Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза

Болдырев, Александр Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза"

□03484232

На правах рукописи

БОЛДЫРЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

Получение и оценка рекомбинантных видоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2009

003484232

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Научные руководители:

кандидат химических наук Туманов Юрий Васильевич

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

кандидат медицинских наук Букин Евгений Константинович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи (г. Новосибирск)

Защита состоится « 20 » _ноября_ 2009 г. в _ч. на заседании

диссертационного совета Д 208.020.01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (383)-336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан «_» _октября_ 2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

Карпенко Л.И.

Актуальность проблемы. Туберкулёз - социально опасная инфекционная болезнь человека. Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида М. tuberculosis, в России инфицировапность превышает 80%. По заболеваемости и числу больных туберкулёзом Россия по-прежнему входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулёзу. По данным ВОЗ за 2007 г., число впервые выявленных заболевших туберкулёзом в нашей стране составило 157 тыс. (110 на 100000 населения). Из них 68 тыс. выявлены как положительные по результатам микроскопии мазка. Общее число больных туберкулёзом на конец 2007 г. составило 164000. Распространение ВИЧ-инфекции становится отягощающим фактором для активизации туберкулёзной инфекции: 26240 заболевших от общего числа больных туберкулёзом являлись ВИЧ-позитивными. Таким образом, доля ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом в нашей стране достигла 16 % (WHO Report 2009). Число смертей составило 20000 (среди не инфицированных ВИЧ) и 5100 - нз числа ВИЧ-инфицированных. Смертность ВИЧ-позитивных пациентов в -70 % случаев связана именно с туберкулёзом.

Возбудителем туберкулёза являются бактерии рода Mycobacterium, среди которых этиологическое значение имеют М. tuberculosis и реже М. africanum и М. bovis (Djelouadji Z. et. al., 2008). Для предотвращения распространения туберкулёза в настоящее время актуальное значение приобретает своевременная и достоверная лабораторная диагностика этого заболевания.

Традиционные методы диагностики, такие как флюорография и бактериоскопия мокроты, не всегда эффективны. Бактериологический метод занимает много времени - даже основывающийся на обнаружении роста микобактерий в присутствии флуоресцентного красителя (Ardito F. et al., 2001). Ежегодная туберкулинодиагностика - основной и до сих пор единственный метод в нашей стране, с помощью которого определяется напряжённость иммунной системы у детей и подростков, - также не всегда отвечает предъявляемым требованиям. Молекулярно-биологические методы позволяют достаточно быстро с высокой специфичностью и чувствительностью проводить выявление и типироваиие микобактерий в различных клинических образцах. Но даже полимеразная цепная реакция (ПЦР), один из самых чувствительных современных методов молекулярной диагностики, не позволяет выявить всех больных, так как для ей проведения требуются микобактерии или ДНК/РНК, выделенная из них. Существенным недостатком ПЦР также является невозможность оценить активность туберкулёзного процесса. Наряду с этими методами основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. Её основной проблемой остаётся низкая специфичность и чувствительность применяемых антигенов. Причиной кросс-реактивности белковых антигенов М. tuberculosis является присутствие гомологичных белков других микроорганизмов, дающих перекрёстные реакции с иммуноглобулинами сыворотки здоровых пациентов. Поэтому результаты рутинного иммунологического обследования группы вакцинированных больных обычно оказываются малоинформативными.

туберкулёза, например гамма-интерфероновый анализ (у-ИФН-анализ), сегодняшний день оказывается и своевременным, и в значительной CTenei достоверным: время выполнения анализа занимает не более 2-х сут (чувствительность в пределах 90 %, а специфичность приближается к 100 %). у-ИФ анализ в настоящее время является одним из самых эффективных методов j детекции у-ИФН, секретирующегося при стимуляции Т-клеток in vitro белковы антигенами М. tuberculosis. Высокая разрешающая способность этого мето позволяет оценивать антигенстимулированную продукцию цитокинов, что оче важно для оценки специфического иммунного ответа. Так, если за рубежом наиболее развитых странах проблема диагностики туберкулёза с помощью эт методов практически решена (имеются тест-системы), в России её решение находит на начальном этапе. Новый тест, основанный на исследовании антигенспецифическ Т-лимфоцитов, позволяет раньше диагностировать туберкулёз, чем кожш туберкулиновые пробы. Разработка иммунологических Т-клеточных тест-сист является крайне важной для нашей страны и в настоящее время входит в разр наиболее актуальных проблем современной медицины.

Цель работы. Целью настоящего исследования являлись получение и оцен пригодности рекомбинантных видоспецифичных белков Mycobacterium tubérculo для диагностики туберкулёза с помощью иммуноферментного и у-интерфероново анализа.

Основные задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходи было решить следующие задачи:

- провести, руководствуясь литературными данными, теоретический анализ выбору видоспецифичных высокоиммуногенных антигенов М tuberculosis-,

- сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующ видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis',

- оптимизировать условия для биосинтеза рекомбинантных белков;

- подобрать условия для выделения и очистки рекомбинантных белков;

- оценить полученные рекомбинантные видоспецифичные белки М. tuberculosis i пригодность для использования их в диагностике туберкулёза;

- провести сравнительный анализ результатов, полученных с использовани рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis, с результатам полученными с помощью ПЦР-анапиза.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые на осно плазмиды pGEX-2T были сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущ гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М tubérculos такие как ESAT-6, CFP10 и МРТ64.

' Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм Е. coli BL21 позволи получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих в своей N-концев части аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве белк носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитнь белков в растворимой форме.

Впервые для проведения иммуноферментного (ИФА) и у-интерферонового анапи для выявления больных туберкулёзом и подтверждения (опровержения) диагно туберкулёз в диагностических целях использованы рекомбинантные белк содержащие на N-конце аминокислотную последовательность глутатионтрансфераз в качестве вспомогательного белка.

Применение рекомбинантных белков без проведения протсолитического расщепления его на два фрагмента - белок-носитель и целевой белок - сокращает существенно время до получения целевого белка, необходимого для выполнения ИФА и у-ИФН-анализа.

Результаты диссертационной работы могут служить основанием для того, чтобы, используя полученные рекомбинантные белки (rESAT-6 и rCFPlO), приступить к разработке тест-системы для диагностики туберкулёза, основывающейся на у-ИФН-анализе, и внедрению её в клинико-диагностические лаборатории специализированных лечебных учреждений и общей лечебной сети, в частности (постановка метода занимает от 1,5 до 2-х суток, чувствительность рекомбинантных белков находится в пределах 80-100 %, а специфичность - в пределах 82-100 %). Положения, выносимые на защиту.

1. Плазмиды pTSE6, рТВ232 и рТВ323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки Е. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулеза.

2. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 применимы в качестве компонента в иммуноферментном и у-интерфероновом анализе при диагностике туберкулёза (без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка).

3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPlO и гДМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, обязательными компонентами которых являются полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающие гены, кодирующие секретируемые белки М tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, может быть использована как составная часть технологической схемы для разработки лабораторного регламента по производству этих белков.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы представлены автором в форме доклада на III Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (27-29 сентября 2006 г., Новосибирск) и конференциях, указанных в списке «Докладов и тезисов» в конце автореферата.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из «Введения», трёх глав: «Обзора литературы», «Материалов и методов» и «Результатов и их обсуждения», «Заключения», «Выводов» и «Списка литературы». Работа изложена на 194 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 13 таблиц. Библиография включает 249 наименований, из которых 10 отечественных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование рекомбинантных молекул, несущих гены, кодирующие высокоиммуногенные видоспецифичные белки М. tuberculosis

На первом этапе создавали генетические конструкции, которые обеспечивали после введения в клетки бактерий Е. coli продукцию видоспецифичного рекомбинантного белка, содержащего в своей С-концевой части аминокислотную последовательность

(АП) целевого белка М. tuberculosis - ESAT-6 (pTSE6), CFP10 (рТВ232) или МРТ64 (полный и не содержащий лазерного пептида белок) (рТВ323 и pTSM64 соответственно) (рис. 1). В качестве экспрессируюгцего вектора использовали коммерческую плазмиду pGEX-2T (ApR) (Pharmacia Biotech, Швеция), содержащую высокоэффективный /ас-промотор под контролем Lac-penpeccopa, ген глутатион-S-трансферазы (GST) с нуклеотидной последовательностью (НП), кодирующей сайт протеолиза для протеазы тромбин, и терминатор транскрипции.

Дизайн НП олигодезоксирибонуклеотидов для синтеза ампликонов, содержащих гены, кодирующие интересуемые белки, проводили по программе на сайте http://www.basic.northwestern.eduAiotools/oIigocalc.htrn!, используя НП генов, найденные на сайте http://genolist.pasteur.fr/TubercuList. Белку ESAT-6 соответствует ген esxA, CFP10 - esxtí и ДМРТ64 - mpt64. Синтез олигонуклеотидов, содержащих, кроме видоспецифичной НП, дополнительную - для сайтов эндонуклеаз рестрикции (ЭР) ВатШ (в прямом праймере) и ЕсоШ (в обратном праймере), был выполнен научным сотрудником Центра Ю.А. Горбуновым В качестве матрицы для синтеза ампликонов с помощью ПЦР использовали геномную ДНК штамма М tuberculosis H37Rv и Гад-полимеразу производства «Сибэнзим» (г. Новосибирск).

Для амплификации интересуемых генов были использованы праймеры: для ESAT-6:

Fesa, - 5'-GAGGATCCATGACAGAGCAGCAGTGG-3', R^sa, - 5'-GCGAATTCTAAACACGAGAAAGGGCG-3';

Pst I

Рис. 1. Кольцевые рестрикционные карты полученных рекомбииантных плазмид. pTSE6 обеспечивает синтез rESAT-6, рТВ232 - iCFPIO и рТВ323 - синтез гДМРТ64 (гМРТ64 без лидерного пептида длиною 23 N-концевьк а.о.). Толстой стрелкой на карте отмечено положение гена, кодирующего рекомбинантный белок. Карта плазмиды pTSM64 не приводится, так как рекомбинантный белок не был обнаружен в растворимой форме (для построения использована программа, размещённая на сайте http://tools.neb.com/NEBcutter2/mdex.php)

Psti

для СИР 10:

Бсгр - З'-САООАТССАТСОСАОАСАТСААСАСС-З', Ясф - З'-СССААПСТАТТАСССОСТСАСААСС-З'; для ДМРТ64 и МРТ64:

Рдтр,б4 - 5'-ССО^ГССССОСССЛЛСАССТАСТО-3', Ртр,б4 - 5'-СОООАТССОТССОСАТСААОАТСТГ-3'.

Лтр1м - 5'-СООМЦССТССТСССОАСТСТАОО-3' - общий для двух ампликоиов.

Ампликоны (рис. 2) обрабатывали одновременно ЭР ВатШ и £соЯ1 («Сибэнзим», г. Новосибирск) и клонировали в вектор по ВатШ- и £соЫ-сайтам.

1 -К 2

(М1>)<00 пи 32.» ген"

*4б п.*

■ ?00 П.Н. (МФ) 100 п.к. (МФ)

у|100п.н.(МФ) Б ■■.:-.•.■-.:;

Пр

Рис. 2. Электрофорс граммы в 1,2 % агарозиом геле амплификатов генов 1А - esxB, ЗА -esxA и 1Б - Ampi64, получмтых с помощью ПЦР. 2А и 2Б - МФ (маркёры длины фрагментов ДНК в п.п.), Пр - не использованные в реакции праймеры

Эффективность протекания лигазной реакции контролировали с помощью ПЦР. Обнаружение ампликона в геле агарозы размером, большим на 160 п.н., чем длина искомого клонируемого гена, являлось основанием для использования лигазной смеси для трансформации компетентных клеток К coli. Особенность этой реакции в том, что праймеры гибридизуются с НП векторной молекулы по разные стороны от НП полилинкера (рис. 3). Поэтому образование ожидаемого ампликона в ПЦР возможно только после объединения НП вектора и клонируемого ДНК-фрагмента.

Поиск интересуемых клонов проводили непосредственно из колоний внесением небольшого количества клеток в реакционную смесь (colony PCR), содержащую те же праймеры, что и для контроля лигазной реакции, - FpGex и RpGEx- Такой подход облегчает скрининг большого числа клонов, минуя операцию выделения рекомбинантной ДНК, необходимую для обнаружения вставки с помощью ПЦР или рестрикционного анализа.

841 ccaecaaeta tataecalez cctttgcagg getggeaage cacgtttggt ggtggcgacc

FpGEX Smal

901 atcctccaaa ateggatetg gttccgcgtG GATCCCCGGG AATTCatcgt gactgactga

BamHI EcoRl

961 cgatctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg etgaaaaccf ctzacacatg caectcccge

RCpOEX

1021 agaeggteae agettgtetg taageggatg ccgggagcag acaagcccgt eagggegegt Рис. 3. Участок НП векторной плазмиды pGEX-2T, прилегающий к полилинкеру (выделен прописными буквами). Курсивом с подчеркиванием выделены НП праймера Fjcex и последовательности, комплементарной последовательности обратного праймера, RCpQEX-Нумерация нуклеотидов соответствует нумерации в плазмиде pGEX-2T (U13850) 2. Обнаружение клонов, продуцирующих рекомбинантные белки Из множества полученных клонов, содержащих одну и ту же плазмидную ДНК с интересуемым геном, засевали по отдельности от 4 до 10 колоний. Экспрессию гена

осуществляли в штамме Е. coli BL21. В качестве контроля для определения выход белка засевали параллельно два образца культуры BL21/pGEX-2T, обеспечивающу! продукцию GST: клетки одного образца • индуцировали, другого - нет (контрол проведения индукции). В качестве дополнительного контроля засевали исходну! культуру BL21 (не содержащую плазмиды) для демонстрации на электрофореграмм картины хозяйских белков (в ходе культивирования индуктор в неё не вносили После анализа лизатов, полученных из этих культур, с помощью ЭФ по Лэммл выбирали единственный клон, обеспечивающий максимальный выход белк Аналогичным способом отбирали клоны для продукции остальных интересуемы белков. В качестве маркёров молекулярных масс белков (МБ) на начальном этапе дл определения местоположения искомого белка использовали смесь двух стандартны белков - овальбумина (44 кДа) и химотрипсиногена А (24 кДа) (рис. 4). Далее большинстве случаев ориентировались по расположению в геле клеточных белко конкретного штамма Е. coli.

44 кДа Овальбум

МБ BLil BLil/pTSBS

32 кДа ~Г rESAT-6

24 кДз

Хнмотрип

Рис. 4. Электрофореграмма лиза культуры клеток ВЬ21/рТ8Е6, содержащ рекомбинантный белок гЕБАТ-б, в 12 ПАА-геле (денатурирующие условия), дорожках слева направо МБ - маркёр молекулярных масс белков: Химотрип химотрипсиноген А, Овальбум овальбумин, белки лизатов культур клето ВЬ21 - бесплазмвдный штамм ВЬ21/рТ5Е6 - штамм-продуци рекомбинантного белка гЕБАТ-

НП клонированного гена после окончательного отбора клона, продуцирующег интересуемый белок, подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Вс рекомбинантные плазмиды, выделенные из отобранных штаммов-продуценто содержали НП клонированных генов, идентичную НП этих генов из штамма tuberculosis H37Rv.

Далее были подобраны условия культивирования клеток для наработк рекомбинантных белков:

rESAT-6: до индукции - 1,5-2 ч, 37 °С, 180 об/мин; индукция - 0,1 мМ ИПТГ продолжение культивирования 3 ч при тех же условиях;

" rCFPIO и ГАМРТ64 (гМРТ64): до индукции - 2,5-3 ч, 37 °С, 180 об/мин; индукция 0,5 мМ ИПТГ и продолжение культивирования 5-6 ч, 37 "С. Три рекомбинантнь белка, за исключением гМРТ64, были обнаружены в растворимой форме цитоплазме и далее нарабатывались в препаративных количествах. Поскольку м ставили своей задачей исследовать рекомбинантные белки в растворимой форм третичная структура которых, на наш взгляд, наиболее идентична третично структуре природного белка, то белок гМРТ64 впоследствии не исследовали.

Чтобы убедиться, что рекомбинантные белки, наблюдаемые н электрофореграммах, это те, которые нас интересуют, из гелей их переносили н нитроцеллюлозные фильтры, которые обрабатывали моноклональными антителам (МКА) 2НЗ-19 к GST (рис. 5Б и 6Б).

12 3 4

f' " f *|CÍT10<3) 40 кДа

csx a¡- yg*""' *

Z6 кДа I

3 4

40 кДа rCFPIO (J)

rESAT-6 (4)

OST (2) ¿6 кДа

А Б

Рис. 5. Детекция рекомбинаитных продуктов экспрессии клонированных генов esxA (rESAT-6) и esxB (iCFPIO) М. tuberculosis в штамме Е. coli BL21.

А - электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 -BL21, 2 - BL21/pGEX-2T (GST), 3 - BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 - BL21/pTSE6 (rESAT-6).

Б - иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с МКА к GST: 1 - BL21, 2 - BL21/pGEX-2Т (GST), 3 BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 -BL21/pTSE6 (rESAT-6)

12 3 4

GSTj 26 кДа

12 3 4

ГДМРТБ4

ЗОкДа

rCFPIO

, f •'{"-i

t ГДМРТ64 50 кДа

rCFPIO

40 кДа

GST

26 кДа

Рис. 6. Детекция рекомбинаитных продуктов экспрессии клонированных генов esxB (rCFPIO) и укороченного mpt64 (гДМРТ64) М. tuberculosis в штамме Е. coli BL2I.

А - электрофорез в 12 % ДСН-ПААГ клеточных лизатов штамма: 1 -BL21, 2 - BL21/pGEX-2T (GST), 3 - BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 BL21/pTB323 (ГДМРТ64). Б - иммуноблотинг лизатов соответствующих штаммов с МКА к GST: 1 - BL21, 2 - BL21/pGEX-2Т (GST), 3 BL21/pTB232 (rCFPIO), 4 BL21/рТВ323

(ГДМРТ64)

Как видно из рис. 5А и 6А, видимая деградация рекомбинаитных белков не была замечена. Белки нарабатывались с высоким выходом: положение их на электрофоре граммах соответствовало расчётным значениям молекулярной массы (м.м.) Однако взаимодействие белков на блотах с МКА к GST выявило дополнительно несколько минорных полос. Они (рис. 5Б и 6Б) соответствовали белкам с м.м. большей, чем м.м. GST, но меньшей, чем м.м. рекомбинантного белка. По-видимому, ограниченной протеолитической деградации, хотя и в незначительной степени, подвергается только С-концевая часть рекомбинаитных белков rCFPIO и гДМРТ64, и только rESAT-б деградирует значительно сильнее (рис. 5Б). Таким образом, местоположение в геле искомых белков было подтверждено. По результатам электрофоретического анализа м.м. рекомбинаитных белков (rESAT-6, rCFPIO, ГДМРТ64) соответствовала расчётным значениям - 32, 40 и 48,8 кДа. Уровень их синтеза, за исключением rESAT-б, составил около 20 % суммарного клеточного белка, что позволило получать до 2,5 мг рекомбинантного антигена с 1 л культуральной среды. Уровень продукции rESAT-б составил 2-4 % суммарного клеточного белка.

3. Выделение и очистка рекомбинантных белков

Слитные рекомбинантные белки выделяли с помощью аффинной хроматографии н глутатионсефарозе 4В. После элюции обычно получали препарат очищенного белка концентрацией 1 мг/мл. Чистоту белка оценивали электрофоретически. Рис. 7 и иллюстрируют очистку белков гЕвАТ-б и гСРРЮ. Из рис. видно, что после каждо" элюции в геле наряду с основным рекомбинантным белком имеются минорные белки представляющие собой ряд дискретных полос. Этими белками, как было определено являлись клеточные белки, от которых удалось освободиться введением 2-3-промывок ФБС с 1 % тритона Х-100.

1 2 3 4 5 rESAT-6 щ» rESAT-6

2бкД. ' ÍT^

Рис. 7. Дробная элюция рекомбинантног белка гЕЯАТ-б с глутатионсефарозы Электрофореграмма ДСН-ПААГ

показывающая этапы выделения белка: 1 осветлённый соникат ВЬ21/рТ8Е6 д нанесения на глутатионсефарозу качестве сорбента, рекомбинантный бело после п-ой элюции с одной колонки: 2-1 ой, 3 - 2-ой, 4 - 3-й, 4 - 4-й

ГСГР10

Рис. 8. Дробная элюция 2-х партий (1-я дорожки 1-4, и 2-я - дорожки 5-8) гСРРЮ рекомбинантного белка гСРРЮ

<- глутатионсефарозы. Электрофореграмм

ДСН-ПААГ, показывающая этапь выделения белка: рекомбинантный бело после п-ой элюции с одной колонки: дорожки 1, 5 - после 1-ой, 2, 6 - 2-й, 3, 7 3-й, 4, 8 - 4-й

Оптимизация условий промывки и элюции рекомбинантных белков с аффинной колонки позволила получать уже после 1-ой элюции препарат, гомогенный на 98У (рис. 9, дорожка 2).

12 3 4

1АМРТ64 -г

ГДМРТ64

Рис. 9. Электрофореграмма аффинно очищенного рекомбинантного белка ГАМРТ64. 1 - лизат BL21/pTB323 (гДМРТ64); аффинно очищенный бело гДМРТ64: 2 - 1-я элюция; 3 - 2-я элюция; 4 - 3-я элюция

Цифровая обработка электрофореграммы показала, что чистота белка после аффинной хроматографии достигает 95-98 %. Выход белка после первой элюци составляет не менее 66 % адсорбированного белка, после второй - 27%, третьей - 7%.

Используя результаты этого исследования, была предложена технологическая схем для наработки рекомбинантных микобактериальных белков в Е. coli, включающая создание генетических конструкций, несущих слитный ген GST с секретируемым антигеном М. tuberculosis, введение их в штамм Е. coli BL21 или его производные, которые в определённых условиях обеспечивают продукцию рекомбинантного белка

в растворимой форме. На рис. 10 представлена схема получения, выделения и очистки такого типа белка.

НК Е coli BL21/pGST-P (1 :100)

•i

160 мл среды LB (YT) I Ар

|Дезинтегратор|

Ферментёр (п «150 мл)

культивирование до ОП600 0,3-0,8 37°С 200 об/мин 1,6-3 ч

отбор пробы,

р-р ИГ1ТГ -

культивирование ИК 37°С 200 об/мин 3-5 ч

КК (слив)

охлаждение до 0 - 4 "С 51

| Центрифуга 11

центрифугирование 4000Q 15 мин 4'С

5 млвТЕ

усадок клеток—8 мл ФБСГ PMSF

Встряхиватель (вортекс)

| промывание! ¡Центрифуга 2 |

центрифугирование 4000а 6 мин 4'С

обработка ультразвуком ЗхЗОс_

инкубирование 30 мин 0 "С

.р-рТХ-100 (до 1 %)

Ж.

I Центрифуга 21

центрифугирование 16000g 5 мин ОТ

дебрис

НЖ

ЁМКОСТЬ|£ (бюкс)

ОД мл суспензия ГС

¡перемешивание 30 мин|

16 i

Колонка L

f 18 |промывание|

■ Б2 ' Б1

|злюция|^~

Р-РГ

рекомбинантный белок

п- количество колб на 0,7-1,0 л ТХ-100 - тритон Х-100 НК- ночная культура ГС - глутатионсефароза

ИК- индуцированная культура Б - буфер НЖ-надосадочная жидкость Г-глутатион

Рис. 10. Принципиальная схема получения рекомбинантного белка GST-P

4. Испытание рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis в ИФА, у-ИФН-ачалнзе на клинических изолятах крови

Второй этап исследования включал использование рекомбинантных белков в иммунодиагностике туберкулёза на образцах клинических изолятов, полученных от больных туберкулёзом. Далее приводятся выборки, использованные в работе:

1. Диагностическое значение рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO в ИФА проверяли на панели из 34 сывороток, собранных от пациентов, больных туберкулёзом. Контрольная группа включала сыворотки 470 пациентов, не болеющих туберкулёзом.

2. Рекомбинантный белок ГДМРТ64 проверяли на выборке из 147 сывороток. Изоляты этих выборок получены из Клинического центра «Фтизиатрия» (г. Новосибирск).

3. Проверку чувствительности и специфичности рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO с помощью у-ИФН-анализа проводили на образцах крови, поступавшими

периодически небольшими партиями. Забор крови производился у больнь туберкулёзом пациентов и здоровых доноров. В общем было получено 114 и 14е образцов соответственно (табл. 1 и 2).

4. Для определения чувствительности и специфичности рекомбинантных белко rESAT-6 и rCFPIO с помощью у-ИФН-анализа при выявлении различных фор туберкулёза лёгких были получены образцы крови от пациентов с установлений! формой заболевания общим количеством 67 (табл. 3).

5. Для испытания рекомбинантных белков в у-ИФН-анализе от пациентов подозрением на туберкулёз были получены:

а) 20 образцов цельной крови (табл. 4) и б) 18 образцов цельной крови (дл выделения мононуклеарных клеток) (табл. 5) и 18 проб цельной крови от здоровь доноров (табл. 5).

6. 38 изолятов мокрот, соответствующих образцам крови от пациентов подозрением на туберкулёз лёгких, были получены для подтверждения туберкулёза помощью ПЦР.

Все клинические изоляты выборок 3-6 получены из областной клиническо туберкулёзной больницы г. Томска

7. 1350 клинических изолятов культур клеток микобактерий М tuberculosi получены из НИИ туберкулёза (г. Новосибирск) и Клинического центр «Фтизиатрия» (г. Новосибирск).

Очищенные антигены проверяли с помощью ИФА и у-ИФН-анализа Иммуноферментным анализом в крови больных туберкулёзом выявлял видоспецифические иммуноглобулины, а с помощью у-ИФН-анализа определял концентрацию у-ИФН, который секретируется Т-лимфоцитами в результа стимуляции их рекомбинантными белками.

4.1. Рекомбинантные белки в иммуноферментном анализе

N-концевая АП полученных нами слитных белков включает АП GST, С-концевая АП целевого антигена. GST способствует повышению растворимости слитного белк и используется для его выделения с помощью аффинной хроматографии (Cabrita L.D et al., 2006). Расщепление рекомбинантного белка может быть проведено с помощь тромбина, результатом которого будут белки GST и целевой антиген. Первичн-структура последнего близка к АП природного белка, отличаясь наличием на N-конц дипептида - GlySer. Поскольку отщепление GST от целевого антигена усложня процедуру выделения этого антигена в чистом виде, мы решили убедиться необходимости проведения такой дополнительной операции. Такое решение был принято благодаря обнадёживающим результатам, предварительно полученным помощью двух программ, первая из которых предсказывает эпитопы, представляемы антиген-презентирующей клеткой с помощью МНС II (http://www.imtech.res.i /raghava/propred/index.html), вторая - вторичную структуру белка, определяемую п первичной (bttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cei-bin/npsa automat.pl?page=npsa sopma.html) Картины, совмещающие результаты, полученные по обеим программам представлены на рис. 11. Это вторичные структуры рекомбинантного и природног белка с выделением на первичной структуре предсказанных эпитопов интересуемо белка. В конечном счёте, сравнивались вторичные структуры эпитопов природно белка (11А - ESAT-6, 11Б - CFP10 и 11В - ДМРТ64) с таковыми же в состав рекомбинантного белка (rESAT-6, rCFPIO и ГДМРТ64).

гЕЭАТ-б (рекомбинантный)

10 20 30 40 50 60 70

1111111 МЗР1ЬСУИК1КСЬУ0РТКЬЬЪЕУЬЕЕКУЕЕНЬУЕКОЕООКИКЫККЕЕЬ6ЬЕГР№РУУ1О6ОУКЬТ(ЗЗМА сссееееььььъсссььььььь№ьссьььььесссссььььььссссосс-2со':с:еве1ьс свеЬЬЬЬЬ 11РУ1АОКНКМЪСССРКЕКАЕ13МЬЕСАУЬОГКУСУЗК1АУЗКОГЕТЬКУОГЬЗКЬРЕМЪКМГЕОНЬСНК hhhhhhhhttc<:cccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhee<^.:;c<:■hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttc' ТУЬЫ6ОНУТНР0ШЬУ0АЬОУУЬУМОРМСЬ0АРРКЬУСЕККК1ЕА1РС1ОКУ1.КЗЗК¥1А№Р10СЮ12АТР

cвввtoc«cвhhhhhhhhhhhhhh^^^•tthhc^chhhhhhhhhhhhco.thhhhhhf:ttcлccoocccвввв

С6СОНРРКЗОЬУРКСЗМТЕОО»КЕАе1ЕАААЗА1^ГЛГ31НЗЬЬОЕСКОЗЬТКЬАААИОСЗеЗЕАХ2<^

^ссссссс-сссо-со-г ЬЬЬЬЬ^ЫшЫЛЬЬ&Ь^ЙЙЩЩЩ« Я|®1ИЬ1 ! - ЬЬЬШ» ЮКИПАТАТЕЬМАЬОШЛЖГ13ЕАСОАМАЗТЕ6МУТСМРА

ШМЬЪЬЬЬЬЬЬьММИ1Й1ьЬЬЬЬЬЬЬЬ^.гс::ейеее Длина АП белка (а.о.): 321

ЕвАТ-б (нативный)

10 20 30 40 50 60 70

1111111 МТЕ00ШЕАв1ЕАААЗА10вОТТ81НЗЬ1.ВЕСКдЗЬТКЬАААИОа5еЗЕАУ0ОУдСКШ>АТАТЕЬ™А1,С

hhhhh;:,chhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhttcí;'hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhh КЪАКТ18ЕАС0АМАЗТЕСиУТСМГА

ЬЬЬЬНЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬНЬЬЬП Длина АП белка (а.о.): 95

Рис. 11А. Сравнение вторичных структур эпитопов в рекомбинантном и нативном (целевом) белках для Е8ЛТ-6 В АП белка предсказанные эпитопы длиною 9 а.о. выделены жирным шрифтом, начало эпитопа обозначено красной буквой. Под приведённой последовательностью эпитопа в составе рекомбинантного белка закрашена область совпадения его вторичной структуры с вторичной структурой нативного белка. Буква зелёного цвета в первичной структуре рекомбинантного белка - Ы-концевой а.о. нативного белка. Обозначения элементов вторичной структуры: Ь - а-спираль, е - вытянутая цепь, 1-0-изгиб, с - случайное кольцо

гСРРЮ (рекомбинантный)

10 20 30 40 50 60 70

I [ I I I I I

МЗР1ЪСУИК1К6ЬУ0РТ№ЬЬЕУЬЕЕКУЕЕНЪУЕКОЕООКИРМККГЕЬОЬЕГРЫЬРУУ1О6ОУКЬТ<ЭЗМА сссеепЬЬЬЬЬЪ'.\':сЬЬЬЬЬЬЬЬЪЪссЬЬЬЬЬссссссЬЬЬЬЬЬсссс<:сссссс>.':еее'Ь1:ссеееЬЬЬЬ 11КУ1АОКНШЬС6СРКЕКАЕ13МЬЕСАУЬ01ЯУСУЗК1АУЗКОЕЕТЬКУОГЪЗКЬРЕМЬКМГЕОНЬСНК ШЛЫЛ*. «ссссссоЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЫЛЬЫЛЬЬЬЬеетсс'.-ЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬНЬЬЬЬЬЬЬЬН^с ТУЬМООНУТНРОГМЬУОАЬОУ¥ЬУМОРМСЬОАГРКЬТСГККК1ЕА1Р01СКУЬК35КУ1АИРЬ2СИОАТЕ ceeetcccchhhhhhhhhhhhhhhhctthhcc■::hhhhhhhhhhhhcct:hhhhhhcttгccccsce;eeeee С600НРРК30ЬУРК03ШЕМКТОААТ1А0ЕАСЫГЕК13еО1ЛТО100УЕЗТА031.0е0ИКвААеТАА0АА

УУТ№2ЕААНКСКСК1,ОЕ1ГзТМ1КдАОУеУЗКАОЕЕдООА1.330МСГ

Длина АП белка (а.о.): 32 6

СЕРЮ (нативный)

10 20 30 40 50 60 70

1111111 МАЕ:МКТПААТ1Л0ЕАС,Ь]РЕЯ13СПЬКТС10(ЗУЕЗТАСЗЬдОаЖСААаТААаА?^КГ0ЕААЬЖ12К0"1,0

Е13ТМ1НОАС?\^ОУЗКАОЕЕОООАЬЗЗОМСЕ

ЬЬЬЬЬЬЬЬЪЪсссссссЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬЬ Длина АП белка (а.о.): 100 Продолжение рис. 11Б Сравнение вторичных структур эпитопов в рекомбинантном и нативном (целевом) белках для СТРЮ (обозначения те же)

ГДМРТ64 (рекомбинантный)

10 20 30 40 50 60 70

I I I I I I I

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMA ccccecocohttccc;: hhhhhhhhhhhhhheeec.ccccchhhhhhhhheccccccceehht :;ccohhhhh IIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHK hhhei^CK^^Cccccccocchhheehhhhhhhccchhhhheec^cchhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhhi^c-:: TYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATF ccccoccc-:. hhhhhh ' .с-: ее eee- hh:ett v:eee - ceeeee

GGGDHPPKSDLVPRGSaPKTYCEELKGTDTGQACQIQMSDPAYNINISLPSYYPDQKSLENYiaQTRDKF tt . ч - . . v • - hhhhh ■ - h) . им-ш, '.>-Ыш

LSAATSSTPREAPYELNITSATYQSAIPPRGTQAVVLKVYQNAGSTHPTTTYKAFDWDQAYRKPITYDTL bhhh * >j . fttИ*е|рШеЙ1йЙ -V eeeecchhht¡|j¡§§cc¡¡hhh

WaADTDPLPWFPrVQGELSKQTGQQVSIAPNAGLDPVNYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEAAGPTQVL hh|ccco<,\::eeeee Mj. :cccceeeeettttccecoi • ф t - et-gf

VPRSAIDSMLA

r hhhh Длина АП белка(a.о.) : 431

ДМРТ64 (зрелый, нативный)

10 20 30 40 50 60 70

I I I I I I I

APKTYCEELKGTDTGQACQIQMSDPAYNIMSLPSYYPDQKSLENYIAQTRDKFLSAATSSTPREAPYEL

ccc4:hhheetcci^cceeeeecccttceeeeec0cc;^cct.v:hhhhhhhhhhhhhhhhhcivcccccccf.'ee NITSATYQSAIPPRGTQAWLKVYQNAGGTHPTTTYKAFDWOQAYRKPXTYDTbWQADTDPLPWFPIVQ

eeoccccccccct.-ccchheeeehhhtttcccccceeeeeccccccccceeeeeecoccccchhhhhhhhh

GELSKQTGQQVSIAPNAGLDPVMYQNFAVTNDGVIFFFNPGELLPEAAGPTQVLVPRSAIDSMLA

hhhhhtcqK'ceeaoeccceocfic<:4:eeee;:'Ctceeeeecttc:occcccccceeeecc ::hhhhhhh

Длина АП белка (а.о.): 2 05 Продолжение рис. 11В. Сравнение вторичных структур эпитопов в рекомбинантном и1 нативном (целевом) белках для ЛМРТ64 (обозначения те же)

Как видно из рис 11, наблюдалось либо полное совпадение вторичных структур,¡ например, FAGIEAAAS, VTSIHSLLD, LQNLARTIS, YQGVQQKWD у ESAT-6 (рис. НА); MKTDAATLA, FERISGDLK, ISGDLKTQI, VVRFQEAAN, VRFQEAANK FQEAANKQK у CFP10 (рис. 11Б); INISLPSYY, YIAQTRDKF, FLSAATSST, YQNAGGTHP, VTNDGVIFFFNPGELLPE (антигенная детерминанта состоит из 5 эпитопов) у ДМРТ64 (рис. 11В), либо - частичное. Такой анализ позволил^ предположить, что рекомбинантные белки ещё до проведения протеолиза должны взаимодействовать с сывороточными видоспецифическими к антигенам М. tuberculosis иммуноглобулинами, а также обладать стимулирующей способностью' для запуска процесса пролиферации лимфоцитов, праймированных Т-клеточными рецепторами к различным эпитопам, принадлежающим АП белков М. tuberculosis. ,

Возраст обследуемых первой выборки составлял 24-45 лет. Контрольная группа включала сыворотки 470 пациентов, не болеющих туберкулёзом. Эти же сыворотку предварительно были проанализированы с помощью референс-тест-систем «Анти-Туб-IgG» (СПб) и «АТ-Туб-БЕСТ-стрип» (г. Новосибирск).

Исследование наличия антител (Ат) к GST в поликлональной сыворотке здоровых доноров и больных туберкулёзом проводили двумя методами. В первом варианте GST сорбировали непосредственно на поверхности лунок. Во втором - на поверхность лунки сначала наносили МКА к GST (рис. 12).

HRP-меченные вторичные антитела

\j) выявления видосиецифических

Рис. 12. Схема ИФА для

HRP антител к рекомбинантному антигену (или GST) Вторичные антитела - поликлональные IgG-Ат человека, меченные пероксидазой хрена

HRP

лунка иммунологического планшета

HRP-пероксидаза хрене

В результате было установлено, что 1,3 % исследованных сывороток (и в группе ТБ-больных и в группе здоровых доноров) содержали антитела к И-концевой компоненте рекомбинантного белка. Из этого был сделан вывод о незначительном влиянии АП белка-носителя на диагностику туберкулёза этим методом (см. рис. 13). И далее как следствие - отщепление М-концевой АП от целевого белка, например, Е8АТ-6, СГРЮ, ДМРТ64 и других, не является обязательной процедурой при испытании рекомбинантиых белков с помощью современных иммунологических методов.

Из рис. 13 видно, что при использовании белка rESAT-б, его фоновое значение при обследовании здоровых лиц, даже выше, чем при использовании белка GST, и составляет 4,6 % (для rCFPIO оно соответствовало 5,3 %). Сыворотки, полученные от таких пациентов, в дополнение подтверждались с помощью референс-тест-систем, так как выявленный низкий уровень IgG-Ат, но превышающий уровень, определённый для здоровых лиц, мог также свидетельствовать о начале патологического процесса.

Проведение ИФА с использованием белков rESAT-б и rCFPIO в случае замены поликлональных IgG-Ат в роли вторичных Ат, меченных пероксидазой хрена, на Ат других классов, показало, что они способны выявлять положительные сыворотки и по антителам IgA и IgM среди разных групп обследуемых. Выявляемоеть иммуноглобулинов различных классов представлена в ряду: анги-IgG - 70,0, анти-IgA - 31,4 и анти-IgM — 11,8 %. Поэтому в дальнейшем способность других рекомбинантных белков выявлять положительные сыворотки, в частности, белка ГДМРТ64, оценивали только по IgG-Ат (сочетанное использование антител к Ig класса G, А и М достигало 82,0 %).

Для подтверждения результатов, полученных на сыворотках здоровых доноров, на предмет выявления уровня видоспецифических IgG-антигел к антигенам М.

Рис. 13. Использование GST и рекомбинантного белка rESAT-6 в ИФА. Частота выявления (%) IgG-антител к GST и к рекомбинантному белку rESAT-6 М. tuberculosis в различных исследуемых группах. 1 - ТБ-больные, 2 - здоровые доноры

больные активным здоровые туберкулёзом доноры

И rESAT-б SGST

tuberculosis нами были проанализированы сыворотки от больных с другими инфекционными заболеваниями, такими как гепатиты А, В и С, пневмонии и бронхиты различной (нетуберкулёзной) этиологии, хламидиоз. В результате было установлено, что при использовании рекомбинантных белков rESAT-6 и rCFPlO сыворотки таких доноров по уровню антител статистически не отличались от сывороток, полученных от здоровых доноров. Эти пациенты были отнесены к здоровым, или ТТГ-пациентам (пациентам, не болеющим туберкулёзом). Поэтому можно сделать вывод: возбудители этих инфекционных заболеваний не проявляют перекрёстных реакций с антигенами ESAT-6 и CFP10. В итоге, используя ИФА, было показано, что rESAT-6 и rCFPlO обладают высокой чувствительностью (65-79 %) и специфичностью (92-98,95-98 % соответственно).

Аналогичная работа была проведена при испытании рекомбинантного белка гАМРТ64 (общая выборка из 147 образцов сывороток: при использовании референс-тест-систем выявлено 47 положительных и 100 отрицательных сывороток, из которых по результатам проведённого анамнестического анализа 62 сыворотки были получены от здоровых лиц без клинических жалоб, а 38 - от пациентов с другими патологиями (вирусные гепатиты - в общем, отдельно - гепатиты, вызванные вирусами гепатита В и С; ВИЧ-инфекция, хламидиоз, пневмонии и бронхиты нетуберкулёзной этиологии, урогенитальные инфекции). В этом эксперименте наблюдали другую картину: во всех случаях - у ТБ-больных, больных другими инфекционными заболеваниями и здоровых доноров - наблюдали различающиеся уровни IgG-Ат или их полное отсутствие. Так, панель, собранная из 100 отрицательных сывороток, только в 76 % образцов показала отсутствие видоспецифических к туберкулёзу IgG-Ат. Разрыв в уровне IgG-Ат между ТБ-больными и ТБ -пациентами различался. Это понятно, поскольку белок ДМРТ64, являющийся секретируемым белком М tuberculosis, присутствует (Behr М.А. et al., 1999) в вакцинном штамме М. bovis BCG, применяемым в России. Этим также объясняется появление антител к белку ДМРТ64 в сыворотке крови здоровых доноров, которые в обязательном порядке вакцинированы против туберкулёза. Тем не менее, с помощью ГДМРТ64 оказалось возможным различать больных и здоровых пациентов. На выборке и 21 ТБ+- и 21 ТБ"-сывороток была определена чувствительность ГДМРТ64 по отношению к референс-тест-системе «Анти-Туб-IgG» как 81 %, а специфичность - 76 %. Отсутствие видоспецифических IgG-Ат к ДМРТ64 в сыворотке крови у большинства лиц, а именно здоровых доноров и больных заболеваниями нетуберкулёзной этиологии можно расценивать как утерю приобретённого в детском возрасте иммунитета против туберкулёза к определённому возрасту, а значит, и как возможность использования его наряду с rESAT-6 и rCFPlO в диагностике туберкулёза.

В настоящее время не существует единого мнения о целесообразности применения ИФА для диагностики туберкулёза в том виде, в котором он используется. Причины тому - это, во-первых, низкая чувствительность из-за слабой выявляемое™ антимикобактериальных антител на фоне индуцируемого возбудителем угнетения процессов антителопродукции и снижения содержания в крови свободных антител, и, во-вторых, низкая специфичность ИФА-тестов, основанных на использовании суммарных антигенов М. tuberculosis, поскольку в сыворотке крови могут присутствовать антитела к белкам М. bovis BCG, а также антитела к белкам

сапрофитных микобактерий, которые дают перекрёстные реакции с антигенами М. tuberculosis.

Анализ антител к исследуемым рекомбинантным белкам, проведённый в нашем исследовании, подтвердил общую тенденцию - выявляемость туберкулёза по уровню IgG-Ат выше, чем по уровню IgA- и IgM-Ат. Показано повышение чувствительности определения положительных сывороток с помощью рекомбинантных антигенов М. tuberculosis (Conde М.В. et al., 2004) по суммарному выявлению иммуноглобулинов класса A, G и М. Таким образом, полученные нами данные об иммунореактивности рекомбинантных белков в серологических исследованиях позволяют сделать вывод о том, что эти белки пригодны для выявления активного туберкулёза или подтверждения его.

4.2. Рекомбинантные белки в у-ИФН-аналнзе

Использование рекомбинантных белков, полученных нами, в у-ИФН-анализе рассматривалась как конечная цель этого исследования. Преимущество у-ИФН-анализа, как одного из Т-клеточных иммунологических методов, заключается в том, что при стимуляции видоспецифичным антигеном (природным, рекомбинантным, синтетическим) мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) основной вклад в секрецию у-ИФН вносят активированные Т-лимфоциты, которые являются главным объектом исследования. Стимуляция их проводится в селективной для размножения лимфоцитов полной ростовой среде - RPMI-1640. В результате стимуляции праймированных к данному заболеванию лимфоцитов они секретируют у-ИФН, концентрацию которого можно измерить.

В большинстве случаев в настоящее время туберкулёзный контроль проводится для выявления лиц с активной формой туберкулёза и лиц, имеющих контакт с больным туберкулёзом, с использованием туберкулиновой пробы. Быстрый путь раннего выявления туберкулёзной инфекции по крови с использованием рекомбинантных белков является альтернативным кожному тесту (Mustafa A.S. et al., 2000, Lalvani A., Pathan A.A. et al., 2001; Mori Т. et al., 2004, Brock I. et al., 2004). При этом уровень y-ИФН коррелирует со стадией развития туберкулёзной инфекции, уровнем иммунного ответа и вероятностью прогрессирования активной формы. Поэтому, измерив концентрацию у-ИФН, можно судить о наличии или отсутствии заболевания туберкулёзом.

Изучение чувствительности и специфичности rESAT-6 и rCFPIO были проведены с использованием образцов гепаринизированной крови, полученных от больных туберкулёзом и поставленных из клиники в разное время небольшими партиями (6-25 образцов) (табл. 1, 2 и 3). Диагноз туберкулёз был предварительно подтверждён с помощью классических методов выявления возбудителя (микроскопическим и культуральным).

Табл. 1 показывает результаты, полученные при стимуляции цельной клеточной культуры крови белком rESAT-6 и туберкулином (PPD): специфичность rESAT-6 в у-ИФН-анализе при выявлении туберкулёза оказывается выше, чем при использовании PPD, поскольку среди здоровых доноров выявлены ТБ-больные. Этот факт, несмотря на свою очевидность, показывает, что развитие туберкулёзного процесса с помощью у-ИФН-анализа может быть зафиксировано у вполне здоровых лиц, поэтому желательно проводить наблюдение в динамике с целью своевременного выявления как впервые заболевших туберкулёзом, так и наблюдения за пациентами,

проходящими курс противотуберкулёзной терапии. В табл. 2 сведены аналогичные результаты по белку гСТРЮ.

Таблица 1

Сравнение чувствительности и специфичности у-ИФН-анализа при использовании гЕБАТ-б

и 1ТО

Количество у-ИФН, пг/мл Антиген Количество выявленных больных ТБ/ к общему числу обследованных Чувствительность, % * Специфичность, % **

ТБ-пациенты здоровые доноры***

>300 РРО 5/6 7/7 83,3 0

гЕЗАТ-6 4/6 4/14 66,7 71,4

> 1000 РРЭ 7/9 13/14 77,7 7,1

гЕ8АТ-6 9/10 3/21 90,0 85,7

>3000 гЕЭАТ-б 17/21 2/19 80,9 89,5

* - Позитивный ответ среди ТБ-инфицированных ** - Позитивный ответ среди неинфицированных пацие1гтов *** - ВСО-вакцинированные и невакцинированные пациенты

Таблица 2

Сравнетое чувствительности и специфичности у-ИФН-анализа при использовании гСРРЮ

иРРО

ТБ-пациенты здоровые доноры***

>300 РРЭ 10/11 14/14 90,9 0

гСИРЮ 12/13 4/21 92,3 81,0

> 1000 РРО 14/17 13/14 82,3 7,1

гСРРЮ 18/21 4/25 85,7 84,0

* - Позитивный ответ среди ТБ-инфицировашшх ** - Позитивный ответ среди неинфицированных пациентов *** - ВСО-вакцинировашше и невакцинированные пациенты

В табл. 3 показаны обобщённые характеристики рекомбинантных белков гЕБАТ-б и гСБРЮ, полученные при выявлении больных с различными формами туберкулёза лёгких (образцы крови были взяты после подтверждения диагноза).

Таблица 3

Показатели рекомбинантных белков гЕБАТ-б и гСРРЮ при выявлении больных с различными формами туберкулёза лёгких в у-ИФН-анализе__

Форма туберкулёза гЕБАТ-б гСИРЮ

лёгких Чувстви- Специфич- Чувстви- Специфич-

тельность, % ность, % тельность, % ность, %

Инфильтративный (19) 86-95 87-97 83-94 86-97

Очаговый (12) 87-94 93-94 82-93 90-94

Диссеминированный (22) 84-97 86-94 80-92 82-94

Фиброзно-кавернозный (14) 96-100 97-100 87-95 93-100

Экспериментальное применение рекомбинантных белков для определения их пригодности в диагностике туберкулёза было проведено с помощью у-ИФН-анапиза на двух выборках: первая включала 20 образцов цельной гспаринизированной крови (пациенты под №№ 1-20) (табл. 4), вторая - 18 образцов крови, из которых выделяли МКПК (пациенты под №№ 21-38) (табл. 5). Первичный материал по обеим выборкам получен от больных с подозрением на туберкулёз, т.е. до установления диагноза с помощью культуралыюго метода. В качестве контрольных образцов белков использовали PPD и митогены конканавалин А (КонА) и фитогемагглютинин (ФГА). Значение «cutoff» - пограничное значение у-ИФН, разделяющее здоровых доноров и лиц, попадающих в группы риска и с диагнозом туберкулёз, - для у-ИФН >300 пг/мл (или > 1,2-1,7 МЕ/мл), согласно рекомендациям производителей, считали положительными. В табл. 4 представлены результаты, полученные на образцах цельной крови от обследуемых лиц, в табл. 5 - результаты, полученные на образцах мононуклеарных клеток, выделенных предварительно из образцов цельной крови с помощью системы Histopaque 1119.

Из табл. 4 видно, что у пациентов под № 9-11 при испытании всех трёх рекомбинантных белков диагноз туберкулёз не подтверждается. Пациенты под № 6 и 15 по уровню у-ИФН находятся практически на пограничной линии - на верхней границе при использовании rESAT-6 и нижней - при использовании rCFPlO. Результат с такими значениями у-ИФН требует повторения анализа и в случае совпадения с предыдущим результатом его следует оценивать как результат, который требует подтверждения с помощью других методов, например, с помощью ПЦР. Пациента под Ks 8 так же следует присоединить к группе пациентов с сомнительным результатом (№ 6 и 15), хотя уровень у-ИФН соответствует пограничному значению, полученному только при использовании rCFPIO (по результату, полученному с помощью белка rESAT-6, пациента под N° 8 следовало бы отнести к лицам с неподтверждённым диагнозом туберкулёз). Таким образом, также требуется подтверждение другими методами. Для полного анализа табличных данных также интересен результат, полученный для пациента под № 14: по белку rESAT-6 -пациенту диагностируется туберкулёз (Су.ифн 5 1,2-1,7), тогда как по белку rCFPIO -результат сомнительный. В этом случае был проведён повторный анализ с использованием этих белков. Данный образец оказался отрицательный (значения для rESAT-6 составили 0,87 МЕ/мл, для rCFPIO - 0,91 МЕ/мл), что было подтверждено также культуральным методом. Остальные пациенты диагностированы однозначно и вошли в группу с подтверждённым позднее диагнозом туберкулёз с помощью культурального и молекулярно-биологических методов.

Анализируя данные табл. 5 аналогичным образом, можно сделать вывод, что у пациентов под № 23, 33 и 35 при испытании всех трёх рекомбинантных белков диагноз туберкулёз не подтверждается: концентрация у-ИФН ниже предельного значения (Ст.ифн - 300 пг/мл). Об этом свидетельствовали и отрицательные результаты, полученные позднее с помощью классического культурального метода. Однако если исходить из полученных PPD-значений у-ИФН, то этих пациентов, за исключением № 35, следовало бы отнести к больным туберкулёзом. Повышенное содержание у-ИФН в анализируемой пробе при использовании PPD можно объяснить тем, что секреция у-ИФН стимулируется не только видоспецифичными белками М. tuberculosis, присутствующими в составе PPD и среди которых имеются, кстати, нативные ESAT-6 и CFP10, но - и за счёт неспецифичных, дающих перекрёстные

иммунологические реакции и имеющих отношение к белкам других видов микобактерий.

Таблица 4

у-ИФН-анализ на образцах гепаринизированной крови при стимуляции их

Пациент ы у-ИФН (МЕ/мл)

PPD rESAT-6 rCFPlO ГДМРТ64 Митоген

КонА ФГА

1 54,30 2,34 3,21 4,23 56,7 63,5

2 27,00 3,10 2,30 4,10 32,1 47,6

3 59,20 5,70 4,30 3,10 148,4 123,0

4 73,00 3,20 2,70 1,30 129,2 117,0

5 24,80 2,70 2,20 1,90 49,7 43,2

6 11,70 1,73 1,34 0,98 19,7 23,1

7 4,70 0,87 2,10 1Д2 139,7 126,8

8 2,90 0,81 1,70 1,20 24,6 21,3

9 5,30 0,73 0,56 0,57 44,7 53,1

10 27,60 0,83 0,46 0,23 163,1 143,9

11 57,20 0,23 0,10 0,12 68,7 65,3

12 10,90 6,40 5,60 3,70 56,9 72,1

13 62,30 7,20 6,25 6,10 67,2 57,4

14 1,70 2,10 1,40 0,30 23,8 19,7

15 33,40 1,70 1,20 0,78 36,0 34,5

16 7,20 13,20 10,70 9,75 77,8 67,3

17 98,70 12,40 11,70 8,90 72,2 78,1

18 74,60 19,30 12,80 11,70 23,5 32,3

19 43,10 132,20 132,80 111,20 184,2 179,3

20 67,30 147,50 132,00 103,40 154,7 165,7

39,22 25,65 25,28 24,37 - -

M(s) (28,86) п=19 (48,75) п=14 (47,69) п=13 (41,15) п=11

39,22+ 25,65± 25,28± 24,37± - -

M±m 6,62 13,03 13,23 12,41

п=19 п=14 п=13 п=11

M(s) к — 0,86(0,47) п=6 0,97(0,59) п=7 0,73(0,45) п=9 — —

М±шк — 0,86±0,19 п=6 0,97±0,22 п=7 0,73±0,15 п=9 — —

здоро- - < 1,2-1,7 < 1,2-1,7 < 1,2-1,7 - -

вые

доноры 200

Крайне низкий уровень у-ИФН при использовании РРЭ у пациента под № 35, который сравним с концентрацией у-ИФН, полученной в результате стимуляции

смесью рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO, может свидетельствовать не только об отсутствии туберкулёзного процесса, более того, - об отсутствии инфицированности организма пациента микобактерией вида М. tuberculosis.

Таблица 5

у-ИФН-анализ на образцах МКПК при стимуляции их рекомбинантными белками rESAT-6, rCFPlO, ГДМРТ64__

Пациенты у-ИФН (пг/мл)

PPD rESAT-6 rCFPlO ГДМРТ64 Митоген rESAT-6/ rCFPlO

КонА ФГА

21 4100 1750 845 736 6700 4782 2830

22 3650 2360 1985 1740 7324 5421 2740

23 2850 110 55 43 4530 3218 198

24 4870 4475 3200 2760 7300 6710 4640

25 5110 1320 2755 2300 9650 8971 3200

26 6200 27 2849 1430 7861 8764 3100

27 17320 4210 5780 3210 12344 14230 5890

28 3980 760 67 43 4851 4352 1240

29 5830 3240 4210 2750 19870 21340 5460

30 10350 3420 7400 6325 18300 17235 6840

31 21200 2290 415 328 16540 14530 2870

32 5730 1318 2065 2650 12347 13247 2655

33 670 64 57 32 23450 32410 112

34 15340 5640 3875 5130 17650 18930 5930

35 23 17 19 14 640 985 21

36 7458 64 2190 330 23410 28750 3310

37 10480 3340 6240 4320 19340 18745 7380

38 6130 1680 1745 1330 34500 29560 2130

M(s) 7722 (5539) п=17 2754 (1445) п=13 3254 (2047) п=14 2524 (1780) п=14 4014 (1859) n=15

M±m 7722± 1343 п=17 2754± 401 п=13 3254± 547 п=14 2524±476 п=14 4014±480 n=15

M(s) к - 56(37) 50(21) 33(14) п=4 - - 110(89)

М±ш к — 56±16 п=5 50±11 п=4 33±7 п=4 — — 110±51 n=3

здоровые доноры 18 <300 <300 <300 <300

Исключая из обсуждения последний случай (№ 35), полученные РРО-данные свидетельствуют о низкой специфичности туберкулина при использовании его как суммарного антигена при диагностировании туберкулёза с помощью у-ИФН-анализа. Низкая специфичность также подтверждается сравнением у-ИФН-РРО-значений с уровнем у-ИФН, полученного при стимуляции известными митогенами - КонА и

ФГА, которые, как известно, вызывают неспецифическую активацию Т-лимфоцитов, не обусловленную связыванием с антигенраспознающими рецепторами, что приводит к высокой продукции у-ИФН.

Пациенты под № 26, 28 и 36 (табл. 5) являются пациентами с диагнозом туберкулёз. Это видно из дополнительного результата, приведённого в крайнем правом столбце (смесь двух белков - rESAT-6/rCFP10). В случае же отсутствия последнего анализ с образцами МКПК следует повторить с тем белком, при использовании которого возникло расхождение в интерпретации полученных результатов. В случае получения такого же (или близкого) значения концентрации у-ИФН результат можно интерпретировать особенностью иммунной системы конкретного пациента, а значит, и более низкой чувствительностью рекомбинаитного белка применительно к конкретному случаю. Для окончательного диагноза необходимо подтверждение другими методами (например, Г1ЦР, культурапьный метод, микроскопия мазка и др.).

ВЫВОДЫ

1. Сконструированы 4 рекомбинантные плазмиды на основе векторной плазмиды pGEX-2T, несущие полные гены esxA, esxB, а также полный и укороченный (без нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид) ген mpt64, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки Mycobacterium tuberculosis. Идентичность каждого клонированного гена природному, соответствующего штамму H37Rv, подтверждена секвенированием.

2. Подобраны оптимальные условия для продукции в штамме Escherichia coli BL21 3 рекомбинантных белков - rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64, которые накапливаются в растворимой форме в цитоплазме бактериальной клетки, а также условия для их выделения и очистки.

3. Впервые показана принципиальная возможность использования рекомбинантных белков в иммуноферментном и у-интерфероновом анализе без предварительного отщепления N-концевой аминокислотной компоненты, используемой в качестве белка-носителя, при установленном уровне выявления антител к N-концевой компоненте рекомбинаитного белка - глутатионтрансферазе, не более 1,3 % среди исследованных сывороток.

4. На примере rESAT-6 и rCFPIO установлено, что эти рекомбинантные белки способны выявлять положительные сыворотки по антителам IgG, IgA и IgM среди разных групп обследуемых. Наиболее высокий показатель выявляемое™ иммуноглобулинов определён для IgG-антител и составил 70 % (для IgA - 31,4 %, IgM -11,8%).

5. При использовании панели сывороток, полученных от больных туберкулёзом и здоровых доноров, показано, что чувствительность ИФА при испытании rESAT-6 и rCFPIO составила 65-79 %, ГДМРТ64 - 81 %, специфичность - соответственно 92-98, 95-98 и 76 %.

6. Показано, что чувствительность у-ИФН-метода при стимуляции Т-лимфоцитов rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 составила соответственно 84-100, 80-95 и 60-78 %, а специфичность - соответственно 86-100, 82-100, 76-97 %. При сочетанием использовании трёх рекомбинантных белков - rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 -специфичность составила 96,2 %, а чувствительность - 89,1 %.

7. Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и ГДМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов. 2

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в рецензируемых изданиях, 2 патента.

Список патентов, оформленных по теме диссертации:

1. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н.. Татьков С.И. Рекомбинаитная плазмидная ДНК pTSE6, кодирующая гибридный полипептид GST-ESAT-6 со свойствами видоспецифичного микобактериалыюго антигена ESAT-6, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида GST-ESAT-6 и рекомбинантный полипептид GST-ESAT-6. Патент RU № 2282661 С2 от 16.08.2004.

2. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н.. Татьков С.И. Рекомбинаитная плазмидная ДНК рТВ232, кодирующая гибридный полипептид GST-CFP10 со свойствами видоспецифичного микобактериального антигена CFP10, рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного полипептида GST-CFP10 и рекомбинантный полипептид GST-CFP10. Решение о выдаче патента на изобретение от 17 июля 2009 г. Заявка № 2008107240/13(007837).

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Туманов Ю.В., Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н.. Вараксин Н.А., Татьков С.И. Рекомбинантные белки М. tuberculosis в диагностике туберкулёза лёгких // Медицинская иммунология. 2006. № 2/3. С. 294-295.

2. Татьков С.И., Туманов Ю.В., Носарева О.В., Болдырев А.Н.. Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Порываева В.А., Ивлев-Дунтау А.П., Ткаченко С.Б., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Применение рекомбинангных видоспецифических белков микобактерий туберкулёза для серологической диагностики инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2006. № 4(29). С. 42-47.

3. Татьков С.И., Носарева О.В., Болдырев А.Н.. Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Лебедев Л.Р., Порываева В.А., Ивлев-Дунтау А.П., Аутеншлюс А.И., Ткаченко С.Б., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Применение рекомбинантных видоспецифических белков М. tuberculosis для серологической диагностики туберкулёза // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. № 12. С. 23-24, 33-34.

4. Сивков А.Ю., Болдырев А.Н.. Азаев М.Ш., Боднев С.А., Медведева Е.В., Баранова О.И., Ивлев-Дунтау А.П., Блинова Л.Н., Пасечников А.Д., Татьков С.И. Определение причин распространения MDR-штаммов на основе анализа популяции рифампицин- и/или изониазид-устойчивых изолятов М. tuberculosis // Молекуляр. генетика микробиол. вирусол. 2006. № 2. С. 30-33.

5. Татьков С.И., Сивков А.Ю., Болдырев А.Н.. Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Медведева Е.В., Ивлев-Дунтау А.П., Стрелис А.К., Новицкий В.В., Уразова О.И., Воронкова О.В. Результаты применения биочипов для определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis в Новосибирской и Томской областях // Молекуляр. генетика микробиол. вирусол. 2007. № 4. С. 9-15.

Доклады и тезисы конференций: 1. Болдырев А Н.. Сивков А.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Использование полимеразной цепной реакции для одновременного определения инфицироваиности пациента туберкулезом и устойчивости к рифампицину // Труды конференции «Межрегиональная научная конференция, посвященная 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П. Карпова». 2003. 7-10 октября. Томск.

2. Смирнова О.Ю., Болдырев А.Н.. Туманов Ю.В. и др. «Рекомбинантные белки M.tuberculosis в серологической диагностике туберкулеза», Тез.докл. Межрегиональной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АМН СССР С.П.Карпова 7-10 октября, 2003, с.171-172

3. Сивков А.Ю., Болдырев АН.. Медведева Е.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Применение олигонуклеотидных чипов для определения цггаммов М. tuberculosis, устойчивых к рифампицину и/или изониазиду // Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней». 2005. 25-27 октября. Сосновка. Новосибирская обл.

4. Болдырев А.Н.. Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Туманов Ю.В., Татьков С.И. Применение рекомбинантных видоспецифических белков М. tuberculosis для серологической диагностики туберкулеза // III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». 2006. 27-29 сентября. Новосибирск. Россия. С. 134-135.

5. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н.. Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Выявление маркёров Т-клеточного иммунитета в видоспецифической диагностике туберкулёза // III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера». 2006. 27-29 сентября. Новосибирск. Россия. С. 1 ¿fríe?.

6. Туманов Ю.В., Болдырев АН.. Носарева О.В., Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Использование рекомбинантных микобактериальных антигенов в диагностике туберкулёза лёгких // Сборник тезисов И Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова. 2007. 9-12 сентября. Томск. Россия. С. 34-35.

7. Туманов Ю.В., Болдырев А.Н.. Смирнова О.Ю., Лебедев Л.Р., Азаев М.Ш., Носарева О.В., Ивлев-Дунтау А.П., Татьков С.И. Видоспецифическая диагностика туберкулёза по маркёрам Т-клеточного иммунитета И Сборник тезисов II Российско-Германской конференции форума Коха-Мечникова. 2007. 9-12 сентября. Томск. Россия. С. 36-37.

8. Туманов Ю. В., Болдырев А.Н.. Смирнова О.Ю., Татьков С.И. Иммунологический мониторинг туберкулёзной инфекции с использованием рекомбинантных белков rESAT-б и rCFPlO M.tuberculosis // Четвёртый Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", секция 1 «Биотехнология и медицина». 2007. 12-16 марта. Москва. Россия. С. 147.

БОЛДЫРЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ

Получение и оценка рекомбинантных видоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулеза.

Подписано в печать 12.10.2009. Заказ № 83. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в издательском отделе Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Болдырев, Александр Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Диагностика туберкулёза.

1.1.1. Микроскопическая и культуральная диагностика.

1.1.2. Туберкулинодиагностика.

1.1.3. Современные иммунологические методы диагностики туберкулёза.

1.2. Поиск иммуногенных белков для диагностики туберкулёза.

1.2.1. Поиск иммуногенов среди белков М. tuberculosis.

1.2.2. Поиск иммуногенов с помощью экспрессионных библиотек геномов микобактерий туберкулёзного комплекса.

1.2.3. Источник иммуногенов - области делеций при сравнительном анализе геномов микобактерий туберкулёзного комплекса и вакцинного штамма М. bovis BCG.

1.2.4. Источник иммуногенов - транспозонные библиотеки интактных патогенных микобактерий (генетически изменённые микобактерии туберкулёзного комплекса).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред, реактивы, реагенты и прочие материалы.г.

2.1.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред и питательные среды.

2.1.2. Реактивы, реагенты.

2.1.3. Ферменты.

2.1.4. Бактериальные штаммы Е. coli.

2.1.5. Плазмиды.

2.1.6. Олигодезоксирибонуклеотиды.

2.1.7. Клинические изоляты культур клеток М. tuberculosis.

2.1.8. Образцы сывороток, крови и мокрот.

2.1.9. Концентрированные буферы / растворы.-.

2.1.10. Рабочие буферы / растворы'.

2.1.11. Тест-системы и наборы реактивов/реагентов.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение ДНК.

2.2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.2.4. Лигазиая реакция.

2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.2.6. Поиск рекомбинантных клонов.

2.2.7. Наработка, выделение рекомбинантных плазмидных ДНК и трансформация штамма Е. coli BL21.

2.2.8. Получение индуцированных культур штамма Е. coli BL21, содержащего рекомбинантные плазмиды, и поиск клонов, продуцирующих рекомбинантный белок.

2.2.9. Отбор клонов, продуцирующих рекомбинантный белок.

2.2.10. Электрофорез.

2.2.11. Иммуноблотинг белков.

2.2.12. Секвенирование клонированной нуклеотидной последовательности.

2.2.13. Наработка и выделение рекомбинантных GST-P-белков.

2.2.14. Иммуноферментный анализ.

2.2.15. у-ИФН-анализ.

2.2.16. Биочип-гибридизационный метод.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выбор видоспецифичных антигенов М. tuberculosis для тестирования в ИФА и у-ИФН-анализе.

3.2. Выбор экспрессирующего вектора для конструирования рекомбинантной молекулы, несущей ген, кодирующий аминокислотную последовательность целевого белка.

3.3. Информационный поиск генов esxA, esxB и mpt64 и дизайн праймеров для синтеза ампликонов, включающих эти гены.

3.4. Конструирование рекомбинантных молекул, несущих гены, кодирующие видоспецифичные белки М. tuberculosis.

3.5. Оптимизация условий для наработки рекомбинантных белков.

3.6. Подбор условий для выделения и очистки рекомбинантных белков.

3.7. Испытание рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis в ИФА, у-ИФН-анализе на клинических изолятах крови.

3.7.1. Рекомбинантные белки в иммуноферментном анализе.

3.7.2. Рекомбинантные белки в у-ИФН-анализе.

3.8. Анализ изолятов мокроты с помощью ПЦР и биочип-гибридизационного метода.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза"

Актуальность проблемы

Туберкулёз - социально опасная инфекционная болезнь человека.

Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида М. tuberculosis, в России инфицированность превышает 80%. По заболеваемости и числу больных туберкулёзом Россия по-прежнему входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулёзу. По данным ВОЗ за 2007 г., число впервые выявленных заболевших туберкулёзом в нашей стране составило 157 тыс. (заболеваемость 110 на 100000 населения). Из них 68 тыс. выявлены как положительные по результатам микроскопии мазка. Общее число больных туберкулёзом на конец 2007 г. составило 164000. Распространение ВИЧ-инфекции становится отягощающим фактором для активизации туберкулёзной инфекции: 26240 заболевших от общего числа больных туберкулёзом являлись ВИЧ-позитивными. Таким образом, доля ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом в нашей стране достигла 16 % (WHO Report 2009). Число смертей составило 20000 (среди не инфицированных ВИЧ) и 5100 - из числа ВИЧ-инфицированных. Смертность ВИЧ-позитивных пациентов в ~70 % случаев связана именно с туберкулёзом.

Возбудителем туберкулёза являются бактерии рода Mycobacterium, среди которых этиологическое значение имеют М. tuberculosis и реже М. africanum и М. bovis (Djelouadji Z. et. al., 2008). Возбудитель передаётся первично аэрогенным или алиментарным путём. В инфицированном организме при определённых условиях могут реализоваться гематогенный, лимфогенный и бронхогенный пути, поражая внутренние органы, а также повторно алиментарный (слюна, мокрота при заболевании лёгких) (Милькаманович В.К., 1997). В настоящее время зафиксирована передача М. bovis от человека человеку (Evans J.T. et. al., 2007), а не только от крупного рогатого скота. Заболевание характеризуется преимущественно поражением лёгких, интоксикацией и аллергизацией организма.

Особенностью туберкулёза, как одной из хронических инфекций, является преобладание случаев латентной, абациллярной форм и бактерионосительства. В связи с исключительно высокой медико-социальной опасностью распространения туберкулёзной инфекции первоочередной задачей остаётся выявление больных бациллярной формой туберкулёза лёгких, так как, являясь бактериовыделителями, они представляют наибольшую эпидемическую опасность для окружающих. Таким образом, для предотвращения распространения туберкулёза в настоящее время ещё большее актуальное значение приобретает своевременная и достоверная лабораторная диагностика этого заболевания даже при отсутствии или минимальном проявлении его клинических признаков. В настоящее время нет ни одного надёжного метода, с помощью которого можно было бы однозначно поставить диагноз туберкулёз.

Традиционные методы диагностики, такие как флюорография и бактериоскопия мокроты, не всегда эффективны. Бактериологический метод занимает много времени - даже основывающийся на обнаружении роста микобактерий в присутствии флуоресцентного красителя (Ardito F. et al., 2001). Ежегодная туберкулинодиагностика - основной и до сих пор единственный метод в нашей стране, с помощью которого определяется напряжённость иммунной системы у детей и подростков, - также не всегда отвечает предъявляемым требованиям. Молекулярно-биологические методы позволяют достаточно быстро с высокой специфичностью и чувствительностью проводить выявление и типирование микобактерий в различных клинических образцах. Но даже ПЦР, один из самых чувствительных современных методов молекулярной диагностики, не позволяет выявить всех больных, так как для его проведения требуются микобактерии или ДНК/РНК, выделенная из них. Существенным недостатком ПЦР также является невозможность оценить активность туберкулёзного процесса. Пбскольку туберкулёз поражает, кроме лёгких, и другие органы, диагностика ещё в большей степени осложняется. Наряду с этими методами основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. Её основной проблемой остаётся низкая специфичность и чувствительность применяемых антигенов. Причиной кросс-реактивности белковых антигенов М. tuberculosis является присутствие гомологичных белков других микроорганизмов, дающих перекрёстные реакции с иммуноглобулинами сыворотки здоровых .пациентов. Поэтому результаты рутинного иммунологического обследования' группы вакцинированных больных обычно оказываются малоинформативными. ч

Для постановки окончательного диагноза туберкулёз требуется сравнение результатов, полученных разными методами. Развитие новых методов Т-клеточной иммунологии напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови, имеющих прямое отношение к иммунной системе. Разрабатываемые в мире в течение последних десяти лет эти методы диагностики туберкулёза, например гамма-интерфероновый анализ, на сегодняшний день оказывается и своевременным, и в значительной степени достоверным: время выполнения анализа занимает не более 2-х суток (чувствительность в пределах 90 %, а специфичность приближается к 100 %). у-ИФН-анализ в настоящее время является одним из самых эффективных методов для детекции у-ИФН, секретирующегося при стимуляции Т-клеток in vitro белковыми антигенами М. tuberculosis. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антигенстимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа. Так, если за рубежом в наиболее развитых странах проблема диагностики туберкулёза с помощью этих методов практически решена (имеются тест-системы), в России её решение находится на начальном этапе. Новый тест, основанный на исследовании антигенспецифических Т-лимфоцитов, позволяет раньше диагностировать туберкулёз, чем кожные туберкулиновые пробы. Разработка иммунологических Т-клеточных тест-систем является крайне важной для нашей страны и в настоящее время входит в разряд наиболее актуальных проблем современной медицины. Цель работы

Целью настоящего исследования являлись получение и оценка пригодности рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis для диагностики туберкулёза с помощью ИФА и у-ИФН-анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести, руководствуясь литературными данными, теоретический анализ по выбору видоспецифичных высокоиммуногенных антигенов М. tuberculosis',

- сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis,;

- оптимизировать условия для биосинтеза рекомбинантных белков;

- подобрать условия для выделения и очистки рекомбинантных белков;

- оценить полученные рекомбинантные видоспецифичные белки М. tuberculosis на пригодность для использования их в диагностике туберкулёза;

- провести сравнительный анализ результатов, полученных с использованием рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis, с результатами, полученными с помощью ПЦР-анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые на основе плазмиды pGEX-2T были сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis, такие как ESAT-6, CFP10 и МРТ64.

Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм Е. coli BL21 позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих в своей Nконцевой части аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве белка-носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.

Впервые для проведения иммуноферментного и у-интерферонового анализа для выявления больных туберкулёзом и подтверждения (опровержения) диагноза туберкулёз в диагностических целях использованы рекомбинантные белки, содержащие на N-конце АП глутатионтрансферазы в качестве вспомогательного белка. v Применение рекомбинантных белков без проведения протеолитического расщепления его на два фрагмента - белок-носитель и целевой белок - сокращает существенно время до получения целевого белка, необходимого для проведения ИФА и у-ИФН-анализа.

Таким образом, продвижение в клиническую практику диагностических методов, использующих Т-клеточные технологии, вооружит медицину новым мощным диагностическим средством, которое необходимо совершенствовать в связи с возрастанием доли больных абациллярной формой туберкулёза и ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом, распространением лекарственно устойчивых штаммов, вызывающих туберкулёз.

Результаты диссертационной работы могут служить основанием для того, чтобы, используя полученные рекомбинантные белки (rESAT-б и rCFPIO), приступить к разработке тест-системы для диагностики туберкулёза, основывающейся на у-ИФН-анализе, и внедрению её в клинико-диагностические лаборатории специализированных лечебных учреждений вообще и общей лечебной сети, в частности (постановка метода занимает от 1,5 до 2-х суток, чувствительность рекомбинантных белков находится в пределах 80-100 %, а специфичность - в пределах 82-100 %).

Положения, выносимые на защиту

1. Плазмиды pTSE6, рТВ232 и рТВ323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки Е. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулёза.

2. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 применимы в качестве компонента в иммуноферментном и у-интерфероновом анализе при диагностике туберкулёза (без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка).

3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, обязательными компонентами которых являются полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающих гены, кодирующие секретируемые белки М. tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, может быть использована в качестве технологической схемы как составная часть для разработки лабораторного регламента по производству этих белков. Личный вклад автора

Работа выполнена автором самостоятельно при участии коллег ГНЦ ВБ «Вектор», которое сводилось к отдельным методическим моментам и обсуждению полученных результатов. Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при непосредственной помощи и в соавторстве с сотрудниками отдела иммунотерапевтических препаратов ГНЦ ВБ «Вектор»: к.х.н. Ю.В. Тумановым, к.б.н. О.Ю. Смирновой, к.б.н. О.В. Носаревой, к.б.н. А.Ю. Сивковым, к.б.н., доц. М.Ш. Азаевым и д.б.н. С.И. Татьковым. Автор им искренне благодарен. Также хочется поблагодарить отдельных сотрудников Центра, которые способствовали продвижению и завершению этого исследования: н.с. Горбунова Ю.А., Азаеву Ф.З. (ЗАО «Вектор-Бест»), н.с. Боднева С.А., к.б.н. Шустова А.В., к.б.н. Тернового В.А., к.ф.-м.н. Сафатова А.С., Буряк Г.А. и в особенности своих рецензентов, бескорыстный труд которых всегда почему-то остаётся в тени, - д.б.н. Тикунову Нину Викторовну и к.б.н. Протопопову Елену Викторовну.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Болдырев, Александр Николаевич

выводы

3. Впервые показана принципиальная возможность использования рекомбинантных белков в иммуноферментном и у-интерфероновом анализе без предварительного отщепления N-концевой аминокислотной компоненты, используемой в качестве белка-носителя, при установленном уровне выявления антител к N-концевой компоненте рекомбинантного белка -глутатионтрансферазе, не более 1,3 % среди исследованных сывороток.

5. При использовании панели сывороток, полученных от больных туберкулёзом и здоровых доноров, показано, что чувствительность ИФА при испытании rESAT-6 и rCFPIO составила 65-79 %, гДМРТ64 - 81 %, специфичность - соответственно 92-98, 95-98 и 76 %.

6. Показано, что чувствительность у-ИФН-метода при стимуляции Т-лимфоцитов rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 составила соответственно 84-100, 80-95 и 60-78 %, а специфичность - соответственно 86-100, 82-100, 76-97 %. При сочетанном использовании трёх рекомбинантных белков (rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64) специфичность составила 96,2 %, а чувствительность - 89,1 %.

7. Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным ВОЗ 2007 г., заболеваемость туберкулёзом в мире продолжает возрастать. Более того, рост её опережает рост народонаселения. Смертность так же продолжает расти. Туберкулёз, являясь социально опасным инфекционным заболеванием, не всегда протекает в острой фазе - болезнь иногда длится годами. Это так называемая хроническая форма течения болезни (пассивное бактерионосительство). И как только заболевание переходит в активную фазу, человек становится социально опасным, поскольку сам, того не подозревая, становится активным бактерионосителем и заражает других.

Появление нового типа диагностических иммунологических тестов - Т-клеточных - вряд ли является случайным. Это закономерный эволюционный процесс развития диагностических тест-систем. Попробуем это объяснить следующими рассуждениями. Для проведения серологических реакций при выявлении инфекционного заболевания (в более широком смысле, и диагностирования аутоиммунных заболеваний) в сыворотке необходимо присутствие специфических антител или антигенов, вызвавших образование этих антител. В нашем случае - наличие противотуберкулёзных видоспецифических иммуноглобулинов или антигенов М. tuberculosis. Первые обнаруживают в количествах, достаточных для их измерения, только при активном протекании туберкулёзного процесса, когда требуется подтверждение диагноза заболевания. Для обнаружения антигенов в сыворотке крови требуется ещё большая чувствительность применяемого иммунологического метода. Вот почему серологические тесты с выявлением антигена менее применимы в медицинской практике, хотя и являются более достоверными, так как напрямую выявляют антиген. Однако и в первом, и во втором вариантах для постановки метода требуются моноклональные антитела, которые могут быть получены с помощью гибридомной технологии. И чем больше вовлекается в анализ иммуногенных белков, тем большее требуется разнообразие моноклональных антител.

Т-клеточные иммунологические тесты принципиально отличаются от тестов, использующих специфичные к антигену иммуноглобулины или антигены, присутствующие в крови, а точнее в сыворотке крови. Т-клеточные тесты не являются по своей сути серологическими, поскольку в основе их лежит обнаружение у-ИФН (или другого цитокина, выбранного в качестве прогностического маркёра заболевания), продуцируемого Т-лимфоцитами. Продукция у-ИФН возможна только при активации той субпопуляции Т-лимфоцитов, которые на своей поверхности несут Т-специфический(е) к антигену рецептор(ы), или, как говорят иначе, праймированы специфическим к антигену Т-рецептором. Более того, эти лимфоциты не только активируются, но и оказываются способными к митотическому делению. Другие, непраймированные Т-лимфоциты не активируются и не пролиферируют, а значит, и не продуцируют у-ИФН. Последний можно обнаружить с помощью специфических иммуноглобулинов к у-ИФН человека или животного (если заболевание хотят диагностировать у животного). Следует понимать, что кровь, представляя собой жидкую ткань организма, для постановки Т-клеточного теста является лишь диагностическим материалом для выделения Т-лимфоцитов в чистом виде, а специфические к у-ИФН иммуноглобулины - инструментом для обнаружения у-ИФН. Секретируемый у-ИФН в данном методе является умножителем. Выделенные *из крови ,в чистом виде Т-лимфоциты ничего общего не имеют с сывороткой крови, содержащей видоспецифические к туберкулёзу иммуноглобулины. Теоретически одной праймированной клетки в анализируемом материале достаточно для выявления заболевания, в частности туберкулёза. Таким образом, этот метод представляется весьма перспективным для ранней диагностики туберкулёза, а значит и для профилактики этого опасного заболевания. В крови здоровых людей всегда будет присутствовать некоторое количество у-ИФН, продуцируемое в результате активации Т-специфических лимфоцитов антигенами, отличающимися от антигенов М tuberculosis. Это количество следует рассматривать как фоновое значение, превышение которого будет указывать на развитие патологического процесса (и необязательно туберкулёзного). Очень важно для убедительности при постановке окончательного диагноза провести повторный анализ (наблюдение за туберкулёзным процессом в динамике). Используя мононуклеарные клетки при проведении у-ИФН-анализа, мы переходим на качественно новый уровень диагностирования туберкулёза, поскольку, выделяя мононуклеарные клетки из плазмы крови, избавляемся от эндогенного у-ИФН. Вот почему у-ИФН-Т-клеточный тест для выявления заболевших туберкулёзом наиболее перспективен для внедрения в нашей стране и в особенности для обследования детей, для которых в настоящее время единственным разрешённым диагностическим методом является ежегодная туберкулинодиагностика (до 15 лет).

Огромное преимущество у-ИФН-Т-клеточного теста перед ИФА (ИФлА) в том, что с выявлением новых иммуногенных белков, поиск которых неустанно продолжается, не требуется получения моноклональных антител к каждому из них для оценки их пригодности.

Для нашего исследования - оценки применимости рекомбинантных туберкулёзных белков в диагностике туберкулёза - мы решили получить генно-инженерным путём те белки, которые были хорошо изучены в других странах мира и зарекомендовали себя в ИФА и у-ИФН-анализе, такие как ESAT-6, CFP10 и МРТ64. Несмотря на то, что некоторые экспрессирующие конструкции, с помощью которых можно продуцировать эти рекомбинантные белки, уже созданы в ряде стран, остаются нерешённые задачи: это получение целевых белков, приближенных к структуре нативного целевого белка, получение рекомбинантных конструкций, которые давали бы высокие выходы рекомбинантного белка и, как следствие, целевого и одновременно рекомбинантного белка в растворимой форме и др.

Те конструкции, которые уже имеются в мировой практике, будучи введёнными в экспрессирующие штаммы клеток бактерий Е. coli, продуцируют, как правило, рекомбинантный белок в нерастворимой форме: белок накапливается в тельцах включения. При выделении таких белков требуется провести денатурацию (растворение телец включения), а затем ренатурацию рекомбинантного белка и, наконец, отщепление с помощью протеазы АП целевого белка от тэга - АП, необходимой для осуществления выделения белка с помощью аффинной хроматографии (или наоборот, сначала - расщепление денатурированного белка, затем - рефолдинг), или использования рекомбинантного белка в том виде, какой он имеет после ренатурации. Далее в ходе исследования возникает вопрос: насколько рекомбинантный белок или полученный целевой соответствует третичной структуре природного белка? Чтобы избежать этого вопроса, мы решили использовать в качестве вектора плазмиду, которая позволяет в большинстве случаев, как следует из литературы, получать растворимые рекомбинантные белки. Однако выход таких белков оказывается ниже. На наш с « взгляд, такие белки должны в большей степени быть приближенными (если не соответствовать полностью) нативной упаковке целевого белка. И второе, — чтобы ускорить получение ответа на вопрос о пригодности целевого белка в ИФА и у-ИФН-анализе для диагностики туберкулёза, мы решили провести их испытание в виде полученного рекомбинантного белка, так как третичная структура целевого белка до и после обработки протеазой должна сохраняться, т.е. в ходе протеолиза не подвергается денатурации. Третье - мы решили оценить влияние N-концевой компоненты (конкретно глутатионтрансферазы) рекомбинантного белка на результат с помощью двух иммунологических методов. Решив эту задачу, можно дать ответ, следует проводить отщепление целевого белка от N-концевой компоненты или использовать такого типа рекомбинантные белки непосредственно в анализе. На сегодняшний день неизвестно, происходит ли в растворе изменение третичной структуры отщеплённого целевого белка от той, которую его АП имеет в составе рекомбинантного?

Современные высокопроизводительные методы клонирования в настоящее время (Dieckman L. et al., 2002) позволяют одновременно провести клонирование в автоматическом режиме до 400 ПЦР-фрагментов. Если эту процедуру выполнять в ручном варианте, то значение снизится до 10 как минимум разных фрагментов при использовании какого-либо одного выбранного вектора. Это означает, что одновременно можно вести испытание 10 иммуногенных белков. Правда, выполнение эксперимента по клонированию (включая стадию получения рекомбинантных экспрессирующих клонов) уже не будет укладываться в три дня - затянется до 1 недели - 10 дней. Далее - 1 неделя на наработку рекомбинантных белков в количествах, достаточных для испытания в у-ИФН- и/или у-ИФН-ELISpot-анализе. Скорость-лимитирующей стадией тестирования рекомбинантных белков будут Т-клеточные тесты, поскольку результат этих исследований зависит от выборки изолятов крови, полученных от больных туберкулёзом (или ВИЧ-ассоциированным туберкулёзом) и здоровых доноров. Поскольку Т-клеточные тесты используют интактные (жизнеспособные клетки крови), то изоляты крови для испытания необходимо использовать свежими или иметь надёжный банк консервированной крови или выделенных мононуклеарных клеток из отобранных изолятов.

Перспективным направлением в области повышения чувствительности у-ИФН-и/или у-ИФН-ELlSpot-анализа для диагностики туберкулёза является как продолжение предыдущих испытаний выявление высокоиммуногенных этитопов (антигенных детерминант) в АП каждого из зарекомендовавших себя белков, и создание на их основе генетических конструкций, включающих различные ассоциации (объединения) эпитоп-кодирующих последовательностей в одной генетической конструкции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Болдырев, Александр Николаевич, Кольцово

1. Богун А.Г., Анисимова В.А., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Структура делеций, выявленных в геномах клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis II Пробл. туберк. болезн. лёгких. 2007. № 12. С. 42-47.

2. Визель А.А., Гурылёва М.Э. Туберкулёз / под ред. М.И. Перельмана. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 208 с. (В помощь практикующему врачу).

3. Гладкова С.Е., Решетников С.С., Пряхина В.Н. Опыт применения тест-системы "АТ-Туб-Бест" для"диагностики туберкулёза // Новости "Вектор-Бест". 2006. № 4(42). С. 3-7.

4. Лукьянов С.А., Гурская Н.Г., Лукьянов К.А, Тарабыкин B.C., Свердлов Е.Д. Высокоэффективная вычитающая гибридизация кДНК // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. №6. С. 701-704.

5. Малярова Е.Ю., Мушкин А.Ю., Коваленко К.Н., Кондратенко И.В. Лечение множественных костных поражений у ребёнка с генерализованной BCG-инфекцией // Пробл. туберк. болезн. лёгких. 2005. №. 11. С. 34-36.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж, Методы генетической инженерии.-Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

7. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 436 с.

8. Милькаманович В.К. Диагностика и лечение болезней органов дыхания. Минск: Полифакт-Альфа, 1997. 360 с. (Практическое руководство).

9. Решетников С.С. Применение набора реагентов "АТ-Туб-Бест" для диагностики туберкулёза (вопросы и ответы) // Новости "Вектор-Бест". 2007. № 4(46). С. 89.

10. Ю.Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров В.И. Новая тест-система для серодиагностики туберкулёза // Новости "Вектор-Бест". 1998. № 3(9). С. 3-7.

11. П.Свердлов Е.Д., Ермолаева О.Д. Вычитающая гибридизация. Теоретический анализ и принцип ловушки // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. № 11. С. 1081—1088.

12. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.

13. Гланц С. Медико-биологическая статистика М.: Практика, 1998. 459 с.

14. Adams J.F., Scholvinck Е.Н., Gie R.P., Potter P.C., Beyers N., Beyers A.D. Decline in total serum IgE after treatment for tuberculosis // Lancet. 1999. V. 353. № 9169. P. 2030-2033.

15. Al-Attiyah R., Mustafa A.S. Characterization of Human Cellular Immune Responses to Novel Mycobacterium tuberculosis Antigens Encoded by Genomic Regions Absent in Mycobacterium bovis BCG // Infect. Immun. 2008. V. 76. № 9. P. 41904198.

16. Al-Attiyah R., Shaban F.A., Wiker H.G., Oftung F., Mustafa A.S. Synthetic peptides identify promiscuous human Thl cell epitopes of the secreted mycobacterial antigen MPB70 // Infect. Immun. 2003. V. 71. № 4. P. 1953-1960.t

17. Amara R.R., Satchidanandam V. Analysis of a genomic DNA expression library of Mycobacterium tuberculosis using tuberculosis patient sera: evidence for modulation of host immune response // Infect. Immun. 1996. V. 64. № 9. P. 3765-3771.

18. Andersen A.B., Hansen E.B. Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b, a 38,000-molecular-weight protein of Mycobacterium tuberculosis 11 Infect. Immun. 1989. V. 57. № 8. P. 2481-2488.

19. Barenholz A., Hovav A.H., Fishman Y., Rahav G., Gershoni J.M., Bercovier H. A peptide mimetic of the mycobacterial mannosy-lated lipoarabinomannan: characterization and potential applications // J. Med. Microbiol. 2007. V. 56. № 5. P. 579-586.

20. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H., Schoolnik G.K., Rane S., Small P.M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray // Science. 1999. V. 284. № 5419. P. 1520-1523.

21. Betts J.C., Dodson P., Quan S., Lewis A.P., Thomas P.J., Duncan K., McAdam R.A. Comparison of the proteome of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv with clinical isolate CDC 1551 //Microbiology. 2000. V. 146. № 12. P. 3205-3216.

22. Bhaskar S., Khanna S.P., Mukherjee R. Isolation, purification and immunological characterization of novel low molecular weight protein antigen CFP 6 from culture filtrate of M. tuberculosis // Vaccine. 2000. V. 18. № 25. P. 2856-2866.

23. Billman-Jacobe H., Sloan J., Coppel R.L. Analysis of isoniazid-resistant transposon mutants of Mycobacterium smegmatis // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 144. № 1. P. 47-52.

24. Brock I., Munk M.E., Kok-Jenson A., Anderson P. Performance of whole blood IFN-y test for tuberculosis diagnosis based on PPD or the specific antigen ESAT-6 and CFP-10 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2001. V. 5. № 5. P. 462-467.

25. Brock I., Weldingh K., Leyten E.M., Arend S.M., Ravn P., Andersen P. Specific T-cell epitopes for immunoassay-based diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection // J. Clin. Microbiol. 2004. V. 42. № 6. P. 2379-2387.

26. Brock I., Weldingh K., Lillebaek T.,'Follmann F., Anderson P. Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004. V. 170. № 1. P. 65-69.

27. Brosch R., Gordon S.V., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Soravito C., Barrell

28. B.G., Cole S.T. Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificialichromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics // Infect. Immun. 1998. V. 66. № 5. P. 2221-2229.

29. Brosch R., Gordon S.V., Buchrieser C., Pym A.S., Gamier Т., Cole S.T. Comparative genomics uncovers large tandem chromosomal duplications in Mycobacterium bovis BCG Pasteur//Yeast. 2000. V. 17. №2. P. 111-123.

30. Camacho L.R., Ensergueix D., Perez E., Gicquel В., Guilhot C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis // Mol. Microbiol. 1999. V. 34. № 2. P. 257-267.

31. CDC Trends in tuberculosis United States, 1998-2003 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. (MMWR). 2004. V. 53. S. 209-214.

32. Chaitra M.G., Hariharaputran S., Chandra N.R., Shaila M.S., Nayak R. Defining putative T cell epitopes from PE and PPE families of proteins of Mycobacterium tuberculosis with vaccine potential // Vaccine. 2005. V. 23. № 10. P. 1265-1272.

33. Chakravorty S., Tyagi J.S. Novel multipurpose methodology for detection of mycobacteria in pulmonary and extrapulmonary specimens by smear microscopy, culture, and PCR // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. № 6. P. 2697-2702.

34. Cho S.N. Current issues on molecular and immunological diagnosis of tuberculosis // Yonsei Med. J. 2007. V. 48. № 3. P. 347-359.

35. Chung C.T., Niemela S.L., Miller R.H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. № 7. P. 2172-2175.

36. Daniel T.M., Debanne S.M., van der Kuyp F. Enzyme-linked immunosorbent assay using Mycobacterium tuberculosis antigen 5 and PPD for the erodiagnosis of tuberculosis I I Chest. 1985. V. 88. № 3. P. 388-392.

37. Delogu G., Sanguinetti M., Pusceddu C., Bua A., Brennan M.J., Zanetti S., Fadda G. PEPGRS proteins are differentially expressed by Mycobacterium tuberculosis in host tissues // Microbes Infect. 2006. V. 8. № 8. P. 2061-2067.

38. Desem N., Jones S. L. Development of a human gamma interferon enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. V. 5. № 4. P. 531-536.

39. Dieckman L., Gu M., Stols L., Donnelly M.I., Collart F.R. High throughput methods for gene cloning and expression // Protein Expr. Purif. 2002. V. 25. № 1. P. 1-7.

40. Djelouadji Z., Raoult D., Daffe M., Drancourt M. A Single-Step Sequencing Method for the Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Species // PLoS Negl. Trop. Dis. 2008. V. 2. № 6. e253. P. 1-8.

41. Drancourt M., Carrieri P., Gevaudan M.J., Raoult D. Blood agar and Mycobacterium tuberculosis: the end of a dogma // J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41. № 4. P. 1710— 1711.

42. Dorokhov Y.L., Sheveleva A.A., Frolova O.Y., Komarova T.V., Zvereva A.S., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves //Tuberculosis (Edinb). 2007. V. 87. № 3. P. 218-224.

43. Drancourt M., Raoult D. Cost-effectiveness of blood agar for isolation of mycobacteria // PLoS Negl. Trop. Dis. 2007. V. 1. № 2. e83. P. 1-5.

44. Flores A.R., Parsons L.M., Pavelka M.S. Jr. Characterization of novel Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium smegmatis mutants hypersusceptible to beta-lactam antibiotics //J. Bacteriol. 2005. V. 187. № 6. P. 1892-1900.

45. Gao L.Y., Guo S., McLaughlin В., Morisaki H., Engel J.N., Brown E.J. A mycobacterial virulence gene cluster extending RD1 is required for cytolysis, bacterial spreading and ESAT-6 secretion // Mol. Microbiol. 2004. V. 53. № 6. P. 1677-1693.

46. Geluk A., Lin M.Y., van Meijgaarden K.E., Leyten E.M.S., Franken K.L.M.C., Ottenhoff T.H.M., Klein M.R. T-Cell Recognition of the HspX Protein of

47. Mycobacterium tuberculosis Correlates with Latent M. tuberculosis Infection but Not with M. bovis BCG Vaccination // Infect. Immun. 2007. V. 75. № 6. P. 2914-2921.

48. Geourjon C., Deleage G. SOPMA: significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments // Comput. Appl. Biosci. 1995. V. 11. №6. P. 681-684.

49. Giri P.K., Schorey J.S. Exosomes derived from M. bovis BCG infectcd macrophages activate antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells in vitro and in vivo // PLoS ONE. 2008. V. 3.№6. c2461.

50. Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing. WHO report 2007. Geneva, World Health Organization, 2007 (WHO/HTM/TB/2007.376).

51. Goldsby R.A., Kindt T.J., Kuby J., Osborne В .A. Immunology. 5th ed. N.-Y.: W.H. Freeman & Co., Amherst College, MA, 2003. (Immunology textbook for students).

52. Gordon S.V., Brosch R., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Cole S.T. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays // Mol. Microbiol. 1999. V. 32. № 3. P. 643-655.

53. Guilhot С., Otal I., Van Rompaey I., Martin C., Gicquel B. Efficient transposition in mycobacteria: construction of Mycobacterium smegmatis insertional mutant libraries //J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 2. P. 535-539.

54. Harboe M., Malin A.S., Dockrell H.S., Wiker H.G., Ulvund G., Holm A., Jorgensen M.C., Andersen P. B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1998. V. 66. № 2. P. 717-723.

55. He X.Y., Zhuang Y.H., Zhang X.G., Li G.L. Comparative proteome analysis of culture supernatant proteins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra // Microbes Infect. 2003. V. 5. № 10. P. 851-856.

56. Hendrix R.W., Smith M.C., Burns R.N., Ford M.E., Hatfull G.F. Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: all the world's a phage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 5. P. 2192-2197.

57. Hernandez Pando R., Aguilar L.D., Infante E., Cataldi A., Bigi F., Martin C., Gicquel B. The use of mutant mycobacteria as new vaccines to prevent tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). 2006. V. 86. № 3/4. P. 203-210.

58. Honda I., Seki M., Ikeda N., Yamamoto S., Yano I., Koyama A., Toida I. Identification of two subpopulations of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) Tokyo 172 substrain with different RD16 regions // Vaccine. 2006. V. 24. № 23. P. 4969-4974.

59. Infante E., Aguilar L.D., Gicquel В., Pando R.H. Immunogenicity and protective efficacy of the Mycobacterium tuberculosis fadD26 mutant // Clin. Exp. Immunol. 2005. V. 141. № 1. P. 21-28.

60. Jackett P.S., Bothamley G.H., Batra H.V., Mistry A., Young D.B., Ivanyi J. Specificity of antibodies to immunodominant mycobacterial antigens in pulmonary tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1988. V. 26. № 11. P. 2313-2318.

61. Jenkin G.A., Stinear T.P., Johnson P.D., Davies J.K. Subtractive hybridization reveals a type I polyketide synthase locus specific to Mycobacterium ulcerans II J. Bacteriol. 2003. V. 185. № 23. P. 6870-6882.

62. Jungblut P.R., Miiller E.C., Mattow J., Kaufmann S.H. Proteomics reveals open reading frames in Mycobacterium tuberculosis H37Rv not predicted by genomics // Infect. Immun. 2001. V 69. № 9. P. 5905-5907.

63. Jurzak M., Boer R, Fritzsch G., Kojro E., Fahrenholz F. Monoclonal antibodies against different epitopes of peptide hormones. Use of photoreactivc analogues in studies on vasopressin // Eur. J. Biochem. 1990. V. 190. № l.P. 45-52.

64. Kalpana G.V., Bloom B.R., Jacobs W.R. Jr. Insertional mutagenesis andiillegitimate recombination in mycobacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 12. P. 5433-5437.

65. Kashyap R.S., Dobos K.M., Belisle J.T., Purohit H.J., Chandak N.H., Taori G.M., Daginawala H.F. Demonstration of components of antigen 85 complex in CSF of Tuberculous meningitis patients // Clinical Diagn. Lab. Immunol. 2005. V. 12. № 6. P. 752-758.

66. Kato-Maeda M., Rhee J.T., Gingeras T.R., Salamon H., Drenkow J., Smittipat N., Small P.M. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis II Genome Res. 2001. V. 11. №4. P. 547-554.

67. Katti M.K. Assessment of RD 1-encoded mycobacterial antigens in the immunodiagnosis of pulmonary, extrapulmonary, and latent tuberculosis infections // J. Infect. Dis. 2001. V. 184. № 11. P. 1497-1498.

68. Kutlu A., Bozkanat E., Cift<?i F., Bozkurt В., Gorur R., Ardi? N., Taskapari O. Effect of active tuberculosis on skin prick allergy tests and serum IgE levels // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2008. V. 18. № 2. P.113-118.

69. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.

70. Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy // Chest. 2007. V. 131. № 6. P. 1898-1906.

71. Lamichhane G., Tyagi S., Bishai W.R. Designer arrays for defined mutant analysis to detect genes essential for survival of Mycobacterium tuberculosis in mouse lungs // Infect. Immun. 2005. V. 73. № 4. P. 2533-2540.

72. Lemus D., Martin A., Montoro E., Portaels F., Palomino J.C. Rapid alternative methods for detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis II J. Antimicrob. Chemother. 2004. V. 54. № 1. P. 130-133.

73. Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., Hickey M.J., Smith S., Behr M.A., Sherman D.R. Deletion of RD1- from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation // J. Infect. Dis. 2003. V. 187. № 1. P. 117-123.

74. Leyten E.M.S., Prins C., Bossink A.W.J., Thijsen S., Ottenhoff T.H.M., van Dissel J.T., Arend S.M. Effect of tuberculin skin testing on a Mycobacteriumtuberculosis-specific interferon-y assay // Eur. Respir. J. 2007. V. 29. № 6. P. 1212— 1216.

75. Lim R.L., Tan L.K., Lau W.F., Ming M.C., Dunn R, Too H.P., Chan L. Cloning and Expression of Immunoreactive Antigens from Mycobacterium tuberculosis II Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. V. 7. № 4. P. 600-606.

76. Litwin C.M. In vitro gamma interferon tests for the detection of tuberculosis infection // J. Immunotoxicol. 2007. V. 4. № 3. P. 219-224.

77. Liu J., Tran V., Leung A.S., Alexander D.C., Zhu B. BCG vaccines: Their mechanisms of attenuation and impact on safety and protective efficacy // Hum. Vaccin. 2009. V. 5. № 2. P. 70-78.

78. LoBue P., Sizemore C., Castro K.G. Plan to Combat Extensively Drug-Resistant Tuberculosis // Morb. Mortal. Wkly. Rep. (MMWR). 2009. V. 58. № RR-3. P. 1-48.

79. MacGum J.A., Cox J.S. A genetic screen for Mycobacterium tuberculosis mutants defective for phagosome maturation arrest identifies components of the ESX-1 secretion system // Infect. Immun. 2007. V. 75. № 6. P. 2668-2678.

80. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickcy M.J., Singh D.C., Stover C.K. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis И J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 5. P. 1274-1282.

81. Malen H., Softeland Т., Wiker H.G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins // Scand. J. Immunol. 2008. V. 67. № 3. P. 245-252.

82. Manca C., Lyashchenko K., Colangeli R., Gennaro M.L. MTC28, a novel 28-kilodalton proline-rich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex // Infect. Immun. 1997. V. 65. № 12. P. 4951-4957.

83. Manca C., Lyashchenko K., Wiker H.G., Usai D., Colangeli R., Gennaro M.L. Molecular cloning, purification, and serological characterization of MPT63, a novel antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1997. V. 65. № 1. P. 16-23.

84. Maus C.E., Plikaytis B.B., Shinnick T.M. Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 2005. V. 49. №2. P. 571-577.

85. Mostowy S., Tsolaki A.G., Small P.M., Behr M.A. The in vitro evolution of BCG vaccines // Vaccine. 2003. V. 21. № 27/30. P. 4270-4274.

86. Mustafa A.S., Al-Attiyah R. Tuberculosis: Looking Beyond BCG Vaccines // J. Postgrad. Med. 2003. V. 49. № 2. P. 134-140.

87. Nagai S., Matsumoto J., Nagasuga T. Specific skin-reactive protein from culture filtrate of Mycobacterium bovis BCG // Infect. Immun. 1981. V. 31. № 3. P. 1152— 1160.

88. Nagai S., Wiker H.G., Harboe M., Kinomoto M. Isolation and partial characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1991. V. 59. № 1. P. 372-382.

89. Nakamura R.M., Einck L., Velmonte M.A., Kawajiri K., Ang C.F., Delasllagas C.E., Nacy C.A. Detection of active tuberculosis by an MPB64 transdermal patch: a field study // Scand. J. Infect. Dis. 2001. V. 33. № 6. P. 405^107.

90. O'Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. № 10. P. 4007^1021.

91. Pai M., Kalantri S., Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosisof tuberculosis: Part I. Latent tuberculosis // Expert Rev. Mol. Diagn. 2006. V. 6. №3. P. 413-422.

92. Pai M., Kalantri S., Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: Part II. Active tuberculosis and drug resistance // Expert Rev. Mol. Diagn. 2006. V. 6. № 3. P. 423-432.

93. Pai M., Riley L.W., Colford J.M. Jr. Interferon gamma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review // Lancet Infect. Dis. 2004. V. 4. № 12. P.761-776.

94. Pethe K., Swenson D.L., Alonso S., Anderson J., Wang C., Russell D.G. Isolation of Mycobacterium tuberculosis mutants defective in the arrest of phagosome maturation//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 37. P. 13642-13647.

95. Petroff S.A., Branch A. Bacillus Calmette-Guerin (B.C.G.): Animal Experimentation and Prophylactic Immunization of Children // Am. J. Public Health Nations Health. 1928. V. 18. № 7. P. 843-864.

96. Pina-Vaz С., Costa-de-Oliveira S., Rodrigues A.G. Safe susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry with the fluorescent nucleic acid stain SYTO 16 // J. Med. Microbiol. 2005. V. 54. № 1. P. 77-81.

97. Pitarque S., Larrouy-Maumus G., Payre В., Jackson M., Puzo G., Nigou J. The immunomodulatory lipoglycans, lipoarabinomannan and lipomannan, are exposed at the mycobacterial cell surface // Tuberculosis (Edinb). 2008. V. 88. № 6. P. 560-565.

98. Pym A.S., Brodin P., Brosch R., Huerre M., Cole S.T. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti II Mol. Microbiol. 2002. V. 46. № 3. P. 709-717.

99. Reisner A.H. Gel protein stains: a rapid procedure // Methods Enzymol. 1984. V. 104. P. 439-441.

100. Reisner A.H., Nemes P., Bucholtz C. The use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels //Anal. Biochem. 1975. V. 64. № 2. P. 509-516.

101. Reisner B.S., Gatson A.M., Woods G.L. Evaluation of mycobacteria growth indicator tubes for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1995. V. 22. № 4. P. 325-329.

102. Rengarajan J., Bloom B.R., Rubin E.J. Genome-wide requirements for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 23. P. 8327-8332.

103. Reuter H., Burgess L., van Vuuren W., Doubell A. Diagnosing tuberculous pericarditis // Quarterly journal of medicine (QJM). 2006. V. 99. № 12. P. 827-839.

104. Rezai M.S., Khotaei G., Mamishi S., Kheirkhah M., Parvaneh N. Disseminated Bacillus Calmette-Guerin Infection after BCG Vaccination // J. Trop. Pediatr. 2008. V. 54. №6. P. 413-416.

105. Rezwan M., Laneelle M.-A., Sander P., Daffe M. Breaking down the wall: Fractionation of mycobacteria//J. Microbiol. Meth. 2007. V. 68. № 1. P. 32-39.

106. Richeldi L. An update on the diagnosis of tuberculosis infection // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. V. 174. № 7. P. 736-742.

107. Roche P.W., Feng C.G., Britton W.J. Human T-cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis 'secreted protein MPT64 // Scand. J. Immunol. 1996. V. 43. № 6 P. 662-670.

108. Roche P.W., Peake P.W., Billman-Jacobe H., Doran Т., Britton W.J. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB59 of Mycobacterium bovis H Infect. Immun. 1994. V. 62. № 12. P. 5319-5326.

109. Rom W.N., Yie T.A., Tchou-Wong K.M. Development of a suicide gene as a novel approach to killing Mycobacterium tuberculosis II Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997. V. 156. № 6. P. 1993-1998.

110. Rosenkrands I., Aagaard C., Weldingh K., Brock I., Dziegiel M.H., Singh M., Hoff S., Ravn P., Andersen P. Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). 2008. V. 88. № 4. P. 335-343.

111. Salamon II., Kato-Maeda M., Small P.M., Drenkow J., Gingeras T.R. Detection of deleted genomic DNA using a semiautomated computational analysis of GeneChip data // Genome Res. 2000. V. 10. № 12. P. 2044-2054.

112. Sassetti C.M., Boyd D.H., Rubin E.J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis // Mol. Microbiol. 2003. V. 48. № 1. P. 77-84.

113. Senaratne R.H., Mougous J.D., Reader J.R., Williams S.J., Zhang Т., Bertozzi C.R., Riley L.W. Vaccine efficacy of an attenuated but persistent Mycobacterium tuberculosis cysH mutant // J. Med. Microbiol. 2007. V. 56. № 4. P. 454-458.

114. Sharma A., Saha A., Bhattacharjee S., Majumdar S., Das Gupta S.K. Specific and randomly derived immunoactive peptide mimotopes of mycobacterial antigens // Clin. Vaccine Immunol. 2006. V. 13. № 10. P. 1143-1154.

115. Sherman D.R., Guinn K.M., Hickey M.J., Mathur S.K., Zakel K.L., Smith S. Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Delta RD1 is more virulent than M. bovis bacille Calmette-Guerin in long-term murine infection // J. Infect. Dis. 2004. V. 190. № 1. P. 123-126.

116. Shizuya H., BirrenB., Kim U.J., Mancino V., Slepak Т., Tachiiri Y., Simon M. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in

117. Escherichia coli using an F-factor-based vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 18. P. 8794-8797.

118. Singh S.K., Shah N.K., Bisen P.S. A synthetic gag p24 epitope chemically coupled to BSA through a decaalanine peptide enhances HIV type 1 serodiagnostic ability by several folds // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2007. V. 23. № 1. P. 153— 160.

119. Sorensen A.L., Nagai S., Houen G., Andersen P., Andersen A.B. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1995. V. 63. № 5. P. 1710-1717.

120. Stewart G.R., Patel J., Robertson B.D., Rae A., Young D.B. Mycobacterial mutants with defective control of phagosomal acidification // PLoS Pathog. 2005. V. 1. № 3. P. 269-278.

121. Straus D., Ausubel F.M. Genomic subtraction for cloning DNA corresponding to deletion mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. № 5. P. 1889-1893.

122. Taggart E.W., Hill H.R., Ruegner R.G., Martins T.B., Litwin C.M. Evaluation of an in vitro assay for gamma-interferon production in response to Mycobacterium tuberculosis infections // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11. № 6. P. 10891093.

123. Talarico S., Zhang L., Marrs C.F., Foxman В., Cave M.D., Brennan M.J., Yang Z. Mycobacterium tuberculosis PEPGRS16 and PEPGRS26 genetic polymorphism among clinical isolates // Tuberculosis (Edinb). 2008. V. 88. № 4. P. 283-294.

124. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. № 5. P. 523-533.

125. Tortoli E., Cichero P., Piersimoni C., Simonetti M.T., Gesu G., Nista D. Use of BACTEC MGIT 960 for recovery of mycobacteria from clinical specimens: multicenter study // J. Clin. Microbiol. 1999. V. 37. № 11. P. 3578-3582.

126. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. № 9. P. 4350-4354.

127. Van Pinxteren L.A., Ravn P., Agger E.M., Pollock J., Andersen P. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10 // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. V. 7. № 2. P. 155-160.

128. Vani J., Shaila M.S., Chandra N.R., Nayak R. A combined immuno-informatics and structure-based modeling approach for prediction of T cell epitopes of secretory proteins of Mycobacterium tuberculosis И Microbes Infect. 2006. V. 8. № 3. P. 738746.

129. Veenstra H., Crous I., Brahmbhatt S., Lukey P., Beyers N., van Helden P.D., Walzl G. Changes in the kinetics of intracellular IFN-gamma production in ТВ patients during treatment// Clin. Immunol. 2007. V. 124. № 3. P. 336-344.

130. Wallis R.S., Aide S.L., Havlir D.V., Amir-Tahmasseb M.H., Daniel T.M., Ellner J.J. Identification of antigens of Mycobacterium tuberculosis using human monoclonal antibodies // J. Clin. Invest. 1989. V. 84. № 1. P. 214-219.

131. Wang A., Clapper J., Guderian J.A., Foy T.M., Fanger G.R., Retter M.W., Skeiky Y.A. A novel method for increasing the expression level of recombinant proteins // Protein Expr. Purif. 2003. V. 30. № 1. P. 124-133.

132. Wang B.L., Xu Y., Wu C.Q., Xu Y.M., Wang H.H. Cloning, expression, and refolding of a secretory protein ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis // Protein Expr. Purif. 2005. V. 39. № 2. P. 184-188.

133. Wang J., Zganiacz A., Xing Z. Enhanced immunogenicity of BCG vaccine by using a viral-based GM-CSF transgene adjuvant formulation // Vaccine. 2002. V. 20. № 23/24. P. 2887-2898.

134. Weldingh K., Andersen P. Immunological evaluation of novel Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. V. 23. №2. P. 159-164.

135. West N.P., Wozniak T.M., Valenzuela J., Feng C.G., Sher A., Ribeiro J.M., Britton W.J. Immunological diversity within a family of cutinase-like proteins of Mycobacterium tuberculosis I/ Vaccine. 2008. V. 26. № 31. P. 3853-3859.

136. WHO Report 2009. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. P. 1-314.

137. Williams-Bouyer N., Yorke R., Lee H.I., Woods G.L. Comparison of the ВАСТЕС MGIT 960. and ,ESP culture system II for growth and detection of mycobacteria//J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. № 11. P. 4167-4170.

138. Yang Z., Barnes P.F., Chaves F., Eisenach K.D., Weis S.E., Bates J.H., Cave M.D. Diversity of DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis isolates in the United States // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. № 4. P. 1003-1007.

139. Young R.A., Bloom B.R., Grosskinsky C.M., Ivanyi J., Thomas D., Davis R.W. Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. № 9. P. 2583-2587.

140. Yiice A., Yucesoy M., Gen? S., Sayan M., U?an E.S. Serodiagnosis of, tuberculosis by enzyme immunoassay using A60 antigen // Clin. Microbiol. Infect. 2001. V. 7. №7. P. 372-376.

Информация о работе

Болдырев, Александр Николаевич
кандидата биологических наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы