Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимические аспекты использования моноклональных антител к тропонину I и белку, связывающему жирные кислоты, для детекции некроза клеток миокарда человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические аспекты использования моноклональных антител к тропонину I и белку, связывающему жирные кислоты, для детекции некроза клеток миокарда человека"

На правах рукописи

БЕРЕЗНИКОВА АНАСТАСИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИММУНОХИМИЧЕСКИЁ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ТРОПОНИНУIИ БЕЛКУ, ЯЗЫВАЮЩЕМУ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ, ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ НЕКРОЗА КЛЕТОК МИОКАРДА ЧЕЛОВЕКА.

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на Соискание ученой степени Кандидата биологических наук

МОСКВА 1998

Работа выполнена в лаборатории "Химии ферментов" кафедры биооргашческой химии МГУ им. М.В. Ломоносова и во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения.

Научные руководители:

доктор химических наук Северин Е.С.

кандидат биологических наук Катруха А.Г.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Москалева Е.Ю кандидат медицинских наук Лебедин Ю.С. ВКНЦРАМН

Защита состоится « _3_ »_декабря 1998 года в 12 часов на заседании

Ученого Совета Д.171.02.01 при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

Автореферат разослан « 2 »_ноября_1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

С^с^м—

В.В. Отраднова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Инфаркт миокарда (ИМ) ежегодно уносит миллионы человеческих жизней. Смертность от ИМ превышает смертность от онкологических и инфекционных заболеваний.

Достоверная и своевременная диагностика ИМ играет важнейшую роль в его терапии. Чем раньше установлен точный диагноз и начато терапевтическое или оперативное лечение больного, тем эффективнее будет дальнейшее лечение и благоприятнее прогноз. В последние годы наиболее достоверным признаком наличия у больного ИМ считается биохимический признак - повышение в кровяном русле концентрации белков-маркеров некроза клеток сердечной мышцы. В 1987 году среди белков-маркеров ИМ появился новый - сердечная форма тропонина I (сТп1), который в настоящее время считается наиболее чувствительным и специфичным маркером этого заболевания. сТп1 может быть обнаружен в крови больного уже через 3-5 часов после появления первых признаков заболевания, достигает пиковых значений концентрации в течение 16-20 часов, после чего белок длительное время -6-8 дней сохраняется в кровотоке. Важно также отметить, что в отличие от других, использовавшихся ранее маркеров ИМ, концентрация сТп1 в крови повышается только в случае развития патологического процесса, связанного с некрозом клеток миокарда.

Несмотря на то, что сТп1 как маркер ИМ известен уже более десяти лет, до сих пор остается ряд серьезных вопросов, связанных с его применит ем в этом качестве в клинической практике. Так, например, концетрация этого белка в одном и том же образце крови, определенная с использованием различных коммерческих диагностических систем, может различаться на порядок и даже более. С нашей точки зрения, эти различия могут быть обусловлены как недостаточным пониманием того, в какой биохимической форме сТп1 представлен в кровотоке больного, так и затянувшимся процессом по выработке единого международного иммунологического стандарта этого белка. В данной работе мы предлагаем свои варианты решения проблемы стандартизации диагностических систем.

Как уже отмечалось ранее, для эффективного лечения больных ИМ особенно важна ранняя постановка диагноза. cTnl, появляющийся в кровотоке больного через 3-5 часов после начала приступа, не может служить для ранней диагностики. В настоящее время с этой целью используются диагностические системы, основанные на детекции в крови миоглобина, также выделяющегося в кровоток из пораженной сердечной мышцы во время ИМ. Повышение концентрации миоглобина в крови может быть обнаружено уже через 1 -1.5 часа после начала приступа, однако отсутствие в организме человека кардиоспецифичной формы, а также высокая концентрация этого белка и скелетной мускулатуре снижают ценность этого биохимического маркера. Недавно для ранней диагностики ИМ было предложено использовать FABP (Fatty Acid Binding Protein - белок, связывающий жирные кислоты). FABP - небольшой цитозольный белок с молекулярной массой 15 kDa - принимает участие во внутриклеточном транспорте жирных кислот. В организме человека известно несколько тканеспецифичных изоформ FABP. Форма, характерная для сердечной мышцы, была обнаружена также и в скелетной мускулатуре, однако в концентрациях в 20 раз меньших, чем в сердце. Это делает FABP существенно более кардиоспецифичиым, чем миоглобин, и позволяет предположить, 4to FABP может быть с большим успехом, чем миоглобин, использован в клинической практике. Однако ввиду того, что FABP является достаточно новым маркером ИМ и только две - три группы исследователей имеют экспериментальные диагностические системы для количественной: определения этого белка в крови больного, накопленный на данный момент клинический материал недостаточен для того, чтобы сделать вывод о преимуществе использование FABP в сравнении с миоглобином. Задачей данной работы являлось создан ж диагностической системы для количественного определения FABP и исследованш возможности ее одновременного использования с системой для детекции cTnl npi диагностике ряда заболеваний, связанных с некрозом клеток миокарда.

Цель и задачи работы

- Получение нового поколения моноклональных антител к сердечной форме Тп] специфичных к стабильной части Tul и узнающих как свободную форму белка, так и cTnl составе тропонинового комплекса.

- Создание на основе полученных антител высокочувствительной диагностической системы для количественного определения cTnl в крови больных.

Исследование возможности использования тропонинового комплекса в качестве иммунологического стандарта в тропониновых диагностических системах.

- Получение моноклональных антител, специфичных к сердечной изоформе FADP.

- Разработка диагностической системы для количественного определения FABP в крови больных.

- Исследование возможности применения данной системы для диагностики инфаркта миокарда, а также мелкоочагового поражения сердечной мускулатуры у больных с нестабильной стенокардией.

- Исследование возможности использования параллельного тестирования образца крови на присутствие обоих антигенов для быстрой и достоверной диагностики заболеваний, связанных с некрозом клеток сердечной мышцы.

Научная новизна

Предложен новый метод иммунизации мышей, позволяющий получить высокоаффипые моноклональные антитела, в равной степени узнающие, как свободную форму сердечного Tnl, так и Tnl в составе тропонинового комплекса.

Показана целесообразность использования полного тропонинового комплекса в качестве иммунологического стандарта для калибрации диагностических систем для количественного определения cTnl в крови.

Показана целесообразность использования одновременного измерения концентраций Tnl и FABP для ранней и достоверной диагностики ИМ и нестабильной стенокардии.

Апробация работы

Результаты исследований были доложены на Съезде Американской Ассоциации Клинической Химии в 1995, 1997 и 1998 годах (Annahaim, Atlanta и Chicago, USA), на Съезде Европейской Ассоциации Клинической Химии в 1996 и 1997 годах (London, UK и Bazel Switzerland), на конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996) и на конференции "XXVI Nordic Congress of Clinical Chemistry" (Turku, Finland) в 1998 году.

Диссертационная работа была апробирована 15 октября 1998 года i совместном научном семинаре ЦМЭП, ВНЦМДЛ, МНИИМЭ и кафедр биоорганической химии МГУ им. М.В.Ломоносова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 Печатных работ. Структура и объем работы

Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литератур! материалы и методы, результаты работы и их обсуждение й список цитирование литературы. Работа проиллюстрирована_рисунками и_таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Магерпал1>1 и методь1 исследовании

Выделение FABP: FABP вь!делялй из Сердечной мышцы человека по следукшн

схеме:

- Гомогенизация ткани в буфере, содержащем 20 мМ Tris - НС1, рН 7.5, 0.1 мМ PMSF последующим центрифу+ированием при 12000 g.

- Гель-хроматография полученного супернатанта íia Sephadcx G75

- ИонобменНая хроматография низкомолекулярной фракции белков на DEAE Sephacél (DI 32)

- Ионобменная хроматография на CM-cellulose (СМ32)

Выделение тропонинового комплекса: Тропониновый комплекс выделяли ] сердечной мышцы человека по методике, разработанной в нашей лаборатории. На Нерве стадии из гомогената ткани экстрагировали цитозольйые белки буфером, содержащим 1 Triton Х100, затем экстрагировали миозин, после 4erd проводили непосредствен! экстракцию тропонинового комплекса. Степень чистоты препарата и концентраци компонентов тропонинового комплекса определяли по методу описанному в разде. "Результаты и их обсуждение". Хранили тропониновый комплекс в замороженном виде п| температуре -20°С.

Образцы сыворопюки: Образцы крови больных с ИМ, нестабильной стенокардией, и здоровых доноров инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут, центрифугировали с охлаждением (5 мин., 5000 g), сыворотку замораживали и хранили при -20°С,

Приготовление аффинного носителя для получения сыворотки, не содержащей FABP и cTnl. Аффинно очищенные моиоклональные антитела (МАТ), узнающие различные эпитопы на поверхности FABP (или центральную, N- или С-концевую части молекулы cTnl) иммобилизовывали на BrCN-активированной сефарозе в 0.1 М бикарбонатном буфере, рН 8.5, содержащем 300 мМ NaCl. Непрореагировавшие активные группы сефарозы блокировали глицином (1.5 М, рН 8.9), затем носитель промывали 2 М NaCl и 0.1 М нитратным буфером с рН 3.0 и хранили в PBS с 0.1% азидом натрия в качестве консерванта.

Синтез перекрывающихся декапеппшдов, соответствующих аминокислотной последовательности FABP. Синтез десятичленных пептидов осуществляли с использованием набора компании Getiosys Biotechnologies согласно методике, рекомендованной производителем,.

Определение концентрации cTnl и FABP: Концентрацию cTnl определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент поглощения А1%28о= 4.2, который был рассчитан нами на основании данных аминокислотного состава. Концентрацию FABP определяли по методу Лоури используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта..

Получение котюгата люноклональных антител с биолитам: Биогинилирование антител проводили с использованием активированного производного биотипа в 0.1 М боратном буфере (рН 8.8) в течение 4 часов при комнатной температуре.

Получение конъюгата моноклональных антител с хелатом европия: Коиьюгат моноклонаЛьных антител со стабильным хелатом европия получали, инкубируя антитела с 200 -кратным избытком активированного произвЬдного хелата в 50 мМ бикарбонатном буфере (рН 9.8) в течение ночи.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение моноклональных антител к cTnl.

Ранее (Katruklia et al, 1997) нами было показано, что основная часть cTnl, выделявшаяся в кровоток больного при ИМ, представлена в виде комплекса с ТпС. Тогда же было показано, что некоторые моноклопальные антитела (МАТ), полученные при иммунизации мышеи очищенной формой cTnl, не "узнают" белок в комплексе с другими тропошшами.

Таким образом, для созддиия высокочувствительной диагностический системы необходимо использовать выоокоаффинные МАТ, одинаково юаимодсйствугацие как со свобод юй формой белка, так и cTnl в комплексе с другими тропонинами. Позднее, в экспериментах по модслированйю некроза сердечной тка1и in Miro, мы показали, что cTnl оказывается крайне нестабильным и уже менее, чем Через двадцать часов после начала эксперимента, представлен в основном в виде протеолишческйх фрагментов, а не шпаклюй молекулы, как считалось раньше. При этом различные части молекулы cTnl демонстрировали различную устойчивость к действие эндогсштых протеаз. Как было показано, наибольшей устойчивостью обладает часть молекулы, расположенная между 30 и 110 ами1 юкисжушыми остатками. Следовательно, шпигела, используемые для создания диагностической системы с одной стороны должны одинаково эффективно узнаватЬ как свободный cTnl, так и cTnl в комплексе с другими тропонинами, с другой стороны оба шпигеЛа должны быгь специфичными к наиболее стабильной части белка.

Дня увеличения вероятности получения шттител с заданными свойствами мы предложили использовать д ля иммунизации животных не очищенный препарат Till, как это бьшэ принято ранее, a cTnl в форме тройного комплекса с сТпТ и ТпС выделенного йепосрсйстветйю из сердсшкш мышцы человека. Иммунизацию мышей линии BALB'c проводили в течение четырех месяцев. На первом этапе внутркбрюнНшю вводили 0.05 мг белка в полном адысванТе Фрейнда, после чего трижды с периодичностью в один месяц такое же количество белта в неполном здькшнге. Заключительно две имму!изации (без адыовшпа) проводили за семь и за два дм до забора ткани

Гибридизацию спленоцигов с клетками миеломной линии ВаИУс осуществляли по традиционной методике. Тестирование полученных гибридомных клеток проводили по схеме, предегашенлой на Рис. 1.

Полученные клоны гибридных клеток тестировали иммунофермешным методом с преадсорбированным антигеном Клетки ю лунок, дававших положительный сигнал, дважды реклонировали методом предельных разведений. Устойчивые клеточные линии наращивались до ко.тичест ва 5х10б- 107 клеток и вводились внугрибргсшинно мышам линии BALB'c для получения асцига. Антитела из асцинюй опухоли оЧишдли на белке А, иммобилизован!юм на сефарозе CL 4В, и хранили й фосфаптю - солевом буфере, содержащем 0.1 % азида натрия После очистки специфичность моноклональных антител была еще раз подтверждена методом Western Blotting.

Лунки, сочер'Кащне I ниргмоммм? нионы

-I (кулыурлльнэясрсла, и-стир^лшис) Наличие антител к сердечному троиониповому комплексу

X (Л0.703.7?те.ц.иьк}

Наличие антител к сердечному тропониму I

1 (иолаязггглынлг) Наличие антител к скелетному тропонину I ^ (огркцагелшиг) Наличие амтшел к* сердечному троионннам Т к С 1 (оТрицаГСЛЫГЫ!')

ДвУК'ртное реклпннриванне

I

Иарлшипание и замораживание

Рис. 1. Схе.на тестирования и отбора гибридных клеток, продуцирующих монокчоналшые антитела к сердечному тропонину I в составе тропонинового комплекса.

Таким образом, было получено 16 гибридом, продуцирующих антитела, "узнающие" сТп1 как в свободном виде, так и в составе тропонинового комплекса..

Предложенная схема иммунизации и тестирования полученных клонов оказалась удачной еще и потому, что одновременно нами были получены гибридомы, продуцирующие МАТ к сТпТ (6 клопов) и к ТпС (4 клона).

Создание новой диагностической системы для количественного определения сТп1

Новые МАТ и МАТ, полученные ранее тестировали попарно методом "сэндвич" - иммунофлуоресцентного анализа как в качестве антител подложки, так и в качестве детекторных антител. Антитела подложки были мечены биотипом, детекторные антитела - стабильным хелатом Еи3+ . Смесь детекторных антител, антител подложки и антигена инкубировали 20 минут при комнатной температуре в 96-ти луночных планшетах с преадсорбировашплм стрептавидином (Рис. 2). При этом биотшшлированпые антитела связывались со егрентавидином и в случае, ссли антитела имели различные эпитопы, образовывался "сэндвич". После этого планшет отмывали от несвязавшегося материала, добавляли раствор, усиливающий флуоресцентный сигнал и измеряли флуоресценцию на 1234 1)Е1ЛА ® флуориметре.

Цяпнпрые amtmlq мсчаёые апйитилмхеютнеерапа

Анптлй по&ламщ шеытровавыгсбиопмюи

Тп!

ОгфгнскиЛм

Рис. 2. Схелш иммунофлуоресцегшшого анализа.

Из всех тестированных комбинаций была выбрана одна пара шггигел - 19С7-биот. -8Е10-Еиэ+. Как было показано позднее, (Filatov, 1998) эпитопы этих антител расположены в стабильной к протеолизу области молекулы cTnl (30 - 100 аминокислотные остатки). На основе этой пары моноклональных антител была создана высокочувствительна^ диагностическая система для количественного определения cTnl (Рис.3).

Концентрация Тп I (нг/мл) Рис. 3. Калибровочная кривая д.гя новой диагмстической системы -• - (МАТ 19С7 - 8Е10) в сравнении с калибровоч1юй кривой для диагностической системы предыдущего поколения -

Как уже отмечалось ранее, формирование комплекса сТр1 - ТпС н некоторых случая* отрицательно сказывается на взаимодействии антител с антигеном. Как следует из Рис. 4, 6 присутствии ЕОТА, снижающего взаимодействие меяоду сТп! и ТпС, новая диагностическая система одинаково эффективно узнает как свободный сТп1, так и сТп1 в составе тропонинового комплекса.

16000 1 4000

1;ооо юооо

О

О. во 00

и

£000 1000 :ооо

уп I Тп I в составе

(30 нг/мл) комплекса

(30 нг/мл)

ис.4. Тестирование стандартных разведений сТп1 в изолированной форме и в форме ативного тропонинового комплекса с использованием новой диагностической системы в оисутствие ЭДТЛ

'роме ТпС отрицательный эффект на взаимодействие антител с сТп1 с антигеном югут оказывать также и некоторые другие макромолекулы, несущие ущественный отрицательный заряд. Так, например, ряд диагностических систем ают заниженные результаты из-за присутствия в образце крови даже езначителъных количеств гепарина (неопубликованные данные). Так как в линике для получения плазмы крови, а также при лечении больных, гепарин «пользуется достаточно часто, антитела, используемые в диагностической истеме, не должны реагировать на присутствие этого вещества в образце. Нами ыло изучено влияние добавления гепарина в исследуемый образец на результаты нализа для нашей новой диагностической системы. В качестве контроля жпользовали пару МАТ, на которые гепарин оказывает отрицательное влиятге Рис. 5). Как видно из Рис. 5, добавлетге в образец, содержащий Тп I, гепарина в онцентрации 50 МЕ/л и 200 МЕ/л практически не влияло на результат анализа с гспользованием новой диагностической системы.

II—-1 исходный образец I I Гепарин 50 ME/n ■■ Гепарин 20О М Ein

19С7-8Е10 10B7-7F4

I'uc. 5. йлияние гепарина на иммунаюгичеаую аПпиепость cTnl в новой диагностической системе {.MAT ¡9С7 - 8Ё10) и в контрольной диагнОстичёской Системе, реагирующей ltd гепарин (МЛТ lQUf- iF4).

Использование смешанно!» сэНдиКчи дли количественного онределсннн сТШ в kpoiuf больных.

Ранее опубликованные нами данные о соотношений свободной формы cTnl и cTnl в комплексе с TnC (Katrukha et а!, 1997), носили косвенный характер, так как были нолучены с использованием МАТ, специфичных только к cTnl. Для исследования содержания комплексной формы cTnl b крови больных мы применили смешанную "сэндвич" - имму но флуоресцентную систему, основаннук на использовании в качестве антител подложки МАТ к cTnl (MAl 19С7), а е качестве детекторных апгител - МАТ к TnC (MAT 7В9), одинаково эффективно узнающих как свободную фор.Му TnC, так и связанную с cTnl (Рис. 6А). Е результате бУла Получена высокочувствительная иммунофлуоресцентная система < участком линейности от 0.05 до 100 нг/Мл, чувствительностью 0.03 нг/мл (по cTnl ] составе комплекса) (Рис. 6Б) и не узнающая свободные формы обоих белко) (данные не приводятся).

Am« TftC Ù

■4

CPS

BD

A

Б

В

Рис 6. А Схематическое изображения смешанного сэндвича. Б. Калибровочная кривая длА полученной диагностической системы В. Измерение концентрации cTnJ (-'-) и cTnl à комплексе с ТпС (•»-) в \qtoeu больного с ИМ.

Используя такую систему, а также систему для определения концентрации cTnl, мы протестировали сыворотки двадцати больных с подтвержденный диагнозом "ИМ". V всех больных концентрация cTnl в составе бинарного комплекса с ТпС равнялась (или была незначительно меньше - на 5 - 10 %) концентрации cTnl, измеренной cTnl с помощью специфичной диагностической системы (Рис. 6В). Такил4 образом, Mi,г смогли Подтвердить наши более ранние дайные, свидетельствующйе о том, что основная часть cTnl выделяется в кровоток больного в Виде ico\iiuieKcti с ТпС. Кроме того, полученные нами данные являются обоснованием возможности использования такой "смешанной " диагностической системы для детекции cTnt в крови больных с ИМ.

Комплекс cTnl - сТпТ в кропи больных инфарктом миокарда.

Так как в сердечной мышце cTnl находится в комплексе не только с ТпС, но и t сТпТ, интересно было исследовать, сохраняйся ли и этот комплекс в крови больного, iîo аналогии со смешанным сэндвичем для детекцйи комплекса cTnl -TilC, нами была создана иммунофлуоресцентная система для количественного определения бинарПого комплекса cTnl - сТпТ. Для этого, так же, как и в предыдущем случае, в качестве антител подложки использовали анти-cTnI МАТ 19С7, а в качестве детекторных антител - антитела, "узнающие" как свободную форму бежа, так и сТпТ в составе тропонинового комплекса.

Исследования сывороток больных с использованием такой диашостической системы показали, что примерно в 60% случаев концентрация комплекса сТЫ - сТпТ в крови больных была ниже предела чувствительности системы (0.25 иг/мл по сТп1). Примерно в 40% исслсдованных образцов мы наблюдали некоторое увеличение концентрации такого комплекса в крови больного, совпадающее по времени с пиком концентрации сТп1. Однако даже в области максимальных значений молярная концентрация комплекса составляла 5 - 10% от концентрации сТп1. Таким образом, нами впервые было показано, что в отличие от комплекса сТп1 - ТпС, комплекс сТп1 -сТпТ не сохраняется (или практически не сохраняется) в крови больного и, очевидно, основная часть сТпТ в крови больных находится в свободной форме.

Использование тропонннового комплекса для калибровки диагностических систем.

Как уже указывалось ранее, результаты тестирования одного и того же образца крови с использованием различных диагностических систем могут различаться на порядок и более. Мы предположили, что причиной различий может быть использование производителями для калибровки диагностических систем различных форм белка (или его синтетических фрагментов), отличных по своим иммунологическим характеристикам от белка, циркулирующего в кровотоке больного. Ввиду того, что основная масса сТп1 в крови больных представлена в виде комплекса с ТпС, а у некоторых больных и в виде тройного сТп1 - ТпС - сТпТ комплекса, с нашей точки зрения, логично было бы использованть для калибровки диагностических систем нативный тропониповый комплекс. Препарат тропонинового комплекса, используемый в качестве иммунологического стандарта, должен быть очищен без применения буферных растворов с экстремальными значениями рН, содержащих мочевину и друтие денатурирующие реагенты в высоких концентрациях, с тем, чтобы конформация сТп1 максимально соответствовала конформации белка в живой клетке. Обычно тропопиновый комплекс, очищенный в таких условиях, содержит примеси других белков (актина, миозина, тропомиозина), поэтому задача по определению концентрации сТп1 в такой белковой смеси представляется достаточно непростым делом.

Для определения концентрации cTnl (равно как и других компонентов юпонина) мы разработали метод, основанный на сканировании геля после 1ектрофоретического разделенйя белков комплекса и белковых стандартов >ие.7). Белки тропониновош комплекса, а также известные количества белка -гандарта (cTnl, ТпС или сТпТ) элекгрофоретически разделяли на одном и том же гле (Рис. 7А). Полосы, соответствующие исследуемому белку, сканировали на азерной гель - сканере Ultroscan XL - Enhanced Laser Densitometer, LKB-Bromma). la основании данных сканирования стандартного белка строили калибровочную ривую (Рис.7Б), с помощью которой рассчитывали концсчгграцию белка в составе юмплекса.

Рис. 7. А. Разделение UoMnonenhioa пфопонинового кдмпЛекса (дорожки 1 и 2) н стандартных разведений cTnl (дорЬжки i - i) методом гель электрофореза; Б. Калибровочнак кривая ■зависимости суммарной оптической плотности белковой полосы от количества белка I пробе.

На основе охарактеризованного таким образом препарата тропонинового шмплекса нами были приготовлены стандартные разведения для калибровки как »'же имеющихся в продаже, так и наших экспериментальных диагностических :иетем (пары МАТ 18t 17 - НЕЮ И 19С7 - ÖElO). Одновременно, в тех же условиях /ге же приборы л реактивы), производили тестирование ряда образцов сыворотки Зольных ИМ. На основании полученных калибровочных графиков мы Смогли пересчитать концентрацию cTnl в крови больных. Полученные данные представлены в Таблице 1

Как следует из Таблицы 1, в том случае, когда диагностические системы откалиброваны по внутреннему стандарту, приготовленному производителем диагностической системы, в концентрации, определяемые в одном и том же образце сыворотки, могут различаться в 10 - 20 раз. Подобные различия мы наблюдали и в случае, когда коммерческие и экспериментальные диагностические системы были откалиброваны с использованием очищенного (из сердечной ткани или рекомбинантного) сТп! (данные не приводятся). Однако, если калибровку диагностических систем осуществляли с использованием тропопинового комплекса, то корреляция между полученными результатами была несравненно более высокой. С нашей точки зрения это наблюдете свидетельствует о том, что сТп1 в составе тропонинового комплекса наиболее полно соответствует той форме белка, которая выделяется в кровоток больного.

Таблица 1

Внутренний стандарт

Концентрация Тп I (нгГмл)

1 8 Н 7-8Е 1 0 О р и 8 тадпигп 19С7-8Е10 А«8УМ

Образец 1 . 15.8 5.4 48 .6

Образец 2 90.7 272 55.2 670

Образец 3 1 4.2 5 0.4 15.0 1 1 4.5

Обр азец 4 12.8 1 3 3 21 .в 25 7.4

Образец 5 3 9.5 25 7 6 5 .4 722

Образец в 5.85 2 3.3 6.2 49 .7

Образец 7 4.3 20 6.3 72.8

Образец 8 40.7 14 2 39 46 1 .2

Образец 9 4.1 8.1 4.6 22 .2

Тролониновый комплекс в качестве стандарта Концентрация Тп I (нг/нп)

18 Н 7-8Е 1 0 О Р и 5 гп а я п и т 1 9 С 7-8Е 1 0 А X Б V М

Образец 1 - 2.2 4.3 3.95

Обр азец 2 90.7 62 44 45.8

Образец 3 14.2 8.8 1 2 .7 9

Образец 4 1 2 .8 27.2 1 8 1 9 .1 5

О б_р а 3 е ц 5 3 9 .5 5 7.5 51 49

Образец 6 5.65 3.5 4.9 4.1

Образец 7 4.3 3 5.4 5.8

Образец 8 40.7 2 8.5 32 32.7

Образец 9 4.1 0.96 3.9 1 .95

Полученные нами данные были представлены международному комитету по стандартизации тропониновых диагностических систем, и было предложено исследовать троиониновый комплекс на предмет возможного использования в качестве вторичного иммунологического стандарта.

Получение моноклональных антител к FABP и создание диагностической системы.

Для получения высокоаффинных моноклональных антител к FABP мы использовали трехмесячный курс иммунизации мышей линии Balb/c с однократное внутрибргошинное введение антигена с полным адыовантом Фрейнда, однократное (спустя месяц после первого) введение антигена в неполном адыованте и двукратным внутрибрюшинным введений антигена без адьюваПта (34 один и два месяца до гибридизации). Для гибридизации так же, как и при получении моноклональных антител к cTnl, использовали мышиную миеломную линию Sp 2/0. Таким образом, нами было получено 4 гибридомы, продуцирующие антитела, специфичные к сердечной изоформе FABP человека.

МАТ тестировали попарно методом сэндвич иммунофлуоресцентного анализа как в качестве антител подложкй, так к в качестве детекторных антител, меченных Еи3+. Все комбинации МАТ в той йлй иной степени могли быть использованы для создания диагностических систем кроме пйрь! 6В6 * 5Í35 длй кото(юй результаты тестирования в присутствии и отсутствии антигена нйчем не отличались друг от друга. Мы предположили, что МАТ 10Е1 и 9F3 узнают индивидуальною участкй молекул FABP, в то время как МАТ 6В6 и 5В5 конкурируют за один и тот же Или близкорасположенные эпитопы. На основании результатов проведениях экспериментов была Предложена карта расположения эпйтопов исследуемых антител, предСтайленная нй Pite. 8.

Рис 8. Схема расположения эпйтопов моноклональных атпител, специфичных к / '.\Ш3

Для более детального эшпопного картирования рАвр мы использовали недавно разработанный метод твердофазного синтеза библиотеки пептидов, представляющих полную последовательность исследуемого белка. Для этого на целлюлозной основе нами был синтезирован 41 десятИчленйый пептйд. КаЖдьШ последующий пептид отличался от предыдущего сдвигом на 3 аминокислотных остатка вправо вдоль аминокислотной последовательности РАВР (Рис. 9А).

VDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATR

VDAFLGTWKL FLGTWKLVDS TWKLVDSKNF LVDSKNFDDY

Пептид 1 Пептид 2 Пептид 3 Пептид 4

А

Б

Рис. 9. А. Аминокислотная последовательность N-копцевой части FABP и соответствующие ей синтетические пептиды; Б. Выявление шноклональпыми антителами 6В6 синтетических пептидов 5 и 6.

Бее полученные антитела были исследованы на способность взаимодействовать с синтетическими пептидами. Однако только MAT 6В6 "узнавало" пептиды 5 и 6 (Рис. 9В). Общим участком для этих двух пептидов является последовательность 16FDDYMKS22. Таким образом, можно предположить, что пептид 16FDDYMKS22 играет важную роль в формировании эпитопа для МАТ 6В6. Отсутствие взаимодействия других антител с синтетическими пептидами можно объяснить либо тем, что в формировании участков связывания этих МАТ принимает участие более 10 аминокислотных остатков, либо, что более вероятно, тем, что эти эпигоны имеют пространственную а не линейную структуру. Так как известно, что молекула FABP имеет весьма сложную третичную структуру, последнее предположение выглядит весьма правдоподобным. Гипотеза о пространственном строении эпитопов подтверждается также тем, что все МАТ (кроме 6В6) практически не взаимодействуют с FABP после проведения Western Blotting, когда нативная конформация белка нарушена.

В "сэндвич" - иммунофлуоресцентной системе наиболее удачной с точки зрения чувствительности и кинетических параметров оказалась комбинация антител 9F3 в качестве подложки и 10Е1 в качестве детекторного МАТ. Сконструированная на основе этих антител диагностическая система обладала чувствительностью 0.1 нг/мл, линейным участком калибровочной прямой от 0.2 до 100 нг/мл (Рис.10) и достигала насыщения при инкубации в течении 20 мин при комнатной температуре.

Концентрация РАВР (нг/мл)

Рис.10. Калибровочный график для диагностической системы для количественного определения РАВР в крови.

Определение верхней границы нормы для сТп1 и РАВР.

Согласно Литературным данным, сыворотка, собранная у здоровых Донорс)в, обычно уже содержит некоторое количество РАВР и сТп1. В свою очередь, дЛя приготовления разведений антигена при построешш калибровочной кривой обычйо используется нормальная человеческая сыворотка. Для очистки сыйоротки от следов содержащегося в ней РАВР или сТп1 нами было предложено использовать аффинный носитель, приготовленный на основе моноклональных антител к РАВР или сТп1 с различной эпитопной специфичностью. Сыворотка, очищенная при помощи такого носителя, обычно не содержала детектируемых следов этих белков.

Для того, чтобы констатировать наличие у больного ИМ или другоЬ) заболевания, связанного с некрозом клеток миокарда, необходимо знать верхнюю границу нормы доя изучаемого белка. Обычно эта величина определяется для каждой отдельно взятой системы путем тестирования образцов крови (сыворотки), здоровых доноров. С помощью обеих диагностических систем нами были протестированы образцы сыворотки, 45 здоровых доноров (РНс 11). Для приготовления стандартных разведешш белка, необходимых для построения калибровочных графиков, использовали сыворотки, не содержащие БАВР или Тп I, обработанные по описанному выше методу. С доверительным интервалом в 95% в качестве верхней границы нормы была принята концентрация 0.25 нг/мл для сТп1 и 6 нг/мл для РАВР.

-ÛJ5 ООО 005 010 015 020 0 25 0 30

Концентрация cTn I (нг/мл)

J 1 5 6 7

Концентрация FABP (кг/мл)

l'île. 11. Концентрация cTnlи FABP в сыворотках здоровых доноров.

Исследование содержания cTnl н FABP п сыворотках больных инфарктом миокарда и нестабильной стенокардией.

Нами были исследованы изменения концентрации cTnl и FABP в крови больных ИМ и нестабильной стенокардией, собранные через определенные промежутки времени в течение 2-3 суток после начала сердечного приступа.

С использованием обеих диагностических систем нами были протестированы серии сывороток от 50 больных с ИМ. Наиболее типичный случай изменения концентрации cTnl и FABP в крови больного представлен на Рис,12А. У всех исследованных больных увеличение концентрации FABP начиналось в среднем на 2 - 3 часа раньше, чем детектируемые изменения концентрации cTnl. Таким образом, можно заключить, что FABP действительно целесообразно использовать для ранней (1-2 часа после начала приступа) диагностики ИМ, а для подтверждения диагноза, несколько позднее - через 3 - 5 часов - проводить измерение cTnl.

Впервые нами было показано, что у больных нестабильной стенокардией также, как и в случае ИМ, происходит увеличение содержания в крови сначала FABP, а затем cTnl (Рис.12Б). Изменения концентраций обоих белков не столь существенны, как в случае ИМ (Превышение над нормой в 5 - 20 раз), однако вполне достаточны для того, чтобы быть зафиксированными обеими описанными диагностическими системами.

Увеличение концентрации РАВР и сТп1 в крови больного с нестабильной стенокардией позволяет нам предположить, что причиной приступа и последующих болей в области сердца является острая ишемия и гибель части клеток участка миокарда, страдающего от недостатка кровоснабжения. Изменение концентрации ГАНР в крови больных нестабильной стенокардией может быть использовано для ранней диагностики этого заболевания, а последующее измерение концентрации сТп! - для подтверждения диагноза.

Рис. 12. А. Типичный график изменения концентрации Тп I и РАВР (- 0-)в крови больного инфарктом миокарда

Б. Типичный график изменений концентрации Тп I (-В-) и РАВР (- крови больного нестабильной стенокардией.

1_

с

Всечя после начала сердечного приступа (часы)

Ор-чмя после начала сердечного гриступа (часы)

выводы

1. Получено шестнадцать гибридом, продуцирующих мопоклопапьные антитела, специфичные к сердечной форме Tul и узнающие как свободную форму белка, так и Тп1 в составе тропонинового комплекса.

2. Создана новая высокочувствительная иммунофлуоресцентная диагностическая система для количественного определения концентрации Тн1 в сыворотке крови. Для этой системы показано отсутствие влияния гепарина на результаты тестирования.

3. Показана целесообразность использования cTnl в составе тропонинового комплекса в качестве иммунологического стандарта для калибровки различных ди агн ости чес них анииппел.

4. Впервые прямым методом показано, что основная часть cTnl в крови больного находится в виде комплекса с ТпС и лишь незначительная часть в виде комплекса с сТпТ.

5. Разработана новая диагностическая система для количественного определения cTnl в комплексе с ТпС в крови больных па основе пары мопоклопальных антител, одно из которых специфично к cTnl, а другое - к ТпС.

6. Получено чепшре гибридомы, продуцирующие мопоклоналыше антитела, специфичные к сердечной форме FA1ÍP, проведено частичное эпитонное картирование полученных мопоклопальных антител

7. Создана высокочувствительная система для количественного определения концентрации FABP в сыворотках крови.

6. Показана целесообразность параллельного тестирования сывороток крови больных на содержание FABP и Тп1 для быстрой и достоверной диагностики заболеваний, связанных с некрозом клеток сердечной мышцы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.G. Katrukha, М.Е. Severina, J. Eskola, К. Petterson, Т. Lovgren, A.V. Bereznikova, N.B. Gusev. Time-resolved fluoroimmunoassay of cardiac troponin I. American Association for Clinical Chemistry, 47th Annual Meeting, 1995 , Clinical Chemistry, v. 41, N6, p 53.

2. A.G. Katrukha, T.V. Bulargina, M.E. Severina, A.V. Bereznikova, T.V. Esakova, K. Mitrunen, K. Petterson, T. Lovgren. Cardiac troponin I - cardiac troponin С complex in sera patients with acute myocardial infarction International Congress of Clinical Chemistry, London, 1996, p 221.

3. A.G. Katrukha, A.V. Bereznikova, T.V. Esakova, K. Mitrunen, P. Mykkanen, K. Petterson, T. Lovgren. Cardiac troponin С influences the binding of monoclonal antibodies to cardiac troponin I. International Congress of Clinical Chemistry, London, 1996, pp 221-

4. Катруха А.Г., Березникова A.B., Есакова T.B., С сверти М.Е., Петтерсон К., Гусев Н.Б. Тропонин I находится в комплексе с тропошшом С в сыворотке крови больных с инфарктом миокарда. Всероссийская конференция «Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц», Пущино 1996, с. 98.

5. A.G. Katrukha, A.V. Bereznikova, К. Pulkki, L.-M. Vuopio-Pulkki, T.V. Esakova, N.E(. Gusev, M.E. Severina, K. Petterson, T. Lovgren Kinetics of liberation of free and total troponin I in sera of patients with acute myocardial infarction. American Association for Clinical Chemistry, 49th Annual Meeting, 1997 , Clinical Chemistry, v. 43, N6, p 106.

6. A.G. Katrukha, A.V. Bereznikova, T.V. Esakova, M.E. Severina, K. Petterson, T. Lovgren. Troponin complex for the preparation of troponin I calibrators and standards. American Association for Clinical Chemistry, 49th Annual Meeting, 1997 , Clinical Chemistry, v. 43, N6, p 106

7. A.G. Katrukha, A.V. Bereznikova, T.V. Esakova, M.E. Severina, V.L. Filatov, K. Petterson, T. Lovgren Stability of cardiac troponin I in human serum. European Congress of Clinical Chemistry, Basel, 1997, p. 118.

8. A.G. Katrukha, A.V. Bereznikova, T.V. Esakova, K. Petterson, T. Lovgren, V.L. Filatov, K. Pulkki, L.-M. Vuopio-Pulkki, N.B. Gusev. Troponin I is released in the blood stream of patients with acute myocardial infarction not in the free form, but as a complex. Clinical Chemistry, 1997, v.43, N 8, pp 1379 - 1385.

9. Katrukha A, Filatov V, Pettersson K, Lnvgren T, Bereznikova A, Esakova T. Development of sandwich time-resolves immunofluorometric assay for the quantitative determination of fatty acid binding protein (FABP). [Abstract] Clin Chem 1997;43:S.

10. Katrukha AG, Bereznikova AV, Filatov VL, Esakova TV, Kolosova OV, Trifonov IR, Bulargina TV, Pettersson K, Gratciansky NA. Stability of human cardiac troponin I (cTnl) in homogenates of necrotic tissue of human cardiac muscle. [Abstract] Clin Chenl 1998; 44(6): A126

11. Filatov VL, Katrukha AG, Bereznikova AV, Esakova TV, Bulargina TV, Severina ME, et al. Epitope mapping of anti-Tnl monoclonal antibodies. Biochem Mol Biol Intern 1998; 45,6; 1179-87.

12. Katrukha AG, Bereznikova AV, Filatov VL, Esakova TV, Kolosova OV, Pettersson K, Lovgren T, Bulargina TV, Trifonov IR, Gracianskyi NA, Pulkki K, Vuopio-Pulkki L-M, Gusev NB. Cardiac troponin I degradation: application for reliable immunodetection. In press, Clin Chem 1998;

222.