Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре CATHARANTHUS ROSEUS L.(DON)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре CATHARANTHUS ROSEUS L.(DON)"

На правах рукописи

ВЕЛИЧКО Надежда Александровна

НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ИНДУЦИРОВАННОГО СИНТЕЗА АЛКАЛОИДОВ В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ CATHARANTHUS ROSEUS L. (DON)

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Красноярск- 2004

Работа выполнена в Сибирском государственном технологическом университете на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии г. Красноярска.

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ,

доктор химических наук, профессор Репях Степан Михайлович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Гуревич Юрий Леонидович доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

академик Россельхозакадемии Сурин Николай Александрович

доктор биологических наук, профессор Анцупова Татьяна Петровна

Ведущая организация: Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Защита состоится 29 июня 2004 г: в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 Сибирского государственного технологического университета по адресу: г. Красноярск, пр. Мира, 82.

Отзывы на автореферат (в двух экземплярах с заверенными подписями) просим присылать ученому секретарю диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского государственного технологического университета

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Е.В. Исаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ: Постоянно возрастающий спрос на лекарственные растения, которые используют в народной и научной медицине приводит к быстрому сокращению их природных запасов. Становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве. В связи с этим культивирование тканей и клеток высших лекарственных растений in vitro, как альтернативный способ получения практически значимых биологически активных соединений специализированного обмена растений приобретает особую актуальность. Культуры изолированных клеток и тканей растений составляют основу современных биотехнологий получения вторичных метаболитов, представляющих практический интерес.

Одной из важных особенностей культуры ткани является сохранение способности к синтезу вторичных соединений свойственных виду. Эта особенность представляет практическую ценность культуры ткани как принципиально нового вида лекарственного сырья. Первичные культуры клеток и тканей обычно содержат незначительное количество веществ специализированного обмена или не содержат совсем.

Выяснение особенностей вторичного метаболизма, поиск методов повышения продуктивности является важной задачей и может послужить основой промышленной технологии получения ценных биологически активных соединений в частности алкалоидов.

Алкалоиды являются продуктами отдаленного синтеза в растениях и их искусственное получение затруднено в связи с многостадийностью процесса, низким выходом продукта, его высокой стоимостью.

' Алкалоиды Catharanthus roseus L. обладают важными фармакологическими свойствами. Мономерные алкалоиды этого растения обладают гипотонической и противоаритмической активностью.

I вИБЛИОТСКА Г ! 1

винбластин и винкристин используют в медицинской практике при химиотерапии ряда опухолевых заболеваний. В настоящее время препараты, содержащие эти алкалоиды, импортируются. Для их получения используют интактные растения, но выделение винкристина осложнено его низкими концентрациями. Именно поэтому Catharanthus roseus L. оказался интересным объектом для биотехнологического получения индольных димерных алкалоидов из культивируемых клеток. Решение задачи по регулированию процесса биосинтеза индольных димерных алкалоидов в культуре ткани Catharanthus roseus L. позволит предложить промышленный способ их получения с более высоким содержанием этих соединений. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Разработать научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L. в условиях in vitro, которые позволят повысить эффективность их биотехнологического производства.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

- получить высокопродуктивную каллусную культуру Catharanthus roseus L.;

- разработать высокоэффективный способ получения клеточной биомассы Catharanthus roseus L, содержащей индольные димерные алкалоиды;

- установить закономерности воздействия физико-химических факторов, способов культивирования, фактора элиситации на накопление биомассы и синтез индольных димерных алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus

L.;

- изучить влияние активности ключевых ферментов шикиматного пути на синтез индольных димерных алкалоидов;

- разработать стратегию направленного синтеза индольных димерных алкалоидов в культуре ткани Catharanthus roseus L.;

- разработать принципиальную технологическую схему получения индольных димерных алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L. и провести ее экономическую оценку.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ: Теоретически и экспериментально обоснована концепция направленного синтеза индольных димерных алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus Ь, позволяющая повысить их выход. Показана эффективность иммерсионного способа получения клеточной биомассы Catharanthus roseus L с использованием различных индукторов вторичного метаболизма. В качестве индукторов вторичного метаболизма использованы элиситор из плодового тела дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus и хвойные экстракты. Обоснован механизм регуляции синтеза индольных димерных алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L. при биотехнологическом производстве. Установлено влияние на синтез индольных димерных алкалоидов активности ключевых ферментов шикиматного пути синтеза. Показано, что интенсивный синтез алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus Ь обеспечивает активация ферментов шикиматного пути, по которому синтезируются их предшественники.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Полученные результаты имеют большое практическое значение с точки зрения повышения эффективности биотехнологического производства индольных димерных алкалоидов.

Получен высокопродуктивный каллусный клон Catharanthus roseus Ь, продуцирующий индольные димерные алкалоиды.

Разработаны методы культивирования эмбриогенной каллусной ткани Catharanthus roseus L..

Определен гормональный состав сред, обеспечивающий активный рост тканей и синтез индольных димерных алкалоидов.

Разработан способ получения эмбриогенной каллусной ткани Catharanthus го^ш Ь, с использованием инертных носителей, позволяющий повысить содержание индольных димерных алкалоидов.

На основе представленных научных и экспериментальных исследований разработана принципиальная технологическая схема получения димерных индольных алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Основные результаты докладывались и обсуждались на Международных, Всесоюзных, республиканских и региональных конференциях: на Всесоюзной конференции «Проблемы физиологии и биохимии древесных растений» (Красноярск, 1982), на Всесоюзной конференции «Превращение древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях» (Рига, 1985), на Международном симпозиуме UFRO (Рига, 1989), на Международном. симпозиуме «Строение, гидролиз и биотехнология растительной биомассы» (С-Петербург, 1У92). Международной инвестиционной конференции «Красноярскому краю - 60 лет» (Красноярск, 1994), Международной научной конференции «Прогрессивные технологии и техника в пищевой промышленности» (Краснодар, 1994), Международной инвестиционной конференции «Инвестиционные проекты Нижнего Приангарья и Красноярского края» (Красноярск, 1996), на Международном симпозиуме ЮФРО (Красноярск, 1996), на VII Международной конференции «Биология клеток растений ы vitro Биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), на Международном совещании «Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений» (Новосибирск, 1998), на Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Уфа,2002), на Всероссийских конференциях: «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар,2000), «Химическое образование и развитие общества» (Москва, 2000), «Химико-лесной комплекс - проблемы и решения» (Красноярск. 2003) и др.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано более 50 работ, получено 7 авторских свидетельств, 4 патента, опубликовано 2 учебных пособия.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ: Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы, приложения; материал изложен на 353 страницах, включая 59 рисунков, 38 таблиц и 290 наименований цитируемой литературы.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность использования культур изолированных клеток и тканей растений в современной биотехнологии.

Глава 1 Культура клеток и тканей растений - как источник биологически активных соединений.

Рассмотрен метод культуры изолированных органов и тканей в качестве нового объекта прикладной биотехнологии для массового воспроизводства, сохранения генофонда древесных и травянистых растительных форм, а также для получения практически значимых биологически активных соединений. Особое внимание уделено способности клеточных культур синтезировать вещества вторичной природы и биотехнологическому аспекту их использования. Отмечено, что основной проблемой метода культуры клеток и тканей высших растений для промышленного получения ценных вторичных метаболитов, является их низкий выход. Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что вторичный метаболизм в культуре тканей определяется не только генотипом растения, но и в большей степени зависит от внешних условий. Следовательно, варьируя химическими и физическими факторами, можно реально добиться того же уровня вторичного синтеза, как и в интактном растении, и даже превысить его. Показано, что условия оптимальные для роста и оптимальные для синтеза веществ, не всегда идентичны. Выяснения условий, обеспечивающих наилучший рост и максимальное содержание вторичных веществ, является важной задачей для биотехнологического использования растительных тканей и клеток, так как в условиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной,

чем в целом организме «сверхзадачей». Проанализированы общие закономерности вторичного метаболизма растений in vivo и in vitro, роль вторичных соединений в жизнедеятельности растений, характер и закономерности регуляции процессов первичного и вторичного синтеза в культуре растительной ткани in vitro. Приведены современные взгляда: на биохимические процессы, приводящие к синтезу алкалоидов в растениях и клеточных культурах.

Литературные данные свидетельствуют о сложности проблемы повышения выхода вторичных метаболитов. Образование и накопление биологически активных веществ является процессом, который в значительной степени подвержен регулятивному влиянию внешних и внутренних факторов. Одним из таких факторов может быть обработка клеток искусственными индукторами (элиситорами).

Наименее изученный вопрос - регуляция активности ферментоз. Исследования, направленные на установление механизмов регуляции синтеза биологически активных веществ в клеточных культурах, являются важными при разработке высокоэффективных способов получения биомассы с более высоким содержанием этих соединений. Методы культивирования клеток и тканей растений в условиях in vitro позволяют альтернативным способом получать сырье, содержащее вещества специализированного обмена.

Глава 2. Экспериментальные методы.

Объектами исследования служили интактные растения Catharanthus roseus L. (Don), а также инициированные из них каллусные культуры, выращиваемые при периодическом освещении (3500 лк) с фотопериодом 8ч- день, !6 ч -- ночь на модифицированных питательных средах Мурасиге и Скуга и Серлиса, содержащих гормоны, витамины, гидролизат казеина и сахарозу В главе обсуждаются способы, условия культивирования и методы проводимых исследований.

Рост каллусных культур оценивали гравиметрическим методом.

Культивирование иммобилизованных клеток и участков каллусных тканей проводили в закрытых сосудах емкостью 250 мл на пенополиуретановых пластинах диаметром ,100 мм и толщиной 20-22 мм. Объем жидкой среды в каждом культивационном сосуде составлял 70 мл.

Суспензионная культура клеток выращивалась из инокулированных в жидкую питательную среду участков каллуса Catharanthus roseus L, выращенного на агаризованной среде. Рост суспензии оценивали методом осажденных клеток..

Для определения концентрации алкалоидов применяли метод П.Морриса, Разделение' алкалоидов проводилось с помощью ВЭЖХ с использованием «Милихрома» с колонкой с обращенной фазой силусорб С-18, высотой 80 мм, диаметром 2 мм, скоростью протока 50 мкл/мин и УФ-детектированием при 254 нм, время удерживания 30 мин. Для разделения применялся ступенчатый градиент «вода-метанол» с 5 %-ной уксусной кислотой. В качестве свидетелей использовали препараты «Rosevinum» - винбластин, партия 040593 (Россия) и «Oncovin» (Eli Lilli & Со, USA) - винкристин. Содержание белка в тканях определяли с помощью красителя амида-черного 10 В.

Количественное содержание аминокислот в каллусной ткани Catharanthus roseus L. определяли с использованием аминокислотного анализатора «Amino Acid Analizer» T 339 М (Microtechna Praha) по стандартной методике. Определение интенсивности массообмена в суспензионной культуре Catharanthus roseus L. оценивали по величине коэффициента массопередачи углекислого газа, расчет которого проводили из совместного решения основного уравнения массопередачи и уравнения Гендерсона-Гассельбалха.

Ферментативную активность ключевых ферментов шикиматного пути -хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы определяли по методике В.И.Осипова. Активность хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы измеряли по скорости восстановления NADP+, количество которого определялось в кювете объемом 1 см? при 340 нм. Использовался спектрофотометр СФ-46 с микропроцессором для автоматической регистрации

скорости изменения оптической плотности. В качестве контроля использовали среду без хината или шикимата соответственно.

Подготовку грибных элиситоров для стимулирования образования продуктов вторичного синтеза проводили по методу Левинсона, основанному на экстракции 70 % этиловым спиртом.

Определение активности эндо-1-4-глкжаназы проводили

вискозиметрическим методом, целлобиогидролазы - колориметрическим методом Шомодьи-Нельсона, активность экзоглюкозидазы определяли по способности расщеплять карбоксиметилцеллюлозу до восстанавливающих Сахаров, активность целлобиазы определяли по скорости накопления восстанавливающих групп в растворе при. ферментативном гидролизе целлобиозы. Определение активности фенолоксидазы проводили фотоколориметрическим методом Ланса.

Общий жирнокислотный состав липидов изучали методом хроматомассспектроскопии. Условия анализа: газ-носитель-гелий, скорость ! мл/мин, температура. ввода пробы 230 °С, начальная температура хроматографирования 100 °С, подъем температуры до 230 °С, со скоростью 8 "С в минуту, температура детектора 230 С. Колонка капиллярная Н-5, длина колонки 30 метров, диаметр 0,25 мм. Идентификацию жирных кислот проводили по массспектрам и сравнению их времен удерживания с имеющимися стандартами.

Обработку результатов проводили на персональном компьютере PC P2-400 с использованием пакетов Microsoft Exel и Math Cad.

Глава 3. Введение в культуру Catharanthus roseus L. (Don)

Традиционно индольные димерные алкалоиды получают из интактных растений Catharanthus roseus L., либо получают мономеры в суспензионной культуре клеток. Оба эти способа имеют ряд существенных недостатков. Во-первых, получение веществ из растений непосредственно зависит от наличия

гарантированного сырья, климатических, погодных условий. Во втором случае в суспензионной культуре синтезируются только мономеры. Выращивание же интактных растений in vitro нецелесообразно по экономическим причинам из-за относительно медленного роста растений. Разработка способа культивирования Catharanthus roseus L.(Don) позволит с большей эффективностью обеспечить непрерывный рост и высокую скорость накопления биомассы, содержащую индольные димерные алкалоиды.

Первым этапом работы было введение в культуру и выделение высокопродуктивного клеточного клона Catharanthus roseus L.(Don).

Были получены пробирочные растения Catharanthus roseus L.(Don), которые в дальнейшем использовались в качестве стерильного маточного посадочного материала.

Введение в культуру in vitro осуществлялось на безгормональные питательные среды со стандартным минеральным составом по Мурасиге и С кугу (1962), Серлису (1979), Ничам (1965), Кнудсону (1943) без добавления гормонов. На этом этапе было отобрано и введено в культуру по 80 эксплантов на каждой среде.

В результате экспериментов по введению в культуру растений Catharanthus roseus L.(Don) было установлено, что минеральный состав среды, при одних и тех же фото - и температурном режимах и одинаковом органическом фоне, влияет на процессы приживаемости, роста и регенерации введенных in vitro эксплантов (таблица 1).

Низкосолевая среда Ничей вызывала этиолированность растений Catharanthus roseus L. - потерю хлоропластов при длительном культивировании.

На среде Кнудсона этиолированности тканей не отмечалось, однако рост и развитие экспланта происходило медленнее, чем на высокосолевых средах Серлиса и Мурасиге-Скуга. Каллусы, культивировавшиеся на среде с минеральным составом по Мурасиге и Скугу, представляли собой рыхлые, ярко-зеленые группы клеток меристемы и паренхимы, собранные в

глобулярные образования диаметром до 1 мм.

Таблица 1 - Влияние минерального состава питательных сред на приживаемость и качественные характеристики растений в условиях in vitro

Название среды Количество прижившихся растений, % Качественная характеристика растений

Мурасиге и Скуга (MS) 91 зеленые, одиночные, хорошо укореняющиеся

Серлиса (S) 86 зеленые, одиночные

Ничей (NN) 65 светло-зеленые, этиолированные, кустистые

Кнудсона (С) 38 бледно-зеленые, с небольшими листьями, не укоренялись

Для поддержания роста пробирочных растений недостаточно их эндогенного уровня гормонов. Присутствие в среде 6-бензиламинопурина (6-БАП) в концентрации 1мг/л стимулировало формирование пазушных почек и развитие растений-регенерантов вокруг участка верхушечной или пазушной меристемы. Было отобрано восемь наиболее перспективных линии укорененных маточных пробирочных растений, отличавшихся между собой по индексу образования растений-регенерантов, накоплению индольных димеров алкалоидов (винкристина и винбластина) и обладающих высокой скоростью роста (таблица

2)-

Установлено, что клеточные линии с наиболее интенсивным образованием растений-регенерантов отличались также высокой удельной скоростью роста и повышенным синтезом индольных димерных

алкалоидов.

Таблица 2 - Общая характеристика пробирочных линий растений Catharanthus гс^ш Ь

Номер клона Индекс образования растений-регенерантов Суммарное содержание винкристина и винбластина, мкг/г Удельная скорость роста растений, сут'1

8 — 2,90±0,05 0,15

21 15 6,62±0,15 0,24

24 18 9,33±0,32 0,31

26 8 5,40±0,25 0,18

27 21 9,10±0,13 0,35 .

28 6 6,44±0,19 0,29

29 12 7,41 ±0,04 0,22

Для выяснения роли различных эксплантированных участков интактного растения на пролиферацию тканей на средах с различным гормональным составом, были получены каллусы и проведена оценка активности каллусогенеза. В качестве эксплантов использовались листья, почки междоузлия и корни. Для оценки влияния качественного и количественного гормонального состава среды на каллусогенез было использовано 67 различных концентраций гормонов двух пар: а-нафтилуксусная кислота (а-НУК) + 6-бензиламинопурин (6-БАП) (условно группа А) и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) + кинетин (К) (условно группа В). Было установлено, что наиболее высоким был процент каллусообразования из эксплантов верхушечных меристем на среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу с добавлением а-НУК и 6-БАЛ (10 и 1 мг/л соответственно), который составил 95,3 % (рисунок 1). Каллусообразование из эксплантов междоузлий и листьев на среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу с добавлением а-НУК и 6-БАП (10 и 1 мг/л соответственно) приведено на рисунках 2,3.

Рисунок 1 - Каллусообразование из эксплантов почек СаШагапШш гозеш Ь. на средах с различным содержанием а-НУК И 6-БАП.

0,1 0,5 1 3 5 10 20"

Содержанке ауксина (а-НУК), мг/л

И0,1 00,5 В 1 □ 2 аз содержаниецитокшшна(6-БАП),мг/л

Рисунок 2 - Каллусообразование из эксплантов листьев СаШагапШш гозеш Ь. на средах различным содержанием а-НУК и 6-БАП

Рисунок 3 - Каллусообразование из эксплантов междоузлий Catharanthus roseus L. на средах с о-НУК и 6-БАП.

0,1 0,5 1 3 5 10 20

Содержание ауксина (а-НУК), мг/л

Ш0,1 00,5 Н1 В 2 ВЗ содержание цитокинина (б-БАП), мг/л

Рисунок 4 - Каллусообразование из эксплантов почек Catharanthus roseus Ь на средах с 2,4-Д и кинетином.

0,1 0,5 1 3 5 10 20

Содержание ауксина (а-НУК), мг/л

110,1 В0,5 В 1 Ш2 £33 содержание цитокшшна(б-БАЦ), мг/л

Рисунок 5 - Каллусообразование из эксплантов междоузлий Catharanthus roseus Ь на средах с 2,4-Д и кинетином.

60

Содержание ауксина (а-1ГУК), мг/л Ш0,1 00,5 01 02 ВЗ содержаниецитокинина(б-БАП),мг/л

Рисунок 6 - Каллусообразование из эксплантов листьев Catharanthus roseus L. на средах с 2,4-Д и кинетином.

Доля каллусообразования из междоузлий составила 90,3 %, а из листьев -74,8 %. Каллусная ткань в этих случаях была представлена активноделящимися клетками меристемы и губчатой паренхимой.

При использовании гормонов группы В отмечены более низкие показатели каллусообразования (рисунки 4, 5, 6).

Наибольший процент каллусообразования дали экспланты, взятые из почек укорененного интактного растения - 85 % при уровне гормонов: 2,4-Д (0,50 мг/л), и кинетина (5 мг/л); 2,4-Д (3 мг/л) и кинетина (1 мг/л).

При гормональном фоне сдвинутом в сторону ауксинов, наиболее активный каллусогенез характерен для участков базального среза центральной или периферической меристемы (апикальной или пазушной почки). Экспланты из корней не образовывали каллус ни на одной из использовавшихся питательных сред. Таким образом, каллусогенез в культуре in vitro зависит от гормонального состава питательной среды и эксплантируемого участка интактного растения.

В результате исследования влияния уровня освещенности на рост каллус-ной ткани, формирование эмбриогенного каллуса и накопление алкалоидов было установлено, что выращивание культуры клеток на свету с уровнем освещенности 3500 лк стимулировало процессы образования эмбриогенного каллуса в культуре Catharanthus roseus L.(Don) и способствовало накоплению алкалоидов. При культивировании каллусов в темноте ткань не содержала хлоропластов и была представлена меристемой и паренхимой. В тканях не происходило формирование соматических эмбриоидов.

Каллусные ткани не автотрофны по типу питания. Исследование влияния концентрации сахарозы в питательной среде показало, что динамика роста при разных концентрациях сахарозы в целом не отличалась (рисунок 7). Однако, микроскопирование ткани показало значительные различия в структуре ткани в зависимости от концентрации сахарозы в питательной среде. При 7 %-ном содержании сахарозы наблюдалось большое количество проводящих элементов, и практически отсутствовали зародышевые ткани, что говорит о быстром старении культуры. На среде с 5 %-ным содержанием сахарозы было

отмечено большое количество эмбриогенных структур, а к концу культивирования воздушно-сухая масса ткани, выращенной на данной среде, была сравнима с таковой на среде с 7 %-ным содержанием сахарозы. Следует отметить, что на среде с 3 %-ным содержанием сахарозы также происходило формирование эмбриогенных структур, однако выход биомассы на конец субкультивирования был ниже, чем на средах с 5 %-ным и 7 %-ным содержанием сахарозы.

Таким образом, для культивирования эмбриогенного каллуса СаШагапШш гс^еш Ь. наиболее приемлема 5 %-ная концентрация сахарозы.

Рисунок 7 - Динамика роста каллусной ткани СаШагапйт гс^еш Ь. при различных концентрациях сахарозы в питательной среде

Для оценки достоверности различий применялся ^критерий Стьюдента для 5 % уровня значимости. Достоверные различия в накоплении биомассы в зависимости от содержания сахарозы отмечаются к 15 суткам культивирования.

Выход биомассы и структура каллусной ткани зависит от качественного состава фитогормонов. Среды, содержащие а-НУК и 6-БАП, стимулировали

образование рыхлой, глобулярной ткани, формирующей в процессе культивирования эмбриоидные структуры (таблица 3).

Таблица 3 - Качественные характеристики каллусной ткани Catharanthus гс^ш L. в зависимости от уровня гормонов

Питательная среда Соотношение гормонов Качественные характеристики ткани

МБ НУК( 10),6-БАП(0,5) рыхлая, глобулярная, зеленая

МБ НУК( 10),6-БАП( 1) рыхлая, глобулярная, ярко-зеленая

Б НУК( 10),6-Б АП( 1,5) рыхлая, глобулярная, зеленая

Б НУК( 10),б-Б АП(2) рыхлая, глобулярная, зеленая

Мй НУК(10),6-БАП(2,5) уплотненная, глобулярная, зеленая

М5 НУК (2), 6-БАП (1) плотная, глобулярная, светло-зеленая

МБ НУК( 1,5),6-БАП( 1) плотная, глобулярная, светло-зеленая

МБ НУК(1), 6-БАП(I) плотная, глобулярная, светло-зеленая

МБ НУК (0,6), 6-БАП (1) плотная, глобулярная, светло-зеленая

Мв НУК (0,3), 6-БАП (1) плотная, глобулярная, светло-зеленая

Гамборга (В-5) 2,4-Д(1),кинетин(0,1) вязкая, неоднородная, сероватого цвета, низкий прирост биомассы

МБ 2,4-Д (1,5), кинетин (0,25) вязкая, желтоватая, неоднородная, низкий прирост

МБ 2,4-Д (1), кинетин (0,25) вязкая, желтоватая, неоднородная, низкий прирост

ш 2,4-Д (0,5), кинетин (0,25) вязкая, желтоватая, неоднородная, низкий прирост

5 2,4-Д (0,2), кинетин (0,25) рыхлая, желтовато-серая, неоднородная

МЭ 2,4-Д (0,02), кинетин (0,25) плотная, белая, неоднородная

МБ 2,4-Д (0,5), кинетин (1,5) плотная, компактная, зеленовато-белая

5 2.4-Д (0,5), кинетин (1) плотная, компактная, зеленовато-белая

МБ 2,4-Д (0,5), кинетин (0,5) плотная, компактная, зеленовато-белая

МБ 2,4-Д (0,5), кинетин (0,2) Плотная, компактная, зеленовато-белая

МЭ 2,4-Д (0,5), кинетин (0,02) плотная, компактная, белая

4 8 12 16 20 24 26 32

Продолжительность

Ж-Среда А □ Среда В культивирования, сут

Рисунок 8 - Динамика роста в изолированной культуре ткани СаШагапШш гозеш Ь. на средах с разным гормональным составом (среда А - а-НУК+6-БАП, среда В - 2,4-Д +кинетин).

Полученные результаты по влиянию гормонального состава сред на рост и развитие каллусной ткани СаШагапШш гозеш Ь. показали, что в целом динамики роста ткани имеют одинаковый характер и описываются сигмоидными кривыми, а линии тренда полиномиальными уравнениями (рисунок 8).

Экспериментально было доказано, что гормональный состав питательной среды оказывал существенное влияние, как на образование продуктов первичного синтеза, так и на синтез, и накопление алкалоидов в тканях СаШагапШш гозеш Ь.

В таблице 4 отражена зависимость содержания алкалоидов, накапливающихся на стационарной фазе культивирования и общее содержание белка в тканях. В пересчете на один литр питательной средь; за субкультивирование на средах с 2,4-Д и кинетином образовывалось в целом меньше алкалоидов, чем на средах с содержанием а-НУК и 6-БАП. Корреляционный анализ полученных результатов показал наличие

отрицательной коррелятивной связи между накоплением в тканях белка и содержанием алкалоидов (коэффициент корреляции для группы сред

[2,4-Д+кинетин] и о=-0,91 для сред [а-НУК +6-БАП]). В этом случае справедливо считать, что существует тенденция к обратной зависимости между двумя этими параметрами, иными словами: либо в тканях происходит накопление белка, либо синтез алкалоидов.

Таблица 4 - Накопление биомассы, содержание белка и алкалоидов в культуре Catharanthus гс^ш Ь на средах с разной концентрацией гормонов: кинетина и постоянной 2,4-Д (0,5 мг/л) - (числитель) и разной концентрацией 6-БАП и постоянной а-НУК (10 мг/л) - (знаменатель)

Номер среды Содержание кинетина/бБАП мг/л Содержание биомассы г/л среды Содержание белка, мг/г Содержание алкалоидов, мг/г

Ь7/а1 1,50/0,50 4,50/8,86 10,10/19,70 2,40/1,90

Ь8/а2 1,00/1,00 7,00/12,78 9,90/11,40 2,60/3,30

Ь9/аЗ 0,50/1,50 8,80/8,94 20,70/13,60 0,90/2,10

Ы0/а4 0,20/2,00 10,40/6,90 17,80/16,50 1,00/1,26

Ы 1/а5 0,02/2,50 6,30/6,04 15,70/8,36 0,60/1,01

Установлена зависимость содержания алкалоидов, накапливающихся на стационарной фазе культивирования и содержания биомассы ткани от гормонального фона среды (рисунок 9).

Коэффициент корреляции между накоплением биомассы (г/л среды) на конец субкультивирования и суммой алкалоидов (мг/г а.с.м.) составил 0,99, что говорит о прямой зависимости этих параметров.

16 - 3,5

О -,- о

0,5 '1 1,5 2 2,5

Содержание 6-БАП, мг/л

—в-а.с.м. ткани сумма алкалоидов

Рисунок 9 - Содержание алкалоидов, накапливающихся на стационарной фазе культивирования и прирост биомассы Catharanthus roseus L.(Don) в конце субкультивирования, а-НУК -const (10 мг/л) при различной концентрацией 6-БАП.

Линии тренда зависимостей накопления биомассы (yt) и алкалоидов описываются уравнениями:

У= -0,4242х4 + 5,835х3- 28,286xJ + 54,295х - 22,56. (1)

У=-0,1138х4 + 1,б308х3 - 8,241 Зх2 + 16,414х-7,79. (2)

Наибольшее содержание алкалоидов наблюдалось в тканях, культивируемых на средах с концентрациями гормонов и 6-

БАП - 1 мг/л.

В результате проведенных исследований был эмпирически подобран гормональный состав питательной среды при

котором ткань обладала высокой скоростью роста, формировала эм-бриогенный каллус и продуцировала индольные димерные алкалоиды винкристин и винбластин.

Исследование воздействия глифозата, фенилаланина и дигидроксифенилаланина на активность ферментов шикиматдегидрогеназы и хинатдегидрогеназы проводили, исходя, из представления о способности этих

веществ направлять поток углерода по шикиматному пути и регулировать процесс образования L-триптофана - одного из предшественников индольных димерных алкалоидов в каллусной культуре Catharanthus roseus L (Don) Полученные результаты показали, что добавление в питательную среду веществ - модуляторов вызывает изменение активности ключевых ферментов шикиматного пути. Изменяя концентрации этих веществ можно регулировать выход индольных димерных алкалоидов в каллусной культуре Catharanthus roseus L (Don)

Питательная среда для культивирования должна быть сбалансированной таким образом, чтобы поддерживать как активный рост, так и синтез алакалоидов При культивировании Catharanthus roseus L (Don) были использована агаризованная питательная среда с повышенным содержанием одного из элементов: цинка, кобальта, меди, молибдена, магния, марганца и бора (исследовано 42 среды), и проведена их оценка на рост, структуру ткани и накопление биологически активных веществ. На рисунках 10 и 11 приведены зависимости накопления биомассы и алкалоидов от минерального состава среды.

Рисунок 10 - Влияние концентрации элементов минерального питания на накопление воздушно-сухой каллусной биомассы Catharanthus roseus Ь

160,0 •

I 140,0 и

120.0

ев

$ 100.(1 ■

х

о

3 80.0 -*

П 60.0 -

х '

3 40,0 ± а.

г го.»

о.о 4-

х|

Рисунок 11-Влияние концентрации элементов минерального питания на накопление алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L.

Установлено, что увеличение микроэлементов цинка, магния, бора в 2 раза по сравнению с контрольной средой стимулировало рост каллусной ткани и способствовало образованию структурированной ткани с повышенным содержанием эмбриоидов.

На основании полученных результатов были выбраны три питательные среды, при использовании которых синтезировалось наибольшее количество алкалоидов ^п2, Mg2, ^5).

Полученные результаты по влиянию фосфатного компонента показали, что недостаток фосфора приводит к снижению выхода биомассы и ослаблению синтеза алкалоидов.

Таким образом, создавая в среде определенные концентрации элементов минерального питания, можно целенаправленно изменять процесс вторичного синтеза в клеточной культуре Catharanthus го^ш L.(Don).

Глава 4. Способы получения клеточной культуры Catharanthus roseus L

Наряду с регуляторами роста важнейшим фактором по влиянию на рост клеток и синтез вторичных веществ является способ культивирования. Для

выяснения особенностей разных способов выращивания • дальнейшее культивирование клеток Catharanthus гс^ш L. проводилось двумя способами: глубинным (в суспензии) и поверхностным - на агаре и на пенополиуретанозых пластинах.

При глубинном культивировании наблюдалось самое низкое содержание алкалоидов. Вероятно, замедление роста, кислородный дефицит, а также уменьшение степени дифференциации ткани, сопровождающееся уменьшением числа хлоропластов привело к частичному угнетению вторичного синтеза в суспензионной культуре.

Для характеристики интенсивности межфазных переходов был определен коэффициент массопередачи углекислого газа и его влияние на процессы роста, жизнеспособности и накопления белка и алкалоидов в суспензионной культуре Catharanthus гс^ш Ь Анализ полученных зависимостей показал, что во всех случаях коэффициент массопередачи увеличивался с ростом скорости вращения платформы качалки и уменьшался с увеличением объема заполнения культивационных сосудов.

Установлено, что с уменьшением коэффициента массопередачи, пик синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток смещается в сторону увеличения продолжительности культивирования. Варьированием коэффициента массопередачи возможно повысить выход алкалоидов в суспензионной культуре Catharanthus roseus Ь

Поскольку интенсивность вторичных процессов связана со степенью дифференциации, структурированностью ткани, большое значение имеет способ выращивания ткани. Условия глубинного культивирования способствуют образованию более гомогенной культуры, быстрорастущей, но, как правило, синтезирующей меньше необходимых продуктов. Поверхностное культивирование характеризуется наибольшей степенью дифференциации клеток, но при этом отличается медленным ростом.

Анализируя полученные результаты при выращивании культуры на твердых агаризованных и жидких средах, можно заключить, что необходим

такой способ культивирования, который бы объединял в себе преимущества поверхностного и глубинного (суспензионного) культивирования Таким способом может быть поверхностное культивирование клеток с использованием инертного носителя и жидкой питательной среды.

Изучение динамики роста каллусной ткани в зависимости от способа культивирования показало, что наибольший прирост биомассы за период культивирования наблюдался при культивировании на пенополиуретановых пластинах (рисунок 12). Повышение накопления биомассы и синтеза алкалоидов для тканей, культивируемых на пенополиуретановых подложках, обусловлены совокупностью причин: за счет более полного использования ресурсов среды (благодаря тому, что среда жидкая, облегчается диффузия питательных веществ к клеткам). Сочетание действия водного дефицита с уменьшением доли кислорода внутри пенополиуретана приводит к изменению метаболизма и повышению синтетических реакций. Возникают градиенты ростовых веществ и питания, которые регулируют метаболические процессы в клеточной культуре.

О 5 10 15 20 25 30 35

Продолжительность культивирования, сут

—»—глубинное —А—поверхностное -е-на пенополиуретане

Рисунок 12 - Динамика роста каллусной ткани Cathaianthus гс^ш Ь в зависимости от способа культивирования

Линия тренда ростовой кривой' для тканей, культивируемых на пенополиуретане, описывается уравнением:

У=-0,0101 х5 + 0,9029х4 - 18,501 хЧ 137,73х2 - 287,11 х + 214,76. (3)

Для тканей, культивировавшихся на агаре, линия тренда ростовой кривой

описывается утавнением:

У= -0,0374х5 + 1,3978х4 - 20,186х' + 128,72х2 - 266х +203,9. (4)

Для суспензионного культивирования:

У=0,0759х5 - 1,5369х4 + 8,7074х' - 3,2774х2 - 29,638х + 71,95. (5)

Пенополиуретановые пластины можно рассматривать как химически нейтральную поддерживающую основу, позволяющую отказаться от использования агара, что удешевляет процесс. Наибольшее накопление как винбластина, так и винкристина наблюдалось при культивировании Catharanthus гс^ш Ь на пенополиуретановых пластинах. Использование пенополиуретана в качестве поддерживающей основы, позволило в 1,9 раза увеличить выход винкристина, по сравнению с выращиванием ткани на агаризованной питательной среде, и в 18,5 раз - по сравнению с глубинным способом культивирования. Результаты по содержанию винкристина и винбластина в культурах тканей Catharanthus гс^ш Ь при различных способах выращивания приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Содержание винкристина и винбластина в культурах тканей Catharanthus гс^ш Ь при различных способах выращивания на 24-е сутки культивирования

Способ кулътивировани Содержание винбластина, мкг/г Содержание винкристина, мкг/г

Глубинное следы 3,12 ±0,05

Поверхностное на агаре 1,20 ±0,09 31,00 ±0,95

На пенополиуретановых пластинах 3,40 ± 0,03 57,80 ± 1,87

Таким образом; иммобилизация клеток обеспечивает условия, приводящие к дифференциации и накоплению вторичных метаболитов.

Глава 5. Элиситоры как индукторы вторичного метаболизма в клеточной культуре Catharanthus roseus L.

Анализ литературных данных показал, что существует возможность регуляции вторичного синтеза в культуре ткани in vitro (эпигенетические факторы, способы культивирования, стресс и другие). Одним из способов регуляции вторичного синтеза является обработка клеток грибными элиситорами и элиситорами, полученными при автоклавировании или частичном гидролизе клеточных стенок растений. Известно, что синтез алкалоидов осуществляется через активацию генов, определяющих синтез ферментов метаболизма этих соединений. Этот процесс запускается элиситором.

Культуры Catharanthus roseus L, иммобилизованные на пенополиуретан, обрабатывали экстрактами из мицелиальных и дрожжевых грибов Aspergillus niger, Trichoderma harsianum, Pleurotus ostreatus, Saccharomyces cerevisiae. Установлено, что удельная скорость роста тканей на средах с элиситорами была ниже, чем удельная скорость роста контрольных каллусов (таблица 6).

Таблица 6- Удельная скорость роста каллусной ткани Catharanthus loseus

L. на средах с элиситорами

Продолжит. культивирования, сут Удельная скорость роста, сут"1

S. cerevisiae P. ostreatus A. niger Т. harsianum контроль

0,2% 2% 0,2% 2% 0,2% 2% 0,2% 2%

6 0,13 0,10 0,09 0,03 0,10 0,11 0,08 0,03 • 0,12

9 0,22 0,12 0,15 0,05 0,13 0,12 0,09 0,08 0,33

13 0,23 0,13 0,18 0,10 0,20 0,18 0,15 0,10 0,35

16 0,22 0,20 0,18 0,15 0,23 0,20 0,18 0,13 0,30

20 0,21 0,19 0,20 0,18 0,20 0,10 0,22 0,12 0,21

23 0,09 0,08 0,10 0,08 0,10 0,08 0,15 0,07 0,10

27 0,05 0,04 0,06 0,04 0,07 0,05 0,10 0,05 0,09

30 0,04 ' 0,03 0,05 0,03 0,05 0,02 0,04 0,02 0,07

Характер роста культур при обработке грибными элиситорами в целом был одинаков (рисунок 13).

Торможение ростовых процессов каллусных тканей на средах с элиситорами протекает более интенсивно, чем на контрольных средах. Действие экстрактов мицелиальных и дрожжевых грибов оказывало существенное влияние на накопление винкристина. Во всех вариантах его концентрация была выше, чем в контроле (таблица 7).

Было установлено, что каллусные культуры Catharanthus roseus L. синтезировали в основном винкристин, который в интактных растениях встречается в небольших (следовых) количествах.

При этом изучали активность ключевых ферментов шикиматного пути, по которому синтезируется предшественники индольных алкалоидов, — шикиматдегидрогеназы (ШДГ) и хинатдегидрогеназы (ХДГ). Экспериментально доказано, что обработка 0,2 %-ным экстрактом Aspergillus niger значительно увеличивает активность ХДГ и ШДГ.

В ходе эксперимента, направленного на выяснение влияния хвойных экстрактов на суммарное накопление алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L., проводили оценку цвета, структуры каллусной ткани, скорости роста. Удельная скорость роста тканей с использованием хвойных экстрактов в целом была ниже, чем удельная скорость роста контрольных каллусов. Торможение ростовых процессов тканей протекает более интенсивно на средах с 1 %-ной концентрацией хвойных экстрактов.

Добавление в питательную среду хвойных экстрактов при 0,5 %-ной концентрации вызвало увеличение содержания алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L., более чем в 2 раза (рисунок 14).

Продолжительность культивирования, сут А) Аврег^Иш ш§ег

4 8 12 16 20 24 28 32 36

Продолжительность культивирования, сут

Б) ИешОш ОБ^еаш

Рисунок 13- Динамика роста каллусной ткани СаШагапШш гоБеш Ь. на средах с грибными элиситорами

Таблица 7 - Влияние грибных элиситоров на накопление винкристина и активность ферментов в культуре ткани Catharanthus roseus L

Обработка элиситором Содержание винкристина Активность ферментов, % от контроля

мкг % от контр хдг ШДГ

Контроль (без элиситора) 58 100 100 100

Aspergillus niger 0,2 % 316 546 415 257

Aspergillus niger 2 % 92 160 121 207

Tnchoderma har 0,2 % 226 391 185 129

Tnchoderma har. 2 % 184 319 79 89

Рисунок 14 - Влияние хвойных экстрактов на накопление алкалоидов в халлусной ткани Catharanthus roseus L

Исходя из химического состава хвойного водного экстракта сосны, была проведена попытка использования его в качестве основы питательной среды для получения каллусной ткани Catharanthus roseus L. в условиях in vitro. Поскольку содержание фенолъных соединений в водных экстактов хвои сосны достаточно велико (10-12 % от а.с.м.), то предварительно в них был добавлен активированный уголь с целью адсорбции соединений фенольного характера.

Культивирование проводилось на агаризованной питательной среде Мурасига и Скуга, в которую был введен хвойный экстракт сосны в различных соотношениях (1:1; 1:2; 1:5; 1:9; 2:1 соответственно). Наибольший прирост биомассы наблюдали на питательной среде при соотношении стандартной среды и хвойного экстракта 2:1. Предлагаемая среда может частично заменять дорогостоящую питательную среду для получения каллусной ткани Catharanthus roseus L..

Глава 6. Разработка концепции направленного синтеза индольных димерных алкалоидов (на примере клеточной культуры Catharanthus roseus L.)

Сложное строение растительного организма, дифференцированного на большое количество специализированных органоидов, тканей и органов, требует совершенных систем управления. Целостность всякого растительного организма обеспечивается системой регуляции, управления и интеграции. Исследование путей регуляции отдельных физиологических процессов в клеточных культурах, управление их ростом, темпами развития, накоплением отдельных метаболитов и другими процессами и функциями, в настоящее время представляется одним из самых важных и перспективных направлений биотехнологии. Внутриклеточные системы регуляции осуществляются на уровне ферментов, генетическом и мембранном. Все эти системы регуляции тесно связаны между собой. Вопрос регуляции и контроля вторичного метаболизма в культуре in vitro клеток и тканей растений в настоящее время исследован недостаточно.

На первом этапе важно определить какие виды растений являются продуцентами и суперпродуцентами требуемых вторичных метаболитов.

В качестве продуцента индольных димерных алкалоидоз было выбрано тропическое кустарниковое растение - СаШагапШш гоБеш Ь.(Боп).

Вторым этапом стратегии регуляции и контроля вторичного синтеза предусматривается выбор органа растения для введения в культуру. Для определения влияния на каллусогенез типа экспланта (участка интактного растения) данной генетической линии проводили сравнение активности каллусогенеза от различных участков интактного растения (почки, листья, междоузлия). Высокий каллусогенез отмечен для эксплантов из почек СаШагапШш гоБеш Ь.(Боп.). Такое распределение каллусообразования в зависимости от типа экспланта связано с уровнем эндогенных гормонов, различным в разных частях интактного растения.

Одной из характерных особенностей развития каллусной ткани СаШагапШш гсйеш Ь. было образование соматических эмбриоидов. Эмбриоидные структуры были расположены в поверхностных слоях каллуса. Пересадка такой ткани на свежую среду того же состава стимулировало развитие эмбриогенного каллуса.

После практической реализации двух первых этапов получения и исследования ростовых и биохимических характеристик каллусной ткани возникает необходимость селективного отбора быстрорастущих тканевых клонов, являющихся продуцентами веществ вторичной природы.

Следующим важным этапом является определение условий роста клеточной биомассы и синтеза вторичных соединений. Из внешних условий на метаболизм влияют два основных фактора: уровень освещения и температура. Синтез алкалоидов в растении происходит в основном в хлоропластах. Белый свет оказывает стимулирующее действие на образование хлоропластов из пропластид и этиопластов. Это в свою очередь обеспечивает процессы первичного синтеза, и приводит к дифференциации клеток в тканевые

структуры. Каллусы СаШагапШш

бибЛи

СД1»Т1.Г-,Г. 09 300 №

»

мые на сь-.''[\' с

освещенностью 3500 люкс, имели ярко-зеленую окраску и были представлены в основном эмбриогенными структурами, глобулами, меристемными и паренхимными клетками. Освещение стимулировало синтез алкалоидов в каллусной культуре СаШагадШш гс«еш Ь(Боп).

Факторы, связанные с самой культурой, то есть состав питательной среды, жизнеспособность, газовое окружение составляет сложную многокомпонентную систему, подход к изучению которой остается эмпирическим. Наиболее значимыми из внутренних факторов культивирования являются факторы среды (регуляторы роста, минеральное питание, источники углерода), наличие предшественников синтеза вторичных метаболитов, фактор элиситации, газовый состав, рН среды.

Использование ауксинов как непременных компонентов питательных сред, необходимых для успешного роста культур тканей и как средства управления, обусловило необходимость оценки их влияния на биосинтез и содержание вторичных метаболитов. Исследование влияния различных концентраций гормонов на рост и развитие каллусной ткани СаШагапШш гс«еш Ь(Боа) показало, что низкие концентрации ауксина, дают невысокий прирост биомассы, и вызывают структурирование ткани. Питательная среда с содержанием а-НУК и 6-БАП характеризовалась высоким накоплением биомассы. Результаты микроскопирования показали наличие эмбриогенных структур.

Минеральный состав сред оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений. При культивировании на средах с избыточным количеством фосфора установлено увеличение продолжительности фазь: экспоненциального роста и совпадение максимального накопления алкалоидов с выходом культуры на стационарную фазу роста. Полученные результаты по влиянию различных концентраций микроэлементов бора, цинка, молибдена показали ингибирующее действие повышенных концентраций этих элементов на синтез алкалоидов. Использование повышенных концентраций магния и марганца в питательной среде относительно стандартной способствовало

увеличению содержания алкалоидов более чем на 30 %, а повышение концентрации кобальта в 5 раз увеличило это содержание на 35 %.

Присутствие в питательной среде биоорганических добавок - инозита, гидролизата казеина оказало влияние на характер. структурной организации каллусных тканей СаШагапШш гожш Ь. Увеличение концентрации гидролизата казеина и инозита.вызывало образование эмбриогенного каллуса ярко-зеленого цвета.

Известно, что высокий уровень синтеза свойственен культурам на сахарозе. Изучение динамики роста каллусной ткани СаШагапШш гожш Ь. на средах с различным содержанием сахарозы показало наличие зависимости между концентрацией сахарозы в среде, длительностью лаг-фазы и накоплением биомассы. Показано, что уровень сахарозы определяет не только ростовые характеристики ткани, но и ее структуру.

Установлено, что при обработке 20-дневной культуры растворами глифозата, фенилаланина, дигидроксифенилаланина наблюдалась низкая активность хинатдегидрогеназы, тогда как активность шикиматдегидрогеназы незначительно превышала активность этого фермента в контрольной культуре. Вероятно, для синтеза вторичных соединений в культуре СаШагапШш гс«еш Ь. определяющим фактором присутствие предшественника не является.

Особую группу стимулирующих факторов представляют элиситоры. Для индукции вторичного метаболизма были использованы элиситоры, приготовленные из мицелиальных и дрожжевых грибов - Азрегщйш niger, ТпсЬоёеппа Иагаапиш, ИшгоШз о&геаШз, 8ассЬогошусе8 сегеуюае. Рост культуры СаШагапШш гс«еш Ь. замедлялся на всех средах с добавлением элиситоров, при этом наблюдалось значительное увеличение содержания алкалоидов.

Сопоставительный анализ различных способов культивирования на рост каллусной ткани СаШагапШш гс«еш Ь. и накопление алкалоидов показал преимущественное культивирование иммобилизованных клеток на инертном носителе.

Наиболее сложный и наименее изученный вопрос - регуляция активности ключевых ферментов; Скорость метаболических процессов в клетках и тканях определяются главным образом составом, соотношением и уровнем активности ферментов. Использование ингибиторов и модуляторов активности ферментов вторичного метаболизма дает возможность повысить уровень накопления алкалоидов за счет перераспределения предшественников с первичных метаболических путей на вторичный синтез. Варьируя концентрациями этих веществ, возможно, регулировать уровень накопления индольных димерных алкалоидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L..

Таким образом, стратегия регуляции и контроля синтеза вторичных метаболитов очевидна - необходимо регулировать активность соответствующих ферментов. Стратегия контроля синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток in vitro включает следующие этапы:

1. Выбор вида-растения, конкретного растения-донора (генетика экспланта

2. Выбор органа растения для введения в культуру (эпигенетика экспланта)

3. Селективный отбор быстрорастущих клонов - продуцентов веществ вторичной природы (генетика популяции клеток)

4. Регуляция активности ферментных систем, осуществляющих синтез целевых продуктов (биохимия синтеза)

5. Определение условий роста и синтеза вторичных соединений (физиология популяции клеток).

На основании полученных экспериментальных результатов определены условия культивирования эмбриогенной каллусной ткани Catharanthus roseus L. с целью получения индольных димерных алкалоидов в культуре in vitro:

- минеральная основа по Мурасиге и Скугу (1962), витамины: ниацин-НС1- 1 мг/л, тиамин-HCl - 1 мг/л, пиридоксин-НС1 - 1 мг/л, гидролизат казеина-4500 мг/л, инозит - 4500 мг/л, сахароза 50000 мг/л, элиситор - 0,2 %, рН-среды 5,8-5,9, а-НУК -10 мг/л, 6-БАП -1 мг/л.

Температура 28-30°С, освещенность - 3500 лк

Продолжительность культивирования - 30 сут

Схема регуляции и стратегии контроля. процессов вторичного метаболизма в культуре ткани Catharanthus roseus L. приведена на рисунке 15.

Глава 7. Получение индольных димерных алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L.

Разработана принципиальная технологическая схема культивирования каллусной ткани Catharanthus roseus L. и получения индольных димерных алкалоидов на ее основе (рисунок 16).

Технологический процесс получения индольных димерных алкалоидов при поверхностном выращивании каллусной эмбриогенной ткани Catharanthus roseus L. на инертном носителе состоит из следующих стадий: введение растений Catharanthus roseus L. в культуру in vitro и получение эмбриогенной каллусной ткани, иммобилизация каллусной ткани на инертный носитель, выращивание ткани в световом биореакторе в течение 30 суток при 28-30 °С на жидкой питательной среде с использованием элиситоров; далее полученная биомасса из растильного светового биореактора (7) подается в экстрактор (13), полученный экстракт фильтруется для отделения от послеэкстракционного остатка каллусной ткани (шрота) и направляется в дистилляционную колонну

(19) для отгонки этилового спирта, далее экстракт направляется зо флорентину

(20), в которую подается аммиак и хлороформ, затем в испаритель (21), где упаривается до 1/5 объема при температуре 45" С. Затем упаренный экстракт направляют на ионнообменную колонку (22) для разделения суммы алкалоидов. Полученные таким образом индольные димерные алкалоиды подвергаются лиофильной сушке. Послеэкстракционный остаток каллусной ткани Catharanthus roseus L. используется в качестве субстрата для культивирования высшего дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus (Fr. Kumm) с целью получения кормовых препаратов.

Рисунок 15 - Схема регуляции и стратегии контроля процессов вторичного метаболизма в культуре ткани СаШагапШш говеш Ь.

1 - выдерживатель питательной' среды при температуре стерилизации; 2 -теплообменник для охлаждения. питательной среды; 3,4,]0,12,16,18 - дозаторы; 5,8 -транспортеры; б - бак для элиситора; 7 - биореактор; 9 - бак для этилового спирта; 11 - бак для серной кислоты; 13 - экстрактор; 14 - фильтр; 15 - бак для хлороформа; 17 - бак для аммиака; 19 - дистилляционная колонка; 20 - флорентина; 21 - испаритель; 22 — ионообменная колонка; 23- сборник; 24 - растильная камера.

Рисунок 16 - Технологическая схема получения алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus го^ш Ь

Предлагаемый способ культивирования эмбриогенной каллусной ткани Catharanthus roseus Ь позволяет получать индольные димерные алкалоида: в количествах, превышающих их содержание в интактных растениях, при сохранении природных популяций.

Проведена экономическая оценка производства индольных димерных алкалоидов, которая показала эффективность предлагаемого биотехнологического процесса.

выводы

1. Разработана концепция направленного синтеза индольных димерных алкалоидов на примере клеточной культуры Catharanthus roseus L.(Don.), позволяющая повысить эффективность их биотехнологического производства.

2. Установлено влияние условий культивирования на процессы приживаемости, роста и регенерации введенных in vitro эксплантов. «Пассивное» снижение минеральных компонентов среды коррелирует с получением маточных стерильных укорененных интактных растений Catharanthus roseus L. в условиях in vitro

3. Разработаны методы получения быстрорастущих клеточных линий Catharanthus roseus L., способных к вторичному синтезу. Установлены закономерности формирования и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L. в зависимости от типа экспланта и его локализации в интактном растении. Показано, что наиболее высокой была инициация каллусообразования из почек Catharanthus roseus L. на средах, содержащих а-НУК и 6-БАП (10 мг/л и 1 мг/л, соответственно).

4. Образование индольных димерных алкалоидов в тканях Catharanthus roseus зависит от структуры ткани. Формирование индольных димерных алкалоидов происходит в эмбриогенном каллусе, рост и развитие которого определяется в свою очередь сбалансированным гормональным составом питательной среды.

5. Установлено влияние углеводного компонента, минерального, гормонального состава питательной среды, способа культивирования на структуру, цвет каллусной ткани, накопление биомассы и алкалоидов. Полученные результаты позволили сформировать культуру с требуемыми характеристиками и повышенным содержанием алкалоидов. Дана оценка воздействия органических добавок (гидролизата казеина, мезоинозита) на тканевый эмбриогенез и характер структурной организации клеточной культуры Catharanthus roseus.

6. Впервые были использованы для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма элиситор из плодового тела дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus и хвойные экстракты Реакция элиситации способствовала активному синтезу винкристина в каллусных культурах Catharanthus msWVi L. Максимальное

накопление алкалоидов наблюдалось при культивировании с 0,5 %-ным экстрактом гриба Pleurotus ostreatus и позволило увеличить выход винкристина в 6,1 раз.

7. Установлено активирующее действие элиситоров на работу ключевых ферментов шикиматного пути. Интенсивный синтез алкалоидов обеспечивается активацией шикиматного пути, по которому синтезируются их предшественники. Установлено влияние ингибиторов и модуляторов вторичного метаболизма на активности ферментов фенилпропаноидного метаболизма. Использование ингибиторов и модуляторов активности ферментов вторичного метаболизма (хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы) позволяет направить предшественники с первичных метаболических путей на вторичный синтез.

8. Определены условия, позволяющие интенсифицировать процессы вторичного синтеза в культуре ткани

9. Разработана технологическая схема получения индольных димерных алкалоидов. Метод культивирования т vitro эмбриогенной каллусной ткани Catharcmthus позволяет получать индольные димеркые алкалоиды в количествах сопоставимых с интактными растениями, при сохранении природных популяций.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1.А.С. №755261 СССР, МКИ А 23 к 1/12 Способ получения корма из хвои / Н.А.Величко СМ Репях., Г.В.Тихомирова СССР - №275469. 3аявл.07.03.79; 0публ.30.06.80. - Бюл. №30. - 4с.

2.Величко Н.А., Репях СМ., Седых В.В., Карепова З.А. Кормовые продукты ьа основе древесной зелени //XII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Реф докл. и сооб.- Москва, 1981. - №6. -С.237-239.

3.Величко Н.А., Репях СМ., Чупрова Н.А. Состав древесной зелени хвойных // Химия древесины.-1982.-№3.-С138-140.

5.Величко НА, Репях СМ., Чупрова Н.А О лигниновых веществах хвои сосны //Лесной журнал. - 1982. -№2.- С. 112-114.

6.Величко Н.А., Репях СМ., Тихомирова Г.В. Возможность использования отработанной древесной зелени в качестве кормовых добавок //Лесной журнал. - 1984.- №2. - С.98-100.

7.Величко Н.А., Репях СМ., Левдикова В.Л. Твердофазное культивирование гриба Pleurotus ostreatus на послеэкстракционном остатке древесной зелени сосны //Превращение древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях: Сб. ст.,-Рига, 1985. - С. 199-203.

8.Величко НА, Репях СМ. Углеводы древесной зелени //Химия древесины. -1988.-№4.-С.103-109.

9АС. №1631777 СССР МКИ А 23 к 1/12 Способ получения коромсвой добавки /Н.А.Величко, СМ. Репях, ВЛ. Левдикова, ВАШтонда, Г.В.Ляндрес, Н.А.Родионова (СССР).-№4386478 Заявл. 18 01.88. Опубл. 1.11.90.- Бюл №2. - 4с.

Ю.Величко НА, Самойлова С.А., Репях СМ. Выращивание съедобных грибов на древесных субстратах // Лесная промышленность. - 1992 .- №6 -С. 12.

П.Величко НА, Моисеева Т.В., Юшкова Е.В. Формирование каллуса в культуре ткани лекарственных растений Сибири из эксплантов семядолей, листьев, побегов и корней .//Переработка растительного сырья и утилизация отходов: Сб.тр., - Краснодар, 1994.- Вып.1,- С. 15-22.

12.Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Репях СМ., Величко Н.А. Вторичный метаболизм в культуре ткани Catharanthus rasens L //Биология клеток растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда. VII Междун. конф.: Сб.тр. - М.: МГУ, 1997.- С.60

13.Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Величко НА, Репях СМ. Получение экологически чистых БАВ методом культуры тканей /Эколого-экономические проблемы лесного комплекса :Сб.тр - Санкт-Петербург, 1997. -С.120-121.

14.Юшкова Е.В.. Величко Н.А., Кытманова М.В., Никонорова Е.В. Культура ткани лекарственных растений. Методы получения биологически активный веществ /Проблемы химико-лесного комплекса: Сб.тр.- Красноярск, 1997.-Ч.2.-С.53-54.

15.Пат. №20930 РФ. МКИ А23 к 1/100 Способ получения кормовой добавки /Н.А.Величко, С.М.Репях Заявл. 5.06.92. Опубл.20.10.97. Бюл. №29. -1997.-4 с.

16.Юшкова Е.В., Величко Н.А. Культивирование растительный тканей на инертных носителях - перспективное направление экологической биотехнологии /Международное общество экологической биотехнологии: Конгресс ISEB, Лейпциг, 1997.- С.36.

17.Юшкова Е.В., Скуратова Е.В, Величко НА, Репях СМ., Шеин И.В., Зражевская Г. К. Особенности роста каллуснык тканей Catharanthus roseus L в зависимости от способа культивирования //Биотехнология.- 1998.- №6. -С.42-47.

18.Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Величко Н.А Способ культивирования лекарственных растений in vitro /Гомеостаз: Сб.тр. Междун. конф.,-Красноярск, 1998.-С.140-144.

19.Положительное решение №96100782/13(00137) РФ МКИ 7 С 12 М 3/00 Способ получения алкалоидов. из каллусных тканей Catharanthus roseus L. /Е.В.Юшкова, Н.А.Величко, Е.В.Никонорова, С.М.Репях /Приоритет 9.04.96.

20.Смольникова Я.В., Юшкова Е.В., Величко НА Оценка влияния элиситоров на каллусную ткань Catharanthus roseus L. /Проблемы химико-лесного комплекса: Сб.тр.- Красноярск, 1999. - С.26-28.

21.Болдырева Я.В., Юшкова Е.В., Величко НА. Поглощение сахарозы при культивировании in,vitro Catharanthus roseus L. /Проблемы химико-лесного комплекса: Сб.тр.- Красноярск, 1999. - С.29-30.

22.Величко НА., Сараев И.В., Смольникова Я.В., Горбунов СВ., Репях СМ. Выделение алкалоидов из интактного растения и каллусной ткани

катарантуса розового /Проблемы химико-лесного комплекса: Сбтр.-Красноярск, 2000.- С.225-228.

23.Величко Н.А, Смольникова Я.В. Применение индукторов вторичного метаболизма для повышения выхода биологически активных веществ в культуре ткани барвинка розового /Проблемы химико-лесного комплекса: Сб.тр.- Красноярск, 2000.- С.228-232.

24.Величко НА, Смольникова Я.В. Использование грибных и дрожжевых элиситоров для индукции вторичного метаболизма в культуре клеток Catharanthus roseus L. // Вестник СибГТУ.- 2000.- №2.- С.75-78.

25.Юшкова Е.В., Никонорова Е.В., Конев И.К., Величко Н.А., Репях СМ. Микроразмножение хвойных в условиях in vitro //Лесной журнал. - 2001.-№4.- С. 128-131.

26.Величко НА, Смольникова Я.В. Влияние элиситоров на биосинтетическую способность клеточной культуры Catharanthus roseus L. /Проблемы химико-лесного комплекса: Сб.тр.- Красноярск, 2001.- С.72-74.

27.Болдырева Я.А., Величко Н.А. Повышение биосинтетической способности катарантуса розового (Catharanthus roseus L Don) в условиях in vitro // Биотехнология. - 2002.- №6 - C.35-40.

28.Юшкова Е.В., Величко Н А., Репях СМ. Влияние уровня освещенности на процессы роста и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L.(Don Mey) и накопление алкалоидов в условиях in vitro // Вестник СибГТУ. -2002. - №2.-С.42-44.

29.Болдырева Я.А., Величко Н.А. Влияние элементов минерального питания на рост каллусной ткани и синтез алкалоидов в культуре ткани катарантуса розового //Биотехнология. - 2003. -№1. - С.53-62.

30.Положительное решение №2130546/13 (1000) РФ МКИ 7 С 12 №5/00 /Заязл. 27.03.2003. Приоритет 5 02.2004. Способ получения алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L /Н А.Величко, СМ.Репях, Я.В.Смольникова

Подписано в печать 14.05.04 Сдано в производство 1& .05.2004. Формат 60 х 84 1/16. Печать офсетная. Бумага типографская. Усл.печ.л.2,0- Усл.изд.л. 2,0 .Изд. №163. Тираж 100 экз. Заказ № 750. Лицензия ИД №06543 16.01.02 Отпечатано с готовых оригинал-макетов в типографии СибГТУ

660049, г.Красноярск, пр. Мира, 82.

1110 0 0 ь

Содержание диссертации, доктора технических наук, Величко, Надежда Александровна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 .Культура клеток и тканей растений - как источник биологически активных соединений

1.1 .Каллусная ткань в изолированной культуре

1.2.Вторичный метаболизм в растениях in vivo и in vitro

1.2.1 .Продукты вторичного метаболизма в культуре ткани Catharanthus roseus L.

1.3.Условия и способы культивирования растительных клеток и синтез биологически активных веществ

1.3.1. Физико-химические факторы среды 20 1.4.Элиситоры как индукторы вторичного метаболизма в клеточной культуре ткани

1.4.1 .Механизмы воздействия элиситоров на биосинтетические способности растительной клетки

1.4.2.Воздействие элиситоров на регуляцию метаболизма алкалоидов 47 1.5.Способы культивирования и их влияние на вторичный синтез в культуре ткани 59 1.5.1 .Культивирование интактных растений 5 9 1.5.2.Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде (суспензионные культуры) 60 1.5.3 .Культивирование иммобилизованных клеток 62 Выводы

Глава 2.0бъект и методы исследования 68 2.1 .Объект исследования

2.2.Введение в культуру Catharanthus roseus L.

2.3.Получение каллусных тканей Catharanthus roseus L.

2.4.Получение суспензионной культуры

2.5.Иммобилизация тканей Catharanthus roseus L. на инертный носитель

2.6.Методы оценки физиологического состояния культуры

2.7.0пределение содержания тяжелых металлов

2.8.Элиситоры в качестве биотического воздействующего фактора в культуре ткани Catharanthus roseus L.

2.9.Определение содержания протеина в каллусных тканях Catharanthus roseus L.

2.10.0пределение флавоноидов в каллусной ткани Catharanthus roseus L.

2.11. Определение сапонинов

2.12.Количественное определение свободных аминокислот 82 2.13.Определение суммарного содержания алкалоидов 83 2.14.Разделение алкалоидов Catharanthus roseus L. высокоэффективной жидкостной хроматографией

2.15.Определение содержания хлорофилла

2.16.Определение ферментативной активности ферментов шикиматного пути хинатдегидрогеназы и шикиматдегидрогеназы

2.17,Определение химического состава плодового тела гриба Pleurotus ostreatus (Fr Kumm)

2.18.Методы исследования водных экстрактов древесной зелени

2.19.Культивирование дереворазрушающего высшего гриба Pleurotus ostreatus (Fr. Kumm) на послеэкстракционном остатке каллусной ткани Catharanthus roseus L.

ГлаваЗ .Введение в культуру Catharanthus roseus L. 93 3.1 .Получение интактных стерильных растений Catharanthus roseus L. в культуре in vitro

3.2.Получение каллусной ткани и суспензионной культуры Catharanthus roseus L.

3.3.Влияние физико-химических параметров на процессы роста и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L. 110 3.3.1.Влияние уровня освещенности на процессы роста и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L.

3.3.2.Влияние концентраций сахарозы на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L.

3.3.3.Влияние инозита и гидролизата казеина на рост ткани и накопление алкалоидов

3.3.4.Влияние гормонального состава среды на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L.

3.3.5.Влияние модуляторов вторичного метаболизма на активности ключевых ферментов шикиматного пути

3.3.6.Влияние минерального состава среды на рост и структуру каллусной ткани Catharanthus roseus L.

3.3.7.Влияние фосфатного компонента на рост каллусной ткани и накопление алкалоидов

Глава 4.Способы получения клеточной культуры Catharanthus roseus L. 165 4.1 .Суспензионная культура Catharanthus roseus L.

4.2.Иммобилизация каллусной ткани Catharanthus roseus L. на пенополиуретановые пластины

4.3.Влияние способа культивирования на рост и развитие каллусной ткани Catharanthus roseus L.

Глава 5.Влияние элиситоров различной природы на биосинтетическую способность клеточной культуры Catharanthus roseus L.

5.1.Динамика роста и накопление индольных димерных алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L. под действием элиситоров мицелиальных, дрожжевых грибов и хвойных экстрактов

5.2.Качественный и количественный состав свободных аминокислот в каллусной ткани Catharanthus roseus L.

5.3.Содержание биологически активных веществ в каллусной ткани Catharanthus roseus L. после элиситации

5.4.Активность ферментов шикиматного пути

5.5.Химический состав плодового тела гриба Pleurotus ostreatus

Fr. Kumm)

5.6.Состав водных экстрактов древесной зелени сосны

5.7.Питательная среда на основе хвойного водного экстракта сосны

Глава б.Проблема регуляции и стратегии контроля процессов вторичного синтеза в культуре in vitro

Глава 7.Технология получения алкалоидов из растительного сырья 237 7.1.Технологический процесс получения каллусной ткани и алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L. 238 7.2.0птимизация процесса извлечения алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L. 242 7.2.1.Химический состав каллусной ткани Catharanthus roseus L. после культивирования дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus

Fr Kumm)

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Научные основы индуцированного синтеза алкалоидов в клеточной культуре CATHARANTHUS ROSEUS L.(DON)"

Растительная клетка - уникальный источник ценных биологически активных веществ разной химической природы, которые обладают не только широким спектром лечебного действия, но и применяются в парфюмерии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Химические аналоги данных веществ, как правило, содержат сопутствующие примеси, проявляющие негативное действие на организм человека и животных. Кроме того, многие специфические биологически активные вещества, такие как алкалоиды, являются продуктами отдаленного синтеза у растений и их искусственное получение затруднено в связи с многостадийностью процесса, низким выходом основного продукта и его дороговизной [1,2].

Поиск альтернативных источников и разработка методов получения биологически активных веществ растительного происхождения, по эффективности сопоставимых или превосходящих использование традиционного сырья определяет актуальность этой проблемы. Одним из таких методов является культура клеток и тканей растений in vitro.-Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений [3,4,5].

Основной проблемой метода культуры тканей и клеток высших растений в аспекте получения ценных вторичных метаболитов является низкий конечный выход продукта. Это обусловлено тем, что в условиях in vitro клетки выходят из-под организменного контроля, присущего целому растению, и образуют специфическую биологическую систему с иной, чем в целом организме "сверхзадачей". Актуальным при использовании культур тканей и клеток высших растений с целью получения ценных вторичных веществ является поиск условий, при которых обеспечивался бы оптимальный рост и оптимальное содержание вторичных веществ в биомассе. Основными факторами, регулирующими эти процессы в культуре in vitro, являются искусственные регуляторы роста и способы культивирования тканей и клеток.

Роль искусственных регуляторов роста в процессах деления клеток in vitro изучена достаточно глубоко. Однако, существенное влияние на выбор вида регулятора, его концентрации оказывает видовая принадлежность, генотип, а также эпигенетические факторы [6]. Поэтому подход к каждой конкретной культуре остается эмпирическим. Данные по влиянию регуляторов роста на процессы вторичного синтеза в разных культурах весьма противоречивы. Этот вопрос требует дальнейшего серьезного изучения [7].

Применение того или иного способа культивирования существенным образом определяет как скорость роста биомассы, так и интенсивность биосинтетических процессов. Традиционные методы культивирования (поверхностное и глубинное) имеют ряд существенных недостатков. Иммобилизация клеток на инертный носитель является перспективным подходом для биотехнологического использования культур высших растений. Преимуществами создаваемых клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на плантациях растения) являются: 1) получение продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий и возможность культивирования клеток тропических растений; 2) оптимизация и стандартизация условий выращивания; 3) перспективы полной автоматизации и компьютеризации процессов.

Культивирование тканей и клеток высших растений in vitro (в частности Catharanthus roseus L. Don) с целью их промышленного использования для получения соединений специализированного обмена определяет актуальность данного исследования.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Величко, Надежда Александровна

1 .Разработана концепция направленного синтеза алкалоидов в клеточной культуре Catharanthus roseus L. в условиях in vitro, позволяющая повысить эффективность биотехнологического производства.2.Установлено влияние минерального состава среды на процессы приживаемости, роста и регенерации введенных in vitro эксплантов.«Пассивное» снижение минеральных компонентов среды коррелирует с получением маточных стерильных укорененных интактных растений Catharanthus roseus L. в условиях in vitro,

3.Разработаны методы получения быстрорастущих клеточных линий Catharanthus roseus L. способных к вторичному синтезу.4.Установлены закономерности формирования и развития каллусной ткани Catharanthus roseus L. в зависимости от типа экспланта и его локализации в интактном растении. Показано, что наиболее высокой была инициация каллусообразования из почек Catharanthus roseus L. на средах, содержащих а НУК и 6-БАП (10 мг/л и 1 мг/л соответственно).5.Образование индольных димерных алкалоидов в тканях Catharanthus roseus L.зависит от структуры ткани. Формирование индольных димерных алкалоидов происходит в эмбриогенном каллусе, рост и развитие которого определяется в свою очередь сбалансированным гормональным составом питательной среды.Гормональный состав среды, содержащей а-НУК и 6-БАП (10 и 1 мг/л) соответственно, обусловливает не только быстрый рост ткани, но и накопление индольных димерных алкалоидов.б.Определено влияние углеводного компонента на структуру, цвет каллусной ткани, накопление биомассы и алкалоидов. Полученные результаты позволили сформировать культуру Catharanthus roseus L. с требуемыми характеристиками и повышенным содержанием алкалоидов.7.Дана оценка воздействия органических добавок (гидролизата казеина,

мезоинозита) на тканевый эмбриогенез и характер структурной организации клеточной культуры Catharanthus roseus L.8.Установленая отрицательная корреляционная связь между содержанием протеина и алкалоидов свидетельствует о том, что протеин расходуется на поддержание роста и образование эмбриоидных структур.Накопление алкалоидов связано с процессами дифференциации каллусной ткани и образованием соматических эмбриоидов.9.Показано влияние минерального состава среды на рост, цвет, структуру каллусной ткани Catharanthus roseus L. Увеличение концентрации микроэлементов цинка, магния, марганца, бора в два раза стимулировало рост и способствовало образованию структурированной ткани с повышенным содержанием эмбриоидов.10. Для поддержания активного роста эмбриогенного каллуса Catharanthus roseus L. и высокого синтеза индольных димерных алкалоидов наилучшим является поверхностный способ культивирования иммобилизованной на пенополиуретан ткани, что обеспечивает увеличение выхода винкристина.11 .Впервые были использованы для повышения биосинтетического потенциала экстракты хвойных пород Сибири и элиситор из плодового тела дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus. Реакция элиситации вызывала активный синтез винкристина в каллусных культурах Catharanthus roseus L. Во всех вариантах его концентрация была выше, чем в контроле. Наиболее эффективно влияние элиситора из плодового тела дереворазрушающего гриба Pleurotus ostreatus. Максимальное накопление алкалоидов наблюдали при культивировании с 0,5 %-ным экстрактом гриба, что позволило увеличить выход винкристина в 6,1 раз.12.0пределены условия извлечения алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L.13.Интенсивный синтез алкалоида обеспечивается активацией шики-матного пути, по которому синтезируются его предшественники. Показано, что разные факторы приводят к координированному повышению активности ферментов фенилпропаноидного метаболизма. Установлено активируюш;ее действие элиситоров на работу ключевых ферментов шикиматного пути. Использование ингибиторов и модуляторов активности ферментов вторичного метаболизма позволяет перераспределить предшественники с первичных метаболических путей на вторичный синтез.14.0пределены основные пути регуляции и стратегии контроля процессов вторичного синтеза в культуре ткани Catharanthus roseus L.15.Разработана технологическая схема получения индольньпс димерных алкалоидов из каллусной ткани Catharanthus roseus L.1 б.Метод культивирования in vitro эмбриогенной каллусной ткани Catharanthus roseus L. позволяет получать индольные димерные алкалоиды в количествах сопоставимых с интактными растениями, при сохранении природных популяций.

Библиография Диссертация по биологии, доктора технических наук, Величко, Надежда Александровна, Красноярск

1. Альферман А.И. и др. Пер. с англ. В.И. Негрука Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.:Агропромиздат, 1987. 5-7.

2. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения //Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. 3-28. З.Бутенко Р.Г. Культура тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964.-272с.

3. Бутенко Р.Г. Культура тканей и клеток растений. М.: Знание. 1971.- 46с. З.Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез в культуре клеток растений. М.: Наука, 1975.-87с. б.Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука. Сиб.отд-ние.- 1990. 243с. 7.3апрометов М.Н. Вторичный метаболизм в культурах клеток и тканей растений //Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.- З7-51.

4. Fuller M.W. Chemicals from plant cell cultures some biochemical and physiological pointers //Chemistry and industry.- Oxford 1984.- Vol.23.- P.825833.

5. Гаммерман А.Ф., Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский A.A. Лекарственные растения: Справ, пособие 4-е изд. М.: Высшая школа, 1990. -543 с. Ю.Крендель Ф.П. ЬСлеточная биотехнология, как экологический принцип охраны лекарственных растений //«Экологические аспекты в фармации»:Тез. док. Междунрод. симп. М 1990. 64. И.Черепанов К. Сосудистые растения России и сопредельных государств. С Пт., 1995.-990 с.

6. Вольф Э.К. Быстрая оценка «горячих точек» Зеленый мир.- 1995.- №24. 14-15. 1 З.Бутенко Р.Г. Культура изолированных клеток и тканей в решении задач физиологии растений //Новые направления в физиологии растений. М.: 252

7. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений Рост растений и природные регуляторы. М.: Наука, 1977. 697-710 1 З.Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений /«Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»: Тез.докл.7-ой Международ, конф. Москва, 1997.- 6-7.

8. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич А.В. Биотехнология. Рига: Зинатне, 1987.-257с.

9. Бутенко Р.Г. Клеточная инженерия. М.: Наука, 1987. 122 с.

10. Муромцев Г.С, Чекаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987.-С.316-322.

11. Бутенко Р.Г. Физиология клеточных культур, состояние и перспективы //Физиология растений. 1978. Т.25.-№5.-С.1009-1024.

12. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез в культуре клеток растений. М.: Наука, 1975.-87 с.

13. Машкина О.С, Табацкая Т.М., Стародубцева Л.М. Эффект длительного черенкования in vitro для массового размножения березы и тополя «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»: Тез. докл. 7ой Международ. Конф. Москва, 1997.- 437-438.

14. МомотТ.С.Технология изолированных культур для микроразмножения лесных древесных растений //Тез. докл. 7-ой Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Москва, 1997. -С.441-442.

15. Нечаева М.Ю., Бурдаева Л.М. Опыт введения в культуру in vitro омоложенного селекционного материала дуба чешуйчатого. //«Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»: Тез. докл. VII. Международ, конф. Москва, 1997.- 447-448. 253

16. Кучеренко Л.А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro /Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. 232-235.

17. Аветисов Л.А,, Горбунов А.Б., Клюева Г.Э. Создание коллекции сортов и форм клюквы методом клепального микроразмножения //«Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»: Тез. докл. VII. Международ, конф. Москва, 1997. 391-392. 27.ВЫСОЦКИЙ В.А. Регенерационная способность изолированных меристематических верхушек черной смородины и вишни и методы получения из них целых растений. Л.: ВИР, 1978.-С.28-34.

18. Биотехнология. Принципы и применение /Г.Бич Д.Бест К.Брайерли и др.: Пер. с англ. Под ред.И.Хиггинса М.: Мир, 1988. 480 с.

19. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев.: Наукова думка, 1984.- 160 с. ЗО.Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с. ЗО.Шамков Н.В., Зайцева Г.В., Белоусава Н.М., Отработка режимов культивирования клеток женьшеня на опытно-промышленной установке. Омутинский химический завод //Биотехнология. -1992.№1.- 384-386.

20. Yeoman М.М., Miedzybrodzka М.В., Lindey К., McLauchlan W.R. The synthetic potential of cultured plant cell //Plant cell cultures: Result and perspectives. Amsterdam ets.: Elsevier, 1980.- P.327-344.

21. Чулафич Л. Клональное микроразмножение диоскореи балканской эндемичного вида флоры Югославии //Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991.- 209-213.

22. Steinitz В., Lilien-Kipnis Н. Control of preococious gladiolus com and cormel formation in tissue culture. //J.Plant Physiology. 1989. Vol. 135. P.495-500. 254

23. Gautheret R.J. Culture du tissue cambial //C.R.Acad. Sci., 1934. D.I98. №24.P.2195-2196.

24. Бутенко Р.Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений Рост растений и природные регуляторы. М.: Наука, 1977.-C.6-21.

25. Кубалакова М., Гавел Л. Использование культур тканей в процессе селекции у Lilium L. //Биология культивируемьк клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991.-С.206-209.

26. Скрипаченко В.В. Культивирование in vitro тканей хвойных Сибири: Автореф.дис.канд.биол. наук. -Красноярск, 1992. 30 с.

27. Olsozowska О., Furmanowa М. Micropropagation of Culuria geoides by axillary shoots //Plantamed.- 1986. -Vol. 52.- P.521 -524.

28. Pamawat K.G. Raj Gansali R., Arya H.C. Soot formation in Catharanthus roseus callus culture //Curr. Sci,-1978.- Vol. 47. P.93-94. 42.ДИКСОН P.A. Изолирование и поддержание каллусньк и суспензионньк культур клеток //Биотехнология растений: культура клеток. М.: Агропромиздат, 1989.-C.8-31.

29. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений //Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991.-С.5-20.

30. Fuller K.V. Chemicals from plant cell cultures some biochemical and physiological pointers //Chemistry and industry. Oxford, 1984.- Vol. 23.- P.825-833.

31. Alfermann A.W. Syntheses by plant cells //Biocatalysts in organ syntheses. Netherlands, 1985. P.225-238.

32. Tsuyoshi E. Alkaloid production in root and soot cultures of Catharanthus roseus //Planta med.-1987. -Vol. 53. 5. P.479-482. 255

33. Shuler M.L. Production of secondary metabolites from plant tissue culture problem and perspectives //Ann NY Acad Sci..- 1981.- Vol.369.- P.65-79.

34. Morris P., Rudge K., Cresswell R., Fowler M.W. Regulation of product synthesis in cell cultures of Catharanthus roseus. V Long-term maintenanance of cells on a production medium //Plant cell, tissue and organ culture. -1989. Vol. 17.- 2.C.79-90.

35. Bailey СМ., Nicholson H., Stafford A., Smart NJ. Catharanthus roseus L.Don. A model for the biosynthethsis of indol alkaloids by cell suspensions //Appl. Biochem. Biotechnol.- 1986.- Vol 12.-№ 3.- P.215-227.

36. Бузук Г.Б., Ловкова М.Я Метаболизм алкалоидов: регуляция на молекулярном уровне, пространственная организация //Прикладная биохимия и микробиология.- 1995.-Т. 31.-№ 5.- 467-479.

37. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение

38. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке. М.: Мир. 1980.-Т. 3.-487 с.

39. Лекарственные средства: свойства, применение, противопоказания: Справочник /Под ред. Клюева М.А. М.: Русская книга, 1993. 576 с.

40. Misawa М. Production of useful metabolites by plant tissue culture Biomass Convers. Technol. Prinsiples and Pract. -1987.- P. 193-199. 256

41. Berlin J., Mollenschott C DiCosmo F. Comparison of various strateggies designed to optimize indole alkaloid accumulation of cell suspension culture of Catharanthus roseus //Naturforesch..- 1987.- Vol.42. 9.- p.i 101-1108.

42. Yoshida F., Kohono H. Regulations of mineral and especially nitrogen nutrition to growth rate of plant cell cultures //Plant cell culture.- 1987. -Vol. 4.- 2- P.53-59.

43. Simpson A.P., Kelly S.L. Cytochrome P-450 inducer/inhibitor effects on cell cultures of Catharanthus roseus Plant Sci. Vol.50, 2.- P.231-236.

44. Kochs G., Welle R., Grisebach H. Differential induction of enzyme in soybean cell cultures by elicitor or osmotic stress J. Planta. 1987. Vol. 171- 4. P.519524.

45. Ukajai Т., Aschihara H. Changes in levels of cellular components in suspension culture of Catharanthus roseus associated with inorganic phosphate depletion /Naturforesch.- 1986.-Vol. 41.-№ 11-12.-P.1045-1051.

46. Goodchild J., Givan C. Influence of ammonium and extracellular pH on the amino and organic acid contents of suspension culture cell of Aser pseudoplatanus //Phisiol. Plant. 1990. 78.- №1.- P.29-37. бб.Савина T.A. Изучение поглощения азота, фосфора, калия суспензион-ной культурой Стефании гладкой Тр. 9 Конф. молод, ученых НПО ВНИИ лекарств, раст. Москва 1989. 139-143.

47. Носов A.M., Пауков В.Н., Бутенко Р.Г. Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток диоскореи дельтовидной //Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986.- 76-79.

48. Носов A.M. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro //Физиология растений.- 1994.- Т.41. 6. -С.876-878. 69.3апрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растениия. М.: Наука, 1996. 56 с.

49. Brodelius Р., Linsefors L. Immobilised plant cell in plant hormone studies Symp .Young Scl .Phisiol and biochim Plants. 1987. 4.14.- 16 p. 257

50. Morris Р. Regulation of production synthesis in cell culture of Catharanthus roseus. Alkaloid metabolism in cultured leaf tissue and primary callus //Planta med.1986.-№2.-P.127-132.

51. Dalton C.C, Peel E. Product formation and plant cell specialization: A case of photosynthetic development in plant cell cultures //Progr.Indust. Microbiol.- 1983. Vol.17.-P.109-166.

52. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение

53. Карначук Р.А., Протасова Н.Н., Добровольский М.В. Физиологическая адаптация листа левзеи к спектральному составу света //Физиология растений.1987.-Т.34.-С.51-59. 76.3агоскина Н.В. Особенности метаболизма фенольных соединений гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур чайного растения (Camellia sinensis L.):Автореферат дисс.. .докт биол.наук, 1997.- 49 с.

54. Tsuyoshi Е., Goodbody А., Masanaru М. Alkaloid production in root and shoot cultures of Catharanthus roseus //Planta med.- 1987.- Vol.53.-№ 5.- P.778-482.

55. Генкель Г.А, Физиология растений с основами микробиологии. М.: Мир, 1988. 463 с.

56. Лебедев СИ. Физиология растений.- М.: Колос. 1982.- 463 с.

57. Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине /Под ред. Я.В.Пейве. М.: Наука, 1974. 438 с.

58. Грин П., Стаут У., Тейлор Д. Биология В 3-х т. /Пер. с англ.. под ред. Р.Сопера. М.: Мир, 1990. 368 с.

59. Hiroshi А, Xiao Ni, Toshibo U. Effect of inorganic phosphatebon the cultuvated cells of biosynthesis of pyramiding nucleotides in suspension Catharanthus roseus.//Ann bot.- 1988.-Vol.61. №2.- P.225-232. 258

60. Метаболизм алкалоидов: регуляция на молекулярном уровне /О. А. Заботина, О. Г. Мурьянов и др.//Физиология растений. 1995. Т. 31, №5-С. 467 479.

61. Бузук Г.Н. Влияние микроэлементов на биосинтез алкалоидов Растительные ресурсы. 1986. Т.22. №2. 272-279.

62. Курсанов А.Л. К вопросу о регулировании белкового обмена в живой растительной клетке //Синтез органических веществ и роль витаминов в растениях. М.: Изд-во АН СССР, 1940. 45-49.

63. Гринкевич Н.И., Сорокина А.А. Роль геохимических факторов среды в продуцировании растениями биологически активных веществ //Биологическая роль микроэлементов. М.: Наука, 1983. 187-191

64. Гринкевич Н.И., Ловкова М.Я., Бузук Г.Н. Изучение биогенеза алкалоидов Glaucium flavum crantz и путей его регуляции //Растительные ресурсы. 1982, №3. 367-372.

65. Щигельский 0,А., Воллосович А.Г., Ященко В.К. Влияние меди и марганца на биосинтез алкалоидов в культуре изолированной ткани Rauwolfia serpentina Benth. //Растительные ресурсы. 1974, Т,10, №4, 563-566.

66. Ддров Б.Н,, Дмитрук У., Батурин В.Г. Влияние меди, марганца и кобальта на продуктивность культуры изолированной ткани Datura Innoxia Mill, //Растительные ресурсы, 1978, Т,14, №3, С,408-411, 92,Ловкова М,Я,, Бузук Г,Н,, Сабирова Н,С, Фармакогностическое изучение мачка желтого //Фармация. 1987. №5. 31-34. 259

67. Мироненко А.В. Влияние микроэлементов на накопление алкалоидов и продуктивность люпина //Биохимия люпина. Минск.: Наука и техника, 1975. С 174-192.

68. Регуляция минерального питания и продуктивность растений Е.С.Ткачук, Л.М.Кузьменко, В.Ф.Нижко и др.; Отв.ред. Л.К.Островская; АН УССР, Ин-т физиологии растений и генетики. Киев.: Наукова думка, 1991. 172 с.

69. Ковальский В.В., Гринкевич Н.И., Грибовская И.О. Геохимическая экология лекарственных растений //Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине. М Наука, 1974. 150-156.

70. Гудков И.Н. Регуляция поступления и транспорта элементов минерального питания в растении //Регуляция минерального питания /Отв. ред. И.Тома Кишинев: Штиинца, 1989. 3-25.

71. Бузук Г.Н. Влияние микроэлементов на биосинтез алкалоидов. Растительные ресурсы.- 1986.- Т.22. 2 272-279.

72. Биотехнология растений культура клеток. Пер. с англ./Г.П.Болвелл К.К.Вуд, Р.А.Гонзалес и др.-М., 1989. 280 с. ЮО.Эргашев А.К., Ефимков В.А. Шелковица как объект в биотехнологических исследованиях Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991.-С.36-39.

73. Нойман К.Х. фотосинтез и фотоавтотрофные культуры растительных клеток //Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991-С.56-75.

74. Drew S.W., Demain A.L. Effect of primary metabolites on secondary metabolism. //Annual revies of microbiology.- I990.-Vol. 31.- P.346-356.

75. Kodja H., Liu D., Merillon J-M. et all. Stimulation par les suspensions cellulaires de Catharanthus roseus //Acad. Sci Ser.-1989. -Vol.3 10. P.453-458. 260

76. Morris P.Regulation of product synthesis in cell culture of Catharanthus roseus Cimparison of production mtdia //Planta med.- 1986.- №2. P. 121-126.

77. Veropoorte R., Hejden R Hoge J. H., Yoopen Y. J. Plant cell biotechnology for the production of secondary methabolites //Pure and Appl. Chem.-1994.- Vol.10. -P.2307-2310.

78. Merillon J-M.. Ouelhazi L., Dorireau P., Chenieux J-C, Rideau M. Methabolic changes and alkaloid production in habituated and non- habituated cells of Catharanthus roseus grown in hormon-free medium. Comparing hormone-deprived nonhabituated cells with habituated cells. //J. Plant physiol.- 1989. Vol.134.- №1. P.54-60.

79. Seitz H.U., Eilert U., De Luca V., Kurtz W.G.W. Eliscitor-mediated induction phenylalanine ammonia lyase and triptophan decarboxilase: Accumulation of phenols and indole alkaloids in cell suspension culture of Catharanthus roseus. Plant cell, tissue and organ culture. -1989.- Vol.18.- 1.- C.71-78.

80. Aldington S. and Frusc /Advances in Botanical Research.- 1993. Vol.19. -P.l101. llS.Liskova D., Auxtova O., Kakoniova D., Kubacrova M., Karacsonyis and Bilisics //Planta.-1995.- Vol.196.- P. 425-429.

81. ColeF and HahnM//Plant Mol. Biol. 1994.-Vol .26.-P. 1379-1411.

82. Ракитин В.Ю., Долгих Ю.И., Шайкина С Ю Кузнецов В.В. Ингибирование олигосахаридом синтеза этилена и стимуляция соматического эмбриогенеза в культуре клеток хлопчатника. //Физиология растений.- 2001. Т.48.- №5.С.728-732.

83. Тарчевский И.А. Элиситор индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. //Физиология растений.- 2000. -Т.47.- №2.- 321-331. 122.3аботина 0.,Аюпова Д., Гурьянов О., Ибрагимова Н., Николаева О., Федина Е.,Торощанина Т., Заботин А. Биоактивные растительные олигосахариды: структура и функции //Тез.докл. Всероссийской конф."Химия и технология растительных веществ". Сыктывкар. 2000.- 65-66. 262

84. Increased secondary product formation in plant cell culture after treatment with carbohydrate preparation /G. Funk, P. Brodelius Phytochemistry. 1987. Vol. 26. P 401-405. 126.0зерцковская О.Л., Переход E.A. Фукозилсодержащие олигосахариды и фитофтороустойчивость картофеля //Физиология растений. 1997. Т.44. №6. -С.893-896.

85. Ловкова М.Я., Бузук Г.Б. Выделение олигосахаридов из побегов гороха и их физиологическая активность //Физиология растений.- 1995. Т.42. №3. 415-422. 128.3аботина О.А., Гурьянов О.П. Метаболизм алкалоидов: регуляция на молекулярном уровне //Физиология растений.- 1995.- Т.31. №5. 467-479.

86. Соколов B.C. Алкалоидоносные растения М.: Высш. шк,1982. 176 с.

87. Вардапетян Г.Р., Киракосян А.Б., Оганесян А.А., Пересян А.Р., Альферман А.В. Накопление лигнанов в каллу сных культурах Linum austnacum L. под действием элиситоров //Биотехнология. 2002. №3. 37-41.

88. Dmitriev А. Р., Kravchuk Z. N., Dyachok J. V. Regulation of fitoalexinproduction in suspension cell culture of onion //Biotechnology Approaches for exploitation and Preservation of Plant Recourceiltemational Symposium, Yalta, Ukraine.- Yalta, 2002.- P. 49.

89. HocoB A.M. Функции вторичных метаболитов //Физиология растений. 1994. Т.41. №6. 873-878.

90. Moreno Р. R., Heijden R., Verpoorte R. //Planta cell Reports. 1994.- Vol. 14.- P. 188-191. 263

91. Ильинская Л.И., Васюкова Н.И., Озерцковская О.Л. Биохимические аспекты интродуцированной устойчивости и восприимчивости растений Итоги науки и техники. Серия «Защита растений». ВИНИТИ.- 1991.- Т.7.-196 с.

92. Чалова Л.И., Авдюшко А., Караваева К.А. и др. Активное начало индуктора защитных реакций картофеля //Прикладная биохимия и микробиология.- 1988.- Т.24.- Вып.6.- 789.

93. Лукнер М. Вторичный метаболизм микроорганизмов, растений и животных. М.: Мир. 1979. 548 с.

94. Девочкин Л.А, Шампиньоны. М., Агропромиздат, 1989.- 174с.

95. Кутафьева Н.П., Цепалова И.Э. Биохимический состав съедобных грибов Сибири //Растительные ресурсы.- 1989. №2. 278-282.

96. Псурцева возможности Н.В., Белова Н.В., Алехина И.А. Биотехнологические использования коллекционных культур базидиомицетов Биотехнология.- 1994.- 7.- 35-39.

97. Морозов А.И. Грибы: руководство по разведению. Д.: Сталкер, 2000. 304с.

98. Белова Н.В., Псурцева Н.В.,.Мнухина А.Я., .Алехина И.А. Современные направления экспериментального исследования базидиомицетов.//Микология и фитопатология.- 1997.- Т.31.- Вып.6 64-75.

99. Piuz L.M. Sanchex J.B. Cultivation of Lentinus edods in tropical mexico Abstr. Of the International Mycological congress. Vancouver, Canada, Ougust.Vancouver, 1994.- P. 183.

100. Багдалян СМ., Дако П., Рапкор С Жакот М., Андарм К., Мнацоконян В.А., Арутюнян Л.С, Гарибова Л.В.. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов. Сравнительное иззение химического состава плодовых тел и культурно-морфологических признаков у некоторых видов рода Namataloma (Fr)P. Karst//Микология и фитопатология,- 1996. -Т.ЗО.- Вып.4,-С.79-86. 264

101. Кохреидзе Н.Г,, Элисашвили В.И. Лигноцеллюлолитическая активность Pleшotus ostreatus ИБК-191 при твердофазной ферментации отходов чайного производства //Прикладная биохимия и микробиология.- 1983.- Т.29. -Вьш.2. 227-232.

102. Ахмедова З.Р., Белецкая О.П. Целлюлазы и лигназы базидиомицетов Прикладная биохимия и микробиология.- 1993.- Т.29.- Вьш.6.- 823-828.

103. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты. Минск.: Наука и техника, 1988.-261С 1 ЗО.Элисашвили В.И.. Биосинтез и свойства целлюлаз и ксиланаз высших базидиомицетов.//Прикладная биохимия и микробиология- 1993. -Вып.З.- Т.29.С.340-353.

104. Bender F. Food from waste //Wood agro logist.- 1975.-Vol.4.- 3.-P.16.

105. Бисько H.A., Дудко И.А. Биология и культивирование съедобных грибов рода вешенка.- Киев: Научк.думка, 1987.- 145с.

106. Клечак И.Р,, Бисько Н.А., Билай В.Г. Особенности биодеструкции виноградной выжимки в процессе роста лищелия Lentinus edodes.//Mикoлoгия и фитопатология.- 1999.- Вьш.1.- Т.ЗЗ.- 44-46.

107. Величко Н.А., Репях СМ. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. //Химико-лесной комплекс научное и кадровое обеспечение в 21 веке. Проблемы и решения. Сб.ст. по материалам Международ, науч. практ. Конф.Красноярск, 2000. -С.263-267. 265

108. Бабицкая В.Г., Стахеев И.В., Щерба В.В., Костина Л.М., Вадецкий Б.Ю.. Трансформация костры льна в белок мицелиальными грибами. //Микология и фитопатология. -1986.- Т.20.- 2.- 113-119.

109. Клечак И.Р., Бисько Н.А., Билай В.Г. Особенности биодеструкции виноградной выжимки в процессе роста мицелия Lentenus Edodes. //Микология и фитопатология.- 1999.-Т.ЗЗ.-Вып.1.- 44-46.

110. Краснопольская Л.М., Белицкий И.В., Федорова Г.Б., Китеуха Г.С.. Pleurotus djamor: Способы культивирования и антимикробные свойства. //Микология и фитопатология.- 2001.-Т.35.- Вып.1.- 62-67.

111. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении БАВ базидиальных грибов //Микробиология.- 1998. -Т.34. №6. 597-608.

112. Краснопольская Л.М, Белицкий И.В., Федорова Г.Б., Китеуха Г.С. Pleurotus djamor: способы культивирования и антимикробные свойства Микология и фитопатология.-2001.-Т.35.-ВЫП.1.-С.62-67.

113. Кочетова Г.И., Мануковский Н.С, Панькова И.М., Трубачев И.Н., Калачева Г.С, Грибовская И.В .Биохимический состав Pleurotus Florida и Panus Tigrinus при культивировании на пшеничной соломе и возможности повторного использования недоокисленного субстрата //Микология и фитопатология.1988.- Т.22.-ВЫП.1.- 51-54.

114. Капич А.Н. Биосинтетическая при глубинном способность культивировании. дереворазрушающих //Микология и базидиомицетов фитопатология.- 1990.-Т.24,-Вып.5.-

115. Капич А.Н., Романовец Е.С., Войт СП. Содержание

116. Соломко Э.Ф., Елисеева Т.С, Рябчук В.А., Пчелинцева Р.К. Состав плодовых тел и мицелия гриба Pleurotus ostreatus //Прикладная биохимия и микробиология. -1987.- Т.23.- Вьш.2.- 180-236. 266

117. Вильнер 3.A., Медников Ф.А. применение в животноводстве и птицеводстве биоактивных продуктов, полученных из хвойной лапки Продукты переработки древесины сельскому хозяйству. Рига Зинатне, 1973.Т.1.-С.61-68.

118. Дагис И., Матейкене И., Заянчкаускене М. Динамика витаминов биогруппы в надземных органах сосны обыкновенной в течение года и применение этих витаминов для повышения урожайности. В кн: Регуляция роста и питание растений. Минск Ураджай, 1972.- 47-56.

119. Судачкова Н.Е. Метаболизм хвойных и формирование древесины Новосибирск Наука, 1977.-229 с.

120. Медведева А., Иванова З., Тюкавкина Н.А. Фенолокислоты и их гликозиды в хвое некоторых видов Pinaceae //Химия древесины.-1977.- №3.С.93-95.

121. Дубицкая Д., Мамонова Л.П. Потребность в витаминах.// Кормовые дрожжи на не пищевых средах. Алма-Ата Наука Каз.ССР, 1974. 30-32.

122. Карасевич Ю.П. Утилизация ароматических соединений дрожжами рода Debaryomyces.//Mикpoбиoлoгия.- 1978.-Вып.6.- 985-991.

123. Капуцелеви Ю.Г., Близник К.М.. Новая смешанная культура дрожжей продуцентов кормового белка на основе гидролизатов древесины, способная вытеснить из производственных популяций условно патогенные штаммы Candida tropicalis. //Биотехнология.-1999.-№2.-С.41-45.

124. Степень Р.А. Летучие фитоорганические продукты древесных пород.//Экстрактивные вещества 1977.-С.91-118.

125. Kowalski Т. Antogonistic effects of Candida sp on Scots pine needes -cast pathogenes and other fungi in vitr.//European Journal of forest pathology.- 1983 .-Vol .13.-P.l 15-129. древесных пород средней Сибири Красноярск, 267

126. Agiinag I. J., Huser R. Determination of organic compounds in needles of spruse and pine. Anales de Edafologia у Agrobiologia.- 1981.- Vol. 40.-№ 9/10.- P. 14851495.

127. Музалева Л.Д., Ганюшкина Л.Т. Динамика Сахаров и крахмала в годичном цикле развития сосны и ели. Учен. зап. Петрозаводск. Ун-та; 1967.- Т. 16.- №1, -С.32-35. 178.0сетрова Г.В. Годичная динамика углеводов у сосны обыкновенной в связи с периодичностью их роста.- Красноярск, 1973. 68-69.

128. Горохова В.Г., Тюкавкина Н.А, Запесочная Г.г. и др. Жидкостная хроматография растительных фенольных соединений //Химия древесины.1979.-№4.-С.76-80.

129. Медведева А., Иванова З., Тюкавкина Н.А. Фенолорсислоты и их гликозиды в хвое некоторых видов Pinaceae //Химия древесины,- 1977, №3. 93-95.

130. Осипов В.И. Гидроароматические кислоты в жизнедеятельности хвойных.Новосибирск.: Наука, 1979. 111с

131. Бабкин В.А. и др. Жидкостная хроматография растительных фенольных соединений. //Химия древесины. -1979.- №5. 100-102.

132. Тюкавкина Н.А., Горохова В.Г., Запесочная Г.г. и др. Жидкостная хроматография растительных фенольных соединений. Обращенно-фазовая хроматография флавоноидных агликонов. //Химия древесины. 1979. №2.С. 105-109. 184.Н.А.Тюкавкина, В.Г.Горохова, В.А.Бабкин Жидкостная хроматография стильбенов. //Химия древесины. 1979. №4. 81-85.

133. Мунтян Л.Н. Потребности в витаминах дрожжей Candida при росте на глюкозе и н-алканах: Автореф. дисс... канд. биол. наук, 1977. 23 с. 268

134. Wellenforf H., Kavfraann V. Thin layerchromatography of fluorescent phenolic compaunds in needles Geographic variation in Picea sitchensis, //Carr Forest tree improment ArboretetHorsholm. -1977.- 11.-21 p.

135. Репях СМ., Рубчевская Л.П. Химия и технология переработки древесной зелени.- Красноярск. 1994. 320 с.

136. Кефели В.И., Турецкая Р.Х. Участие фенольных соединений в ингибировании аБСТивности ауксинов и в подавлении роста побегов ивы, Физиология растений.- 1965.- Т. 12. Вып.4. 638-645.

137. Шуберт Г.А., Кравченко Н.Т. Физиологическая роль и цис-трансизомерия в ряду оксикоричных кислот. Фенольные соединения и их биологические функции.- М Наука, 1968. 138-142.

138. Воронков Л. А. Ингибирование ангтоцианами ауксинооксидазной активности пероксидазы. //Сельскохозяйственная биология. 1970. Т.5. №1.С.58-63

139. Ciertych М. М, Growth regulator changes in relation to growth of Pinus resinosa.//Act.-Canad J. Bot .-1966.-Vol. 44.- №6. P. 717-738.

140. Протопопов В.В., Никитенко Л.А. Влияние водных экстрактов из хвои различных пород на прорастание семян лиственницы сибирской. /В сб. Лиственница. Красноярск, 1964.- С194-197.,

141. Эрнст Л.К., Науменко Э.М. Биомасса леса и ее кормовое использование. М.: Наука.-1977.-90 с.

142. Мезенцева В.Г,, Попова И.И., Дерюжкин Р.И. Динамика содержания микроэлементов в хвое отдельных экотипов лиственницы сибирской в течение вегетации. //Биологические науки. 1976. №11. 96-102. 269

143. Репях СМ., Науменко Н.К, Голикова О.В. Состав минеральных компонентов хвои сосны. //Химия древесины.- 1981- №2. С103-106.

144. Ивашин А., Писарев В.Д., Олиференко Г.И. и др. Микроэлементы хвои и шишки Pinus sibirica. //Химия природных соединений. 1981.- №5. 675.

145. Sheedu G.Mineral composition of foliage of two groups of jack pine stands according to geographical location.// Memoire cervice de la Recherohe Forestieve.Oubec, 1980.-68.-36 p.

146. Митрофанов Д.П. Химический состав лесных растений Сибири- Новосибирск Наука, 1977. 119 с.

147. Роуз Э. Химическая микробиология. М.: Мир, 1971. 294 с.

148. Кудрина P.M. Влияние молибдена на накопление биомассы кормовых дрожжей Использование микроорганизмов в кормопроизводстве. Алма-Ата Наука Каз.ССР, 1970- С112-115.

149. Хрычева A.M. Влияние микроэлементов на нпакопление биомассы пекарских дрожжей //Прикладная биохимия и микробиология.- 1970.- Вып.З.С.307-312.

150. Schiel О., Witte L., Berlin J. Geraniol-10-hydroxylase activity and its suspension cultures of Catharanthus roseus //J.Naturforesch.-1987.- Vol.42.- №9.-p. 1075-1081. 206.3апрометов M.H., Загоскина H.B., Стрекова В.Ю., Морозова Г.А. Образование фенольных соединений и процесс дифференциации в каллус-ной культуре чайного растения //Физиология растений.- 1979- Т.26.- 485-491.

151. Ментел СТ., Смит Т. Факторы культивирования, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток и тканей растений Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропром-издат, 1987.-С 154-198

152. Archambault J., Volesky В., Kurtz W.G.W. production of indol alkaloids by Surface immobilized Croseus cells //Biochemical engineering research unit Monreal.- 1990.- Vol.35.- P.660-667. 270

153. Miura Y., Hirata К. Kurano N. Formation of vinblastine in multiple soot culture of Catharanthus roseus //Planta med.-1968. -Vol.54. P. 18-20. 211.В0ЛЛОСОВИЧ А.Г., Бутенко Р.Г. Культура ткани раувольфии змеиной как продуцент алкалоидов //Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1981.- 235-257.

154. Dhruva В., Ramakrishnan Т., Vaidynthan C.S. et al. Studies on Catharanthus roseus callus cultures, callus initiation and differentiation //Curr.Sci.- 1977 -Vol. 46.P.364-365.

155. Hirata K., Yamaka A., Kurano N. et al. Production of indole alkaloids in multipile soot culture of Catharanthus roseus L. Don, //Agr and Biol. Chem. -1987.Vol.51.-P.1311-1317.

156. Sakuta M., Komamine A. Cell growth and accumulation of secondary methabolites //Cell culture and somatic cell genetics of plants. Acad. Press. 1987. P.97-114. 21 З.Архангельская H.B., Кестнер А.И. Иммобилизованные растительные клетки //Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Пуш;ино,1987.- 40-43

157. Биология. Большой энциклопедический словарь./Гл. ред. М.С.Гиляров.- 3-е изд. М.: Большая Российская энциклопедия, 1999. 865 с.

158. Ареалы лекарственных и родственных им растений СССР. Л.: Изд-во ЛГУ, 1983.-208 с.

159. Sigma Chemical Company Cataloglog P. О. Box 14508, st Louis, Mo.- 63178 USA,1991.-P.1078.

160. Рабинович A.M., Толкачев O.H. О целесообразности изучения и использования целебных растений республики Конго //Труды 1 Всероссийской конференции по ботаническому ресурсоведению. Санкт-Петербург, 1996. 35-36. 271

161. Высоцкая Е.Ф., Гамбург К.З. К вопросу о природе кондиционирования при изолированной культуре растительных клеток //Физиология растений.- 1975. Т.22.-ВЫП.1.-С.63-69.

162. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.:Высшая школа, 1986. 356-357.

163. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. КиевгНаукова думка, 1973. 380 с.

164. Данилов А.В., Зайцева Г.В., Константинова В.А. и др. Влияние интенсивности массообмена на рост суспензионной культуры клеток женьшеня. //Физиология растений.- 1981. Т.28.- Вьш.5. 1072-1077.

165. Lemsohn Е., Worden Е,, Croteau R. Monoterpene cyclases in grand fir callus cultures modulation by elisitor and growth regulation //Phytochemistr.- 1994. Vol.36.-№3._p.651-656.

166. Левин Э.Д., Миронов П.В. Современные физико-химические методы исследования. -Красноярск СТИ, 1988.- 20.

167. Химический анализ лекарственных растений /Под ред.Н.И.Гринкевич Л.Н.Сафронович М Высш. Шк., 1983. 175 с.

168. Методы белкового и аминокислотного анализа растений: Методические указания. Л.: Наука, 1973. 69 с.

169. ЕрмаковА.И., Ярош Н.П. Методы биохимических исследований растений. Л.: Наука, 1972.-455 с.

170. Осипов В.И., Александрова Л.П. Изучение метаболизма хвойных методом пульсовой метки. /Исследование обмена веществ древесных растений. Новосибирск Наука, 1985. 5-14.

171. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. 322 с.

172. Рубчевская Л.П. Липиды хвойных растений семейства. Дисс.докт. хим. наук(05.21.03).- Красноярск, 1997.-431 с.

173. Ермаков А.И., Ярош Н.П. Методы биохимических исследований растенийЛ.: Наука, 1972. 455 с. 272

174. Клесов А.А. Ферментативное превращение целлюлозы //Итоги науки и техники.- М.:МГУ, 1983.

175. Ферментативный гидролиз целлюлозы /А.А.Клесов, М.Л.Рабинович, А.П.Синицын и др. //Биоорганическая химия. 1980.- Т.6.- №8.- 1225-1242. 237.0пределение использованием глюкозы в патоке калия глюкооксидазным В.Д.Щербухин, методом с ферроцианида Л.И.Миронова, А.В.Кондырева и др. //Прикладная биохимия и микробиология. 1970..- 476480.

176. Биохимические методы в физиологии растений. М.:Наука. 1971.- 227 с.

178. Ягодин В.И. Основы химии и технологии переработки древесной зелени. Л.: Изд-во Ленинггр. ун-та. 1981. 223 с.

179. Оболенская А.В., Леонович А.Л. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М.: Экология, 1991. 320 с.

180. Стеновая определение Л.П., Холькин Ю.И., Зенькович А.Н. Количественное методом углеводного состава технических гидролизатов газожидкостной хроматографии //Гидролизное производство.- 1970. Вып.1. 3-11.

181. Евдокимова Г.А., Косоногова Л.В., Фридлянд И.Г. Исследование органических кислот гидролизатов торфа методом ГЖХ //Химия древесины.1976.-№3.-С.113-116.

182. Плешков В.Д. Практикум по биохимии растений.- М.: Колос. 1976. 254 с.

183. Биохимические методы в физиологии растений М.: Наука, 1971. -227с. 246.3апрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высш. шк.-1974.-211 с.

184. Методы определения регуляторов роста и гербицидов. М.: Наука. 1966. 199 с. 273

185. Sacuta М., Comamine А. Cell growth and accmnulation of secondary methabolites //Cell culture and comatic cell geneticsof plante. Аса. Press., 1987.- P. 97-114.

186. Архангельская H. B. Алкалоиды клеточных культур Papaver somniferum Известия АН ЭССР. Химия.- 1989.- Т.38.- 4. 282-283.

187. Кочетова Г.И., Мануковский Н.С, Панькова И.М., Трубачев И.Н., Pleurotus Florida и Калачева Г.С, Грибовская И.В. Биохимический состав Panus Tigrinus при культивировании на пшеничной соломе и возможности повторного использования недоокисленного субстрата //Микология и фитопатология. 1988.- Т.22.-Вып.1 -С.51-53

188. Волчатова И.В., Медведева А., Бабкин В.А. Электронно- микроскопические исследования древесины.//Микология и фитопатология. 1998. Т.32. Вып.1- 55-60. 253,Багдалян СМ., Доко Л., Рапиар С Жакоб М., Андари К., Мнацаконян В.А., Арутюнян В.А., Гарибова Л.В. Химическое и фармакологическое исследование высших грибов //Микология и фитопатология. 1996. Т.ЗО. Вьш.4. 7386.

189. Багдалян СМ., Доко Л., Рапиар С Жакоб М., Андари К., Мнацаконян В.А., Арутюнян В.А., Гарибова Л. В. Химический состав и фармакологическое исследование плодовых тел Coriinarius armillatus (Fr:Fr)Fr.// Микология и фитопатология.- 1996. -Т.ЗО.- Вьш.З. 37-42.

190. Riuz L.M Sancek J.E., Calvo L.A. Cultivation of Lentinus edodes in tropical Mexico //Abstr. of Canada,-1994.-P.187.

191. Горшина B.C., Скворцова B.B., Бирюков В.В. Технология получения биологически активной субстанции лекарственного гриба кориола опушенного. //Биотехнология. -2003. №2 45-53. the VI International mycological Congress. Vanoovever.- 274

192. Клесов А.А., Григораш СЮ. Ферментативный гидролиз целлюлозы. //Биоорганическая химия. -1981. Т.7.- №10. 1538-1552.

193. Иванова Г.С, Белецкая О.П., Окунев О.Н. и др. Фракционирование целлюлазного комплекса гриба Aspergillus ter. микроьиология. 1983. -Т. 19.- Вып.З.- 362-368.

194. Варфоломеев Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. -М.:Наука, 1999.-715 с.

195. Lamed R., Leikus J. //J. Bacteriol. -1980.- 141.- P. 1251-1257.

196. Swith M.R, binder S.H., Moh R.A..// Process Biochem. -1980. 15. P.34-39.

197. Клесов А.А. Химическая энзимология. М.: МГУ, 1983.- 189-250

198. Воллосович А.Г., Бутенко Р.Г. .Культура ткани раувольфии змеиной как продуцент алкалоидов Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1981.- 235-257.

199. Кириллова Н.В., Орехова И.А., Комов В.П. Влияние фитогормонов на метаболизм ферментов антиоксидантной системы в культуре ткани раувольфии змеиной «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». Тез.докл. VII Международ, конф. -Москва, 1997. 25-26.

200. Носов A.M. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений //Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Наука, 1991.-C.5-20.

201. Моррис П. Образование продуктов вторичного метаболизма в суспензионных культурах клеток. М.: ВО Агропрмиздат, 1987.- 154-203.

202. Муромцев Г.С, Чекаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987.-С 316-322.

203. Ржержабек П., Горелова О.А. Влияние количестваи форм азота на рост клеток и накопление стероидных соединений в суспензионной культуре Solamun laciniatum Ait //Культура клеток растений и биотехнология .М.:Наука.-1986.- 70-76. //Прикладная биохимия и 275

204. Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. Effect of carbon dioxide and ethylene on berberine production and cell browning in Thalictrum minus cell cultures //Plant Cell Reports,- I99I.-V0I. 9- P.469-499.

205. Pissarra J., Santos I. Effect of ammonium on growth and lignin content of cultured callus tissue //Sciens biol.mol and cell.- 1988. -13. 3-4. P. 125. 273.0hlsson A., Berglund T. Effect of high MnS04 levels on cardenolide accumulation by digitalis lanata tissue in light and darkness //J. Plant physiol. -1989.Vol. 135.-.№4--P.505-507.

206. Yoshida F., Kohono H. Regulations of mineral and especially nitrogen nutrition to growth rate of plant cell cultures Plant cell culture. -1987. 4.- 2. P.53-59.

207. Albersheim P. Oligosaccharins that regulate growth, developments and defense responses in plant //Glycobiology.-1992.- Vol 2.- 3 P. 181 -198.

208. Brodelius P. Use of fungal to induce or enhance secondary metabolism in plant cells cultures //World Biotech. Rept- 1989.- Vol. 1. P. 123-128.

209. Dittrich berberine H., Kutchan T. Molecular cloning, expression, and induction of bridge enzyme, an enzyme essential to the formation of benzophenanthridine alcaloids in the response of plants to pathogenic attack //Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1991.- Vol. 88.- P. 9989-9973.

210. Gugler K., Funk Ch„ Brodelius P. Elisitor-induced tyrosine decarboxylase in berberine-synthesizing suspension cultures of Thalictrum rugosum //Eur. J. Biochem. -1988.-Vol. 170.-P.661-666.

211. Kobayshi Y., Fukui H., Tabata M. Effect of oxygen supply on berberine .production in cell suspension cultures and immobilized cells of Thallictum minus T, V //Plant Cell Reports.- 1989.- Vol. 8.- P.225-228.

212. Kobayshi Y., Fukui H., Tabata M. Effect of carbon dioxide and ethylene on berberine protection and cell browning in Thallictum minus, /Plant Cell Reports. 1989.- Vol. 8,- P.225-228. 276

213. Chasan R. Phytochemical Forecasting //Plant Cell.- 1994.-Vol.6-.NI.-P.3-9.

214. Cordell G. A.// Introduction to Alcaloids./ John Wiley.NewYork,-1981.

215. Калашникова Е.А. Морфо-физиологические особенности пробирочных растений каллусных тканей и суспензионной культуры картофеля, solani обусловленные действием экзометаболитов гриба Rhixoctonia //Биотехнология. 2003.- №3.- 33-41.

216. Могепо Р., Poulsen С Van der Heijden R., Verpoorte R. Effect of different secondary metabolic pathways in Catharanthus roseus cell suspension cultures //Enzyme microb. Technol. 1996. 18.-P. 99-107.

217. Lastra Humberto, Risco Gladus del, Cuela Armando.Meтoды получения катарантина и виндолина у листьев Catharanthus roseus Hetodo раса obtencion de catharantina у vindolina a partir del Catharanthus roseus.//Rev. Cub. Form.-1986. -20.-№2.-P.181-185. 288,Волков C.K., Гродницкая Е.И. Количественный анализ винбластина в Catharanthus roseus //Журнал физической химии.- 1991.- Т.65. №10.- 28602861.

218. Волков К. Методы анализа некоторых противоопухолевых алкалоидов катарантуса розового //Химико-фармацевтический журнал. 1996.- Т.ЗО.- №6. 36-43.

219. Ситхина Д.Е., Садовина К.И. Организация и планирование производства на лесохимических и гидролизных предприятиях. М.: Лесная пром-сть. 1984. 1984.-224с. 277