительности и специфичности бактериологической» -г; ичаиаляъх- »"««'"'Т^гс-^уд;; -' тель в 10-15 раз быстрее.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ермолаева С.А., Зигангирова- Н.А. , Маракуш'а Б.И. , Тарта-ковский И.С., Гинцбург А.Л. "Разработка метода выявления Listeria monocytogenes на основе метода полимеразной цепной реакции"//Тез. Всероссийской конференции по проблемам листериоза. - Покров, 1993

2. Ерколаева С.А., Зигангирова Н.А., Маракуша Б.И., Тарта-ковский И.С., Прозоровский С.В. "Видоспецифическое выявление Listeria monocytogenes методом- направленной амплификации ДНК"// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. - N1. -С.26-30

3. Ериолаепа С.Л., Белый Ю.Ф., Тяртаковский И.С., Гинцбург А.Л. "Получение и характеристика гибридного белка Protei-nA::PI-PLC L.monocytogenes"// Тез. VI Конференции Российской Федерации " Новые направления биотехнологии. - Пущино, 24-26 мая 1994г. - С.75

4. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Гинцбург А.Л., Прозоровский С.В. "Клонирование и экспрессия фосфатидилино-зитол-специфичной фосфолипази С L.monocytogenes"// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1994. - N5. - С.