Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода дифференциального выявления микобактерий туберкулезного комплекса с использованием однопробирочной многоцикловой амплификации двух геномных нуклеотидных последовательностей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хорошева, Евгения Марковна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биология и эпидемиология микобактерий туберкулезного комплекса

1.2. Применение методов молекулярной биологии к эпидемиологии туберкулеза.

1.2.1. Видоспецифичные белки микобактерий.

1.2.2. Видоспецифичные нуклеотидные последовательности геномов микобактерий.

1.2.3. Типирование изолятов возбудителей туберкулеза по количеству и местам интеграции в бактериальную хромосому инсерционного элемента

IS6110.

1.2.4. Применение ПЦР для детекции ДНК микобактерий в клинических ч • образцах. -У. с у. Ли.:.'.

1.3. Современные способы обнаружения микобактерий, их недостатки и преимущества.

1.3.1. Специфичность и чувствительность детекции микобактерий методом

ПЦР. Факторы на них влияющие.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода дифференциального выявления микобактерий туберкулезного комплекса с использованием однопробирочной многоцикловой амплификации двух геномных нуклеотидных последовательностей"

В последние годы во всем мире отмечается рост заболеваемости туберкулезом. Ежегодно выявляется около 8 миллионов новых случаев туберкулеза и около 3 миллионов людей умирают от этой инфекции [1]. Известно, что 75-80% взрослого населения нашей планеты инфицированы туберкулезом. Риск возникновения болезни у инфицированного человека составляет приблизительно 1-4% на каждые 25 лет его жизни [2]. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения за 2000 год, в период между 2000 и 2020 годами один миллиард людей будет инфицирован туберкулезом. Активный туберкулез разовьется у 200 миллионов человек, из них у 35 миллионов развитие туберкулеза приведет к летальному исходу, если для сдерживания развития и распространения этого заболевания будут использоваться те же методы диагностики и лечения, которыми здравоохранение располагает на сегодняшний день.

В практической медицине и ветеринарии для выявления возбудителей туберкулеза традиционно используют метод световой микроскопии и метод культивирования микобактерий на селективных средах. Световая микроскопия является быстрым методом (на проведение анализа требуется несколько часов), но характеризуется низкой чувствительностью [3]. Метод выявления возбудителей туберкулеза при помощи культивирования микроорганизмов на селективных средах, обладает высокими чувствительностью и специфичностью (около 100%). Однако, поскольку возбудители туберкулеза характеризуются медленным ростом (деление происходит 1 раз в 15-20 часов) [2], то применение метода культивирования микобактерий требует значительных затрат времени (около 8 недель) [4].

Создание в последние десятилетия библиотек генов туберкулезных бактерий, а также накопление информации о видовой специфичности белков и нуклеотидных последовательностей возбудителей туберкулеза, предоставляют возможность использовать некоторые методы молекулярной биологии для быстрой (идентификации ДНК возбудителей туберкулеза.

В последние годы для выявления возбудителей туберкулеза созданы зарубежные и отечественные диагностические тесты на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые характеризуются одновременно высокими чувствительностью, специфичностью и скоростью проведения анализа [5, 6, 7, 8, 9, ,10]. Однако, применение метода ПЦР в лабораторной диагностике туберкулеза выявило ряд специфических проблем. Прежде всего, при проведении двухраундовой ПЦР возникает риск перекрестной контаминации реакционных смесей ампликонами первого раунда и, как следствие этого, получение ложноположительных результатов анализа [11]. Проведение же ПЦР за один раунд не обеспечивает высокой чувствительности выявления микобактерий [12]. Кроме этого, в зависимости от способа выделения ДНК микобактерий из клинических образцов, от 2,6% до 10% препаратов могут содержать ингибиторы термостабильной ДНК-полимеразы [6, 7, 8, 13], приводящие к ложноотрицательным результатам анализа. Правильный подбор для амплификации нуклеотидных последовательностей-мишеней, строго специфичных для возбудителей туберкулеза, консервативных и присущих геномам всех изолятов МТК также влияет на специфичность и чувствительность выявления возбудителей туберкулеза [14,15].

Очевидно, что преимущества метода ПЦР как такового, могли бы быть использованы в большей или меньшей степени в зависимости от решения данных проблем при разработке дизайна способа диагностики туберкулеза. Таким образом, разработка достоверного метода быстрого обнаружения возбудителей туберкулёза в клинических образцах с помощью ПЦР, который характеризовался бы одновременно высокой специфичностью и чувствительностью, представляется на сегодняшний день .актуальной задачей.

Целью настоящего исследования являлась разработка быстрого, информативного, высокоспецифичного и высокочувствительного метода выявления геномной ДНК возбудителей туберкулеза в клинических образцах, [Пригодного для широкого использования в практическом здравоохранении и ветеринарии. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- подобрать на основе анализа литературных данных и собственной экспериментальной проверки консервативные и специфичные только для геномов МТК нуклеотидные последовательности, которые можно было бы использовать в качестве специфичных диагностических мишеней в ПЦР-анализе; ;

- выбрать оптимальный метод выделения ДНК из микобактерий, обеспечивающий наибольший выход ДНК, пригодной для анализа методом ПЦР;

- сконструировать рекомбинантную ДНК, которая при внесении её в реакционные смеси могла бы служить в качестве положительного внутреннего контроля прохождения ПЦР (ДНК внутреннего стандарта);

- оптимизировать условия проведения одновременной амплификации выбранных нуклеотидных последовательностей-мишеней и ДНК внутреннего стандарта в один раунд в течение многих циклов, для обеспечения высокой чувствительности обнаружения геномной ДНК возбудителей туберкулёза; :

- апробировать разработанный метод выявления возбудителей туберкулёза на клинических образцах для оценки его пригодности в лабораторной диагностике туберкулеза. ;

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хорошева, Евгения Марковна

выводы.

1. Разработан способ дифференциального обнаружения геномных ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (МТК) методом мультипраймерной ПЦР, исключающий выявление ДНК вакцинных штаммов M.bovis BCG и, следовательно, возможность получения ложноположительных результатов анализа у недавно вакцинированных людей и животных.

2. Выбран и предложен быстрый и простой в исполнении метод выделения ДНК из микобактерий, который обеспечивает наибольший выход ДНК, пригодной для анализа методом ПЦР.

3. В экспериментах на музейных штаммах и клинических изолятах МТК продемонстрирована диагностическая ценность совместного использования двух выбранных для амплификации мишеней, одна из которых - фрагмент области RD1 генома M.tuberculosis, была впервые использована для детекции геномных ДНК МТК.

4. Используемая в тест-системе рекомбинантная ДНК внутреннего стандарта позволяет осуществлять контроль прохождения ПЦР в каждом анализируемом образце.

5. Подобранные оригинальные условия проведения многоцикловой (51 циклов) однораундовой амплификации ДНК обеспечивают поддержание активности термостабильной ДНК-полимеразы и существенное повышение чувствительности ПЦР-анализа.

6. Разработанный способ дифференциального выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса является быстрым, высокочувствительным, информативным и высокоспецифичным и представляет собой законченный метод, пригодный для использования в практическом здравоохранении для диагностики туберкулезной инфекции, контроля над эффективностью противотуберкулёзной терапии.

7. Проведена апробация разработанного способа детекции и типирования микобактерий на 37 клинических образцах. Показана высокая специфичность анализа и 100%-ная выявляемость возбудителей в клинических образцах от больных туберкулезом при использовании этого способа.

Автор благодарит: своего научного руководителя к.б.н. Беклемишива А.Б. за руководство и всестороннюю поддержку настоящей работы; к.б.н. Номоконову Н.Ю. за большую помощь в работе, к.б.н. Морозова И.В. за ценные методологические советы, д.м.н. Аутеншлюса А.И. за помощь в получении инактивированных микобактерий и вакцинного штамма M.bovis BCG; д.м.н. Шкунова А.Н. за предоставление клинических образцов для анализа, а также за ценные советы при подборе групп обследуемых пациентов; к.б.н. Шаманина В.А. за большое участие в работе; к.б.н. Гимаутдинову О.И. за моральную поддержку и ценные советы при написании диссертации; к.м.н. Кузнецова Павла Валерьевича за предоставление различных штаммов микобактерий; к.м.н. Бакунову Галину Михайловну за обеспечение параллельного исследования клинических образцов методами микроскопии и культивирования и предоставление базы для выделения ДНК из образцов; всех сотрудников лаборатории генетической инженерии НИИ биохимии СО РАМН за моральную поддержку и дружескую атмосферу, способствующую плодотворной работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Способ выявления геномных ДНК представителей МТК с одновременной идентификацией ДНК M.bovis, основанный на методе двухраундовой ПЦР обладает высокой чувствительностью. За счет подбора достаточно консервативных видоспецифичных мишеней, следует ожидать его высокой специфичности даже при анализе большой выборки образцов. Использование рационального метода выделения ДНК позволяет минимизировать снижение чувствительности анализа. Следует ожидать, что данный метод будет позволять в большинстве случаев судить о принадлежности возбудителя туберкулеза к виду M.bovis или M.tuberculosis.

Однако к недостаткам этого способа можно отнести: необходимость проведения реакции в два раунда, что повышает риск кросс-контаминации образцов продуктами амплификации 1-го раунда; многокопийность инсерционного элемента (1-19 копий в геномах различных изолятов) осложняет создание сбалансированной мультиплексной системы ПЦР и не позволяет использовать в данном способе ДНК внутреннего стандарта для контроля над прохождением реакции в каждом образце; всвязи с отсутствием инсерционного элемента Т^б 110 и гена mtp40 в геномах некоторых изолятов M.tuberculosis существует риск получения ложноотрицательных результатов ПЦР; для проведения анализа затрачивается больше времени, чем при использовании способа, основанного на однораундовой многоцикловой ПЦР; существует также некоторая возможность получения ложноположительных результатов анализа у здоровых лиц, вакцинированных БЦЖ.

Способ выявления геномных ДНК возбудителей туберкулеза, основанный на методе однораундовой многоцикловой мультиплексной ПЦР также обладает высокой чувствительностью и следует ожидать его высокой специфичности за счет рационального подбора ДНК-мишеней для амплификации. Применение в данном способе детекции ДНК внутреннего положительного контроля (ДНК ВК) прохождения ПЦР позволит регистрировать возможные случаи ингибирования Тод-полимеразы в анализируемых образцах и, следовательно, отслеживать ложноотрицательные результаты анализа. Проведение реакции в одной пробирке позволяет снижать риск перекрестной контаминации образцов продуктами амплификации. В тоже время подобранные условия проведения ПЦР в течение многих циклов обеспечивают достаточно высокую чувствительность метода. Важным достоинством данного способа детекции ДНК является и то, что ни одна из ДНК-мишеней, выбранных для амплификации не содержится в геномах вакцинных штаммов М. bovis BCG, что существенно, учитывая высокий процент вакцинированного населения и длительность циркуляции БЦЖ в организме. Следует ожидать, что данный метод будет позволять в большинстве случаев судить о принадлежности возбудителя к видам М. bovis или М. tuberculosis, что позволит уточнять эпидемиологическую обстановку по туберкулезу.

Более низкая чувствительность этого метода (выявляется от 500 микобактерий в анализируемом образце) по сравнению с чувствительностью выявления микобактерий методом двухраундовой ПЦР (выявляется от 200 микобактерий в анализируемом образце) не может рассматриваться как серьезный недостаток, так как она, тем не менее, сравнима с чувствительностью выявления микобактерий методом культивирования на селективной среде.

В целом можно утверждать, что разработанный способ дифференциального выявления геномных ДНК представителей МТК основанный на методе однораундовой многоцикловой мультиплексной ПЦР, является более удобным и эффективным, чем способ дифференциального выявления геномных ДНК возбудителей туберкулеза, основанный на методе двухраундовой ПЦР.

Оба метода могут быть использованы в медицинской практике для диагностики туберкулезной инфекции, контроля над эффективностью противотуберкулёзной терапии и для оценки эпидемиологической ситуации по туберкулёзу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хорошева, Евгения Марковна, Новосибирск

1. Barnes, P.F., Barrow, S.A., «Tuberculosis in the 1990s», Ann. Intern. Med., 1993, vol. 119, 400-410.

2. И.Г.Урсов. «Эпидемиология туберкулеза», Новосибирск, 1997.

3. Behr MA, Warren SA, Salamon H, Hopewell PC, Ponce de Leon A, Daley CL, Small PM. «Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli», Lancet 1999 Feb 6;353(9151):444-9.

4. Daniel T.M., «The rapid diagnosis of tuberculosis, a selective review.» J. Lab. Clin. Med. 1990, vol. 116, 277-282.

5. Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. «Разработка методаидентификации микобактерий бычьего и человеческого видов с использованием реакции цепной полимеризации» Мол.генетика, микробиол., вирусол.-1993. Т.З. -С.27-30.

6. Folguerra L., Delgado. R., et al., «Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in clinicalsamples by using a simple lysis method and polymerase chain reaction», J.Clin. Microbiology, 1993, vol. 31(4), 1019-1021.

7. Stauffer F.,Haber H., Rieger A., et al. «Genus Level Identification of Mycobacteria from

8. Clinical Specimens by Using an Easy-to-Handle Mycobacterium-Specific PCR Assay.» J. Clin. Microbiol. 1998, vol. 36(3), 614-617.

9. Brisson-Noel, A., Nguyen, S., et al., «Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clinical practice evaluation», The Lancet, 1991, vol. 338, 334-338.

10. Innis M.A., Gelfand D.H.,Snisky J.J., White T.J. «PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications». Academic Press, Inc: 1990. 450-452.

11. Liebana E., Aranaz A., Francis В., Cousins D. «Assessment of genetic markers for species differentiation within the Mycobacterium tuberculosis complex.» J. Clin. Microbiol. 1996, vol. 34(4), 933-938.

12. Hernandez-Pando R, Jeyanathan M, Mengistu G, Aguilar D, Orozco H, Harboe M, Rook GA, Bjune G. « Persistence of DNA from Mycobacterium tuberculosis in superficially normal lung tissue during latent infection » Lancet. 2000 Dec 23-30; 356(9248):2113-4

13. McDonough, K.A., Kress, Y., Bloom, B.R., «Pathogenesis of tuberculosis: interaction with macrophages», Infect. Immun., 1993, vol. 61(7), 2763-2773.

14. В.А.Краснов, Е.В.Кульчавеня, Е.В.Брижатюк. Внелегочной туберкулез в Западной Сибири: эпидемиология, клиника, лечение. Новосибирск, 1999.

15. Mahairas, G.G., Sabo P.J., Hickey M.J., Singh D.C., Stover C.K., «Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis.», J.Bacteriol., 1996, Mar.;178(5): 1274-82.

16. American Thoracic Society. «Diagnostic standarts and classification of tuberculosis», Am. Rev. Respir. Dis., 1990, vol. 142, 725-735.

17. Saz, J.V., Lardon de Guevara, M.C. «IgG against A60 antigen and the tuberculin test in healthy individuals and tubercular patients», Enferm. Infec. Microbiol. Clin., 1992, vol. 10(8), 477-480

18. Young,D.B., Kaufmann S.H.E, Hermans, P.W.M., Thole, J.E.R. «Mycobacterial protein antigens: a compilation», Mol. Microbiol., 1992, vol. 6, 133-145.

19. Young, R.A., Bloom, B.R., et al., «Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA», Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 2583-2587.

20. Shinnick, T.M, Krat, C., Schadow, S., «Isolationand restriction site maps of the genes encoding five Mycobacterium tuberculosis proteins», Infect. Immun., 1987, vol. 55.(7), 1718-1721.

21. Imaeda, Т., «Desoxyribonucleic acids relatedness among selected strains of M.tuberculosis, M.bovis BCG, M.microti, M.africanum», Inf. J. Sys. Bacteriol., 1985, vol. 35,147-150.

22. Husson, R.N., Young, R.A., «Genes for the major protein antigens of Mycobacterium tuberculosis: the etiologic agents of tuberculosis and leprosy share an immunodominant antigen», Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1987, vol. 84, 1679-1683.

23. Ashbridge, K.A., Booth, R.J., et al., «Nucleotide sequence of the 19kDa antigen gene from Mycobacterium tuberculosis», Nucleic Acids Research, 1989, vol. 17(3), 1249.

24. Borremans, M., L. De Wit G. et.al., «Cloning, seguence determination, and expression of a 32-kilodalton-protein gene of Mycobacterium tuberculosis», Infect. Immun., 1989, vol. 57, 3123-3130.

25. Wilker, H.G., Sleren, K., Nagai, S., Harboe, M. «Evidence for three separate genes encoding the proteins of the Mycobacterial antigen 85 complex», Infect. Immun., 1990, vol. 58(1), 272-274.

26. Matsuo, K., Yamaguchi, R., et al., «Cloning and expression of the M. bovis BCG gene for extracellular a-antigen», J. Bacteriology, 1988, vol. 170(9), 3847-3854.

27. Matsuo, K., Yamaguchi, R., et al., «Cloning and expression of the gene for the cross-reactive a-antigen of M.kansasii», Infect. Immun., 1990, vol. 58(2), 550-556.

28. Andersen, A.B., Ljungqvist, L., Olsen, M., «Evidence that protein antigen b of Mycobacterium tuberculosis is involved in phospate metabolism», J. Gen. Microbiology, 1990, vol. 136,477-480.

29. Espitia, C., Cervera, I., et al., «А 38-kD Mycobacterium tuberculosis antigen associated with infection. Its isolation and serologic evaluation», Clin. Exp. Immunol., 1989. vol. 77, 373372.

30. Kadival, G.V., Chaparas, S.D., Hussong,D., «Characterization of serologic and cell-mediated reactivity of a 38-kDa antigen isolated from Mycobecterium tuberculosis», J. of Immunology, 1987, vol. 139(7), 2447-2451.

31. Andersen, A.B., Hansen, E.B., «Structure and mappins of antigenic domains of protein antigen b, a 38,000-molecular weight protein of Mycobacterium tuberculosis», Infect. Immun., 1989, vol. 57(10), 3123-3130.

32. Young, D.B., Garbe, T.R., «Lipoprotein antigens of Mycobacterium tuberculosis», Res. Microbiol, 1991, vol. 142, 55-65.

33. Young, D., et al., «Immunological activity of a 38-kilodalton protein purified from Mycobacterium tuberculosis», Infect. Immun., 1986, vol. 54(1), 177-183.

34. Wood, P.R., Ripper, J., Radford, A.J., et al., «Production and characterization of monoclonal antibodies specific for Mycobacterium bovis», J. Gen. Microbiology, 1988, vol. 134, 25992604.

35. Radford, A.J., Duffield, B.J., Plackett, P., «Cloning a species-specific antigen of Mycobacterium bovis», Infect. Immun, 1988, vol. 56(4), 921-925.

36. Radford, A.J., Wood, P.D., et al., «Epitope mapping of the Mycobacterium bovis secretory protein MPB70 using overlapping peptide analysis», J. Gen. Microbiology, 1990, vol. 136, 265-272.

37. Harboe, M., Nagai, S., et al., «Properties of proteins MPB64, MPB70,and MPB80 of Mycobacterium bovis BCG», Infect. Immun., 1986, vol. 52(1), 193-302.

38. Yamaguchi, R., Matsuo, K., et al., «Cloning and characterization of the gene for immunogenic protein MPB64 of M.bovis BCG», Infect. Immun., vol. 57, 283-288.

39. Li, H., Ulstrup, J.C., et al., «Evidence for absense of the MPB64 gene in some substrains of M.bovis BCG», Infect. Immun., 1993, vol. 61(5), 1730-1734.

40. Portillo, P.D., Murillo, L.A., Patarroyo, M.E., «Amplification of species-specific DNA fragment of Mycibacterium tuberculosis and its possible use in diagnosis», J. Clin. Microbiology, 1991, vol. 29, 2163-2168.

41. Herrera, E.A., Segovia M., «Evaluation of mtp40 genomic fragment amplification for specific detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens», J Clin Microbiol 1996 May;34(5):l 108-1113.

42. Sorensen, A.L., Nagai, S., Houen, G., Andersen, P., Andersen, A.B., «Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis.»

43. Pollock, J.M., Andersen P., «Predominant recognition of the ESAT-6 protein in the first phase of interferon with Mycobacterium bovis in cattle.», Infect. Immun., 1997, Jul;65(7):2587-2592.

44. Brandt, L., Oettinger, Т., Holm, A., Andersen, A.B., Andersen, P., «Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis.», J. Immunol., 1996, Oct. 15;157(8):3527-3533.

45. Collins, D.M., de Lisle, G.W., «DNA restriction endonuclease analysis of M.tuberculosis and M.bovis BCG», J. Clin. Microbiology, 1984, vol. 130, 1019-1021.

46. Zhang, Y., Mazurek, G.H., Cave, M.D., et al., «DNA polymorphisms in strains of Mycobacterium tuberculosis analyzed by pulse-field gel electroforesis: a tool for epidemiology», J. Clin. Microbiology, 1992, vol. 30, 1551-1556.

47. Eisenach, K.D., Crawford, J.T., Bates, J.H., «Repetitive DNA sequences as probes for Mycobacterium tuberculosis», J. Clin. Microbiology, 1988, vol. 26, 2240-2245.

48. Zainudin, Z.F. and Dale, J.W., «Polimorfic repetitive DNA sequences in Mycobacterium fortuitum plasmid», J. Clin. Microbiology, 1989, vol. 135, 2347-2355.

49. Thierry, D., Cave, M.D., et al., «IS6110 an IS like element of Mycobacterium tuberculosis complex», Nucleic Acids Research, 1990, vol. 18, 188.

50. Thierry, D., Brisson-Noel, A., et al., «Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence IS6110 and its application in diagnosis», J. Clin. Microbiology, 1990, vol. 28, 2668-2673.

51. McAdam, R.A., Hermans, P.W.M., et al, «Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence belongin to the IS3 family», 1990, Mol. Microbiol., vol. 4, 1607-1613.

52. Beck-Sague, С., Dooley, S.W., et al., «Hospital outbreak of multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis infections. Factor in transmittion to staff and HIV-infected and patients», J. Amer. Med. Ass, 1992, vol. 268, 1280-1286.

53. Edlin, B.R., Tokars, J.I., et al., «Nosocomial transmission of multidrug-resistant tuberculosis among AIDS patients: epidemiologic studies and restriction fragment lenght polymorphism analysis», New Engl. J. Med., 1992, vol. 326, 1514-1521.

54. Pearson, M.L., Jereb, J.A., et al., «Nosocomial transmission of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: a risk to patients and healthcare workers», Ann. Intern. Med.,1992, vol. 117, 191-196.

55. Ross, B.C., Dwyer, B.D., «Rapid simple method for typing isolates of Mycobacterium tuberculosis by using the polymerase chain reaction», J. Clin. Microbiology, 1993, vol. 31(2), 329-334.

56. Haas, W.H., Butler, W.R., et al., «Mixed linker Polymerase chain reaction: a new method for rapid fingerprinting of isolates of the Mycobacterium tuberculosis complex», J. Clin. Microbiology, 1993., vol. 31(5), 1293-1298.

57. Shawar, R.M., El-Zaatari, F.A.K., et al., «Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by two-step polymerase chain reaction and non-isotopic hybridizadion methods», J. Clin. Microbiology, 1993, vol. 31(1), 61-65.

58. Kocagoz, Т., Yilmaz, E., et al., «Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure», J. Clin., Microbiology,1993, vol. 31(6), 1435-1438.

59. Wilson S.M., McNerney R., et al., «Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis», J. Clin Microbiology, 1993, vol. 31(4), 776782.

60. Takewaki, S.-I., Okuzumi, K., et al., «Genus-specific polymerase chain reaction for the mycobacterial dnaJ gene and species-specific oligonucliotide probes», J. Clin. Microbiology,- 1993, vol. 31(2), 446-450;

61. Fries, J.W.U., Patel, R.J., «Genus and species specific DNA probes to identify mycobacteria using the polymerase chain reaction», Mol. Cel. Probes., 1990, vol. 4, 87-105.

62. Lodha R, Kabra SK, Seth V., «Diagnosis of tuberculosis», Indian J Pediatr 2000 Feb; 67 (2 Suppl): 3-8.

63. Stauffer F, Mutschlechner R, Hasenberger P, Stadlbauer S, Schinko H. «Detection of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical specimens by a commercial polymerase chain reaction kit.» Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1995 Dec;14(12):1046-51

64. Bennedsen J, Thomsen VO, Pfyffer GE, Funke G, Feldmann K, Beneke A, Jenkins PA, Hegginbothom M, Fahr A, Hengstler M, Cleator G, Klapper P, Wilkins EG. «Utility of PCR in diagnosing pulmonary tuberculosis.» J Clin Microbiol 1996 Jun;34(6): 1407-11.

65. Lebrun L, Mathieu D, Saulnier C, Nordmann P. «Limits of commercial molecular tests for diagnosis of pulmonary tuberculosis.» Eur Respir J 1997 Aug; 10(8): 1874-6

66. Ginesu, F., Pirina, P., Sechi, L.A., Molicotti, P., Santoru, L., Porcu, L., Fois, A., Arghittu, P., Zanetti, S., Fadda, G., «Microbiological diagnosis of tuberculosis: a comparison of old and new methods.», J. Chemother., 1998 Aug;10(4):295-300.

67. Texier-Maugein J., Carbonnelle В., Grosset J., «А blind study of the polymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis DNA. Azay Mycobacteria Study Group», Tuber. Lung. Dis., 1996, Aug; 77(4):358-362.

68. Almeda J, Garcia A, Gonzalez J, et al, «Clinical evaluation of an in-house IS6110 polymerase chain reaction for diagnosis of tuberculosis. » Eur J. Clin Microbiol Infect Dis 2000 Nov;19(ll):859-67

69. Aslanzadeh, J., de la Viuda, M., Fille, M., Smith, W.B., Namdari, H., «Comparison of cultureand acid-fast bacilli stain to PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples.», Mol. Cell. Probes., 1998 Aug; 12(4):207-11.

70. Eing, B.R., Becker, A., Sohns, A., Ringelmann, R., «Comparison of Roche Cobas Amplicor Mycobacterium tuberculosis assay with in-house PCR and culture for detection of M. tuberculosis.», J. Clin. Microbiol, 1998, Jul;36(7):2023-9.

71. Weekes, K.M., Pearse, M .J., Sievers, A., Ross, B.C., d'Apice, A. J., «The diagnostic use of thepolymerase chain reaction for the detection of Mycobacterium tuberculosis.», Pathology, 1994, Qct;26(4):482-6

72. Kolk, A.H., Noordhoek, G.T., de Leeuw, O., Kuijper, S., van Embden, J.D., «

73. Mycobacterium smegmatis strain for detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR used as internal control for inhibition of amplification and for quantification of bacteria.» J. Clin .Microbiol .,1994, May;32(5): 1354-6 .

74. Rosenstraus M, Wang Z, Chang SY, DeBonville D, Spadoro JP An internal control forroutine diagnostic PCR: design, properties, and effect on clinical performance. J Clin Microbiol 1998 Jan;36(l):191-7

75. Walker, D.A., Taylor, I.K., et al., «Comparison of poymerase chain reaction amplification of two mycobacterial DNA sequences, IS6110 and the 65kDa antigen gene, in the diagnosis of tuberculosis», Thorax, 1992, vol. 47, 690-694.

76. Young, D.B.,Kaufmann S.H.E, Hermans, P.W.M.,Thole, J.E.R., «Mycobacterial protein antigens: a compilation», Mol. Microbiol., 1992, vol. 6, 133-45.

77. Маниатис. Т., Фрич.Э., Дж.Сэмбрук, «Методы генетической инженерии, Молекулярное клонирование», издательство Москва "Мир", 1984.

78. Kawasaki, E.S., «Sample preparation from Blood, cells, and other fluids, " from "PCR protocols. A guide to methods and applications», edited by M.A.Innis, D.F.Gelfand, J.N.Shinsky, T.J.White.

79. Mandel, M., Higa, A., «Calcium dependent bacteriophage DNA infection», J. Mol. Biol., vol. 53, 154.