Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и их использование при повреждении костной ткани

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и их использование при повреждении костной ткани"

На правах рукописи

Кульнева Екатерина Игоревна

Получение in vitro трехмерных трансплантатов костной

ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и их использование при повреждении костной ткани

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 ИЮН 2011

Москва-2011

4849276

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент РАСХН, Девришов Давудай Абдулсемедович доктор медицинских наук, профессор Тепляшин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Фомина Наталья Васильевна

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

Ведущая организация - Государственный научный центр «Институт иммунологии» федерального медико-биологического агентства.

Защита состоится » ¿у^иЯ 2011 года в '/ОсС часов на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан » сЯ-^ 2011 г и размещен на

сайте http://mgavm.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Существует множество клинических случаев, когда лечение костной ткани требует заполнения достаточно обширных дефектов, восстановление которых стандартными методами не эффективно и требует применения специфических подходов.

В настоящее время разрабатываются различные способы восстановления костных дефектов, среди которых можно выделить несколько: применение имплантов различной природы (Mastrogiacomo М. et al., 2005), факторов роста (Nordsletten L. et al., 2006) или плазмы, обогащенной тромбоцитами (Kasten Р. et al., 2008). Данные подходы позволяют восстановить дефекты костной ткани небольшой величины, но для восстановления крупных повреждений их эффективность значительно уменьшается, что связано либо с высокой стоимостью метода (факторы роста), либо с отсутствием у материала остеогенного потенциала (плазма, обогащенная тромбоцитами, импланты).

Особую актуальность приобрели методы тканевой инженерии и клеточные технологии. Главным компонентом тканевой инженерии является клеточный материал, в основном, стволовые клетки, обладающие большими потенциями к репарации различных тканей и органов. Широкие потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и простота получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективный в регенерационной медицине. Существующие способы загрузки ММСК в пористые носители обладают низкой эффективностью заселения матриксов клетками. Следовательно, для более равномерного заполнения требуется большее число клеточного материала.

Таким образом, разработка метода оптимальной загрузки матрикса клеточным материалом является актуальной задачей для получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани. Применение таких биологических эквивалентов костной ткани, обладающих, помимо

остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств, остеогенными характеристиками, и исследование их влияния на организм овцы является перспективным направлением для применения в ветеринарии, регенерационной медицине и ортопедии.

Цели и задачи исследований. Целью исследований являлось in vitro получение трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга, а также их использование для замещения костных дефектов критического размера. Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить наиболее оптимальный источник мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) для создания на их основе трехмерных трансплантатов костной ткани (ТТКТ).

2. Охарактеризовать клетки, выделенные из костного мозга овцы, с фенотипом подобным ММСК.

3. Провести анализ потенций ММСК костного мозга овцы к направленной дифференцировке in vitro.

4. Оптимизировать среду для направленной дифференцировки ММСК костного мозга овцы in vitro.

5. Оптимизировать существующий способ загрузки ММСК в кальций-фосфатный матрикс для создания трехмерных трансплантатов костной ткани in vitro.

6. Провести доклиническое изучение полученных трансплантатов костной ткани на овцах (баранах).

Научная новизна. Впервые охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства ММСК, выделенных из костного мозга овцы. Впервые изучены потенции ММСК КМ овцы к остеогенной (93± 0,05%), хондрогенной (90±0,2%) и адипогенной (83±0,2%) дифференцировке. Подобрана оптимальная среда для направленной адипогенной дифференцировки.

Впервые разработан метод эффективного (93,9±0,01%) заселения пористых трехмерных кальций-фосфатных матриксов клеточным материалом, которые могут быть использованы для восстановления костных дефектов критической величины. Определена оптимальная скорость орбитального шейкера для более эффективного заполнения пористого матрикса клетками. Доказано, что в результате in vitro культивирования ММСК костного мозга в матриксе в среде с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки, получены трехмерные биологические структуры костной ткани.

Впервые в России проведены доклинические испытания, полученных in vitro костных трансплантатов, по восстановлению костной ткани in vivo. В качестве модели дефекта костной ткани критической величины использовались бараны с двойной остеотомией большеберцовой кости. Получены данные о влиянии трехмерных трансплантатов костной ткани на основе ММСК костного мозга на организм овцы.

Практическая значимость. Разработанный метод получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани представляет практический интерес для биотехнологии, медицины и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный биологический эквивалент костной ткани при относительной низкой стоимости его изготовления. На базе ООО «Бьюти Плаза» налажено создание трехмерных трансплантатов костной ткани в производственных масштабах.

Разработан метод эффективной загрузки трехмерных кальций-фосфатных матриксов ММСК КМ для создания ТТКТ с эффективностью 93,9 ±0,01%.

Проведены доклинические испытания полученных ТТКТ на овцах.

Метод получения и наращивания ММСК костной ткани овцы используется на кафедре иммунологии, а способ имплантации ТТКТ используется на кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.

Полученные биотрансплантаты костной ткани используются в ФГУ «ЦИТО им. H.H. Приорова» Минздравсоцразвития России для клинического изучения.

На базе ООО «Бьюти Плаза» создан Национальный банк стволовых клеток, с целью криоконсервации ММСК КМ для создания ТТКТ и их дальнейшего научного и клинического применения.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное осуществление лабораторных исследований, проведение доклинических испытаний, анализ, обобщение и интерпретация полученных результатов. Были сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии. Доклиническое испытание было выполнено совместно с аспирантом кафедры иммунологии Девришовым P.C. В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со старшим научным сотрудником Центра клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза», канд. биол. наук Коржиковой C.B.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука XXI века» (Пущино, 2010); на Московской международной научно-практической конференции, Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010); на IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); 14-м Международном биотехнологическом симпозиуме и выставке (Италия, 2010), на Всероссийской школе-конференции для молодых ученых «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, российских и зарубежных изданий, а так же 5 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (191 источник, из которых 8 отечественных и 183 иностранных). Работа иллюстрируется 6-ю таблицами, 24-мя рисунками и содержит 6 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты.

1. Выбор наиболее оптимального клеточного материала для создания трехмерных трансплантатов костной ткани и его характеристика.

2. Характеристика ММСК костного мозга овцы.

3. Усовершенствованный метод заселения ММСК кальций-фосфатного матрикса.

4. Доклиническое изучение полученных биологических эквивалентов костной ткани в организме овец.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2007 по 2011 год на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина и Центре клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза».

Жировая ткань от 10-ти здоровых доноров была предоставлена для исследований ООО «Бьюти Плаза». ММСК ЖТ человека были получены обработкой ткани раствором коллагеназы 1-го типа (0,075%) и градиентной фильтрации клеточной суспензии (100 и 10 мкм).

Костный мозг 9 здоровых доноров был получен в ООО «Бьюти Плаза» при пунктировании гребня подвздошной кости. ММСК КМ человека выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла по разработанной в Центре клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза» ранее методике. Количество полученных клеток оценивали

подсчетом в камере Горяева, сеяли во флаконы площадью 150 см2 из расчета 1 млн. клеток на 1 см2. Костный мозг получали от 9-ти баранов при пунктировании гребня подвздошной кости. ММСК выделяли после последовательной фильтрации суспензии клеток, сеяли во флаконы площадью 150 см2 из расчета 1 млн. клеток на 1 см2.

Тест на жизнеспособность проводили после окрашивания 4% раствором трипанового синего путем подсчета окрашенных клеток в камере Горяева.

Морфологическую оценку ММСК проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Анализ иммунофенотипа ММСК проводили методом проточной цитофлуориметрии на цитометре Beckman Coulter. Окрашивание проводилось по стандартной методике. Было проанализировано 250 проб клеточной суспензии от 9 доноров.

Способность ММСК к направленной дифференцировке и специфическое окрашивание проводилось согласно общепринятым методам. Индукторами остеогенной дифференцировки были дексаметазон (10-7 М), р-глицерофосфат (10 мМ) и аскорбиновая кислота (0,2 мМ). Среда для хондрогенной дифференцировки состояла из: DMEM-HG, 1 % HSA, 0,1 нМ дексаметазона, 0,2 мМ аскорбат-2-фосфата, lx ITS, 10 нг/мл линолиевой кислоты, 10 нг/мл TGF — рЗ, 1% антибиотик, 10 нг/мл IGF-1. Для адипогенной дифференцировки использовали дексаметазон, инсулин, индометацин, и 3 изобутил-1-метилксантин.

Молекулярный анализ ММСК костного мозга и ПЖК, направленных в остеогенную дифференцировку, проводили методом ОТ-ПЦР.

Для создания ТТКТ использовали кальций-фосфатные матриксы (Институт металлургии и материаловедения им А.А. Байкова (ИМЕТ РАН)) и ММСК КМ человека и овцы. После насыщения матрикса клеточным материалом, трехмерные структуры культивировали в остеогенной среде 28

дней. Анализ полученного трансплантата проводили с помощью окрашивания парафинизированных гистосрезов, с применением DAB-kit.

Доклиническое изучение ТТКТ проводили на 12-ти овцах романовской породы путем моделирования двойного перелома в средней трети большой берцовой кости размером 2,5 см. В течение всего срока эксперимента изучалась динамика изменений гематологических показателей периферической крови (методика описана в работе Девришова P.C.). Через 3 месяца участок костной ткани с имплантированным ТТКТ фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После чего проводили декальцинацию образцов и гистологическую оценку новообразованной костной ткани.

Экспериментальные данные обрабатывали методом среднестатистического анализа и с помощью программ СХР v.2.1 (Beckman-Coulter). Для оценки достоверности различий между группами использовали критерий Статистическую обработку проводили при помощи компьютерной программы Excel.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие к.б.н. Коржикова (Центр клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза»), сотрудники кафедры иммунологии и кафедры хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, ФГУ «ЦИТО им. H.H. Приорова» Минздравсоцразвития России, за что автор им искренне благодарен.

Результаты исследований Характеристика ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека

Клетки, выделенные из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки, были охарактеризованы по экспрессии поверхностных антигенов с использованием метода проточной цитофлуориметрии.

Выделенные популяции ММСК КМ и подкожно-жировой клетчатки обладали схожим иммунофенотипом, характерным для ММСК. Клетки положительно окрашивались антителами к антигенам: CD 10, CD13, CD29,

CD44, CD49a, CD49b, CD71, CD73, CD90, CD105, CD166, HLA ABC. Оба типа клеток были отрицательны по экспрессии следующих маркеров: CD14, CD19, CD34, CD45, CD133, CD31, HLA DP, DR, DQ. Кроме того, I популяции ММСК, выделенные из двух источников, не экспрессировали Strol. Тем не менее, ММСК, выделенные из костного мозга, положительно окрашивались антителами к CD106 и умеренно экспрессировали CD49d, в то время как для ММСК подкожно-жировой клетчатки наблюдался низкий уровень экспрессии CD106, и высокая экспрессия маркера CD49d. Данные результаты соответствуют литературным данным.

Сравнение остеогенного потенциала ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки человека

При культивировании ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки, в среде с остеогенными индукторами, характерные изменения морфологии клеточных популяций, выявленные окрашиванием ализариновым красным, наблюдались уже на 14-й день культивирования, а для ММСК подкожно-жировой клетчатки данный период составлял 28 дней (Рис. 1).

Рисунок 1. Остеогенная дифференцировка ММСК КМ и ПЖК in vitro.

А - контроль остеогенной дифференцировки ММСК ПЖК, окрашивание ализариновым красным, ув. 100, Б - 14-й день культивирования ММСК

ПЖК в остеогенной среде, окрашивание ализариновым красным, ув. 100, В - 28-й день культивирования ММСК ПЖК в остеогенной среде окрашивание ализариновым красным, ув. 100, Г- контроль остеогенной дифференцировки ММСК КМ, окрашивание ализариновым красным, ув. 100, Д — 14-й день культивирования ММСК КМ в остеогенной среде, окрашивание ализариновым красным, ув. 100, Е — 28-й день культивирования ММСК КМ в остеогенной среде, окрашивание ализариновым красным, ув. 100.

Эффективность дифференцировки ММСК КМ на 28 день культивирования составила 98±0,05%, а ММСК ПЖК - 57±0,04%.

Способность клеток к дифференцировке в остеобласты была продемонстрирована с помощью ОТ-ПЦР анализа. В индуцированных ММСК КМ экспрессия маркеров остеогенеза остеопонтина (ОП) и остеокальцина (ОК) наблюдалась уже на 14-й день культивирования, костный сиалопротеин (КСП) детектировался на 21-й день. ММСК ПЖК характеризовались экспрессией ОП на 14-й, которая сохранялась до 28-го дня, экспрессия ОК и КСП не наблюдалась в течение всего срока культивирования клеток в среде с индукторами остеогенеза.

Таким образом, был сделан вывод о том, что ММСК КМ обладают более выраженной потенцией к дифференцировке в клетки остеогенной линии, по сравнению с ММСК ПЖК.

Характеристика ММСК костного мозга половозрелых баранов

ММСК КМ овцы обладали высокой адгезией к культуральному пластику и способностью к образованию колоний. Уже на 6-е сутки наблюдалось характерное для ММСК костного мозга образование колоний (Рис. 2А, Б). Монослой клеточной популяции можно наблюдать уже на 9-10й день культивирования. Анализ препаратов, окрашенных по Романовскому-Гимза, показал, что клетки имеют фибробластоподобную форму, гомогенную цитоплазму, низкое ядерно-цитоплазматическое соотношение, смещенное к периферии овальное ядро, с 4-6 хорошо

различимыми ядрышками (Рис. 2В). Диаметр ошаренных клеток составляет 18-20 мкм.

Культура выделенных клеток характеризовалась высоким митотическим индексом — 60±0,03%о. Время цитогенерации составило 3842 часа.

Рисунок 2. ММСК костного мозга овцы.

А, Б - колонии ММСК на шестой день культивирования, окрашивание по Романовскому-Гимза, Б - ув. 100. В - монослой ММСК, окрашивание по Романовскому-Гимза, ув. 200.

Полученные нами данные согласуются с результатами других лабораторий (Kern S. et al., 2006; Colter D.C. et al., 2001). Таким образом, был сделан вывод, что полученная популяция клеток из костного мозга половозрелых баранов обладает морфологическими характеристиками ММСК in vitro.

Анализ экспрессии поверхностных маркеров полученной популяции ММСК костного мозга половозрелых баранов

В таблице 1 приведены среднестатистические данные уровня экспрессии поверхностных маркеров ММСК КМ по 9 половозрелым баранам.

Таблица 1. Уровень экспрессии поверхностных антигенов ММСК костного мозга овцы (%)

CD31 CD44 CD45 OLADQ OLADR

1,6 ±0,4 98,3±1,0 1,1±0,6 1,2±0,3 2,9±0,9

Данный анализ показал, что выделенные клетки обладают иммунофенотипом, характерным для ММСК костного мозга, они не экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток (CD31) и клеток кроветворного ряда (CD45), кроме того, отсутствует экспрессия молекул второго комплекса гистосовместимости DQ и DR.

Направленная дифференцировка ММСК костного мозга овцы

Через 21 день после культивирования в среде с индукторами остеогенеза в опытных лунках, наблюдалась активная цитодифференцировка ММСК КМ овцы в клетки остеогенного ряда, что подтверждалось окрашиванием препаратов ализариновым красным и по von Kossa. Эффективность дифференцировки составила 93+0,05%.

Рисунок 3. Направленная остеодифференцировка ММСК костного мозга овцы, 14 день культивирования.

А - контроль дифференцировки клеток, окраска БАВ-кИ, ув. 200. Б -остеокальцин, окраска ПАВ-кк, ув. 200. В - контроль окрашивания на остеокальцин, окраска ОАВ-кк. ув. 200.

Остеогенная дифференцировка подтвердилась окрашиванием ММСК костного мозга овцы антителами к специфическому маркеру дифференцировки - остеокальцину (Рис. 3).

После 28 дней культивирования осажденных центрифугированием ММСК КМ овцы в среде с индукторами хондрогенеза, наблюдалось формирование плотных структур, их окрашивание антителами к основным маркерам хондрогенеза (коллагену II и аггрекану) показало эффективную дифференцировку клеток в сформированных структурах. Эффективность

хондродифференцировки ММСК костного мозга половозрелых баранов составила 90±0,2%.

Таким образом, было показано, что ММСК КМ овцы обладают потенцией к направленной дифференцировке в клетки остеогенной и хондрогенной линий. Подбор среды для адипогенной дифференцировки ММСК костного мозга половозрелых баранов

В таблице 2 представлены составы сред, используемые для анализа адипогенной дифференцировки.

Таблица 2. Концентрации индукторов адипогенной дифференцировки ММСК костного мозга овцы в различных вариантах сред

Индукторы Среда №1 Среда №2 Среда №3 Среда №4 Среда №5 Среда №6

Дексаметазон 1 цт 0,1 цт 1 цт 1 цт 0,1 цт 1 цт

Инсулин 10 тМ 10 тМ 10 тМ 6 тМ 6 тМ 10 тМ

Индометацин 200 цт 200 цт 200 цт 20 цт 20 цт 20 цт

3 изобутил-1-метилксантин 0,5тМ 0,05тМ 0,05тМ 0,05тМ 0,05тМ 0,05тМ

Содержание индукторов в Среде №1 эквивалентно их концентрации для эффективной адипогенной дифференцировки ММСК человека. Через 21 день культивирования в этой среде большинство клеток погибало, дифференцировки в адипоциты не наблюдалось. Эффективность цитодиффренцировки сред №4, 5 и 6 была меньше, чем №2 и №3. При использовании среды №3, эффективность дифференцировки была сопоставима с уровнем дифференцировки среды №2. Однако, при использовании среды №3 наблюдалось большое количество погибших клеток (18,3+0,15%). Таким образом, наиболее эффективной средой для цитодифференцировки являлась Среда №2 (число погибших клеток -5,4±0,1%). Эффективность дифференцировки ММСК костного мозга овцы при культивировании в данной среде составила 83±0,2%.

Получение in vitro трехмерного трансплантата костной ткани на основе ММСК костного мозга и кальций-фосфатного матрикса

Для заселения матриксов клетками использовали метод,

разработанный в Центре клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза» для

небольших матриксов (V=0,058см3). Однако, для оптимального заполнения

используемых в эксперименте скаффолдов (V= 12,56см3) клеточным

материалом были разработаны некоторые модификации. Было установлено,

что 30 об./мин. - оптимальная скорость орбитального шейкера для

заселения матриксов клетками с эффективностью 93,9±0,01% (Таблица 3).

Таблица 3. Определение оптимальной скорости орбитального шейкера для заселения пористых кальций-фосфатных матриксов ММСК

Скорость (об./мин.) Число клеток, вышедших из матрикса через 24 часа (тыс. кл.) Эффективность загрузки

30 600,9 ± 1,0 93,9+0,01%

50 1000,0 ±2,2 90±0,02%

70 1900,7 ±7,4 81+0,6%

После культивирования в остеогенной среде полученных in vitro ТТКТ по результатам иммуногистохимического анализа была выявлена экспрессия специфического маркера остеодифференцировки -остеопонтина.

Влияние полученных in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на организм овец при остеосинтезе

Исследования влияния ТТКТ на организм овец проводили при их имплантации в область дефекта в эксперименте двойной остеотомии большеберцовой кости на трех группах животных. В качестве контрольной группы вместо ТТКТ помещали пустой матрикс без клеток. Все животные удовлетворительно перенесли операционное вмешательство.

Рисунок 4. Костная ткань на разных этапах формирования.

А - Разнонаправленные остеоны и признаки пластинчатого строения кости в относительно зрелой интермедиарной костной мозоли, окраска гематоксилином и эозином, ув. 200. Б - Элементы грубоволокнистой незрелой кости в наружных отделах периостальной костной мозоли, окраска гематоксилином и эозином, ув. 400. В - Остатки матрикса, окруженные формирующейся костной тканью (контрольная группа), указаны стрелками, окраска гематоксилином и эозином, ув. 400.

Через три месяца после операции был проведен гистологический анализ новообразованной костной ткани в области дефекта. Степень зрелости сформированной костной ткани существенно не отличалась в группах, где в область дефектов были имплантированы ТТКТ на основе ММСК из костного мозга человека или овец. Было показано наличие новообразованной костной ткани на разных стадиях формирования. На рисунке 4А показано наличие разнонаправленных остеонов с признаками пластинчатого строения кости. Периостальная мозоль в наружных отделах содержала элементы грубоволокнистой незрелой кости (Рис. 4Б). В контрольной группе детектировалось наличие не биодеградировавших участков кальций-фосфатных матриксов (Рис. 4В), которые были погружены в формирующуюся костную ткань, без признаков воспалительной реакции.

Таким образом, полученные биологические эквиваленты костной ткани участвуют в процессе репаративного остеогенеза при заживлении дефектов критического размера (2,5см) и не обладают токсическим и туморогенным действием на организм овцы, кроме того, они не вызывают иммунного отторжения.

17

ВЫВОДЫ

1. Определен оптимальный клеточный материал для создания трехмерных трансплантатов костной ткани in vitro. Эффективность остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга составила 98±0,05% на 28-й день культивирования в среде с индукторами остеогенеза.

2. Из костного мозга овцы выделена популяция мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга овцы имеют фибробластоподобную морфологию, обладают адгезивной и колонообразующей активностью. Время цитогенерации - 38-42 ч. Митотический индекс 60±0,03%о.

3. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга овцы положительно окрашиваются антителами к CD44 - 98,3+1,0%, не экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток (CD31 - 1,6±0,4%) и клеток кроветворного ряда (CD45 - 1,1+0,6%), экспрессия OLA DQ составила - 1,2±0,3%, DR - 2,9±0,9%.

4. При индукции к цитодифференцировке в клетки остеогенной и хондрогенной линий in vitro мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга овцы обладают высоким дифференцировочным потенциалом (93±0,05% и 90±0,2% соответственно).

5. Оптимизирована среда для адипогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга овцы. Содержание индукторов для эффективной дифференцировки (83+0,2%) клеток в клетки адипогенной линии составляет: 0,1 цш дексаметазона, 10 гпМ инсулина, 200 цш индометацина и 0,05 шМ 3 изобутил-1-метилксантина.

6. Оптимизирован метод загрузки клеток в пористый цилиндрический матрикс, с эффективностью 93,9±0,01%. Предложенный метод основан на насыщении матрикса мультипотентными мезенхимными

стромальными клетками и последующим покачиванием орбитального шейкера со скоростью 30 об./мин., что позволяет добиться увеличения эффективности загрузки матрикса (93,9+0,01%), сокращая общее число используемых клеток.

7. Установлено, что полученные in vitro трехмерные трансплантаты костной ткани положительно влияют на активность остеогенеза при двойной остеотомии большеберцовой кости с дефектом в 2,5 см. Трехмерные трансплантаты костной ткани не оказывают токсического и туморогенного действия на организм овец, а также не вызывают иммунного отторжения трансплантатов, созданных на основе ММСК костного мозга человека.

8. При аллогенной и ксеногенной трансплантации трехмерных трансплантатов костной ткани, через 3 месяца после операции, уровень формирования новообразованной костной ткани существенно не отличался, что было подтверждено гистологическим анализом новообразованной костной ткани в области дефекта.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. На базе ООО «Бьюти Плаза» налажена техническая линия создания трехмерных трансплантатов костной ткани (ТТКТ) в производственных масштабах.

2. Полученные биотрансплантаты костной ткани используются в ФГУ «ЦИТО им. H.H. ПРИОРОВА» (договор № БГН-1 от 10.04.2011) Минздравсоцразвития России для контроля эффективности остеогенеза при репарации дефектов критической величины.

3. На базе ООО «Бьюти Плаза» создан Национальный Банк Стволовых клеток, с целью криоконсервации ММСК КМ для создания ТТКТ и их дальнейшего научного и клинического применения (по лицензии Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального

развития на применение новых клеточных технологий в здравоохранении №ФС-99-01-005527 от 01 августа 2008).

4. Метод получения и наращивания ММСК костной ткани овцы используется на кафедре иммунологии, а способ имплантации ТТКТ используется на кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать отработанные методологические параметры по получению ТТКТ на основе ММСК КМ для использования в разработке методов восстановления костных дефектов с целью ускорения процесса регенерации костной ткани у человека и животных.

2. Рекомендовать использование результатов исследований и выводов в учебном процессе высших учебных заведений при изучении дисциплин «Иммунология», «Биотехнология», «Хирургия».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кульнева Е.И. Выделение и характеристика клеток, подобных мезенхимным стволовым клеткам, из костного мозга овцы / Биотехнология: состояние и перспективы развития: сб. научн. тр.- М.: «Экспо-Биохим-технологии»,- 2010,- С. 484-485.

2. Кульнева Е.И., Коржикова C.B., Тепляшин A.C. Характеристика клеток, подобных мезенхимным стволовым клеткам, выделенных из костного мозга овцы / 14-я международная школа конференция молодых ученых - Биология - Наука XXI века: сб. научн. тр. - Пущино.: "ИП Скороходов В.А." 2010. - Т.1 - С. 264-265.

3. Тепляшин A.C., Кульнева Е.И., Коржикова C.B. Организация и деятельность первого негосударственного банка стволовых клеток / Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: сб. научн. тр.- СПб.: Человек и его здоровье. -2010. - С. 30-31.

4. Кульнева Е.И., Коржикова C.B., Тепляшин A.C. Создание трансплантатов костной ткани in vitro, на основе синтетического матрикса и

клеточного материала / Всероссийская научная школа - конференция: Стволовые клетки и регенеративная медицина: сб. науч.тр. - М.: МАКС Пресс.-2010.-С. 44.

5. Характеристика клеток, подобных мультипотентным мезенхимным стромальным клеткам, выделенным из костного мозга овцы / Кульнева Е.И., Девришов Д.А., Тепляшин А.С. и др. // Ветеринарная медицина,- 2010. - № 3-4. - С. 102-104.

6. Эффективность адипогенной дифференцировки ММСК, выделенных из костного мозга овцы при использовании сред с различной концентрацией индукторов / Кульнева Е.И., Коржикова С.В., Тепляшин А.С. и др. // Ветеринарная медицина.- 2010. - № 3-4. - С. 104-105.

7. Кульнева Е.И.., Коржикова С.В., Тепляшин А.С. Использование клеточных технологий в создании биологических эквивалентов костной ткани / Стволовые клетки и регенеративная медицина: сб. статей - М.: МАКС Пресс. - 2011.-С. 280-288.

8. Kulneva E.I., Korzhikova S.V., Teplyashin A.S. Bone Tissue Engineering: Synthetic Materials and Stem Cells / Bone Regeneration: Growth Factors, Augmentation Procedures and Tissue Engineering Applications. - New York. - Nova Publishers Inc. - 2010. - P. 119-146.

9. Kulneva E.I., Korzhikova S.V., Teplyashin A.S. HUVEC for Prevascularization of Bone Tissue-Engineered Graft. // Journal of Biotechnology. -2010.-V. 150.-S.1.-P. 96-97.

Подписано в печать: 16.05.11 Объем: 1,5усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 799498 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кульнева, Екатерина Игоревна

Список сокращений.

Введение.

1 Обзор литературы.

1.1 Материалы, используемые для восстановления костной ткани.

1.1.1 Ауто-, алло- и ксенотрансплантаты.

1.1.2 Синтетические матриксы.

1.2 Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки — перспективный материал для тканевой инженерии костной ткани.

1.2.1 Морфология ММСК.

1.2.2 Иммунофенотип ММСК.

1.2.3 Иммунологические свойства ММСК.

1.2.4 Потенциал ММСК к направленной цитодифференцировке.

1.3 Тканевая инженерия костной ткани.

1.4 Современные подходы к восстановлению костных дефектов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение in vitro трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и их использование при повреждении костной ткани"

Актуальность темы. Существует множество клинических случаев, когда лечение костной ткани требует заполнения достаточно обширных дефектов. Например, лечение различных травм, не срастающихся переломов, реконструкция костной ткани после удаления имплантов, заполнение дефекта после удаления опухоли в травматологии и ортопедии, или удлинение ног для эстетической хирургии. В настоящее время применение стандартных методов лечения не способствует эффективному восстановлению таких дефектов, и требует применения специфических методов лечения.

Клеточные технологии и тканевая инженерия являются одним из крупных разделов биотехнологии и появились как отдельные направления медицины в конце 20-го — начале 21-го века. Быстрое развитие данных областей науки способствует появлению новых современных подходов лечения различных заболеваний животных и человека, как врожденных, так и приобретенных.

В настоящее время разрабатываются различные способы восстановлеия костных дефектов, среди которых можно выделить несколько: применение имплантов различной природы (Mastrogiacomo М. et al., 2005), факторов роста (Nordsletten L. et al., 2006) или плазмы, обогащенной тромбоцитами (Kasten Р. et al., 2008). Данные подходы позволяют восстановить дефекты костной ткани небольшой величины, но для восстановления крупных повреждений их эффективность значительно снижается, что связано либо с высокой стоимостью метода (факторы роста), либо с отсутствием у материала остеогенного потенциала (плазма, обогащенная тромбоцитами, импланты).

Таким образом, особую актуальность приобрели методы тканевой инженерии и клеточные технологии. Главным компонентом тканевой инженерии является клеточный материал, в основном, стволовые клетки, обладающие большими потенциями к репарации различных тканей и органов. Разработка технологий, с использованием стволовых клеток, стала возможной благодаря бурному развитию клеточной биологии. В научном понимании стволовые клетки являются особой популяцией не дифференцированных клеток, способных к самообновлению и дифференцировке в различные виды тканей. Обычно в организме они находятся в состоянии покоя. При возникновении необходимости восстановления поврежденных органов, или восполнения клеточного состава тканей запускается механизм, в котором каждая стволовая клетка начинает активно делиться, образуя две дочерние, одна сохраняет свойства стволовой, а другая дифференцируется и участвует в регенерации тканей. Широкие потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и простота получения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективный в регенерационной медицине. Важной составляющей тканевой инженерии является матрикс, с помощью которого осуществляется направленная доставка клеток в область дефекта. Успехи физико-химических наук способствовали появлению новых материалов, отличающихся от натуральных, и обладающих необходимыми свойствами. Так, при создании синтетических материалов, стало возможным задавать матриксам определенные свойства, такие как размер и форма, и предугадывать их поведение внутри организма. Существующие способы загрузки ММСК в пористые носители обладают низкой эффективностью заселения матриксов клетками. Следовательно, для более равномерного заполнения требуется большее число клеточного материала. Таким образом, разработка метода оптимальной загрузки матрикса клеточным материалом является актуальной задачей для получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани.

Исследования эффективного совместного применения клеточных технологий и новых усовершенствованных материалов для лечения костных дефектов различной этиологии является основным направлением развития тканевой инженерии для применения в регенерационной медицине и ортопедии. В настоящее время ведутся интенсивные исследования по восстановлению костной ткани полученных in vitro трансплантатов на животных моделях (CanceddaaR. et al., 2007).

Применение таких биологических эквивалентов костной ткани, обладающими помимо остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств, остеогенными характеристиками, и исследование их влияния на организм овцы является перспективным направлением для применения в ветеринарии, регенерационной медицине и ортопедии.

Цели и задачи исследований. Целью исследований являлось in vitro получение трехмерных трансплантатов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга, а также их использование для замещения костных дефектов критического размера. Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить наиболее оптимальный источник мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) для создания на их основе трехмерных трансплантатов костной ткани (ТТКТ).

2. Охарактеризовать клетки, выделенные из костного мозга овцы, с фенотипом подобным ММСК.

3. Провести анализ потенций ММСК костного мозга овцы к направленной дифференцировке in vitro.

4. Оптимизировать среду для направленной дифференцировки ММСК костного мозга овцы in vitro.

5. Оптимизировать существующий способ загрузки ММСК в кальций-фосфатный матрикс для создания трехмерных трансплантатов костной ткани in vitro.

6. Провести доклиническое изучение полученных трансплантатов костной ткани на овцах (баранах).

Научная новизна. Впервые охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства ММСК, выделенных из костного мозга овцы. Впервые изучены потенции ММСК КМ овцы к остеогенной (93±0,05%), хондрогенной (90±0,2%) и адипогенной (83±0,2%) дифференцировке. Подобрана оптимальная среда для направленной адипогенной дифференцировки.

Впервые разработан метод эффективного (93,9±0,01%) заселения пористых трехмерных кальций-фосфатных матриксов клеточным материалом, которые могут быть использованы для восстановления костных дефектов критической величины. Определена оптимальная скорость орбитального шейкера для более эффективного заполнения пористого матрикса клетками. Доказано, что в результате in vitro культивирования ММСК костного мозга в матриксе в среде с добавлением индукторов остеогенной дифференцировки, получены трехмерные биологические структуры костной ткани.

Впервые в России проведены доклинические испытания, полученных in vitro костных трансплантатов, по восстановлению костной ткани in vivo. В качестве модели дефекта костной ткани критической величины использовались бараны с двойной остеотомией болыиеберцовой кости. Получены данные о влиянии трехмерных трансплантатов костной ткани на основе ММСК костного мозга на организм овцы.

Практическая значимость. Разработанный метод получения эффективных трехмерных трансплантатов костной ткани представляет практический интерес для биотехнологии, медицины и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный биологический эквивалент костной ткани при относительной низкой стоимости его изготовления.

На базе ООО «Бьюти Плаза» налажено создание трехмерных трансплантатов костной ткани в производственных масштабах.

Разработан метод эффективной загрузки трехмерных кальций-фосфатных матриксов ММСК КМ для создания ТТКТ с эффективностью 93,9 ±0,01%.

Проведены доклинические испытания полученных ТТКТ на овцах.

Метод получения и наращивания ММСК костной ткани овцы используется на кафедре иммунологии, а способ имплантации ТТКТ используется на кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.

Полученные биотрансплантаты костной ткани используются в ФГУ «ЦИТО им. H.H. Приорова» Минздравсоцразвития России для клинического изучения.

На базе ООО «Бьюти Плаза» создан Национальный банк стволовых клеток, с целью криоконсервации ММСК КМ для создания ТТКТ и их дальнейшего научного и клинического применения.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит непосредственное осуществление лабораторных исследований, проведение доклинических испытаний, анализ, обобщение и интерпретация полученных результатов. Были сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии. Доклиническое испытание было выполнено совместно с аспирантом кафедры иммунологии Девришовым P.C. В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве со старшим научным сотрудником Центра клеточных технологий ООО «Бьюти Плаза», канд. биол. наук Коржиковой C.B.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - Наука

XXI века» (Пущино, 2010); на Московской международной научно-практической конференции, Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010); на IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, 2010); 14-м Международном биотехнологическом симпозиуме и выставке (Италия, 2010), на Всероссийской школе-конференции для молодых ученых «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, российских и зарубежных изданий, а так же 5 статей в сборниках научных трудов.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (191 источник, из которых 8 отечественных и 183 иностранных). Работа иллюстрируется 6-ю таблицами, 24-мя рисунками и содержит 6 страниц приложений.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Кульнева, Екатерина Игоревна

ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать отработанные методологические параметры по получению ТТКТ на основе ММСК КМ для использования в разработке методов восстановления костных дефектов с целью ускорения процесса регенерации костной ткани у человека и животных.

2. Рекомендовать использование выводов в учебном процессе на базе высших учебных заведений в изучении дисциплин «Иммунология», «Биотехнология», «Хирургия».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кульнева, Екатерина Игоревна, Москва

1. Анохина Е. Б., Буравкова Л. Б. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс // Цитология. -2007. -№49(1). -С. 40-47

2. Быков В. Л. Цитология и общая гистология // С.Пб: Сотис. 2000. - 520 с.

3. Дризе Н. И., Чертков И. Л. «Пластичность» костномозговых стволовых клеток // Терапевтический архив. 2004. - № 7. - С. 5-11.

4. Кузнецов С. Л., Мушкамбаров Н. Н. Гистология, цитология и эмбриология // М: МИА. 2007. - 602 с.

5. Новик А. А., Иванов Р. А. Клеточная терапия // М.:МИА. 2008.240 с.

6. Уотсон-Джонс Р. Переломы костей и повреждения суставов // М.: Медицина. 1972. - 672 с.

7. Чупикова Н. И., Ростовская М. С., Шарифуллина С. 3. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека и их характеристика //Цитология. 2004. - №46(10).- С. 947.

8. Abdel-Aal А. М. Bone Transport for Massive Tibial Bone Defects // Orthopedics. 2006. - № 29(1). - P. 70-74.

9. Aggarwal S., Pittenger M. F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses // Blood. 2005. - № 105(4). - P. 1815-1822.

10. Aho A. J., Hirn M., Aro H. T. et al. Bone bank service in Finland. Experience of bacteriologic, serologic and clinical results of the Turku Bone Bank 1972-1995 // Acta Orthop Scand. 1998. - № 69(6). - P. 559-565.

11. Alvarez K., Camero S., Alarcon M. E. et al. Physical and mechanical properties evaluation of Acropora palmata coralline species for bone substitution applications // J Mater Sei Mater Med. 2002. - № 13(5). - P. 509-515.

12. Arinzeh T. L., Tran T., Mcalary J. et al. A comparative study of biphasic calcium phosphate ceramics for human mesenchymal stem-cell-induced bone formation //Biomaterials. 2005. - № 26(17). - P. 3631-3638.

13. Arinzeh T. L., Peter S. J., Archambault M. P. et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect // J Bone Joint Surg Am. 2003. - № 85-A(10). - P. 1927-1935.

14. Arnhold S. J., Goletz I., Klein H. et al. Isolation and characterization of bone marrow-derived equine mesenchymal stem cells // Am J Vet Res. 2007. -№68(10).-P. 1095-1105.

15. Arnsdorf E. J., Tummala P., Jacobs C. R. Non-canonical Wnt signaling and N-cadherin related beta-catenin signaling play a role in mechanically induced osteogenic cell fate //PLoS. 2009. -№ 4(4). - P. 5388.

16. Arlington E. D., Smith W. J., Chambers H. G. et al. Complications of iliac crest bone graft harvesting // Clin Orthop Relat Res. 1996. - № 329. - P. 300-309.

17. Bai K., Huang Y., Jia X. et al. Endothelium oriented differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under chemical and mechanical stimulations //JBiomech. -2010. -№43(6). P. 1176-1181.

18. Balamurugan A., Balossier G., Kannan S. Development and in vitro characterization of sol-gel derived Ca0-P205-Si02-Zn0 bioglass // Acta Biomater. 2007. - №3(2). - P. 255-262.

19. Ban S., Maruno S., Iwata H. Calcium phosphate precipitation on the surface of HA-G-Ti composite under physiologic conditions // J Biomed Mater Res. 1994. -№28(1). - P. 65-71.

20. Barry F., Boynton R. E., Liu B. et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components // Exp Cell Res. 2001. - № 268. - P 189-200.

21. Barry F. P., Boynton R. E., Haynesworth S. et al. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD 105) // Biochem Biophys Res Commun. 1999. - № 265(1).-P. 134-139.

22. Bellows C. G., Heersche J. N., Aubin J. E. Determination of the capacity for proliferation and differentiation of osteoprogenitor cells in the presence and absence of dexamethasone // Dev Biol. 1990. - № 140(1). - P. 1328.

23. Bellows C. G., Heersche J. N. M. et al. Inorganic phosphate added exogenously or released from P-glycerolphosphate initiates mineralization of osteoid nodules in vitro // Bone Min. 1992. - № 17. - P. 15-29.

24. Bensaïd W., Oudina K., Viateau V. et al. De novo reconstruction of functional bone by tissue engineering in the metatarsal sheep model // Tissue Eng. -2005. -№ 11(5-6).-P. 814-824.

25. Bergsma J. E., de Bruijn W. C., Rozema F. R. et al. Late degradation tissue response to poly(L-lactide) bone plates and screws // Biomaterials. 1995. -№16(1).-P. 25-31.

26. Betz, R.R. Limitations of autograft and allograft: new synthetic solutions // Orthopedics. 2002. - № 25(5). - P. 561-570

27. Billiard J., Moran R. A., Whitley M. Z. et al. Transcriptional profiling of human osteoblast differentiation // J Cell Biochem. 2003. - № 89(2). - P. 389400.

28. Bóstman O. M., Pihlajamáki H. K. Late foreign-body reaction to an intraosseous bioabsorbable polylactic acid screw. A case report // J Bone Joint Surg Am. 1998. - №80(12). - P. 1791-4.

29. Boyle A. J., McNiece I. K., Hare J. M. Mesenchymal stem cell therapy for cardiac repair // Methods Mol Biol. 2010. - № 660. - P. 65-84.

30. Brodke D. S., Gollogly S., Mohr R. A. et al. Dynamic cervical plates: biomechanical evaluation of load sharing and stiffness // Spine. 2001. - № 26(12). - P. 1324-1329.

31. Byers P.H. Disorders of collagen biosynthesis and structure, in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease / C. Scriver, A. Beaudet, W. Sly, D. Valle (Eds.) // 1995. P. 4029-4077.

32. Canceddaa R., Giannoni P., Mastrogiacomoa M. A tissue engineering approach to bone repair in large animal models and in clinical practice // Biomaterials. 2007. - № 28. - P. 4240-4250.

33. Casado-Díaz A., Santiago-Mora R., Jiménez R. et al. Cryopreserved human bone marrow mononuclear cells as a source of mesenchymal stromal cells: application in osteoporosis research // Cytotherapy. 2008. - № 10(5). - P. 460468.

34. Castro-Malaspina H., Gay R. E., Resnick G. et al. Characterisation of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny // Blood. 1980. - № 56. - P. 289-301

35. Cedola A., Mastrogiacomo M., Burghammer M. et al. Engineered bone from bone marrow stromal cells: a structural study by an advanced x-ray microdiffraction technique // Phys Med Biol. 2006 - № 51(6). - P. 109-116.

36. Chagastelles P. C., Nardi N. B., Camassola M. Biology and applications of mesenchymal stem cells // Sci Prog. 2010. - № 93 (Pt 2). - P. 113-127.

37. Chattopadhyay P., Pal S., Wahi A. et al. Synthesis of Crystalline Hydroxyapatite from Coral (Gergonacea sp) and Cytotoxicity Evaluation // Trends Biomater. Artif. Organs. 2007. - № 20(2). - P. 142-144.

38. Chaudhary L. R., Hofineister A. M., Hruska K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation // Bone. -№34:33.-P. 402-411.

39. Chen J., Shapiro H. S., Sodek J. Development expression of bone sialoprotein mRNA in rat mineralized connective tissues // Bone Miner Res. -1992.-№7(8).-P. 987-97.

40. Cirpar M., Cetik O., Uslu M. et al. Common complications of segmental bone transport with Ilizarov technique in defective tibia pseudoarthrosis: a review // Europ. J. of Orthop. Surg, and Traum. 2006. - № 16(4). - P. 380-385.

41. Colter D. C., Sekiya I., Prockop D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. - № 98(14). - P. 78417845.

42. Cora?a D. C.5 Duek E. A., Padovani C. A. et al. Osteointegration of poly(L: -lactic acid)PLLA and poly(L: -lactic acid)PLLA/poly(ethylene oxide)PEO implants in rat tibiae // J Mater Sci Mater Med. 2008. - № 19(7). - P. 2699-2704.

43. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E. et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions // Blood. 2006. - № 107(1). - P. 367-372.

44. Cricchio G., Lundgren S. Donor site morbidity in two different approaches to anterior iliac crest bone harvesting // Clin Implant Dent Relat Res. -2003.-№5(3).-P. 161-169.

45. D'Agostino B., Sullo N., Siniscalco D. et al. Mesenchymal stem cell therapy for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease // Expert Opin Biol Ther. 2010. - № 10(5). - P. 681-687.

46. De Ugarte D. A., Morizono K.; Elbarbary A. et al. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow // Cells Tissues Organs. 2003. -№ 174(3). - P. 101-109.

47. DeLise A. M., Tuan R. S. Analysis of N-cadherin function in limb mesenchymal chondrogenesis in vitro // Develop Dyn. 2002. - № 225(2). - P. 195-204.

48. Delorme B., Ringe J., Gallay N. et al. Specific plasma membrane protein phenotype of culture-amplified and native human bone marrow mesenchymal stem cells // Blood. 2008. - № 111(5). - P. 2631-2635.

49. Demers C., Hamdym C. R., Corsi K. et al. Natural coral exoskeleton as a bone graft substitute: a review // Biomed Mater Eng. 2002. - № 12(1). - P. 15-35.

50. Di Nicola M., Carlo-Stella C.5 Magni M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli // Blood. 2002. - № 99(10). - P 3838-3843.

51. Dragoo J. L., Choi J. Y., Lieberman J. R. et al. Bone induction by BMP-2 transduced stem cells derived from human fat // Orthop Res. 2003. - № 21(4). - P. 622-629.

52. Dunsmuir R. A., Gallacher G. Microwave sterilization of femoral head allograft // J Clin Microbiol. 2003. - № 41(10). - P. 4755-4757.

53. Elks M. L., Manganiello V. C. A role for soluble cAMP phosphodiesterases in differentiation of 3T3-L1 adipocytes // Cell Physiol. 1985. -№124(2).-P. 191-198.

54. Eslaminejad M. B., Nazarian H., Falahi F. et al. Ex vivo Expansion and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Goat Bone Marrow // Iranian J of Basic Med Sc. 2009. - № 12(2). - P. 70-79.

55. Fadilah A., Zuki A. B., Loqman M. Y. et al. Microscopic evaluation of the natural coral (Porites spp.) post-implantation in sheep femur // Med J Malaysia. 2004. - № 59(B). - P. 127-128.

56. Gang E. J., Bosnakovski D., Figueiredo C. A. et al. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow // Blood. 2007. - № 109(4). - P. 1743-1751.

57. Gigante A., Cappella M., Manzotti S. et al. Osteoinduction properties of different growth factors on cells from non-union patients: in vitro study for clinical application I I Biol Regul Homeost Agents. 2010. - № 24(1). - P. 51-62.

58. Goshima J., Goldberg V. M., Caplan A. I. The osteogenic potential of culture-expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks // Clin Orthop Relat Res. -1991. № 262. - P. 298-311.

59. Green S. A., Jackson J. M., Wall D. M. et.al. Management of segmental defects by the Ilizarov intercalary bone transport method // Clin Orthop Relat Res. 1992. - № 280. - P. 136-142.

60. Gronthos S., Graves S. E., Ohta S. et al. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors // Blood. 1994. - № 84(12).-P. 4164-73.

61. Guillemin G., Patat J. L., Fournie J. The use of coral as a bone graft substitute // J Biomed Mater Res. 1987. - № 21(5). - P. 557-567.

62. Gunatillake P. A., Adhikari R. Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering //Eur Cell Mater. 2003. - № 5. - P. 1-16.

63. Hamm J. K., Park B. H., Farmer S. R. A role for C/EBPbeta in regulating peroxisome proliferator-activated receptor gamma activity during adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes // Biol Chem. 2001. - № 276(21). - P. 18464-18471.

64. Hata R. I., Senoo H. J. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three dimensional tissue-like substance by skin fibroblasts // Cell Physiol. 1989. - № 138. P. 8-16.

65. Hattori H., Sato M., Masuoka K. et al. Osteogenic potential of human adipose tissue-derived stromal cells as an alternative stem cell source // Cells Tissues Organs. -2004. № 178(1). - P. 2-12.

66. Haynesworth S. E., Baber M. A., Caplan A. I. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies //Bone. 1992. - № 13(1). - P. 69-80.

67. Hench L. L. Bioactive ceramics // Ann N Y Acad Sci. 1988. - № 523.-P. 54-71

68. Hench L. L. Bioceramics: From concept to clinic // J American Ceramic Society. -1991. №74(7). - P. 1487-1510.

69. Hench L. L., Splinter R. J. M., Allen W. C. et al. Bonding mechanisms at the interface of ceramic prosthetic materials // J Biomed Mater Res. 1971.-№5.-P. 117-141.

70. Horwitz E. M., Prockop D. J., Fitzpatrick L. A. et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta // Nat Med. 1999. - № 5(3). - P. 309-313.

71. Hoshino M., Egi T., Terai H. et al. Repair of long intercalated rib defects in dogs using recombinant human bone morphogenetic protein-2 deliveredby a synthetic polymer and beta-tricalcium phosphate // Biomed Mater Res A. -2009.-№90(2).-P. 514-521

72. Hulbert S. F., Young F. A., Mathews S. F. et al. Potential of ceramic materials as permanently implantable skeletal prostheses // J Biomed Mater Res,/ -1970. -№4(3). P. 433-56.

73. Im G. I., Shin Y. W., Lee K. B. Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? // Osteoarthritis Cartilage. 2005. - № 13(10). - P. 845-53.

74. Issa J. P., Defino H. L., Netto J. C. Evaluation of rhBMP-2 and natural latex as potential osteogenic proteins in critical size defects by histomorphometric methods // Anat Rec. 2010. - № 293(5). - P. 794-801.

75. Jacobs J. J., Skipor A. K., Patterson L. M. Metal release in patients who have had a primary total hip arthroplasty. A prospective, controlled, longitudinal study // J Bone Joint Surg Am. 1998. - № 80(10). - P. 1447-1458.

76. Jethva R., Otsuru S., Dominici M. et al. Cell therapy for disorders of bone // Cytotherapy. 2009. - № 11(1). - P. 3-17.

77. Johnstone B., Hering T. M., Caplan A. I. et al. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells // Exp Cell Res. 1998. -№238.-P. 265-272.

78. Jones E., McGonagle D. Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo //Rheumatology (Oxford). 2008. - № 47(2). - P. 126-131.

79. Kamalia N., McCulloch C. A. G., Tenebaum H. C. et al. Dexamethasone recruitment of self-renewing osteoprogenitor cell in chick bone marrow stromal cultures // Blood. 1992. - № 79. - P. 320- 326.

80. Kasten P., Vogel J., Geiger F. et al. The effect of platelet-rich plasma on healing in critical-size long-bone defects // Biomaterials. 2008. - № 29(29). -P. 3983-3992.

81. Katz A. J., Tholpady A., Tholpady S. S. et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells // Stem Cells. 2005. - № 23(3). - P. 412-423.

82. Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue // Stem Cells. 2006. - № 24(5). - P. 1294-1301.

83. Kestendjieva S., Kyurkchiev D., Tsvetkova G. et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord // Cell Biol Int.- 2008. № 32(7). - P. 724-732.

84. Khan M. T., Stockley I., Ibbotson C. Allograft bone transplantation: a Sheffield experience // Ann R Coll Surg Engl. 1998. - № 80(2). - P. 150-153.

85. Kim H., Suh H., Jo S. A. et al. In vivo bone formation by human marrow stromal cells in biodegradable scaffolds that release dexamethasone and ascorbate-2-phosphate // Biochem Biophys Res Commun. 2005.- № 332(4). - P. 1053-60.

86. Kim W. S., Kim H. K. Tissue engineered vascularized bone formation using in vivo implanted osteoblast-polyglycolic acid scaffold // J Korean Med Sei.- 2005. № 20(3). - P.479-482.

87. Komlev V. S., Peyrin F., Mastrogiacomo M. et al. Kinetics of in vivo bone deposition by bone marrow stromal cells into porous calcium phosphate scaffolds: an X-ray computed microtomography study // Tissue Eng. 2006. -12(12).-P. 3449-3458.

88. Kon E., Muraglia A., Corsi A. et al. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones // Biomed Mater Res. 2000. - № 49(3). - P. 328337.

89. Kon E., Filardo G., Delcogliano M. et al. Platelet autologous growth factors decrease the osteochondral regeneration capability of a collagen-hydroxyapatite scaffold in a sheep model // BMC Musculoskelet Disord. 2010. -№27.-P. 11-220.

90. Koshihara Y., Kawamura M., Oda H. et al. In vitro calcification in human osteoblastic cell line derived from periosteum // Biochem Biophys Res Commun. 1987. - № 145. - P. 651.

91. Krampera M., Glennie S., Dyson J. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide // Blood. 2003. - № 101(9). - P. 3722-3729.

92. Kroeze R. J., Helder M. N., Govaert L. E. et al. Biodegradable Polymers in Bone Tissue Engineering // Materials. 2009. - № 2. - P. 833-856.

93. Kruyt M. C., Dhert W. J., Oner C. et al. Optimization of bone-tissue engineering in goats // J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2004. - № 69(2). -P. 113-120.

94. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K. et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells // Exp Hematol. 2003. - № 31(10). - P. 890-896.

95. Lee C. H., Singla A., Lee Y. Biomedical applications of collagen // Int J Pharm. 2001. - № 221(1-2). - P. 1-22.

96. Lee R. H., Kim B., Choi I. et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue // Cell Physiol Biochem. 2004. - № 14(4-6). - P. 311-324.

97. Ling L., Victor N., Cool S. M. Wnt signaling controls the fate of mesenchymal stem cells // Gene. -2009. -№ 433(1-2). P. 1-7.

98. Lucarelli E., Fini M., Beccheroni A. et al. Stromal stem cells and platelet-rich plasma improve bone allograft integration // Clin Orthop Relat Res. -2005. -№(435).-P.62-68.

99. Luria E. A., Owen M. E., Friedenstein A. J. et al. Bone formation in organ cultures of bone marrow // Cell Tissue Res. 1987. - № 248. - P. 449.

100. Mackay A. M., Beck S. C., Murphy J. M. et al Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow // Tissue Eng. 1998. -№ 4. - P. 415-428

101. Majumdar M. K., Wang E., Morris E. A. BMP-2 and BMP-9 promotes chondrogenic differentiation of human multipotential mesenchymal cells and overcomes the inhibitory effect of IL-1 // JCell Physiol. 2001. - № 189. - P. 275-284.

102. Majumdar M. K., Keane-Moore M., Buyaner D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells //J Biomed Sci. 2003. - № 10(2). - P. 228-41.

103. Maniatopoulos C., Sodek J., Melcher A. H. Bone formation in vitro by stromal cells obtained from the bone marrow of young rats // Cell Tissue Res. -1988.-№254.-P. 317.

104. Mark M. P., Prince C. W., Oosawa T. et al. Immunohistochemical demonstration of a 44-KD phosphoprotein in developing rat bones // Histochem Cytochem. 1987. - № 35(7). - P. 707-15.

105. Marmor L. BONE BANKS—A New Concept in Procurement and Storage for Homologous Grafts // Calif Med. 1960. - № 92(6). - P. 407-408.

106. Massague J., Blain S. W., Lo R. S. TGFbeta signaling in growth control, cancer, and heritable disorders // Cell. 2000. - №103(2). - P. 295-309.

107. Mastrogiacomo M., Muraglia A., Komlev V. et al. Tissue engineering of bone: search for a better scaffold // R. Orthod Craniofac Res. 2005. - № 8(4). -P. 277-284.

108. Mudali K., Sridhar T., Baldev R. Corrosion of bio implants // Sadhana. 2003. - № 28 (3, 4). - P. 601-637.

109. Nakae J., Kitamura T., Kitamura Y. et al. The forkhead transcription factor Foxol regulates adipocyte differentiation // Dev Cell. 2003. - № 4(1). - P. 119-129.

110. Niemeyer P., Szalay K., Luginbtihl R. et al. Transplantation of human mesenchymal stem cells in a non-autogenous setting for bone regeneration in a rabbit critical-size defect model // Acta Biomater. 2010. - №. 6(3). - P. 900-8.

111. Nordsletten L. Recent developments in the use of bone morphogenetic protein in orthopaedic trauma surgery // Curr Med Res Opin. 2006. - № 22. - P. 13-17; 23.

112. Paley D., Maar D. C. Ilizarov bone transport treatment for tibial defects // J Orthop Trauma. 2000. - № 14(2). - P. 76-85.

113. Palmer S. H., Gibbons C. L., Athanasou N. A. The pathology of bone allograft // J Bone Joint Surg Br. 1999. - № 81(2). - P. 333-335.

114. Pelker R. R., Friedlaender G. E., Markham T. C. Biomechanical properties of bone allografts // Clin Orthop Relat Res. 1983. - №(174). - P. 54-57.

115. Petite H., Viateau V., Bensaid W. et al. Tissue-engineered bone regeneration // Nature Biotechnology. 2000. - № 18. - P. 959 - 963.

116. Phinney D. G., Kopen G., Righter W. et al. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells // J Cell Biochem. 1999. - № 75(3). - P. 424-36.

117. Pietrzak W. S., Woodell-May J., McDonald N. Assay of bone morphogenetic protein-2, -4, and -7 in human demineralized bone matrix // J Craniofac. Surg. 2006. - №17(1). - P. 84-90

118. Pietrzak W. S., Perns S. V., Keyes J. et al. Demineralized Bone Matrix Graft: A Scientific and Clinical Case Study Assessment // J.of Foot and Ankle Surg. 2005. - № 44(5). - P. 345-353.

119. Pittenger M. F., Mackay A. M., Beck S. C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. 1999. - № 284(5411). - P. 143-147.

120. Plumas J., Chaperot L., Richard M. J. et al. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells // Leukemia. 2005. - № 19(9). - P. 15971604.

121. Reyes M., Verfaillie C. M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells // Ann N Y Acad Sei. -2001. -№ 938. P. 231-233.

122. Rho G. J., Kumar B. M., Balasubramanian S. S. Porcine mesenchymal stem cells-current technological status and future perspective // Front Biosci. -2009.-№14.-P. 3942-3961.

123. Rodríguez J. P., González M., Ríos S. et al. Cytoskeletal organization of human mesenchymal stem cells (MSC) changes during their osteogenic differentiation // J Cell Biochem. 2004. - № 93(4). - P. 721-731.

124. Rosen E. D., Walkey C. J., Puigserver P. et al. Transcriptional regulation of adipogenesis II Genes Dev. 2000. - № 14(11). - P. 1293-1307

125. Sakaguchi Y., Sekiya, Yagishita K. et al. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source // Arthritis Rheum. 2005. - № 52(8). - P. 2521-2529.

126. Sampath T. K., Reddi A. H. Importance of geometry of the extracellular matrix in endochondral bone differentiation // J Cell Biol. 1984. - № 98(6).-P. 2192-2197.

127. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro II Exp Neurol. 2000. -№ 164(2). - P. 247-256.

128. Scala M., Gipponi M., Mereu P. et al. Regeneration of mandibular osteoradionecrosis defect with platelet rich plasma gel // In Vivo. 2010. - №. 24(6).-P. 889-93.

129. Schoeters G. E., de Saint-Georges L., Van Den Heuvel V. et al. Mineralization of adult mouse bone marrow cells in vitro // Cell Tissue Kinet/ -1988. -№21(5).-P. 363-74.

130. Sekiya I., Colter D. C., Prockop D. J. BMP-6 enhances chondrogenesis in a subpopulation of human marrow stromal cells // Biochem Biophys Res Commun. 2001. - № 284. P. 411-418.

131. Sekiya I., Larson B. L., Smith J. R. et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality // Stem Cells. 2002. - № 20(6). - P. 530541.

132. Shakhbazau A. V., Goncharova N. V., Kosmacheva S. M. Plasticity of human mesenchymal stem cell phenotype and expression profile under neurogenic conditions // Bull Exp Biol Med. 2009. - № 147(4). - P. 513-516.

133. Shen B., Wei A., Whittaker S. et al. The role of BMP-7 in chondrogenic and osteogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in vitro IIJ Cell Biochem. 2010. - № 109(2). - P. 406416.

134. Shur I., Marom R., Lokiec F. et al. Identification of cultured progenitor cells from human marrow stroma // J Cell Biochem. 2002. - № 87(1). -P. 51-57.

135. Singaravelu K., Padanilam B. J. In vitro differentiation of MSC into cells with a renal tubular epithelial-like phenotype // Ren Fail. 2009. - № 31(6). -P. 492-502.

136. Sotiropoulou P. A., Perez S. A., Gritzapis A. D. et al. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells // Stem Cells. -2006. -№24(1). -P. 74-85.

137. Stephan S. J., Tholpady S. S., Gross B. et al. Injectable tissue-engineered bone repair of a rat calvarial defect // Laryngoscope. 2010. - № 120(5).-P. 895-901.

138. Subramanian M., Colvard D., Keeting P. E. et al Glucocorticoid regulation of alkaline phosphatase, osteocalcin, and proto-oncogenes in normal human osteoblast like cells // J Cell Biochem. 1992 - № 50 - P. 411-24.

139. Tabera S., Pérez-Simón J. A., Diez-Campelo M. et al. The effect of mesenchymal stem cells on the viability, proliferation and differentiation of B-lymphocytes //Haematologica. 2008. - № 93(9). - P. 1301-1309.

140. Taggard D. A., Menezes A. H. Successful use of rib grafts for cranioplasty in children // Pediatr Neurosurg. 2001. - № 34(3). - P. 149-155.

141. Takagi M., Umetsu Y., Fujiwara M. et al. High inoculation cell density could accelerate the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells to chondrocyte cells // J Biosci Bioeng. 2007. - №103. - P. 98-100.

142. Tang Q. Q., Otto T. C., Lane M. D. Mitotic clonal expansion: a synchronous process required for adipogenesis // Proc Natl Acad Sci US A.-2003.-№100(1).-P. 44-49

143. Teplyashin A. S., Koijikova S. V., Sharifullina S. Z. et al. Characteristic of human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and adipose tissue // Tsitologia. 2005. - № 2. - P. 130-135.

144. Teplyashin A. S., Chyupikova N. I., Korjikova S. V. et al. Comparative analysis of cell populations with phenotype similar to mesenchymal stem cells derived from subcutaneous fat // Tsitologia. 2005. - № 7. - P. 637-643.

145. Teplyashin A. S., ChupikovaN. I., Koijikova S. V. et al. Formation of human three-dimensional transplants of bone tissue / Proceedings of the 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society Munich, Germany. 2005c.-P. 343.

146. Tracy R. P., Andrianorivo A., Riggs B. L. et al. Comparison of monoclonal and polyclonal antibody-based immunoassays for osteocalcin: a study of sources of variation in assay results // Bone Miner Res. 1990. - № 5(5). - P. 451-461.

147. Tse W. T., Pendleton J. D., Beyer W. M. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation // Transplantation. 2003. - № 75(3). - P. 389-97.

148. Uhthoff H. K., Boisvert D., Finnegan M. J. Cortical porosis under plates. Reaction to unloading or to necrosis? // Bone Joint Surg Am. 1994. - № 76.-P. 1507-1512.

149. Uo M., Watari F., Yokoyama A. et al. Tissue reaction around metal implants observed by X-ray scanning analytical microscopy // Biomaterials. -2001. -№22(7). -P. 677-685.

150. Valimaki V. V., Aro H. T. Molecular basis for action of bioactive glasses as bone graft substitute // Scand J Surg. 2006. - № 95(2). - P. 95-102.

151. Vasconcellosa L. M. R., Oliveirab M. V., Gra9ac A. et al. Porousj

152. Titanium Scaffolds Produced by Powder Metallurgy for Biomedical Applications // Materials Research. 2008. - № 11(3). - P. 275-280.

153. Vehof J. W., Haus M. T., de Ruijter A. E. et al. Bone formation in transforming growth factor beta-I-loaded titanium fiber mesh implants // Clin Oral Implants Res. 2002. - № 13(1). - P. 94-102.

154. Violini S., Ramelli P., Pisani L. F. et al. Horse bone marrow mesenchymal stem cells express embryo stem cell markers and show the ability for tenogenic differentiation by in vitro exposure to BMP-12 // BMC Cell Biol. 2009. -№10.-P. 29.

155. Volk S. W., Diefenderfer D. L., Christopher S. A. et al. Effects of osteogenic inducers on cultures of canine mesenchymal stem cells // Am J Vet Res. 2005. - № 66(10). - P. 1729-1737.

156. Wakitani S.5 Saito T., Caplan A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine // Muscle Nerve. -1995. -№ 18(12). P. 1417-1426.

157. Wang J. C., Alanay A., Mark D. et al. A comparison of commercially available demineralized bone matrix for spinal fusion // Eur Spine J. 2007. - № 16(8).-P. 1233-1240.

158. Wang Z, Goh J. et al. Efficacy of bone marrow-derived stem cells in strengthening osteoporotic bone in a rabbit model // Tissue Eng. 2006. - № 12(7). -P. 1753-1761.

159. Wen C., Yamada Y., Hodgson P. Fabrication of novel metal alloy foams for biomedical applications // Materials forum. 2005. - № 29. - P. 274-278.

160. Winter A., Breit S., Parsch D. et al. Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheroids: a comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells // Arthritis Rheum. 2003. - № 48(2). - P. 418-429.

161. Woodbury D., Schwarz E. J., Prockop D. J. et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons // D. Woodbury, , I.B. Black // J Neurosci Res. 2000. - № 61(4). - P. 364-370.

162. Xu W., Zhang X., Qian H. et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro // Exp Biol Med (Maywood). 2004. - № 229(7). - P. 623-31.

163. Yilgor P., Hasirci N., Hasirci V. Sequential BMP-2/BMP-7 delivery from polyester nanocapsules // Biomed Mater. 2010. - № 93(2). - P. 528-536.

164. Young C. S., Terada S., Vacanti J. P. et al. Tissue engineering of complex tooth structures on biodegradable polymer scaffolds // J Dent Res. 2002. - №81(10).-P. 695-700.

165. Zeile G. Intracytoplasmic immunofluorescence in multiple myeloma // Cytometry. 1980. - №1(1). - P. 37-41.

166. Zhang M., Powers Jr R. M., Wolfinbarger Jr. L. Effect(s) of the demineralization process on the osteoinductivity of demineralized bone matrix // J Periodontol. 1997. - №68(11). - P. 1085-1092.

167. Zhang Z. X., Guan L. X., Zhang K. et al. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro // J.Cell Biol Int. 2007. - № 31(6). - P. 645-648.

168. Zippel N., Schulze M., Tobiasch E. Biomaterials and mesenchymal stem cells for regenerative medicine // Recent Pat Biotechnol. 2010. - № 4(1). -P. 1-22.

169. Zohar R., Sodek J., McCulloch C. A. Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry // Blood. 1997. - № 90(9). - P. 34713481.

170. Zuk P. A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol Biol Cell. 2002. - № 13(12). - P. 4279-4295.

171. Zuk P. A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue Eng. 2001. - № 7(2). - P. 211-228.

172. Zuki A., Fadilah A., Zamri-Saad M. et al. Post-implantation Evaluation of the Natural Coral (Porites sp.) and Calcium Phosphate Cement in

173. Sheep Femur: A Comparative Study // Asian J. of Animal and Veter. Adv. 2006. -№ 1(1).-P. 1-12.