Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Получение индольных димерных алкалоидов в культуре ткани Catharanthus roseus L. как ресурсосберегающая технология

ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Получение индольных димерных алкалоидов в культуре ткани Catharanthus roseus L. как ресурсосберегающая технология"

РГВ од

На правах рукописи

2СНН :: ;

ЮШКОВА Елена Викторовна

ПОЛУЧЕНИЕ ИIIДОЛЬНЫХ ДИМЕРНЫХ АЛКАЛОИДОВ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ СА ТНАЮтТНиБ ЛОБЕЮ ь. КАК РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ

11.00.11 - Охрана окружающей среды и рациональное использование

природных ресурсов 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

На правах рукописи

ЮШКОВА Елена Викторовна

ПОЛУЧЕНИЕ ИНДОЛЬНЫХ ДИМЕРНЫХ АЛКАЛОИДОВ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ СА ТНАКАИТНиБ КОБЕиБ Ь. КАК РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ ТЕХНОЛОГИЯ

11.00.11 - Охрана окружающей среды и рациональное использование

природных ресурсов 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Работа выполнена в проблемной лаборатории Сибирского государственного технологического университета.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Репях С.М.

кандидат технических наук, доцент Величко H.A.

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Войнов H.A. кандидат технических наук, доцент Давыдова JI.H.

Ведущая организация: Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН

г.Красноярск

Защита состоится «Д^ » К 1998 г. в[0"на заседании диссертационного совета Д 063.83.01 в Сибирском государственном технологическом университете по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 82.

Овыв на автореферат в двух экземплярах с заверенными под писями просим присылать ученому секретарю диссертационного совета Д 063.83.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «_

г »¡к 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук, доцент Исаева Е.В.

(Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

В настоящее время проблемы охраны окружающей среды и ее рацио-ального использования стали предметом серьезных научных исследований и готъемлемой стороной организации современного производства.

Ухудшение экологической ситуации, нерациональное использование риродных ресурсов, техногенное воздействие человека на окружающую сре-/ отрицательно влияет на сохранность генофонда лекарственных растений.

Многие виды лекарственных и декоративных растений, интродуциро-шных на территории нашей страны в настоящее время требуют специальной -ратегии для их сохранения. Крупномасштабное использование медленно «обновляемых плантаций постепенно приводит к их сокращению. В част-эсти неуклонно сокращается выращивание катара/¡ту са розового мЛагашЪия гохеш С.Поп.) — растения, содержащего уникальную совокуп-эсть индольных димерных алкалоидов, используемых для получения проти-эраковых препаратов.

В связи с возрастающими требованиями к рациональному использова-;ио сырья, напряженной экологической обстановкой возросло внимание неге дователей и производственников к вопросам создания рациональных и ■хничсски обоснованных безотходных технологий получения ценных проектов вторичного синтеза растений.

Становится актуальным поиск и разработка новых ресурсосберегаю-;их, экологически чистых и безотходных технологий, по эффективности со-эставимых или превосходящих использование традиционного сырья. Одной $ таких технологий является культура клеток и тканей растений, которая, эоме того, рассматривается как нетрадиционный метод охраны лекарствен-ых растений.

Развитию культуры клеток в качестве альтернативного источника родуктов вторичного метаболизма способствовали определенные пре-

имущества этого способа включая независимость от сезонных условий, болезней и их переносчиков и возможность получать требуемый продукт, обладающий качественными характеристиками в необходимых количествах, вне зависимости от политических ограничений.

Таким образом, создание ресурсосберегающей технологии получения в условиях in vitro ценных биологически активных веществ растений становится актуальной задачей.

Цель работы.

Разработка научных основ получения индольных димерных алкалоидов в культуре растительных клеток с созданием ресурсосберегающей технологии.

В задачи исследования входило:

- получить высокопродуктивный клон Catharanthus roseus L. в условиях in vitro.

- разработать условия, способы и этапы получения клеточных линий Catharanthus roseus L., обеспечивающие выход индольных димерных алкалоидов.

- исследовать влияние эпигенетических и биотических факторов на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L.

- исследовать состав каллусной ткани Catharanthus roseus L.

- разработать принципиальную технологическую схему получения индольных димерных алкалоидов в культуре ткани Catharanthus roseus L.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Комплексное использование и воспроизводство древесного сырья», тема 03.001.06.

Научная новизна.

Впервые разработана ресурсосберегающая, экологически чистая и безотходная технология получения индольных димерных алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L. Показана зависимость выхода алка-

лоидов от структуры ткани. Исследован химический состав каллусной ткани СаАгагаЫНив гоБеш Ь.

Установлена зависимость выхода алкалоидов от активности ключевых ферментов шикиматного пути биосинтеза вторичных соединений.

Изучено влияние различных эпигенетических факторов, влияющих на выход индольных димерных алкалоидов (состав питательной среды, уровень освещенности, способ культивирования, влияние элиситоров).

Предложен способ получения индольных димерных алкалоидов в тканях катарантуса розового на инертном носителе (пенополиуретане) и разработаны условия, позволяющие повысить выход димерных алкалоидов.

Практическая значимость.

На основе представленных научных и экспериментальных исследований разработана технология получения индольных димерных алкалоидов, позволяющих увеличить производительность и сохранить генофонд растений.

Получен высокопродуктивный каллусный клон катарантуса, продуцирующий индольные димерные алкалоиды. Отработаны и методически описаны этапы и способы культивирования эмбриогенной каллусной ткани катарантуса. Подобран гормональный состав сред, позволяющий совмещать активный рост тканей и синтез индольных димерных алкалоидов.

Автор защищает:

Результаты теоретических и экспериментальных исследований получения высокопродуктивного клона, клеточных линий катарантуса розового, влияние физико-химических факторов среды на рост и развитие кал-тусной ткани, принципиальную технологическую схему получения димерных индольных алкалоидов в клеточной культуре катарантуса розового.

Апробация работы.

Результаты исследований докладывались на Международной научной конференции «Прогрессивные технологии и техника в пищевой про-

мышленности» (Краснодар, 1994); на VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997.); на Всероссийской научно-практической конференции «Эколого-экономические проблемы лесного комплекса», (Санкт-Петербург, 1997); региональной научно-практической конференции «Проблемы химико-лесного комплекса» (Красноярск, 1997), на Международной научно-практической конференции «Проблемы гомеостаза...» (Красноярск, 1998); на Международном совещании «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» (Новосибирск, 1998).

Теоретические и экспериментальные результаты исследования обсуждались на методологических семинарах лаборатории биотехнологии кафедры химической технологии древесины СибГТУ, лаборатории экологической физиологии и биохимии института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН в 1994-1998 гг.

По теме диссертационного исследования опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения и 3 глав, выводов, списка литературы из 159 библиографических описаний и приложения. Материал изложен на 157 страницах, содержит 16 таблиц, 20 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава имеет обзорный характер. Рассматриваются литературные данные о применении метода культивирования клеточной биомассы растений с целью создания безотходных ресурсосберегающих технологий получения биологически активных веществ. Рассматриваются общие закономерности вторичного метаболизма растений in vivo и in vitro, роль вторичных соединений в жизнедеятельности растений, характер и законо-

мерности регуляции процессов первичного и вторичного синтеза в культуре растительной ткани in vitro.

Объекты исследования описаны во второй главе диссертационного исследования. Ими являлись интактные растения Catharanthus roseus L., а также инициированные из них каллусные культуры, выращиваемые при периодическом освещении (3500 лк) с фотопериодом 8ч- ночь: 16 ч- день, или в темноте, на модифицированных питательных средах Мурасиге и Скуга и Серлиса, содержащих гормоны, витамины, гидролизат казеина и сахарозу. В главе обсуждались способы, условия культивирования и методы проводимых исследований.

Рост каллусных культур оценивали гравитационным методом, по

т. — щ,п ,

удельной скорости роста ц = —-—- • г (сут '), где - ц - удельная скорость

ш

роста сухой биомассы, nij - масса сухой ткани в конечный момент времени; шм - масса сухой ткани в начальный момент времени; т - сутки, по ростовому индексу (прирост сырой биомассы за определенный период).

Культивирование иммобилизованных к л его к и участков каллусных тканей проводили в закрытых сосудах емкостью 250 мл на пепополиурета-новых пластинах диаметром 100 мм и толщиной 20-22 мм. Объем жидкой среды в каждом культуральпом сосуде составлял 70 мл.

Суспензионная культура клеток выращивалась из инокулированных в жидкую питательную среду участков каллуса катарантуса, выращенного на агаризованой среде. Культивирование проводили на качалке с частотой вращения - 65 об/мин. Рост суспензии оценивали методом осажденных клеток.

Для определения жизнеспособности клеток использовали раствор 5 % метиленового синего. Метод основан на избирательной проницаемости клеточной стенки живых и нежизнеспособных клеток.

Химический состав каллусной ткани исследовался по схеме, разработанной на кафедре химической технологии древесины для изучения хими-

ческого состава растительного сырья. Согласно схеме в высушенном и измельченном образце каллусной ткани устанавливали содержание зольных веществ, легко- и трудногидролизуемых полисахаридов, лигнина, содержание общего протеина, содержание экстрактивных веществ, суммы алкалоидов и количественного определения димерных индольных алкалоидов (винкристина и винбластина) по методикам, принятым в химии древесины и биохимии растений.

Для определения концентрации алкалоидов применяли метод ВЭЖХ.

Ферментативная активность ключевых ферментов шикиматного пути — хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы определялась по методике В.И.Осипова. Активность хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы измеряли по скорости восстановления NADP+.

Подготовку грибных элиситоров для стимулирования образования продуктов вторичного синтеза проводили по методу Левинсона, основанному на экстракции 70% этиловым спиртом.

Обработку результатов вели на персональном компьютере PC Р-100 с использованием пакетов Microsoft Excel и Math Cad. Проведен корреляционный и регрессионный анализ полученных результатов. Статистическая достоверность полученных результатов оценивалась с помощью пакета программ Microsoft Excel по значению t-критерия Стыодента, для 5 % уровня значимости.

В третьей главе диссертационного исследования представлены результаты экспериментов и их обсуждение.

Традиционно индольные димерные алкалоиды экстрагируют из ин-тактных растений катарантуса либо получают мономеры в суспензионной культуре клеток.

Оба эти способа имеют ряд существенных недостатков. Во-первых, получение веществ из растений непосредственно зависит от наличия гарантированного сырья, климатических и погодных условий. Во втором случае в суспензионной культуре синтезируются только мономеры. Выращивание

же интактных растений in vitro нецелесообразно по экономическим причинам из-за относительно медленного роста растений.

Разработанная технология позволяет получать димерные алкалоиды с большей эффективностью, чем традиционные способы, поскольку обеспечивается непрерывный рост и высокая скорость накопления биомассы.

Можно выделить 2 основных этапа технологии получения алкалоидов в каллусной культуре катарантуса.

Первый этапом работы - введение в культуру in vitro и выделение высокопродуктивного клеточного клона катарантуса. Второй - разработка технологии получения димерных алкалоидов с использованием полученного in vitro клона.

Введение в культуру in vitro осуществлялось на безгормональные питательные среды со стандартным минеральным составом по Мурасиге и Скугу (1962), Серлису (1979), Ничам (1965), Кнудсону (1943).

В результате экспериментов по введению в культуру растений катарантуса было обнаружено, что минеральный состав среды, при одних и тех же фото-и температурном режимах и одинаковом органическом фоне, влияет на процессы приживаемости, роста и регенерации введенных in vitro эксплаитов (таблица 1).

Таблица 1 - Влияние минерального состава питательных сред на приживаемость и качественные характеристики растений в условиях in vitro

Название среды Количество прижившихся растений ,в% Качественная характеристика растений

Мурасиге и Скуга (MS) 91,3 зеленые, одиночные, хорошо укореняющиеся

Серлиса (S) 86,3 зеленые, одиночные

Ничей (NN) 65,0 светлозеленые, этиолированные, кустистые

Кнудсона (С) 37,5 бледно-зеленые, с небольшими листьями, не укоренялись

Для поддержания роста пробирочных растений недостаточно их эндогенного уровня гормонов. Присутствие в среде 6-бензиламинопурина (6-БАП) з концентрации 1мг/л стимулировало формирование пазушных почек и раз-

витие растений-регенерантов вокруг участка верхушечной или пазушной меристемы.

Было отобрано восемь наиболее перспективных линии укорененных маточных пробирочных растений, отличавшихся между собой по индексу образования растений-регенерантов, накоплению индольных димеров алкалоидов (винкристина и винбластина и обладающих) высокой скоростью роста (таблица 2).

Таблица 2 - Общая характеристика пробирочных линий растений Catharanthw. roseusL.

Номер клона Индекс образования растений-регенерантов Суммарное содержание винкристина и винбластина, мкг/г, а.с.м. Удельная скорость роста растений, суг1

7.08 — 2,9 0,15

7.21 15 6,62 0,24

7.24 18 9,33 0,31

7.26 8 5,4 0,18

7.27 21 9,1 0,35

7.28 6 6,44 0,29

7.29 12 7,41 0,22

7.33 3 1,24 0,20

Установлено, что клоны с наиболее интенсивным образованием растений-регенерантов отличались также высокой удельной скоростью роста — 0,35 суг1 и повышенным синтезом индольных димеров.

Каллусогенез в культуре in vitro зависит от гормонального состава питательной среды и эксплантируемого участка интактного растения.

В качестве эксплантов были взяты листья, почки междоузлия и корни Для выяснения влияния качественного и количественного гормонального со става среды было использовано 67 различных концентраций гормонов дву> пар: а-нафтилуксусная кислота (сс-НУК) + 6-бензиламинопурин (6-БАП (условно группа А) и 2,4-дихлорфеносксиуксусная кислота (2,4-Д) + кинетш (К) (условно группа В).

Было установлено, что наиболее высоким был процент каллусообразо вания из эксплантов верхушечных меристем на среде с минеральной ochoboi по Мурасиге и Скугу с добавлением а-НУК и 6-БАП (10 и 1 мг/л соответст

венпо) и составил 95,3 % (рисунок 1). Доля каллусообразования из междоузлий составила 90,3 %, а из листьев - 74,8 %.

уровень ауксинов (а-НУК, мг/л)

ПОДмг/л И0,5мг/л □ I мй П2мг/л ИЗмг/л - уровень цитокининов (6-ЕАП)

Рисунок 1 - Каллусообразование (%) из эксплантов почек С.гозегк Ь, на средах с различным содержанием а-НУК и 6-БАП.

При использовании гормонов группы В отмечены более низкие показатели каллусообразования. Эксплапты из корней не образовывали кал-1ус ни на одной из использовавшихся питательных сред.

Известно, что белый свет оказывает стимулирующее действие на об-эазование хлоропластов из пропластид и этиопластов в растении, а синтез алкалоидов происходит в основном в хлоропластах. Установлено, что это, з свою очередь, обеспечиваег процессы первичного синтеза; приводит к дифференциации клеток в тканевые структуры; стимулирует эмбриогенез в <аллусной ткани.

В результате изучения влияния уровня освещенности на рост каллус-юй ткани, формирование эмбриогенного каллуса и накопление алкалои-(ов было установлено, что выращивание культуры клеток на свету с уров-1ем освещенности 3500 стимулировало процессы образования эмбриоген-юго каллуса в культуре катарантуса и способствовало накоплению алка-юидов. При культивировании каллусов в темноте ткань не содержала хло-

ропластов и была представлена меристемой и паренхимой. Не происход! ло формирование соматических эмбриоидов в тканях.

Каллусные ткани не автотрофны по типу питания. Исследоваш влияния концентрации сахарозы в питательной среде показало, что дин; мика роста при разных концентрациях сахарозы в целом не отличалас Однако микроскопирование ткани, показало значительные различия структуре ткани в зависимости от концентрации сахарозы в питательно среде. При 7 % содержании сахарозы наблюдалось большое количестЕ проводящих элементов и практически отсутствовали зародышевые ткан! что говорит о быстром старении культуры. На среде с 5% сахарозой бьи отмечено большое количество эмбриогенных структур, а к концу культ! вирования воздушно-сухая масса ткани, выращенной на данной среде бьи сравнима с таковой на среде с 7% сахарозы. Следует отметить, что на сре; с 3% сахарозы также происходило формирование эмбриогенных структу; однако выход биомассы на конец субкультивирования был ниже, чем I средах с 5 и 7% сахарозы. Таким образом, для культивирования эмбри< генного каллуса СаШагапЖш гозеш Ь наиболее приемлема 5 %-ная ко) центрация сахарозы.

Исследование влияния гормонального состава сред на рост и разв] тие каллусной ткани показали, что целом динамики роста каллусной тка1 имеют одинаковый характер и описываются сигмоидными кривыми, а т нии тренда - полиномиальными уравнениями (рисунок 2). Выход биомасс и структура каллусной ткани зависит от качественного состава фитого] монов. Среды, содержащие а-НУК и 6-БАП стимулировали образован! рыхлой, глобулярной ткани, формирующей в процессе культивирован! эмбриоидные структуры. Для оценки достоверности различий применял« ^критерий Стьюдента для 5 % уровня значимости. Достоверные различия накоплении биомассы отмечаются к 20 сут культивирования (Чф =11,45, щ = 2,26).

4 8 12 16 20 24 28 32

0 среда А сутки культивирования

а соеда в

Рисунок 2 - Динамика роста в изолированной культуре ткани СсИкагатЪш гозеш Ь. на средах с разным гормональным составом (среда А - а-НУК+6-БАП, среда В - 2,4-Д +кинетин).

Экспериментально было доказано, что гормональный состав питательной среды оказывал существенное влияние как на образование продуктов первичного синтеза, так и на синтез и накопление алкалоидов в тканях. В таблицах 3 и 4 отражена зависимость содержания алкалоидов, накапливающихся на стационарной фазе культивирования и общее содержание белка в тканях.

Таблица 3 - Накопление биомассы, содержание белка и алкалоидов в кулыуре СаОшгамИш гохеш I. на средах с разной концентрацией кинетика и постоянной 2,4-Д (0,5 мг/л)

Номер среды Кинетин, мг/л А.с.м. ткани, г/литр среды Содержание белка, мг/г Сумма алкалоидов, мг/г|

Ь7 1,5 4,5 10,1 2,4

Ь8 1 7,0 9,9 2,6

Ь9 0,5 8,8 20,7 0,9

ЫО 0,2 10,4 17,8 1,0 1

Ы1 0,02 6,3 15,7 0,6

В пересчете на 1 литр питательной среды за субкультивирование на средах с 2,4-Д и кинетином образовывалось в целом меньше алкалоидов, чем на средах с содержанием а-НУК и 6-БАП.

Таблица 4 - Накопление биомассы, содержание белка и алкалоидов в культуре СмкагапЛш гояеш I. на средах с разной концентрацией 6-БАП и постоянной а-НУК (10 мг/л)

Номер среды Содержание 6-БАП, мг/л А.с.м ткани, г/л среды белок, мг/г сумма алкалоидов, мг/г

а! 0,5 8,86 19,7 1,9

а2 1 12,78 11,4 3,3

аЗ 1,5 8,94 13,6 2,1

а4 2 6,9 16,5 1,26

а5 2,5 6,04 8,36 1,01

Корреляционный анализ полученных результатов показал наличие сильной отрицательной коррелятивной связи между накоплением в тканях белка и содержанием алкалоидов (коэффициент корреляции а = -0,87, для группы сред [2,4-Д+кинетин] и а = -0,91 для сред [а-НУК+6-БАП]). В этом случае справедливо считать, что существует тенденция к обратной зависимости между двумя этими параметрами, иными словами: либо в тканях происходит накопление белка, либо - синтез алкалоидов.

На рисунке 3 показана зависимость содержания алкалоидов, накапливающихся на стационарной фазе культивирования и абсолютно сухая масса ткани.

Коэффициент корреляции между накоплением биомассы (г/л среды) на конец субкультивирования и суммой алкалоидов (мг/г а.с.м.) составил 0,99, что говорит о прямой зависимости этих параметров.

14 т

а.с.м.

ткани,

г/л

среды

12-

10

3,5 !

Содер' жание укал с! идов в| ткани,! мг/г

2.5

1,5

0,5

О

0,5

' а.с.м ткани

1

• алкалоидов сумма

1,5

2 2,5

содержание 6-бап, мг/л

Рисунок 3 - Содержание алкалоидов, накапливающихся на стационарной фазе культивирования и прирост биомассы катарантуса в конце субкультивирования, с а-нук -const (10 мг/л) при различной концентрацией 6-БАП.

Анализ общего количества алкалоидов показал, что наибольшим их накоплением характеризовались ткани культивируемые на средах с концентрациями гормонов а-НУК - 10 мг/л и 6-БАП - 1 мг/л. В этом случае сумма алкалоидов составила 42,17 мг/на 1 л среды.

В результате проведенных исследований был эмпирически подобран гормональный состав питательной среды (а-НУК 10 мг/л и 6-БАП 1мг/л), при котором ткань обладала высокой скоростью роста, формировала эм-бриогенный каллус и продуцировала индольные димерные алкалоиды винкристин и винбластин.

8

4

Т

Было установлено, что каллусные культуры катарантуса розового синтезировали в основном винкристин, который в интактных растениях встречается в небольших (следовых) количествах.

Дальнейшее культивирование клеток катарантуса проводилось двумя способами: глубинным (в суспензии) и поверхностным: на агаре и на пено-полиуретановых пластинах. На рисунке 4 представлена динамика роста каллусной ткани Са&агамкш гохеш Ь, в зависимости от способа культивирования.

Было установлено, что наибольший прирост биомассы за период культивирования наблюдался при культивировании на пенополиуретане.

О 5 10 15 20 25 30 35

Время культивирования, сут ♦ Глубинное и поверхностное а на пенополеуретане

Рисунок 4 - Динамика роста каллусной ткани СаЛагаткиБ гозеш Ь. в зависимости от способа культивирования.

Повышение накопления биомассы и синтеза обусловлены совокупностью причин: за счет более полного использования ресурсов среды (благодаря тому, что среда жидкая, облегчается диффузия питательных веществ к клеткам); увеличивается влажность внутри сосуда.

Пенополиуретановые пластины можно рассматривать как химически нейтральную поддерживающую основу, позволяющую отказаться от использования агара, что удешевляет процесс.

В результате исследований было установлено, что способ культивирования каллусных тканей влияет на накопление в них алкалоидов. Было обнаружено, что культивирование каллусной ткани поверхностным способом положительно влияет на накопление винкристина. Использование пенополиуретана в качестве поддерживающей основы, позволило в 1,9 раза увеличить выход винкристина, по сравнению с выращиванием ткани на агаризованной питательной среде, ив 18,5 раз - по сравнению с глубинным способом культивирования.

Данные по содержанию винкристина и винбластина в культурах тканей СмНагаШкт гачеш Ь. при различных способах выращивания приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Содержание винкристина и винбластина в культурах тканей Catharanthus roseas L. при различных способах выращивания на 24-е сутки культивирования.

Способ культивирования Содержание винбластина, мкг/г а.с.м. Содержание винкристина, мкг/г а.с.м.

глубинное следы 3,12

на пенополиурстановых пластинах 3,4 57,8

поверхностное на агаре 1.2 31,0

Анализ литературных данных показал, что существует возможность регуляции вторичного синтеза в культуре ткани in vitro. Одним из способов регуляции является обработка клеток грибными элисисторами.

Культуры катарантуса, иммобилизованные на пенополиуретан, обрабатывались экстрактами из мицелиев грибов Aspergillus niger и Trichoderma sp. Характер роста культур при обработке разными грибными суспензиями в цепом был одинаков.

Действие экстрактов мицелиев грибов оказывало существенное влияние на накопление винкристина. Во всех вариантах его концентрация была выше, чем в контроле (таблица 6).

Таблица 6 - Влияние грибных эяиситоров на накопление винкристина и активность ферментов в культуре ткани С.го.чеиз Ь.

Обработка элиситором Содержание Активность ферментов, % от

винкристина контроля

мкг/г % от контроля ХДГ ШДГ

контроль (без элиситора) 57,87 100 100 100

Aspergillus niger 0,2% 316 546 415 257

Aspergillus niger 2% 92 160 121 207

Trichoderraa sp. 0,2 % 184 318 185 129

Trichoderma sp. 2 % 226 391 79 89

Максимальное накопление наблюдалось при культивировании с 0,2%-ным экстрактом аспергилла. Во всех вариантах опыта концентрация винбла-стина обнаруживалась в следовых количествах.

При этом изучалась активность ключевых ферментов шикиматного пути, по которому синтезируется предшественники индольных алкалоидов, — ши-киматдегидрогеназы и хинатдегидрогеназы. Было установлено, что обработка 0,2% экстрактом аспергилла увеличивает активность ХДГ и ШДГ.

Проведенный анализ химического состава тканей катарантуса показал, что в каллусных тканях Catharanthus roseiis L. содержатся экстрактивные вещества, легкогидролизуемые и трудногидролизуемые полисахариды, лигнин, зольные компоненты. В каллусной массе Catharanthus roseus L. количество легкогидролизуемых полисахаридов составляет 25,88 %, что на 6,6 % меньше, чем в листьях растения. Содержание трудногидролизуемых полисахарвдов составляет в каллусе 24,01 %, что также превышает содержание этого компонента в листе. Содержание лигнина в каллусе значительно превышает содержание лигнина в листе и составляет 17,02 %. Содержание экстрактивных веществ в каллусной ткани на 4 % меньше, чем в листьях и составляет 20,04 %. Содержание зольных компонентов в каллусе сопоставимо с таковым в листьях.

Условия культивирования каллусной ткани катарантуса розового с целью получения индольных димерных алкалоидов в культуре in vitro приведены в таблице 7.

Таблица 7 - Условия культивирования эмбриогенной каллусной ткани катаранту-са розового

Питательная среда Условия культивирования 1

Минеральная основа по Мурасиге и Скугу (1962), витамины: ниацин-НС1 1 мг/л, тиа-мин-HCl - 1 мг/л, пиридсксин-НС! - 1 мг/л, гидролизат казеина -500 мг/л, инозит - 500 мг/л, сахароза 50000 мг/л, экстракт мицелия Aspergillus niger - 0,2 %, рН-среды 5,8-5,9, а-НУК - 10 мг/л, 6-БАП - 1 мг/л. Температура 28-30 °С, Освещенность - 3500 лк укультивационного сосуда - 250 мл, Усрсды - 70 мл, Размер пенополиуретановой плас-тины -200x150x20 мм Длительность культивирования - 30 сут.

В данной работе предлагается принципиальная технологическая схема получения индольных димерных алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L.

Технологический процесс получения индольных димерных алкалоидов при поверхностном выращивании каллусной эмбриогенной ткани Catharanthus roseus L на инертном носителе состоит из следующих стадий: введение растений катарантуса в культуру in vitro и получение эмбриогенной каллусной ткани, иммобилизация каллусной ткани на инертный носитель, выращивание ткани на инертном носителе в световом термостате при 28-30 °С на жидкой питательной среде с использованием элиситоров; полученная биомасса изымается из растильного светового термостата и подается в экстрактор для получения грубых экстрактов из тканей, полученный экстракт суммы алкалоидов затем разделяется. Полученные таким образом индольные димер-ные алкалоиды подвергаются лиофильной сушке.

Предлагаемый способ культивирования каллусной ткани катарантуса с использованием иммобилизованных на инертный носитель эмбриоидов Catharanthus roseus L. позволяет получать индольные димерные алкалоиды в количествах превышающих их содержание в интактных растениях, при сохранении природных популяций, без вредных воздействий на окружающую среДУ-

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана возможность и определены условия формирования индольных димерных алкалоидов в культуре каллусной ткани катарантуса розового. Формирование индольных димерных алкалоидов происходит в эм-бриогенном каллусе, рост и развитие которого определяется в свою очередь сбалансированным гормональным составом питательной среды.

2. Установлено, что наиболее высокой была инициация кагшусообразо-вания из почек Catharanthus roseus L. на средах, содержащих а-НУК и 6-БАП (10 мг/л и 1 мг/л соответственно). Такой гормональный состав питательной среды обусловливает не только быстрый рост ткани, но и накопление индольных димерных алкалоидов.

3. Показано, что для поддержания активного роста эмбриогенного каллуса катарантуса розового и высокого синтеза индольных димерных алкалоидов наилучшим является поверхностный способ культивирования иммобилизованной на пенополиуретан ткани, что обеспечивает увеличение выхода винкристина.

4. Установлен химический состав каллусной ткани катарантуса розового. В каллусной ткани отмечено более высокое содержание полисахаридов и лигнина и более низкое содержание протеина, что связано с особенностями роста и развития ткани в условиях in vitro.

5. Показано, что реакция элиситации вызывает активный синтез винкристина в каллусных культурах Catharanthus roseus L. Во всех вариантах его концентрация была выше, чем в контроле. Наиболее эффективно действует экстракт из мицелия аспергилла. Максимальное накопление наблюдалось при культивировании с 0,2%-ным экстрактом аспергилла и позволило увеличить выход винкристина в 5,5 раз. Интенсивный синтез алкалоида обеспечивается активацией шикиматного пути, по которому синтезируются его предшественники.

6. Разработана принципиальная технологическая схема получения индольных димерных алкалоидов в каллусной культуре катарантуса розового,

основанная на культивировании эмбриогенного каллуса с использованием питательной среды с минеральным составом и витаминами по Мурасиге и Скугу, 5 % -ной сахарозой, гормонами: 6-БАП 1 мг/л и а-НУК 10 мг/л и добавлением элиситоров на пенополиуретане. Метод культивирования in vitro эмбрио! енной каллусной ткани Catharanthus roseus L. позволяет получать экологически чистые индольные димерные алкалоиды в количествах сопоставимых с интактными растениями, при сохранении природных популяций, без вредных воздействий на окружающую среду.

Основные положения диссертации содержатся в работах:

1. Юшкова Е.В., Моисеева Т.В., Величко H.A. Каллусная культура солодки уральской как источник получения сапонинов для пищевой промышленности // Тез. докл. международной научной конференции "Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности". Краснодар, 1994. С.71-72.

2. Юшкова Е.В. Моисеева Т.В., Величко H.A. Культивирование солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis L.) // В сб. трудов "Переработка растительного сырья и утилизация отходов" выпуск 2 Красноярск 1995. С.58-63.

3. Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Величко H.A. Формирование биологически активных веществ в культуре тканей высших растений. И В сб. трудов "Проблемы химико-лесного комплекса". Красноярск, 1996. c.l 1.

\. Репях С.М., Юшкова Е.В., Величко H.A. "Влияние физических и химических факторов на рост и развитие каллусной ткани левзеи сафлоровидной" // Биотехнология, № 8, М., 1996.С.45-49. 5. Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Репях С.М., Величко H.A. «Вторичный метаболизм в культуре ткани C.roseus.» Тез .докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда». - М.: МГУ, 1997. с 60. 5. A.c. 87-104, Питательная среда для выращивания культуры ткани Glycyrrhiza uralensis L. Юшкова Е.В., Моисеева Т.В., Величко H.A., Репях С.М. Заявл. 07.10.96. №94026958/13(026208).

7. Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Величко H.A., Репях С.М. «Получение экологически чистых БАВ методом культуры тканей». Тез. Докл. Научно-практическая конференция «Эколого-экономические проблемы лесного комплекса», Санкт-Петербург, 1997. С.120-121.

8. Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Величко H.A. «Состав каллусной ткани лекарственных растений» Тез.докл. начно-практ. конференция «Достижения науки и техники - развитию города Красноярска» 22-24 окт. 1997. С. 303.

9. Юшкова Е.В., Величко H.A., Кытманова М.В., Никонорова Е.В. «Культура ткани лекарственных растений. Методы получения биологически активных веществ». Тез. Докл., науч.практ. конф. «Проблемы химико-лесного комплекса» ч.П., Красноярск, 1997. С.53-54.

10. Шеин И.В., Зражевская Г.К, Юшкова Е.В., Репях С.М. «Действие грибных элиситоров на синтез индольных алкалоидов в каллусных культурах Са-tharanthus roseus L.). Материалы международного совещания «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» 15-18 апр. 1998 г. Новосибирск, 1998. С.71-72.