Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение инсулин - продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение инсулин - продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток человека"

На правах рукописи

ФЕДЮНИНА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ ИНСУЛИН-ПРОДУЦИРУЮЩИХ КЛЕТОК ИЗ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАР 2071

Москва-2011

4840675

Работа выполнена в лаборатории генетики стволовых клеток Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор,

Гольдштейн Дмитрий Вадимович

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

Климов Евгений Александрович

доктор биологических наук, профессор, Поляков Александр Владимирович

т. Московский Государственный Университет имени

Ведущая организация - '

М.В. Ломоносова

Защита состоится « 04 » апреля 2011г. в ._ часов на заседании

Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,!)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан

2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р. А.

Актуальность темы

Распространение диабета в мире постепенно достигает эпидемических масштабов. Согласно прогнозам, в течение следующих 25 лет произойдет увеличение количества больных диабетом почти в два раза (до 300 миллионов человек). Сегодня более 5 миллионов человек по всему миру больны диабетом первого типа (наиболее жесткая форма заболевания), 395 тысяч из них - дети. Сахарный диабет 1 типа (СД 1) характеризуется разрушением р - клеток путем аутоиммунной атаки. Недостатки современных методов лечения СД 1 - инсулинотерапии и трансплантации ткани поджелудочной железы (ПЖ) - стимулируют развитие и совершенствование клеточной терапии, в частности, поиск новых альтернативных источников р - клеток.

В связи с этим, в последние годы стали активно разрабатываться и изучаться новые методы регенерационной терапии, предусматривающие выделение и ex vivo предифференцировку эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Эти клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем зрелые дифференцированные островки ПЖ и поэтому могут оказаться хорошим материалом для получения достаточных количеств функционально-активной массы р - клеток.

Дифференцировка в инсулин-продуцирующие клетки должна включать индукцию регуляции секреции, которая подразумевает накопление инсулина в клетках и быстрое выделение его в ответ на различные физиологические сигналы. Чтобы достичь этого, в клетках должен быть активирован комплекс панкреатических генов, очень сходный с таковым в нормальных р - клетках. Получение просто продуцирующих инсулин клеток, без обратной связи и какого-либо контроля его секреции не дает никаких преимуществ по сравнению с простыми методами введения инсулина. Мультипотентные стромальные клетки (МСК) взрослого организма привлекают внимание исследователей и практических врачей по следующим причинам: они наилучшим образом подходят для аутологичной трансплантации; высокая скорость пролиферации позволяет нарастить достаточное количество клеток для трансплантации; обладают способностью к дифференцировке в разные клеточные линии.

Существует предположение, что для эффективной направленной дифференцировки в инсулин - продуцирующие клетки, необходима экспрессия клетками нестина (Lee S., 2000), т.к. показано, что нестин-экспрессирующие клетки, изолированные из человеческих или крысиных островков поджелудочной железы могут дифференцироваться в эндокринные и экзокринные клетки in vitro (Zulewski Н., 2001; Blyszczuk P., 2003; Zhang L., 2005). И авторы многих работ для получения таких клеток используют стадию селекции нестин-экспрессирующих клеток, описанную ранее для генерации нейронов (Blyszczuk Р., 2003). До сих пор остается неясным, является ли необходимой экспрессия нестина для эффективной трансдифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки.

В настоящее время активно развивается тема о происхождении МСК из предшественников перицитов, имеющих фенотип CD146+CD31- и обладающих более широким спектром дифференцировки по сравнению со стандартно пассированными МСК. Работ по получению инсулин-продуцирующих клеток из популяций данного фенотипа не обнаружено. Опубликовано несколько первых исследований, демонстрирующих возможность использования МСК из костного мозга в качестве источника получения инсулин-продуцирующих клеток, в том числе аутологичных (Karnieli О., 2007; Li Y., 2007). Эффективная трансдифференцировка МСК из жировой ткани и сосудов пупочного канатика в инсулин-продуцирующие клетки в литературе не описана.

Цель исследования

Получение инсулин-продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и пупочного канатика человека.

Задачи исследования

1. Выделить и охарактеризовать популяции МСК из сосудистой стенки пупочного канатика и жировой ткани.

2. Подобрать метод доставки гена, кодирующего транскрипционный фактор Pdxl, играющий ключевую роль в дифференцировании клеток поджелудочной железы.

3. Оптимизировать условия трансфекции, культивирования и состав дифференцировочной среды.

4. Трансфицировать МСК из пупочного канатика и жировой ткани геном Pdxl и проанализировать транскрипцию ключевых генов панкреатической дифференцировки: NGN3, NeuroD, MafA, Insulin.

5. Показать способность полученных инсулин-продуцирующих клеток изменять уровень секреции инсулина в ответ на изменение концентрации глюкозы (тест на толерантность) к глюкозе.

6. Проанализировать экспрессию нестина в полученных популяциях МСК и проследить корреляцию между уровнем экспрессии нестина и способностью к эффективной дифференцировке в функционально-активные инсулин продуцирующие клетки.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые показано, что эффективная дифференцировка в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки преимущественно происходит в CD146+CD31- популяциях МСК жировой ткани и пупочного канатика человека.

Подобраны оптимальные условия трансфекции (необходимая концентрация аденовирусной конструкции, время сорбции, а так же эффективность трансфекции)

CD146+CD31- и CD146-CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека.

Подобраны условия культивирования трансфицированных клеток, а так же состав дифференцировочной среды. Показано, что добавление этапа культивирования в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к увеличению транскрипции инсулина в 7 раз в трансфицированных CD 146+ популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM.

В результате проведенного исследования установлено, что транскрипция инсулина сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.

Показано, что полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31-популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.

Проведен анализ зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин. Корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31-популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдали экспрессию нестина на высоком уровне, к активации транскрипции инсулина не приводила.

В настоящей работе впервые разработан метод получения функционально-активных инсулин-продуцирующих клеток из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека путем транзиентной трансфекции геном Pdxl.

Положения, выносимые на защиту

1. Популяции МСК из пупочного канатика и жировой ткани периваскулярного фенотипа, несущие на поверхности маркер CD146 эффективно дифференцируются в функционально-активные инсулин-продуцирующие клетки путем транзиентной трансфекции геном Pdxl. Трансфекция популяций МСК, не имеющих маркер CD 146, к эффективной дифференцировке в панкреатическом направлении не приводит.

2. Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к значительному увеличению транскрипции гена Insulin в трансфицированных CD146+CD31- популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM. Транскрипция гена Insulin сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.

3. Полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.

4. В процессе анализа зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31-популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдалась экспрессия нестина на высоком уровне, к активации транскрипции Insulin не приводила.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по аутологичным стволовым клеткам (Москва,

2009); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов на Дону,

2010); Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по стволовым клеткам и регенеративной медицине (Москва, 2010).

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен лично. Протоколы исследования разработаны автором. Публикации работы, а также описание исследования выполнены автором самостоятельно.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 6-ти печатных работах: 3-х статьях и 3-х тезисах. Три статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в курс лекций «Соединительные ткани» кафедры гистологии и эмбриологии РГМУ и в работу МГНЦ РАМН.

Объем н структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 109 стр. машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 163 источника отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы исследования

Получение культуры клеток

Стромально-васкулярную фракцию жировой ткани получали из липоаспирата 10 здоровых доноров на основании добровольного согласия. Возраст доноров составил 39± 13,97 лет. Жировую ткань дезагрегировали с помощью коллагеназы 1 (1мг/мл) типа («ПанЭко», Россия) и диспазы (200 мг/мл) («ПанЭко», Россия) в течение часа при 37°С, постоянно встряхивая пробирку. Пупочные канатики получали от здоровых рожениц (8 образцов) на основании их добровольного согласия. Из пупочного канатика выделяли сосуды, измельчали их с помощью ножниц, затем дезагрегировали смесью ферментов диспазы (200 мг/мл) и коллагеназы 1 типа (1мг/мл).

Полученные суспензии центрифугировали 10 минут при 1100 об./мин, супернатант отбирали. Клеточный осадок ресуспендировали в небольшом объеме среды DMEM/F12 («ПанЭко», Россия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия), 2 тМ L-глутамина («ПанЭко», Россия), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (ФРФ-2) («Prospec»), гепарина 8 Е/мл («BRAUN», Испания), амикацина 100мг/л («Красфарма», Россия). Клетки высевали на пластиковые чашки Петри (Corning) диаметром 90 мм, затем помещали в С02-инкубатор (37° С, 5% С02) и инкубировали до достижения 70% конфлюентности, затем снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду в плотности 1500-2000 клеток\см2.

Выделение CD146+ популяции клеток

Часть клеток культивировали согласно опубликованному ранее оригинальному протоколу получения CD146+ популяций клеток, имеющих периваскулярный фенотип (Ржанинова А., 2010). Для этого клетки высаживали на среду DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 тМ L-глутамина, 10 нг/мл ФРФ-2, гепарина 8 Е/мл, амикацина 100мг/л с добавлением рекомбинантного человеческого инсулина, который растворяли в IM соляной кислоте и использовали в конечной концентрации 5нг/мл. После 3-х дневной инкубации неприкрепившиеся клетки переносили на новые чашки, ростовую среду полностью заменяли. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности, затем снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду в плотности 1500-2000 клеток/см2.

В течение 2-3 пассажей преимущественно выделялась фибробластоподобная популяция клеток. Но рост этих клеток ингибировался присутствующим в среде инсулином. Через несколько недель (2-4) после посева культур на среду с инсулином

8

наблюдали участки плотного роста мелких эпетелиоподобных клеток, отличающихся по морфологии от основной популяции (рис.1).

Эти клетки характеризовались высокой митотической активностью в присутствии инсулина и ФРФ-2. Колонии мелких эпителиоподобных клеток были выделены механически и культивированы отдельно в присутствии инсулина. Культура характеризовалась очень быстрым ростом: время удвоения составляло не более 18 часов, в то время как популяции, культивируемые параллельно по стандартному протоколу (С0146), удваивались за 32-45 часов.

Рис. 1. Фенотип выделенных популяций МСК из жировой ткани (А, Б) и пупочного канатика (В, Г). А, В- популяции клеток, выделенных по стандартной методике (CD146-CD31-); Б, Г- популяции клеток, выделенных путем добавления инсулина (CD146+CD31-). Рельефный фазовый контраст (Х100).

Г

Метод иммунофлуоресцентного разделения клеток в потоке

Исследуемые культуры инкубировали в ростовой среде DMEM с низким содержанием эмбриональной сыворотки (2%) в течение 24 ч перед проведением анализа. Клетки трипсинизировали, суспендировали в PBS в концентрации 100 тыс. клеток в мл. Неспецифическое связывание блокировали инкубацией в 1% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки отмывали в трех объемах PBS, центрифугировали, и осадок суспендировали в 0,5% рабочего раствора первичных антител на 1% БСА с 0,1% козьей сывороткой. После инкубации в течение 40 минут при 4°С клетки отмывали PBS. Использовали мышиные моноклональные 1 антитела для цитофлюориметрии, меченные FITC, РЕ, АРС, к CD29, CD44, CD49a, CD73, CD90, CD166, CD146, CD31, CD105 (BD Biosciences). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные (кроличьи) IgG тех же фирм. Клетки затем отмывали в PBS и в объеме 1 мл анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Calibur ("BD Biosciences"). Результаты

обрабатывали с помощью программы \VINMDI 2.8.

Дифференцирование выделенных МСК

Для того, чтобы показать, что клетки соответствуют всем критериям, предъявляемым к МСК, проводили исследования по дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениям. Для этого клетки культивировали в соответствии с табл. 1.

Таблица 1. Компоненты дифференцировочных сред

Остеогениая среда

Среда ЭМЕМ 90%

Ь-глутамин 4 мМ

Амикацин 100 мкг/мл

Ь-аскорбиновая кислота 50 мг/Л

Р-глицерофосфат 10 мМ/Л

1,25-дигидроксивитамин Ш 10 нМ

Сыворотка крови (й) 10%

Адипогенная среда

Среда ИМЕМ/Р12 90%

Ь-глутамин 4 мМ

Амикацин 100 мкг/мл

Дексаметазон 100 нМ

Сыворотка крови 10%

Хопдрогенная среда

Среда ОМЕМ/Ф12 90%

Ь-глутамин 4 мМ

Амикацин 100 мкг/мл

ТСР-Ь 10 нМ

Дексаметазон 100 нМ

Получение аденовирусной конструкции

Синтез гена Рс!х1 с фланкирующими последовательностями, содержащими сайты рестрикции осуществили в ООО «Евроген». Данную последовательность клонировали в плазмиду р5ЬиШе-СМУ под контроль промотора цитомегаловируса человека. Затем полученную плазмиду рЗИиик-СМУ-РсШ линеаризировали и дефосфорилировали щелочной фосфатазой С1АР. Линеаризованную плазмиду р5Ьий1е-СМУ-РОХ1 отделяли от кольцевой формы электрофорезом в агарозном геле с последующей элюцией из геля. Полученную после элюции ДНК переосаждали этиловым спиртом, после чего осадок растворяли в 5 мкл деионизованной воды. Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли электрофоретически.

Для получения рекомбинантной плазмиды, несущей экспрессирующую кассету с геном Pdxl в составе генома аденовируса человека 5 серотипа, проводили электропорацию клеток E.coli штамма BJ5183 смесью плазмид pShuttle-CMV- Pdxl (1 мкг) и pAd-EASY-1 (ОД мкг).

Параллельно проводили электропорацию клеток E.coli штамма BJ5183 только плазмидой pShuttle-CMV- Pdxl (1 мкг). После электропорации клетки E.coli штамма BJ5183 инкубировали 1 час в среде SOB на 37°С при встряхивании. После инкубации клетки E.coli штамма BJ5183 высеяли на агар с канамицином, затем инкубировали 18 часов при 37°С. Полученные изолированные колонии рассеяли штрихом на сектора и инкубировали 18 часов при 37°С. ДНК из полученных клонов выделяли методом кипячения и анализировали методом ПЦР на наличие гена Pdxl и последовательности, специфичной для генома аденовируса человека 5 серотипа.

Размер полученных рекомбинантных ДНК определяли электрофоретически в сравнении с размером плазмиды pAd-EASY-1. Плазмидную ДНК положительных по результатам ПЦР и электрофоретического анализа клонов подвергали гидролизу рестриктазой Hindlll для получений характерной для генома аденовируса человека 5 серотипа электрофоретической картины, в качестве контроля параллельно гидролизовали рестриктазой Hindlll плазмиду pAd-EASY-1. Плазмидной ДНК положительных клонов трансформировали клетки E.coli штамма DH5a. Полученные клоны анализировали методом ПЦР, электрофоретически и гидролизом по Hindlll, после чего 2 положительных клона нарастили в препаративном количестве.

Плазмидные ДНК положительных клонов гидролизовали рестриктазой Рас1 с послеующей элюцией из агарозного геля и переосаждением этиловым спиртом. Осадок ДНК растворили в 5 мкл деионизованной воды.

Трансфекцию клеток эмбриональной почки человека линии 293 рекомбинантной плазмидой pAd5- Pdxl проводили с использованием реагента Lipofectamine в соответствии с протоколом Invitrogen. Через 10 дней в лунках с клетками, трансфицированными рекомбинантной плазмидой pAd5-PDXl, наблюдали ЦПД. Клетки с ЦПД собрали, полученную вирусную затравку проанализировали методом ПЦР на наличие гена Pdxl, последовательности, специфичной для генома аденовируса человека 5 серотипа и отсутствие примесей вируса дикого типа.

Аденовирусные частицы pAd5-Pdxl наращивали в линии клеток эмбриональной почки человека НЕК 293, которая была трансфицирована плазмидой с полным геномом рекомбинантного аденовируса. Для этого монослой клеток линии промывали раствором PBS и затем добавляли среду DMEM/F12 (1:1) с 1% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 тМ L-глутамином, 100мг/л амикацином и pAd5- Pdxl. Далее инкубировали клетки 2-3 дня для размножения аденовирусных частиц, после чего клетки вместе со средой замораживали на -70°С для разрушения мембран клеток и выхода аденовирусных частиц. Затем размораживали при 37°С, тщательно пипетировали и центрифугировали при 3000 об/мин 20 минут. Далее

отбирали надосадочную жидкость, в которой содержались аденовирусные частицы pAd5- Pdxl.

Для оценки количества трансфицированных клеток, аденовирусными конструкциями pAd5-GFP со встроенным геном GFP (green fluorescent protein) инфицировали различные популяции МСК, выделенные из пупочного канатика и жировой ткани человека и проводили анализ на проточном цитофлуориметре FACS Calibur ("BD Biosciences").

Далее определяли титр вирусов. Для этого проводили разведение вируссодержащей жидкости 1:10; 1:100; 1:1000 и т.д. Каждым из растворов с указанной концентрацией инфицировали клеточные линии НЕК-293 и наблюдали образование бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляли с помощью микроскопа. Титр вируса выражали числом бляшкообразующих единиц в 1 мл.

Трансфекция клеток и индукция панкреатической дифференцировки

Для индукции панкреатической дифференцировки монослой клеток заливали средой DMEM/F12 (1:1) с 1% эмбриональной телячьей сывороткой, 2 mM L-глутамином, 100мг/л амикацином и равным объемом свежеполученных аденовирусных частиц. Для определения наилучшего времени адсорбции аденовирусных частиц, клетки инкубировали с pAd5- Pdxl в течение 2, 6, 24 или 30 часов. Затем среду с вирусом отбирали, промывали средой DMEM/F12 (1:1) и добавляли к клеткам дифференцировочную среду для усиления индукции панкреатической дифференцировки в течение 5 дней. Для подбора наиболее эффективных дополнительных индукторов панкреатической дифференцировки к трансфицированным клеткам добавляли компоненты в соответствии с табл. 2. В качестве контроля использовали нетрансфицированные клетки.

Анализ экспрессии панкреатических маркерных генов

Уровень экспрессии анализируемых генов оценивали на уровне транскрипции методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), а также по количеству исследуемых белков методами иммуноцитохимии и ELISA.

Анализ изменения транскрипции генов

Выделение РНК

Выделение РНК осуществляли с использованием коммерческих реагентов «RNeasy Miny Kit», («QIAGEN», США). Количество РНК измеряли спектрофотометром. Качество оценивали электрофоретически в агарозном геле,

образец использовался для ПЦР, если на форезе были отчетливо видны две полосы, соответствующие 28 и 18 8 РНК.

Таблица 2. Используемые комбинации компонентов дифференцировочной среды.

1. Не трансфицированные клетки + СМЯЬ 1066+1% БСА+ ЯА(10нг/мл)

2. Трансфицированные клетки + БМЕМ+1% БСА

3. Трансфицированные клетки + СМИ- 1066+1% БСА

4. Трансфицированные клетки + СМЯЬ 1066+1% БСА + никотинамид (0,1 г/л)

5. Трансфицированные клетки+ СМЯЬ 1066+1% БСА + СЬР(10нмоль/л)

6. Трансфицированные клетки + СМЯЬ 1066+1% БСА + ИА (Юнг/мл)

7. Трансфицированные клетки + СМЯЬ 1066+1% БСА + никотинамид (0,1г/л)+ ОЬР(Юнмоль/л) + 11А (Юнг/мл)

8. Трансфицированные клетки + СМИ! 1066+1% БСА + ИА (Юнг/мл) + ОУ(Юнмоль/л)

Синтез первой цепи ДНК на матрице РНК

Синтез первых цепей кДНК проводили согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя набор для проведения обратной транскрипции. Реакцию проводили в термостате при 37°С в течение часа.

ПЦР в реальном времени

Для анализа транскрипции генов проводили ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем Sybr Green («Синтол», Россия) в амплификаторе BioRad iQ cycler. В качестве затравок использовали уникальные пары праймеров к анализируемым генам (табл. 3).

Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы и очищены фирмой «Синтол». Дизайн праймеров проводили с использованием программы DNASTAR Primer Select. Праймеры подбирали через интрон гена, чтобы можно было отличить продукты амплификации, синтезированные на матрице кДНК от синтезированных на геномной ДНК.

Реакционную смесь собирали в соответствии со стандартным протоколом фирмы «Синтол». Схема реакции: первичная денатурация: 95°С, 5 мин; денатурация: 95°С, 20 сек; отжиг праймеров: 56-62°С, 20 сек; элонгация: 72°С, 20 сек (40 циклов); плавление продуктов амплификации.

Для дополнительного контроля чистоты реактивов и работы проводили контрольную реакцию, в которой присутствовали все компоненты, кроме матрицы, а так же электрофорез продуктов реакции в 1,5% агарозном геле. Для анализа специфичности амплификации по окончании ПЦР-РВ проводили плавление продуктов с постоянным анализом флуоресценции для построения кривых плавления.

Таблица 3. Используемые в работе праймеры.

ген 5'праймер З'праймер ^отж размер продукта п.н.

Insulin CCGCAGCCTTTGT GAACC CGGGTCTTGGGTG TGTAGAA 59 100

NGN3 CCCTCTACTCCCC AGTCTCC CCTTACCCTTAGC ACCCACA 62 176

NeuroD ACAGCTCCCATGT CTTCCAC AAGATTGATCCGT GGCTTTG 59 250

MafA CTTCAGCAAGGAG GAGGTCA TTGTACAGGTCCC GCTCTTT 59 150

Pdxl GAGCTGGCTGTCA TGTTGAA TTGTCCTCCTCCTT TTTCCA 59 88

ActB CCTGGCACCCAGC ACAAT GGGCCGGACTCGT CATAC 60 144

GAPDH TGCACCACCAACT GCTTAGC GGCATGGACTGTG GTCATGAG 60 87

Nestin GCAGCTGGCGCAC CTCAAGATGTC GGCAAGGGTGAG GGGAGGGAAGTT 65.5 225

Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации двух генов неизменного уровня экспрессии (house keeping genes, гены домашнего хозяйства) GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и ¡i-actin ((3-актин). Относительное количество мРНК рассчитывали с помощью ДС (Т) метода. Величины столбцов высчитывали по формуле 2A-(Ct гена - Ct генов дом.хозяйства), где С(Т) -пороговый цикл (threshold cycle), то есть соотношение столбцов прямопропорционально зависит от соотношения уровня мРНК исследуемых генов в образцах.

Гель-электрофорез ампликонов

Электрофорез продуктов амплификации проводили в 1,5 % агарозном геле. Агарозу растворяли в ТВЕ-буфере, добавляли бромистый этидий из расчета 0,4мкг/мл. Электрофорез проводили при напряжении 10 В на 10 см длины геля. Образцы ДНК смешивали с 1 мкл краски фирмы «Fermentas». Электрофорез проводили до тех пор, пока краска ксиленцианол не мигрировала на 3-4 см от начала геля. Результат визуализировали при помощи UVP трансиллюминатора.

Иммуноцитохимическое окрашивание клеток

Экспрессию белков Nestin, Pdxl и Insulin оценивали методом иммуноцитохимии. Клетки сажали на 12-луночные планшеты. После прикрепления клетки промывали раствором PBS («ПанЭко», Россия) 3 раза и фиксировали ледяным ацетоном в течение 5 мин. Далее промывали 3 раза раствором PBS, и заливали раствором PBS с 0, 25% Triton Х-100 («Helicon», Россия) и 1% БСА («ПанЭко», Россия) на 30 минут. После этого добавляли первичные мышиные моноклональные («Santa Cruz», США) к Insulin и Nestin, козлиные моноклональные к Pdxl антитела в концентрации 1:50 в растворе PBS с 0, 25% Triton Х-100 и 1% БСА, и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Далее клетки промывали раствором PBS 3 раза и добавляли флуоресцентные вторичные антитела против мыши меченые FITS («Abcam», США) к Insulin и Nestin, против козла меченые РЕ к Pdxl в растворе PBS с 0, 25% Triton Х-100, инкубировали 1 час в темноте. Затем клетки промывали PBS 3 раза и визуализировали флуоресценцию.

Анализ транскрипции инсулина во времени

Трансфицированные CD146+ популяции МСК, выделенные по оригинальной методике из пупочного канатика и жировой ткани человека культивировали в дифференцировочной среде CMRL 1066 с добавлением ретиноевой кислоты в течение 7, 14 и 21 дней. Затем из клеток выделяли мРНК и проводили анализ транскрипции гена Insulin методом ПЦР-РВ. В качестве контроля использовали нетрансфицированные клетки, культивированные в той же среде.

ELISA (тест на толерантность к глюкозе)

Трансфицированные pAd5-Pdxl CD146+CD31- популяции МСК, культивируемые в течение 14 дней в дифференцировочной среде, промывали раствором PBS 4 раза, затем сажали клетки на 6-луночные плашки по 100 тыс. кл. на лунку с добавлением 1мл DMEM/F12 (1:1) с содержанием 5.56 mmol/л и 25 mmol/л глюкозы. После 24ч инкубации среду отбирали и замораживали на -80°С. Количество инсулина в среде определяли с использованием коммерческого набора «Ultrasensitive insulin ELISA» («Mercodia AB», Швеция) согласно приложенному протоколу фирмы Mercodia. Результаты анализировали с помощью спектрофотометра Anthos («Biochrom», Англия).

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы «Статистика 9» с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05. п-количество поставленных экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы в связи с недостатками современных методов лечения СД 1 типа активно развивается поиск альтернативных источников [5 - клеток. Поэтому ученые стали уделять особое внимание разработке и изучению новых методов регенерационной клеточной терапии, предусматривающих выделение и ex vivo предифференцировку эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Жировая ткань и пупочный канатик, как известно, представляют собой перспективные источники МСК.

Основными преимуществами этих клеток является их доступность, возможность к аутологичной и аллогенной трансплантациям, а так же к дифференцировке в различных направлениях.

Исследована возможность получения функционально - активных инсулин -продуцирующих клеток из различных популяций МСК жировой ткани и пупочного канатика путем введения гена ключевого транскрипционного фактора панкреатической дифференцировки Pdxl. Транскрипционный фактор Pdxl играет ключевую роль в дифференцировке панкреатических р - клеток. В ряде работ было показано, что стабильная трансфекция геном Pdxl индуцирует дифференцировку ЭСК и МСК костного мозга в инсулин - продуцирующие клетки. Традиционные методы трансфекции, такие как липофекция и электропорация не имеют высокой эффективности в доставке экзогенной ДНК (Mhashilkar А., 2001; Segura Т., 2001; Niidome Т., 2002). Как показано в ряде работ эффективность трансфекции МСК при использовании липофектамина достигает 5%, а с использованием электропорации - до 50 %, но доля трансфицированных клеток через 14 дней не более 10% (Лопатина Т., 2009; Verma I., 2005). Именно поэтому был выбран аденовирусный метод доставки, который является наиболее эффективным методом транзиентной доставки. Большим преимуществом этого метода является возможность ввести большое количество копий гена внутрь как делящихся, так и не делящихся клеток, запуская их дифференцировку без встраивания конструкции в ядерный геном.

Трансфекция pAd5-Pdxl стандартных МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека

Полученные согласно стандартному протоколу МСК из жировой ткани и пупочного канатика имели фенотип CD105+, CD29+, CD44+, CD49a+, CD73+, CD90+, CD166+, CD 146-, CD31-, который характерен для всех МСК. Также показано, что клетки эффективно дифференцируются в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях.

Для трансфекции МСК из жировой ткани и пупочного канатика была получена аденовирусная конструкция на основе аденовируса человека 5 серотипа с геном Pdxl.

Для оценки доли трансфицированных клеток, МСК были инфицированы pAd5-GFP. На проточном цитофлуориметре FACS Calibur ("BD Biosciences") было

показано, что эффективность трансфекции составляет 70% для стандартно полученных популяций МСК при добавлении 100 БОЕ/мл свежеполученных частиц аденовируса (рис. 2А). Большее количество БОЕ/мл уже приводило к значительной гибели клеток.

Рис. 2. Экспрессия гена GFP через 7 дней после трансфекции pAd5-GFP в CD146-CD31-(А) и CD146+CD31- (Б) популяциях МСК из жировой ткани человека. Трансфицированные клетки содержали GFP (зеленая флуоресценция). (XI00).

При трансфекции стандартно полученных МСК (МСК CD146-CD31-) из жировой ткани и пупочного канатика было показано, что большое значение имеет время сорбции аденовирусной конструкции. Эффективность трансфекции оценивали по уровню транскрипции целевого гена Pdxl, то время считали наилучшим, когда транскрипция Pdxl была максимальна (рис. 3). В качестве контроля брали клетки, не инкубированные с pAd5-Pdxl. Для клеток данного фенотипа максимальный уровень транскрипции Pdxl достигался при сорбции вируса в течение 6ч (рис. ЗБ). При увеличении времени сорбции происходило падение уровня транскрипции трансгена в результате гибели клеток. Возможно, это связано именно с Pdxl- очень сильным транскрипционным фактором, поскольку с идентичной конструкцией, несущей ген GFP такого эффекта не наблюдалось. Анализ транскрипции генов панкреатической дифференцировки в МСК жировой ткани и пупочного канатика, культивированных по стандартному протоколу, после трансфекции pAd5-Pdxl показал активацию транскрипции трансгена Pdxl и генов Ngn-3, Neuro D и MafA. Активация транскрипции гена Insulin не обнаружена (рис. 4).

Так же был проведен анализ экспрессии генов Pdxl и Insulin на уровне белка методом иммуноцитохимического окрашивания. Показано, что в трансфицированных CD146-CD31- популяциях МСК из жировой ткани и пупочного канатика экспрессируется Pdxl, а экспрессия инсулина не обнаружена.

Трансфскцпя pAd5-Pdxl МСК периваскулярного фенотипа из жировой ткани и пупочного канатика человека

В связи с отрицательным результатом эксперимента были предприняты попытки поиска чувствительных клеток-мишеней. Поскольку описана возможность успешного получения инсулин-продуцирующих клеток из МСК костного мозга,

следовательно, должны существовать популяции клеток, в которых весь транскрипционный каскад запускается успешно.

А.

Относительный уровень мРНК

Б.

----Г*Т

Относительный уровень мРНК

*

-;-;-«- ..............*

.1: : | ; гЪ

Рис. 3. Анализ транскрипции гена Р(1х1 в трансфицированных популяциях (С0146+С0 31- и ( 0146-0031-) МСК из жировой ткани и пупочного канатика. А- анализ транскрипции гена Рс1х1 в популяциях СБ146-КЛ}31-; Б- анализ транскрипции гена РсЫ в популяциях С0146-С031-. (пА=15, пБ=13). * - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю.

Одним из основных вопросов в современной науке является вопрос о происхождении МСК, которые были найдены в органах и тканях, имеющих различное происхождение в эмбриогенезе: в костном мозге, жировой ткани, печени, поджелудочной железе, эндометрии, пупочном канатике, а так же пуповинной крови, скелетной мышце и других. Недавно были опубликованы работы, которые перевернули многие понятия о биологии МСК.

Впервые в своих исследованиях А. Сар1ап (2008) выдвинул теорию о происхождении МСК из периваскулярных ниш и их принадлежности к отдельным популяциям перицитов - клеток стенок кровеносных сосудов и капилляров. В 2008 году было также показано, что клетки периваскулярных ниш полностью соответствуют критериям, предъявляемым к МСК.

В настоящее время у многих исследователей появился высокий интерес к популяциям стволовых клеток периваскулярного фенотипа, однако, известно о них немного. Показано, что при использовании стандартных методов культивирования,

МСК не сохраняют фенотип периваскулярных клеток при культивировании более 2х пассажей. А.

Относительный уровень мРНК

Б.

100 п.о.

250 п.о. 176 п.о.

150 п.о.

87 п.о.

<Ш

Pdx1

Insulin

NeuroD

NGN3

MafA

GAPDH

Рис. 4. Анализ транскрипции генов панкреатической дифференцировки в СВ146-С031- популяциях МСК жировой ткани и пупочного канатика. А - Анализ проведен методом ПЦР в реальном времени. (п= 21). * - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю; Б - анализ продуктов ПЦР методом гель - электрофореза. 1- не трансфицированные МСК СШ46+ СБ31-, 2 -трансфицированные МСК СБ146+ СЭЗ!-.

В лаборатории генетики стволовых клеток была разработана методика селективной изоляции МСК периваскулярного фенотипа (рис. 1). Основой метода служит различный ответ клеток периваскулярного фенотипа и стандартных МСК, по-видимому, являющихся их более дифференцированными производными, на присутствие в ростовой среде инсулина. Рост стандартных МСК ингибируется, клетки увеличиваются в размерах, становятся более распластанными. Время репликативной жизни МСК сокращается, такие клетки быстро стареют. Отмечается адипогенная дифференцировка. На клетки периваскулярного фенотипа инсулин не оказывает ингибирующего воздействия, хотя и не стимулирует их рост. В экспериментах было показано, что число колониеобразующих клеток в культурах периваскулярного фенотипа значительно возрастает при выращивании с инсулином и ФРФ-2.

Используя данный метод выделения клеток периваскулярного фенотипа, удалось получить МСК (МСК С0146+С031-) из жировой ткани и пупочного канатика с содержанием СБ 146+ клеток более 80%. В остальном они имеют тот же фенотип,

что и у стандартных МСК из тех же источников: CD105+, CD29+, CD44+, CD49a+, CD73+, CD90+, CD166+, CD31-. Было показано, что клетки эффективно дифференцируются в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях.

Эти клетки трансфицировались с несколько меньшей эффективностью, чем МСК CD146-CD31-, а именно около 45% клеток (рис.2Б).

В экспериментах по определению наиболее эффективного времени сорбции pAd5-Pdxl МСК периваскулярного фенотипа было показано, что для данного типа клеток время сорбции должно быть увеличено до 24ч (рис. ЗА). Возможно, это связано с более низкой плотностью альтернативных рецепторов для аденовируса 5 серотипа.

Трансфекция МСК CD146+CD31- из пупочного канатика и жировой ткани pAd5-Pdxl приводила к активации транскрипции генов NeuroD, NGN3, MafA, а так же гена Insulin на высоком уровне (рис.5).

Появление транскрипции гена Insulin не доказывает наличие белкового продукта гена, т.к. на эпигенетическом уровне может происходить блокирование синтеза белка. Был проведен анализ экспрессии белковых продуктов генов Pdxl и Insulin в трансфицированных популяциях МСК с помощью иммуноцитохимического окрашивания антителами. Показано, что в трансфицированных CD146+CD31-популяциях МСК экспрессируется белок Pdxl. Часть клеток, экспрессирующих Pdxl, экспрессировали и инсулин (рис. 6).

Получение просто продуцирующих инсулин клеток, без обратной связи и какого-либо контроля его секреции не дает никаких преимуществ по сравнению с простыми методами введения инсулина. В связи с этим эффективность инсулин-продуцирующих клеток для клинических целей определяется возможностью возрастания продукции гормона в ответ на стимуляцию глюкозой. Тест на толерантность к глюкозе показал, что происходит возрастание продукции инсулина в 3 раза при увеличении концентрации глюкозы в среде с 5 до 25 миллимоль на литр (рис. 7).

Показано, что полученные инсулин - продуцирующие клетки, как из пупочного канатика, так и из жировой ткани обладают толерантностью к глюкозе, что позволяет предположить возможность их перспективного использования в клеточной терапии СД1.

Выбор условий дифференцмровкн трансфицированных популяций МСК CD146+ CD 31- человека pAd5-Pdxl

Таким образом, было впервые показано, что эффективная трансдифференцировка МСК из разных источников достигается за счет присутствия клеток периваскулярного фенотипа, обладающих большей пластичностью по сравнению со стандартными МСК.

Исследовано влияние отдельных индукторов цитодифференцировки на уровень экспрессии гена Insulin. Добавление этапа культивирования в

дифференцировочной среде трансфицированных клеток могло привести к активации транскрипции гена Insulin и в MCK CD146-CD31-. В качестве среды была использована коммерческая среда для культивирования островков ПЖ CMRL-1066 («Invitrogen»). Как дополнительные индукторы были использованы GLP-1, никотинамид, и ретиноевая кислота.

А. „............................._.............................._............................................._

Относительный ю уровень мРНК

Б.

88 п.о.

100 п.о.

250 п.о. 176 п.о. 150 п.о.

87 п.о.

й

!

И й

Рис. 5. Анализ транскрипции генов панкреатической дифференцировки в СВ146+С031-нопуляциях МСК жировой ткани и пупочного канатика. А - Анализ проведен методом ПЦР в реальном времени. (п=18). * - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю; Б -анализ продуктов ПЦР методом гель -электрофореза. 1- не

трансфицированные МСК СИ 146+ С031-, 2 - трансфицированные МСК СЭ146+С031-.

Рис. 6. Иммуноцитохимическое окрашивание трансфицированных СШ46+С031-популяций МСК из жировой ткани (А) и пупочного канатика (Б) на Р(1х (красная флуоресценция) и инсулин (зеленая флуоресценция). (Х200). Рисунок получен совмещением двух фотографий одного поля.

Никотинамид - витамин РР, способный в организме предотвращать повреждение ПЖ. Действие никотинамида обусловлено его вхождением в состав ниацинамидадениндинуклеотида (НАД) и ниацинамидадениндинуклеотида фосфата (НАДФ), являющихся кофакторами ряда ферментов. Так же была использована ретиноевая кислота, которая является одной из самых ранних молекул, необходимых для региональной спецификации энтодермы, ведущей к образованию ПЖ, а так же тормозит пролиферацию клеток.

Был проанализирован такой компонет, как GLP-1, который является естественным гормоном, влияющим на уровень глюкозы в крови и стимулирующий образование островков, а так же как показано в ряде исследований увеличивющий выживаемость клеток. Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводило к увеличению транскрипции Insulin в 7 раз в трансфицированных CD146+CD31- популяциях МСК по сравнению с культивированием в обычной среде (рис.8). Культивирование в дифференцировочной среде трансфицированных популяций МСК CD146-CD31- к активации транскрипции гена Insulin не привело. Таким образом, было найдено новое, ранее не использованное авторами сочетание индукторов дифференцировки -коммерческая среда CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты.

Проведена оценка морфологических изменений МСК после трансфекции pAd5-Pdxl. Через сутки после трансфекции во всех типах клеток морфологических изменений не обнаружено. Через 7 дней культивирования трансфицированных клеток в подобранных условиях во всех культурах, кроме МСК CD146-CD31- из пупочного канатика, отмечено снижение количества живых клеток. В МСК CD146+CD31- из жировой ткани образовывались суспензионные кластеры не плотной структуры. В CD146+CD31- популяциях МСК из пупочного канатика наблюдали плотные островковоподобные структуры, которые были прикреплены к подложке. В поле зрения сохранялись одиночные прикрепленные клетки (рис.9).

Одним из важнейших вопросов при получении трансфицированных клеток, продуцирующих инсулин, является период дифференцировки клетки и сохранения секреции гормона. Трансфицированные клетки культивировали в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой в течение 7, 14 и 21 дня соответственно (рис. 10).

Показано, что транскрипция Insulin максимальна на 14 день после трансфекции. Через 21 день после трансфекции транскрипция инсулина значительно падала. Падение транскрипции гена Insulin обуславливалось гибелью клеток. Дифференцировочная среда не содержит сыворотки, что является необходимым для остановки пролиферации клеток, в такой среде клетки долго жить не могут. Добавление к среде сыворотки может вызвать пролиферацию клеток и, соответственно, выброс аденовирусных частиц, т.е. блокировать панкреатическую дифференцировку. Именно поэтому 10-12 дней для in vitro дифференцировки клеток является оптимальным.

количество инсулина (мЕ/л)

ши

■и

* lliill

................................. _ .....................Г ................. шив

ШВт

ВВ|

Рис. 7. Результаты теста на толерантность к глюкозе. 1 - среда с нетрансфицированных клеток; 2, 3 - среда с трансфицированных клеток с содержанием глюкозы 5.56 шшо1/л и 25 шшо1/л соответственно. (п=9).* - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю.

Относительный уровень мРНК

* ill ppl

4-

1 • Шщ - * jijp

шшшшшшяшяк, В

*

г-—, П

Рис. 8. Анализ уровня мРНК гена Insulin в трансфицированных клетках, культивированных в различных дифференцировочных средах. 1-контроль, 2-трансфицированные клетки в обычной среде; 3- в среде CMRL-1066, 4- в среде CMRL-I066 с GLP-1, 5- в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой, 6- в среде CMRL-1066 с никотинамидом, 7- в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой, GLP-1 и никотинамидом, 8- в среде CMRL-1066 с GLP-1 и ретиноевой кислотой. (п=6). * - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю.

Анализ экспрессии нестина в исследованных популяциях МСК

Поскольку в большинстве работ по получению инсулин - продуцирующих клеток авторы для эффективной направленной дифференцировки используют популяции нестин - положительных клеток (Blysrczuk Р., 2003), были проведены исследования по анализу экспрессии нестина в полученных популяциях МСК (CD 146-CD31- и CD146+CD31-) из пупочного канатика и жировой ткани с целью проследить зависимость между эффективностью дифференцировки и экспрессией нестина. Были получены данные об экспрессии нестина на уровне транскрипции гена методом ПЦР-РВ, а также на уровне белка методом иммуноцитохимического окрашивания (рис. 11, 12).

Рис. 9. Морфологические изменения CD146-CD31- (А, В) и CD146+CD31- (Б, Г) популяций МСК жировой ткани и пупочного канатика после трансфекции pAd5-Pdxl.

А, В - трансфицированные МСК CDi46- через 7 дней культивирования в дифференцировочной среде; Б, Г- трансфицированные МСК CD146+ через 7 дней культивирования в дифференцировочной среде. Рельефный фазовый контраст (Х100).

Относительный э уровень мРНК а

7 6 5 4 3 2 1 О

Рис. 10. Анализ транскрипции Insulin в трансфицированных CD146+CD31- популяциях МСК во времени. (п=9). * - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю.

В CD146-CD31- популяциях МСК из жировой ткани обнаружена транскрипция нестина на невысоком уровне, а в CD146+CD31- культурах транскрипции гена нестина нет (рис.11).

В популяциях клеток из пупочного канатика CD146-CD31- и CD146+CD31-транскрипция нестина наблюдалась на высоком уровне, в 2, 5 раза выше, чем в CD 146-CD31 - популяциях жировой ткани.

Анализ экспрессии нестина в различных популяциях МСК на уровне белка методом иммуноцитохимического окрашивания подтвердил данные ПЦР-РВ. В клетках обеих популяций МСК из пупочного канатика регистрирован белок нестина

на высоком уровне (рис.12 В, Г). В МСК С0146-С031- из жировой ткани часть клеток содержали небольшое количество белка нестина по сравнению с МСК пуповины, а в С0146+С031- культурах экспрессия нестина не обнаружена.

9

Относительный в уровень мРНК 7 б 5 4 3 2 1 о

Рис. 11. Сравнительный анализ уровня мРНК нестина в различных популяциях МСК (С0146+СБ31- и СВ146-С031-) пупочного канатика и жировой ткани человека. (п=11).* - различия достоверны (р<0,05) по отношению к контролю.

Рис. 12. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к нестину. А -МСК CD146-CD31-, выделенные из жировой ткани; Б -МСК CD146+CD31-, выделенные из пупочного канатика. Флуоресцентная микроскопия (Х100).

Таким образом, в процессе анализа зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался, эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдали экспрессию нестина на высоком уровне, к активации транскрипции Insulin не приводила.

МСК из жировой ткани МСК из пупочного канатика

25

ВЫВОДЫ

1. Получены клеточные популяции, обладающие свойством МСК из пупочного канатика и жировой ткани, различающиеся по экспрессии маркера СО 146.

2. Эффективность трансфекции рАс15-ОЕР для С0146-С031- популяций МСК составляет 70%, а для СШ46+СОЗ1- 46%.

3. Время сорбции аденовирусных частиц для С0146+СШ1- и С0146-С031-популяций МСК различно. Для МСК С0146+С031- оно составляет 24ч, а для С0146-СЭ31- 6 ч. Культивирование в среде СМЯНОбб с добавлением ретиноевой кислоты приводит к увеличению транскрипции инсулина в 7 раз по сравнению с культивированием в базовой среде.

4. Трансфекция рАс15-Р<1х1 популяций МСК С0146-С031- и СШ46+С031-фенотипов приводит к активации транскрипции генов Ыеигой, МЖЗ, Ма/А, однако, транскрипция кш1пЫт обнаружена только в С0146+С031- популяциях МСК

5. Полученные инсулин - продуцирующие клетки увеличивают уровень секреции инсулина в ответ на увеличение концентрации глюкозы.

6. Установлено, что экспрессия нестина не является необходимой для эффективной направленной дифференцировки МСК в инсулин-продуцирующие клетки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ:

1. Лопатина Т. В., Калинина Н. И., Ревищин А. В., Беме А. А., Спирова (Федюнина) И. А., Павлова Г. В., Парфенова Е. В. Индукция нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани Н Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2008. - №3. - С. 50-54.

2. Спирова (Федюнина) И. А., Ржанинова А. А., Гольдштейн Д. В. Получение инсулин-продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток пупочного канатика человека // Сборник материалов Всероссийской научной школы-конференции для молодежи по аутологичным стволовым клеткам. - 2009. - С. 50.

3. Ржанинова А. А., Куликов А. В., Спирова (Федюнина) И. А., Кириенко Е. Е., Волков А. В., Гольдштейн Д. В. Получение и характеристика культуры С0146+ культуры клеток из жировой ткани человека // Клеточные технологии в биологии н медицине. - 2010. - №1. - С. 3-9.

4. Спирова (Федюнина) И. А., Ржанинова А. А., Гольдштейн Д. В. Получение инсулин-продуцирующих клеток из различных популяций мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека / Материалы У1-го Съезда Российского общества медицинских генетиков // Медицинская генетика. - 2010. -Т., прил. к №5. -С. 169.

5. Федюнина И. А., Омельченко Д. О., Ржанинова А. А., Гольдштейн Д. В. Получение инсулин-продуцирующих клеток из различных популяций мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и пупочного канатика

человека // Сборник материалов Всероссийской научной школы-конференции для молодежи по стволовым клеткам и регенеративной медицине. - 2010. С. 84. 6. Федюнина И. А., Ржанинова А. А., Кириенко Е. Е., Гольдштейн Д. В. Получение инсулин-продуцирующих клеток из различных популяций мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и пупочного канатика человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - №1. - С. 10-16.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

МСК - мультипотентные стромальные клетки

ПЖ - поджелудочная железа

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени СД1 - сахарный диабет 1 типа ЦПД - цитопатическое действие

Подписано в печать:

25.02.2011

Заказ № 5040 Тираж - 120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федюнина, Ирина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Цель и задачи исследования.

1.2. Научная новизна и практическая значимость.

1.3. Положения, выносимые на защиту.Ю

1.4. Апробация работы.

1.5. Публикации.

1.6. Структура и объем диссертации.

ГЛАВА 2. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ. АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

2.1. Развитие поджелудочной железы.

2.2. Генетические механизмы развития поджелудочной железы.

2.3. формирование энтодермы.

2.4. Ключевые гены панкреатической детерминации и дифференцировки.

2.4.1. Ген PDXI.

2.4.2. ГЕНNKX2.2.■„.

2.4.3. ГЕНЫ NKX6.1 HNKX6.2.

2.4.4. PTFlА.

2.5. Гены эндокринной дифференцировки.

2.5.1. Neurod.

2.5.2. Neurogenin 3.

2.5.3. Notch сигнальный путь.

2.5.4. HESl.

2.5.5. ISLl.

2.5.6. РАХ4 ИРЛХб.

2.5.7. MAFA.

2.6. Проблема лечения сахарного диабета.

2.7. сигнальный путь инсулина

2.8. Диабет зрелого типа у молодых (MODY).

2.9. Современные подходы к лечению инсулинзависимого сахарного диабета.

2.9.1. Терапия, основанная на восстановлении регенерации в-клепок островков Лангерганса.

2.9.2. Терапия, основанная на трансплантации островков Лангерганса.

2.9.3. Терапия-шрного диабетапомощьюволовых клеток.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Получение культуры клеток.

3.2. Выделение CD146+ популяции клеток.

3.4. Дифференцирование выделенных МСК.

3.5. Получение аденовирусной конструкции.

3.6. Трансфекцпя клеток и индукция панкреатической дифференцировки.

3.7. Анализ экспрессии панкреатических маркерных генов.

3.7.1. Анализ изменения транскрипции генов.

3.7.2. иммуноцитохимическое окрашивание клеток.

3.7.3. Анализ транскрипции инсулина во времени.

3.7.4. ELISA (тест на толерантность к глюкозе).

3.8. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Трансфекция рАо5-Рбх1 стандартных МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека.

4.2. трансфекция ра05-рбх1 МСК периваскулярного фенотипа из жировой ткани и пупочного канатика человека.

4.3. Выбор условий дифференцировки трансфицированных популяций МСК СВ146+СБ31- человека рА1)5-Рох1.

4.4. Анализ экспрессии нестина в исследованных популяциях МСК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федюнина, Ирина Александровна, Москва

1. Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А. Возможные пути реализации регенерационной стратегии при лечении сахарного диабета 1 типа методами клеточной трансплантации. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007; Том 2; (2): 23-3.

2. Лопатина Т.В., Калинина Н.И., Парфенова Е.В. Опыт невирусной трансфекции стромальных клеток жировой ткани. Клеточные технологии в биологии и медицине 2009; №2: 73-76.

3. Ржанинова А.А., Куликов А. В., Спирова И. А., Кириенко Е. Е., Волков А. В., Гольдштейн Д. В. Получение и характеристика культуры CD146+ клеток из жировой ткани человека. Клеточные технологии в биологии и медицине 2010; №1: 3-9.

4. Afelik S, Chen Y, Pieler Т. Combined ectopic expression of Pdxl and Ptfla/p48 results in the stable conversion of posterior endoderm into endocrine and exocrine pancreatic tissue. Genes Dev. 2006 Jun l;20(ll):1441-6.

5. Ahlgren U, Pfaff SL, Jessell TM, Edlund T, Edlund H. Independent requirement for ISL1 in formation of pancreatic mesenchyme and islet cells. Nature. 1997 Jan 16;385(6613):257-60.

6. Alexander J, Stainier DY. A molecular pathway leading to endoderm formation in zebrafish. Curr Biol. 1999 Oct 21;9(20):1147-57.

7. Ang SL, Wierda A, Wong D, Stevens KA, Cascio S, Rossant J, Zaret KS. The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvement of HNF3/forkhead proteins. Development. 1993 Dec;119(4):1301-15.

8. Apelqvist A, Li H, Sommer L, Beatus P, Anderson DJ, Honjo T, Hrabe de Angelis M, Lendahl U, Edlund H. Notch signalling controls pancreatic cell differentiation. Nature. 1999 Aug 26;400(6747):877-81.

9. Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science. 1999 Apr 30;284(5415):770-6.

10. Ashjian P.H., Elbarbary A.S., Edmonds B., DeUgarte D., Zhu M., Zuk P.A., Lorenz H.P., Benhaim P. and Hedrick M.H. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast Reconstr Surg, 2003, 111(6): 1922-31.

11. Atkinson MA, Rhodes CJ. Pancreatic regeneration in type 1 diabetes: dreams on a deserted islet? Diabetologia. 2005 Nov;48(l l):2200-2.

12. Baeza N, Hart A, Ahlgren U, Edlund H. Insulin promoter factor-1 controls several aspects of beta-cell identity. Diabetes. 2001 Feb;50 Suppl 1:S36.

13. Bailly A, Torres-Padilla ME, Tinel AP, Weiss MC. An enhancer element 6 kb upstream of the mouse HNF4alphal promoter is activated by glucocorticoids and liver-enriched transcription factors. Nucleic Acids Res. 2001 Sep l;29(17):3495-505.

14. Banerjee M, Kumar A, Bhonde RR. Reversal of experimental diabetes by multiple bone marrow transplantation. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Mar 4;328(1):318-25.

15. Barbacci E, Reber M, Ott MO, Breillat C, Huetz F, Cereghini S. Variant hepatocyte nuclear factor 1 is required for visceral endoderm specification. Development. 1999 Nov;126(21):4795-805.

16. Bhushan A, Itoh N, Kato S, Thiery JP, Czernichow P, Bellusci S, Scharfmann R. FgflO is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis. Development. 2001 Dec;128(24):5109-17.

17. Blyszczuk P., Czyz, J., Kania G., Wanger M., et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulin-producing cells. Proc. 2003.

18. Brissova M, Shiota M, Nicholson WE, Gannon M, Knobel SM, Piston DW, Wright CV, Powers AC. Reduction in pancreatic transcription factor PDX-1 impairs glucose-stimulated insulin secretion. J Biol Chem. 2002 Mar 29;277(13):11225-32.

19. Caplan AI. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 2008 Sep ll;3(3):229-30.

20. Chang X, Jorgensen AM, Bardrum P, Led JJ. Solution structures of the R6 human insulin hexamer. Biochemistry. 1997 Aug 5;36(31):9409-22.

21. Chao KC, Chao KF, Fu YS, Liu SH. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's Jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 2008 Jan 16;3(l):el451.

22. Chen LB, Jiang XB, Yang L. Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells. World J Gastroenterol. 2004 Oct 15;10(20):3016-20.

23. Chen Y, Hu X, Wei LN. Molecular interaction of retinoic acid receptors with coregulators PCAF and RIP 140. Mol Cell Endocrinol. 2004 Oct 29;226(l-2):43-50.

24. Cissell MA, Zhao L, Sussel L, Henderson E, Stein R. Transcription factor occupancy of the insulin gene in vivo. Evidence for direct regulation by Nkx2.2. J Biol Chem. 2003 Jan 10;278(2):751-6. Epub 2002 Nov 7.

25. Coffinier C, Barra J, Babinet C, Yaniv M. Expression of the vHNFl/HNFlbeta homeoprotein gene during mouse organogenesis. Mech Dev. 1999 Dec;89(l-2):211-3.

26. Dahl E, Koseki H, Balling R. Pax genes and organogenesis. Bioessays. 1997 Sep;19(9):755-65.

27. Dahlstrand J, Zimmerman LB, McKay RD, Lendahl U. Characterization of the human nestin gene reveals a close evolutionary relationship to neurofilaments. J Cell Sci. 1992 Oct; 103 (2):589-97.

28. Deryl L. Troyer R, Mark L. Weiss S. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells 2008; 26; 591-599.

29. Di Guglielmo GM, Drake PG, Baass PC, Authier F, Posner BT, Bergeron JJ. Insulin receptor internalization and signalling. Mol Cell Biochem. 1998 May; 182(l-2):59-63.

30. Duester G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 2008 Sep 19;134(6):921-31.

31. Dutta S, Gannon M, Peers B, Wright C, Bonner-Weir S, Montminy M. PDX:PBX complexes are required for normal proliferation of pancreatic cells during development. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jan 30;98(3): 1065-70. Epub 2001 Jan 16.

32. Edlund H. Pancreatic organogenesis—developmental mechanisms and implications for therapy. Nat Rev Genet. 2002 Jul;3(7):524-32.

33. Fortini ME, Artavanis-Tsakonas S. Notch: neurogenesis is only part of the picture. Cell. 1993 Dec 31 ;75(7): 1245-7.

34. Galameau L, Paré JF, Allard D, Hamel D, Levesque L, Tugwood JD, Green S, Bélanger L. The alpha 1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family. Mol Cell Biol. 1996 Jul;16(7):3853-65.

35. Gamer LW, Wright CV. Autonomous endodermal determination in Xenopus: regulation of expression of the pancreatic gene XlHbox 8. Dev Biol. 1995 Sep;171(l):240-51.

36. Gerrish K, Cissell MA, Stein R. The role of hepatic nuclear factor 1 alpha and PDX-1 in transcriptional regulation of the pdx-1 gene. J Biol Chem. 2001 Dec 21;276(51):47775-84. Epub 2001 Oct 5.

37. Gradwohl G, Dierich A, LeMeur M, Guillemot F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Feb 15;97(4):1607-11.

38. Grapin-Botton A, Majithia AR, Melton DA. Key events of pancreas formation are triggered in gut endoderm by ectopic expression of pancreatic regulatory genes. Genes Dev. 2001 Feb 15;15(4):444-54.

39. Gu G, Dubauskaite J, Melton DA. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development 2002 May; 129(10):2447-57.

40. Hansson M et al., Artifactual insulin release from differentiated embryonic stem cells, Diabetes 2004; 53.

41. Hayhurst GP, Lee YH, Lambert G, Ward JM, Gonzalez FJ. Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis. Mol Cell Biol. 2001 Feb;21(4): 1393-403.

42. Hebrok M, Kim SK, Melton DA. Notochord repression of endodermal Sonic hedgehog permits pancreas development. Genes Dev. 1998 Jun 1;12(11):1705-13.

43. Henry GL, Melton DA. Mixer, a homeobox gene required for endoderm development. Science. 1998 Jul 3;281(5373):91-6.

44. Herrera PL. Adult insulin- and glucagon-producing cells differentiate from two independent cell lineages. Development. 2000 Jun; 127(11):2317-22.

45. Horb ME, Shen CN, Tosh D, Slack JM. Experimental conversion of liver to pancreas. CurrBiol. 2003 Jan 21; 13(2): 105-15.

46. Ishibashi M, Moriyoshi K, Sasai Y, Shiota K, Nakanishi S, Kageyama R. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. EMBO J. 1994 Apr 15;13(8):1799-805.

47. Iso T, Kedes L, Hamamori Y: HES and HERP families: multiple effectors of the Notch signaling pathway. J Cell Physiol. 2003 Mar;194(3):237-55.

48. Jacquemin P, Lemaigre FP, Rousseau GG.The Onecut transcription factor HNF-6 (OC-1) is required for timely specification of the pancreas and acts upstream of Pdx-1 in the specification cascade. Dev Biol. 2003 Jun 1;258(1):105-16.

49. Jarikji ZH, Vanamala S, Beck CW, Wright CV, Leach SD, Horb ME. Differential ability of Ptfla and Ptfla-VP16 to convert stomach, duodenum and liver to pancreas. Dev Biol. 2007 Apr 15;304(2):786-99.

50. Jensen J, Serup P, Kaiisen C, Nielsen TF, Madsen OD. mRNA profiling of rat islet tumors reveals nkx 6.1 as a beta-cell-specifichomeodomain transcription factor. J Biol Chem. 1996 Aug 2;271(31): 18749-58.

51. Jonsson J, Carlsson L, Edlund T, Edlund H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 1994 Oct 13;371 (6498):606-9.

52. Kajiyama H, Hamazaki TS, Tokuhara M, Masui S, Okabayashi K. Pdxl-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice. Int J Dev Biol. 2010;54(4):699-705.

53. Kaneto H, Miyatsuka T, Kawamori D, Matsuoka TA. Pleiotropic Roles of PDX-1 in the Pancreas. Rev Diabet Stud. 2007 Winter;4(4):209-25.

54. Karges B, Durinovic-Bello I, Heinze E, Debatin KM, Boehm B, Karges W. Immunological mechanisms associated with long-term remission of human type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 2006 May-Jun;22(3): 184-9.

55. Karnieli O, Izhar-Prato Y, Bulvik S, Efrat S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 2007 Nov;25(l l):2837-44.

56. Kawaguchi Y, Cooper B, Gannon M, Ray M, MacDonald RJ, Wright CV. The role of the transcriptional regulator Ptfla in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nat Genet. 2002 Sep;32(l): 128-34.

57. Kim SK, Hebrok M, Melton DA. Notochord to endoderm signaling is required for pancreas development. Development. 1997 Nov; 124(21):4243-52.

58. Kim SK, Selleri L, Lee JS, Zhang AY, Gu X, Jacobs Y, Cleary ML. Pbxl inactivation disrupts pancreas development and in Ipfl-deficient mice promotes diabetes mellitus. Nat Genet. 2002 Apr;30(4):430-5.

59. Kojima H, Fujimiya M, Matsumura K, Younan P, Imaeda FI, Maeda M, Chan L. NeuroD-betacellulin gene therapy induces islet neogenesis in the liver and reverses diabetes in mice. Nat Med. 2003 May;9(5):596-603.

60. Kos R, Reedy MV, Johnson RL, Erickson CA. The winged-helix transcription factor FoxD3 is important for establishing the neural crest lineage and repressing melanogenesis in avian embryos. Development. 2001 Apr; 128(8): 1467-79.

61. Koutsourakis M, Langeveld A, Patient R, Beddington R, Grosveld F. The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development. Development. 1999 Feb;126(4):723-32.

62. Krapp A, Knofler M, Frutiger S, Hughes GJ, Hagenbiichlc O, Wellauer PK. The p48 DNA-binding subunit of transcription factor PTF1 is a new exocrine pancreas-specific basic helix-loop-helix protein. EMBO J. 1996 Aug 15;15(16):4317-29.

63. Kristinsson SY, Thorolfsdottir ET, Talseth B, Steingrimsson E, Thorsson AV, Helgason T, Hreidarsson AB, Arngrimsson R. MODY in Iceland is associated with mutations in HNF-1 alpha and a novel mutation in NeuroDl. Diabetologia. 2001 Nov;44(l 1):2098-103.

64. Lammert E, Brown J, Melton DA. Notch gene expression during pancreatic organogenesis. MechDev. 2000 Jun;94(l-2): 199-203.

65. Lammert E, Gu G, McLaughlin M, Brown D, Brekken R, Murtaugh LC, Gerber HP, Ferrara N, Melton DA. Role of VEGF-A in vascularization of pancreatic islets. Curr Biol. 2003 Jun 17;13(12):1070-4.

66. Lee JE, Hollenberg SM, Snider L, Turner DL, Lipnick N, Weintraub H. Conversion of Xenopus ectoderm into neurons by NeuroD, a basic helix-loop-helix protein. Science. 1995 May 12;268(5212):836-44.

67. Lee SH, Lumelsky N, Studer L, Auerbach JM, McKay RD. Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2000 Jun;18(6):675-9.

68. Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 1990 Feb 23;60(4):585-95.

69. Leonard J, Peers B, Johnson T, Ferreri K, Lee S, Montminy MR. Characterization of somatostatin transactivating factor-1, a novel homeobox factor that stimulates somatostatin expression in pancreatic islet cells. Mol Endocrinol. 1993 Oct;7(10):1275-83.

70. Leon-Quinto T, Jones J, Skoudy A, Burcin M, Soria B. In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells. Diabetologia 2004. 47(8): 1442-1451.

71. Li L, Yi Z, Seno M, Kojima I. Activin A and betacellulin: effect on regeneration of pancreatic beta-cells in neonatal streptozotocin-treated rats. Diabetes. 2004 Mar;53(3):608-15.

72. Li Y, Zhang R, Qiao H, Zhang H, Wang Y, Yuan H, Liu Q, Liu D, Chen L, Pei X. Generation of insulin-producing cells from PDX-1 gene-modified human mesenchymal stem cells. J Cell Physiol. 2007 Apr;21 l(l):36-44.

73. Lingohr MK, Dickson LM, McCuaig JF, Hugl SR, Twardzik DR, Rhodes CJ. Activation of IRS-2-mediated signal transduction by IGF-1, butnot TGF-alpha or EGF, augments pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 2002 Apr;51(4):966-76

74. Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, McKay R. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science. 2001 May 18;292(5520):1389-94.

75. Mansouri A, Hallonet M, Grass P. Pax genes and their roles in cell differentiation and development. Curr Opin Cell Biol. 1996 Dec;8(6):851-7.

76. Martinez-Barbera JP, Rodriguez TA, Beddington RS. The homeobox gene Hesxl is required in the anterior neural ectoderm for normal forebrain formation. Dev Biol. 2000 Jul 15;223(2):422-30.

77. McLin VA, Rankin SA, Zorn AM. Repression of Wnt/beta-catenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development. Development. 2007 Jun;134(12):2207-17.

78. Mhashilkar A., Chada S., Roth J.A., Ramesh R. Gene therapy. Therapeutic approaches and implications. Biotechnology Advances, 2001 (19), C.279-297;

79. Miller CP, McGehee RE Jr, Habener JF. IDX-1: a new homeodomain transcription factor expressed in rat pancreatic islets and duodenum that transactivates the somatostatin gene. EMBO J. 1994 Mar 1 ;13(5):1145-56.

80. Molkentin JD. The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. J Biol Chem. 2000 Dec 15;275(50):38949-52.

81. Morrisey EE, Tang Z, Sigrist K, Lu MM, Jiang F, Ip HS, Parmacek MS. GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo. Genes Dev. 1998 Nov 15;12(22):3579-90.

82. Morrow EM, Furukawa T, Lee JE, Cepko CL.NeuroD regulates multiple functions in the developing neural retina in rodent. Development. 1999 Jan;126(l):23-36.

83. Muhammad BJ, Swift PG, Raymond NT, Botha JL. Partial remission phase of diabetes in children younger than age 10 years. Arch Dis Child. 1999 Apr;80(4):367-9.

84. Narita N, Heikinheimo M, Bielinska M, White RA, Wilson DB. The gene for transcription factor GATA-6 resides on mouse chromosome 18 and is expressed in myocardium and vascular' smooth muscle. Genomics. 1996 Sep l;36(2):345-8.

85. Naya FJ, Stellrecht CM, Tsai MJ.Tissue-specific regulation of the insulin gene by a novel basic helix-loop-helix transcription factor. Genes Dev. 1995 Apr 15;9(8):1009-19.

86. Niidome T., Huang L. Gene therapy. Progress and prospects: nonviral vectors. Gene therapy, 2002 (9), C. 1647-1652;

87. Ning H., Lin G., Lue T.F. and Lin C.S. Neuron-like differentiation of adipose tissue-derived stromal cells and vascular smooth muscle cells. Differentiation, 2006, 74(9-10): 510-8.

88. Noll M. Evolution and role of Pax genes. Curr Opin Genet Dev. 1993 Aug;3(4):595-605.

89. Offield MF, Jetton TL, Labosky PA, Ray M, Stein RW, Magnuson MA, Hogan BL, Wright CV. PDX-1 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duodenum. Development. 1996 Mar; 122(3):983-95.

90. Ogawa W, Matozaki T, Kasuga M. Role of binding proteins to IRS-1 in insulin signalling. Mol Cell Biochem. 1998 May; 182(1-2): 13-22.

91. Ohlsson H, Karlsson K, Edlund T. IPF1, a homeodomain-containing transactivator of the insulin gene. EMBO J. 1993 Nov;12(ll):4251-9.

92. Ohlsson H, Karlsson O, Edlund T. A beta-cell-specific protein binds to the two major regulatory sequences of the insulin gene enhancer. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Jun;85(12):4228-31.

93. Ohtsuka T, Sakamoto M, Guillemot F, Kageyama R. Roles of the basic helix-loop-helix genes Flesl and Hes5 in expansion of neural stem cells of the developing brain. J Biol Chem. 2001 Aug 10;276(32):30467-74.

94. Olbrot M, Rud J, Moss LG, Sharma A. Identification of beta-cell-specific insulin gene transcription factor RIPE3bl as mammalian MafA. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 May 14;99(10):6737-42.

95. Oster A, Jensen J, Serup P, Galante P, Madsen OD, Larsson LI. Rat endocrine pancreatic development in relation to two homeobox gene products (Pdx-1 and Nkx 6.1). J Histochem Cytochem. 1998 Jun;46(6):707-15.

96. Park SM, Kim SM, Flan JH. The role of epithelial-mesenchymal transition in the gastroenterology. Korean J Gastroenterol. 2010 Aug;56(2):69-77.

97. Parekh VS, Joglekar MV, Hardikar AA. Differentiation of human umbilical cord blood-derived mononuclear cells to endocrine pancreatic lineage. Differentiation. 2009 Nov;78(4):232-40.

98. Peers B, Leonard J, Sharma S, Teitelman G, Montminy MR.Insulin expression in pancreatic islet cells relies on cooperative interactions between the helix loop helix factor E47 and the homeobox factor STF-1. Mol Endocrinol. 1994 Dec;8(12): 1798-806.

99. Pfaff SL, Mendelsohn M, Stewart CL, Edlund T, Jessell TM. Requirement for LIM homeobox gene Isll in motor neuron generation reveals a motor neuron-dependent step in interneuron differentiation. Cell. 1996 Jan 26;84(2):309-20.

100. Rajagopal J., Anderson W., Kume S., et al. Insulin staining of ES cell progeny from insulin uptake. Science 2003; 299: 363.

101. Rausa F, Galarneau L, Bélanger L, Costa RH. The nuclear receptor fetoprotein transcription factor is coexpressed with its target gene HNF-3beta in the developing murine liver, intestine and pancreas. Mech Dev. 1999 Dec;89(l-2):185-8.

102. Reiter JF, Kikuchi Y, Stainier DY. Multiple roles for Gata5 in zebrafish endoderm formation. Development. 2001 Jan;128(l):125-35.

103. Sasai Y, Kageyama R, Tagawa Y, Shigemoto R, Nakanishi S. Two mammalian helix-loop-helix factors structurally related to Drosophila hairy and Enhancer of split. Genes Dev. 1992 Dec;6(12B):2620-34.

104. Scholin A, Berne C, Schvarcz E, Karlsson FA, Bjork E. Factors predicting clinical remission in adult patients with type 1 diabetes. J Intern Med. 1999 Feb;245(2): 155-62.

105. Schwitzgebel VM, Scheel DW, Conners JR, Kalamaras J, Lee JE, Anderson DJ, Sussel L, Johnson JD, German MS. Expression of neurogenin3 reveals an islet cell precursor population in the pancreas. Development. 2000 Aug;127(16):3533-42.

106. Segev H., Fishman B., Ziskind A. et al. Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters. Stem Cells 2004; 22(3): 265-74.

107. Segura T., Shea L.D. Materials for non-viral gene delivery. Annu Rev Mater, 2001 (31), C.25-46;

108. Sellick GS, Barker KT, Stolte-Dijkstra I, Fleischmann C, Coleman RJ, Garrett C, Gloyn AL, Edghill EL, Hattersley AT, Wellauer PK, Goodwin G, Houlston RS. Mutations in PTF1A cause pancreatic and cerebellar agenesis. Nat Genet. 2004 Dec;36(12):1301-5.

109. Sladek FM, Zhong WM, Lai E, Darnell JE Jr. Liver-enriched transcription factor FÍNF-4 is a novel member of the steroid hormone receptor superfamily. Genes Dev. 1990 Dec;4(12B):2353-65.

110. Soria B, Roche E, Berná G, León-Quinto T, Reig JA, Martín F. Diabetes. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. 2000 Feb;49(2): 157-62.

111. Sosa-Pineda B. The gene Pax4 is an essential regulator of pancreatic beta-cell development. Mol Cells. 2004 Dec 31;18(3):289-94.

112. Stoffers DA, Zinkin NT, Stanojevic V, Clarke WL, Habener JF. Pancreatic agenesis attributable to a single nucleotide deletion in the human 1PF1 gene coding sequence. Nat Genet. 1997 Jan; 15(1): 106-10.

113. St-Onge L, Sosa-Pineda B, Chowdhury K, Mansouri A, Gruss P. Pax6 is required for differentiation of glucagon-producing alpha-cells in mouse pancreas. Nature. 1997 May 22;387(6631):406-9.

114. Suarez-Pinzon WL, Yan Y, Power R, Brand SJ, Rabinovitch A. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin increases beta-cell mass and reverses hyperglycemia in diabetic NOD mice. Diabetes. 2005 Sep;54(9):2596-601.

115. Sun Z, Hopkins N. vhnfl, the MODY5 and familial GCKD-associated gene, regulates regional specification of the zebrafish gut, pronephros, and hindbrain. Genes Dev. 2001 Dec l;15(23):3217-29.

116. Thor S, Ericson J, Brännström T, Edlund T. The homeodomain LIM protein Isl-1 is expressed in subsets of neurons and endocrine cells in the adult rat. Neuron. 1991 Dec;7(6):881-9.

117. Tremblay KD, Hoodless PA, Bikoff EK, Robertson EJ. Formation of the definitive endoderm in mouse is a Smad2-dependent process. Development. 2000 Jul;127(14):3079-90.

118. Uittenbogaard M, Chiaramello A. Constitutive overexpression of the basic helix-loop-helix Nexl/MATH-2 transcription factor promotes neuronal differentiation of PC 12 cells and neurite regeneration. J Neurosci Res. 2002 Jan 15;67(2):235-45.

119. Vaxillaire M, Froguel P. Monogenic diabetes in the young, pharmacogenetics and relevance to multifactorial forms of type 2 diabetes». Endocr. Rev. 2008 May; 29 (3): 254-64.

120. Verma I, Weitzman M. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem. 2005;74:711-38.

121. Vetere A, Marsich E, Di Piazza M, Koncan R, Micali F, Paoletti S. Neurogenin3 triggers beta-cell differentiation of retinoic acid-derived endoderm cells. Biochem J. 2003 May l;371(Pt 3):831-41.

122. Watada H, Mirmira RG, Leung J, German MS. Transcriptional and translational regulation of beta-cell differentiation factor Nkxö.l. J Biol Chem. 2000 Nov 3;275(44):34224-30.

123. Weber H, Symes CE, Walmsley ME, Rodaway AR, Patient RK. A role for GATA5 in Xenopus endoderm specification. Development. 2000 0ct;127(20):4345-60.

124. Wu KL, Gannon M, Peshavaria M, Offield MF, Henderson E, Ray M, Marks A, Gamer LW, Wright CV, Stein R. Hepatocyte nuclear factor 3beta is involved in pancreatic beta-cell-specific transcription of the pdx-1 gene. Mol Cell Biol. 1997 0ct;17(10):6002-13.

125. Yamada S, Kojima I. Regenerative medicine of the pancreatic beta cells. J Hepatobiliary Pancreat Surg. 2005; 12(3):218-26.

126. Yamagata K, Furuta H, Oda N, Kaisaki PJ, Menzel S, Cox NJ, Fajans SS, Signorini S, Stoffel M, Bell GI. Mutations in the hepatocyte nuclear factor-4alpha gene in maturity-onset diabetes of the young (MODY1) Nature. 1996 Dec 5;384(6608):458-60.

127. Yang H, Lu MM, Zhang L, Whitsett JA, Morrisey EE. GATA6 regulates differentiation of distal lung epithelium. Development. 2002 May;129(9):2233-46.

128. Yang X, Li C, Xu X, Deng C. The tumor suppressor SMAD4/DPC4 is essential for epiblast proliferation and mesoderm induction in mice. Proc Natl Acad Sei USA. 1998 Mar 31;95(7):3667-72.

129. Yoon YS, Noma T, Yamashiro Y, Ito H, Nakazawa A. Molecular cloning and characterization of the gene encoding human NeuroD. Neurosci Lett. 1998 Jul 17;251(1): 17-20.

130. Yuan X, Yamada K, Ishiyama-Shigemoto S, Koyama W, Nonaka K. Identification of polymorphic loci in the promoter region of the serotonin 5-HT2C receptor gene and their association with obesity and type II diabetes. Diabetologia. 2000 Mar;43(3):373-6.

131. Zhang CK, Lin W, Cai YN, Xu PL, Dong H, Li M, Kong YY, FuG, Xie YH, Huang GM, Wang Y. Characterization of the genomic structure and tissue-specific promoter of the human nuclear receptor NR5A2 (hBlF) gene. Gene. 2001 Aug 8;273(2):239-49.

132. Zhang L, Hong TP, Hu J, Liu YN, Wu YH, Li LS. Nestin-positive progenitor cells isolated from human fetal pancreas have phenotypic markers identical to mesenchymal stem cells. World J Gastroenterol. 2005 May 21;11(19):2906-11.

133. Zhou Q, Brown J, Kanarek A, Rajagopal J, Melton DA. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 2008 Oct 2;455(7213):627-32.

134. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., MizunoH., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P. and Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell, 2002, 13(12): 4279-95.