Получение и исследование свойств рекомбинантных фрагментов антитела, специфичного к сердечной изоформе тропонина I

Альтшулер, Евгений Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и исследование свойств рекомбинантных фрагментов антитела, специфичного к сердечной изоформе тропонина I
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование свойств рекомбинантных фрагментов антитела, специфичного к сердечной изоформе тропонина I"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи Р,

ГТГ"

005055853

Альтшулер Евгений Петрович

ПОЛУЧЕНИЕ II ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНОГО К СЕРДЕЧНОЙ ЮОФОРМЕ

ТРОИОНИНАI

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Москва-2012

005055853

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Катруха Алексей Генриховнч

Официальные оппоненты: Глухов Александр Иванович

доктор биологических наук, профессор, Курчатовский центр нано-, бионаук, информационных и конвергентных технологий с источниками синхротронного излучения и нейтронов и социогуманитарных наук Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр «Курчатовский Институт», заведующий лабораторией молекулярных основ онкогенеза.

Бирих Клара Рудольфовна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.

Защита состоится 10 декабря 2012 года в 15 часов 30 минут на'заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, д. 1, стр. 12, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «.

_» ноября 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

Медведева Марина Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Сердечно-сосудистые заболевания остаются главной причиной высокой смертности в России и других индустриально-развитых странах. Они являются одними из наиболее распространенных и наиболее опасных заболеваний в мире. Изоформа тропонина I из сердца человека (ЬсТп1) представляет собой наиболее ранний и специфический маркер повреждения кардиомиоцитов, сопровождающего такие серьезные сердечно-сосудистые заболевания, как инфаркт миокарда и нестабильная стенокардия. Кроме того, повышение уровня тропонина I в крови используется для оценки риска осложнений с острым коронарным синдромом и оптимизации лечебных мероприятий.

Иммунохимические методы определения белковых маркеров различных заболеваний являются важным диагностическим инструментом. Моноклональное антитело 19С7 (МАт 19С7) с высокой аффинностью и специфичностью распознает ЬсТп1 и может быть использовано для создания многих систем диагностики инфаркта миокарда, основанных на определении концентрации ЬсТп1 в крови.

Альтернативным методом получения антител является создание их рекомбинантных аналогов. Этот подход позволяет получать высокоочищенные препараты рекомбинантных антител, а также изменять их свойства с помощью генно-инженерных методов. Для этого используют различные виды мутагенеза, такие как создание ограниченного количества мутантных форм на основе структуры комплекса антитела с антигеном, либо создание больших библиотек мутантных форм, из которых в ходе дальнейшей работы отбирают варианты с улучшенными свойствами. К таким модификациям можно отнести повышение аффинности, увеличение числа антиген-связывающих участков, изменение состава доменов, пространственной ориентации участков связывания с антигеном, молекулярного веса, изоэлектрической точки и потенциальной иммуногенности.

В данной работе проведено сравнение свойств рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 со свойствами исходного полноразмерного антитела. Также на основе рекомбинантных фрагментов были созданы различные мутантные формы с целью увеличения аффинности их взаимодействия с антигеном. Для анализа влияния отдельных мутаций на аффинность рекомбинантных антител был проведен сравнительный анализ иммунохимических свойств полученных мутантных форм.

Цель н задачи работы. Основной целью данного исследования было сравнение рекомбинантных веру и РаЬ-фрагментов моноклонального антитела 19С7 и их модификация путем мутагенеза антигенсвязывающих участков для увеличения их аффинности и совершенствования системы детекции ЬсТп1 в крови.

В работе решались следующие задачи:

1. Определить нуклеотидную последовательность генов, кодирующих цепи РаЬ-фрагмента МАт 19С7, создать на ее основе молекулярно-генетические конструкции для экспрессии рекомбинантных бсРу и РаЬ-фрагментов МАт 19С7 и осуществить получение рекомбинантных веру и РаЬ-фрагментов МАт 19С7.

2. Сравнить иммунохимические свойства рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 и исходного антитела, а также результаты, получаемые при их использовании для измерения концентрации ЬсТп1 в сыворотках больных с диагностированным острым инфарктом миокарда.

3. Определить аминокислотные остатки всру-фрагментов МАт 19С7, модификация которых может привести к увеличению аффинности, провести моделирование т зШсо влияния отдельных мутаций на аффинность, выбрать мутантные формы для экспериментального анализа.

4. Охарактеризовать отобранные в результате т эШсо моделирования бсРу-фрагменты и сравнить их с всру-фрагментами МАт 19С7 дикого типа.

5. Создать библиотеку фаговых частиц, несущих на поверхности мутированные в заданном участке последовательности всру-фрагменты МАт 19С7 и осуществить отбор мутированных вариантов всру-фрагментов МАт 19С7 методом фагового дисплея при разных условиях.

6. Охарактеризовать отобранные методом фагового дисплея мутантные бсРу-фрагменты и сравнить их с всРу-фрагментами МАт 19С7 дикого типа.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены рекомбинантные РаЬ и всру-фрагменты МАт 19С7. Разработан протокол экспрессии, ренатурации, очистки. Методами иммуноферментного и флуороиммунного анализа, а также методом детекции поверхностного плазменного резонанса показано, что иммунохимические свойства рекомбинантных фрагментов существенно не отличаются от свойств полноразмерного МАт 19С7. Использование полноразмерного МАт 19С7 и его рекомбинантных фрагментов в системах для детекции ЬсТп1 дает сопоставимые результаты как при измерении концентрации ЬсТп1 в калибровочных растворах, так и в сыворотках больных с диагностированным острым инфарктом миокарда. В ходе работы проведено увеличение аффинности рекомбинантных всру-фрагментов МАт 19С7 такими

методами, как in silico мутагенез и экспериментальный отбор из библиотеки scFv-фрагментов, содержащих точечные мутации в участке CDR-H3, с использованием фагового дисплея. В результате сравнения иммунохимических свойств 18 отобранных мутантных форм найдено две, характеризующиеся повышенной аффинностью связывания антигена.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 37-м конгрессе Союза Европейских Биохимических Сообществ и 22-м конгрессе Международного Объединения Биохимии и Молекулярной биологии в 2012 году (Севилья, Испания); на Международной конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в 2012 году (Москва, Россия), а также на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2009 году (Москва, Россия).

Публикации. По теме диссертации было опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи в профильных журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, выводы, список цитированной литературы. Работа изложена на 187 страницах печатного текста, иллюстрирована 60 рисунками и 1 таблицей. Список цитированной литературы содержит 268 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы приведены данные о строении, функциях, аффинном созревании, получении и практическом применении антител. Особое внимание уделяется получению рекомбинантных антител и методам модификации их последовательности с целью усовершенствования их свойств для практического применения.

Материалы и методы исследования

Материалы. Праймеры, используемые в работе, были синтезированы в компаниях Синтол (Россия) и ЗАО «Евроген» (Россия). Синтез генов с оптимизацией кодонного состава проводился в компании GenScript (США). Синтез библиотеки генов мутированных scFv-фрагментов проводился в компании MetGen (Финляндия). Секвенирование проводилось в ЦКП «Геном» и ЗАО «Евроген» (Россия). Пептид Тп188 (SASRKLQLKTC) был синтезирован в компании Anaspec (Дания).

Экспрессия рекомбинантных фрагментов. В работе мы использовали два

принципиально разных метода экспрессии рекомбинантных фрагментов в клетках E.coli. Один метод заключался в экспрессии рекомбинантных Fab-фрагментов, содержащих сигнальный пептид реШ, в периплазматическом пространстве E.coli, характеризующейся образованием функционально активных Fab-фрагментов. При получении Fab-фрагментов этим методом проводилась коэкспрессия составляющих его полипептидных цепей -легкой цепи (ЛЦ) и фрагмента тяжелой цепи (фТЦ). Другой метод - экспрессия белка (ЛЦ или фТЦ или scFv) в неактивной агрегированной форме, обнаруживаемого во фракции телец включения (ТВ) и требующего ренатурации для восстановления антиген-связывающей активности. Экспрессию проводили в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS или Rosetta(DE3) в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола, при температуре 37°С и перемешивании. Индукцию экспрессии проводили при оптической плотности (600 нм) 0.4-0.5 путем добавления к суспензии изопропил-p-D-1 -тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 3 мМ и продолжали инкубацию при 37°С в течение 3 часов при перемешивании.

Выделение рекомбииантиых фрагментов МАт 19С7. Бактериальную культуру E.coli после проведения экспрессии центрифугировали 30 мин при 4000 g при 4°С. Осадок бактерий лизировали в 25 мл буфера (50 мМ Трис-HCl рН 7.6, 150 мМ NaCl, 0.5 мМ PMSF, Тритон-ХЮО 2% по объему) путем обработки ультразвуком (Branson Digital Sonifier, Model 250), после чего промывали, используя аналогичный буфер, не содержащий Тритон Х-100. В зависимости от используемого метода выделение рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 проводили либо из фракции осадка после лизиса клеток, либо из фракции супернатанта, либо из культуральной среды.

Ренатурация рекомбинантных фрагментов МАт 19С7. Осадки ТВ, содержащие ЛЦ или фТЦ МАт 19С7, промывали буфером 50 мМ Трис-HCl, рН 7.6, затем растворяли в 1 мл солюбилизирующего буфера (6 М гуанидинхлорид, 0.1 М аргинин, 2.5 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl рН 8.0). Аликвоты суспензий солюбилизированных ТВ, содержащих эквимолярные количества ЛЦ и фТЦ смешивали, а к смеси добавляли р-меркаптоэтанол до концентрации 50 мМ. После 1 часа инкубации при 37°С при перемешивании раствор восстановленных ЛЦ и фТЦ рекомбинантных Fab-фрагментов разбавляли ренатурирующим буфером, содержащим 6 М гуанидинхлорид, 0.1 М аргинин, 2.5 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl рН 8.0, и 4 мМ окисленный глутатион, до суммарной концентрации ЛЦ и фТЦ 0.2 мг/мл и инкубировали в течение 24 часов при температуре 25°С и постоянном перемешивании. После этого раствор рекомбинантных Fab-фрагментов диализовали против 10-кратного объема буфера, содержащего 0.1 М аргинин,

2.5 мМ ЭДТА, 100 мМ, Трис-HCl рН 8.0 в течение 72 часов при 4°С, затем против буфера, содержащего 2.5 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl рН 8 при 4°С в течение 24 часов, после чего переводили в буфер ФСБ (10 мМ КН2Р04, 150 мМ NaCl, рН 7.4) с 0.1% NaN3, также при 4°С. Ренатурацию scFv-фрагментов проводили аналогично ренатурации рекомбинантных Fab-фрагментов, только с использованием ТВ scFv.

Аффинная очистка рекомбинантных фрагментов. Для очистки функционально-активных рекомбинантных фрагментов использовали метод хроматографии на аффинном носителе Sulfolink с иммобилизованным пептидом Tni88, последовательность которого включает эпитоп МАт 19С7. Рекомбинантные фрагменты элюировали раствором 0.1 М глицина рН 2.0.

Биотинилирование белков. В работе были использованы два тала биотинилирующих агентов. Peareinbi первого типа (биотинизотиоцианат или BITC, биотин-ПЭГг-Ы-гидроксисукшшимид и биотин-88-сульфо->1-гидроксисукцинимид), осуществляют биотинилирование белков по аминогруппам. При этом может происходить частичная потеря иммунохимической активности белка из-за модификации функционально значимых остатков. Другие два реагента - биотин-ПЭГ2-иодоацетил и биотин-ПЭГ2-малеимид (МРВ) обеспечивают сайт-специфическое биотинилирование по аминокислотным остаткам цисгеина.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Метод ИФА использовали для анализа и сравнения иммунохимической активности МАт 19С7 и его фрагментов. В качестве антигена использовали hcTnl или тропониновый комплекс ITC (комплекс, в состав которого входят молекулы тропонина I, Т и С), выделенный из сердца человека, в концентрации 1 мкг/мл на ФСБ. В лунки с засорбированным антигеном наносили растворы МАт 19С7 или его фрагментов разной концентрации. Для детекции комплекса антитела с антигеном использовали антитела, специфичные к Fab-фрагментам иммуноглобулинов, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma), в сочетании с субстратом ТМВ. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на приборе Victor 1420 Multilabel counter (Wallac, Финляндия).

Флуороиммунный анализ (ФИА) «сэндвич»-типа. В нашей работе мы

использовали ФИА «сэндвич»-типа для изучения иммуиохимических свойств как

биотинилированного, так и небиотинилированного МАт 19С7 и его фрагментов. Для этого

одно из антител (МАт 19С7 или его фрагменты) сорбировали на поверхность планшета за

счет неспецифического связывания либо, в случае использования биотинилированного

антитела, за счет взаимодействия биотина с поверхностью планшета с иммобилизованным

стрептавидином. Затем в лунки планшета добавляли антиген в разных концентрациях,

после чего связавшийся с иммобилизованным антителом антиген детектировали антителом 560 (кроме этого антитела, при анализе с иммобилизацией мутантных форм scFv-фрагментов также использовали такие детектирующие антитела, как MF4 и 625), содержащим стабильный хелат европия в качестве метки. Количество метки в каждой лунке определяли, измеряя интенсивность фосфоресценции с использованием прибора Victor 1420 Multilabel counter (PerkinElmer, США).

Детекция поверхностного плазменного резонанса (surface plasmon resonance, SPR). Изучение кинетики связывания МАт 19С7 и его фрагментов с антигеном проводили методом детекции SPR на приборе Biacore X. Для этого на поверхность чипа иммобилизовывали тропониновый комплекс ITC и затем проводили детекцию сигнала в форме кинетических кривых при нанесении растворов исследуемых антител в разных концентрациях. Расчет констант связывания проводили в программе BiaEvaluatíon 3.1.

Моделирование in silico. Для моделирования трехмерной структуры Fv-фрагментов мы использовали программы RosettaAntibody, PIGS (Prediction of Immunoglobulin Structure), MODELLER, SWISS-MODEL, I-TASSER и 3D-JIGSAW, а для проведения докинга - программу Autodock. Для генерации моделей мутантных форм с точечными мутациями и расчета энергии полученных моделей использовали программу FoldX. Результаты работы данных программ, представляющие собой файлы в различных форматах, конвертировались в другие форматы и сводились воедино с использованием программ, написанных на языке Python. Расчеты проводились на кластере MeatGrinder научно-учебного центра «Биоинформатика» Института проблем передачи информации РАН. Для визуализации трехмерных структур белковых молекул и различных манипуляций с ними использовалась программа Pymol.

Получение фаговых частиц. Для выделения библиотеки фаговых частиц клетки, трансформированные фагмидами pSEX81/scFv-H3Lib, содержащими мутированные гены scFv-фрагментов, растили до оптической плотности при 600 нм 0.4-0.6. Затем проводили заражение бактерий фагом-хелпером М13К07 в течение 30 мин при 37°С. Инфицированные клетки переводили в свежую среду и растили при 37°С до оптической плотности 0.3-0.6, после чего температуру понижали до 30°С и инкубировали в течение 17-20 часов. Для очистки фаговых частиц использовали метод двойного переосаждения в PEG/NaCl (20% PEG-6000, 2.5М NaCl). Количество фаговых частиц оценивали, исходя из того, что раствору с оптической плотностью при 269 нм равной 0.3 соответствует концентрация около 2><1012 фаговых частиц на 1 мл. Основным способом подсчета фаговых частиц был метод титрования раствора, содержащего фаговые частицы с последующим заражением этими частицами суспензии бактериальных клеток и подсчетом

количества клеток, выросших на чашке с антибиотиком.

Различные способы отбора при фаговом дисплее.

Библиотеку фаговых частиц, несущих мутированные scFv-фрагменты МАт 19С7 на своей поверхности, подвергали отбору на способность к связыванию с hcTnl двумя способами - на поверхности планшета и в растворе. При первом типе отбора на поверхность лунок планшета сорбировали антиген, после чего в эти лунки наносили раствор фаговых частиц, затем проводили интенсивную отмывку тех фаговых частиц, которые были непрочно связаны с поверхностью планшета, а фаговые частицы, оставшиеся иммобилизованными после отмывки, элюировали. При втором типе отбора взаимодействие биотинилированного антигена (тропониновый комплекс 1С или пептид Tni88) с фаговыми частицами проходило в растворе. Смесь фаговых частиц с антигеном инкубировали при перемешивании, затем наносили в лунки планшета с предсорбированным стрептавидином. В результате фаговые частицы, связанные с биотинилированным антигеном, иммобилизовывались на поверхности планшета.

Отбор на поверхности планшета (panning)

На поверхность планшета сорбировали тропониновый комплекс ITC в концентрации 5-100 нг в лунку (100 мкл), после чего проводили блокировку поверхности планшета и фаговых частиц. Заблокированные лунки инкубировали с раствором фаговых частиц в блокировочном растворе, после чего проводили интенсивную промывку лунок буфером ФСБ с добавлением Tween-20 (ФСБТ). Для вытеснения антигена из непрочных комплексов с фаговыми частицами в некоторых экспериментах кроме вышеуказанной промывки также проводили «конкурентную промывку», то есть добавление в лунки промывочного буфера, содержащего либо МАт 19С7, либо различные концентрации Tni88 пептида (10-1000х молярный избыток), после чего лунки снова подвергали интенсивной промывке. В некоторых экспериментах для разрушения непрочных комплексов между антигеном и фаговыми частицами после промывки дополнительно проводили «предэлюцию», т.е. инкубацию с раствором с субоптимальными значениями рН (3-5) с последующей интенсивной отмывкой лунок от диссоциировавших фаговых частиц. Элюцию иммобилизованных фаговых частиц проводили либо путем непосредственного добавления в каждую лунку 100 мкл клеток штамма TG1 в фазе логарифмического роста с последующей инкубацией в течение 30 мин при 37°С без перемешивания, либо путем добавления 100 мкл одного из элюирующих растворов: 1) 0.1 М глицинового буфера рН 2.2, инкубация с которым проводилась в течение 10 мин с перемешиванием и последующей нейтрализацией путем добавления 2 М Трис-буфера; 2) 10 мкг/мл раствора трипсина в ФСБТ, инкубация с которым проводилась в течение 30 мин с

перемешиванием; 3) 10 мМ раствора ДТТ в ФСБТ, инкубация с которым проводилась в течение 5 мин с перемешиванием. Полученный после безклеточной элюции раствор, содержащий фаговые частицы, смешивали с трехкратным избытком по объему клеток TG1 в фазе логарифмического роста и далее инкубировали в течение 30 мин при 37°С без перемешивания. Определение количества фаговых частиц в растворах элюатов проводили путем высаживания зараженных клеток на чашки Петри. По 20 клонов с чашек Петри после завершения каждого типа отбора секвенировали для анализа мутаций.

Отбор в растворе

При отборе в растворе фаговые частицы инкубировали с биотинилированным пептидом Тп188 в концентрации 10 нМ, после чего в раствор добавляли ЮООх избыток небиотинилированного пептида Tni88 в качестве конкурирующего агента. Перед началом сорбции на поверхность планшета с предсорбированным стрептавидином фаговых частиц в смеси с антигеном, проводили блокировку как поверхности лунок планшета, так и фаговых частиц с антигеном. Лунки после инкубации промыли 3 раза блокировочным буфером, после чего стадии промывки, элюции и титрования фаговых частиц проводили так же, как при отборе на поверхности планшета.

Основные результаты н их обсуждение

Первым этапом данной работы было определение последовательности генов, кодирующих две полипептидные цепи, входящие в состав Fab-фрагмента - легкую цепь (ЛЦ) и фрагмент тяжелой цепи (фТЦ) МАт 19С7. Для этого из клеток гибридомы, продуцирующей МАт 19С7, была выделена тотальная РНК с помощью набора реагентов YellowSolve фирмы donogene (Россия), на основе которой методом обратной транскрипции была получена кДНК с использованием M-MLV обратной транскриптазы (Силекс М, Россия). Из полученной кДНК фрагменты, соответствующие ЛЦ и фТЦ, были амплифицированы методом ПЦР, а их последовательность была определена методом секвенирования. На основе полученных последовательностей создавали молекулярно-генетические конструкции (МГК) для экспрессии рекомбинантных Fab и scFv-фрагментов.

Для получения рекомбинантных Fab-фрагментов (rFab) было необходимо провести

экспрессию двух цепей, из которых состоит Fab-фрэгмент, - ЛЦ и фТЦ МАт 19С7. Для

этого мы использовали два подхода: 1) независимая экспрессия ЛЦ и фТЦ в цитоплазме с

последующей ренатурацией и восстановлением гетеродимерной структуры Fab-

фрагментов, 2) экспрессия функционально-активных rFab-фрагментов в

периплазматическом пространстве клетки E.coli. Для получения scFv-фрагментов был

синтезирован ген, содержащий вариабельные домены обеих цепей, соединенных линкером. После получения функционально-активные рекомбинантные фрагменты были очищены методом аффинной хроматографии, а их свойства были изучены при помощи различных иммунохимических и биохимических методов в сравнении с МАт 19С7 и его Fab-фрагментами, полученными в результате протеолиза под действием папаина (eFab).

Получение гРаЬ-Фрагментов МАт 19С7 из цитоплазмы клеток E.coli

Получение rFab-фрагментов методом ренатурации включало нескольких стадий. Сначала были созданы МГК для экспрессии ЛЦ и фТЦ МАт 19С7. Для этого фрагменты, соответствующие ЛЦ и фТЦ, амплифицированные методом ПЦР из кДНК, были клонированы в вектор рЕТ23а+ по рестрикционным сайтам Hindlll и Xhol с образованием МГК pET23a+/LC и рЕТ23а+/НС, соответственно. При амплификации в конце последовательности гена ЛЦ перед стоп-кодоном был добавлен кодон цистеина. Полученные плазмиды трансформировали в клетки Е. coli штамма DH5a.

Для экспрессии рекомбинантных ЛЦ и фТЦ МАт 19С7 полученными МГК трансформировали клетки E.coli штамма BL21(DE3)pLysS, в которых осуществляли независимую экспрессию каждой из цепей, входящих в состав Fab-фрагментов. После проведения экспрессии клетки лизировали и фракционировали, а полученные фракции анализировали методом ДСН-электрофореза и иммуноблоттинга (см. рис. 1). Из рисунка видно, что во фракции ТВ присутствуют мажорные белки, имеющие молекулярную массу около 25 кДа, которые специфически взаимодействуют при использовании метода иммуноблоттинга с детектирующими поликлональными антителами, специфичными к Fab-фрагментам. Из этого следует, что при экспрессии в E.coli ЛЦ и фТЦ локализуются во фракции ТВ. При этом в растворимой фракции ЛЦ и фТЦ присутствуют лишь в следовых количествах. Поэтому на последующих этапах работы мы проводили выделение ЛЦ и фТЦ из препаратов ТВ и восстановление их функциональной структуры.

Получение функционально-активных rFab-фрагментов проводили путем осуществления полной денатурации ЛЦ и фТЦ с разрушением всех дисульфидных связей и последующего создания оптимальных окислительно-восстановительных условий для формирования правильных дисульфидных связей и восстановления гетеродимерной структуры rFab-фрагментов. Из полученного раствора функционально-активные rFab-фрагменты очищали методом аффинной хроматографии на хроматографическом носителе Sulfolink, коньюгированном с пептидом Тп188, последовательность которого включает эпитоп МАт 19С7 (см. рис. 2). Из графика видно, что элюция rFab-фрагментов с носителя

происходит в единственном пике, и элюирующийся белок имеет молекулярную массу около 50 кДа. Чистота полученного препарата гЕаЬ составляет 70-80% с наибольшим выходом около 2.5 мг на 1 литр культуральной среды, что соответствует 20% иммунохимически активного бежа от общего количества белка (ЛЦ + фТЦ) из телец включения.

72 кДа -55 кДа -

-72кДа É- 55 кДа

gj- 36 кДа I- 28 кДа

Рис. 1. Анализ внутриклеточной локализации ЛЦ и фрагмента ТЦ методом ДСН-электрофореза (А) в восстанавл ив ающих условиях и иммуноблот-тинга (Б).

С — нанесены белковые стандарты фирмы РеппеШаБ (Литва).

РФ - растворимая фракция, ТВ - тельца включения.

72 кДа -55 кДа -

36 кДа -28 кДа -

Рис. 2. Очистка рекомбинантных Fab-фрагментов МАт 19С7 методом аффинной хроматографии.

А) Профиль элюции при очистке rFab на аффинной колонке. Стрелкой обозначено начало элюции rFab раствором 0.1 М глицина с рН 2.0.

Б) Анализ проб из наносимого на колонку раствора (дорожка 2) и из элюата (дорожка 3) на содержание rFab методом ДСН 3 электрофореза в невосстанавливающих условиях. На дорожку 1 нанесены белковые стандарты фирмы Fermentas (Литва).

Таким образом, мы получили препарат rFab-фрагментов методом ренатурации из ТВ. Однако существенным недостатком этого метода является сложность процедуры и длительное время, затрачиваемое на процесс ренатурации. В связи с этим, на следующем этапе нашей работы мы решили протестировать метод получения rFab-фрагментов, используя направленную экспрессию в периплазматическом пространстве E.coli.

Получение rFab-фрагментов МАт 19С7 из периплазматического пространства клеток E.coli

Для того чтобы получить функционально-активные гТаЬ-фрагменты, локализованные в периплазматическом пространстве клеток E.coli, необходимо осуществить коэкспрессию ЛЦ и фТЦ, каждая из которых содержит сигнальную последовательность для направления обеих цепей в периплазматическое пространство в одной и той же клетке. В периплазматическом пространстве выполняются такие условия правильного формирования структуры многих белков, как 1) присутствие специализированных шаперонных структур, 2) подходящие окислнгельно-

востановительные условия для формирования дисульфидных связей. В связи с этим, данный метод позволяет получать нативные белки в растворимой форме, тогда как для получения нативных белков из фракции ТВ требуется дополнительный этап -ренатурация.

Для получения rFab в периплазматическом пространстве мы создали МГК pET22b+/pelB-LC/pelB-HC, кодирующую обе цепи Fab-фрагмента на основе вектора рЕТ22Ь+. содержащую промотор и сигнальный пептид pelB перед каждым из генов (см. рис. 3). Для создания этой МГК была использована последовательность гена, кодирующего ЛЦ с дополнительным аминокислотным остатком цистеина, последовательность гена фТЦ из МГК рЕТ23а+/НС и участок последовательности вектора рЕТ22Ь+. в состав которого входят Т7 промотор и сигнальная последовательность pel В. Правильность полученной МГК была проверена методом секвенирования.

Поскольку экспрессия rFab-фрэгментов в

периплазматическом пространстве клетки E.coli

характеризуется достаточно низким выходом пр<)„ОТО|

синтезированного рекомбинантного белка, мы провели

серию экспериментов для оптимизации условий

экспрессии и количества синтезированных rFab-

фрагментов, протестировав зависимость выхода

экспрессии от используемых штаммов бактерий, amPR

времени экспрессии, состава среды и способа Рис- 3-Схема мгк pET22b+/pelB-LC/

pelB-HC для периплазматической

индукции. Мы пришли К выводу, ЧТО для экспрессии rFab-фрагментов. периплазматической экспрессии rFab-фрагментов МАт 19С7 лучше всего подходят клетки Е. coli штамма Rosetta. Наибольший выход rFab-фрагментов (2.5 мг на литр культуральной среды) был получен при использовании среды роста бактерий 3XLB и инкубации клеток при пониженной температуре 25°С в течение 20 часов без добавления IPTG. Согласно нашим данным, большая часть rFab-фрагментов попадает в культуральную среду и лишь их незначительное количество остается в периплазматическом пространстве. Чистота полученного препарата rFab-фрагментов после очистки на аффинном носителе Sulfolink-Tni88 составляет также 70-80%.

Получение рекомбинантных scFv-d)parMeHTOB методом ренатурации из телец включения

Е. coli

На основе последовательности, полученной в результате секвенирования генов ЛЦ и фТЦ мы создали три МГК для экспрессии рекомбинантных scFv-фрагментов: scFvl и

scFv2, имеющие VL и VH домены, расположенные в разной последовательности, а также фрагмент scFv3, аналогичный scFvl, но содержащий в начале линкерного участка дополнительный остаток цистеина для осуществления направленного биотинилирования по SH-группе (см. рис. 4). Гены scFvl-3 были синтезированы и оптимизированы по составу кодонов для экспресии в клетках Е. coli в компании GenScript. Клонирование каждого из генов scFv в вектор рЕТ22Ь+ проводили как по рестриктным сайтам Ndel и Xhol, так и Ncol и Xhol. Использование рестрикционного сайта Neo! во втором случае позволило поместить ген scFv после pelB последовательности, повышающей вероятность периплазматической локализации синтезированного белка. Таким образом, мы получили МГК для экспрессии scFv-фрагментов с локализацией как в цитоплазме, так и в периплазматическом пространстве.

Экспрессию фрагментов scFvl-3 проводили в клетках Е. coli штамма Rosetta(DE3) аналогично экспрессии rFab-фрагментов. По нашим данным, вне зависимости от наличия pelB сигнального пептида, всее типы рекомбинантных scFv-фрагментов накапливались в нерастворимой форме в виде ТВ. Поэтому в дальнейших экспериментах использовались плазмиды без pelB последовательности, а получение функционально-активных scFv-фрагментов проводили методом ренатурации белка из ТВ. Также как и при получении функционально-активных rFab-фрагментов из фракции ТВ, в случае scFv-фрагментов использовался метод ренатурации. Протокол для scFv-фрагментов был разработан на основе экспериментов с ренатурацией rFab. Для очистки функционально-активных scFv-фрагментов из раствора после ренатурации использовали метод аффинной хроматографии на носителе Sulfolink-Tni88. Выход иммунохимически активных scFv-фрагментов составил до 5 мг на литр культуральной среды, а доля иммунохимически активного белка от общего количества белка ТВ составила около 20-35%.

scFvl scFv2 scFv3

Т7 prom Т7 term Т7prom

j—* VH VL VL

Phc. 4. Строение генов для экспрессии scFv фрагментов: фрагменты scFvl и scFv2 отличаются порядком входящих в их состав доменов (VL, VH), a scFv3 аналогичен scFvl, однако в начале линкерной последовательности содержит дополнительный остаток цистеина.

Полученные препараты рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 использовались для изучения их биохимических и иммунохимических свойств.

Исследование биохимических и иммунохимических свойств рекомбинантных фрагментов МАт 19С7

В нашей работе мы исследовали такие биохимические и иммунохимические

свойства полученных гРаЬ и всру-фрагментов МАт, как электрофоретическая подвижность, способность взаимодействовать с ЬсТп1 и аффинность этого взаимодействия, а также их способность к сорбции на поверхности планшета.

72 кДа -1 55 кДа - i 36 кДа - i 28 кДа -

Рис. 5. Анализ проб рекомбинантных фрагментов методом ДСН электрофореза в невосстанавливающих - - 72 кДа (дорожки 4-5) и восстанавливающих условиях (дорожки ^^ - —55 кДа 2-3,6). На дорожки 1 и 7 нанесены белковые стандарты

фирмы РегтеЩав (Литва), на дорожки 2 и 4 нанесен «аг- 36 кДа очищенный препарат гРаЬ, полученный методом -28кДа Рвнатурации из телец включения, на дорожки 3 и 5 нанесен очищенный препарат гРаЬ, полученный в 17 кДа - ^^ *** результате периплазматической экспрессии, а на

дорожку 6 — очищенный препарат зсРу2, полученный 1 2 3 4 5 6 7 методом ренатурации из телец включения.

Из анализа рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 методом ДСН-электрофореза (см. рис. 5) видно, что в невосстанавливающих условия гРаЬ-фрагменты имеют кажущуюся молекулярную массу около 50 кДа, которая вдвое уменьшается в восстанавливающих условиях, так как гРаЬ-фрагмент распадается на составляющие его ЛЦ и фТЦ. БсРу-фрагменты представляют собой полосу с кажущейся молекулярной массой 30 кДа.

8 1,8 °i,6 1,4 1,2 1

■ МАЬ

Сигнал, CPS К о $ ООО ООО ООО Б

20000 ■

15000 •

10000 ■

5000 •

МАЬ eFab rFab

Рис. 6. Сравнение иммуно-химических свойств eFab, rFab и полноразмерного МАт 19С7 («МАЬ») с помощью методов ИФА (А) и «сэндвич»-ФИА (Б).

10,0 100,0 1000,0 Концентрация hcTnl, нг/мл

5,00 10,00 15,00

Концентрация hcTnl, нг/мл

о 4 А £ 501000

¡3,5. "-4S1000

А V I 401000

3 • 1 МАЬ 3 351000

2,5 ■ и scFvl / ш scFv2 / ■ 301000

2 ■ и scFv3 / 251000

1,5 ■ 1 Wf 201000

1 ■ /А / 151000 101000

0,5 ■ «etdb^f 51000

Рис. 7. Сравнение иммуно-химических свойств scFvl-3 и полноразмерных молекул МАт 19С7 («МАЬ») с помощью методов

«сэндвич»-ФИА (А) и ИФА (Б).

1 10 100 1000 Концентрация hcTnl, нг/мл

10 100 1000 10000 Концентрация hcTnl, нг/мл

Сравнение иммунохимических свойств рекомбинантных фрагментов проводили такими методами, как ИФА, ФИ А и SPR. Как видно из представленных результатов (см. рис. 6-7), иммунохимическая активность eFab и rFab-фрагментов практически не

отличается, а фрагменты scFvl-З также демонстрируют сходные свойства. Небольшое снижение сигнала в случае rFab-фрэгментов по сравнению с eFab-фрагментами можно объяснить наличием некоторого количества примесных белков в препарате rFab-фрагментов. Однако уровень сигнала в пробах с полноразмерным МАт 19С7 («МАЬ») существенно выше, чем в случае рекомбинантных фрагментов, из-за бивалентности полноразмерных антител, лучшего взаимодействия с детектирующими антителами (ИФА) и наличия большего количества сайтов, по которым может происходить конъюгирование с хелатом европия (ФИА). Результаты анализа иммунохимической активности МАт 19С7 и их фрагментов не отличаются при использовании в качестве антигена тропонинового комплекса (ITC) вместо hcTnl. Кинетические кривые eFab и rFab-фрагментов, полученные методом SPR, практически совпадают во всем диапазоне используемых концентраций; значения их кинетических констант также очень близки (см. табл. 1). Анализ разных типов scFv-фрагментов методом SPR показал небольшие различия в их кинетике связывания антигена с разбросом в значениях констант аффинности 2.5-6.5-10"8 М; для фрагментов scFv2 характерна несколько более быстрая диссоциация.

Таблица I. Расчетные значения констант взаимодействия фрагментов МАт 19С7 с тропониновым комплексом ITC. ка и kd - константы скорости ассоциации и диссоциации, Ко — равновесная константа диссоциации; rFab-ib — rFab-фрагмешы, полученные из ТВ, а rFab-pp - из периплазматического пространства.

Направленное биотинилирование рекомбинантных фрагментов антител и исследование сорбционных свойств биотинилированных антител

Биотинилирование антител - один из наиболее распространенных подходов, используемых для совершенствования иммунохимических систем за счет возможности увеличить плотность и прочность иммобилизации антител на поверхности планшетов, покрытых стрептавидином, а также оптимизировать ориентацию иммобилизированных антител. В пашей работе мы использовали два способа биотинилирования антител -направленное (или сайт-специфическое) и ненаправленное. Направленное биотинилирование проводили с использованием МРВ по специально включенному в последовательность рекомбинантных фрагментов свободному остатку цистеина, который расположен в удаленной от паратопа части молекулы и поэтому не оказывает влияние на взаимодействие антитела с антигеном. Можно ожидать, что увеличение числа молекул, способных взаимодействовать с антигеном, при ориентированной иммобилизации будет приводить к увеличению детектируемого сигнала и повышению чувствительности иммунохимической системы. Ненаправленное биотинилирование проводили по

¿„•КЛм-'-с-1 А-,г10Л с' AVI(r\ М

eFab 3.57 1.42 3.98

rFab-ib 4.09 1.29 3.15

rFab-pp 2.36 1.17 4.94

scFv2 4.42 1.53 3.46

аминогруппам с помощью BITC.

С использованием метода SPR было показано,

что как направленное, так и ненаправленное

биотиншшрование не влияет на аффинность МАт

19С7. Это может быть связано с тем, что МАт 19С7

не имеет свободных боковых аминогрупп в области в

области связывания антигена, а биотиншшрование

но имеющимся свободным аминогруппам не

оказывает существенного влияния на антиген- Рис. 8. Калибровочные графики зависимости сигнала от концентрации hcTnl.

связывающий участок.

С использованием биотинилированных рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 удалось построить калибровочные графики, имеющие как значения сигнала, так и угол наклона очень близкие к полученным с полноразмерными МАт 19С7 («МАЬ», см. рис. 8). При определении концентрации hcTnl методом ФИА в сыворотках больных с диагностированным острым инфарктом миокарда значения, полученные при измерении с использованием биотинилированных МАт 19С7 и их scFv-фрагментов, обладают высокой сходимостью (коэффициент корреляции >0.99; р<0.001). Таким образом, ФИА системы, созданные с использованием рекомбинантных scFv-фрагментов, могут быть использованы для измерения концентрации hcTnl в образцах сывороток.

Из полученных данных можно заключить, что rFab и scFv-фрагменты МАт 19С7 обладают необходимыми иммунохимическими свойствами для использования в диагностических системах и являются адекватной заменой антителам, полученным гибридомным методом. Поэтому данные фрагменты могут быть использованы в качестве основы для увеличения аффинности МАт 19С7 путем изменения их последовательности.

Модификация последовательности scFv-фрагментов МАт 19С7

Поскольку использование рекомбинантных антител открывает возможности для усовершенствования их свойств, в данной работе была исследована возможность увеличения аффинности рекомбинантных фрагментов антител с помощью мутагенеза. Для поиска остатков, которые могли бы привести к увеличению аффинности антител, было использовано два подхода: моделирование in silico с последующей in vitro проверкой найденных мутантных форм и создание библиотеки мутантных форм с последующим отбором наилучших мутантных вариантов методом фагового дисплея.

Моделирование мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7 - in silico отбор.

Первым методом поиска мутаций для увеличения аффинности, которым мы воспользовались, был метод in silico отбора в виду его быстроты, дешевизны и возможности анализа всех точечных мутаций и пар точечных мутаций, входящих в состав CDR-участков. Первым этапом in silico отбора было моделирование Fv-фрагмента -участка, принимающего участие в связывании антигена. Для моделирования структуры Fv-фрагментов МАт 19С7 был использован метод гомологичного моделирования, реализованный в программах RosettaAntibody, PIGS, MODELLER, SWISS-MODEL, I-TASSER и 3D-JIGSAW (одна из полученных моделей Fv-фрагмента, а также модель scFv-фрагмента МАт 19С7, приведены на рис. 9). Все полученные модели использовались в качестве стартового материала для моделирования структуры комплекса с антигеном методом докинга с использованием программы Autodock. В качестве модели антигена для докинга использовались участки структуры эпигопа из структур центральной части тропонинового комплекса 1J1E и 1J1D (Protein Data Bank). Модели комплекса Fv-фрагмента с эпитопом, обладающие наименьшей расчетной энергией, использовали для проведения виртуального мутагенеза остатков, входящих в состав CDR-участков, с использованием программы FoldX.

В результате анализа энергий взаимодействия мутантных форм с антигеном, рассчитанных с использованием программы FoldX, 2 варианта мутантных форм с единичными точечными мутациями и 8 с двумя точечными мутациями отобрали для экспрессии и анализа in vitro. В дополнение к поиску мутантных вариантов МАт 19С7 с увеличенной аффинностью путем моделирования был проведен экспериментальный скрининг библиотеки мутантных форм.

Получение библиотеки мутантных форм scFv-фрагментов МАт 19С7 для фагового дисплея. В качестве альтернативы для in silico поиска мутантных форм с увеличенной аффинностью использовали фаговый дисплей — метод одновременного отбора scFv-фрагментов с высокой аффинностью, находящихся на поверхности фаговых частиц, из множества мутантных форм. Для этого была создана библиотека генов scFv-фрагментов, мутированных в районе аминокислотных остатков CDR-H3 петли (12 остатков) и провели ее клонирование по рестрикционным сайтам Ncol и NotI в вектор pSEX81 для фагового диплея. При этом в каждой мутируемой аминокислотной позиции исходный аминокислотный остаток заменяли на все типы аминокислотных остатков, кроме цистеина. Синтез библиотеки мутантных вариантов генов scFv2 был выполнен в сотрудничестве с компанией MetGen. На основе библиотеки генов была получена библиотека фаговых частиц, несущих на своей поверхности мутированные scFv-фрагменты, которые подвергали отбору на основе их антиген-связывающих свойств.

Подбор условий и отбор мутантных форм scFv-фрагментов МАт 19С7 методом фагового дисплея. В связи с тем, что во взаимодействии разных фрагментов антител с антигеном могут преобладать различные типы связей, наиболее перспективным подходом представляется использование различных вариантов отбора (отбор на поверхности планшета и отбор в растворе, различные условия сорбции, блокировки, промывок и элюции). Способы отбора, которые были использованы в данной работе, можно поделить на две группы: отбор на поверхности планшета (panning) и отбор в растворе. Для увеличения селективности каждого типа отбора применяли такие методы, как добавление конкурирующего агента, использование промывочных буферов с разной ионной силой и разным содержанием детергента, «предэлюция» буферами с рН 3 и рН 5 фаговых частиц, непрочно связанных с антигеном, а также «специфическая элюция», то есть элюция только тех фаговых частиц, которые связаны с поверхностью планшета только за счет взаимодействия с иммобилизованным антигеном scFv-фрагмента на поверхности этих фаговых частиц.

Для того чтобы проверить данные моделирования о типах мутаций, приводящих к увеличению аффинности scFv-фрагментов, а также для сравнения аффинности вариантов мутантных антител, найденных в результате фагового дисплея, проводилось клонирование их генов в экспрессионные вектора рЕТ23а+ или рЕТ28а+ и затем их экспрессия в клетках Rosetta(DE3) (аналогично клонированию scFvl-З фрагментов и их экспрессии в нерастворимом виде). Полученные в результате ренатурации и очищенные на хроматографическом носителе Sulfolink-Tni88 рекомбинантные scFv-фрагменты анализировали методами ИФА и SPR в сравнении с scFv-фрагментами дикого типа.

Результаты сравнения аффинности мутантных форм, предсказанных in silico.

На основе in silico мутагенеза была предсказана увеличенная аффинность для двух мутантных форм с одиночными мутациями таких как, mutl (NL32D) и mut2 (WH100AT), и для восьми с двойными мутациями - mut3(KL49D, DH104F), mut4(WL94D, NL32E) mut5(QL90D, WL94D), mut6(NL92D, YL96E), mut7(KL49D, DH104N), mut8(DH104Q, NL32E), mut9(YL50R, NL32Y), mutlO(YH27D, YH54F). Однако лишь для двух мутантных форм с одиночными мутациями и для шести с двойными (кроме mut5 и mut7) удалось детектировать экспрессию. Из них, согласно результатам ИФА, лишь две мутантные формы с одиночными мутациями и две с двойными (mut9, mut 10) обладали детектируемой иммунохимической активностью. Причем угол наклона линейного участка кривых scFv-фрагментов дикого типа был больше, чем для кривых мутантных форма scFv (см. рис. 10). Это, а также более низкий уровень сигнала в зоне насыщения сигнала

(кривые веру и шиП на рис. 10А), указывает на более низкую аффинность мутантных вариантов всИу по сравнению с диким типом, что подтверждается с помощью метода БРЯ (см. рис. 11). При сравнении кинетических кривых мутантных форм с одиночными мутациями с кинетическими кривыми всру-фрагментов дикого типа видно, что уровень сигнала, при котором кривая ассоциации достигает насыщения, значительно выше для кривой ассоциации всру-фрагментов дикого типа. При сравнении кинетических кривых мутантных вариантов с двумя точечными мутациями с кинетическими кривыми эсру-фрагментов дикого типа видно, что при сходном значении сигнала в области насыщения кривой ассоциации, диссоциация мутантных форм происходит быстрее, чем диссоциация всру-фрагмента дикого типа. В результате, мутантные всру-фрагменты, дня которых была предсказана /л 5Шсо повышенная аффинность по сравнению с всРу-фрагментами дикого типа, на самом деле обладали меньшей аффинностью. Негативный результат моделирования мутагенеза т 5Шсо связан низкой точностью исходной модели Иу-фрагмента МАт 19С7 и ее комплекса с моделью эпитопа. Разрешение кристаллической структуры комплекса ру-фрагмента МАт 19С7 с антигеном могло бы сделать моделирование мутагенеза намного более точным.

Результаты сравнения аффинности мутантных форм, отобранных методом фагового дисплея.

Для выявления вариантов всру-фрагментов с увеличенной аффинностью методом фагового дисплея, 15-20 клонов после отбора каждого типа анализировались методом секвенирования для установления характерных типов аминокислотных замен среди отобранных мутантных форм. Наиболее часто встречающие из них были клонированы в экспрессионную плазмиду рЕТ28а+, экспрессированы в клетках ЯовеКафЕЗ) и использованы для сравнения иммунохимических свойств с всру-фрагментами дикого типа.

Всего было отсеквенировано 104 последовательности. В 6 последовательностях мутантных форм, найденных при отборе в растворе, были обнаружены делеции большей части последовательности гена веру, поэтому последовательности, найденные в ходе этого отбора, были исключены из дальнейшего анализа. Из оставшихся 84 последовательностей 59 содержали одну или больше мутаций, остальные имели последовательность дикого типа. Некоторые из этих мутаций встречались более чем один раз (УН97<3 - 12 раз; УН97Р, АНЮОЫ - по три раза; АН100Е, ОН98<3, ЭН98Н, \VH100aF, АН101К, АН101Е, УН1020, УН102У, УН102Р - по два раза). Также можно выделить аминокислотные позиции, которые часто мутированы в отобранных вариантах (Н97 - 17,

HI02 - 10, Н100 - 9, HI01 - 8, H98 - 6 раз). Поскольку повышенная встречаемость может свидетельствовать в том числе и о увеличенной аффинности этих клонов, были выбраны следующие мутантные формы для экспериментального сравнения иммунохимических свойств: phsl (YH97F), phs2 (YH97Q), phs3 (AH100N), phs4 (AH100N, YH97F), phs5 (AH100N, YH97Q, YH102V), phs6 (AH100N, YH97Q, YH102D), phs7 (AH100N, YH97Q), phs8 (AH100N, YH102D).

scFv-фрагмент

линкер IJ w

Рис. 9. Модель поверхности Fv-фрагмента МАт 19C7, построенная с использованием программы PIGS в разных проекциях. Серым цветом обозначены каркасные участки вариабельных доменов, а другими цветами -CDR-петли. Также на рисунке приведена модель scFv-фрагмента, сделанная с использованием программы I-TASSER, на которой обозначено положение линкерного пептида в структуре scFv-фрагмента.

Рис. 10. Сравнение иммунохимической активности очищенных образцов му-тантных форм с одиночными (А) и двойных (Б) мутациями методом ИФА.

0,001 0,010 0100 1000 °'001 0-010 0,100 1,000 10,000 Коэффициент разведения scFv Коэффициент разведения scFv

о 2,500 2

° 2,000 1,500 1,000 0,500

0,000

0 0,700 §0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100

500 600 700 Время, с

Рис. 11. Сравнение кинетики связывания с антигеном мутант-ных вариантов бсРу с диким типом методом БРИ. А - мутантные формы с одиночными точечными мутациями, Б -с двойными.

Выбранные для анализа БсРу-фрагменты, содержащие одиночные, двойные и тройные мутации, были клонированы в экспрессионную плазмиду рЕТ28а+ и экспрессированы в клетках штамма ЛозеПафЕЗ). Препараты ренатурированных и очищенных мутантных БсРу-фрагментов анализировали методами ИФА, 8РЯ и ФИА в сравнении с всРу-фрагментами дикого типа.

1Л

21,4 о

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2

0,00010,001 0,01 ОД 1 10 100 Концентрация мкг/мл

0,001 0,01

0,1 1 10 100 Концентрация '>сру, мкг/мл

Рнс. 12. Сравнение иммунохимической активности мутантных форм зсРу-фрагментов (А - рЬэ 1-3. Б -и рЬу4-8) с диким типом (^ср\'2) методом ИФА.

рЬз!

—*-5сРУ2

• рИ$4 —"—рИэб ■ рИБб

)К рИ$8

1,5

0,5

500 600 Время, с

1000 1200 Время, с

Рис. 13. Сравнение кинетики связывания с антигеном мутантных < рЬэ! и р11з4-8) с диким типом (эсРу2) методом БРИ..

ЬсТп1, нг/мл

рм бсРV-фрагментов (А — р1ю1-3, Б -

Рис. 14. Калибровочные графики ФИА, полученные при сорбции МАЬ 19С7 и его мутированных БсРу-фрагмен-тов, а также фрагментов дикого типа в сочетании с использованием разных детектирующих антител: МР4 (А) и 625 (Б).

ИсТЫ, нг/мл

Согласно данным ИФА, наибольший уровень сигнала в области насыщения наблюдается для мутантных вариантов рЬэ 1 -3 и рЬ85-7 (см. рис. 12А и Б, соответственно), и этот уровень превышает соответствующее значение для всБу-фрагментов дикого типа. Также видно, что угол наклона линейного участка этих кривых несколько больше для вышеуказанных мутантных форм, чем для всру-фрагментов дикого типа. Большее количество молекул этих мутантных форм, оставшихся связанными с антигеном на поверхности планшета после сорбции на единицу концентрации, может свидетельствовать об увеличенной аффинности данных всру-фрагментов по сравнению с диким типом. Так же следует отметить, что для мутантных форм рЬэЬЗ при более низких концентрациях

(0.001-0.1 мкг/мл) достигаются более высокие значения сигнала, чем фоновые. Однако результаты метода SPR (см. рис. 13) не для всех мутантных вариантов согласуются с результатами ИФА. Вариант phsl обладает повышенной аффинностью по отношению к дикому типу согласно экспериментам, полученным обоими методами (kd в 1.2 раза меньше, чем у scFv-фрагментов дикого типа). В то же время вариант phs3, согласно результатам SPR, обладает более низкой аффинностью, несмотря на возможно несколько увеличенную скорость ассоциации, тогда как по результатам ИФА этот вариант демонстрирует увеличенный сигнал. Мутантный вариант phs4, содержащий комбинацию мутаций, входящих в состав phsl и phs3, согласно методу SPR обладает наибольшей аффинностью среди исследованных фрагментов (kj в 1.7 раз меньше, чем у scFv-фрагментов дикого типа). Однако этот результат не согласуется с данными ИФА, по которым этот вариант не отличается по иммунохимическим свойствам от scFv-фрагмента дикого типа. Кинетические кривые вариантов phs7-8 практически не отличаются от дикого типа, а для вариантов phs5-6 при обеих концентрациях видно, что их аффинность ниже, чем у scFv-фрагментов дикого типа. Результаты использованных методов для сравнения иммунохимических свойств вариантов антител могут различаться, поскольку в этих методах используются разные способы иммобилизации антигена, а взаимодействие между антителом и антигеном происходит в разных буферных растворах, что оказывает влияние на параметры связывания. Поэтому, кроме оценки аффинности методами ИФА и SPR, мы провели сравнение калибровочных графиков для определения концентрации hcTnl методом ФИА «сэндвич»-типа с использованием биотинилированного МАт 19С7 и его мутированных scFv-фрагментов phsl и phs4, а также scFv-фрагментов дикого типа. Как видно из полученных кривых (см. рис. 14), величина сигнала, полученного с использованием мутированных вариантов scFv-фрагментов МАт 19С7 в качестве иммобилизованных антител и любого из детектирующих антител 625 и MF4, превосходит величину сигнала для scFv-фрагментов дикого типа. Более высокий уровень сигнала указывает увеличенную чувствительность детектирующих систем, полученных на основе мутантных форм phsl и phs4, связанную с повышенной аффинностью использованных мутантных форм.

Таким образом, для мутантных форм phsl и phs4 на основании данных нескольких видов анализа можно сделать вывод об увеличенной аффинности по сравнению с scFv-фрагментами МАт 19С7 дикого типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе были получены рекомбинантные веру и ЕаЬ-фрагменты МАт 19С7 и было показано, что они распознают как очищенный ЬсТп1, так и ЬсТп1 в крови человека.

Наличие всру-фрагментов МАт 19С7, обладающих аналогичными антиген-связываюгцими свойствами по сравнению с исходными антителами, позволило нам провести эксперименты по увеличению аффинности антител методом мутагенеза. Для этого были использованы две стратегии мутагенеза — поиск мутаций методом т $Шсо мутагенеза и генерацию библиотеки из множества мутантных форм в области СОЯ-НЗ с последующим отбором наиболее аффинных вариантов методом фагового дисплея.

Предсказанные методом т яШсо мутагенеза модификации последовательности, соответствующие мутантным вариантам антител с увеличенной аффинностью, были исследованы экспериментально. Восемь из десяти мутантных форм всру-фрагментов МАт 19С7 были получены в бактериальных клетках в количествах, обеспечивающих их выделение и очистку. Четыре мутантные формы обладали способностью к связыванию с антигеном, но ни одна из этих мутантных форм не имела аффинность выше, чем у дикого типа. Методом фагового дисплея удалось обнаружить ряд мутаций, которые часто встречаются среди отобранных клонов. Все восемь исследованных мутантных форм обладали способностью к связыванию антигена, причем, согласно результатам анализа иммунохимических свойств (ИФА, БРЯ, ФИА), аффинность всех полученных вариантов была не хуже чем у дикого типа по данным как минимум одного из использованных методов. Для мутантных форм рЬэ 1 и рЬэ4 данные нескольких методов сравнения иммунохимической активности позволяют сделать вывод об увеличенной аффинности по сравнению с всРу-фрагментами дикого типа.

Таким образом, в ходе работы были получены рекомбинантные 5сРу и РаЬ-фрагменты МАт 19С7, обладающие сходными иммунохимическими свойствами с исходным полноразмерным МАт 19С7 и детектирующие близкие значения концентрации ЬсТп1 в сыворотках больных. Эти фрагменты были использованы в качестве основы для увеличения их аффинности методом мутагенеза, и мы можем заключить, что нам удалось получить как минимум два мутантных варианта ясРу-фрагмепта, которые обладают более высокой аффинностью, чем всру-фрагменты дикого типа.

Выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность МАт 19С7, кодирующая ЛЦ и фТЦ. Были созданы молекулярно-генетические конструкции для экспрессии рекомбинантных scFv и Fab-фрагментов антитела, подобраны условия для экспрессии и очистки рекомбинантных фрагментов.

2. Показано, что рекомбинантные фрагменты МАт 19С7 и исходное антитело обладают аналогичными иммунохимическими свойствами и параметрами связывания как с очищенным hcTnl, так и с hcTnl в крови человека.

3. Проведено ш silico моделирование всех видов мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7 с одиночными и избранными двойными мутациями в шгтиген-связывающих участках, и на основе моделей рассчитана энергия связывания этих мутантных форм с антигеном.

4. Из десяти мутантных форм scFv-фрагментов МАт 19С7, для которых была предсказана in silico увеличенная аффинность, удалось экспрессировать четыре иммунохимически активные формы. Ни одна из этих мутантных форм не имела аффинность выше, чем у дикого типа.

5. Создана библиотека фаговых частиц, несущих на своей поверхности scFv-фрагменты, содержащие мутации в области CDR-H3, и проведен отбор фаговых частиц на основе их способности к связыванию антигена. Найдены аминокислотные позиции в CDR-H3 МАт 19С7 (Н97, Н102, Н100, Н101, Н98) и конкретные мутации (YH97F, YH97Q, AH100N, YH102V, YH102D), которые наиболее представлены среди отобранных вариантов.

6. Была осуществлена экспрессия восьми мутантных вариантов scFv-фрагментов МАт 19С7, отобранных методом фагового дисплея. Два из них (YH97F и AH100N+YH97F) обладали увеличенной аффинностью по сравнению с scFv-фрагментами дикого типа.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Альтшулер ЕП. Серебряная ДВ, Катруха АГ. Получение рекомбинантных антител и способы увеличения их аффинности. Успехи биологической химии, 2010; 50:203-258.

2. Альтшулер ЕП. Вылегжанина АВ, Катруха ИА, Березникова АВ, Серебряная ДВ. Использование рекомбинантных фрагментов моноклонального антитела для количественного определения тропонина. Биохимия, 2012; 77 (12): 1653-1660.

3. Altshuler Е. Comparison of biochemical and immunochemical properties of the recombinant scFv and Fab fragments of antibodies TnlMAB specific to human cardiac troponin I. Abstract, FEBS and IUBMB congress, Seville, Spain, 4-9 September 2012, The FEBS journal, 2012, Vol. 279, Supplement 1, p. 335.

4. Альтшулер ЕП. Серебряная ДВ, Постников АБ, Катруха АГ. Сравнение биохимических и иммунохимических свойств рекомбинантых scFv и Fab фрагментов антител TnIMAT, специфичных к тропонину I сердца человека. Тезисы конференции "Фармацевтические и медицинские биотехнологии", секция "Биотехнология генно-инженерных продуцентов", 2012, стр. 108-109, Москва.

5. Альтшулер ЕП. Получение и характеристика рекомбинантных Fab фрагментов антител клона 19С7, специфичных к сердечной изоформе тропонина I человека. Тезисы конференции «Ломоносов-2009», секция «Биохимия», 2009, стр. 37-38, Москва.

Подписано в печать 05.11.2012 . Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ № 1381 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Альтшулер, Евгений Петрович

Список используемых сокращений.

Оглавление.

Введение.

Обзор литературы.

1. МАт 19С7 как важный инструмент определения тропонина I в крови.

2. Антитела: строение, функции, аффинное созревание в организме, практическое применение.

2.1 Строение иммуноглобулинов.

2.2 Функции иммуноглобулинов.

2.3 Аффинное созревание антител в организме.

2.4 Способы получения и практическое применение антител.

3. Рекомбинантные антитела: производные и фрагменты, методы получения, практическое значение.

3.1 Типы рекомбинантных фрагментов антител.

3.2 Способы получения рекомбинантных антител и их фрагментов.

3.2.1 Создание рекомбинантных аналогов антител.

3.2.2 Создание рекомбинантных антител и их фрагментов de novo.

3.2.3 Экспрессия рекомбинантных антител.

3.3 Практическое применение рекомбинантных антител.

4. Увеличение аффинности антител.

4.1 Методы случайного мутагенеза.

4.1.1 Ненаправленный мутагенез.

4.1.2 Увеличение аффинности антитела методом рекомбинации.

4.2 Направленный мутагенез.

4.2.1 Подходы для выбора будущих мишеней мутагенеза.

4.2.2 Методы направленного мутагенеза.

Материалы и методы.

5. Материалы.

5.1 Реактивы и материалы для молекулярно-биологических работ.

5.2 Реактивы и материалы для биохимических работ.

5.3 Реактивы и материалы для культурально-биологических исследований.

6. Методы исследования.

6.1 Молекулярно-биологические методы.

6.1.1 Выделение тотальной РНК из клеток гибридомы, продуцирующих МАт 19С7.

6.1.2 Определение концентрации РНК и ДНК.

6.1.3 Обратная транскрипция.

6.1.4 Полимеразная цепная реакция.

6.1.5 Реакция рестрикции.

6.1.6 Отщепление нуклеотидов с выступающих однонитевых концов ДНК («затупление липких концов»).

6.1.7 Реакция лигирования.

6.1.8 Трансформация клеток и выращивание ночных культур.

6.1.9 Выделение плазмидной ДНК из ночной культуры.

6.1.10 Экспрессия рекомбинантных Fab и scFv-фрагментов МАт 19С7 в клетках Е. coli.

6.2 Биохимические и культурально-биологические методы.

6.2.1 Приготовление образцов для ДСН электрофореза.

6.2.2 ДСН электрофорез в полиакриламидном геле.

6.2.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка (OD280).

6.2.4 Определение концентрации белка по методу Лоури.

6.2.5 Культивирование клеток гибридомы, продуцирующих МАт 19С7.

6.2.6 Выделение рекомбинантных фрагментов МАт 19С7.

6.2.7 Ренатурация рекомбинантных фрагментов МАт 19С7.

6.2.8 Аффинная очистка рекомбинантных фрагментов МАт 19С7.

6.2.9 Гельфильтрационная хроматография.

6.2.10 Концентрирование проб МАт 19С7 и его фрагментов.

6.2.11 Конъюгирование носителя Sulfolink с пептидом Tni88.

6.3 Иммунохимические методы.

6.3.1 Иммуноблоттинг.

6.3.2 Иммуноферментный анализ (ИФА).

6.3.2 Флуороиммунный анализ (ФИА) «сэндвич»-типа.

6.3.3 Биотинилирование антител, их фрагментов и антигена.

6.3.4 Получение Fab-фрагментов из полноразмерного МАт 19С7 методом протеолиза под действием папаина.

6.3.5 Измерение параметров связывания фрагментов и полноразмерного МАт 19С7 с тропониновым комплексом методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

6.3.6 Определение стабильности rFab, eFab и полноразмерного МАт 19С7.

6.4 Моделирование in silico мутагенеза Fv-фрагментов МАт 19С7.

6.5 Фаговый дисплей.

6.5.1 Наращивание и выделение фаговых частиц.

6.5.2 Определение концентрации фаговых частиц.

6.5.3 Различные способы отбора методом фагового дисплея.

Результаты и их обсуждение.

7. Получение rFab-фрагментов МАт 19С7 из цитоплазмы клеток Е. coli.

7.1 Определение нуклеотидной последовательности, соответствующей ЛЦ и фТЦ МАт 19С7.

7.2 Получение молекулярно-генетических конструкций для экспрессии ЛЦ и фТЦ МАт 19С7.

7.3 Экспрессия и локализация ЛЦ и фТЦ МАт 19С7 в клетках Е. coli штамма BL21pLysS.

7.3.1 Экспрессия рекомбинантных ЛЦ и фТЦ МАт 19С7 в клетках Е. coli штамма BL21pLysS.

7.3.2 Изучение внутриклеточной локализации ЛЦ и фТЦ МАт 19С7.

7.4 Восстановление гетеродимерной структуры rFab-фрагментов МАт 19С7 методом ренатурации.

7.4.1 Денатурация ЛЦ и фТЦ и ренатурация rFab-фрагментов МАт 19С7.

7.4.2 Оптимизация условий ренатурации rFab-фрагментов МАт 19С7.

7.4.3 Очистка rFab-фрагментов МАт 19С7 методом афинной хроматографии и характеристика полученного препарата.

8. Получение rFab-фрагментов МАт 19С7 из периплазматического пространства клеток Е. coli.

8.1 Получение молекулярно-генетической конструкции для экспрессии rFab-фрагментов МАт 19С7 в периплазматическом пространстве клеток Е. coli.

8.2 Оптимизация количества функционально-активных rFab-фрагментов МАт 19С7, получаемого при периплазматической экспрессии.

8.3 Очистка rFab-фрагментов МАт 19С7 методом аффинной хроматографии и характеристика препарата.

9. Получение рекомбинантных scFv-фрагментов МАт 19С7 методом ренатурации из ТВ клеток Е. coli.

9.1 Получение молекулярно-генетических конструкций для экспрессии scFv-фрагментов МАт 19С7.

9.2 Экспрессия и локализация scFv-фрагментов МАт 19С7 в клетках Е. coli.

9.3 Восстановление структуры scFv-фрагментов МАт 19С7 методом ренатурации и их очистка методом афинной хроматографии.

10. Исследование биохимических и иммунохимических свойств рекомбинантных фрагментов МАт 19С7.

10.1 Анализ электрофоретической подвижности рекомбинантных фрагментов МАт 19С7.

10.2 Исследование иммунохимических свойств рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 методами ФИА и ИФА.

10.3 Исследование кинетики взаимодействия rFab-фрагментов МАт 19С7 и hcTnl методом поверхностного плазмонного резонанса.

10.4 Сравнение стабильности полноразмерных МАт 19С7 и их рекомбинантных фрагментов.

10.5 Изучение способности к сорбции на поверхности планшета рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 в сравнении с полноразмерными МАт 19С7 методом ФИА.

11. Направленное биотинилирование полноразмерных МАт 19С7 и их рекомбинантных фрагментов и исследование сорбционных свойств биотинилированных антител.

11.1 Подбор условий для эффективного биотинилирования rFab-фрагментов МАт 19С

11.2 Сравнение способности к сорбции на поверхности планшета биотинилированных МАт 19С7 и их рекомбинантных фрагментов.

12. Модификация последовательности scFv-фрагментов МАт 19С7.

12.1 Отбор in silico мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7.

12.2 Отбор мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7 методом фагового дисплея.

12.2.1 Клонирование библиотеки мутированных генов scFv-фрагментов МАт 19С7, получение фаговых частиц.

12.2.2 Подбор условий и осуществление отбора мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7 методом фагового дисплея.

12.3 Характеризация клонов мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7.

12.3.1 Результаты сравнения аффинности мутантных вариантов scFv-фрагментов МАт 19С7, предсказанных in silico.

12.3.2 Результаты сравнения аффинности мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7, отобранных методом фагового дисплея.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование свойств рекомбинантных фрагментов антитела, специфичного к сердечной изоформе тропонина I"

Сердечно-сосудистые заболевания остаются главной причиной высокой смертности в России и других индустриально-развитых странах. Они являются одними из наиболее распространенных и наиболее опасных заболеваний в мире. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в 2008 году сердечно-сосудистые заболевания привели к смерти 17.3 миллионов человек, что составило 30% всех случаев смерти в мире. Из них 6.2 миллиона человек умерли от инфаркта миокарда. Основными методами диагностики заболеваний сердца являются физическое обследование, электрокардиография и изучение биохимических маркеров повреждения миокарда.

Иммунохимические методы являются важным диагностическим инструментом определения белковых маркеров различных заболеваний. Открытие метода получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии Келлером и Мильштейном в 1975 году оказало огромное влияние на развитие фундаментальной науки и клинической практики. Благодаря уникальному свойству специфично и с высоким сродством взаимодействовать с антигенами, моноклональные антитела начали активно использовать для научных исследований и терапии различных заболеваний. На сегодняшний день, антитела составляют приблизительно одну треть от общего количества белков, используемых в терапии различных заболеваний в развитых странах [1].

Изоформа тропонина I из сердца человека (hcTnl) представляет собой ранний и наиболее специфический маркер повреждения кардиомиоцитов, сопровождающего такие серьезные сердечно-сосудистые заболевания, как инфаркт миокарда и нестабильная стенокардия. Кроме того, повышение уровня тропонина I в крови используется для оценки риска осложнений с острым коронарным синдромом и оптимизации лечебных мероприятий. Создание новых и усовершенствование уже существующих диагностических систем, основанных на определении концентрации hcTnl в крови, является одной из актуальных задач биомедицинской химии.

Моноклональное антитело 19С7 (МАт 19С7) с высокой аффинностью распознает hcTnl и может быть использовано для создания многих систем диагностики инфаркта миокарда, основанных на определении концентрации hcTnl в крови. Однако антитела, получаемые гибридомным методом и очищаемые обычно на хроматографических носителях с иммобилизованным белком А из Staphylococcus aureus, содержат примеси иммуноглобулинов мыши, которые могут взаимодействовать с другими антигенами в анализируемых жидкостях, что может приводить к ложноположительным результатам детекции исследуемого антигена.

Альтернативным методом получения антител является создание их рекомбинантных аналогов. Этот подход позволяет получать высокоочищенные препараты иммуноглобулинов, лишенные примесей. Кроме того, свойства рекомбинантных антител и их фрагментов могут быть изменены с помощью генно-инженерных методов. Для изменения свойств рекомбинантных антител используют различные виды мутагенеза, такие как создание ограниченного количества мутантных форм на основе анализа структуры комплекса антитело:антиген, либо создание больших библиотек мутантных форм, из которых в ходе дальнейшей работы отбирают варианты с улучшенными свойствами. К таким модификациям можно отнести повышение аффинности, увеличение числа антиген-связывающих участков, изменение состава доменов, пространственной ориентации участков связывания с антигеном, молекулярного веса, изоэлектрической точки и потенциальной иммуногенности. Еще одним преимуществом генно-инженерных технологий является возможность создания разнообразных рекомбинантных фрагментов антител, которые менее иммуногенны и могут легче проникать в ткани, чем полноразмерные молекулы иммуноглобулинов. Эти преимущества особенно важны для создания терапевтических антител и их фрагментов.

В данной работе проведено сравнение свойств рекомбинантных фрагментов МАт 19С7 со свойствами исходного полноразмерного антитела. Также, на основе рекомбинантных фрагментов были созданы различные мутантные формы с целью увеличения аффинности их взаимодействия с антигеном. Для анализа влияния отдельных мутаций на аффинность рекомбинантных антител был проведен сравнительный анализ иммунохимических свойств полученных мутантных форм.

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Альтшулер, Евгений Петрович

Выводы

3. Проведено in silico моделирование всех видов мутантных scFv-фрагментов МАт 19С7 с одиночными и избранными двойными мутациями в антиген-связывающих участках, и на основе моделей рассчитана энергия связывания этих мутантных форм с антигеном.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю, доктору биологических наук, Катрухе А.Г. за чуткое руководство, коллективу лаборатории и кафедры за неоценимую помощь в выполнении данной исследовательской работы и, в особенности, Серебряной Д.В. и Постникову А.Б. за помощь и участие в работе на всех ее этапах.

Также автор выражает свою признательность Ламану А.Г. и Ломакину Я.А. за многочисленные консультации по отбору методом фагового дисплея и Базыкину Г.А. за помощь при проведении ш 5/7/со мутагенеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Альтшулер, Евгений Петрович, Москва

1. Hagemeyer С.Е., von Zur Muhlen С., von Elverfeldt D., and Peter K. Single-chain antibodies as diagnostic tools and therapeutic agents. Thromb. Haemost., 2009. 101(6): p. 1012-1019.

2. Filatov V.L., Katrukha A.G., Bulargina T.V., and Gusev N.B. Troponin: structure, properties, and mechanism of functioning. Biochemistry, 1999. 64(9): p. 969-985.

3. Cummins В., Auckland M.L., and Cummins P. Cardiac-specific troponin-I radioimmunoassay in the diagnosis of acute myocardial infarction. Am. Heart J., 1987. 113(6): p. 1333-1344.

4. Ilva Т., Lund J., Porela P., Mustonen H., Voipio-Pulkki L.M., Eriksson S., Pettersson K., Tanner P., and Pulkki K. Early markers of myocardial injury: cTnl is enough. Clin. Chim. Acta, 2009.400(1-2): p. 82-85.

5. Sundberg E.J. Structural basis of antibody-antigen interactions. Methods Mol. Biol., 2009. 524: p. 23-36.

6. Thygesen K., Alpert J.S., Jaffe A.S., Simoons M.L., Chaitman B.R., and White H.D. Third Universal Definition of Myocardial Infarction. Circulation, 2012.126(16): p. 2020-2035.

7. Apple F.S. and Collinson P.O. Analytical characteristics of high-sensitivity cardiac troponin assays. Clin. Chem., 2012. 58(1): p. 54-61.

8. Tate J.R., Bunk D.M., Christenson R.H., Katrukha A., Noble J.E., Porter R.A., Schimmel H., Wang L., and Panteghini M. Standardisation of cardiac troponin I measurement: past and present. Pathology (Phila). 2010. 42(5): p. 402-408.

9. Ylikotila J., Hellstrom J.L., Eriksson S., Vehniainen M., Valimaa L., Takalo H., Bereznikova A., and Pettersson K. Utilization of recombinant Fab fragments in a cTnl immunoassay conducted in spot wells. Clin. Biochem., 2006. 39(8): p. 843-850.

10. Ylikotila J. (2009) Highly functional binding surface for miniaturised solid-phase immunoassays. A spot story. URL: http://www.doria.fi/handle/10024/43773.

11. Saul F.A. and Alzari P.M. Crystallographic studies of antigen-antibody interactions. Methods Mol. Biol, 1996. 66: p. 11-23.

12. Katrukha A., Bereznikova A., Filatov V., and Esakova T. Biochemical factors influencing measurement of cardiac troponin I in serum. Clin. Chem. Lab. Med., 1999. 37(11-12): p. 1091-1095.

13. Eriksson S., Halenius H., Pulkki K., Hellman J., and Pettersson K. Negative interference in cardiac troponin I immunoassays by circulating troponin autoantibodies. Clin. Chem., 2005. 51(5): p. 839-847.

14. Schroeder H.W., Jr. and Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins. J. Allergy Clin. Immunol., 2010. 125(2 Suppl 2): p. S41-52.

15. Volkov V., Kayushina R., Lapuk V., Shtykova E., Varlamova E., Malfois M., and Svergun D. Solution structures of human immunoglobulins IgG and IgM and rheumatoid factor IgM-RF. Crystallography Reports, 2003.48(1): p. 98-105.

16. Padlan E.A. Anatomy of the antibody molecule. Mol. Immunol, 1994. 31(3): p. 169-217.

17. Sundberg E.J. Structural basis of antibody-antigen interactions. Methods Mol Biol, 2009. 524: p. 23-36.

18. Kashmiri S.V., De Pascalis R., Gonzales N.R., and Schlom J. SDR grafting—a new approach to antibody humanization. Methods, 2005. 36(1): p. 25-34.

19. Padlan E.A., Abergel C., and Tipper J.P. Identification of specificity-determining residues in antibodies. FASEBJ., 1995. 9(1): p. 133-139.25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,

20. Raghavan M. and Bjorkman P.J. Fc receptors and their interactions with immunoglobulins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 1996. 12: p. 181-220.

21. Jung D., Giallourakis C., Mostoslavsky R., and Alt F.W. Mechanism and control of V(D)J recombination at the immunoglobulin heavy chain locus. Annu. Rev. Immunol., 2006. 24: p. 541-570.

22. Chowdhury P.S. Engineering hot spots for affinity enhancement of antibodies. Methods Mol. Biol., 2003. 207: p. 179-196.

23. Ho M. and Pastan I. In vitro antibody affinity maturation targeting germline hotspots. Methods Mol. Biol., 2009. 525: p. 293-308, xiv.

24. Tomlinson I.M., Walter G., Jones P.T., Dear P.H., Sonnhammer E.L., and Winter G. The imprint of somatic hypermutation on the repertoire of human germline V genes. J. Mol. Biol., 1996. 256(5): p. 813-817.

25. Maynard J. and Georgiou G. Antibody engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng., 2000. 2: p. 339-376.

26. Foote J. and Eisen H.N. Kinetic and affinity limits on antibodies produced during immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1995. 92(5): p. 1254-1256.

27. Batista F.D. and Neuberger M.S. Affinity dependence of the B cell response to antigen: a threshold, a ceiling, and the importance of off-rate. Immunity, 1998. 8(6): p. 751-759.

28. Cauerhff A., Goldbaum F.A., and Braden B.C. Structural mechanism for affinity maturation of an anti-lysozyme antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004. 101(10): p. 3539-3544.

29. Ho M., Kreitman R.J., Onda M., and Pastan I. In vitro antibody evolution targeting germline hot spots to increase activity of an anti-CD22 immunotoxin. J. Biol. Chem., 2005. 280(1): p. 607-617.

30. Thorpe I.F. and Brooks C.L., 3rd Molecular evolution of affinity and flexibility in the immune system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007. 104(21): p. 8821-8826.

31. Davies D.R. and Padlan E.A. Twisting into shape. Curr. Biol., 1992.2(5): p. 254-256.

32. Braden B.C. and Poljak R.J. Structural features of the reactions between antibodies and protein antigens. FASEBJ., 1995. 9(1): p. 9-16.

33. Acierno J.P., Braden B.C., Klinke S., Goldbaum F.A., and Cauerhff A. Affinity maturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies. J. Mol. Biol, 2007. 374(1): p. 130-146.

34. Cowell L.G. and Kepler T.B. The nucleotide-replacement spectrum under somatic hypermutation exhibits microsequence dependence that is strand-symmetric and distinct from that under germline mutation. J. Immunol., 2000. 164(4): p. 1971-1976.

35. Li Y., Li H., Yang F., Smith-Gill S.J., and Mariuzza R.A. X-ray snapshots of the maturation of an antibody response to a protein antigen. Nat. Struct. Biol., 2003. 10(6): p. 482-488.J

36. Masuda K., Sakamoto K., Kojima M., Aburatani T., Ueda T., and Ueda H. The role of interface framework residues in determining antibody V(H)/V(L) interaction strength and antigen-binding affinity. FEBSJ., 2006.273(10): p. 2184-2194.

37. Wedemayer G.J., Patten P.A., Wang L.H., Schultz P.G., and Stevens R.C. Structural insights into the evolution of an antibody combining site. Science, 1997. 276(5319): p. 1665-1669.

38. Bartal A.H. and Hirshaut Y. Methods ofhybridoma formation. 1987: Humana Press.

39. Engvall E. and Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 1971. 8(9): p. 871-874.

40. Van Weeman B. and Schuurs A. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett., 1971. 15: p. 232-235.

41. Towbin H., Staehelin T., and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1979. 76(9): p. 4350-4354.

42. Katrukha A., Bereznikova A., and Pettersson K. New approach to standardisation of human cardiac troponin I (cTnl). Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 1999. 230: p. 124-127.

43. Koshkina E.V., Krasnosel'skii M., Fedorovskii N.M., Goriacheva E.V., Polupan A.A., Arefev A.A., and Katrukha A.G. Diagnostic value of cardiac troponin T increase in critically ill patients. Anesteziol. Reanimatol., 2009(6): p. 42-46.

44. Adams J.E., 3rd, Bodor G.S., Davila-Roman V.G., Delmez J.A., Apple F.S., Ladenson J.H., and Jaffe A.S. Cardiac troponin I. A marker with high specificity for cardiac injury. Circulation, 1993. 88(1): p. 101-106.

45. Vaidya H.C. Myoglobin: an early biochemical marker for the diagnosis of acute myocardial infarction./. Clin. Immunoassay, 1994. 17(1): p. 35-39.

46. Filatov V.L., Katrukha A.G., Bereznikova A.V., Esakova T.V., Bulargina T.V., Kolosova O.V., Severin E.S., and Gusev N.B. Epitope mapping of anti-troponin I monoclonal antibodies. Biochem. Mol. Biol. Int., 1998.45(6): p. 1179-1187.

47. Krishnamurti U. and Steffes M.W. Glycohemoglobin: a primary predictor of the development or reversal of complications of diabetes mellitus. Clin. Chem., 2001. 47(7): p. 1157-1165.

48. Clark P.M. Assays for insulin, proinsulin(s) and C-peptide. Ann. Clin. Biochem., 1999. 36 ( Pt 5): p. 541-564.

49. Ludwig J.A. and Weinstein J.N. Biomarkers in cancer staging, prognosis and treatment selection. Nat. Rev. Cancer, 2005. 5(11): p. 845-856.

50. Arthur J.M., Janech M.G., Varghese S.A., Almeida J.S., and Powell T.B. Diagnostic and prognostic biomarkers in acute renal failure. Contrib. Nephrol., 2008.160: p. 53-64.

51. Nakamura R.M. and Binder W.L. Current concepts and diagnostic evaluation of autoimmune disease. Arch. Pathol. Lab. Med., 1988.112(9): p. 869-877.

52. Ekins R. The free hormone hypothesis and measurement of free hormones. Clin. Chem., 1992. 38(7): p. 1289-1293.

53. Shivaraj G., Prakash B.D., Sonal V., Shruthi K., Vinayak H., and Avinash M. Thyroid function tests: a review. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci., 2009.13(5): p. 341-349.

54. Cummings M.C., Lukehart S.A., Marra C., Smith B.L., Shaffer J., Demeo L.R., Castro C., and McCormack W.M. Comparison of methods for the detection of treponema pallidum in lesions of early syphilis. Sex. Transm. Dis., 1996.23(5): p. 366-369.

55. Stamm W.E., Cole B., Fennell C., Bonin P., Armstrong A.S., Herrmann J.E., and Holmes K.K. Antigen detection for the diagnosis of gonorrhea. J. Clin. Microbiol., 1984. 19(3): p. 399-403.

56. Black C.M. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections. Clin. Microbiol. Rev., 1997.10(1): p. 160-184.

57. Safford J.W., Abbott G.G., Craine M.C., and MacDonald R.G. Automated microparticle enzyme immunoassays for IgG and IgM antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Pathol., 1991. 44(3): p. 238-242.

58. Malomgre W. and Neumeister B. Recent and future trends in blood group typing. Anal. Bioanal. Chem., 2009. 393(5): p. 1443-1451.

59. Cole L.A. Human chorionic gonadotropin tests. Expert Rev. Mol. Diagn., 2009. 9(7): p. 721-747.

60. Donzeau M. and Knappik A. Recombinant monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol., 2007. 378: p. 14-31.

61. Wark K.L. and Hudson P.J. Latest technologies for the enhancement of antibody affinity. Adv. Drug Deliv. Rev., 2006. 58(5-6): p. 657-670.

62. Hust M., Jostock T., Menzel C., Voedisch B., Mohr A., Brenneis M., Kirsch M.I., Meier D., and Dubel S. Single chain Fab (scFab) fragment. BMC Biotechnol., 2007. 7: p. 14.

63. Jain M., Kamal N., and Batra S.K. Engineering antibodies for clinical applications. Trends Biotechnol., 2007. 25(7): p. 307-316.

64. Chowdhury P.S. and Vasmatzis G. Engineering scFvs for improved stability. Methods Mol. Biol., 2003.207: p. 237-254.

65. Conrad U. and Scheller J. Considerations on antibody-phage display methodology. Comb. Chem. High Throughput Screen., 2005. 8(2): p. 117-126.

66. Telleman P. and Junghans R.P. The role of the Brambell receptor (FcRB) in liver: protection of endocytosed immunoglobulin G (IgG) from catabolism in hepatocytes rather than transport of IgG to bile. Immunology, 2000. 100(2): p. 245-251.

67. Lo B.K.C. ed. Antibody engineering. Methods and protocols. 2004, Humana Press.

68. Benhar I. and Pastan I. Cloning, expression and characterization of the Fv fragments of the anti-carbohydrate mAbs B1 and B5 as single-chain immunotoxins. Protein Eng., 1994. 7(12): p. 1509-1515.

69. Wlad H., Ballagi A., Bouakaz L., Gu Z., and Janson J.C. Rapid two-step purification of a recombinant mouse Fab fragment expressed in Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 2001. 22(2): p. 325-329.

70. Saviranta P., Haavisto Т., Rappu P., Karp M., and Lovgren T. In vitro enzymatic biotinylation of recombinant fab fragments through a peptide acceptor tail. Bioconjug. Chem., 1998. 9(6): p. 725-735.

71. Presta L.G. Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies. J. Allergy Clin. Immunol., 2005. 116(4): p. 731-736; quiz 737.

72. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., and Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol., 1994. 12: p. 433-455.

73. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 1985. 228(4705): p. 1315-1317.

74. Hanes J. and Pluckthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1997. 94(10): p. 4937-4942.

75. Liu R., Barrick J., Szostak J.W., and Roberts R.W. Optimized synthesis of RNA-protein fusions for in vitro protein selection. Methods Enzymol., 2000. 1(317): p. 268-293.

76. Daugherty P.S., Chen G., Olsen M.J., Iverson B.L., and Georgiou G. Antibody affinity maturation using bacterial surface display. Protein Eng., 1998. 11(9): p. 825-832.

77. Boder E.T., Midelfort K.S., and Wittrup K.D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000. 97(20): p. 10701-10705.

78. Boder E.T. and Wittrup K.D. Optimal screening of surface-displayed polypeptide libraries. Biotechnol. Prog., 1998.14(1): p. 55-62.

79. Boder E.T. and Wittrup K.D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol., 1997.15(6): p. 553-557.

80. Siegel R.W. Antibody affinity optimization using yeast cell surface display. Methods Mol. Biol., 2009. 504: p. 351-383.

81. Odegrip R., Coomber D., Eldridge B., Hederer R., Kuhlman P.A., Ullman C., FitzGerald K., and McGregor D. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of proteinDNA complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004. 101(9): p. 2806-2810.

82. Brockmann E.C. (2010) Evolution of Bioaffinity Reagents by Phage Display. URL: http://www.doria.fi/handle/10024/62387.

83. Hoogenboom H.R. and Chames P. Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunol. Today, 2000. 21(8): p. 371-378.

84. Barderas R., Desmet J., Timmerman P., Meloen R., and Casal J.I. Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2008. 105(26): p. 9029-9034.

85. Pluckthun A., Schaffitzel C., Hanes J., and Jermutus L. In vitro selection and evolution of proteins. Adv. Protein Chem., 2000. 55: p. 367-403.

86. Hanes J., Schaffitzel C., Knappik A., and Pluckthun A. Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display. Nat. Biotechnol., 2000. 18(12): p. 1287-1292.

87. Tabuchi I., Soramoto S., Nemoto N., and Husimi Y. An in vitro DNA virus for in vitro protein evolution. FEBSLett., 2001. 508(3): p. 309-312.

88. Matsuura T. and Yomo T. In vitro evolution of proteins. J. Biosci. Bioeng., 2006. 101(6): p. 449-456.

89. Ulrich H.D., Patten P.A., Yang P.L., Romesberg F.E., and Schultz P.G. Expression studies of catalytic antibodies. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A., 1995. 92(25): p. 11907-11911.

90. Levin A.M. and Weiss G.A. Optimizing the affinity and specificity of proteins with molecular display. Mol Biosyst., 2006.2(1): p. 49-57.

91. Hawkins R.E., Russell S.J., and Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking affinity maturation. J. Mol. Biol, 1992. 226(3): p. 889-896.

92. Yang W.P., Green K., Pinz-Sweeney S., Briones A.T., Burton D.R., and Barbas C.F., 3rd CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range. J. Mol Biol, 1995. 254(3): p. 392-403.

93. Verma R., Boleti E., and George A.J. Antibody engineering: comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Methods, 1998. 216(1-2): p. 165-181.

94. Dimitrov D.S. and Marks J.D. Therapeutic antibodies: current state and future trends—is a paradigm change coming soon? Methods Mol Biol, 2009. 525: p. 1-27, xiii.

95. Dubel S. Recombinant therapeutic antibodies. Appl. Microbiol Biotechnol, 2007. 74(4): p. 723-729.

96. Stemmer W.P.C. Searching sequence space. Nat. Biotechnol., 1995. 13(6): p. 549-553.

97. Honegger A. Trobleshooting antibody fragments. 2003; Available from: http://www.bioc.uzh.ch/antibodv/IntroductionA^irtualSeminars/AE2003/source/slide01 .ht m.

98. Lippow S.M., Wittrup K.D., and Tidor B. Computational design of antibody-affinity improvement beyond in vivo maturation. Nat. Biotechnol., 2007. 25(10): p. 1171-1176.

99. Crameri A., Raillard S.A., Bermudez E., and Stemmer W.P. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution. Nature, 1998. 391(6664): p. 288-291.

100. Stemmer W.P. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 1994. 370(6488): p. 389-391.

101. Cline J., Braman J.C., and Hogrefe H.H. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res., 1996. 24(18): p. 3546-3551.

102. Martineau P. Error-prone polymerase chain reaction for modification of scFvs. Methods Mol. Biol., 2002. 178: p. 287-294.

103. Fujii I. Antibody affinity maturation by random mutagenesis. Methods Mol. Biol., 2004. 248: p. 345-359.

104. Low N.M., Holliger P.H., and Winter G. Mimicking somatic hypermutation: affinity maturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutator strain. J. Mol. Biol., 1996. 260(3): p. 359-368.

105. Greener A., Callahan M., and Jerpseth B. An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. Methods Mol. Biol., 1996. 57: p. 375-385.

106. Irving R.A., Kortt A.A., and Hudson P.J. Affinity maturation of recombinant antibodies using E. coli mutator cells. Immunotechnology, 1996. 2(2): p. 127-143.

107. Lantto J., Jirholt P., Barrios Y., and Ohlin M. Chain shuffling to modify properties of recombinant immunoglobulins. Methods Mol. Biol., 2002.178: p. 303-316.

108. Бикбулатова C.M., Мингазетдинова C.P., Чемерис A.B., and Вахитов B.A. Эволюция in vitro есть ли предел методам «перетасовки» генов? Успехи современной биологии, 2009. 129(4): р. 323-335.

109. Pogulis R.J., Vallejo A.N., and Pease L.R. In vitro recombination and mutagenesis by overlap extension PCR. Methods Mol. Biol., 1996. 57: p. 167-176.

110. Zhao H., Giver L., Shao Z., Affholter J .A., and Arnold F.H. Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination. Nat. Biotechnol., 1998. 16(3): p. 258-261.

111. Sivasubramanian A., Sircar A., Chaudhury S., and Gray J.J. Toward high-resolution homology modeling of antibody Fv regions and application to antibody-antigen docking. Proteins, 2009. 74(2): p. 497-514.

112. Essen L.O. and Skerra A. The de novo design of an antibody combining site. Crystallographic analysis of the VL domain confirms the structural model. J. Mol. Biol., 1994. 238(2): p. 226-244.

113. Schiweck W. and Skerra A. Fermenter production of an artificial fab fragment, rationally designed for the antigen cystatin, and its optimized crystallization through constant domain shuffling. Proteins, 1995. 23(4): p. 561-565.

114. Marvin J.S. and Zhu Z. Computation-based design and engineering of protein and antibody therapeutics. Drug Design Reviews Online, 2005. 2(6): p. 419-425.

115. Teng S., Michonova-Alexova E., and Alexov E. Approaches and resources for prediction of the effects of non-synonymous single nucleotide polymorphism on protein function and interactions. Curr. Pharm. Biotechnol., 2008. 9(2): p. 123-133.

116. Yue P., Li Z., and Moult J. Loss of protein structure stability as a major causative factor in monogenic disease. J. Mol. Biol., 2005. 353(2): p. 459-473.

117. Ng P.C. and Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res., 2003. 31(13): p. 3812-3814.

118. Раменский В. and Сюняев Ш. Вычислительный полиморфизм генома человека. Молекулярная биология, 2009.43(2): р. 286-294.

119. Sunyaev S., Ramensky V., and Bork P. Towards a structural basis of human non-synonymous single nucleotide polymorphisms. Trends Genet., 2000. 16(5): p. 198-200.

120. Sunyaev S., Ramensky V., Koch I., Lathe W., 3rd, Kondrashov A.S., and Bork P. Prediction of deleterious human alleles. Hum. Mol. Genet., 2001. 10(6): p. 591-597.

121. Ramensky V., Bork P., and Sunyaev S. Human non-synonymous SNPs: server and survey. Nucleic Acids Res., 2002. 30(17): p. 3894-3900.

122. Bromberg Y. and Rost B. SNAP: predict effect of non-synonymous polymorphisms on function. Nucleic Acids Res., 2007. 35(11): p. 3823-3835.

123. Teng S., Madej Т., Panchenko A., and Alexov E. Modeling effects of human single nucleotide polymorphisms on protein-protein interactions. Biophys. J., 2009. 96(6): p. 2178-2188.

124. Boas F.E. and Harbury P.B. Design of protein-ligand binding based on the molecular-mechanics energy model. J. Mol. Biol., 2008. 380(2): p. 415-424.

125. Reumers J., Schymkowitz J., Ferkinghoff-Borg J., Stricher F., Serrano L., and Rousseau F. SNPeffect: a database mapping molecular phenotypic effects of human non-synonymous coding SNPs. Nucleic Acids Res, 2005. 33(Database issue): p. D527-532.

126. Karchin R., Diekhans M., Kelly L., Thomas D.J., Pieper U., Eswar N., Haussler D., and Sali A. LS-SNP: large-scale annotation of coding non-synonymous SNPs based on multiple information sources. Bioinformatics, 2005.21(12): p. 2814-2820.

127. Capriotti E., Fariselli P., and Casadio R. I-Mutant2.0: predicting stability changes upon mutation from the protein sequence or structure. Nucleic Acids Res., 2005. 33(Web Server issue): p. W306-310.

128. Chowdhury P.S. Targeting random mutations to hotspots in antibody variable domains for affinity improvement. Methods Mol. Biol., 2002.178: p. 269-285.

129. Yau K.Y., Dubuc G., Li S., Hirama Т., Mackenzie C.R., Jermutus L., Hall J.C., and Tanha J. Affinity maturation of a V(H)H by mutational hotspot randomization. J. Immunol. Methods, 2005.297(1-2): p. 213-224.

130. Chowdhury P.S. and Pastan I. Improving antibody affinity by mimicking somatic hypermutation in vitro. Nat. Biotechnol., 1999. 17(6): p. 568-572.

131. Marvin J.S. and Lowman H.B. Redesigning an antibody fragment for faster association with its antigen. Biochemistry, 2003. 42(23): p. 7077-7083.

132. Selzer Т., Albeck S., and Schreiber G. Rational design of faster associating and tighter binding protein complexes. Nat. Struct. Biol., 2000. 7(7): p. 537-541.

133. Чугунов A. (2007) Новые успехи в предсказании пространственной структуры белков. URL: http://biomolecula.ru/content/l 89.

134. Чугунов А. (2008) Торжество компьютерных методов: предсказание строения белков. URL: http://biomolecula.ru/content/264.

135. Guo J.T., Ellrott К., and Xu Y. A historical perspective of template-based protein structure prediction. Methods Mol. Biol., 2008.413: p. 3-42.

136. Xu J., Jiao F., and Yu L. Protein structure prediction using threading. Methods Mol. Biol., 2008. 413: p. 91-121.

137. Eswar N., Webb В., Marti-Renom M.A., Madhusudhan M.S., Eramian D., Shen M.Y., Pieper U., and Sali A. Comparative protein structure modeling using Modeller. Curr. Protoc. Bioinformatics, 2006. Chapter 5: p. Unit 5 6.

138. Schwede T., Kopp J., Guex N., and Peitsch M.C. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res., 2003. 31(13): p. 3381-3385.

139. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics, 2008.9: p. 40.

140. Bates P.A., Kelley L.A., MacCallum R.M., and Sternberg M.J. Enhancement of protein modeling by human intervention in applying the automatic programs 3D-JIGSAW and 3D-PSSM. Proteins, 2001. Suppl 5: p. 39-46.

141. Lambert C., Leonard N., De Bolle X., and Depiereux E. ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures. Bioinformatics, 2002. 18(9): p. 1250-1256.

142. Kelley L.A. and Sternberg M.J. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat. Protoc., 2009.4(3): p. 363-371.

143. Lund O., Frimand K., Gorodkin J., Bohr H., Bohr J., Hansen J., and Brunak S. Protein distance constraints predicted by neural networks and probability density functions. Protein Eng., 1997. 10(11): p. 1241-1248.

144. Qian B., Raman S., Das R., Bradley P., McCoy A.J., Read R.J., and Baker D. Highresolution structure prediction and the crystallographic phase problem. Nature, 2007. 450(7167): p. 259-264.

145. Zhang Y. and Skolnick J. Automated structure prediction of weakly homologous proteins on a genomic scale. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2004. 101(20): p. 7594-7599.

146. Martin A.C.R. and Allen J. Bioinformatics Tools for Antibody Engineering, in Handbook of Therapeutic Antibodies. 2007.

147. Wu T.T. and Kabat E.A. An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med., 1970. 132(2): p. 211-250.

148. Kabat E.A., Wu T.T., Bilofsky H., Reid-Milner M., and Perry H. Sequences of Proteins of Immunological Interest. 1983, Washington, DC: Public Health Service, NIH.

149. Al-Lazikani B., Lesk A.M., and Chothia C. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J. Mol. Biol., 1997. 273(4): p. 927-948.

150. Chothia C. and Lesk A.M. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol., 1987.196(4): p. 901-917.

151. Chothia C„ Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G„ Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature, 1989. 342(6252): p. 877-883.

152. Martin A.C., Cheetham J.C., and Rees A.R. Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989. 86(23): p. 9268-9272.

153. Honegger A. and Pluckthun A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. J. Mol. Biol, 2001. 309(3): p. 657-670.

154. MacCallum R.M., Martin A.C., and Thornton J.M. Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography. J. Mol. Biol, 1996.262(5): p. 732-745.

155. Bruccoleri R.E. Ab initio loop modeling and its application to homology modeling. Methods Mol. Biol, 2000. 143: p. 247-264.

156. Martin A.C., Cheetham J.C., and Rees A.R. Molecular modeling of antibody combining sites. Methods Enzymol., 1991. 203: p. 121-153.

157. Whitelegg N.R. and Rees A.R. WAM: an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB. Protein Eng., 2000.13(12): p. 819-824.

158. Whitelegg N. and Rees A.R. Antibody variable regions: toward a unified modeling method. Methods Mol. Biol, 2004. 248: p. 51-91.

159. Marcatili P., Rosi A., and Tramontano A. PIGS: automatic prediction of antibody structures. Bioinformatics, 2008. 24(17): p. 1953-1954.

160. Sircar A., Kim E.T., and Gray J.J. RosettaAntibody: antibody variable region homology modeling server. Nucleic Acids Res., 2009. 37(Web Server issue): p. W474-479.

161. Wiehe K., Peterson M.W., Pierce B., Mintseris J., and Weng Z. Protein-protein docking: overview and performance analysis. Methods Mol. Biol, 2008.413: p. 283-314.

162. Comeau S.R., Gatchell D.W., Vajda S., and Camacho C.J. ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes. Bioinformatics, 2004. 20(1): p. 45-50.

163. Sternberg M.J., Gabb H.A., Jackson R.M., and Moont G. Protein-protein docking. Generation and filtering of complexes. Methods Mol. Biol, 2000. 143: p. 399-415.

164. Chaudhury S. and Gray JJ. Conformer selection and induced fit in flexible backbone protein-protein docking using computational and NMR ensembles. J. Mol. Biol, 2008. 381(4): p. 1068-1087.

165. Goodsell D.S., Morris G.M., and Olson A.J. Automated docking of flexible ligands: applications of AutoDock. J. Mol. Recognit., 1996. 9(1): p. 1-5.

166. Ewing T.J., Makino S., Skillman A.G., and Kuntz I.D. DOCK 4.0: search strategies for automated molecular docking of flexible molecule databases. J. Comput. Aided Mol. Des., 2001. 15(5): p. 411-428.

167. Rarey M., Kramer B., Lengauer T., and Klebe G. A fast flexible docking method using an incremental construction algorithm. J. Mol. Biol., 1996.261(3): p. 470-489.

168. Halgren T.A., Murphy R.B., Friesner R.A., Beard H.S., Frye L.L., Pollard W.T., and Banks J.L. Glide: a new approach for rapid, accurate docking and scoring. 2. Enrichment factors in database screening. J. Med. Chem., 2004.47(7): p. 1750-1759.

169. Verdonk M.L., Cole J.C., Hartshorn M.J., Murray C.W., and Taylor R.D. Improved protein-ligand docking using GOLD. Proteins, 2003. 52(4): p. 609-623.

170. Domínguez C., Boelens R., and Bonvin A.M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc., 2003. 125(7): p. 1731-1737.

171. Totrov M. and Abagyan R. Flexible protein-ligand docking by global energy optimization in internal coordinates. Proteins, 1997. Suppl 1: p. 215-220.

172. Wriggers W. and Birmanns S. Using situs for flexible and rigid-body fitting of multiresolution single-molecule data. J. Struct. Biol., 2001. 133(2-3): p. 193-202.

173. Sousa S.F., Fernandes P.A., and Ramos M.J. Protein-ligand docking: current status and future challenges. Proteins, 2006. 65(1): p. 15-26.

174. Skerra A. Engineered protein scaffolds for molecular recognition. J. Mol. Recognit., 2000. 13(4): p. 167-187.

175. Sidhu S.S., Li B., Chen Y., Fellouse F.A., Eigenbrot C., and Fuh G. Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions. J. Mol. Biol., 2004. 338(2): p. 299-310.

176. Bostrom J., Lee C.V., Haber L., and Fuh G. Improving antibody binding affinity and specificity for therapeutic development. Methods Mol. Biol., 2009. 525: p. 353-376, xiii.

177. Lee C.V., Liang W.C., Dennis M.S., Eigenbrot C., Sidhu S.S., and Fuh G. High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold. J. Mol. Biol., 2004. 340(5): p. 1073-1093.

178. Schier R., Balint R.F., McCall A., Apell G., Larrick J.W., and Marks J.D. Identification of functional and structural amino-acid residues by parsimonious mutagenesis. Gene, 1996. 169(2): p. 147-155.

179. Brorson K., Thompson C., Wei G., Krasnokutsky M., and Stein K.E. Mutational analysis of avidity and fine specificity of anti-levan antibodies. J Immunol, 1999. 163(12): p. 66946701.

180. Jackson T., Morris B.A., Martin A.C., Lewis D.F., and Sanders P.G. Molecular modelling and site-directed mutagenesis on a bovine anti-testosterone monoclonal antibody. Protein Eng., 1992. 5(4): p. 343-350.

181. Liu Y. and Kuhlman B. RosettaDesign server for protein design. Nucleic Acids Res., 2006. 34(Web Server issue): p. W235-238.

182. Yuan L., Kurek I., English J., and Keenan R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2005. 69(3): p. 373-392.

183. Wells J.A. Additivity of mutational effects in proteins. Biochemistry, 1990. 29(37): p. 8509-8517.

184. Riechmann L. and Weill M. Phage display and selection of a site-directed randomized single-chain antibody Fv fragment for its affinity improvement. Biochemistry, 1993. 32(34): p. 8848-8855.

185. Foote J. and Winter G. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J. Mol. Biol., 1992. 224(2): p. 487-499.

186. Chen C., Roberts V.A., and Rittenberg M.B. Generation and analysis of random point mutations in an antibody CDR2 sequence: many mutated antibodies lose their ability to bind antigen. J. Exp. Med., 1992. 176(3): p. 855-866.

187. Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem., 1987. 162(1): p. 156-159.

188. Chung C.T., Niemela S.L., and Miller R.H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1989. 86(7): p. 2172-2175.

189. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-685.

190. Lowry O.H., Rosebrough N J., Farr A.L., and Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951. 193(1): p. 265-275.

191. Wibbenmeyer J.A., Xavier K.A., Smith-Gill S.J., and Willson R.C. Cloning, expression, and characterization of the Fab fragment of the anti-lysozyme antibody HyHEL-5. Biochim. Biophys. Acta, 1999. 1430(2): p. 191-202.

192. Frey A., Meckelein B., Externest D., and Schmidt M.A. A stable and highly sensitive 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays. J. Immunol. Methods, 2000. 233(1-2): p. 47-56.

193. Adamczyk M., Gebler J.C., and Wu J. Papain digestion of different mouse IgG subclasses as studied by electrospray mass spectrometry. J. Immunol. Methods, 2000. 237(1-2): p. 95104.

194. Guerois R., Nielsen J.E., and Serrano L. Predicting changes in the stability of proteins and protein complexes: a study of more than 1000 mutations. J. Mol. Biol., 2002. 320(2): p. 369-387.

195. Saito R. and Tomita M. On negative selection against ATG triplets near start codons in eukaryotic and prokaryotic genomes. J. Mol. Evol., 1999. 48(2): p. 213-217.

196. Sharp A.J. and Slater R.J. Mung-Bean Nuclease 1 (EC 3.1.30.1). Methods Mol Biol, 1993. 16: p. 253-261.

197. Buchner J. and Rudolph R. Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragments produced in Escherichia coli. Biotechnology. (N. Y). 1991. 9(2): p. 157-162.

198. Mayer M. and Buchner J. Refolding of Inclusion Body Proteins, in Methods Mol. Med. 2004, Humana Press Inc. Totowa, NJ. p. 239-254.

199. Kiefhaber T., Rudolph R., Kohler H.H., and Buchner J. Protein aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology. (N. Y). 1991. 9(9): p. 825-829.

200. Schein C.H. and Noteborn M.H.M. Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Biotechnology, 1988. 6(291-294).

201. Lilie H., Schwarz E., and Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Curr. Opin. Biotechnol., 1998. 9(5): p. 497-501.

202. Arora D. and Khanna N. Method for increasing the yield of properly folded recombinant human gamma interferon from inclusion bodies. J. Biotechnol., 1996. 52(2): p. 127-133.

203. Buchner J., Pastan I., and Brinkmann U. A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins: single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal. Biochem., 1992. 205(2): p. 263-270.

204. De Bernardez Clark E., Schwarz E., and Rudolph R. Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding. Methods Enzymol., 1999. 309: p. 217-236.

205. Chalmers J.J., Kim E., Telford J.N., Wong E.Y., Tacon W.C., Shuler M.L., and Wilson D.B. Effects of temperature on Escherichia coli overproducing beta-lactamase or human epidermal growth factor. Appl. Environ. Microbiol., 1990. 56(1): p. 104-111.

206. Lee M.H., Park T.I., Park Y.B., and Kwak J.W. Bacterial expression and in vitro refolding of a single-chain fv antibody specific for human plasma apolipoprotein B-100. Protein Expr. Purif., 2002. 25(1): p. 166-173.

207. Lei S.P., Lin H.C., Wang S.S., Callaway J., and Wilcox G. Characterization of the Erwinia carotovora pelB gene and its product pectate lyase. J. Bacteriol., 1987. 169(9): p. 43794383.

208. Pugsley A.P. and Possot O. The general secretory pathway of Klebsiella oxytoca: no evidence for relocalization or assembly of pilin-like PulG protein into a multiprotein complex. Mol. Microbiol., 1993. 10(3): p. 665-674.

209. Arbabi-Ghahroudi M., Tanha J., and MacKenzie R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer Metastasis Rev., 2005. 24(4): p. 501-519.

210. Lee N., Holtzapple C.K., and Stanker L.H. Cloning, expression and characterization of recombinant Fab antibodies against dioxin. J. Agric. Food Chem., 1998. 1(46): p. 33813388.

211. Maeda F., Nagatsuka Y., Ihara S., Aotsuka S., Ono Y., Inoko H., and Takekoshi M. Bacterial expression of a human recombinant monoclonal antibody fab fragment against hepatitis B surface antigen. J. Med. Virol, 1999. 58(4): p. 338-345.

212. Desogus A., Burioni R., Ingianni A., Bugli F., Pompei R., and Fadda G. Production and characterization of a human recombinant monoclonal Fab fragment specific for influenza A viruses. Clin. Diagn. Lab. Immunol, 2003.10(4): p. 680-685.

213. Diamandis E.P. and Christopoulos T.K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem., 1991. 37(5): p. 625-636.

214. Santala V. and Lamminmaki U. Production of a biotinylated single-chain antibody fragment in the cytoplasm of Escherichia coli. J. Immunol. Methods, 2004. 284(1-2): p. 165-175.

215. Smith G.P. and Petrenko V.A. Phage Display. Chem. Rev., 1997. 97(2): p. 391-410.

216. Benhar I. and Reiter Y. Phage display of single-chain antibody constructs. Curr Protoc Immunol, 2002. Chapter 10: p. Unit 10 19B.

217. Rojas G. Selección de fragmentos de anticuerpo específicos a partir de bibliotecas en fagos filamentosos. URL: http://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Muestras/chapterl 1 .pdf.

218. Yu H., Dong X.Y., and Sun Y. An alternating elution strategy for screening high affinity peptides from a phage display peptide library. Biochemical engineering journal, 2004. 18(3): p. 169-175.

219. Thomas W.D. and Smith G.P. The case for trypsin release of affinity-selected phages. Biotechniques, 2010. 49(3): p. 651-654.

220. Lee C.M., Iorno N., Sierro F., and Christ D. Selection of human antibody fragments by phage display. Nat Protoc, 2007. 2(11): p. 3001-3008.

221. Marks J.D. and Bradbury A. Selection of Human Antibodies from Phage Display Libraries. Antibody Engineering: Methods and Protocols, 2003. 248: p. 161.

222. Hoogenboom H.R. Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies. Trends Biotechnol., 1997. 15(2): p. 62-70.

Информация о работе

Альтшулер, Евгений Петрович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Получение и исследование свойств рекомбинантных фрагментов антитела, специфичного к сердечной изоформе тропонина I - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы