Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культивирование эфедры односемянной (Ephedra monosperma) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на ее основе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Культивирование эфедры односемянной (Ephedra monosperma) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на ее основе"

На правах рукописи

ПЛЫНСКАЯ Жанна Александровна

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭФЕДРЫ ОДНОСЕМЯННОЙ (.EPHEDRA MONOSPERMA) В УСЛОВИЯХ 1N VITRO И ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ЕЕ ОСНОВЕ

03.00.23- Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Г3499

Красноярск - 2009

003473499

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирском государственном технологическом университете» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии.

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Величко Надежда Александровна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Войнов Николай Александрович кандидат биологических наук, доцент Хижняк Сергей Витальевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет»

Защита диссертации состоится «££ » и ¿ом. Л- 2009 г. в /£'"часов на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 при ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет», по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82.

Отзыв (в двух экземплярах с заверенными подписями) просим направить ученому секретарю диссертационного совета по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 82.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет»

Автореферат разослан «¿6 » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук, доцент

Исаева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Нерациональное использование природных ресурсов, техногенное воздействие человека на окружающую среду отрицательно влияет на сохранность генофонда лекарственных растений.

Эфедра односемянная (Ephedra monosperma) - двудомный густоветвистый кустарник, источник ценных биологически активных вешеств, в том числе фармакологически значимых алкалоидов. Растение занесено в Красную книгу.

В народной медицине Ephedra monosperma используется при кашле и высокой температуре, бронхиальной астме, крапивнице, гипотонии, ринитах. Алкалоиды эфедры - антагонисты наркотиков, снотворных и употребляется при отравлении ими.

Культура клеток и тканей растений в условиях т vitro является не только одним из альтернативных источников получения необходимых биологически активных веществ, но и может служить нетрадиционным методом охраны и восстановления популяции Ephedra monosperma.

Цель и задачи исследования

Введение в культуру in vitro Ephedra monosperma, изучение синтеза алкалоидов в зависимости от гормонального состава среды и способов культивирования, влияющих на накопление биологически активных веществ в каллусной ткани. В связи с целью были поставлены следующие задачи:

- подобрать условия для введения в культуру in vitro и получить стабильно растущие каллусные ткани Ephedra monosperma;

- установить влияние гормонального состава среды и способа культивирования на рост клеточной биомассы и накопление алкалоидов в каллусной ткани Ephedra monosperma;

- провести сравнительную оценку состава биологически активных веществ интактного растения и каллусной ткани Ephedra monosperma;

- разработать технологическую схему получения алкалоидов из клеточной культуры Ephedra monosperma и провести оценку экономической эффективности данного производства.

Научная новизна работы

Впервые введена в культуру in vitro Ephedra monosperma. Проведена модификация питательной среды Murashige and Skoog по гормо-

нальному составу, обеспечивающая высокие темпы накопления продуктов вторичного метаболизма в каллусной ткани Ephedra monosperma. Предложена технологическая схема получения алкалоидов из клеточной культуры Ephedra monosperma.

Практическая значимость работы

Впервые предлагается использовать клеточную биомассу Ephedra monosperma в качестве источника алкалоидов.

На основе представленных научных и экспериментальных исследований разработана технологическая схема получения алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma. Получена опытная партия продукта и его качество подтверждено актом получения.

Апробация работы: основные результаты исследований докладывались и обсуждались на международных конференциях: «Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология» (Казахстан, 2008); «Пищевые технологии и биотехнология» (Казань, 2008); «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Москва, 2008). Во всероссийских конференциях: «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения» (Красноярск, 2007); «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул. 2009); «Химия и жизнь» (Новосибирск. 2009).

Структура и объём работы

Диссертационная работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 12 рисунков и 14 таблиц.

Работа состоит из введения, литературного обзора, методической экспериментальной и технологической частей, выводов, библиографического списка, состоящего из 113 наименований.

Публикации

Материалы диссертации изложены в 8 публикациях (из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК). Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителем.

Содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и задачи исследований, показана научная новизна и практическая ценность результатов работы.

Аналитический обзор

В аналитическом обзоре проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучению химического состава растений рода Ephedra. Рассмотрены методы культивирования хвойных растений в условиях in vitro и влияние различных групп фитогормонов на физические и морфогенетические программы растений. Большое развитие получил метод культуры клеток для синтеза продуктов вторичного метаболизма, производство которых является дорогостоящим, либо вообще невозможным. Одними из таких веществ являются алкалоиды эфедры, химический синтез которых трудно выполним и экономически невыгоден. Поэтому имеет большое практическое значение получение алкалоидов из клеточной ткани Ephedra monosperma.

Объекты и методы исследований

При выполнении работы объектами исследования служили интакт-ное растение Ephedra monosperma, собранное в окрестностях г. Красноярска, и инициированная из него каллусная ткань, выращенная на модифицированной питательной среде Murashige and Skoog.

В этом разделе дана характеристика объекта исследования. Приведены описания методик, используемых для изучения химического состава интактного растения и каллусной ткани Ephedra monosperma. Описаны условия введения в культуру эксплантов и получения каллусной культуры Ephedra monosperma.

Экспериментальная часть

Получение стерильных интактных растений и введение их в культуру in vitro

На начальном этапе исследования важно было подобрать условия для стерилизации эксплантов Ephedra monosperma. Необходимость введения в культуру in vitro стерильных растений эфедры односемянной была обусловлена трудностями, связанными с инициацией образования и развитие стерильной недифференцированной ткани (каллуса), и разработки условий её культивирования. Получение стерильных растений in vitro являлось одним из первых этапов исследования.

Наиболее часто применяемыми для стерилизации эксплантов являются растворы диацида, КМп04, гипохлорита натрия, пероксида водорода и этилового спирта (таблица 1).

Наиболее приемлемой оказалась двухступенчатая стерилизация:

- первая ступень: 0,1 %-й раствор КМп04, в течение 20 мин;

- вторая ступень: 0,1 % -й раствор диацида + Твин-80, (10:0,01) в течение 1 мин.

При этом достигался наиболее высокий процент живых, незара-женных эксплантов. При проведении дальнейших экспериментов использовали эти условия стерилизации.

Таблица 1- Эффективность различных схем стерилизации эксплантов Ephedra monosperma

s Состав стерилизующего раствора X Я s оГ 5 Отмывка Эффективность

1 со S Г) о с о Ы О стерилизации, %

1 0,1 % -й раствор диацида + Твин-80 (10:0,01) 1 Вода дистиллированная, 3><15 мин 45

2 0,1 %-й раствор КМп04 20 Вода дистиллированная, 3 х 15 мин 55

3 96 %-й этиловый спирт 0,5 Вода дистиллированная, 3х 15 мин 15

4 Двухступенчатая стерилизация: 1) 0,1 %-й раствор КМп04 2) 0,1 %-й раствор Диацид + Твин-80 (10:0,01) 1)20 2)1 Вода дистиллированная, Зх15 мин 92

5 70 %-й раствор этанола + 10 %-й раствор гипохлорита натрия (1:1) 30 Вода дистиллированная, 3x15 мин 11

6 10 %-й раствор пероксида водорода 5 Вода дистиллированная, 3x15 мин 10

7 10 %-й раствор пероксида водорода 15 Вода дистиллированная, 3 х 15 мин 5

8 70 %-й раствор этанола + Твин-80 (10:0,02) 4 Вода дистиллированная, Зх15 мин 28

Введение в культуру in vitro Ephedra monosperma Введение в культуру in vitro осуществлялось на безгормональные питательные среды со стандартным минеральным составом по Murashige and Skoog, Uata, Knop и Гамборга.

В результате проведенных экспериментов по введению в культуру растений Ephedra monosperma было установлено, что минеральный состав среды, при одних и тех же фото- и температурном режимах и одинаковом органическом фоне, влияет на процессы жизнеспособности, роста и регенерации введенных in vitro эксплантов (таблица 2).

Таблица 2 - Влияние минерального состава питательных сред на жизнеспособность и качественные характеристики растений в условиях in vitro

Название среды Количество жизнеспособных растений, % Качественная характеристика растений

Murashige and Skoog 97,50 состояние отличное, растения зеленого цвета, наблюдается рост

Uata 66,60 состояние хорошее, растения зеленого цвета, рост не наблюдается

Knop 29,30 состояние удовлетворительное, растения бледно-зеленого цвета, рост не наблюдается

Гамборга 88,00 состояние отличное, растения зеленого цвета, наблюдается рост

Минеральная низкосолевая среда по макро- и микроэлементам Кпор вызывала этиолированность - потерю хлоропластов растений Ephedra monosperma в течение 20-ти суток культивирования.

На низкосолевой среде Uata, в состав которой входят только макроэлементы, этиолированности тканей не отмечалось, однако рост и развитие экспланта происходило медленнее, чем на высокосолевых средах Гамборга и Murashige and Skoog (MS).

Среды Гамборга и MS отличаются между собой только по наличию солей, таких как KN03 и КН2Р04. В среде Гамборга данные компоненты отсутствуют. Отмечено, что наличие этих солей влияет на рост и приживаемость эксплантов.

Растения, культивируемые на среде с минеральным составом по MS, показали высокий процент жизнеспособности (97,50 %) и сравнительно низкое содержание алкалоидов (0,17 %).

В дальнейших исследованиях по подбору условий для роста и инициирования каллусной ткани из Ephedra monosperma была проведена модификация питательной среды Murashige and Skoog.

Влияние регуляторов роста на каплусогенез Ephedra monosperma

Считается, что наиболее важными компонентами питательной среды, определяющими каллусогенез, являются регуляторы роста. Модификации подвергается в первую очередь фитогормональная составляющая питательной среды, в связи с этим основной целью этого этапа исследования было изучение влияния экзогенных регуляторов роста на рост культуры клеток Ephedra monosperma.

В качестве эксплантов для получения изолированных культур были использованы верхушки молодых побегов Ephedra monosperma размером от 7 до 20 мм. Экспланты стерилизовали по схеме, приведенной выше, и помещали в пробирки базальным срезом на агаризованые питательные среды, вследствие чего образовывалась каллусная ткань.

Одним из способов регуляции процессов дифференциации и метаболизма в культурах клеток и тканей растений является подбор питательных сред с использованием различных концентраций гормонов, т.е. модификация сред.

Исследовали влияние модифицированных сред с различной концентрацией гормонов 2,4-Д, кинетина, а-НУК, 6-БАП на развитие и накопления каллусной ткани и алкалоидов.

Гормональный состав сред и характеристика тканей, полученных на данных средах, приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Характеристика каллусной ткани эфедры односемянной в зависимости от уровня гормонов

2 8. о Соотношение гормонов Качественная характеристика Прирост каллусной ткани в пассажах, г/л

Ч О ткани I II III IV

1 2 3 4 5 6 7

Е, НУК-0,1 БАП-0,1 2,4-Д-0,1 бурая, неоднородная; ярко-зеленая и бледно-желтая 1,5 0,7 - -

Ei НУК-0,2 Кинетин- 0,1 желто-коричневая, неоднородная; светло-зеленая, рыхлая, дифференцированная 2,3 1,9 2,6 -

Продолжение таблицы 3

1 2 3 4 5 6 7

Е3 НУК-2,5 БАП-0,15 водянистая, прозрачная, желтая 7,5 7,1 10,2 11,4

е4 БАП-0,1 буро-зеленая, плотная 2,5 1,3 - -

е5 ИУК-8 Кинетин-0,8 бурая, светлоохристая, местами структурированная 1,7 0,3 - -

Еб НУК-1 БАП-0.3 водянистая, бледно-зеленая и желтая, с глобулами 3,9 4.2 5,8 7,4

Ет НУК-0,3 БАП-0,5 2,4-Д-0,1 водянистая, прозрачная, с ярко-зелеными глобулами 2,3 5,4 6,7 5,9

е8 БАП-1 Кинетин-1 2,4-Д-0,4 бурая, красноватая с переходом в коричневую 3,2 2,9 5,4 6,2

В результате после первого пассажа наибольший прирост биомассы наблюдали на средах Е3 и Е6 - 7,5 и 3,9 г/л, соответственно. Длительность одного субкультивирования составляла 30 сут.

В втором пассаже наилучшими показателями прироста биомассы и стабильности обладали каллусы на тех же средах Е3 и Ее. Экспонирование на среде Е7 позволило выделить еще два быстрорастущих клона. Во всех остальных вариантах гормонального состава сред наблюдали постепенное угнетение и остановку роста.

В третьем пассаже наблюдали угнетение роста на среде Е3, а на среде Е8 в то же самое время, было отмечено развитие каллусной ткани со складчатой поверхностью, красноватого цвета, отличавшейся мелкозернистой однородной структурой, быстрым ростом и высокими показателями прироста биомассы.

В результате проведенных модификаций к четвертому пассажу были выделены четыре клона, проявляющие стабильные качественные и количественные характеристики (цвет, структура, скорость роста, прирост биомассы) на средах по гормональному составу: Е3, Е6, Е8 и Е7 (таблица 3)

Динамика роста каллусной ткани в зависимости от вида среды и продолжительности культивирования приведена на рисунке 1.

Из рисунка 1 видно, что на среде Е3 масса каллусной ткани вне зависимости от продолжительности культивирования превышает в два раза по сравнению с массой каллусной ткани получаемой на средах Е6 и Е8, и в три раза по сравнению со средой Е7.

На 18-е сутки масса каллусной ткани составляла более 9 г/л, тогда как на средах Еб и Es биомасса клеток не достигала и 5 г/л, а на среде Е7 - 4 г/л.

Полученные результаты по влиянию гормонального состава сред на накопление каллусной ткани Ephedra monosperma показали, что в целок динамика роста ткани имеет одинаковый характер.

Продолжительность культивирования, суг

0 Е8 SE3 ОЕ6 □ Е7

Рисунок i - Динамика роста каллусной ткани Ephedra monosperma в зависимости от вида среды и продолжительности культивирования

На рисунке 2 приведено содержание алкалоидов в каллусной ткани Ephedra monosperma на 30-е сутки культивирования.

Из рисунка 2 видно, что каплусная ткань отличалась по содержанию алкалоидов. На среде Е3 содержание алкалоидов превышает в 1,5 раза по сравнению со средой Е8, в 2,5 раза со средой Еб и в 4,3 раза со средой Е7. Разница с контролем (стандартной питательной средой MS) по содержанию алкалоидов в каллусной ткани полученной на среде Е3 превосходит в 13 раз.

Из результатов проведенных экспериментов следует, что включение в состав питательной среды регуляторов роста модифицированной питательной среды Е3 (НУК-2,5 и БАП-0,15) позволяет не только накапливать биомассу клеток, но и увеличивать содержание алкшюидов в ней.

Дальнейшие исследования проводились с каллусной тканью, полученной на среде Ез.

2,5

1,5

|0,5

и

гс

Е8 Е6 ЕЗ Е7 контроль

Код среды

Рисунок 2 - Содержание алкалоидов в каллусной ткани Ephedra monosperma

Способы получения клеточной культуры Ephedra monosperma Известно, что большое влияние на накопление продуктов вторичного метаболизма в условиях \п vilro оказывает способ культивирования растительной ткани. Для выяснения влияния способов культивирования на процессы роста клеточной ткани Ephedra monosperma была исследована динамика роста при поверхностном культивировании на агаре и инертном носителе с периодическим омыванием ткани питательной средой (Е3).

Выбор пенополиуретана в качестве инертного носителя для выращивания тканей Ephedra monosperma был обусловлен существенными преимуществами этого материала. Это дешевизна, удобство манипулирования, возможность многократного использования носителя. Пористость этого материала обусловливает хороший доступ веществ питательной среды к клеткам.

На рисунке 3 приведена динамика роста каллусной ткани Ephedra monosperma при культивировании на пенополиуретановых подложках и агаре.

По структуре каллусная ткань на пенополиуретане не отличалась от каллусной ткани получаемой на агаре. На пенополиуретане наблюдался бо-

лее интенсивный рост, чем на агаре, и масса кагшусной ткани на пенополиуретане превышала в два раза по сравнению с агаром, уже начиная на 12-е сутки культивирования.

На 30-е сутки масса каллусной ткани полученной на пенополиуретане составила более ¡ 1 г/л, тогда как на агаре масса каллуса за этот же период культивирования достигала более 7 г/л.

Пенополиуретановые пластины можно рассматривать как химически нейтральную поддерживающую основу, позволяющую отказаться от использования агара, что удешевляет процесс.

На рисунке 4 представлена динамика накопления атеалоидов в культуре клеток Ephedra monosperma в зависимости от способа культивирования.

Установлено, что при выращивании каллусной ткани на ненопо-лиуретановых подложках накопление алкалоидов происходило раньше, чем при культивировании на агаре. „На 30-е сутки содержание алкалоидов в каллусной ткани культивированной на пенополиуретане составляло 1,2 раза больше, чем на агаре.

1 на агаре ¡S на пенополиуретане

Рисунок 3 - Динамика роста каллусной ткани Ephedra monosperma в зависимости от способа культивирования.

9 12 15 18 21 24 27 30 33

Продолжительность культивирования, сут

2,7 2,4 -

со

§ 1 S 1.1

0

1 1,5 -§

¥ 1-2 H

I 0.9

Q.

a>

§ 0,6 о

0,3

..□в. aJ i

3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Продолжительность культивирования, суг

□ на пенополиуретане ■ на агаре

Рисунок 4 - Динамика накопления алкалоидов в культуре клеток Ephedra monosperma в зависимости от способа культивирования

Для применения в фармацевтической промышленности с практической точки зрения представляет интерес каллусная ткань, культивируемая на пенополиуретане, с использованием модифицированной питательной среды Е3.

Содержание биологически активных веществ в интактном растении и каллусной ткани Ephedra monosperma, приведено в таблице 4.

Таблица 4 - Содержание биологически активных веществ в Ephedra monosperma

Содержание

Наименование компонента Каллусная ткань куль- Молодые

тивированная побеги

на среде Е3

Алкалоиды, % а.с.м 2,20±0.03 1.31 ±0.08

Флавоноиды. % а.с.м 0.Ю±0.04 0.09±0,04

Сапонины, % а.с.м 4.41±0,05 5,32±0,04

Витамин С, мг % 15,65±0,02 13,65±0,07

Витамин Р. мг % 1.61 ±0,03 4.80±0,06

Витамин В, мг % 2,89±0,04 2,57±0,03

Хлорофилл А мг % 0,13±0,03 0,25±0,04

Хлорофилл В мг % 0,21±0.05 0.47±0,06

Из результатов, приведенных в таблице 4, следует что, каллусная ткань по сравнению с молодыми побегами интактного растения содержит большее количество алкалоидов, практически в два раза превышающее таковое в интактном растении, а также витамина Си В) (в 1,2 раза).

Следующий этап работы был посвящен выявлению закономерностей влияния основных технологических параметров (температура, продолжительность, гидромодуль, концентрация экстрагента) на выход алкалоидов.

На основании литературных данных и серии предварительных экспериментов в качестве основных факторов были выбраны: температура, гидромодуль и концентрация экстрагента, которые были застабилизиро-ванны на следующих уровнях: температура (25 °С); гидромодуль (1:1); концентрация экстрагента (2 %-я уксусная кислота).

В качестве переменного фактора условий экстрагирования нами была выбрана продолжительность экстрагирования алкалоидов (от 1 до 3,5 ч). Основной уровень и граница варьирования выбраны на основании предварительно проведенных исследований.

В качестве выходного параметра был выбран выход суммарного количества алкалоидов У, мг %. Результаты эксперимента приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Зависимость выхода алкалоидов (У) от продолжительности экстрагирования (I)

Вариант 1 У

0 0

1 1 1,01

2 1,5 2.20

3 2 1,90

4 2,5 1,81

5 3 1,71

6 3,5 1,69

На рисунке 5 представлена полученная зависимость между продолжительностью экстрагирования и выходом алкалоидов. Данная зависимость описывается уравнением следующего вида:

у= 3,51 (е ~°'168' - е "а998')

2,5 j

в4 u

S 2-

со

o 4

я ¡

¿s §

I 0,5 - /

o /

U /

0 Y--i-1---!-1-1-!

0 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Время извлечения алкалоидов, ч

Рисунок 5 - Влияние продолжительности экстракции на выход алкалоидов в клеточной культуре Ephedra monosperma

Установлено, что выход алкалоидов максимален (2,20 %) при продолжительности экстрагирования в течение 1,5 ч.

Результаты проведенных экспериментов положены в основу технологической схемы получения алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma (рисунок 6).

Процесс получения алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma на инертном носителе состоит из ряда последовательных стадий. На первой стадии осуществляется введение растений Ephedra monosperma в культуру in vitro и получение каллусной ткани на инертном носителе в растильной камере (1). Выращивание ткани производится в биореакторе (5), в течение 30 суток при 28-32 °С. Далее полученная биомасса из растильного биореактора (5) подается в экстрактор (8), в качестве экстрагента использована 2 %-я уксусная кислота в соотношении 1:1 (по объему). Экстрагирование осуществляется при умеренном перемешивании в течение 1,5 ч и температуре 25 °С. Полученный экстракт фильтруется для отделения послеэкстракционного остатка каллусной ткани (шрота) и направляется в испаритель (11) для упаривания экстракта и отгонки уксусной кислоты. Уксусная кислота через конденсатор направляется в сбор- ник (14), а упаренный экстракт направляется в сборник (12), в который подается 15 %-я щавелевая кислота и 2 %-я уксусная кислота в соотношении (1:1). Далее экстракт направляется в ис-

паритель (19), где упаривается до 1/5 объема при температуре 55 °С. Затем упаренный экстракт направляют на ионообменную колонну (21) на очистку алкалоидов от полисахаридов, белков, фенольных соединений. Колонну промывают хлороформом. На выходе из колонны получают очищенную фракцию, содержащую алкалоиды. Хлороформный экстракт алкалоидов следует на стадию упаривания в испаритель (23) до образования сухого остатка. После чего в вакуум-испаритель (23) подают горячую воду для перехода оксалатов алкалоидов в алкалоиды. Процесс перекристаллизации осуществляется в кристаллизаторе (25). Промытые кристаллы сушат при комнатной температуре в течение от 3 до 5 ч. Таким образом, получают алкалоиды с содержанием основного вещества не менее 85 %.

Проведенные технико-экономические расчеты, показали эффективность получения алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma (таблица 6).

Таблица 6 - Основные технико-экономические показатели производства

Наименование показателя Величина

1 Объем производства, т 1

2 Объем реализации, тыс. руб. 6676,00

3 Численность рабочих:

-основных 3

-вспомогательных 2

-руководителей и специалистов 1

4 Фонд заработной платы, руб:

-основных 142433,10

-вспомогательных 21251,00

-руководителей и специалистов 82368,00

5 Полная себестоимость годового выпуска, тыс. руб. 1381,42

6 Прибыль от реализации, тыс. руб. 5294,58

7 Чистая прибыль, тыс. руб. 3490,82

8 Рентабельность производства, % 39,57

9 Срок окупаемости, лет 2,5

Как видно из таблицы 6, производство алкалоидов является рентабельным. Чистая прибыль данного производства составляет 3490,82 тыс.руб. Данное предприятие окупит вложенные в него затраты в течение - 2,5 лет.

Основные результаты работы

1 Впервые подобраны условия для введения в культуру in vitro Ephedra monosperma и получена высокопродуктивная каллусная культура Ephedra monosperma из дикорастущего растения-донора, характеризующаяся стабильностью роста. Установлено, что модифицированная питательная среда с минеральной основой по Murashige and Skoog наилучшим образом обеспечивает процессы жизнедеятельности эксплантов Ephedra monosperma и накопление биологически активных веществ в каллусной ткани.

2 Установлено, что гормональный состав среды влияет на накопление клеточной биомассы Ephedra monosperma к количество алкалоидов в ней.

3 Определено, что каллусная ткань по сравнению с молодыми побегами интактного растения содержит большее количество алкалоидов, практически в 2 раза превышающее таковое в интактном растении, а также витамина Си В! (в 1,2 раза).

4 Установлено, что наибольшее количество алкалоидов (2,20 %) содержится в каллусной ткани, выращенной на пенополиуретановых подложках.

5 Предложена технологическая схема получения алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma и проведена оценка экономической эффективности получения алкалоидов из клеточной культуры Ephedra monosperma.

Предприятие является рентабельным, чистая прибыль составляет 3490,82 тыс.руб. Срок окупаемости - 2,5 года.

Основные материалы диссертации изложены в следующих работах:

1 Плынская, Ж.А. Культивирование хвойных в условиях in vitro/ Ж.А Плынская, Н.А. Величко, Е.Н. Аёшина // Хвойные бореапьной зоны,- 2008.-№ 1-2.-С. 68-70.

2 Плынская, Ж.А. Влияние регуляторов роста на процессы синтеза вторичных веществ в культуре in vitro Ephedra monosperma/ Ж.А. Плынская, Н.А. Величко // Химия растительного сырья. - 2008. -№ 4. - С. 125127.

3 Плынская, Ж.А. Кормовые добавки на основе послеэкстракцион-ного остатка Ephedra monosperma / Ж.А. Плынская, Н.А. Величко // Биотехнология, нанотехнология и физико-химическая биология: сб. материалов междунар. конф. - Казахстан, 2008. - С. 110-111.

4 Плынская, Ж.А. Культура клеток Ephedra monosperma как источник алкалоидов / Ж.А. Плынская, Н.А. Величко // Пищевые техноло-

гии и биотехнология: сб. материалов IX междунар. конф. молодых ученых. - Казань, 2008. - С. 173.

5 Плынская, Ж.А. Повышение содержания алкалоидов в клеточной культуре эфедры односемянной (Ephedra monosperma) /Ж.А. Плынская // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: сб. материалов IX междунар. конф. - М„ - 2008. - С. 304-305.

6 Плынская, Ж.А. Химический состав эфедры односемянной (Ephedra monosperma)/ Ж.А. Плынская // Лесной и химический комплексы - проблемы и решения: сб. материалов регион, науч.-практич. конф. -Красноярск, 2007.-С. 129-130.

7 Плынская, Ж.А. Экстрактивные вещества Ephedra monosperma/ Ж.А. Плынская, Н.А. Величко // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: сб. материалов IV Всерос. конф. -Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2009. - Кн.2. - С. 43-44.

8 Плынская Ж.А. Элементный состав интактного растения и кал-лусной ткани Ephedra monosperma/ Ж.А. Плынская // Химия и жизнь: сб. материалов VIII регион, науч.-практич. конф. - Новосибирск, 2009. - С. 108-109.

Сдано в производство 22.05.2009. Формат 60x84 1/16. Усл. печ. л. 1. Изд. № 5/5. Заказ № 492. Тираж 80 экз.

Редакционно-издательский центр СибГТУ 660049. г. Красноярск, пр. Мира, 82

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Плынская, Жанна Александровна

Введение.

1 Аналитический обзор.

1.1 Характеристика семейств эфедровые {Ephedraceae).

1.2 Культура клеток и тканей растений - источник биологически активных соединений.

1.3 Каллусная ткань в изолированной культуре.

1.4 Вторичный метаболизм в растениях in vivo и in vitro.

1.4.1 Физико-химические факторы среды.

1.4.2 Способы культивирования и их влияние на вторичный синтез в культуре ткани.

2 Методическая часть.

2.1 Объект исследования.

2.2 Исследование химического состава интактного растения Ephedra monosperma.

2.3 Определение влажности.

2.4 Определение суммарного содержания алкалоидов.

2.5 Количественное определение L-эфедрина

2.6 Определение флавоноидов.

2.7 Определение сапонинов.

2.8 Количественное определение витаминов.

2.9 Определение содержания хлорофилла АиБ.

2.10 Разделение липидов на силикагеле.

2.11 Спектрометрическое определение содержания белка.

2.12 Определение минеральных компонентов.

2.13 Определение легко- и трудногидролизуемых полисахаридов.

2.14 Определение содержания лигнина.

2.15 Определение экстрактивных веществ.

2.16 Определение L-эфедрина в интактном растении и клеточной биомассе методом ГХ/МС.

2.17 Определение L-эфедрина в интактном растении и клеточной биомассе методом ИК спектров.

2.18 Определение содержания жирных кислот.

2.19 Получение каллусных тканей Ephedra monosperma.

2.20 Статистическая обработка результатов эксперимента.

3 Экспериментальная часть.

3.1 Химический состав Ephedra monosperma.

3.2 Культивирование Ephedra monosperma в условиях in vitro.

3.2.1 Получение интактных стерильных растений и введение в культуру in vitro.

3.2.2 Влияние регуляторов роста на каллусогенез Ephedra monosperma.

3.2.3 Влияние способа культивирования на рост каллусной ткани Ephedra monosperma.

4 Получение алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma.

Выводы.

Список используемых источников.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Культивирование эфедры односемянной (Ephedra monosperma) в условиях in vitro и получение биологически активных веществ на ее основе"

В последнее время проблемы охраны окружающей среды и её рационального использования стали предметом серьёзных научных исследований и неотъемлемой стороной организации современного производства.

Традиционно биологически активные вещества растений получают на основе использования природного сырья. Зачастую используют биомассу дикорастущих лекарственных растений, часть получают с полей специализированных хозяйств, где растения культивируют, повышают урожайность различными мероприятиями и собирают механическим способом. Широкое использование растений,для получения биологически активных веществ, привело к стремительному сокращению их в природе. Некоторые из них относятся к редким и исчезающим видам, многие растения долго восстанавливают свои площади произрастания.

Поэтому для получения > и сохранения растений - источника биологически активных веществ, кроме традиционных методов, таких как интродукция, организация заповедников, заказников, создание плантаций, существуют иные методы. Одним из них является культура клеток и тканей высших растений in vitro.

Препараты из растений по сравнению с синтетическими лекарствами имеют ряд преимуществ. Будучи сложными, по составу, они содержат много ингредиентов, которые придают им ценные свойства и обеспечивают многостороннее действие на организм, более сильное, чем действие каждого в отдельности. Культура клеток и тканей высших растений является нетрадиционным методом охраны лекарственных растений, сохранения ценного генофонда древесных и травянистых растительных форм, методом получения, оздоровления, возобновления и размножения растений за счёт круглогодичного продуцирования регенерантов и массового выхода посадочного материала путём клонального микроразмножения [1].

В настоящее время для создания рентабельного производства на основе клеточных культур цена продукта должна быть достаточно высокой. В перспективе, при увеличении продуктивности клеточных штаммов и создании технологий, позволяющих увеличить количество продукта и уменьшить время его наработки, клетки растений могут выступать как конкуренты микроорганизмов в синтезе незаменимых аминокислот, некоторых ценных растительных белков, витаминов и других веществ [2,15].

В связи с этим культивирование тканей и клеток высших растений in vitro (в частности Ephedra monosperma) с целью их промышленного использования для получения соединений специализированного обмена и сохранение генофонда определяет актуальность данного исследования.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Плынская, Жанна Александровна

Выводы

1 Впервые подобраны условия для введения в культуру in vitro Ephedra monosperma и получена высокопродуктивная каллусная культура Ephedra monosperma из дикорастущего растения-донора, характеризующаяся стабильностью роста. Установлено, что модифицированная питательная среда с минеральной основой по Murashige and Skoog наилучшим образом обеспечивает процессы жизнедеятельности эксплантов Ephedra monosperma и накопление биологически активных веществ в каллусной ткани.

2 Установлено, что гормональный состав среды влияет на накопление клеточной биомассы Ephedra monosperma и количество алкалоидов в ней.

3 Определено, что каллусная ткань по сравнению с молодыми побегами интактного растения содержит большее количество алкалоидов, практически в 2 раза превышающее таковое в интактном растении, а также витамина Си В] (в 1,2 раза).

4 Установлено, что наибольшее количество алкалоидов (2,20 %) содержится в каллусной ткани, выращенной на пенополиуретановых подложках.

5 Предложена технологическая схема получения алкалоидов из каллусной ткани Ephedra monosperma и проведена оценка экономической эффективности получения алкалоидов из клеточной культуры Ephedra monosperma.

Предприятие является рентабельным, чистая прибыль составляет 3490,82 тыс.руб. Срок окупаемости - 2,5 года.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Плынская, Жанна Александровна, Красноярск

1. Яковлева, Г.П. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия/ Г. П. Яковлева, К.Ф. Блиновой. СПб.: СпецЛит, 2004.- 289 с.

2. Новиков. В. С. Популярный атлас-определитель. Дикорастущие растения / B.C. Новиков, И. А. Губанов. М.: Дрофа, 2004. - 518 с.

3. Гиляров, М.С. Биологический энциклопедический словарь / М.С. Гиляров, А.А. Баев, Г.А. Заварзин. М.: Наука, 1989. - 465 с.

4. Воробьев, Г. И. Лесная энциклопедия / Г. И. Воробьев, Н. А. Ану-чин, В. Г. Атрохин М.: Наука, 1986. - 350с.

5. Орлов, Б. Н. Ядовитые животные и растения СССР: Справочное пособие для студентов вузов по спец. "Биология" / Б.Н. Орлов, Д.Б. Гелашвили, А.К. Ибрагимов. М.: Высш. шк., 1990.

6. Минаева, В. Г. Лекарственные растения Сибири / В.Г. Минаева. -Новосибирск: Наука , 1970. 270 с.

7. Орехов, А. П. Химия алкалоидов / А.П. Орехов. М.: Химия , 1975.- 672 с.

8. Журинов, М. Ж. Химия эфедриновых алкалоидов / М.Ж. Журинов.- Алма-Ата: Наука, 1990. 140 с.

9. Рубцов, М. В. Синтетические фармацевтические препараты / М. В. Рубцов, А. Г. Байчиков. М.: Медицина , 1971. - 320 с.

10. Абдувахабов, А. А. Алкалоиды и их производные как инструмент для изучения холиэнергетической системы / А. А Абдувахабов. — М.: Ме-децина, 1976.- 209 с.

11. Грандберг, И. И. Органическая химия / И. И. Грандберг. -М.: Высш. Шк., 1987.- 480 с.

12. Бузук, Г. Б. Метаболизм алкалоидов: регуляция на молекулярном уровне, пространственная организация / Г. Б. Бузук, М. Я. Ловкова // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. - Т.31. С. 467-479

13. Бутенко, Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1964. - 272 с.

14. Бутенко, Р. Г. Культура тканей и клеток растений / Р. Г. Бутенко. М.: Знание, 1971.-46 с.

15. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных клеток и тканей в решении задач физиологии растений / Р.Г. Бутенко // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985.- С. 270.

16. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения / Р.Г. Бутенко // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. - С. 3 -28.

17. Болвелл, Г. П. Биотехнология растений: культура клеток / Г. П. Болвелл, К. Р. Вуд., Р. А. Гонзалес.- М.: Агропромиздат, 1989. 280 с.

18. Бродепиус, П. Иммобилизованные растительные клетки: методы получения и способность к биосинтезу / П. Броделиус // Иммобилизованные клетки и ферменты. М.: Мир, 1988.- С. 156-176.

19. Воллосович, А. Г. Культура ткани раувольфии змеиной как продуцент алкалоидов / А. Г. Воллосович, Р. Г. Бутенко // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1981.- С.235-257.

20. Высоцкая, Е. Ф. К вопросу о природе фактора кондиционирования при изолированной культуре растительных клеток / Е. Ф. Высоцкая, К. 3. Гамбург // Физиология растений. -1975. Т.22. - №.1. - С.63-69.

21. Глеба, Ю. Ю. Клеточная инженерия растений / Ю. Ю.Глеба, К.М.Сытник. Киев: Наукова думка, 1984.- 160с.

22. Глеба, Ю.Ю. Биотехнология растений / Ю. Ю. Глеба // Тез.докл. VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда». —М.: Наука, 1997. С. 6-7.

23. Бутенко, Р. Г. Экспериментальный морфогенез в культуре клеток растений. / Р. Г. Бутенко. М.: Наука, 1975.-87 с.

24. Бич, Г. Биотехнология. Принципы и применение / Г. Бич, Д. Бесг, К Брай-ерли. Пер. с англ. Под ред. И. Хиггинса- М.: Мир, 1988. 480 с.

25. Воллосович, А. Г. Культура ткани раувольфии змеиной как продуцент алкалоидов / А. Г. Воллосович, Р. Г. Бутенко // Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М.: Наука, 1981. - С. 235-257.у

26. Высоцкая, Е.Ф. К вопросу о природе фактора кондиционирования при изолированной культуре растительных клеток / Е.Ф. Высоцкая, К. З.Гамбург // Физиология растений. 1975. - Т.22. - С. 63-69.

27. Константинова, Н. А. Исследование ростовых и биосинтетических способностей длительнопассируемой суспензионной культуры женьшеня / Н. А. Константинова, Г. В. Зайцева, В. С. Фаустов, //Биотехнология М.: Наука 1989. -№5. -С. 571-575.

28. Кунах, В. А. Геномная изменчивость соматических клеток растений, каллу сообразован ие in vitro / В.А. Кунах // Биоцолимеры и клетка М.: Наука 1997. -Т. 13.- №5. С.362-371

29. Лукнер, М. Вторичный метаболизм у микроорганизмов, растений и животных. / М. Лукнер. М.: Мир. 1995. - 548 с.

30. Масек, Т. Иммобилизованные растительные клетки некоторые аспекты их непрерывного культивирования / Т. Масек, Т. Ванек, И.Бениш // Труды 16-й конф». - М.: Наука, 1984. - № 2.- С. 313-316.

31. Машковский, М. Д. Лекарственные средства. / М. Д. Машковский. -М.: Медицина, 1986.-Т.2.-576 с.

32. Ментел, С.Т.Факгоры культивирования, влияющие на накопление вторичных метаболитов в культуре клеток и тканей растений / С. Т. Ментел,

33. Т. Смит // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М.: Агропромиздат, 1987.-С. 154-198.

34. Муромцев, Г. С. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. / Г. С. Муромцев, Д. И.Чекаников, О. Н. Кулаева. М.: Агропромиздат, 1987. - С. 316-322.

35. Мясоедов, Н. А. Выращивание биомассы ткани женьшеня с применением поддерживающего субстрата /НА. Мясоедов, Р. Г. Бутенко, JI. Н Слешш // Растительные ресурсы. 1986. - Т.З.- С. 314-344.

36. Моррис, П. Образование продуктов вторичного метаболизма в суспензионных культурах клеток. / П. Моррис М.: Агропрмиздат, 1987.-С. 154-203.

37. Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / А. М. Носов // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. - С. 5-20.

38. Пейве, Я.В. Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине. / Я.В. Пейве. М.: Наука, 1974.-438 с.

39. Носов, А. М.Физиологическая регуляция синтеза стероидов культурой клеток диоскореи дельтовидной / А. М. Носов, В. Н. Пауков, Р. Г. Бутенко // Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1986. - С. 76 -79.

40. Носов, А.М. Функции вторичных метаболитов растений in vivo и in vitro / А. М. Носов // Физиология растений. 1994. - Т.41. -№ 6. - С. 876 - 878.

41. Попов, Ю. Г. Вопросы производства лекарственных средств растительного происхождения / Ю. Г. Попов, М. А. Саркисова // ВНИИ систем, упр., экон. исслед. и НТИ. М.: Наука, 1989.- С. 1-27.

42. Самыгин, Г. А. Сравнение разных методов для оценки жизнеспособности клеток суспензионных и каллусных кулыур / Г.А.Самыгин, Л.А.Волкова // Физиология растений. 1983. -Т.32. - № 4.- С. 813-815.

43. Сассон, А. Биотехнология и повышение продуктивности растений / А. Сассон v //Биотехнология свершения и надежды. -М.: Мир, 1987. - С. 150-164.

44. Соколов, С. Л. Справочник по лекарственным растениям/ С. Л. Соколов, И. П. Замотаев. М.: Наука, 1990. -189 с.

45. Рощина, В. Д. Выделительная функция высших растений. / В. Д. Рощина,

46. B. В. Рощина.-М.: Наука. 1989. 214с.

47. Albersheim, P. Oligosaccharins: naturally occurring carbohydrates with biological regionaly function / P. Albersheim, A. G. Darvill, M. Neil // Structure and functeon of plant genomes. N.Y.: Plenum press, 1983. P.293-312.

48. Albersheim, P. Oligosaccharins that regulate growth, developments and defense responses in plant // Glycobiology. -1992. Vol 2.- № 3 P.181-198.

49. Archambault, J. Production of indol alkaloids by surface immobilized

50. C.roseus cells / J. Archambault, B. Volesky, W. Kurtz // Biochemical engineering research unit. Monreal. 1990. -Vol.35. - P.660-667.

51. Amann, M. (S)-tethrahydroprotoberberine oxidase the final enzyme in pro-toberberine biosynthesis / M. Amann, N. Nakagura, M. Zenk // Tetrahedron Lett. -1984. Vol.25. - № 9. - P. 953-954.

52. Bailey, С. M. Catharanthus roseus L. Don. A model for the biosyntheth-sis of indol alkaloids by cell suspensions / С. M. Bailey, H. Nicholson, A. Stafford // Appl.YBiochem. Biotechnol.- 1986. -Vol 12. -№ 3 P. 215-227.

53. Beecher, C. The incorporation of berberine into jattorthizine / C. Beecher W. J. Kelleher // Tetrahedron Lett. -1983. -Vol.24. № 5. P. 469- 472.

54. Beck, C. Cell culture bioreactors/ C. Beck, P. Stifl // Chem. Eng, -1987.-T.21. P. 121-129.

55. Bender, L. On the photosynthetic system and assimilate methabolism of Daucus and Arachis cell cultures / L. Bender, B. Pauler, К. H. Neumann // Primary and secondary methabolism of plant cell cultures. Bets.: Springer, 1985. - P. 2542.

56. Biswas, G. Callus formation and plant regeneration from protoplasts derived from suspension culture of rise / G. Biswas, F. Zapata // Plant breed. 1990. - T.2. -P. 95-100.

57. Breuling, M. Cultivation of cell cultures of Berberis wilsonae in 20-1 airlift bioreactors / M. Breuling, A. W. Alfermann, E. Reinhard // Plant Cell Reports. 1985. - Vol.4. - P. 220-223.

58. Brodelius, P. Entrapment of plant cells in different matrices / P. Brodelius, K. Nilson // FEBS Left. 1985. - T.2.- P.312-316.

59. Brodelius, P. Increasing secondary metabolic production in plant cell culture by redirecting transport / P. Brodelius, H. Pedersen // Trends in Biotechnology. -1993.-VoL.ll. №1.- P. 30-36.

60. Cabral, Q. M. Comparison of immobilisation metods for plant cells and protoplasts / Q. M. Cabral, P. Fevereiro // Current Sciene. 1985, T.7. - P. 335336.

61. Cadra, M. S.Plant cells, tissue and organ culture: potential sourses for plant secondary metabolites / M. S. Cadra, M. P. Heble // Proc. DAE Symp. Never Appr. Biol. Appl.- 1985.-P. 183-191.

62. Chasan, R. Phytochemical Forecasting / R. Chasan // Plant Cell. -1994.- Vol.6 -.№1. P. 3-9.

63. Cordell, G. A. Introduction to Alcaloids. / G. A. Corde. NewYork. 1981. -P. 118.

64. Cosgrove, C. Biophlsical control of plant cell growth / C. Cosgrove // Ann. Rev. Plant Phisiol. -1985 .-№37.-P. 377- 405.

65. Dalton, C.C. Produrt formation and plant cell specialization: A case of pho-tosynthetic development in plant cell cultures / С. C. Dalton, E. Peel // ProgrJndust. Microbiol. 1983. -Vol.17. - P. 109-166.

66. Drapeau, D. Ajmalicln, serpentin and catharanthine accumulation in Catharanthus roseus bioreactor cultures / D. Drapeau, W. Harvey // Planta med.-1987. №4. -P. 154-201.

67. Fuller, K.V. Chemicals from plant cell cultures some biochemical and physiological pointers / K.V. Fuller // Chemistry and industry. - Oxford. 1984. Vol.23.-P.825-833.

68. Fujiwara, H. Expression of (S)-scoulerine- 9-O-methyltransferase in Coptis japonica plants / H. Fujiwara, N. Takeshita, Y. Terano // Phytochem. -1993.-Vol.34.-P. 949-954.

69. Furuya, T. Isolation of berberine from callus tissue of Coptis japonica / T. Furuya, K. Syono, A. Ikuta//Phitochem.-1972.-Vol.-P.175.

70. Gray, D. Rapid grouwth in plant cell culture // Trend blotechnol. 1988.-T.10. -P.233-234.

71. Gugler, K. Elisitor-induced tyrosine decarboxylase in berberine-synthesizing suspension cultures of Thalictrum rugosum / K. Gugler, C. Funk, P. Brodelius // Eur. J. Biochem. -1988. -Vol.170. P.661-666.

72. Gulik, W. M. Growth of a Catharanthus roseus cell suspension culture in a modified chemostat under glucoselimiting conditions / W. M. Gulik, J. J. Meijer, H. J. Hoopen // Appl. Microbiol, and biotechnol. 1989. - Vol.30. -P. 270-275.

73. Goodchild, J. Influence of ammonium and extra cellular pH on the amino and organic acid contents of suspension culture cell of Aser pseudoplatanus / J. Goodchild, C. Givan //Phisiol. Plant. 1990. - №1. -P.29-37.

74. Нага, M. Induction of a specific methyltransferase activity regulating by cytokinine in Thalictrum minus cell cultures/ M. Hara, S. Tanaka, M. Tabata // Phytochem. -1994. -Vol.36.-№.2. P.327-332.

75. Hara, Y. Enhancement of berberine production in suspension cultures of Coptis japonica by gibberellic acid treatment / Y. Hara, T. Yoshioko, T. Morimoto // PlantPhysiol. 1988. - Vol.133. - P. 12-15.

76. Kelleher, W.J. Enzymatic formation of protoberberine alkaloids/ W. J. Kelleher, A. Rother, E. Wellman // Planta Med. 1980. - Vol.40. -P. 127-136.

77. Ketel, D. Inorganic nutriention of callus tissues of tagetes species: the effects on morphogenesis and accumulation of thiophenes and non-polar secondary methabolithes / D. Ketel // J. Plant physiol. 1986. - Vol.125. - № 1-2. - P.69-77.

78. Matsubara, К. High density culture of Coptis japonica cells increases berberine production/ K. Matsubara, S. Kitani, T. Yoshioka// J. Chem. Tech. Bio-technol. -1989. -Vol.46.- P.61-68.

79. Misawa, M. Production of useful metabolites by plant tissue culture/ M. Misawa//BiomassConvers. Technol.PrinsiplesandPract- 1887. P.193-199.

80. Morimoto, T. Berberine production by cultured Coptis japonica cells in a one-stage culture usingmedium with a high cooper concentration / T. Morimoto, Y. Нага, Y. Kato // Agric. Biol. Chem. 1988. -Vol.2 - №7. - P. 1830-1836.

81. Morris, P. Regulation of product synthesis in cell culture of Catharanthus roseus.Ci'mparison of production media / P. Morris // Planta med. 1986. - №2. -P.121-126

82. Muller, M. The norcoclaurine pathway in operate in berberine biosynthesis in Coptis japonica / M. J. Muller, M. H. Zenk // Planta Med. 1992. -Vol.58. -№6.-P. 524-527.

83. Nakagawa, K. Release and crystallization of berberine liquid medium of Thalictrum minus cell suspension cultures / K. Nakagawa, A. Konagai, H. Fukui // Plant Cell Reports. -1984. Vol.3. - P. 254-257.

84. Гутман, Г.С. Новый способ получения культуры тканей высших растений / Г. С. Гутман, Г. А. Ширяева // Растительные ресурсы. -1980.- № 4.-С. 601-606.

85. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. / Ф.Л.Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е.Полшцук Киев: Наукова думка, 1980. -487 с.

86. Бутенко, Р.Г. Выращивание клеток растений в суспензионной культуре / Р.Г. Бутенко // Известия АН СССР, Серия биологическая. 1977.- №5-С. 697-710.

87. Диксон, Р. А. Изолирование и поддержание каллусных и суспензионных культур клеток / Р. А. Диксон // Биотехнология растений: культура клеток М.: Аг-ропромиздат, 1989,-С. 8-31.

88. Бутенко, Р. Г. Рост и дифференциация в культуре клеток растений / Р. Г. Бутенко // Рост растений и природные регуляторы. — М.: Наука, 1977.-С. 697-710.

89. Момот, Т. С. Технология изолированных культур для микроразмножения лесных древесных растений / Т. С. Момот // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда : тез. докл. 7-ой междунар. конф. М.: Наущц 1997. - С. 441-442

90. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. / Р. Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

91. Агафонов, Н. В. Декоративное садоводство / Н. В. Агафонов. -М.: Колос, 2000.-320 с.

92. Рязанова, Т. В. Химия древесины / Т. В. Рязанова, Н. А. Чупро-ва, Е. В. Исаева. Красноярск: КГТА, 1996. - 358 с.

93. Гринкевич, Л. Н. Химический анализ лекарственных растений / Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич. М.: Высш. шк., 1983. - 175 с.

94. Лазуревский Г.В. Практические работы по химии природных соединений. / Г.В. Лазуревский, И.В. Тереньтьева, А.А. Шамшурин. М.: Высш. Шк., 1966.-335 с.

95. Адихотдаев, К. Б. Определение флавоноидов в растительном сырье / К. Б. Адихотдаев, А. И. Баньковский, В. И. Глызин // Фармация. — 1977. -№3.- С. 3-27.

96. Мальчуковский, Л. Б. Определение тритерпеновых сапонинов в порошке и таблетках "сапарал " / Л. Б. Мальчуковский, Н. И. Либизов // Фармация. 1971. - № 2. - С. 68-71.

97. Девяткина, В. А. Методы определения витаминов/

98. B. А. Девяткина. -М.: Пищепромиздат, 1954. — 135 с.

99. Нижний, С. А. Скрининг физиологически активных веществ /

100. C. А. Нижний, Н. В. Дмитриева. -М.: Медицина, 1985. 158 с.

101. Левин, Э. Д. Современные физиолого-химические методы исследования : метод, указ. к проведению лаб. работ для студентов спец. 2603 всех форм обучения. / Э. Д. Левин, П. В. Миронов. Красноярск: СТИ, 1988.-28 с.

102. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. М.: Наука, 1975. - 322 с.

103. Оболенская, Л. В. Практические работы по химии древесины и целлюлозы / Л. В. Оболенская. М.: Наука, 1965. - 111 с.

104. Ушанова, В.М. Основы научных исследований / В.М. Ушанова, О. И. Лебедева. Красноярск, 2003.- кн.2 - 98 с.

105. Кретович, В. Л. Биохимия растений / В. Л. Кретович. М.: Высш. шк., 1986.-С. 356-357.

106. Лазуревский, В. Г. Практические работы по химии природных соединений. / В. Г. Лазуревский, И. В. Терентьева, А. А. Шамшурин. — М.: Высш. шк., 1966. 335 с.

107. Гороховская, В. И. Практикум по электрохимическим методам анализа. / В. И. Гороховская, В. М. Гороховский. М.: Мир, 1987. - 191 с.

108. Гоберман, В.А. Технология научных исследований — методы, модели, оценки: Учеб. пособие. 2-е изд. стереотипное / В.А. Гоберман, Л.А. Гоберман.- М.: МГУЛ, 2002. 390 с.

109. Gamborg, О. L. Plant cell, tissue, and organ culture: fundamental methods / O. L. Gamborg, G. C. Phillips. Berlin: Springer-Verlag, 1995. -557 p.

110. Болвелл, Г. П. Биотехнология растений: культура клеток. / Г. П. Болвелл. М.: Агропромиздат, 1989. - 280 с.

111. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Р. Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. — 160 с.

112. Гоберман, В. А. Технология научных исследований методы, модели, оценки : учеб. пособие / В. А. Гоберман, JI. А. Гоберман. - М.: МГУЛ, 2002. - 390 с.

113. Калашникова, Е. А. Получение посадочного материала древесных, цветочных и травянистых растений с использованием методов клеточной и генной инженерии. / Е. А. Калашникова.- М.: МГУЛ, 2001.- 73 с.

114. Сассон, А. Биотехнология и повышение продуктивности растений / А. Сассон. -М.: Мир, 1987. С. 150-164.

115. Муромцев, Г. С. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений / Г. С. Муромцев, Д. И. Чекаников, К. 3. Гамбург М.: Агропром-издаг, 1987.-С. 316-322.