Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование свойств сердечного тропонина I как маркера инфаркта миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование свойств сердечного тропонина I как маркера инфаркта миокарда"

л

^ .• . ' На правах рукописи

КАТРУХА АЛЕКСЕЙ ГЕНРИХОЗИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СЕРДЕЧНОГО ТРОП О НИ НА I КАК МАРКЕРА ИНФАР;

МИОКАРДА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации ка соискание ученой степени Кандидата биологических наук

МОСКВА 1597

Работа выполнена в отделе биохимии Московского научно-исследовательского института

медш^нскзй экологии

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая орган,сз:(ия:

доктор химических наук Север!-'« С.Е

кзцаидат фиача-матшатических наук Буларгина Т. В.

доктор биологических наук Свеьшиксв П.Г. кяе-дидат биологических наук Луценвз C.B. ВКНЦ РАМН

Защита состоится _1997 года в/о2асов на заседай!« Ученого

Совета Д.171.02.01 при Центре медкю-биопогкческих и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

Автореферат разослан « (О- г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук /О Отрадкоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

8 настоящее время инфаркт миокарда (ИМ) стоит на первом месте среди причин смерти, опереисая онкологические и инфекционные заболевания,

В последние годы наиболее достоверным признаком наличия у больного ИМ счтается повышенна в хровяном русле концентрации банков - маркеров некроза клеток сердечной мышцы. В разное время □ этом качесте ^.егюпчзазалчеьпаггатдегмдрогекя^а, креатинкиназа, лгтае цегм миоз;*на, миогпобин. В 1937 году 5ыло предложена для диагностики ЯМ использовать ссрдечн^ форму трогюнина I (Тн!) Гн1 - компонент тропонинового комплекса, или просто трспонина, играющего вакную роль з регуляции мышечногс сокращения. Тролонии состоит из трех компонентов, прданю обязанных друг с .оругем. Тропоиин С (ТнС) - Ся'* - ссяэываящий бепок, трогюнин ! - иигтйируег АТФ-азкую экпяноаь актомкозича и трогганчн Т (ТнТ) обеспечивает прикрепление тропокинз к тропомиозину.

Ть,| может йьггь обнаружен в крови больного ужэ через 3-6 чяеоз после появления первых признаков заболевания, достигает пиковых значений концентрации в течение 16 - 20 часов и сохраняется в кровотоке длигелчюе время - 6-8 дней. Таким образом Тн1 может быть использован как для ранней, так и для поздней диагностики ИМ. Взхно, также, отметить, что в обличив от других, испопьзоеззшихся ранее маркеров ИМ, концеятрация Гн1 в крови повышается только в случае развития патологического процесса, связанного с некрозом кл-эток миокарда. Большое значение имеет также то, что Тн! мгокет испопьзоватьоя дня диагностик микроинфарктов, а повы-пенме его концентрации в крови больных с нестабильной стенокардией имеет прогностическое значение. Все сказанное - высокая специфичность, чуыствительнехлъ, шфекий диапазон времени, в течение которою Тн! сохраняется в крови больного делают этот белок уникальным маркером ИМ.

Однако, несмотря на тот огромный интерес, который проявляют к Тн! медики до сих пор неизвестно, г какой формо Тн! выделяется б фоеогок больных, с ИМ. Это незнадав биохимии

исследуемого объекта приводи г к существенным проблемам при разработке новых и

стандартизации уже имеющихся диагностических систем.

Цель и задачи работы

» Разработка нового высокоэффективного метода ецпепения выпокоочищэнного препарата Tt-í! из сердечна) мыщы человека.

• Попечение мтюкпональннх«тлел, специфичных к сердечной изоформеTut.

• Иымунохимичаский анализ 7h¡, обнзру>хшавмсго в крови больных с ИМ

« На основе полученных мочеклонапьньк антител и данных иммунохимичесаого исследования - создание аысэионувятвигельгюй и специфичной диагностической системы для г-.ог.ичестзечно'о опродепени!» Ть) ь кроеи

Научная козизнз

« Разработан новый метод ¡юпучения гысоксасз ««печного rpensрзта Тк) и друпск компонентов тропониноьо! о комплекса (ТвС и ТиТ).

• Изучены некоторые осоОонносги бмэхимии Tu! в крови больных с ИМ

« На базе проведенных иммунохимичеся« иссте^ов-ани* предложен новый t/етод получения стабильного препарата Тн;.

Апробация работ»;

Результаты исследований были доложены на съезде Международной Федерации Клинической Химии в 19SS году {Tamoere, Finland), на съезде Американской Ассжциаци;» Клинической Химии г 19S5 и 1997 годах (Annahairn и Atlanta, USA), на съезде Европейской Ассоциации Клинической Химии в 1S&6 и 1397 годах (London, UK и 6aie.l Switzerland), на конференции "The Internationa! Congress on Clinical Enzymology' (Cambncge, UK, 1936), на конференции "Прикладные аспекты исследований скелггных, сердечных и гладких мышц*

(Лущимо, 1953) и на научной конференции, посвященной памяти академика С.Е.Северима (Москва, 1993). Диссертационная работа было япрсбнровака 30 сктяЗря 1997 года на научном семинаре МНИ/МЭ.

Публикации

По теме диссертаиии ог^йпиковано '14 печатных работ

Структура я объем работы

.Диссертационная работа содержит сг.едуюаце раздень;: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и 1-л обсуждение и список цитированной литературы.

Работа шпакена на__страницах печатного текста и иллюстрирована _рисунками и

_таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Получение ипискпоиз/:ьных антител CS Мсноклональныа антитела С5 получали согласно трздицио! (ной методике {Köhler cl а!, 1070) после иммунизации мышей бычьим Тн!.

Образцы ткани: Образен скелетной и сердечна"! ткани человека хранились замороженными при температура -70°С. Все образцы ткани тестировались нз наличие ачппел к возбудителю сифилиса, вирусам гепатита В и С. ВИЧ 1 и 2.

Аффинная очистка моно*лоналы/ых антител мв PrA-Sephsrose и определение концентрации монокпональных антител: Асциткую жидкость, содержащую монохпочщъные антитела, обрабатывали 50% сульфатом аммония, центрифугировали при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяли в буфера, содержащим 1.5 М глмцина, pH S.9, и 3 И NaCI, фильтровали и наносили ¡ia колонку с PrA-Sepharose, уравновешенную тш же буфером. Эпюцию антител осуществляли 0.1 М цитрагным буфером с pH 4.0. Концентрацию антител определяли по методу

Лоури, используя для получения калибровочной прямой стандарт политональных мьшиьк аьгтягеп (Calbíocfterti).

Призотовлетю аффинной колонки йля выделения тропониновоео комплекса. Аффкнно очищенные антитела С5 фиксировались яа BrCN-акшвировачной сефзрозе в 0.1 М бикарбонатом буфере, рН 3,5, содержащем 300 мМ NaCl.

Определение концентрации Tul, ТнГ и ТнС Кси-хрггрзцмю белкоа определяли спектрофотоматрич2ски о использование козффицкетое потощзния Агло (С=0.1%) 0.42 и 0.52 для тропонимоа ! и 7, которые были ргсочита-ы нами на основании данных аминокислотного состава этих белков и коэффициента 0.35 -для определения концентрами ТнС, определенного ранее для крслич»его ТнС.

Получение хоиъюззгоа монэкпональных e.timumsn с биотипом: Бдагикилирование антител проводили в 0.1 М боратном буфере (рН 8.8} с активированным производным бисткна в течение А часоа при комнатной температуре.

Получение коныогата моноклинальных антител с халату.) европия: Коньюгат монсклоьальиык антгеп со стабилыыч хелатом европия получали, тгубируя антитела с 200 ~ кратным избытком активированного производного хеяата в 50 мМ бикарбонатам буфере (рН 9.8) в течение ночи.

Результаты и их обсу>здение

Выделение Thí.

Необходимость разработки нового мзтеда выделения Тн! была обусловлена для нас несколькими факторами. Во-лэрвьи - это недостаточная эффективность описанных ранее методов выделения, которые приводили к существенным потерям белка, что в случае работы с человеческой тканью абсолютно недопустимо. Бо-вторьк, все описанные ранее методы выделения быда разработаны дня очистки белка из свежей животной ткани и занимали обычно 3-4 дня. Однако, известно, что Tul крайне чувствшелен к действию протеаз. Крупные прстаолщическиэ фрагменты белка мало отличаются ог исходной молекулы по езоим физико-химическим

свойствам, и поэтому разделить смесь нлтивного Ти! и его фрагментов традииисииыми методами невозможно. В результата Тп1, яь'деленкый по описанным ранее методам, практически всегда содержит примеси - крупные фрагменты бепкэ.

Поскольку мы не имели возможности получагь сеежую (постопграЦионную) сердечную ткань человека, ми пынуьдены был* работать струпном натериапем Трупная ткамь прзкгичеьм всегда содержит значительные количества (до 50%) протеслитических фрагментов Тн!. Но даже и в тех случаях, когда содержание прогеогмтаческих фрагиентоз в ткани не было существенным, метод еыцеления однородного препарата белка должен был быть достаточно быстрым. чтобы до минимума сократить время воздействия очдогонных протваз на Тн!.

Для определения степени протеолт ичеокой деградации Тн1 8 сердечной ткани мы использобэпи иммучсжимичеекий метод Перед началом зь\цс-ления образец ткани гоеюгенизировзли в буфгрз для лриготочлсния образцов для ДСН-гель-злекгрсфореза, гилятили в течение 5 минут и наносили на гель о градиентом ажипагида '10-15%. После проведения элсктрофорстичоского разделения белад из геля переносили на иитеоиеллюггазную мембрану по методу полусухого (/Уейет Е(о:Епд и ви^уализировзп'и антитояани кпона С5 (Рис. 1). Для дальнейшей ра&пы »юхетьзсеатсь только то образцы ткани, которые не содержали пвотеолитическусс фрагментов Тн!. Схема предложенного нами метода ввдежнмя представлена из Рис. 2.

¡ <. г * х

Jj" . . .. ТТродукти ^рйТАСЛНТИЧ(1ГКоГ,

. дсгрч.апйии Tkí

Рис. 1 Предварительное тестирование гтани методом Wosfem Blofíing пэред началом выдёпенияТн!. Цифрами сбогна'-гены различные образцы ткани.

Отобранную таким образом ткань (100 г) измельчали в гоюошниззтерэ системы Wuring

Blendor в течение 30 сек в восьми объемах суферэ, содержащего 20 мМ Tris-HCI ípH 7.5), и

ингибиторы поотсаз. Гомогенат ткэнк цонтрифущроаагм 10 мин при 10000 g и осадок слова

гомогенизировали а том жв буфере с добавленным до концентрации 1% тритоном Х-100. Посла центрифугирования осадок промьшаш в течение 15 минут при легком перемешивании буфером, содержащим 160 мМ фосфат каг.ия (рН 8.5). ОЗУ! KCI, 0.2 мМ АТФ, ICs.nV ЗДГА. Отмыеха в таких успозиях позаоляет избавиться ся существенной часта миозина, затрудняющего работу с экстрактом. Пспученнуто суспензию центрифугировали 30 мин при 15000 д. Тропониновый комплекс экстрагировали из собранного осадка SCO мл оуфора, содержащею 25 мМ Tris-HCl (рН 7.5), 0.7 М UCI. 5 mW ЗДГА, 0.1 mM PMSF при температуре 0° С, при медленном перемешивании в течение одного часа. Полученный еязкий экстракт центрифугировали 1 час при 20000 а. суг/ернзтант собирали, а осадок пэдзергалк повторной экстракции в тех же условиях. После центрифугирования супернашпь; объединят и наносили на аффинную колонку, которая, как это указано в разделе "Материалы и методы", готовилась на основе BrCN-активированной сефарозы и маноклонгпьных антител С5. Ранее нами было показано, что антитела С5 обладают цмрохой специфичностью. В Western Blotting антитела С5 "узнавали" как сердечную, так и скелетные формы Tni карася, курицы, кролика, быка и человека, на основании чего нами был сделан вывод, что эпитапом данных антител »еляется весьма ¡данозраэтиеный участок молекулы Tnl.

Предварительной тестирование ткани в Vfestern Blotting

I

Гомогенизация ткани и отмывки от цитозопькых и части сократительных белхоа

I

Экстракция тропонинового комплекса

i

Очистка тропоникового комплекса на колонке с антителами ктропонину f

4.

Разделение компонентов тропоникоаого комплекса на DEAE и СМ целлюлоза Рис 2. Схема очиски компонентов тропоншового комплекса.

Перед нанесением полученного экстракта аффинную лблокку (25x100 мм) ураьчовешизали буфером применявшимся длч г'мггрзщчи тропониновао вдмплекга. Экстракт напоили со ечсроох.ю ЮС мп/чдс, поел-.1, чр.т> промывали тем же буфером Тролснинсзый комплекс алюк.ропапи 0 1 М глициюпым буфером с рН ?.0. Данные электрофореза (Рис. 3) свидетельствуют, --по на этой стадии йыдел^кя достигается очень высокая степень очистки тропонина (по расчетам примерно э 200 - 300 paJ) Получчмаый таким образом препарат содержит 85-90°* (от содержания в лкстрзие) тропсиинсного вдмплвкса с чистотой 70 - 80 %. Важно также оплатить, что использование аффинной хроматографии позволило нам получить достаточно чистый npsn^par тропонина уже через 4—5 часов ¡вспс начала выделения и свести, таким образом, до минимума время контакта Тп! сундогеннЫммпротеазами.

На следующей стадии эпгоэт к аффинной колонки высаливали 50% сульфатом эримснир vi центрифугировали при 10000 g в течении 20 минут Известно, что компоненты трояоничо^огп комплекса настолько прочно связаны друг с другом, что да?делить их можно только в присутствии высоких концентраций донатуркюукхцих реагентоя - таких сэч мочевина или гузнидин хлорид. Поэтому, осадок растворяли в минймалыюм объеме буфера, содержащего 20 мМ Tris - HCI, (рН 7 Ь), 7 М мочевину, 10 мМ меркалт оэтанол и 5 мМ ЗДТА и диаштовагм протиа этого же буфера в

12 3 4

I

ц *» *

Рис. 3 Выделения тропонииоаого комплекса. ДСНе«ль-элз.\7Г:рофорез.

Дорожа 1 - эистрэнм до нзн&сения на аффинную колонку, дорожки 2-4 - с эффинной ь'опоики

течение ночи. После диализа смесь бел®» наносили на колонку с DE-52 цэлгеолмой (Whatman, 25x100 мм), уравноаашаниую тем же буфером. Тн! проходил через копойху, не взаимодействуя с носителем, гада, как ТнТ и ТнС алюироват градиентом NaC! (0 ~ 0.5 М), приготовленном на буфере нанесения. К препарату Тк! добавляли ацегтет натрия до концентрации 20 м5Д, pH доводили до 4.5 и дочиирлк на колонке о Ш цглгио/теой (13x20 мм), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ ацетат натрия (pH 4.5), 8 М мочевину. 10 мМ мзркаптоэтаиол и 5 мМ ЭДТА. Элнзировали белок градиентов NaCI (0 - 0.5М), приготовленном на том же буфере. Тн1 выходит с колонки при концентрэции соли 150 мМ. ДСН-гель-зпекгрэфораз тропонинового комплекса, элюировадного с аффинной колонки, и ксмпонентов тропониноаого комплекса после окончательной очистки представлен на Рис. 4

12 3 4

■с*.

%Ss чт

. ■ v.- ^ ; ... . . S

Яис. 4 Очистка компонентов тропонинового комплекса. ДСН-гель-зпехтро^юрэз.

Дорожа 1 - тропонииовый кшплеые поосла апюции с аффинной колонки Дорожа 2-тропонин С Дорожа 3 - тропон ин I Дорожка 4 - тропонин Т

Следует отметить, что по разработанной нами методике из 100 г сзрдечно-мыиечной ткани обычно удается получеть до 20-25 мгТн!, 35 - 40 мг ТнТ и 15-20 мгТаС.

Учтывоч то, что использовавшиеся нами для приготовления аффинной колонии моноклонапьные антитела С5 "узнают* достатсчмо консераятнгшый участок молекулы Tri, характерный на только для сердечной, но и для скелетных изоформ белка, а также для Тн! многех лозпон-чных, мы уппешчо ивк-льзопапк! да-шьй метод дпя очистки тропоытнсо из человеческой а еле гной мускулатуры, а также, дпя счистки тропонинов из скелетной и сердечной мышечнсй ткани других видов животных (кролик, доза).

Таким образом, предложенный нами нацый метод очистки позволяет сыделкть до 50 -SO % содержащихся в сердечной мышце тропонинов за очень короткий срок - 2 дня и получить вьадокаочищеный препарат Тн1, практтмэски на загрязненный протеолдаичесшми фрагментами. Разработанный нами метод предварительного ткугмрованмя дает возможность ещэ до начата выделение отобрать пригодные для этого образцы ткани. Кроме ятопх благодаря универсальности исгользсвгнных для приготовления аффинной врлочки моноклинальных антител, описанный метод мсжно применять не талью дпя очистки троночкное из челоееческой сердечной мьялцы, но, и для их выделения из скелетной мускулатуры и тканей других видоа животных.

Получение моноктюнапьных антител

Концентрация Тн! г крови боланьк с КМ находится в области довольно низких значений, в диапазоне от 0.2 до 100 иг/мл. Поэтому моноиюнальныо (ипп политональные) пнллела, используемые при разработке диагностических систем, должны взаимодействовать с aifm-еном с достаточно еысокш аффиютетом. Аффинитет получаемь* антител находится в прямой зависимости от времени, прошедшего с начала иммунизации »квотного. Поэтому, мы разрвпотали протокол иммунизации, ргссчитачьый на 4 - 5 месяцев К к?нцу указанного срока проводили тестирование животных на содержание антител кТй. Селгзгнку животных с наивысшие титром антител использовали для гибридизации о мышиной миеломной линией Sp 2/0. Полученные клоны гибридных клеток тестировались методом имм^иоферментнсге анализа с прсадсорбироаакным антигеном на еэаимедеиствие с сердечной формой Тн1, а гатем положительные клоны проверялись на азэимодзйссгеие со скелетными фер»1ами белка. Отбирались ¡¿паны, не имеющие перекрестного взаимодействия со скелетным Тн1. После этого клетки дважды реклонирозапясь методом предельных разведений. Устойчивые клеточныэ пжии наращивались до количества

5x106 - Ю7 клеток и вводились шутрибркхдинно мышам яжки BALB/C для пслучв(шя асщпной опухоли. Антитела т аа^кгной опухали очищагда на PiA - SepSiarose и хранили в фосфа1.чо -салэвом буфере о 0.1 % азздом натрия до иегюпьзеяания. После очистки специфичность монокломэльньк акт^ггеп была еще раз подтверждена мзтодом Western Б!оШлд. Полагают, что после проведения ДСН-гель апектрофоое-за и перекоса на нитроцмиволозу белок теряет свою вторичную к третичную структуру. Однако, все полученные нами монокг.энальныв антитела взаимодействовали с Тн!, перенвсанкым на нитроцедпюлссиую мембрану. Это позволяет нам предположить, что, w одно из исследуемых моноклональных антител не взаимодействует с конформационными детерминантами, а "узнает" только линейные участки молекулы

Б результате проделанной работы нами было получек) 12 гибридом, праду^руюир« антитела, специфичные к сердечной изоформе Т.ч. человек.

Разработка диагностической системы для количаственного определения Тн! в крови больных с ИМ.

Для создания диалогической системы мы использовали идею "сзедви'Г-иммунофлусресиенгного анализа. Схематично принцип такого анализа изображен i ia Pi«.'.. 6.

Рис. S. Схема ишунофлуоресцентного 8на/тза, использовавшаяся при разра5огтз диагностической системы.

Из всех полученных конеклональныхатмтеа а также антител кпоиа 414 (HyTest, Finland) готовили следующие конъюгаты:

а. монокг.'опальное антитело — производной биогйна & моиэклональкэз антитело - стабильный xsriar европия

Биотиниляромнные антитела штионизовап/сь и качестве Подложки, а аь'тепа мпчонние енрошиом - как д? гектср: lue.

Для постановки эксперимента применяли планшеты с; прездсорСмрозанным и рептогчедииом. В лунку Эй-ти луночного планшета одновременно вносили раствор биогинилироеанных и Eu-меченных антител и антиген, растворенный в нормальной человеческой сызоротке. Смесь ангйгеп с антигеном инкубировали тридцать, минут при комнатной температуре мри активном перемешивании. При зтом бмот имитированные антитела связывались си стрептагаедином, и в случав, если антитела имели различные зпитопы, образовывайся 'сэндвич". Посла этого планшет отмывали ст несяпзавшогося материала, добавляли раствор, усиливающий флуоресцентный сигнал и флуоресценцию измерягш на 1224 DB.FIA я флусриметрз. Все полученные антитела были протестированы з таком эксперименте как в качестве подложки, так и с качестве детекторных nimtcn В результате проведанного исследования мы смогли: • составил ь карту зпугопоя полученных антител (Рис в).

- сыбрзтъ пары ат.п ел, даюиуе наиЗолее сильнь:н сигнал при такой лостэноике эксперимента, Эти пары били использованы в дальнейшей работа по созданию диагностической системы

Рас. 5 элмгппггная парта 12 моноклинальных ентшпел

Как вадно т Рис, 6- полученные нами монокпснальные акштела взаимодействовали с тремя мндавидуйльньвли и двумя перекрывающшися эгшопами.

Для дальнейшей работы были отобраны десять пар анпп вд для которых обнаружена наивысшая чувствительность при раститрокче ал иге на На основ« мш нар антител были сконструированы иммунофлуоресцантные системы с чуЕстоттелыкетью не 0,1 иг/иг, и лтейньм участком ваг&йроаочной прямой от 0.2 до 100 нг/ьдп.

Не смотря на то, что всо сыбранные для дальнейшей работы пары антитвл давали вполне удовлетворительные результаты г,ря работе о очищенным препаратам белка, эксперименты с образцами крови человека поставили перед нами ряд вопросов. На Рис. 7 представлен график, демонстрирующий кинетику кзменеткя концентрами* Тн1 в крови бс/ьногт; с ИМ. Концентрами ТЫ измвряпи с помощью деух разных диагностических систем.

Рис. 7 Измерение концентрации Тн1 « крози одного и тоео же больного в деух различных системах

Как видно иэ рисунка, концентрация Тн1, определенная а одном и том же образца крови, но с использованием различных диагностических систем (откашброеанньк по единому стандарт), по непонятным для нас причинам разломалась р несколько раз. К этому моменту и в клинической

литературе появились сообщения с аналогичными данными, полученными при испог.ьзсвании коммерческих дигапостических систем.

Исследование биохимических свойств Ти! в крови больных с ИМ.

Неоднозначные результаты, полученные при измерении концентрации Тн1 г. крови больных с ИМ поставили, перед наш задачу выяснения причин наблюдаемых нами явлений. Мы предположили, что антитела, использовавшмгсч нами для конструирования диагностических систем по-разному "узнает" очищенный препарат ТМ и Тн!, который находится о крови больных с ИМ. Чтобы понять, какие пары антетел можно использовать для создания диагностической системы, праэде всего надо было выяснить - а какой биохимической форме Тн! представлен о крови болкньк и какие факторы могут повлиять н<з взаимодействие антител с антигеном,

В Таблице 1 представлены факпоры, которые, на наш взгляд, могут отзывать злиянне на взаимодействие антител и антигена.

Таблица 1

Посттрансляцчоккая модификация Как может влиять на взаимодействие

антител с антигеном

I Формирование комплекса с Тн'Г и Т'нС

Изменение информации Тн'г Экранирование части эпитопоа

! Частичная деградация молекулы Тн! род | Изменение («»-¡формации. Тн! действием эндогенных прстеаз в процессе | Потеря часта элитопов неурогизации ткани

Фосфорилированиэ ¡Зег 22 и Рег 23 цам<Ь- Изменение «информации Тн! зависимой прогеинкиназой Изменение чзсти эпмтопов

Ожслсние/восстзновлеиие 5Н-грут Изменение конфсрмации Тн1

Изменение ччсти эпитопов

Наиболее важным из перечисленных выше сочетаний факторов, на наш взгляд, является взаимодействие ТН с ТИС. Известно, что образование комплекса между двумя атаки белками (особенно прочного з присутствии ионов кальция) приводит к существенным изменениям в информации Тн1, что может сказывать влияние на взаимодействие антител с антигеном. Кроме этого ТнС, формируя комплекс с Тн1, может создавать пространственные затруднения для взаимодействия мочспотональных антител с их зпитопами на поверхности Тн1.

Для тою, чтобы ороаеригь, оказывает ли влияние формирование бинарного комплекса Tul -ТнС. на взэимодейсггеие исопедувмья нами антител с антигеном. мы доставили акспвркмвч!, схема которого представлена на Рис. 8. Во всех исследуемых системах измерялся уровень сигнала при добавлении а) Тн1; 6} Тн1, иреи^кубироваиного с 6-ти молярным избытком ТнС в присутствии ионов кальция; е) Tui, преинкубироваиного с 6-ти молярл-ии избытке!.! ТнС о присутствии 5 мМ ЗДТА. Результаты этого эксперимента представлены на Рис. 9.

Рис. 8 Схема эксперимента по исачедсаанию влияния ТнС на взаимодействие антитьл с.Тн!

j^JJj'oí-AMfcá | 7f-í\ 7P¿

Рис. 9. Впийние тропонина С на связывание гит'гпеп с тропонинои /.

Съепто-серые столбики - сигнал, полученный при добавлении в систему ТЫ; темно-серые столбики - йобавлен 7м', лреинкуСировтшый с ТнС, белые - ТнК лреинк/бироеанный с ТнС в присутствии ЕДТА.

Как видно из Рис. 9 практически все лары антигел {за исключением двух) реагировали на добавление ТнС к раствору ТШ. Дпя одних пар, например 7Р4 - 10В11, это выражалось з увеличении сигнала, что, очевидно, можно объяснить положительным в/жянием информационных изменений Тн! при формировании комплек» с ТкС на эпигон одного т антител. Для болытш'стаа же исследсваш1ихся пар зьттеп образование бинарного комплекса приводило к снижению (в нескольких случаях весьма существенному) уровня сигнала. Так. например, для г<ары антител 7Р4-414 мы наблюдал* только 3% от исходной акгианозти при добавлении ТнС. Связывание кальция при добавлении ЗДТА приведет к ослаблению взаимодействия мевду ТнС и Тн1, и, кок следствие, к восстановлению исходного уровня сигнала для большинства пар антител. На основами« полученных данных нами Была предложена следующая схема влияния ТнС на взаимодействие антител с Тн! (см. Рис, 10). Как видно из этото рисунка, при о5ра?свании бинарного комплекта

Рис. 10 Влияние тропонина С на гпитопы глонохлональкых антител в присутствии и отсутствии иокое кальция.

в присутствии ионов кальция ТнС закрывает (пли существенно видоизменяет) участок связывания антител 414 и частично изменяет участки связывакир ррда других еитител. В отсутствии ионов кальция взаимодействие между двумя белками становится не таким прочным и ТнС частично экранирует (видоизменяет) только участок связывания 414 антител.

Как следует из Рис. S для нескольких пар антител (например - TF4 - 414) образование бинарного комплекса препятствует взаимодействию антител с кпкгенс-и. Следовательно, такие пары антител можно использовать для измерения юпько сеободяга Тн!. В то же время, пары антител, на которые образование комплекса не оказывает влияния или исходный уровень сигнала восстанавлиаазтсч после добавления ЭДТА, можно использовать для измерения конценграцни общего (как свободного, так и в форме комплекса с ТнС) Тн!.

До последнего времени оставалось невыясненным, в каком шеде (свободная магдаула или комплекс с ТнС) 7н1 попадает в кровоток больных с ИМ. Для разрешения этого вопроса мы использовали дзе лары анытел 7F4-414 и 10F4-7F4 (в присутствии ЭДТА) - чтобы прозести измерения, соответственно, свободного и общего Тн! б крози больных с ИМ. Рез/тьтаты

Tní (нг/мл)

Время шесле начала ярвстуиа (часы)

Рис, 11 Изменение концентрации свободного (-о-) и общего (-и-) Тн! s крови больного с ИМ.

тестирования сыворотки крови одного из наиболее характерных больных с ИМ, приведены на Рис 11. Как следует т этого рисунка, основная часть ТИ о кропи больных с ИМ присутствует в виде комплекса с ТнС.

Попучьнные результаты имеют большое практическое значение Так, например, если разработчики диэгностичестой системы при работе с очяценной формой Тн1 отдадут предпочтелие паре антител типа 7F4-414, то такая система Судет выявлять в крови больного только незначительную часть аншыш и, соответетвачко, чувствительность такой системы может оказаться недостаточной для детекции Тн1 при микггаичфаретах. когда его концентрация в крови находится в диапазоне от 0.5 до 5 кАлл.

На основании полученных данных, мы для конструирования диагностической! системы выбрали пару антител 1CF4-7F4 [в присутствии ЗДТА). Нэ основе этой пары антител нами была создана высокочувствительна и высоюспецифичная система для количественного определения 7н! а крови больньк с ИМ. Чувотаительнозть дачной системы равняется O OS иг/мл, учзстк линейности от Q.0T до 1СЮ нг/мл (Ри<112!, время от начата исследований до получения результатов - 25-30 минут. Многочисленные клиннчесадв испытания показали, что данная система пригодна не только для .диагностики ИМ, но и при постановке диагноза у больных с микроинфаркта»! и, очевидно, дате, у больных с нестабильном стенокардией.

Коиа©итр»ц»й тропомпя* I Otr/wn)

Рис. 12 Калибровочный график dussnocmu-iscKaii системы для колтештиного опреЗапения Тн! в крови.

Использование трспониноеого комплекса для приготовления стандартов Тн'.

Как уже бало сказано ранее, Тн! üpavwe восприимчив к дййсгвида протеаз, Разработчики диагностических систем столкнулись с этой проблемой на этапа приготовления стандартов бепка. 3 растворенном вида Тн! сказывался крайне неустойчивым и быстро терял иммунологическую активность. Однако, нами было поназачо, что стабильность Ты а крози больных с ИМ существеяю выше, чем стабильность очищенного белка, растворежото а нормальной человеческой сыаорош:. Мы предположит что компоненты тропсниновагс комплекса мсгут запищать Тн! от воздействия эндогенных протеаз и, таким образом, Тн! е комгпехее с другими тролонинаиди будет более стабильным, чш свободный бепок. Кроме этого, Гн( в ада: комплекса с другими тролонинзми будет представлять собой ту самую форму, в которой (ка» было псказйно выихг) белок оыдепяетсч в кровоток больного с ИМ. Как мы и предполагали, (Рис.13) стэбилыккяъ Тн! в комплексе с ТнТ и ТнО охагалгсь существенно выше, чем стабильность очищенного белка и иммунологическая активность стандартов Тн1, пригэтомтеюмх на оснозб тропониновогс комплекса практически не менялась при инкубации при +4-С б течение недели и более. Таким образом,, на основании данных, полученных при изучении, биохимии Тн! ¡- крови ёотных, наг/ удалось решить достаточно

С 2 а в в 10 13 14 16 w яа

Время кнкудацих (дли)

Рис. 13 Стабильность свободного Тн! (-С-) и ТЫ в еибе /прояониновосо комплекс® (-о-) в растворе при инкубации при температуре +4 <С

сложную практическую задачу.

Выводы

1, Разработан торый высокоэффективный метод выделения Тн! v, других компонентов трочонииового комплекса из сердечно-мьшечной ткени человека

5. Получесо двенадцать гибридом, продуцирукщик монотечапьные антитела, сле^фичныв i; сердечной форме Тн!

3. Осуществлено зпятопное картирование попученных лоокпоиальных антитол

4. Показано впият« овзззования бинарного яомплсюа ТпЬТкС на взаимодействие части моьоглона/ъных зкппеп с Tnl

5. Показано, чю » к?ояя>'ги pvc.io больны* a ИМ Tul выделяется о основном в Э1ед9 комплекса с 1нС

6. На основе получение« монокпонаяьных анттвл раарабьтвна вьссясочувстаэтепьнал сизгсмз для количественного определения Тн1 п крови

7. Предложена но?я« методика придотвлечия сгар»пм1ых стандарта» Тн! на основе полного тропонйнового комплекса

Список публикаций по теме диссертации

1 A.G. KatnjWia, N.V. Sogatchevs, MB. <3<;sev. isolation of human cardiac troponin T and localisation cf epitopes recognized by monoclone) antibodies to cardiac troponin T. FEBS LETTERS, 1923, v.316, N1, cp. 25-28.

2. A.G Kataikhs, A.V. Bereznikcva, T.V. Esatava, V.L. Filatov, T.V. Bularjjina. N.3. Gusev. A new method of human cardiac troponin i and troponin T purification. Biochemistry and Molecular Biology international, 1995. v. 36. N1, pp. 19S-202.

3. H. Lahlkainan, A.G. Kalrukha, A.V. Bereznitova, T.V, Bulargina, N.B.Gusev, V.L Filatov. New monoclonal anii'jodies to human cardiac troponin T. ProceGding of the Laboratory Medicine '$S 11*1 IFCC European Congress of Clinical Chemistry, Tampere, Finland, 19&5, N647.

4. A.G. Kstmkha, M.E. Severing, J. Eskoia, К Pettersorv T. Lovgren, A.V. Berezrakova, N.H5 Gusbv. Time-resolved fiuoroirair.unosssay of cardiac troponin I. American Association for Clinical Chemistry, ¿7" Annua! Meeting, 1995, Clinicai Chemistry, v. 41, No, p 53.

5. A.G. KatruWia, T.V. Eiiargina, W.E. Severina, A.V. Berenriitovs, TV. Esakova, K. Mitrunen, K. Petterson, T. Lovgren. Castfiac troponin I - cardiac troponin С compiex in sera patients with acute myocardial infarction. Intsrnaiiona! Congress of C'.micai Chemistry, London, 1S96, p 221.

6. A.G. Katrukha, A.V. Bereznikova, T.V. Esakova, K. Mitmnen, P. Mykkanen. K. Petterson, T. Lovgren. Cardiac troponn С influences the binding of monoctora! antibodies to cardiac trc/jionin I. Irterm'Jona! Congress of Ciirica! Chemistrj, London, 1GS8, pp 221-222.

7. A.G. Kairutfw, M.E. bevsjina, AV. Bereznikova, T.v. Esakova, N.B. Gusev, К F'ettecson, T. Ltwgren. Phosphorylauon o? human cardiac troponin 1 by protein kinase A affects its immunological activity, Iniernaiiona! Ccngrsss of Clinical Eraymology, 19S5, Camfcrige, p 25, 51.

8. A.G. fatrukfia, №.£. Ssvenna, A.V. Berazrikova, T.V. Esakcva, fC Petterson, T. Lovijren. Decrease of non-specific binding of cartfcac troponin I. InteniaiiorKsl Congress of Clinica! Enzymoiogy, 1936, Cambrige, p 53.

8. Катруха А.Г., Березшнма A.B., Есакоеа T.B., Северина М.Е, Псттерсон К., Гусев H.S. Тропами I находился в комплексе о трогонином С в сыворотке крови больных с инфарктом миокарда. Всероссийская конференция. «Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечны* и глади« мышц», Пуцино 1996, с. 93.

10. Катруха А,Г., Гусев НБ Испопьзование компонентов тропонина ь качесгвз маркеров повреждения сердца. Всероссийская конференция «Прикладные- аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышца, Пущино 19S6, с. 93,

11. A.G. KatruMia, A,V. Bereznikova, К. Р'л'КМ, L.-M. Vuopio-Pulkki, T.V. Esakova, N.8. Gusev, M E. Severing, K. Petterson, T. Lovyren. Kineses of liberation of free and total troponin I in sera of patients with aerie myocardial infarction. American Association for Ciirtical Chemistry, 43a Annua! Meeting, 1997 , Clinicai Chemistry, v. 43, N6, p 106.

12. A.G. Katrukha, A.V. Bereznlkova, T.V. Esateya, M.E. Severins, K. Petteraon, T. Lovgren Troponin comp/ax for the preparation of troponin ( aaEBrators and siandarrfs. Amcrinan Association for CSnical Che.-nfstry, 49s AnrmS Westing, 1997 , Clinical Cftetristry, v. 43, NB, p 108

13. A.G.Kaio№a, AV. Reneznikova, T.V. Esakova, U.E Seve:ir)a, V.L. Filatov, K. PeHerso-i, T. Lwsren. in wvo ciearance of cardiac troponin i. European Congress of Cünicai Chmriisiry, Base), 1897, p. 113.

14 A.G. Kfltrukfia, A.V. Eferfi-zniteva, T.V. Esakova, ME. Severina, V.U. Filatov, K. Pefterson, T. Lovgren. Stability of cardiac troponin I in iiutnan serum, European Congress of Ciinicni Chemistry, Basel, 1997, p. 113.

15. A.G. Keiruiiha, A.V. BerczniKova, T.V. Esatova, K. Peteson, T. Lovgren, V.L. Fiiatov, K. PuftW, L-M. Vuopio-Pi.iikki, N.B. Qnsev. Troponin! is released in the faicod stream of patients wtth acute myocardial infarction no! in the fires farm, Put as a complex Clinical Chemistry, 1937, v.43, N a, pp 1379 - 1385.